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與炎性腸病有關的抗原.pdf

摘要
申請專利號:

CN201280076034.8

申請日:

2012.10.03

公開號:

CN104768563A

公開日:

2015.07.08

當前法律狀態:

實審

有效性:

審中

法律詳情: 實質審查的生效IPC(主分類):A61K 38/00申請日:20121003|||公開
IPC分類號: A61K38/00 主分類號: A61K38/00
申請人: 菲羅根股份公司
發明人: G·內里; K·施瓦格爾; M·魯熱克; D·奧哈拉; 陳建清
地址: 意大利錫耶納
優先權:
專利代理機構: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所11038 代理人: 劉曉東
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201280076034.8

授權公告號:

|||

法律狀態公告日:

2015.11.11|||2015.07.08

法律狀態類型:

實質審查的生效|||公開

摘要

結合纖維連接蛋白的ED-A同種型的特異性結合成員,其可用于炎性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的治療、診斷、檢測和/或成像方法中,和/或用于將綴合至該特異性結合成員的分子遞送至IBD組織。該特異性結合成員可(例如)綴合至免疫抑制性或抗炎性分子,例如白介素-10。

權利要求書

1.  一種特異性結合成員,其結合纖維連接蛋白的外結構域A同種型,用于治療炎性腸病(IBD)的方法,例如克羅恩氏病(CD)或潰瘍性結腸炎(UC)。

2.
  一種結合纖維連接蛋白的ED-A同種型的特異性結合成員用于制造供治療IBD(例如CD或UC)的藥物的用途。

3.
  一種治療患者IBD的方法,該方法包含向患者施予治療有效量的藥物,所述藥物包含結合纖維連接蛋白的ED-A同種型的特異性結合成員。

4.
  權利要求1的特異性結合成員、權利要求2的用途或權利要求3的方法,其中該特異性結合成員結合該纖維連接蛋白的ED-A。

5.
  權利要求1或4的特異性結合成員、權利要求2或4的用途或權利要求3或4的方法,其中該特異性結合成員被綴合至免疫抑制性或抗炎性分子,例如IL-10。

6.
  權利要求5的特異性結合成員、用途或方法,其中該特異性結合成員經可切割的連接子綴合至該生物活性分子。

7.
  一種結合纖維連接蛋白的ED-A同種型的特異性結合成員,其用于IBD的診斷方法中。

8.
  權利要求7的特異性結合成員,其中該特異性結合成員結合纖維連接蛋白的ED-A。

9.
  權利要求7或8的特異性結合成員,其中該特異性結合成員被綴合至可檢測標記或放射性同位素。

10.
  一種結合纖維連接蛋白的ED-A同種型的特異性結合成員,其用于將綴合至該特異性結合成員的分子遞送至IBD組織的新生血管。

11.
  權利要求10的特異性結合成員,其中該特異性結合成員結合纖維連接蛋白的ED-A。

12.
  權利要求10或11的特異性結合成員,其中該分子是免疫抑 制性或抗炎性分子,例如IL-10。

13.
  權利要求1和4-12中任一項的特異性結合成員、權利要求2的用途或權利要求3的方法,其中該特異性結合成員包含VH結構域,其包含構架和一組互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3,其中
HCDR1具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列,
HCDR2具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列,
HCDR3具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列;
或其中該VH結構域包含一組互補決定區,其在互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3中具有十個或更少個氨基酸取代。

14.
  權利要求13的特異性結合成員、用途或方法,其中該VH結構域構架是人種系構架。

15.
  權利要求14的特異性結合成員、用途或方法,其中該VH結構域具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

16.
  權利要求13-15中任一項的特異性結合成員、用途或方法,其中該特異性結合成員進一步包含VL結構域,所述VL結構域包含一組互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3和構架。

17.
  權利要求16的特異性結合成員、用途或方法,其中
LCDR1具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列,
LCDR2具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列,和
LCDR3具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列;
或其中該VL結構域包含一組互補決定區,其在該互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3中具有十個或更少個氨基酸取代。

18.
  權利要求16或17的特異性結合成員、用途或方法,其中該VL結構域構架是人種系構架。

19.
  權利要求18的特異性結合成員、用途或方法,其中該VL結構域具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

20.
  權利要求17-19中任一項的特異性結合成員、用途或方法,其中該特異性結合成員包含單鏈Fv。

21.
  權利要求20的特異性結合成員、用途或方法,其中該結合成 員是小型免疫蛋白(SIP)。

22.
  前述權利要求中任一項的特異性結合成員、用途或方法,其中該IBD不是潰瘍性結腸炎(UC)。

23.
  前述權利要求中任一項的特異性結合成員、用途或方法,其中該IBD是膠原性結腸炎。

24.
  前述權利要求中任一項的特異性結合成員、用途或方法,其中該IBD是淋巴細胞性結腸炎。

25.
  前述權利要求中任一項的特異性結合成員、用途或方法,其中該IBD是缺血性結腸炎。

26.
  前述權利要求中任一項的特異性結合成員、用途或方法,其中該IBD是分流性結腸炎。

27.
  前述權利要求中任一項的特異性結合成員、用途或方法,其中該IBD是貝賽特氏病。

28.
  前述權利要求中任一項的特異性結合成員、用途或方法,其中該IBD是未定型結腸炎。

29.
  前述權利要求中任一項的特異性結合成員、用途或方法,其中該IBD是克羅恩氏病。

30.
  一種綴合物,其包含綴合至IL-10的結合纖維連接蛋白ED-A同種型的結合成員,其中該綴合物具有如SEQ ID NO:13所示的序列。

說明書

與炎性腸病有關的抗原
技術領域
本發明是關于炎性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的治療和檢測。本發明牽涉結合纖維連接蛋白的ED-A同種型的特異性結合成員的使用,特別是結合纖維連接蛋白的結構域ED-A的特異性結合成員。該特異性結合成員可(例如)綴合至免疫抑制性或抗炎性分子,例如白介素-10。
【先前技術】
炎性腸病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)是一群影響結腸與小腸的炎性病況。IBD的主要類型為克羅恩氏病(Crohn’s disease,CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)。IBD致病機理的特征為造成和維持腸內慢性發炎狀態的不同血管發生性調節作用(Chidlow et al.,2006,Am J Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.,29,G5-G18)。克羅恩氏病可影響胃腸道的任何部分,而潰瘍性結腸炎則通常受限于結腸和直腸(Summers RW,Elliott DE,Qadir K,Urban JF,Thompson R,Weinstock JV(2003)Am.J.Gastroentol.,98:2034-2041)。依據其嚴重性,潰瘍性結腸炎的治療可能需要免疫抑制作用以控制其癥狀,且治療經常牽涉施予抗炎性分子。
已知IBD的特征為促炎細胞因子的上調,例如:IFN-γ、IL-6和IL-12(如IL-12p70)。例如已知克羅恩氏病與過量的IL-12/IL-23和IFN-γ/IL-17產生有關(Strober et al.(2007),The Journal of Clinical Investigation,117(3),514-521)。亦已有克羅恩氏病活躍期間,IL-12p70與IL-23合成的報導(Fuss et al.2006,Inflamm.Bowel Dis.12:9-15)。
纖維連接蛋白(Fibronectin(FN))是一種醣蛋白,其在多種正常組織和體液中廣泛表達。其是胞外基質(extracellular matrix (ECM))的組分,并參與許多生物過程,包括細胞附著、細胞遷移、止血、血栓形成、創傷愈合、組織分化和癌性轉化。
不同的FN同種型是藉由原始轉錄體FN前mRNA(pre-mRNA)的三個區域(ED-A、ED-B、IIICS)的選擇性剪接而產生,其是由細胞因子和胞外pH所調節的過程(Balza(1988)FEBS Lett.,228,42-44;Carnemolla(1989)J.Cell Biol.,106,1139-1148;Borsi(1990)FEBS Lett.261,175-178)。纖維連接蛋白含有兩個III型球狀外結構域(globular extra-domains),其可進行選擇性剪接:ED-A和ED-B(ffrench-Constant(1995)Exp.Cell Res.,22,261-271,Kaspar et al.(2006)Int.J.cancer,118,1331-1339)。小鼠纖維連接蛋白的ED-A和人纖維連接蛋白的ED-A的同一性為96.7%(這兩個90氨基酸的序列之間僅有3個氨基酸不同)。
經報導乳癌(Jacobs et al.(2002)Human Pathol,33,29-38,Matsumoto et al.(1999)Jpn.J.Cancer Res.,90,320-325)和肝癌(Oyama et al.(1989)JBC,264,10331-10334,Tavian et al.(1994)Int.J.Cancer,56,820-825)的腫瘤細胞和實體腫瘤中在mRNA水平上有纖維連接蛋白ED-A的表達,而纖維肉瘤(fibrosarcoma)、橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)和黑色素瘤在分離蛋白質水平上有纖維連接蛋白ED-A的表達(Borsi et al.(1987)J.Cell Biol.,104,595-560)。除了癌癥,已報導類風濕性關節炎有纖維連接蛋白的ED-A的表達(WO2009/056268)。WO2010/078950亦報導了纖維連接蛋白的ED-A在子宮內膜異位、牛皮癬和牛皮癬性關節炎中的表達,然而組織化學分析顯示在多發性硬化癥和潰瘍性結腸炎中,ED-A的表達很弱至實際上無表達。Brenmoehl等人發表的免疫組織化學分析(Int.J.Colorectal Dis.(2007)22:611-623)顯示相較于對照組黏膜,ED-A表達在CD患者的發炎腸黏膜的表達降低,而在潰瘍性結腸炎則升高。Brenmoehl等人(2007)亦報導在CD患者的纖維性黏膜(fibrotic mucosa)中,ED-A和ED-B同種型的表達升高。因為已知所述纖維連接蛋白同種型與創傷愈合相關,故可預期纖維性黏膜中有ED-A和 ED-B同種型表達。以CD患者的發炎腸粘膜中ED-A表達較衍生自對照組患者的黏膜低,Brenmoehl等人(2007)并未提出CD(活躍)期間ED-A發生表達。此文件中也沒有公開結合纖維連接蛋白的ED-A同種型的結合成員用于治療或診斷IBD的用途。
白介素-10(IL-10)是一種抗炎性細胞因子,其功能為免疫系統的重要調控者。雖然已知IL-10在免疫系統中具有許多不同的作用,其兩種主要活性包括抑制巨噬細胞的細胞因子產生,以及在T細胞活化期間抑制巨噬細胞的附屬功能(Abbas A,Lichtman A,Pober J.,1994,Cellular and Molecular Immunology.2nd Ed.Philadelphia:W.B.Saunders Company)。這些作用的效果使得IL-10在免疫系統中主要扮演抗炎性作用。IL-10最初被稱為細胞因子合成抑制因子(cytokine synthesis inhibiting factor(CSIF)),此蛋白質的發現基于的是其生物活性(Delves P,Roitt I(eds),1998,Encyclopedia of Immunology,2nd Ed.San Diego:Academic Press)。因為其眾所周知的抗炎性特性,IL-10療法被引入作為克羅恩氏病(CD)可能的新穎抗炎性治療(Fedorak et al.,Gastroenterology(2000)119,1473-1482.;Schreiber et al.,Gastroenterology(2000)119,1461-1472;Colombel et al.,Gut(2001)49,42-46)。
Asadullah等人(Pharmacology Reviews,(2003),55,245-269)回顧了數種炎性疾病中白介素-10療法的技術狀況。在回顧慢性炎性腸病時,Asadullah等人報導進行了許多大型多中心臨床試驗(multicenter trial),以患有輕微/中度CD或治療抗性CD的患者測試多個IL-10劑量,以及藉由全身性施予進行治療性回腸或回腸結腸切除術的患者,以預防內窺鏡術后遺癥(Fedorak et al.,Gastroenterology(2000)119,1473-1482.;Schreiber et al.,Gastroenterology(2000)119,1461-1472;Colombel et al.,Gut(2001)49,42-46.)。數據顯示IL-10療法是安全的且耐受性良好。然而,與安慰劑治療相較,IL-10治療并未造成顯著較高的緩解率或臨床改善。
整體而言,臨床結果并不讓人滿意,而Herfarth和Scholmerich 則有許多關于此治療策略令人失望的討論(Gut(2002)50,146-147)。
因此,仍有對于多種IBD狀態的有效治療的需求。
發明內容
本發明人意外發現,融合至IL-10的抗EDA抗體能夠:(i)在IBD患病小鼠中體內選擇性定位至發炎結腸的位點,和(ii)降低IBD患病小鼠中某些促炎細胞因子的血清水平,特別是干擾素-γ、IL-6和IL-12p70。
經由施予融合至IL-10的抗EDA抗體而下調促炎細胞因子特別令人意外,因為Tilg等人(Gut(2002),50,191-195)報導以重組的人IL-10治療克羅恩氏病患者會引發干擾素-γ。Shibata等人(J.Immunol.,(1998)161,4283-4288)亦報導IL-10增強了NK細胞產生INF-γ,但抑制巨噬細胞產生誘導INF-γ的因子。
于是,在第一方面中,本發明提供一種特異性結合成員(例如:抗體分子),其結合纖維連接蛋白(A-FN)的外結構域-A(Extra Domain-A(ED-A))同種型,用于治療IBD的方法。本發明亦提供結合纖維連接蛋白的外結構域-A(ED-A)同種型的特異性結合成員(例如:抗體分子),用于制造供治療IBD的藥物的用途。本發明亦提供一種治療患者IBD的方法,該方法包含施予患者治療有效量的藥物,其包含結合纖維連接蛋白的ED-A同種型的特異性結合成員。優選地,該特異性結合成員結合人纖維連接蛋白的ED-A同種型。
用于本發明的第一方面的特異性結合成員(例如:抗體分子),可結合纖維連接蛋白的ED-A。
用于本發明的第一方面的特異性結合成員(例如:抗體分子),可綴合至具有免疫抑制性或抗炎性活性的分子、可檢測標記、放射性同位素或生物活性分子,例如:細胞因子、激素、治療性放射性同位素、細胞毒性藥物。該特異性結合成員可由可切割的連接子綴合至該生物活性分子。
在一個優選實施例中,該特異性結合成員(例如:抗體分子)被 綴合至具有免疫抑制性或抗炎性活性的分子,例如:IL-10。
IBD,如本文所稱,可為活性IBD。具體而言,該IBD可為克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、膠原性結腸炎(collagenous colitis)、淋巴細胞性結腸炎(lymphocytic colitis)、缺血性結腸炎(ischaemic colitis)、分流性結腸炎(diversion colitis)、貝賽特氏病(disease)或未定型結腸炎(indeterminate colitis)。該IBD可為CD或UC。該IBD可為CD、膠原性結腸炎、淋巴細胞性結腸炎、缺血性結腸炎、分流性結腸炎、貝賽特氏病或未定型結腸炎。在一個實施方案中,該IBD不是UC。該IBD可為通常發炎作用不限于結腸和直腸的IBD,例如:CD。IBD可為不僅止影響結腸內膜的IBD。優選地該IBD是CD。本文所使用的術語CD、UC、膠原性結腸炎、淋巴細胞性結腸炎、缺血性結腸炎、分流性結腸炎、貝賽特氏病和未定型結腸炎,可分別代表活性CD、活性UC、活性膠原性結腸炎、活性淋巴細胞性結腸炎、活性缺血性結腸炎、活性分流性結腸炎、活性貝賽特氏病和活性未定型結腸炎。
在第二方面中,本發明提供結合纖維連接蛋白的ED-A同種型的特異性結合成員(例如:抗體分子),用于將綴合至該特異性結合成員的分子傳遞至IBD組織。本發明亦提供結合纖維連接蛋白的ED-A同種型的特異性結合成員(例如:抗體分子),用于制造供將綴合至該特異性結合成員的分子遞送至IBD組織的藥物。本發明亦提供一種將分子傳遞至人或動物內IBD組織的方法,其中該分子被綴合至結合纖維連接蛋白的ED-A同種型的特異性結合成員以形成綴合物,該方法包含將該綴合物施予該人或動物。優選地,該特異性結合成員結合人纖維連接蛋白的ED-A同種型。
本發明的第二方面中使用的特異性結合成員(例如:抗體分子)可結合纖維連接蛋白的ED-A。
本發明的第二方面中使用的特異性結合成員(例如:抗體分子)可綴合至可檢測性標記、放射性同位素或生物活性分子,例如:細胞因子、激素、治療性放射性同位素或細胞毒性藥物。該特異性結合成 員可藉由可切割的連接子綴合至該生物活性分子。
該特異性結合成員(例如:抗體分子)優選地綴合至IL-10。
在第三方面中,本發明提供一種結合纖維連接蛋白的ED-A同種型的特異性結合成員(例如:抗體分子)以用于診斷IBD的方法。本發明亦提供結合纖維連接蛋白的ED-A同種型的特異性結合成員用于制造供診斷IBD的診斷產品的用途。本發明亦提供一種檢測或診斷人或動物中IBD的方法,其中該方法包含下列步驟:
(a)向該人或動物施予結合纖維連接蛋白的ED-A結構域的特異性結合成員,和
(b)測定該特異性結合成員存在或不存在于該人體或動物體中的IBD位置,其中該特異性結合成員區域定位至IBD的位置代表IBD存在。
優選地,該特異性結合成員結合人纖維連接蛋白的ED-A同種型。
本發明的第三方面中使用的特異性結合成員(例如:抗體分子)可結合纖維連接蛋白的ED-A。
本發明的第三方面中使用的特異性結合成員(例如:抗體分子)可綴合至可檢測標記或放射性同位素。
在第四方面中,本發明提供一種結合纖維連接蛋白的ED-A同種型的特異性結合成員以用于對IBD組織成像的方法。本發明亦提供結合纖維連接蛋白的ED-A同種型的特異性結合成員,用于制造供對IBD組織成像的成像劑的用途。本發明亦提供一種檢測人或動物中IBD組織或對其成像的方法,其中該方法包含下列步驟:
(a)向該人或動物施予結合纖維連接蛋白的ED-A結構域的特異性結合成員,和
(b)檢測該特異性結合成員與人體或動物體內的IBD組織的結合。
優選地,該特異性結合成員結合人纖維連接蛋白的ED-A同種型。
本發明的第四方面中使用的特異性結合成員(例如:抗體分子)可結合纖維連接蛋白的ED-A。
本發明的第四方面中使用的特異性結合成員(例如:抗體分子)可綴合至可檢測標記或放射性同位素。
在第五方面中,本發明提供一種綴合物,其包含綴合至IL-10的結合纖維連接蛋白的ED-A同種型(例如:ED-A)的結合成員,其中該綴合物具有如SEQ ID NO:13所示的序列。此綴合物在本文中稱為F8-IL10。因為此綴合物的VH和VL結構域是藉由5個氨基酸的連接子連接(參見圖1B),預期該綴合物在溶液中形成非共價性同型二聚體。
本發明使用的特異性結合成員可為結合纖維連接蛋白的ED-A同種型和/或纖維連接蛋白的ED-A的抗體分子,其中該抗體包含本文所述的F8抗體的一個或多個互補決定區(CDR)。所述序列提供于下文(參見SEQ ID NO:1-6)。F8抗體的CDR序列亦顯示于圖1。
本發明使用的特異性結合成員可包含一個或多個本文所述的CDR(例如:CDR3),且任選地包含CDR1和CDR2,以形成一組CDR。
優選地,本發明使用的特異性結合成員包含一組本文所述的F8抗體的H和/或L抗體CDR,在所公開的H和/或L CDR組中帶有十個或更少(例如:一個、二個、三個、四個或五個)氨基酸取代。
取代作用可能在該組CDR中的任何殘基發生,且可在CDR1、CDR2和/或CDR3中。
本發明使用的特異性結合成員可包含抗體分子,例如:人抗體分子。該特異性結合成員通常包含抗體VH和/或VL結構域。特異性結合成員的VH結構域亦提供用于本發明中。各VH和VL結構域中包含互補決定區(CDR)和構架區域(FR)。VH結構域包含一組HCDRs,而VL結構域包含一組LCDR。抗體分子可包含抗體VH結構域,其包含VH CDR1、CDR2和CDR3與構架。其可替代性或同時包含抗體VL結構域,其包含VL CDR1、CDR2和CDR3與構架。所有本文所公開的VH和VL序列、CDR序列、CDR組和HCDR組與LCDR組,均代表本發明使用的特異性結合成員的實施方式。如本文所述, “一組CDR”包含CDR1、CDR2和CDR3。因此,一組HCDR代表HCDR1、HCDR2和HCDR3,而一組LCDR代表LCDR1、LCDR2和LCDR3。除非另有指明,“一組CDR”包括HCDR和LCDR。
本發明使用的特異性結合成員可包含抗體VH結構域,其包含互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3與構架,其中HCDR1是SEQ ID NO:1,且其中任選的HCDR2是SEQ ID NO:2和/或HCDR3是SEQ ID NO:3。
一般而言,VH結構域與VL結構域配對以提供抗體抗原結合位點,雖然如下文的進一步論述,VH或VL結構域單獨可能用來結合抗原。因此,本發明使用的特異性結合成員可進一步包含抗體VL結構域,其包含互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3與構架,其中LCDR1是SEQ ID NO:4,且其中任選地LCDR2是SEQ ID NO:5和/或LCDR3是SEQ ID NO:6。
本發明使用的特異性結合成員優選地可包含纖維連接蛋白的ED-A的抗體分子,其中該抗體分子包含VH結構域和VL結構域,其中該VH結構域包含構架和一組互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3,且其中該VL結構域包含互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3與構架,且其中:
HCDR1具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列;
HCDR2具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列;
HCDR3具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列;
LCDR1具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列;
LCDR2具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列;和
LCDR3具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
一個或多個CDR或抗體的一組CDR可被接枝至構架(例如:人構架)中,以提供用于本發明的抗體分子。構架區域可包含人生殖細胞基因區段序列。因此,該構架可為種系化的,藉以改變構架內的一個或多個殘基,以使之與最相似的人種系構架中相當位置的殘基相符。本發明使用的特異性結合成員可為具有VH結構域的分離抗體分子, 該VH結構域包含人種系構架中的一組HCDR(例如:DP47)。該特異性結合成員通常亦具有包含一組LCDR(例如在人種系構架中)的VL結構域。該VL結構域的人種系構架可為DPK22。
本發明使用的VH結構域可以優選地具有氨基酸序列SEQ ID NO:7,其是F8抗體的VH結構域。本發明使用的VL結構域可優選地具有氨基酸序列SEQ ID NO:8,其是野生型F8抗體的VL結構域。
本發明使用的特異性結合成員可為或包含單鏈Fv(scFv),其包含由肽連接子鏈接的VH結構域和VL結構域。熟練技術人員可選擇連接子的適當長度與序列,例如:至少為5個或至少為10個氨基酸長,至多約15個、至多約20個或至多約25個氨基酸長。該連接子可具有氨基酸序列GGSGG(SEQ ID NO:9)。
該特異性結合成員可為雙功能抗體(diabody),其是由基因融合所建構的多價或多特異性片段(WO94/13804;Holliger et al.(1993a),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448)。
優選地,該特異性結合成員是scFv,其在溶液中形成(穩定的)非共價同型二聚體。例如:本文所述的F8抗體和F8-IL10綴合物均包含scFv,其預期在溶液中形成(穩定的)非共價同型二聚體。
單鏈Fv(scFv)可被包含在微型免疫球蛋白(mini-immunoglobulin)或小型免疫蛋白(small immunoprotein(SIP))中(例如Li et al.,(1997),Protein Engineering,10:731-736所述)。SIP可包含融合至人IgE分泌性同種型IgE-S2的CH4結構域的scFv分子(εS2-CH4;Batista et al.,(1996),J.Exp.Med.,184:2197-205),形成同型二聚體性的微型免疫球蛋白抗體分子。
或者,本發明使用的特異性結合成員可包含非抗體分子中的抗原結合位點,一般由一個或多個CDR提供,例如:在非抗體蛋白質支架中的一組CDR。特異性結合成員(包括非抗體和抗體分子)在本文其他部分有更詳細的描述。
本發明使用的特異性結合成員可為抗體分子,其包含如SEQ ID NO:7所示的F8抗體的VH結構域和/或如SEQ ID NO:8所示的F8 抗體的VL結構域。本發明使用的特異性結合成員可為包含如SEQ ID NO:11所示的序列的抗體分子。本發明的綴合至IL-10的特異性結合成員可包含如SEQ ID NO:13所示的序列。
本發明使用的特異性結合成員亦可包含抗ED-A抗體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F1、B7、E8或G9或其變體的一個或多個(例如:全部六個)CDR,或者抗ED-A抗體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F1、B7、E8或G9或其變體的VH和/或VL結構域。所述抗體的CDR序列與VH和VL結構域序列公開于WO2010/078950。
本發明使用的適當變體包含抗體抗原結合位點,其包含本文所述的F8抗體的VH結構域和VL結構域,其中如SEQ ID NO:7所示的VH結構域中位置5的亮氨酸(L)殘基被纈氨酸(V)所取代,和/或如SEQ ID NO:8所示的VL結構域中位置18的精氨酸(R)殘基被賴氨酸(K)所取代。
本發明的所述和其他方面在下文有更詳細的描述。
【附圖簡單說明】
圖1A顯示抗ED-A F8抗體重鏈(VH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。抗ED-A F8抗體的重鏈CDR1的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)以下劃線標出。抗ED-A F8抗體的重鏈CDR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)以斜體字加下劃線顯示。抗ED-A F8抗體的重鏈CDR3的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)以粗體字加下劃線顯示。圖1B顯示VH和VL結構域之間抗ED-A F8抗體連接子序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)。圖1C顯示抗ED-A F8抗體輕鏈(VL)的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。抗ED-A F8抗體的輕鏈CDR1的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)以下劃線顯示。抗ED-A F8抗體的輕鏈CDR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)以斜體字加下劃線呈現。抗ED-A F8抗體的輕鏈CDR3的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)以粗體字加下劃線顯示。圖1D顯示當抗體綴合至IL-10時,F8抗體和IL-10之間連接子的氨基酸序列。圖1E顯示人IL-10的氨基酸序列。
圖2顯示IBD小鼠和健康小鼠的結腸自顯影結果。收集結腸并將其暴露于磷成像屏(Molecular Dynamics)24小時,并經由Storm 860成像。第1道:注射后6小時收集自第0組的結腸(健康小鼠);第2道:注射后6小時收集自第2組的結腸(IBD小鼠);
第3道:注射后24小時收集自第0組的結腸(健康小鼠);第4道:注射后24小時收集自第2組的結腸(IBD小鼠)。
圖3顯示125I-F8-IL10在健康和患病小鼠中的生物分布。圖表顯示注射后6小時(A)、注射后24小時(B)和注射后96小時(C)125I-F8-IL10在健康和患病小鼠中的生物分布。于96小時,相較于健康小鼠,明顯可見125I-F8-IL10傾向累積在患病小鼠的結腸和腸系膜淋巴結(L.N.)。所述實驗中所用的F8-IL10綴合物的序列如SEQ ID NO:13所示。
圖4顯示經F8-IL10處理的小鼠的細胞因子水平。上述圖表代表在健康小鼠(水)、未接受治療的患病小鼠(3%DSS)、接受小型免疫蛋白(Small Immune Protein)形式F8抗體的患病小鼠(F8SIP)、接受F8-IL10的患病小鼠(F8-IL10)的血清中細胞因子的水平。報告的細胞因子水平(表示為每ml血清中的pg蛋白質)為:白介素1β(IL1-b)、白介素12(IL-12p70)、干擾素γ(IFNγ)和白介素6(IL6)。
圖5顯示經F8-IL10處理的小鼠中的細胞因子水平。上述圖表代表在健康小鼠(水)、未接受治療的患病小鼠(3%DSS)、接受小型免疫蛋白(Small Immune Protein)形式F8抗體的患病小鼠(F8SIP)、接受F8-IL10的患病小鼠(F8-IL10)的血清中細胞因子的水平。報告的細胞因子水平(表示為每ml血清中的pg蛋白質)為:角質細胞衍生的趨化因子(KC)、白介素10(IL10)和腫瘤壞死因子α(TNFa)。
圖6顯示組織化學分析來自罹患潰瘍性結腸炎和克羅恩氏病的患者的結腸組織樣本,其中采用SIP形式的F8抗體和馮維勒布蘭德因子進行探測。以F8抗體和溫韋伯因子觀察到的染色結果顯示,F8在罹患潰瘍性結腸炎和克羅恩氏病的患者中對新形成血管染色,但不對正常血管染色。(溫韋伯因子常規上作為正常血管的標記。)
圖7顯示罹患潰瘍性結腸炎和克羅恩氏病患者的患部結腸組織樣本(右)和非患部結腸樣本(左)的組織化學分析。以F8抗體觀察到的染色結果顯示F8對患病結腸中新形成血管更為強烈地染色。
術語
纖維連接蛋白
纖維連接蛋白是一種進行選擇性剪接的抗原,如本文在他處所述,目前已知數種選擇性同種型。外結構域-A(Extra Domain-A(EDA或ED-A))也已知為ED、外部III型重復序列A(extra type III repeat A(EIIIA))或EDI。人ED-A的序列已經由Kornblihtt等人((1984),Nucleic Acids Res.12,5853-5868)和Paolella等人((1988),Nucleic Acids Res.16,3545-3557)公開。人ED-A的序列亦可在SwissProt數據庫,以登錄號P02751保存的氨基酸序列的氨基酸1631-1720(III型纖維連接蛋白12;外結構域2)獲得。小鼠ED-A的序列可在SwissProt數據庫,以登錄號P11276保存的氨基酸序列的氨基酸1721-1810(III型纖維連接蛋白13;外結構域2)獲得。
纖維連接蛋白的ED-A同種型含有外結構域A(Extra Domain-A(ED-A))。人A-FN的序列可從相對應的人纖維連接蛋白前體序列推導得到,該前體序列可在SwissProt數據庫以登錄號P02751取得。小鼠A-FN的序列可從相對應的小鼠纖維連接蛋白前體序列推導得到,該前體序列可在SwissProt數據庫以登錄號P11276取得。A-FN可為纖維連接蛋白的人ED-A同種型。ED-A可為人纖維連接蛋白的外結構域A。
ED-A是90個氨基酸的序列,其是藉由選擇性剪接插入纖維連接蛋白(FN)中,并位于FN的結構域11與12之間(Borsi et al.,1987,J.Cell Biol.,104,595-600)。ED-A大體上不存在于FN的血漿形式中,但在胚胎形成、組織重塑、纖維化、心臟移植和實體腫瘤形成期間卻含量豐富。
選擇性剪接
選擇性剪接代表剪接DNA的原始RNA轉錄體時,發生不同剪接方式而產生不同mRNA。在切除內含子后,選擇作用可決定哪些外顯子被剪接在一起而形成mRNA。選擇性剪接產生含有不同外顯子和/或不同數量的外顯子的不同同種型。例如,一種同種型可包含對應于一個或多個外顯子的額外氨基酸序列,其可包含一個或多個結構域。
特異性結合成員
此術語描述特異性地彼此結合的一對分子中的一個成員。特異性結合分子對的成員可為自然衍生或全體或部分由人工合成。該分子對的一個成員在其表面上具有結合至并因而與該分子對的另一成員的特定空間與極性組織互補的區域或腔。結合分子對類型的實例是抗原-抗體、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受體、受體-配體、酶-底物。本發明涉及抗原-抗體類型反應。
特異性結合成員一般包含具有抗原結合位點的分子。例如:特異性結合成員可為抗體分子或包含抗原結合位點的非抗體蛋白質。本文中所稱的特異性結合成員優選是抗體分子。
抗原結合位點可藉由在非抗體蛋白質支架(例如纖維連接蛋白或細胞色素B等)上排布互補決定區(CDR)的方式提供(Haan&Maggos,(2004),BioCentury,12(5):A1-A6;Koide et al.,(1998),Journal of Molecular Biology,284:1141-1151;Nygren et al.,(1997),Current Opinion in Structural Biology,7:463-469),或藉由將蛋白質支架中環的氨基酸殘基隨機化或突變的方式提供,以賦予對于目標靶的結合特異性。用于在蛋白質中加工新的結合位點的支架已由Nygren等人詳盡回顧(1997)(Current Opinion in Structural Biology,7:463-469)。用作抗體模擬物的蛋白質支架公開于WO/0034784,在該文獻中發明人描述了包括纖維連接蛋白III型結構域(具有至少一個隨機化環)的蛋白質(抗體模擬物)。移植一個或多個CDR(例如:一組HCDR)的適當支架可由免疫球蛋白基因超家族(gene  superfamily)的任何結構域成員提供。該支架可為人或非人蛋白質。非抗體蛋白質支架的優勢為其可在相較于至少某些抗體分子而言較小和/或較容易操作的支架分子中提供抗原結合位點。小尺寸的結合成員可賦予有用的生理特性,例如:能夠進入細胞、穿透至組織深處或到達其他結構內的目標、或結合至目標抗原的蛋白質腔中。抗原結合位點在非抗體蛋白質支架中的用途回顧于Wess,2004,In:BioCentury,The Bernstein Report on BioBusiness,12(42),A1-A7。典型有具有適當構架和一個或多個可變環的蛋白質,在其中該環的氨基酸序列被特異性或隨機化突變,以創造結合目標抗原的抗原結合位點。該蛋白質包括來自金黃色葡萄球菌(S.aureus)的蛋白質A的IgG結合結構域、轉鐵蛋白、四連蛋白(tetranectin)、纖維連接蛋白(例如:第10纖維連接蛋白III型結構域)和脂質運載蛋白(lipocalin)。其他方式包括基于大環寡肽(cyclotide)的合成“微小體(Microbody)”(Selecore GmbH)─具有分子內二硫鍵的小蛋白質。
除了抗體序列和/或抗原結合位點之外,本發明使用的特異性結合成員可包含其他氨基酸例如:形成肽或多肽,諸如折迭結構域,或除了結合抗原的能力外,給予該分子以另一功能特性的氨基酸。本發明使用的結合成員可帶有可檢測標記,或可綴合至毒素、具免疫抑制效果或抗發炎效果的分子或靶向部分或酶(例如:通過肽鍵或連接子)。優選地,本發明使用的結合成員綴合至白介素10。
例如:結合成員可包含催化位置(如于酶結構域中)以及抗原結合位點,其中該抗原結合位點結合抗原并因此使該催化位點靶向該抗原。該催化位點可抑制抗原的生物功能,例如:經由切割。
如所述的,雖然CDR可由非抗體支架攜帶,但用于攜帶CDR或CDR組的結構通常是抗體重鏈或輕鏈序列或其實質上的部分,其中該CDR或CDR組位于對應于由重排的免疫球蛋白基因編碼的天然存在的VH和VL抗體可變結構域的CDR或CDR組的位置。免疫球蛋白可變結構域的結構與位置可參考Kabat等人的文獻(1987)(Sequences of Proteins of Immunological Interest.4th Edition.US Department of  Health and Human Services.)以及在互聯網上可獲得的其更新版本(于immuno.bme.nwu.edu,或使用關鍵詞“Kabat”以任何搜索引擎檢索)確定。
提到CDR區域或CDR時,其意指Kabat等人,(1987)Sequences of Proteins of Immunological Interest,4th Edition,US Department of Health and Human Services(Kabat et al.,(1991a),Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Edition,US Department of Health and Human Services,Public Service,NIH,Washington,以及之后的版本)中所定義的免疫球蛋白重鏈與輕鏈的高變區。抗體通常包含3個重鏈CDR和3個輕鏈CDR。根據情況,本文中所用的術語CDR意指這些區域之一或數個,或甚至這些區域的全部,其含有由該抗體對該抗原或其識別的表位的親和力負責結合的主要的氨基酸殘基。
在六個短CDR序列之中,該重鏈的第三個CDR(HCDR3)具有較大的尺寸可變性(更大的多樣性,主要因為產生該HCDR3的該基因重排的機制導致的)。雖然已知最長的尺寸為26個氨基酸,但其可短如2個氨基酸。在功能上,HCDR3在決定該抗體的特異性方面起著部分作用(Segal et al.,(1974),PNAS,71:4298-4302;Amit et al.,(1986),Science,233:747-753;Chothia et al.,(1987),J.Mol.Biol.,196:901-917;Chothia et al.,(1989),Nature,342:877-883;Caton et al.,(1990),J.Immunol.,144:1965-1968;Sharon et al.,(1990a),PNAS,87:4814-4817;Sharon et al.,(1990b),J.Immunol.,144:4863-4869;Kabat et al.,(1991b),J.Immunol.,147:1709-1719)。
抗體分子
抗體分子描述天然或部分或全部人工合成的免疫球蛋白。該術語亦涉及任何包含抗體的抗原結合位點的多肽或蛋白質。在此須了解,本發明不涉及天然形式的抗體,也就是說它們并非存在于天然環境中,而是已從天然來源經純化而分離或獲得,或其他經由基因重組而獲得, 或經由化學合成,且其可包括如下文所述的非天然氨基酸。包含抗體的抗原結合位點的抗體片段包括(但不限于)諸如Fab、Fab’、Fab’-SH、scFv、Fv、dAb、Fd;和雙功能抗體的抗體分子。
有可能獲得單克隆抗體以及其他抗體,以及使用重組DNA技術產生其他結合標靶抗原的抗體或嵌合分子。此技術可涉及將編碼抗體的免疫球蛋白可變區或CDR的DNA導入不同免疫球蛋白的恒定區或恒定區加構架區。參見,例如:EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400,以及后來的大部分文獻。可使產生抗體的雜交瘤或其他細胞進行基因突變或其他改變的處理,其可能會或可能不會改變所產生抗體的結合特異性。
因為抗體可經多種方式修飾,所以術語“抗體分子”應被解釋為涵蓋任何具有所需特異性和/或結合至抗原的抗體之抗原結合位點的結合成員或物質。因此,此術語涵蓋抗體片段以及衍生物,包括不管是天然的或者是全部或部分人工合成的任何包含抗體之抗原結合位點的多肽。因此包括含有抗體之抗原結合位點(或相等物)與另一多肽(例如:由另一物種衍生而來,或屬于另一抗體類型或亞型)融合成的嵌合分子。嵌合抗體的克隆和表達描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023,以及后來的大部分文獻。
抗體工程技術領域中可得到的更進一步技術已使得有可能分離人以及人源化抗體。例如,人雜交瘤可以由Kontermann&Dubel所述的方式制得(Kontermann&Dubel(2001),S,Antibody Engineering,Springer-Verlag New York,LLC;ISBN:3540413545)。噬菌體展示,另一種已建立用于產生結合成員的技術,于許多公開文獻中已有詳細的說明,諸如:WO92/01047(進一步于下文討論)和美國專利第US5969108號、第US5565332號、第US5733743號、第US5858657號、第US5871907號、第US5872215號、第US5885793號、第US5962255號、第US6140471號、第US6172197號、第US6225447號、第US6291650號、第US6492160號、第US6521404號和Kontermann&Dubel(2001)(S,Antibody Engineering,Springer-Verlag New York,LLC;ISBN: 3540413545)。將小鼠抗體基因去活化并以人抗體基因功能性取代,同時留下小鼠免疫系統的完整的其他組份的轉基因小鼠可用來分離人抗體(Mendez et al.,(1997),Nature Genet,15(2):146-156)。
合成性抗體分子的制造可藉由從以寡核苷酸合成的手段產生的基因,然后裝配在適合的表達載體內而表達出來,例如:于Knappik等人(2000)(J.Mol.Biol.296,57-86)或Krebs等人(2001)(Journal of Immunological Methods,25467-84)發表的文章所述。
已顯示整個抗體的片段可進行結合抗原的功能。結合片段的實例為(i)由VL、VH、CL和CH1結構域組成的Fab片段;(ii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段;(iii)由單一抗體的VL和VH結構域組成的Fv片段;(iv)dAb片段(Ward et al.(1989)Nature 341,544-546;McCafferty et al.,(1990)Nature,348,552-554;Holt et al.(2003)Trends in Biotechnology 21,484-490),其是由VH或VL結構域組成;(v)分離的CDR區域;(vi)F(ab')2片段,一種包含兩個相連接的Fab片段的二價片段;(vii)單鏈Fv分子(scFv),其中VH結構域和VL結構域經由肽連接子連接,使得此兩個結構域能締合形成抗原結合位點(Bird et al.(1988)Science,242,423-426;Huston et al.(1988)PNAS USA,85,5879-5883);(viii)雙特異性的單鏈Fv二聚物(PCT/US92/09965);和(ix)因基因融合構建成的“雙功能性抗體(diabodies)”、多價或多特異性片段(WO94/13804;Holliger et al.(1993a),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448)。Fv、scFv或雙功能性抗體分子可藉由摻入二硫基橋連接該VH與VL結構域予以穩定化(Reiter et al.(1996),Nature Biotech,14,1239-1245)。亦可制造包含連接至CH3結構域的scFv的微體(minibodies)(Hu et al.(1996),Cancer Res.,56(13):3055-61)。結合片段的其他實例為Fab’,其與Fab片段的差異為在重鏈CH1結構域的羧基末端處添加了一些殘基,包括一個或多個來自該抗體絞鏈區的半胱氨酸,以及Fab’-SH,其是恒定區的半胱氨基酸殘基帶有游離巰基基團的Fab’片段。
本發明所用的抗體片段可從任何本文所述的抗體分子(例如:包 含VH和/或VL結構域或任何本文所述的抗體的CDR的抗體分子)開始,利用諸如酶(例如:胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化的方法和/或利用化學還原打斷二硫橋的方法而得到。于另一方法中,本發明的抗體片段可利用本領域熟練技術人員熟知的基因重組的技術制得,或利用其他肽合成方法,例如,使用諸如Applied Biosystems等公司所提供的自動肽合成器,或核酸合成以及表達制得。
本發明的功能性抗體片段包括任何半衰期經化學修飾(特別是聚乙二醇化)或經摻入脂質體中而延長的功能性片段。
dAb(結構域抗體)是一種抗體的小單體抗原結合片段,即抗體重鏈或輕鏈的可變區(Holt et al.(2003)Trends in Biotechnology 21,484-490)。VH dAbs天然存在于駱駝科(例如:駱駝、駱馬)中,可經由以標靶抗原免疫駱駝科動物、分離抗原特異性B細胞,和直接從個別B細胞中克隆dAb基因而產生。dAb亦可于細胞培養物中生產。它們的小尺寸、良好的溶解性以及溫度穩定性使得它們特別有利于生理上的應用,適合用于選擇以及親和力成熟。本發明的結合成員可為包含實質上如本文所述的VH或VL結構域的dAb,或包含含有實質上如本文所述的CDR組的VH或VL結構域的dAb。
本文中所用的詞組“實質上如…所述”代表本文中所述的結合成員的VH或VL結構域的相關CDR的特征會與本文中所示的序列的指定區域相同或高度相似。針對一個或多個可變結構域的指定區域使用的表達“高度相似”,意指可以在CDR和/或VH或VL結構域中進行1至約5個(例如:1至4個,包括1至3個,或1或2個,或3個或4個)氨基酸取代。
雙特異性或雙官能性抗體形成第二代單克隆抗體,在其中兩個相異的可變區于相同分子中組合(Holliger and Bohlen 1999Cancer and metastasis rev.18:411-419)。由所述能夠恢復新的效應子功能或將許多分子靶向至腫瘤細胞表面的能力,已證實它們在診斷領域以及治療領域內的應用。使用雙特異性抗體時,它們可為常見的雙特異性抗體(其可以各種方法制成(Holliger et al.(1993b),Current Opinion  Biotechnol 4,446-449),例如:由化學方法制得或從雜合雜交瘤制得),或可為如前文所述的雙特異性抗體片段中的任一種。所述抗體可經由化學方法(Glennie et al.,(1987)J.Immunol.139,2367-2375;Repp et al.,(1995)J.Hemat.377-382)或體細胞方法(Staerz U.D.and Bevan M.J.(1986)PNAS 83;Suresh et al.(1986)Method.Enzymol.121:210-228)制得,同樣可由基因工程技術制備,其使得異源二聚體化作用加速,并因而促進所搜尋的抗體的純化過程(Merchand et al.,1998Nature Biotech.16:677-681)。雙特異性抗體的實例包括那些具有BiTETM技術者,其中可使用具有不同特異性的二種抗體的結合結構域,并通過短的柔性肽直接連接。這樣將二個抗體組合在短的單一多肽鏈上。雙功能性抗體和scFv可在沒有Fc區域的情況下僅使用可變區構建,有可能會降低抗獨特型反應的效用。
雙特異性抗體可構建為完整IgG、雙特異性Fab'2、Fab'PEG、雙功能性抗體或其他雙特異性scFv。再者,二個雙特異性抗體可使用技術領域熟知的例行方法連接在一起以形成四價抗體。
與雙特異性完整抗體相反,雙特異性雙功能性抗體亦可特別有用,因為它們可輕易地建構成且可在E.coli中表達。使用噬菌體展示系統(WO94/13804),可從文庫中輕易地選擇具有適當結合特異性的雙功能性抗體(和許多其他多肽,諸如抗體片段)。假如該雙功能性抗體的一個臂需要保持恒定(例如,具有針對標靶抗原的特異性),則可建立一個文庫,其中另一臂是可變的,并選擇具有適當特異性的抗體。雙特異性完整抗體可經由在Ridgeway等人發表的文獻(1996)(Protein Eng.,9,616-621)中所述的替代性工程方法制得。
技術領域中有各種方法可用于獲得抗標靶抗原的抗體。該抗體可為單克隆抗體,特別是人、鼠科動物、嵌合或人源化來源的單克隆抗體,其可依照熟諳此技術人士所熟知的標準方法制得。
一般而言,在制備單克隆抗體或其功能性片段(特別是鼠科動物來源)的方面,可能參照特別地在手冊“Antibodies”(Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y.,pp.726,1988)中描述的技術,或由Kohler和Milstein(1975,Nature,256:495-497)所述的從雜交瘤制備的技術。
單克隆抗體可從,例如,經A-FN或其含有可被該單克隆抗體識別的表位的片段(例如:包含或由ED-A組成的片段,或ED-A的肽片段)中之一免疫的動物細胞取得。該A-FN(或其片段之一)可特別地根據一般的操作方法,利用基因重組從編碼A-FN(或其片段)的cDNA序列中所含的核酸序列開始,利用肽合成從A-FN和/或其片段的肽序列中所包含的氨基酸序列開始,來加以制造。
例如,單克隆抗體可在親和柱(于其上A-FN或所述含有可被該單克隆抗體識別的表位的片段(例如:包含或由ED-A組成的片段,或ED-A的肽片段)之一已預先被固定在其上)上純化。單克隆抗體可經由層析于蛋白質A和/或蛋白質G上純化,接著使用或不使用離子交換層析,其目的為消除殘留的蛋白質污染物以及其本身中的DNA與LPS,接著使用或不使用Sepharose凝膠上的排阻層析法,其目的為消除因二聚物或其他多聚物的存在而可能產生的凝聚。可同時使用或依續使用所述技術的全體。
抗原結合位點
此術語描述結合至并互補于標靶抗原的全部或部分的分子部分。在抗體分子中,其代表抗體的抗原結合位點,并包含結合至并互補于標靶抗原的全部或部分的抗體部分。當抗原較大時,抗體可能僅結合至該抗原的特定部分,此部分被稱為表位。抗體之抗原結合位點可由一個或多個抗體可變結構域提供。抗體之抗原結合位點可包含抗體輕鏈可變區(VL)和抗體重鏈可變區(VH)。
分離
分離意指一種狀態,其中本發明使用的特異性結合成員或編碼此特異性結合成員的核酸,通常與本發明一致。因此,如本發明的特異性結合成員、VH和/或VL結構區,可(例如)從其天然環境中分離 和/或純化而得,呈實質上純的或均質形式,或在核酸的情況下,呈無或實質上無除編碼具有所需功能的多肽的序列外的其他來源的核酸或基因。分離的成員以及分離的核酸無或實質上無與其天然相關的材料,諸如其他于所述的天然環境中發現的多肽或核酸,或當于體外或體內實施重組DNA技術制備時,于其制備的環境(例如:細胞培養物)中可發現的多肽或核酸。特異性結合成員和核酸可以稀釋劑或佐劑配制,且為實用目的仍是分離的,例如:該成員通常可與明膠或其他載體(若有使用)混合,以涂覆在供免疫分析使用的微滴定板,或當應用于診斷或治療時,可與藥學可接受的載體或稀釋劑混合。特異性結合成員可為天然糖基化的,或經異源真核細胞(例如:CHO或NS0(ECACC 85110503))細胞體系糖基化的,或其可為(例如,假如是于原核細胞中表達而產生)非糖基化的。
包含抗體分子的異源制品亦可用于本發明。例如,此制品可為具有全長重鏈與缺少C端賴氨酸的重鏈,具有各種糖基化程度和/或衍生化氨基酸(諸如N端谷氨酸的環化,以形成焦谷氨酸殘基)的抗體的混合物。
抗原(例如:A-FN、纖維連接蛋白的ED-A)的一個或多個特異性結合成員可藉由使本發明的特異性結合成員文庫與抗原或其片段(例如:包含ED-A或由ED-A組成的片段,或ED-A的肽片段)接觸,并選擇該文庫中能夠與該抗原結合的一個或多個特異性結合成員來獲得。
抗體文庫可利用Iterative Colony Filter Screening(ICFS)篩選。ICFS中,含有編碼多種結合特異性的DNA的細菌生長在液體培養基中,當已達指數生長階段時,將數十億細菌分散在由合適預處理的薄膜濾紙組成的生長支持物上,并培養直到完全匯聚的菌落出現為止。第二捕獲基底(trap substrate)由另一薄膜濾紙(經預先濕潤并以所需要的抗原覆蓋)組成。
接著將該捕獲薄膜濾紙置于含有適當培養基的板上,并以生長薄膜覆蓋,其中被菌落覆蓋的面朝上。將所得到的夾層結構物在室溫培 養約16小時。因此有可能得到擴散狀的抗體片段scFv編碼基因的表達,因而捕獲與存在于該捕獲膜上的抗原特異性結合的片段。接著將該捕獲薄膜以常規用于此目的的比色技術處理以將結合的抗體片段指示出來。
該捕獲濾紙上彩色斑點的位置使得能夠回溯至存在于生長薄膜上并制造被捕捉的抗體片段的對應菌落,收集這樣的菌落并使細菌生長─將數以百萬計的該細菌重復前述步驟而分散在新的培養薄膜上。進行類似的循環直到捕獲薄膜上的陽性信號對應于單一陽性菌落為止,各陽性菌落代表針對篩選中所用抗原的單克隆抗體片段的可能來源。ICFS描述于例如WO0246455。
文庫亦可展示在顆粒或分子復合體(例如:可復制的基因封包,諸如噬菌體(例如:T7)顆粒或其他體外展示系統)上,各粒子或分子復合體含有展示于其上的抗體VH可變結構域的編碼核酸,以及任選地所展示的VL結構域的編碼核酸(如存在的話)。噬菌體展示法描述于WO92/01047和例如:美國專利第US5969108號、第US5565332號、第US5733743號、第US5858657號、第US5871907號、第US5872215號、第US5885793號、第US5962255號、第US6140471號、第US6172197號、第US6225447號、第US6291650號、第US6492160號和第US6521404號。
篩選能夠結合抗原并展示在噬菌體或其他文庫粒子或分子復合體上的結合成員之后,可從展示該被選定的結合成員的噬菌體或其他粒子或分子復合體取得核酸。該核酸可用于后續結合成員或抗體VH或VL可變結構域的制造,其是藉由從帶有取自展示該被選定結合成員的噬菌體或其他粒子或分子復合體的核酸序列的核酸進行表達而得到的。
帶有該被選定結合成員的抗體VH可變結構域的氨基酸序列的抗體VH可變結構域可以分離形式提供,包含這樣的VH結構域的結合成員也可以分離形式提供。
可進一步檢測結合A-FN或纖維連接蛋白的ED-A或其他標靶抗 原或同種型的能力,例如:與抗ED-A抗體F8競爭與A-FN或A-FN的片段(例如:纖維連接蛋白的ED-A)相結合的能力。
本發明使用的特異性結合成員可特異性結合A-FN和/或纖維連接蛋白的ED-A。本發明的特異性結合成員可以與抗ED-A抗體F8(例如:scFv形式)相同或更好的親和力結合A-FN和/或纖維連接蛋白的ED-A。本發明使用的特異性結合成員可以KD為3×10-8M或更好的親和力結合A-FN和/或纖維連接蛋白的ED-A。優選地,本發明使用的特異性結合成員以KD為2×10-8M或更好的親和力結合A-FN和/或纖維連接蛋白的ED-A。更優選地,本發明使用的特異性結合成員以KD為1.7×10-8M或更好的親和力結合A-FN和/或纖維連接蛋白的ED-A。進一步更優選地,本發明使用的特異性結合成員以KD為1.4×10-8M或更好的親和力結合A-FN和/或纖維連接蛋白的ED-A。最優選地,本發明使用的特異性結合成員以KD為3×10-9M或更好的親和力結合A-FN和/或纖維連接蛋白的ED-A。
本發明的特異性結合成員可結合A-FN和/或纖維連接蛋白的ED-A上與抗ED-A抗體F8相同的抗原決定位。
本發明使用的特異性結合成員可能不會顯著結合除了A-FN和/或纖維連接蛋白的ED-A以外的分子。特別是該特異性結合成員可能不會結合纖維連接蛋白的其他同種型,例如纖維連接蛋白的ED-B同種型和/或IIICS同種型。
本文所公開的抗體分子的變體可制造并使用于本發明。在CDR、抗體VH或VL結構域(特別是VH和VL結構域的構架區域)和結合成員的氨基酸序列中進行取代所需的技術是本技術領域中可獲得的。可制造變體序列(帶有可或不可預期對活性具有最小或有益影響的取代)并測試結合A-FN和/或纖維連接蛋白的ED-A的能力,和/或任何其他所希望的性質。
其序列在本文中特別公開的任何VH和VL結構域的可變結構域氨基酸序列變體可如所討論的依據本發明而使用。具體變體可包括一個或多個氨基酸序列改變(alteration)(氨基酸殘基的增加、刪除、 取代和/或插入),可少于約20個改變、少于約15個改變、少于約10個改變或少于約5個改變,可能為5、4、3、2或1個。改變可制造于一個或多個構架區域和/或一個或多個CDR。該改變一般不會造成功能喪失,故包含如此改變的氨基酸序列的特異性結合成員可保留結合A-FN和/或纖維連接蛋白的ED-A的能力。例如,其可能保留與其內未制造改變的特異性結合成員相同的定量結合(例如:如本文所述的檢驗法所測得)。包含如此改變的氨基酸序列的特異性結合成員可具有更好的結合A-FN和/或纖維連接蛋白的ED-A的能力。例如,如本文所提到的,結合ED-A同種型或纖維連接蛋白的ED-A的特異性結合成員可包含如SEQ ID NO:7所示的VH結構域和如SEQ ID NO:8所示的VL結構域,在該VH和/或VL結構域的構架區域之中帶有10個或更少(例如:5、4、3、2或1個)氨基酸取代。這樣的特異性結合成員可以與包含如SEQ ID NO:7所示的VH結構域和如SEQ ID NO:8所示的VL結構域的特異性結合成員相同或實質上相同的親和力結合ED-A同種型或纖維連結蛋白的ED-A,或者以比包含如SEQ ID NO:7所示的VH結構域和如SEQ ID NO:8所示的VL結構域的特異性結合成員更高的親和力結合ED-A同種型或纖維連結蛋白的ED-A。
本發明使用的帶有CDR衍生序列的新穎VH或VL區域可利用一個或多個被選定的VH和/或VL基因的隨機誘變以在整個可變結構域中產生突變而制造。在一些實施例中,于整個可變結構域或CDR組中制造一或兩個氨基酸取代。另一種可使用的方法為定點誘變VH或VL基因的CDR區域。
如前文所述,實質如本文所示的CDR氨基酸序列可作為CDR攜帶在人抗體可變結構域或其主要部分中。實質如本文所示的HCDR3序列代表本發明的實施例,例如其中的每一個可作為HCDR3攜帶在人重鏈可變結構域或其主要部分中。
本發明所用的可變結構域可獲自或衍生自任何種系或重排的人可變結構域,或可為基于已知人可變結構域的共有或真實序列的合成可 變結構域。可變結構域可衍生自非人抗體。本發明使用的CDR序列(例如:CDR3)可利用重組DNA技術導入缺少CDR(例如:CDR3)的可變結構域文庫(repertoire)。例如:Marks等人(1992)描述了制造抗體可變結構域文庫的方法,其中將針對或鄰近可變結構域區域5'端的共有引物(consensus primer)與針對人VH基因的第三構架區域的共有引物一起使用,以提供缺少CDR3的VH可變結構域文庫。Marks等人進一步描述了如何將此文庫與特定抗體的CDR3結合。使用類似技術的情況下,本發明的CDR3衍生序列可與缺少CDR3的VH或VL結構域文庫改組,而經改組的完整VH或VL結構域與同源VL或VH結構域組合以提供本發明使用的結合成員。接著可將該文庫展示于適當宿主系統中(諸如WO92/01047或任何后續的大部分文獻,包括Kay,Winter&McCafferty(1996)的噬菌體系統),以便可篩選適當的結合成員。文庫可由大于104以上的個體成員組成,例如:至少105、至少106、至少107、至少108、至少109或至少1010個成員。
類似地,一個或多個或全部三個CDR可被移植到VH或VL結構域文庫中,然后用來篩選結合A-FN和/或纖維連結蛋白的ED-A的結合成員。
可使用抗體F8的HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一個或多個或抗體F8的HCDR組,和/或可使用抗體F8的LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一個或多個或抗體F8的LCDR組。
類似地,可使用本文所公開的其他VH和VL結構域、CDR組和HCDR組和/或LCDR組。
A-FN和/或纖維連接蛋白的ED-A可用于篩選用來制備供治療IBD的藥物的特異性結合成員(例如:抗體分子)。該篩選可為篩選本文其它處所公開的文庫。
免疫球蛋白可變結構域的主要部分可包含至少該三個CDR區域,以及它們的間插構架區域。該部分亦可包括至少約50%的第一和第四構架區域之一或兩者,該50%為第一構架區域的C端的50%和第四 構架區域的N端的50%。位于該可變結構域主要部分的N端或C端的額外殘基可為一般不與天然存在的可變結構域區域正常相關的那些殘基。例如:由重組DNA技術所制造的本發明的特異性結合成員的構建可能造成導入由連接子編碼的N或C端殘基以促進克隆或其他操作步驟。其他操作步驟包括導入連接子以將本文其他處所公開的可變結構域連接至另外的蛋白質,包括:抗體恒定區域、其他可變結構域(例如在雙功能抗體的生產中)或如本文他處詳盡描述的可檢測/功能性標記。
雖然特異性結合成員可包含一對VH和VL結構域,基于VH或VL結構域序列的單一結合結構域亦可用于本發明中。已知單一免疫球蛋白結構域(特別是VH結構域)能夠以特定方式結合標靶抗原。例如:參見前文對于dAbs的討論。
以單一結合結構域而言,所述結構域可用于篩選互補結構域,其能夠形成可以結合A-FN和/或纖維連接蛋白的ED-A的二結構域結合成員。此可由利用如WO92/01047中所公開的所謂階層式雙重結合方法(hierarchical dual combinatorial approach)的噬菌體展示篩選法實現,其中含有H或L鏈克隆的個別菌落被用來感染編碼另一鏈(L或H)的克隆的完整文庫,并根據諸如所述描述于該參考文獻中的噬菌體展示技術選擇所生成的二鏈結合成員。此技術亦公開于Marks1992。
本發明使用的特異性結合成員可進一步包含抗體恒定區域或其部分,例如人抗體恒定區域或其部分。例如:VL結構域可在其C端連接至包括人Cκ或Cλ鏈的抗體輕鏈恒定結構域(例如:Cλ)。類似地,基于VH結構域的特異性結合成員可在其C端連接至衍生自任何抗體同工型(isotype)(例如:IgG、IgA、IgE和IgM)和任何同工型亞類(特別是IgG1和IgG4)的免疫球蛋白重鏈的全部或部分(例如:CH1結合域)。任何具有所述性質并穩定可變區的合成或其他的恒定區域變異體亦可用于本發明的實施方案中。
本發明使用的特異性結合成員可以用可檢測或功能性標記進行標 記。標記可為任何產生信號或可以被引發產生信號的分子,包括但不限于熒光劑、放射性標記、酶、化學發光劑或光敏劑。因此可藉由檢測熒光或發光、放射活性、酶活性或光吸收度而檢測和/或測量結合。可檢測標記可利用本技術領域中已知的常規化學法連接到本發明使用的抗體。
標記可以通過許多方法產生可藉由外部手段檢測的信號,例如:藉由目測檢查、電磁輻射、熱和化學試劑。該標記亦可結合至另一個結合本發明使用的抗體的特異性結合成員,或結合至支持物。
經標記的特異性結合成員(例如:以可檢測標記標記的scFv)可于體內(in vivo)、離體(ex vivo)或體外(in vitro)診斷上和/或治療上使用。
例如:經放射標記的結合成員(例如:綴合至放射性同位素的結合成員)可使用于放射性診斷和放射性治療中。可綴合至本發明使用的結合成員的放射性同位素包括諸如94mTc、99mTc、186Re、188Re、203Pb、67Ga、68Ga、47Sc、111In、97Ru、62Cu、64Cu、86Y、88Y、90Y、121Sn、161Tb、153Sm、166Ho、105Rh、177Lu、123I、124I、125I、131I、18F、211At和225Ac的同位素。優選地使用諸如18F和124I的正子發射體或諸如99mTc、111In和123I的γ發射體進行診斷應用(例如:用于PET),而諸如131I、90Y和177Lu的β發射體則優選地用于治療應用。諸如211At和225Ac的α發射體亦可用于治療。
例如:經可檢測標記標記的本發明使用的特異性結合成員可用于檢測、診斷或監測人或動物的IBD。
本發明的特異性結合成員可用于制造供診斷IBD的診斷產品。
本發明使用的結合成員和對于病灶中靶細胞發揮殺生物效果、細胞毒性免疫抑制效果或抗炎性效果的分子和針對存在于該病灶的胞外基質組分的抗體之間的綴合物或融合物可使用于本發明中。例如:該綴合分子可為白介素-10。該綴合物可用于治療上,例如:用于治療本文所提及的IBD。
特異性結合成員與殺生物性或細胞毒性分子的融合物或綴合物的 制造和用途描述于例如WO01/62298之中。
本發明使用的特異性結合成員可為下列的綴合物:(i)藉由細胞相互作用對靶細胞發揮抗炎性效果的分子,抗炎性分子,細胞因子(例如:IL-10)以及(ii)纖維連接蛋白的ED-A同種型和/或纖維連接蛋白的ED-A的特異性結合成員。
本發明使用的特異性結合成員可為下列的綴合物:(i)發揮免疫抑制性或抗炎性效果的分子和(ii)纖維連接蛋白的ED-A同種型和/或纖維連接蛋白的ED-A的特異性結合成員。
本發明使用的特異性結合成員優選是下列的綴合物:(i)白介素-10(IL10)和(ii)纖維連接蛋白的ED-A同種型和/或纖維連接蛋白的ED-A的特異性結合成員。這樣的特異性結合成員可用于本文所公開的關于治療IBD的本發明各方面中。
本文還提及下列的綴合物:(i)藉由細胞相互作用對靶細胞發揮殺生物性或細胞毒性效果的分子,或發揮免疫抑制性或抗炎性效果的分子和(ii)纖維連接蛋白的ED-A同種型和/或纖維連接蛋白的ED-A的結合成員。該綴合物優選地包含融合蛋白質,該融合蛋白質包含殺生物性、細胞毒性、免疫抑制性或抗炎性分子以及該結合成員,或者,當該結合成員為雙鏈或多鏈時,該融合蛋白質包含該殺生物性、細胞毒性、免疫抑制性或抗炎性分子以及該結合成員的多肽鏈組分。優選地該結合成員是單鏈多肽,例如:諸如scFv的單鏈抗體分子。
本文所稱的綴合物可以融合蛋白質形式表達。因此,包含免疫抑制性或抗炎性分子以及單鏈Fv抗體分子的融合蛋白可用于本發明中。
該藉由細胞相互作用對靶細胞發揮其效果的免疫抑制性或抗炎性分子,可直接與該靶細胞交互作用、可與靶細胞上的膜結合型受體相互作用或擾亂細胞膜的電化學電位。優選地該分子是IL-10。
優選地綴合至特異性結合成員的所述分子是IL-10。
如下文所詳述,本發明中使用的特異性結合成員優選地是抗體分子或包含抗體的抗原結合位點。該特異性結合成員較適合為單鏈多肽,諸如單鏈抗體。如此得以方便制造包含單鏈抗體和(例如)免疫抑制 性或抗炎性分子(例如:白介素-10或TGFβ)的融合蛋白。抗體的抗原結合位點可藉由將分開的多肽中(例如:在完整的抗體中或在諸如Fab或雙功能抗體的抗體片段中)的抗體VH結構域與抗體VL結構域相締合而提供。特異性結合成員是雙鏈或多鏈分子(分別例如Fab或完整抗體)時,免疫抑制性或抗炎性分子(例如)可綴合為特異性結合成員中有一個或多個多肽鏈的融合多肽。
特異性結合成員可藉由肽鍵的手段與免疫抑制性或抗炎性分子綴合,意即:在包含該分子和該特異性結合成員或其多肽鏈組分的融合多肽中(參見例如Trachsel等人的文獻)。其他用于綴合的手段包括化學綴合,特別是利用雙功能試劑進行交聯(例如:利用DOUBLE-REAGENTSTM Cross-linking Reagents Selection Guide,Pierce)。
還提供了編碼本發明使用的特異性結合成員的分離核酸。核酸可包括DNA和/或RNA。核酸可編碼CDR或CDR組或VH結構域或VL結構域或抗體的抗原結合位點或抗體分子,例如:如前文定義的scFv或IgG(例如:IgG1)。核苷酸序列可編碼本文所公開的VH和/或VL結構域。
本文進一步詳述了質粒、載體、轉錄或表達盒形式的構建體,其包含至少一種前文所述的多核苷酸。
還提供了包含一或多種如前述的構建體的重組宿主細胞。描述了編碼任何CDR或CDR組或VH結構域或VL結構域或抗體之抗原結合位點或抗體分子(例如所提供的scFv或IgG1或IgG4),如制造所編碼的產物的方法中,該方法包含從編碼核酸進行表達。表達可藉由在適當的條件下培養含有該核酸的重組宿主細胞而達成。在藉由表達而制造之后,VH或VL結構域或特異性結合成員可利用合適的技術進行分離和/或純化,接著在適當時使用。
核酸可包含DNA或RNA,并可為完整或部分人工合成的。提及如本文所示的核苷酸序列時,包括帶有具體指明的序列的DNA分子,并包括帶有具體指明的序列的RNA分子(其中U取代T,除非上下 文另有要求)。
還描述了一種制造抗體VH可變結構域的方法,該方法包括從編碼核酸進行表達。該方法可包含將宿主細胞培養在用于制造該抗體VH可變結構域的條件下。
制造方法可包含分離和/或純化產物的步驟。制造方法可包含將產物配制成包括至少一種額外組分(諸如醫藥上可接受的賦形劑)的組合物。
用于在多種不同宿主細胞中克隆和表達多肽的系統是熟知的。適當的宿主細胞包括細菌、哺乳類細胞、植物細胞、絲狀真菌、酵母和桿狀病毒系統以及轉基因植物和動物。在原核細胞中表達抗體和抗體片段的技術在技術領域中已確立。回顧文獻參見例如Plückthun(1991),Bio/Technology 9:545-551。常見的細菌宿主為E.coli。
在培養的真核細胞中表達亦為本技術領域中熟練技術人員可用作制造特異性結合成員的選擇,例如Chadd等人的文獻(2001)(Current Opinion in Biotechnology 12:188-194);Andersen等人的文獻(2002)(Current Opinion in Biotechnology 13:117);Larrick&Thomas(2001)(Current Opinion in Biotechnology 12:411-418)。本技術領域中可用來表達異源多肽的哺乳類細胞系包括中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary(CHO))細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞(baby hamster kidney cell)、NS0小鼠黑色素瘤細胞、YB2/0大鼠骨髓瘤細胞、人胚腎細胞、人胚視網膜細胞和多種其他細胞。
可選擇或構建含有適當調節序列的合適載體,該適當調節序列包括啟動子序列、終止子序列、聚腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因和適用的其他序列。載體可為質粒(例如:噬菌粒)或適用的病毒(例如:噬菌體)。更進一步的細節參見,例如:Sambrook&Russell(2001)(Molecular Cloning:a Laboratory Manual:3rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press)。許多用于操縱核酸(例如:核酸構建體的制備、誘變、測序、將DNA導入細胞和基因表達)與分析蛋白質的已知技術和實驗流程細節詳述于Ausubel等人的文獻(1999) (4th eds.,Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons)。
宿主細胞可含有如本文所述的核酸。該宿主細胞可是體外的,并且可以處于培養物中。該宿主細胞可以是體內的。宿主細胞的體內存在使得本發明使用的結合成員能夠細胞內表達為“內體(intrabody)”或細胞內抗體(intracellular antibody)。內體可用于基因治療。
本文亦描述一種包含將本文所公開的核酸導入宿主細胞的方法。該導入作用可利用任何可供利用的技術。以真核細胞來說,合適的技術可包括磷酸鈣轉染法、DEAE-葡聚糖法、電穿孔法、脂質體介導的轉染法和利用反轉錄病毒或其他病毒(例如:牛痘病毒,或以昆蟲細胞而言則包括桿狀病毒)的轉導法。將核酸導入宿主細胞(特別是真核細胞)可使用病毒或基于質粒的系統。該質粒系統可保持為游離于體外形式的或可合并入宿主細胞或并入人工染色體。合并作用可為一個或多個基因拷貝在單一或多個基因座的隨機或靶向整合。以細菌細胞而言,合適的技術可包括氯化鈣轉化法、電穿孔法和利用噬菌體的轉染法。
在導入作用之后可接著引發或允許該核酸表達,例如:藉由將宿主細胞培養在表達該基因的條件下。所表達產物的純化可藉由本技術領域中熟練技術者已知的方法實現。
核酸可嵌入宿主細胞的基因組(例如:染色體)。可藉由根據標準技術納入促進與基因組重組的序列而促進整合。
本文亦描述一種在表達系統中利用前文說明的構建體表達如前述的特異性結合成員或多肽的方法。
本發明使用的特異性結合成員被設計用于診斷或治療人或動物個體(例如:人)的方法。本發明使用的特異性結合成員可用于診斷或治療IBD。
因此,本發明提供了包含施予如所述的特異性結合成員或包含該特異性結合成員的藥物組合物的治療方法,和該特異性結合成員用于 制造供施予的藥物的用途,例如:制造藥物或藥物組合物的方法,其包含將特異性結合成員與醫藥上可接受的賦形劑一起配制。醫藥上可接受的載體是眾所周知的,并且可由本技術領域中的熟練技術人員根據所選活性化合物的性質和施予模式進行調整。
本發明使用的特異性結合成員通常會以藥物組合物的形式施予,其中除該特異性結合成員以外還可包含至少一種組分。因此,本文所述并根據本發明所用的藥物組合物中,除活性成分外,還可包含醫藥上可接受的賦形劑、載體、緩沖劑、穩定劑或本領域熟練技術人員熟知的其它物質。該物質應為無毒的且不應干擾活性成分的功效。載體或其他物質的確切性質將視施予的途徑而定,該途徑可為口服、吸入或注射(例如:靜脈注射)。
用于口服施予的藥物組合物(諸如例如納米小體(nanobody)等)亦涵蓋在本發明中。這樣的口服配方可為片劑、膠囊、粉劑、液體或半固體形式。片劑可包含諸如明膠的固體載劑或佐劑。液體藥物組合物一般包含諸如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油的液體載體。生理鹽水溶液、葡萄糖或其他糖類溶液或諸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇的二元醇類可被包括在內。
以靜脈注射或注射于患部而言,活性成分的形式可以是胃腸外可接受的水溶液,其不含熱源(pyrogen-free)并具有適當的pH值、等張性和穩定性。本技術領域中的那些相關技術可用來制備合適的溶液,使用例如:諸如Sodium Chloride Injection、Ringer's Injection、Lactated Ringer's Injection的等張媒液。如有需要,可使用防腐劑、穩定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其他添加劑。醫藥配方的許多制備方法為本技術領域中熟練技術人員所已知。參見例如Robinson ed.,Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
視所治療的病況而定,組合物可單獨進行,或與其他治療一起同時或依序使用或作為與其他治療劑的組合制劑而施予。
本發明使用的特異性結合成員可與額外藥品組分結合用作組合療 法的部分。組合治療可用來提供顯著的協同效應,特別是將本發明使用的特異性結合成員與一或多種其他藥品組合。本發明使用的特異性結合成員可同時或依序或作為與其他治療劑的組合制劑而施予,用來治療一或多種本文所列的病況。
例如:本發明使用的特異性結合成員可與已有的治療劑組合使用來治療IBD。
本發明使用的特異性結合成員和一種或多種前述的額外藥品組分可用于制造藥物。該藥物可分別或組合施予個體,據此可為包含特異性結合成員和額外組分的組合制劑或分開制劑形式。分開制劑有助于分開和依序施予或同時施予,并容許組分的施予經由不同途徑(例如:口服和胃腸外施予)進行。
依據本發明,所提供的組合物可施予哺乳類。可以“治療有效劑量”施予,此劑量足以對患者展現益處。該益處可為至少改善至少一種癥狀。因此,“IBD的治療”代表改善至少一種癥狀。施予的真實劑量和施予的頻率與時程,將依治療的性質和嚴重性、所治療的特定哺乳類動物、個別患者的臨床病況、病癥的起因、遞送組合物的位置、特異性結合成員的類型、施予的方法、施予的方案和醫務人員已知的其它因素而定。治療處方(例如:劑量等的決定)是在一般從業者和其他醫生的職責范圍內,且可視癥狀的嚴重性和/或所欲治療的疾病的進程而定。抗體的合適劑量為本技術領域所熟知(Ledermann et al.(1991)Int.J.Cancer 47:659-664;and Bagshawe et al.(1991)Antibody,Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4:915-922)。當適用于所施予的藥物類型時,可使用本文或在Physician's Desk Reference(2003)中所指出的具體劑量。本發明使用的特異性結合成員的治療有效劑量或合適劑量可藉由比較其體外活性和在動物模式的體內活性而確定。已知小鼠和其他試驗動物至人的有效劑量的推斷方法。精確劑量將視數個因素而定,包括:抗體是用于診斷、預防還是治療,所欲治療的范圍大小和位置,確切的抗體性質(例如:完整抗體、片段或雙功能抗體),以及附著至抗體的任何可檢測標記或其他 分子的性質。一般的抗體劑量對于全身性應用會在100μg至1g范圍內,局部應用則在1μg至1mg范圍內。初始可施予較高的載入劑量,接著施予一個或多個較低劑量。抗體可為完整抗體,例如:IgG1或IgG4同工型。這是用于成年患者的單一治療的劑量,其可依比例調整而用于孩童和嬰幼兒,亦可依其他抗體形式的分子量比例調整。治療可依醫師判斷以每日一次、每周兩次、每周或每月的間隔重復。治療于皮下施予的情況可為每二至四周一次,而于靜脈施予則為每四到八周一次。在本發明的一些實施例中,治療可為周期性的,且兩次施予之間的間隔是約二周或更久,例如:約三周或更久、約四周或更久或約一個月一次。在本發明的其他實施例中,可在手術前和/或手術后給予治療,并可直接施予或施用至手術治療的解剖位置。
炎性腸病(IBD)
炎性腸病是一群影響結腸和小腸的炎性病況。IBD的主要類型為克羅恩氏病(Crohn’s disease,CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC),而其他類型的IBD包括膠原性結腸炎(collagenous colitis)、淋巴細胞性結腸炎(lymphocytic colitis)、缺血性結腸炎(ischaemic colitis)、分流性結腸炎(diversion colitis)、貝賽特氏病(disease)和未定型結腸炎(indeterminate colitis)。CD可影響胃腸道的任何部分,然而UC通常僅局限在結腸和直腸。
本文中所稱的IBD可為CD、UC、膠原性結腸炎、淋巴細胞性結腸炎、缺血性結腸炎、分流性結腸炎、貝賽特氏病或未定型結腸炎。特別是本文中所使用的術語CD、UC、膠原性結腸炎、淋巴細胞性結腸炎、缺血性結腸炎、分流性結腸炎、貝賽特氏病和未定型結腸炎,可分別指稱活躍性CD、活躍性UC、活躍性膠原性結腸炎、活躍性淋巴細胞性結腸炎、活躍性缺血性結腸炎、活躍性分流性結腸炎、活躍性貝賽特氏病和活躍性未定型結腸炎。在一實施例中,該IBD可為CD或UC。在另一實施例中,該IBD可為CD、膠原性結腸炎、淋巴細胞性結腸炎、缺血性結腸炎、分流性結腸炎、貝賽特氏病或未定型 結腸炎。在進一步實施例中,該IBD不為UC。該IBD可為一種通常不局限于結腸和直腸發炎的IBD,諸如CD。該IBD可為一種不僅止影響結腸內膜的IBD。在一個優選實施例中,該IBD是CD。最優選地,該IBD是活躍性CD。
根據包括下列實驗范例的本公開文件,本領域熟練技術人員將能明白了解本發明的更多方面和實施例。
所有在此說明書中提及的文件均以引用方式將所述的全文并入本文中。
本文中所使用的“和/或”被視為所指定的兩個特征或組份中的每一個,其中具有或不具有另一個。例如“A和/或B”被視為明確的揭示(i)A、(ii)B和(iii)A與B,就如同其中每一個在此被單獨地表述一樣。
除非另有說明,否則前文所載的特征的描述和定義并不局限于任何本發明的特定方面或實施例,并同等的適用于所有所述的方面和實施例。
本發明的某些方面和實施例現在將以實例方式說明并參照前文所述的附圖。
實驗
材料和方法
小鼠IBD模型
與施予DSS相關的IBD小鼠模型為技術領域中所已知。適當小鼠模型的描述亦見于例如:Okayasu等人的文章(1990)(Gastroenterology,98,694-702)。
本文所述的實驗是藉由在飲用水中加入3%葡聚糖硫酸鈉(DSS)(MP BioMedicals)7天,接著給予正常飲用水3至5天,而在C57BL/6小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)中引發結腸炎。在本研究的全程中均對對照組小鼠給予標準水。利用第3至5天的潛血檢測以及每日的體重變化作為監測小鼠疾病引發/進展的證明。于停止在 水中添加DSS后3至5天的不同時間處死小鼠,以評估F8-IL-10的靶向、區域定位和藥理學效果。
125I-F8/IL10放射性碘標定、純化、鑒定和給藥溶液制備
125I-F8/IL10是利用琥珀酰亞胺基-碘苯甲酸酯(SIB)(Zalutsky&Narula(1988)Cancer Research,48,1446-1450;Zalutsky&Narula(1987)Appl.Radiat.Isot.38,1051-1055;Cheng,et al.(2002)J.Med.Chem.45,3048-3056)制備。簡言之,將一等分的碘-125(20μL~2.0mCi)(Perkin Elmer,Waltham,MA)與2.5μg N-琥珀酰亞胺基-3-(三-正丁基錫烷基)苯甲酸酯(C23H35NO4Sn;MW=508.23,由Texas Biochemicals,Inc.College Station,TX合成)和10μg NCS(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)作為氧化劑在50μL的含有1.5%醋酸(v:v)的甲醇(均購自Sigma-Aldrich)中反應。在室溫培養15分鐘后,添加10μg亞硫酸鈉(還原劑)(Sigma-Aldrich)并在室溫額外培養5分鐘,以將反應溶液中剩余的氧化劑淬滅。于室溫在pH 8.0培養20分鐘,以將經125I標記的SIB綴合至F8-IL10抗體(約0.2mg,起始摩爾比是中間物比抗體約為2.5:1)。將經過放射標記的產物(125I-F8/IL10)利用經預平衡的PD-10管柱(GE Healthcare,Little Chalfont,Buckinghamshire,UK)(利用牛血清白蛋白使柱上可能的非特異性蛋白結合位點飽和,接著以至少三倍柱體積的PBS沖洗柱)純化,洗脫于PBS中。所得的放射化學產率約為30%。
分別以尺寸排阻層析法(size exclusion chromatogram(SEC))和EDA-親和柱鑒定125I-F8/IL10的放射化學純度(radiochemical purity(RCP))和生物活性。在SEC分析方面,將約1μCi的125I-F8/IL10產物溶液注射至配備有粒徑排阻柱(G3000SWxl,TOSOH Biosciences,Tokyo,Japan)的HPLC(Agilent 1100,配備有在線放射活性檢測器)中,并以25mM磷酸鹽緩沖液、0.15M NaCl、pH 6.8的流動溶劑以每分鐘1mL的流速洗脫。比較125I-F8/IL10在放射測量層析中的滯留時間與參考F8/IL10在UV(280nm)層析中的滯留時 間以確認其身份。125I-F8/IL10的RCP大于99%,放射性比活性(radioactive specific activity)約為4.5mCi/mg。
通過EDA親和柱檢測法測定125I-F8-IL10的生物活性。簡言之,將一等分(約1μCi)125I-F8/IL10上樣至經預平衡的EDA親和柱(含有250μL EDA樹脂,藉由以2mL BSA(2mg/mL于PBS中)封閉非特異性結合位點、接著以8mL PBS洗滌柱而實施預平衡)。以6mL的BSA(2mg/mL于PBS中)洗滌該親和柱并以級分形式收集洗出液。在γ計數器中測量所收集的洗出液的放射活性和該親和柱上所殘留的放射活性。計算殘留在EDA-樹脂柱的放射活性對總上樣放射活性的百分比。以125I-F8/IL10而言,殘留在親和柱上的放射活性百分比為64%。
125I-F8/IL10與未經標記的F8/IL10(F8/IL10儲存溶液)以及制劑緩沖液混合至所需的最終濃度,制備用于PK和組織分布研究的給藥溶液。受試品(test article)溶液是在給藥當日制備,并在施予動物之前使其達到室溫。
125I-F8/IL10在IBD小鼠模型中的生物分布和區域定位至結腸
在施藥(開始DSS處理后的第5至7天)之前約2至4天,將未經或經DSS處理的小鼠均以碘化鉀(KI)水(20mM)處理,以阻斷甲狀腺對在體內產生的任何潛在未結合的游離I-125。在開始DSS處理后的第9天,經由靜脈(IV)注射施予單劑125I-F8/IL10。每組的劑量和放射活性說明如下:
i)第0組-每只小鼠的大致劑量:5mg/kg
第0組-每只小鼠的大致放射活性:7.5μCi(比活性75uCi/mg)。
ii)第1組-每只小鼠的大致劑量:5mg/kg
第1組-每只小鼠的大致放射活性:10μCi(比活性100uCi/mg)。
iii)第2組-每只小鼠的大致劑量:0.15mg/kg,
第2組-每只小鼠的大致放射活性:12μCi(比活性4490uCi/mg)。
分別在第5分鐘、第1、3、6、24、48和96小時將小鼠亞組進行采血和收集不同組織。血液樣本是藉由心臟穿刺或眼后采血收集至血 清分離收集管。藉由將血液樣本在10,000g離心5分鐘收集血清樣本。組織收集方面,則是處死動物,并在采集血液樣本和全身性灌流之后立刻收集感興趣的組織。全身性血液灌流是藉由在約10分鐘期間施予約20mL的肝素-PBS(每mL 25單位)而實施。收集并稱重感興趣的組織,包括:腦、腸系膜淋巴結、皮膚、脂肪、大腿骨骼肌、肺、心、脾、肝、胃、小腸、大腸和腎。將GI中的內容物移除。直接以γ計數器測量組織樣本中的放射活性(以cpm表達的總計數)。
患病和健康小鼠的結腸放射自顯影
在來自第0組和第2組小鼠的結腸進行結腸放射自顯影(radio-autography)。收集結腸、清除所述的內容物并將組織暴露于放射性磷成像屏(phosphor-imaging screen)(Molecular Dynamics)24小時,并經由Storm 860成像。結果顯示于圖2。第1道:注射6小時之后,收集自第0組(健康小鼠)的結腸;第2道:注射6小時之后,收集自第2組(經DSS處理的小鼠)的結腸;第3道:注射24小時之后,收集自第0組(健康小鼠)的結腸;第4道:注射24小時之后,收集自第2組(經DSS處理的小鼠)的結腸。在經DSS處理的小鼠中沿著結腸可觀察到塊狀的125I-F8/IL10定位,在正常小鼠中則未能觀察到,此結果與本模型中不規則的結腸發炎和相關的靶EDA表達模式相符。
測定血清和組織中放射活性當量濃度與藥物動力學計算
125I-F8/IL10的血清當量濃度(ng eq./g)以所測得的TCA(三氯乙酸)可沉淀性(與蛋白質相關)放射活性為基礎進行估算。為了進行TCA沉淀作用,將等分量(50μL)的血清樣本與50μL小鼠血清混合,接著添加100μL的20%TCA溶液。將樣本混合物在10,000g旋轉5分鐘以沉淀蛋白質。測定上清液中的總體放射活性和TCA可溶性放射活性。利用給定樣本中的TCA可沉淀性放射活性(cpm)、給藥溶液的比活性(每mg蛋白質的TCA可沉淀性cpm),以及采樣 (tS)與給藥溶液(tD)測量的日期,以下列方程式計算給定樣本中受試品的當量濃度(ng eq./mL):[TCA可沉淀性cpm/EXP(-0.693/60.2*(tS-td))]/[比活性(以cpm/mg表示)*樣本體積(以mL表示)]。
125I-F8/IL10在組織中的當量濃度(ng eq./g)定量是以在樣本中測得的總體放射活性和校正125I的物理性衰退半衰期后給藥溶液的比活度為基礎,利用下列方程式計算:[樣本cpm/EXP(-0.693/60.2*(tS-tD))]/[比活性(以cpm/mg表示)*樣本重量(以mg表示)]。組織樣本沒有進行勻漿化作用或TCA沉淀作用。除了放射活性當量濃度(血清為ng eq./mL,組織為ne eq./g)之外,還計算血清和感興趣組織每克的注射劑量百分比(%ID/g)和/或注射劑量百分比(%ID)。
在注射后6小時(圖3A)、24小時(圖3B)和96小時(圖3C),測定正常小鼠(第0組)和經DSS處理小鼠(第1組)中125I-F8/IL10的生物分布。
利用受測時間點的平均血清或組織濃度計算PK參數。使用藥物動力學軟件包WinNonlin(第5.1版,Pharsight)的非區室數據分析模塊。利用線性梯形法(linear trapezoidal method)計算濃度對時間曲線下的面積(AUC)。
IBD小鼠模型中F8-IL10治療性處理對血清細胞因子量的效用
既已知IL-10會降低促炎細胞因子,我們測試在IBD小鼠模型中施予F8-IL10是否會影響此模型中的血清細胞因子反應。在開始DSS處理后第3、6和9天,靜脈注射施予每只小鼠200μg的F8-IL10或對照組小型免疫蛋白(small Immune Protein(F8-SIP))(n=10只小鼠/組)。此給藥方案與膠原蛋白引發的關節炎模型中的有效方案相同(Schwager K,et al.Arthritis Research and Therapy,(2009)11:R142)。對照組包括未患病組(一般水)和未經治療的患病組(n=10只小鼠/組)。在開始DSS處理之后的第10天,收集血液并以如前文針對定位研究所述的方式取得血清。利用MSD技術平臺和小鼠7plex  MSD試劑盒,根據制造商的說明書評估血清中IL-1b、IL-12p40、IFNg、IL-6、KC、IL-10和TNFa的量(Mesoscale Discovery,Gaithersburg,MD)。圖4和5中細胞因子水平表示為每ml血清中有多少pg蛋白質。
EDA表達的人組織染色
以免疫組織化學分析OCT包埋的冷凍結腸組織樣本,樣本是來自患有潰瘍性結腸炎的60歲女性患者和患有克羅恩氏病(Crohn’s disease)的42歲男性患者。兩個樣本均以SIP形式的F8抗體和馮維勒布蘭德因子(von Willebrand factor)進行探測。
此外,來自患有克羅恩氏病或潰瘍性腸炎的相同患者(n=3克羅恩氏病患者和n=5UC患者)的患部和非患部冷凍活檢樣本是自Analytical Biological Services(Wilmington,DE)取得的。將冷凍樣本置于干冰上以避免融化,將其包埋于充滿O.C.T.化合物(Tissue-Tek#4583)的Cryomolds標準模具(Tissue-Tek 4557)中并在經過干冰冷卻的異戊烷中快速冷凍。將組織塊以Leica CM1850冷凍切片機切片為4微米,將切片放置于玻片上并儲存于-80℃直到進行免疫組織化學染色(IHC)為止。開始IHC時,將組織浸入冷的(-20F)甲醇(Fisher Scientific A412P-4)中以除去儲存中可能形成的任何水分,并在室溫風干20分鐘。接著將組織浸入冷的(-20F)丙酮(ACROS CAS#67-64-1)10分鐘,并在室溫風干10分鐘。
以適當的Ventana條形碼標記組織玻片,并將其置入Ventana Discovery XT進行Fibronectin F8SIP或KSF SIP(對照組抗體)IHC。將內源性生物素以Ventana S Block(Ventana 760-4212)中的5%正常小鼠血清(Jackson Immuno Research 015-000-120)封閉20分鐘,并以Ventana Biotin Blocking kit(Ventana 760-050)封閉8分鐘。將纖維連接蛋白F8SIP或KSF以1:200濃度(每片玻片100ul)稀釋在Dako抗體稀釋液(S0908)(Dako North America,Carpinteria,CA)中,并孵育40分鐘。在完成該輪程序前,將玻片以蘇木色素 (hematoxylin)和藍色試劑進行負染色(各4分鐘)。將玻片取出并置入Ventana Symphony,以進行接下來的脫水和封片。IHC的代表性圖像顯示于圖7。來自潰瘍性腸炎患者UH0501-34(上)和克羅恩氏病患者UH0405-09(下)的非患部(左)和患部(右)組織樣本的IHC。
結果
結腸放射自顯影
圖2顯示非患病小鼠(水)(第1和3泳道)或患病小鼠(經DSS處理)(第2和4泳道)的結腸在施予經放射標記的F8-IL10后第6小時(第1和2泳道)或第24小時(第3和4泳道)的放射自顯影。此結果顯示F8-IL10在發炎結腸中的累積確實比正常結腸多。F8-IL10在患病結腸部位的斑塊狀外觀,與此模型中沿結腸長度所觀察到的發炎和EDA表達水平的多變性相符合,進一步支持F8-IL10會區域定位于發炎處的理論。
125I-F8-IL10在患病小鼠和健康小鼠中的生物分布
圖3顯示患病(DSS)小鼠與正常(水)小鼠比較,125I-F8-IL10在第6、24和96小時時間點在結腸和腸系膜淋巴結(L.N.)中的積累。相似于圖2,所述數據顯示在經DSS處理的小鼠中,F8-IL10會靶向至結腸和相關聯的淋巴結。從所述研究亦可看出,血清半衰期測定為約3.5小時,而結腸中F8-IL10的半衰期則為約35小時;提高10倍代表了組織持久性增強。此結果表明,在結腸發炎期間,F8-IL10不僅靶向至結腸和腸系膜淋巴結,而且一旦抵達后,其相較于在循環中亦滯留更久。總結來說,所述數據代表在結腸發炎的情況下(例如人的克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎),F8-IL10傾向于靶向至并滯留于所述位置。
來自患病小鼠和健康小鼠的血清中的細胞因子量
圖4顯示相較于對照組,以治療形式施予F8-IL10使得炎性細胞因子、IL-1β、IL12p40、IFNγ和IL-6的血清水平顯著降低。
圖5顯示相較于對照組,以治療形式施予F8-IL10不會造成TNF-α和角質細胞衍生趨化因子(KC)升高,而會造成IL-10水平升高。DSS模型中圖4的細胞因子水平的升高與在結腸中該病的誘導有關。圖4所述炎性細胞因子的下降與IL-10的升高均與IL-10的已知生物作用一致(Abbas A,Lichtman A,Pober J.,1994,Cellular and Molecular Immunology.2nd Ed.Philadelphia:W.B.Saunders Company;Delves P,Roitt I(eds),1998,Encyclopedia of Immunology,2nd Ed.San Diego:Academic Press)。因此,F8-IL10藉由降低IBD中與發炎作用和病理相關的細胞因子,證實了在此IBD模型中的藥理學活性。因為已知所述促炎細胞因子在IBD患者體內會被上調,因此經由施予F8-IL10而將所述細胞因子下調揭示了F8-IL10對于在體內治療IBD可能是有益的。尤其是已知CD患者內干擾素γ和IL-12p70會被上調,本文所公開的數據表明施予F8-IL10很可能在體內治療CD中特別有用。
免疫組織化學染色
圖6顯示F8SIP抗體會將潰瘍性結腸炎患者的新生血管染色,但不會將正常血管染色。(馮維勒布蘭德因子常規被用作為正常血管的標記。)
圖7顯示克羅恩氏病或UC配對活檢組織樣本,經由EDA免疫組織化學染色的代表性圖像。箭頭指出每張圖像中的血管。患部血管周圍的染色強度較來自相同患者的非患部樣本高。此結果表明在所述人類疾病情形下EDA表達提高可造成更多地靶向至結腸中發炎區域。總結來說,在鼠類IBD模型中以F8-IL10觀察到的結腸靶向分布與血清細胞因子降低,以及在人克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎結腸組織中血管周圍的EDA表達增加,共同表明施予F8-IL10可靶向并積極影響患有IBD的患者。
本申請所公開的序列
SEQ ID NO:1(F8抗體VH結構域CDR1)
LFT
SEQ ID NO:2(F8抗體VH結構域CDR2)
SGSGGS
SEQ ID NO:3(F8抗體VH結構域CDR3)
STHLYL
SEQ ID NO:4(F8抗體VL結構域CDR1)
MPF
SEQ ID NO:5(F8抗體VL結構域CDR2)
GASSRAT
SEQ ID NO:6(F8抗體VL結構域CDR3)
MRGRPP
SEQ ID NO:7(F8抗體VH結構域)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:8(F8抗體VL結構域)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:9(F8抗體VH結構域和VL結構域之間的連接子)
GGSGG
SEQ ID NO:10(F8抗體的VL結構域和IL-10之間的連接子)
SSSSGSSSSGSSSSG
SEQ ID NO:1 1(人IL-10)
SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN
SEQ ID NO:12(F8抗體)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGSGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:13(F8-IL10)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGSGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN

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炎性腸病 有關 抗原
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