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用于檢測輔酶Q10的方法和試劑盒.pdf

摘要
申請專利號:

CN201380021300.1

申請日:

2013.03.01

公開號:

CN104245599A

公開日:

2014.12.24

當前法律狀態:

實審

有效性:

審中

法律詳情: 實質審查的生效IPC(主分類):C02F 3/00申請日:20130301|||公開
IPC分類號: C02F3/00 主分類號: C02F3/00
申請人: 博格有限責任公司
發明人: N·N·坦納; R·薩蘭加拉簡; N·R·納萊恩; S·欒
地址: 美國田納西州
優先權: 2012.03.02 US 61/606,019
專利代理機構: 北京市金杜律師事務所 11256 代理人: 陳文平;徐志明
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201380021300.1

授權公告號:

|||

法律狀態公告日:

2015.04.01|||2014.12.24

法律狀態類型:

實質審查的生效|||公開

摘要

本發明提供了易于適應于高通量篩選方法的用于快速和定量提取和檢測樣品中輔酶Q10的方法。本發明還提供了用于實施本發明的方法的試劑和試劑盒。

權利要求書

1.  一種用于測定樣品中輔酶Q10(CoQ10)的量的方法,所述方法包括:
向所述樣品中加入第一提取緩沖液和第二提取緩沖液,其導致所述樣品的相分離;和光譜學地分析所述第二提取層來測定CoQ10的量。

2.
  一種用于測定樣品中CoQ10的量的方法,所述方法包括:
向所述樣品中加入第一提取緩沖液和第二提取緩沖液;
混合所述樣品;和
分析所述第二提取層以測定CoQ10的量,其中所述第一提取緩沖液和第二提取緩沖液的單次提取導致比使用單獨甲醇的提取檢測到至少2倍的CoQ10量。

3.
  一種用于測定樣品中CoQ10的量的方法,所述方法包括:
向所述樣品中加入第一提取緩沖液;
加熱并混合所述樣品;
向所述樣品中加入第二提取緩沖液,其導致所述樣品的相分離;
加熱并混合所述樣品;
冷卻所述樣品至環境溫度;及
分析所述第二提取緩沖液層以測定樣品中CoQ10的量。

4.
  一種用于測定樣品中CoQ10的量的方法,所述方法包括:
向所述樣品中加入第一提取緩沖液;
加熱并混合所述樣品;
向所述樣品中加入第二提取緩沖液,其導致所述樣品的相分離;
加熱并混合所述樣品;
冷卻所述樣品至環境溫度;及
通過光譜分析對第二提取緩沖液層進行光譜學分析,以測定樣品中CoQ10的量,其中用提取緩沖液的單次提取導致比使用單獨甲醇 提取隨后是液相色譜/質譜/質譜(LC/MS/MS)提取到至少2倍的CoQ10量。

5.
  如權利要求1至3中任一項所述的方法,其中在樣品中檢測到的CoQ10的量是通過光譜分析法光譜學地測定的。

6.
  如權利要求1至3中任一項所述的方法,其中CoQ10的量用LC/MS/MS檢測。

7.
  如權利要求2或4中任一項所述的方法,其中所述使用第一提取緩沖液和第二提取緩沖液提取的CoQ10的量光譜學地測定,和用單獨甲醇提取檢測的CoQ10的量使用LC/MS/MS測定。

8.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述方法是高通量篩選分析方法的部分。

9.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中整個方法通過自動化完成。

10.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中整個方法在短的時間段中完成。

11.
  如權利要求1、3-4和7-10中任一項所述的方法,其中與使用單獨甲醇提取隨后LC/MS/MS的CoQ10檢測而檢測到的CoQ10的總量相比,所述樣品使用第一提取緩沖液和第二提取緩沖液提取并且CoQ10的量光譜學地測定,在樣品中檢測到的CoQ10的總量至少為2倍。

12.
  如權利要求11所述的方法,其中與使用單獨甲醇提取隨后LC/MS/MS的CoQ10檢測而檢測到的量相比,所述樣品使用第一提取緩沖液和第二提取緩沖液提取并且CoQ10的量光譜學地測定,在樣品中檢測到的CoQ10的總量為至少5倍。

13.
  如權利要求11所述的方法,其中與使用單獨甲醇提取隨后LC/MS/MS的CoQ10檢測而檢測到的量相比,所述樣品使用第一提取緩沖液和第二提取緩沖液提取并且CoQ10的量光譜學地測定,在樣品中檢測到的CoQ10的總量為至少10倍。

14.
  如權利要求11所述的方法,其中與使用單獨甲醇提取隨后LC/MS/MS的CoQ10檢測而檢測到的量相比,所述樣品使用第一提取緩沖液和第二提取緩沖液提取并且CoQ10的量光譜學地測定,在樣品中檢測到的CoQ10的總量為至少15倍。

15.
  如權利要求11所述的方法,其中與使用單獨甲醇提取隨后LC/MS/MS的CoQ10檢測而檢測到的量相比,所述樣品使用第一提取緩沖液和第二提取緩沖液提取并且CoQ10的量光譜學地測定,在樣品中檢測到的CoQ10的總量為至少25倍。

16.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第二提取緩沖液包含非極性溶劑。

17.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第二提取緩沖液包含有機溶劑。

18.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第二提取緩沖液包含選自于苯、甲苯、二甲苯、己烷、庚烷、辛烷、環己烷、1,4-二氧六烷、氯仿、二乙醚、二異丙醚和二異丁基醚、四氯化碳、二甲基甲酰胺(DMF)、氯甲烷和二氯甲烷的溶劑。

19.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第二提取緩沖液包含烷烴。

20.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第二提取緩沖液包含己烷。

21.
  根據權利要求1-15和17中任一項所述的方法,其中所述第二提取緩沖液包含乙腈。

22.
  根據權利要求1-15和17中任一項所述的方法,其中所述第二提取緩沖液包含異丙醇。

23.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第一提取緩沖液包含極性質子溶劑。

24.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第一提取緩沖液包含有機溶劑。

25.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第一提取緩沖液包含選自于甲酸、正丁醇、異丙醇、正丙醇,乙醇、甲醇、乙酸、三氯乙酸(TCA)和水的溶劑。

26.
  如權利要求25所述的方法,其中所述溶劑包含醇。

27.
  如權利要求26所述的方法,其中所述醇是甲醇。

28.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第一提取緩沖液包含表面活性劑。

29.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第一提取緩沖液包含去垢劑。

30.
  如權利要求29所述的方法,其中所述去垢劑是溫和的去垢劑。

31.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第一提取緩沖液是水性溶液。

32.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第一提取緩沖液包含類固醇酸。

33.
  如權利要求32所述的方法,其中所述類固醇酸是膽汁酸。

34.
  如權利要求33所述的方法,其中所述膽汁酸包含選自于牛黃膽酸、甘氨膽酸、膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸和石膽酸的酸。

35.
  如權利要求33所述的方法,其中所述膽汁酸包含脫氧膽酸。

36.
  如權利要求35所述的方法,其中脫氧膽酸是鹽。

37.
  如權利要求36所述的方法,其中所述脫氧膽酸鹽包含的無機離子是I族金屬。

38.
  如權利要求37所述的方法,其中所述脫氧膽酸鹽的無機離子包含作為選自于Li+、Na+和K+的鹽的無機離子。

39.
  如權利要求34所述的方法,其中所述脫氧膽酸鹽的無機離子包含作為鈉離子的無機離子。

40.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述樣品包含生物樣品。

41.
  如權利要求40所述的方法,其中所述生物樣品是基于細胞的樣品。

42.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述樣品包含哺乳動物樣品或兩棲動物樣品。

43.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述樣品包含選自于人類樣品、非人靈長類動物樣品和嚙齒動物樣品的樣品。

44.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述樣品是來自于選自小鼠、大鼠、豚鼠、兔和人的受試者的樣品。

45.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述光譜分析通過使用選自于吸收光譜法、熒光X射線光譜法、火焰光譜法、可見光譜法、紫外光譜法、紅外光譜法、近紅外光譜法、拉曼光譜法、相干反斯托克斯拉曼光譜法(CARS)、核磁共振光譜法、光子發射光譜法和穆斯堡爾光譜法的光譜技術進行。

46.
  如權利要求45所述的方法,其中所述光譜技術是紫外光譜法。

47.
  如權利要求45或46所述的方法,其中所述紫外光譜法在270nm至280nm的一個或多個波長處進行。

48.
  如權利要求45或46所述的方法,其中所述紫外光譜法在273nm至277nm的一個或多個波長處進行。

49.
  如權利要求45或46所述的方法,其中所述紫外光譜在275nm的波長處進行。

50.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第一提取緩沖液的體積與所述第二提取緩沖液的體積之比是5:1至1:1。

51.
  如權利要求28至50中任一項所述的方法,其中所述表面活性劑或去垢劑與所述第一提取緩沖液的體積之比為50:1至1:1。

52.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述樣品在添加所述第一提取緩沖液、第二提取緩沖液或第一和第二提取緩沖液兩者后加熱至50-100℃。

53.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述樣品在添加所述第一提取緩沖液、第二提取緩沖液或第一和第二提取緩沖液兩者后加熱至55-75℃。

54.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述樣品在添加所述第一提取緩沖液、第二提取緩沖液或第一和第二提取緩沖液兩者后加熱至60-70℃。

55.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述樣品在添加所述第一提取緩沖液、第二提取緩沖液或第一和第二提取緩沖液兩者后加熱至65℃。

56.
  如權利要求52至55中任一項所述的方法,其中所述樣品在添加所述第一提取緩沖液和所述第二提取緩沖液后加熱至相同的溫度。

57.
  如權利要求52至55中任一項所述的方法,其中所述樣品在添加所述第一提取緩沖液和所述第二提取緩沖液后加熱至不同的溫度。

58.
  如權利要求52至57中任一項所述的方法,其中所述的加熱持續至少5秒、至少10秒、至少15秒、至少20秒、至少30秒、至少40秒、至少50秒、至少60秒、至少75秒、至少90秒、至少105秒或至少120秒的時間。

59.
  如權利要求52至58中任一項所述的方法,其中所述樣品在添加所述第一提取緩沖液和所述第二提取緩沖液后加熱相同的時間量。

60.
  如權利要求52至58中任一項所述的方法,其中所述樣品在添加所述第一提取緩沖液和所述第二提取緩沖液后加熱不同的時間量。

61.
  如權利要求52至60中任一項所述的方法,其中與沒有被加熱的對照樣品相比,加熱樣品提高CoQ10的提取至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%或至少50%。

62.
  如權利要求2-61中任一項所述的方法,其中所述樣品通過機械攪拌混合。

63.
  如權利要求2-61中任一項所述的方法,其中所述樣品通過超聲處理混合。

64.
  如權利要求2-61中任一項所述的方法,其中所述樣品通過磁力攪拌混合。

65.
  如權利要求62至64中任一項所述的方法,其中所述樣品在加入所述第一提取緩沖液后混合。

66.
  如權利要求62至64中任一項所述的方法,其中所述樣品在加入所述第二提取緩沖液后混合。

67.
  如權利要求62至64中任一項所述的方法,其中所述樣品在加入所述第一提取緩沖液和所述第二提取緩沖液后混合。

68.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中在加入所述第二提取緩沖液后向所述樣品中加入無機鹽。

69.
  如權利要求68的方法,其中所述無機鹽包括NaCl。

70.
  根據權利要求1-69中任一項所述的方法,其中在加入所述第二提取緩沖液后,向所述樣品中添加飽和鹽水溶液。

71.
  如權利要求68至70中任一項所述的方法,其中所述鹽被添加至約1mM至約50mM的終濃度。

72.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中在所述第二提取緩沖液的光譜分析前過濾所述樣品。

73.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中整個方法在10分鐘內完成。

74.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中整個方法在5分鐘內完成。

75.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中整個方法在1分鐘內完成。

76.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中整個方法在30 秒內完成。

77.
  一種用于實施前述權利要求中任一項所述的方法的試劑盒。

78.
  如權利要求77所述的試劑盒,包含如下的至少兩種:第一提取緩沖液、第二次提取緩沖液和CoQ10。

79.
  一種用于測定樣品中輔酶Q10(CoQ10)的量的方法,所述方法包括:
a)向所述樣品中加入已知量的氘化輔酶Q10(CoQ10-d6);
b)通過質譜檢測CoQ10和CoQ10-d6;和
c)通過與已知量的檢測到的CoQ10-d6相比較來測定檢測到的CoQ10的量。

80.
  一種用于測定樣品中還原形式的CoQ10(CoQ10H2)的量的方法,所述方法包括:
a)向所述樣品中加入已知量的還原的氘化輔酶Q10(CoQ10H2-d6);
b)通過質譜檢測CoQ10H2和CoQ10H2-d6;和
c)通過與已知量的檢測到的CoQ10H2-d6相比較來測定檢測到的CoQ10H2的量。

81.
  一種用于同時測定樣品中CoQ10和CoQ10H2的量的方法,所述方法包括:
a)向所述樣品中加入已知量的CoQ10-d6和CoQ10H2-d6;
b)通過質譜檢測CoQ10、CoQ10H2、CoQ10-d6和CoQ10H2-d6;和
c)通過與已知量的檢測到的CoQ10H2-d6相比較來測定檢測到的CoQ10的量;和
d)通過與已知量的檢測到的CoQ10H2-d6相比較來測定檢測到的CoQ10H2的量。

82.
  一種用于測定樣品中CoQ10H2氧化程度的方法,所述方法包括:
a)向所述樣品中加入已知量的CoQ10H2-d6和/或CoQ10-d6;
b)通過質譜測量所述樣品中CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的相對量;和
c)將CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的理論相對量與在步驟b中測量的CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的相對量相比較。

83.
  如權利要求80-82所述的方法,其中通過將CoQ10-d6與一種或多種還原劑進行反應而獲得CoQ10H2-d6。

84.
  如權利要求83所述的方法,其中所述還原劑是硼氫化鈉。

85.
  如權利要求81-84所述的方法,其中在樣品收集后立即將CoQ10-d6和/或CoQ10H2-d6加入到所述樣品中。

86.
  如權利要求81-85所述的方法,其中所述樣品是生物樣品。

87.
  如權利要求86所述的方法,其中所述生物樣品是血漿或血清。

88.
  如權利要求86或87所述的方法,其中所述生物樣品是人類樣品。

89.
  一種用于測定樣品中CoQ10的量的方法,所述方法包括:
a)提供所述樣品;
b)向所述樣品中加入已知量的CoQ10-d6;
c)提取所述樣品;
d)任選地將所述樣品進行液相色譜;
e)通過質譜檢測CoQ10和CoQ10-d6;和
f)通過與已知量的檢測到的CoQ10-d6相比較來測定檢測到的CoQ10的量。

90.
  一種用于測定樣品中CoQ10H2的量的方法,所述方法包括:
a)提供所述樣品;
b)向所述樣品中加入已知量的CoQ10H2-d6;
c)提取所述樣品;
d)任選地將所述樣品進行液相色譜;
e)通過質譜檢測CoQ10H2和CoQ10H2-d6;和
f)通過與已知量的檢測到的CoQ10H2-d6相比較來測定檢測到的CoQ10H2的量。

91.
  一種用于測定樣品中CoQ10和CoQ10H2的量的方法,所述方法包括:
a)提供所述樣品;
b)向所述樣品中加入已知量的CoQ10-d6和CoQ10H2-d6;
c)提取所述樣品;
d)任選地將所述樣品進行液相色譜;
e)通過質譜檢測CoQ10、CoQ10-d6、CoQ10H2和CoQ10H2-d6;
f)通過與已知量的檢測到的CoQ10-d6相比較來測定檢測到的CoQ10的量;和
g)通過與已知量的檢測到的CoQ10H2-d6相比較來測定檢測到的CoQ10H2的量。

92.
  如權利要求89-91所述的方法,其中步驟c包括加入提取緩沖液。

93.
  如權利要求92所述的方法,其中所述提取緩沖液包含1-丙醇。

94.
  如權利要求92所述的方法,其中所述提取緩沖液包含異丙醇。

95.
  如權利要求89-94所述的方法,其中步驟b-d使用預冷的低溫模塊實施。

關 鍵 詞:
用于 檢測 輔酶 Q10 方法 試劑盒
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