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用于檢測輔酶Q10的方法和試劑盒.pdf

關 鍵 詞:
用于 檢測 輔酶 Q10 方法 試劑盒
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摘要
申請專利號:

CN201380021300.1

申請日:

2013.03.01

公開號:

CN104245599A

公開日:

2014.12.24

當前法律狀態:

實審

有效性:

審中

法律詳情: 實質審查的生效IPC(主分類):C02F 3/00申請日:20130301|||公開
IPC分類號: C02F3/00 主分類號: C02F3/00
申請人: 博格有限責任公司
發明人: N·N·坦納; R·薩蘭加拉簡; N·R·納萊恩; S·欒
地址: 美國田納西州
優先權: 2012.03.02 US 61/606,019
專利代理機構: 北京市金杜律師事務所 11256 代理人: 陳文平;徐志明
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201380021300.1

授權公告號:

|||

法律狀態公告日:

2015.04.01|||2014.12.24

法律狀態類型:

實質審查的生效|||公開

摘要

本發明提供了易于適應于高通量篩選方法的用于快速和定量提取和檢測樣品中輔酶Q10的方法。本發明還提供了用于實施本發明的方法的試劑和試劑盒。

權利要求書

1.  一種用于測定樣品中輔酶Q10(CoQ10)的量的方法,所述方法包括:
向所述樣品中加入第一提取緩沖液和第二提取緩沖液,其導致所述樣品的相分離;和光譜學地分析所述第二提取層來測定CoQ10的量。

2.
  一種用于測定樣品中CoQ10的量的方法,所述方法包括:
向所述樣品中加入第一提取緩沖液和第二提取緩沖液;
混合所述樣品;和
分析所述第二提取層以測定CoQ10的量,其中所述第一提取緩沖液和第二提取緩沖液的單次提取導致比使用單獨甲醇的提取檢測到至少2倍的CoQ10量。

3.
  一種用于測定樣品中CoQ10的量的方法,所述方法包括:
向所述樣品中加入第一提取緩沖液;
加熱并混合所述樣品;
向所述樣品中加入第二提取緩沖液,其導致所述樣品的相分離;
加熱并混合所述樣品;
冷卻所述樣品至環境溫度;及
分析所述第二提取緩沖液層以測定樣品中CoQ10的量。

4.
  一種用于測定樣品中CoQ10的量的方法,所述方法包括:
向所述樣品中加入第一提取緩沖液;
加熱并混合所述樣品;
向所述樣品中加入第二提取緩沖液,其導致所述樣品的相分離;
加熱并混合所述樣品;
冷卻所述樣品至環境溫度;及
通過光譜分析對第二提取緩沖液層進行光譜學分析,以測定樣品中CoQ10的量,其中用提取緩沖液的單次提取導致比使用單獨甲醇 提取隨后是液相色譜/質譜/質譜(LC/MS/MS)提取到至少2倍的CoQ10量。

5.
  如權利要求1至3中任一項所述的方法,其中在樣品中檢測到的CoQ10的量是通過光譜分析法光譜學地測定的。

6.
  如權利要求1至3中任一項所述的方法,其中CoQ10的量用LC/MS/MS檢測。

7.
  如權利要求2或4中任一項所述的方法,其中所述使用第一提取緩沖液和第二提取緩沖液提取的CoQ10的量光譜學地測定,和用單獨甲醇提取檢測的CoQ10的量使用LC/MS/MS測定。

8.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述方法是高通量篩選分析方法的部分。

9.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中整個方法通過自動化完成。

10.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中整個方法在短的時間段中完成。

11.
  如權利要求1、3-4和7-10中任一項所述的方法,其中與使用單獨甲醇提取隨后LC/MS/MS的CoQ10檢測而檢測到的CoQ10的總量相比,所述樣品使用第一提取緩沖液和第二提取緩沖液提取并且CoQ10的量光譜學地測定,在樣品中檢測到的CoQ10的總量至少為2倍。

12.
  如權利要求11所述的方法,其中與使用單獨甲醇提取隨后LC/MS/MS的CoQ10檢測而檢測到的量相比,所述樣品使用第一提取緩沖液和第二提取緩沖液提取并且CoQ10的量光譜學地測定,在樣品中檢測到的CoQ10的總量為至少5倍。

13.
  如權利要求11所述的方法,其中與使用單獨甲醇提取隨后LC/MS/MS的CoQ10檢測而檢測到的量相比,所述樣品使用第一提取緩沖液和第二提取緩沖液提取并且CoQ10的量光譜學地測定,在樣品中檢測到的CoQ10的總量為至少10倍。

14.
  如權利要求11所述的方法,其中與使用單獨甲醇提取隨后LC/MS/MS的CoQ10檢測而檢測到的量相比,所述樣品使用第一提取緩沖液和第二提取緩沖液提取并且CoQ10的量光譜學地測定,在樣品中檢測到的CoQ10的總量為至少15倍。

15.
  如權利要求11所述的方法,其中與使用單獨甲醇提取隨后LC/MS/MS的CoQ10檢測而檢測到的量相比,所述樣品使用第一提取緩沖液和第二提取緩沖液提取并且CoQ10的量光譜學地測定,在樣品中檢測到的CoQ10的總量為至少25倍。

16.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第二提取緩沖液包含非極性溶劑。

17.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第二提取緩沖液包含有機溶劑。

18.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第二提取緩沖液包含選自于苯、甲苯、二甲苯、己烷、庚烷、辛烷、環己烷、1,4-二氧六烷、氯仿、二乙醚、二異丙醚和二異丁基醚、四氯化碳、二甲基甲酰胺(DMF)、氯甲烷和二氯甲烷的溶劑。

19.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第二提取緩沖液包含烷烴。

20.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第二提取緩沖液包含己烷。

21.
  根據權利要求1-15和17中任一項所述的方法,其中所述第二提取緩沖液包含乙腈。

22.
  根據權利要求1-15和17中任一項所述的方法,其中所述第二提取緩沖液包含異丙醇。

23.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第一提取緩沖液包含極性質子溶劑。

24.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第一提取緩沖液包含有機溶劑。

25.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第一提取緩沖液包含選自于甲酸、正丁醇、異丙醇、正丙醇,乙醇、甲醇、乙酸、三氯乙酸(TCA)和水的溶劑。

26.
  如權利要求25所述的方法,其中所述溶劑包含醇。

27.
  如權利要求26所述的方法,其中所述醇是甲醇。

28.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第一提取緩沖液包含表面活性劑。

29.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第一提取緩沖液包含去垢劑。

30.
  如權利要求29所述的方法,其中所述去垢劑是溫和的去垢劑。

31.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第一提取緩沖液是水性溶液。

32.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第一提取緩沖液包含類固醇酸。

33.
  如權利要求32所述的方法,其中所述類固醇酸是膽汁酸。

34.
  如權利要求33所述的方法,其中所述膽汁酸包含選自于牛黃膽酸、甘氨膽酸、膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸和石膽酸的酸。

35.
  如權利要求33所述的方法,其中所述膽汁酸包含脫氧膽酸。

36.
  如權利要求35所述的方法,其中脫氧膽酸是鹽。

37.
  如權利要求36所述的方法,其中所述脫氧膽酸鹽包含的無機離子是I族金屬。

38.
  如權利要求37所述的方法,其中所述脫氧膽酸鹽的無機離子包含作為選自于Li+、Na+和K+的鹽的無機離子。

39.
  如權利要求34所述的方法,其中所述脫氧膽酸鹽的無機離子包含作為鈉離子的無機離子。

40.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述樣品包含生物樣品。

41.
  如權利要求40所述的方法,其中所述生物樣品是基于細胞的樣品。

42.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述樣品包含哺乳動物樣品或兩棲動物樣品。

43.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述樣品包含選自于人類樣品、非人靈長類動物樣品和嚙齒動物樣品的樣品。

44.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述樣品是來自于選自小鼠、大鼠、豚鼠、兔和人的受試者的樣品。

45.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述光譜分析通過使用選自于吸收光譜法、熒光X射線光譜法、火焰光譜法、可見光譜法、紫外光譜法、紅外光譜法、近紅外光譜法、拉曼光譜法、相干反斯托克斯拉曼光譜法(CARS)、核磁共振光譜法、光子發射光譜法和穆斯堡爾光譜法的光譜技術進行。

46.
  如權利要求45所述的方法,其中所述光譜技術是紫外光譜法。

47.
  如權利要求45或46所述的方法,其中所述紫外光譜法在270nm至280nm的一個或多個波長處進行。

48.
  如權利要求45或46所述的方法,其中所述紫外光譜法在273nm至277nm的一個或多個波長處進行。

49.
  如權利要求45或46所述的方法,其中所述紫外光譜在275nm的波長處進行。

50.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述第一提取緩沖液的體積與所述第二提取緩沖液的體積之比是5:1至1:1。

51.
  如權利要求28至50中任一項所述的方法,其中所述表面活性劑或去垢劑與所述第一提取緩沖液的體積之比為50:1至1:1。

52.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述樣品在添加所述第一提取緩沖液、第二提取緩沖液或第一和第二提取緩沖液兩者后加熱至50-100℃。

53.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述樣品在添加所述第一提取緩沖液、第二提取緩沖液或第一和第二提取緩沖液兩者后加熱至55-75℃。

54.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述樣品在添加所述第一提取緩沖液、第二提取緩沖液或第一和第二提取緩沖液兩者后加熱至60-70℃。

55.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中所述樣品在添加所述第一提取緩沖液、第二提取緩沖液或第一和第二提取緩沖液兩者后加熱至65℃。

56.
  如權利要求52至55中任一項所述的方法,其中所述樣品在添加所述第一提取緩沖液和所述第二提取緩沖液后加熱至相同的溫度。

57.
  如權利要求52至55中任一項所述的方法,其中所述樣品在添加所述第一提取緩沖液和所述第二提取緩沖液后加熱至不同的溫度。

58.
  如權利要求52至57中任一項所述的方法,其中所述的加熱持續至少5秒、至少10秒、至少15秒、至少20秒、至少30秒、至少40秒、至少50秒、至少60秒、至少75秒、至少90秒、至少105秒或至少120秒的時間。

59.
  如權利要求52至58中任一項所述的方法,其中所述樣品在添加所述第一提取緩沖液和所述第二提取緩沖液后加熱相同的時間量。

60.
  如權利要求52至58中任一項所述的方法,其中所述樣品在添加所述第一提取緩沖液和所述第二提取緩沖液后加熱不同的時間量。

61.
  如權利要求52至60中任一項所述的方法,其中與沒有被加熱的對照樣品相比,加熱樣品提高CoQ10的提取至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%或至少50%。

62.
  如權利要求2-61中任一項所述的方法,其中所述樣品通過機械攪拌混合。

63.
  如權利要求2-61中任一項所述的方法,其中所述樣品通過超聲處理混合。

64.
  如權利要求2-61中任一項所述的方法,其中所述樣品通過磁力攪拌混合。

65.
  如權利要求62至64中任一項所述的方法,其中所述樣品在加入所述第一提取緩沖液后混合。

66.
  如權利要求62至64中任一項所述的方法,其中所述樣品在加入所述第二提取緩沖液后混合。

67.
  如權利要求62至64中任一項所述的方法,其中所述樣品在加入所述第一提取緩沖液和所述第二提取緩沖液后混合。

68.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中在加入所述第二提取緩沖液后向所述樣品中加入無機鹽。

69.
  如權利要求68的方法,其中所述無機鹽包括NaCl。

70.
  根據權利要求1-69中任一項所述的方法,其中在加入所述第二提取緩沖液后,向所述樣品中添加飽和鹽水溶液。

71.
  如權利要求68至70中任一項所述的方法,其中所述鹽被添加至約1mM至約50mM的終濃度。

72.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中在所述第二提取緩沖液的光譜分析前過濾所述樣品。

73.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中整個方法在10分鐘內完成。

74.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中整個方法在5分鐘內完成。

75.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中整個方法在1分鐘內完成。

76.
  根據前述權利要求中任一項所述的方法,其中整個方法在30 秒內完成。

77.
  一種用于實施前述權利要求中任一項所述的方法的試劑盒。

78.
  如權利要求77所述的試劑盒,包含如下的至少兩種:第一提取緩沖液、第二次提取緩沖液和CoQ10。

79.
  一種用于測定樣品中輔酶Q10(CoQ10)的量的方法,所述方法包括:
a)向所述樣品中加入已知量的氘化輔酶Q10(CoQ10-d6);
b)通過質譜檢測CoQ10和CoQ10-d6;和
c)通過與已知量的檢測到的CoQ10-d6相比較來測定檢測到的CoQ10的量。

80.
  一種用于測定樣品中還原形式的CoQ10(CoQ10H2)的量的方法,所述方法包括:
a)向所述樣品中加入已知量的還原的氘化輔酶Q10(CoQ10H2-d6);
b)通過質譜檢測CoQ10H2和CoQ10H2-d6;和
c)通過與已知量的檢測到的CoQ10H2-d6相比較來測定檢測到的CoQ10H2的量。

81.
  一種用于同時測定樣品中CoQ10和CoQ10H2的量的方法,所述方法包括:
a)向所述樣品中加入已知量的CoQ10-d6和CoQ10H2-d6;
b)通過質譜檢測CoQ10、CoQ10H2、CoQ10-d6和CoQ10H2-d6;和
c)通過與已知量的檢測到的CoQ10H2-d6相比較來測定檢測到的CoQ10的量;和
d)通過與已知量的檢測到的CoQ10H2-d6相比較來測定檢測到的CoQ10H2的量。

82.
  一種用于測定樣品中CoQ10H2氧化程度的方法,所述方法包括:
a)向所述樣品中加入已知量的CoQ10H2-d6和/或CoQ10-d6;
b)通過質譜測量所述樣品中CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的相對量;和
c)將CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的理論相對量與在步驟b中測量的CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的相對量相比較。

83.
  如權利要求80-82所述的方法,其中通過將CoQ10-d6與一種或多種還原劑進行反應而獲得CoQ10H2-d6。

84.
  如權利要求83所述的方法,其中所述還原劑是硼氫化鈉。

85.
  如權利要求81-84所述的方法,其中在樣品收集后立即將CoQ10-d6和/或CoQ10H2-d6加入到所述樣品中。

86.
  如權利要求81-85所述的方法,其中所述樣品是生物樣品。

87.
  如權利要求86所述的方法,其中所述生物樣品是血漿或血清。

88.
  如權利要求86或87所述的方法,其中所述生物樣品是人類樣品。

89.
  一種用于測定樣品中CoQ10的量的方法,所述方法包括:
a)提供所述樣品;
b)向所述樣品中加入已知量的CoQ10-d6;
c)提取所述樣品;
d)任選地將所述樣品進行液相色譜;
e)通過質譜檢測CoQ10和CoQ10-d6;和
f)通過與已知量的檢測到的CoQ10-d6相比較來測定檢測到的CoQ10的量。

90.
  一種用于測定樣品中CoQ10H2的量的方法,所述方法包括:
a)提供所述樣品;
b)向所述樣品中加入已知量的CoQ10H2-d6;
c)提取所述樣品;
d)任選地將所述樣品進行液相色譜;
e)通過質譜檢測CoQ10H2和CoQ10H2-d6;和
f)通過與已知量的檢測到的CoQ10H2-d6相比較來測定檢測到的CoQ10H2的量。

91.
  一種用于測定樣品中CoQ10和CoQ10H2的量的方法,所述方法包括:
a)提供所述樣品;
b)向所述樣品中加入已知量的CoQ10-d6和CoQ10H2-d6;
c)提取所述樣品;
d)任選地將所述樣品進行液相色譜;
e)通過質譜檢測CoQ10、CoQ10-d6、CoQ10H2和CoQ10H2-d6;
f)通過與已知量的檢測到的CoQ10-d6相比較來測定檢測到的CoQ10的量;和
g)通過與已知量的檢測到的CoQ10H2-d6相比較來測定檢測到的CoQ10H2的量。

92.
  如權利要求89-91所述的方法,其中步驟c包括加入提取緩沖液。

93.
  如權利要求92所述的方法,其中所述提取緩沖液包含1-丙醇。

94.
  如權利要求92所述的方法,其中所述提取緩沖液包含異丙醇。

95.
  如權利要求89-94所述的方法,其中步驟b-d使用預冷的低溫模塊實施。

說明書

用于檢測輔酶Q10的方法和試劑盒
相關申請
本申請要求2012年3月2日提交的61/606019號美國臨時申請的優先權,其全部內容在此通過引用并入本文。
發明背景
輔酶Q10,本文也稱為CoQ10、泛醌或泛癸利酮,是一種常用的營養補充物,并可以作為維生素類補充劑在營養品商店、健康食品商店、藥店等處找到其膠囊的形式,以通過泛醇(CoQ10的還原形式)的抗氧化性能幫助保護免疫系統。CoQ10在人體的大部分組織和其他哺乳動物的組織中普遍發現。CoQ10是高度親脂性的,并且在大部分不溶于水。不溶性與烴性質的50個碳原子的類異戊二烯側鏈有關,如CoQ10的如下結構中所示。

輔酶Q10(CoQ10)是線粒體中氧化磷酸化機制的有機組成部分,并與生物膜和細胞的氧化還原狀態的動態平衡相關。CoQ10的還原形式(CoQ10H2)參與許多重要的生化功能,包括作為抗氧化劑、產生ATP和插入膜脂以保持結構。
發明概述
研究表明,總CoQ10(T-CoQ10)中CoQ10H2的較低百分比與線 粒體細胞病、糖尿病、心臟病、帕金森氏病和癌癥相關。最近的研究還表明,降低的CoQ10水平與服用他汀類藥物的患者中前列腺癌的風險增加和黑色素瘤患者中轉移的風險增加有關。這就強調了開發穩定、準確、靈敏和特異的CoQ10和CoQ10H2測量方法的重要性。本發明提供了一種易于適應于高通量篩選方法的用于快速和定量的提取和檢測樣品中CoQ10的方法。本發明還提供了用于實施本發明方法的試劑和試劑盒。
在一個方面,本發明提供了一種用于測定樣品中的輔酶Q10(CoQ10)的量的方法,包括向樣品中加入第一提取緩沖液和第二提取緩沖液,其導致樣品的相分離;和光譜學分析第二提取層來測定CoQ10的量。
在另一個方面,本發明還提供了用于測定樣品中的CoQ10的量的方法,包括向樣品中加入第一提取緩沖液和第二提取緩沖液;混合樣品;和分析第二提取層以測定CoQ10的量,其中所述第一提取緩沖液和第二提取緩沖液的單次提取比使用單獨甲醇提取導致檢測到至少2倍的CoQ10量。
在另一個方面,本發明提供了用于測定樣品中的CoQ10的量的方法,包括向樣品中加入第一提取緩沖液;加熱并混合樣品;向樣品中加入第二提取緩沖液,其導致樣品的相分離;加熱并混合樣品;冷卻樣品至環境溫度;及分析第二提取緩沖液層以測定樣品中CoQ10的量。
而在另一個方面,本發明提供了用于測定樣品中的CoQ10的量的方法,包括向樣品中加入第一提取緩沖液;加熱并混合樣品;向樣品中加入第二提取緩沖液,其導致樣品的相分離;加熱并混合樣品;冷卻樣品至環境溫度;及對第二提取緩沖液層進行光譜分析以測定樣品中CoQ10的量,其中提取緩沖液的單次提取比使用單獨甲醇提取隨后液相色譜/質譜/質譜(LC/MS/MS)導致提取到至少2倍的CoQ10量。
在本發明的某些實施方式中,在樣品中檢測到的CoQ10的量是由 光譜分析法光譜學地測定的。在本發明的某些實施方式中,CoQ10的量是用LC/MS/MS檢測的。在本發明的某些實施方式中,光譜學地測定使用第一提取緩沖液和第二提取緩沖液提取的CoQ10的量,和使用LC/MS/MS測定用單獨甲醇提取檢測的CoQ10的量。
在本發明的某些實施方式中,所述方法是高通量篩選分析方法的部分。在本發明的某些實施方式中,整個方法是自動化完成的。在本發明的某些實施方式中,整個方法是在短的時間段中完成的。例如,使用光譜分析進行該方法和樣品中CoQ10量的測定在使用LC/MS/MS進行分析所需的大約一半的時間或者更少、大約四分之一的時間或更少、或約十分之一的時間或者更少的時間內完成。在某些實施方式中,將用光譜檢測方法對一組樣品進行分析所需的時間量與用LC/MS/MS對一組樣品進行分析的時間量相比較。在某些實施方式中,用光譜檢測方法對一組樣品進行分析所需的時間量少于5小時、少于4小時、少于3小時、少于2小時、少于30分鐘、少于15分鐘、少于10分鐘、少于5分鐘、少于4分鐘、少于3分鐘、少于2分鐘、少于1分鐘或少于30秒。
在本發明的某些實施方式中,與使用單獨甲醇提取隨后LC/MS/MS的CoQ10檢測在重復樣品中檢測到的CoQ10的總量相比,其中所述樣品使用第一提取緩沖液和第二提取緩沖液提取并且CoQ10的量用光譜學測定,在樣品中檢測到的CoQ10的總量為至少2倍。例如,光譜學測定的CoQ10的總量是使用單獨甲醇提取隨后LC/MS/MS的CoQ10檢測量的至少5倍、至少10倍、至少15倍或至少25倍。
在本發明的某些實施方式中,第二提取緩沖液包含非極性溶劑。在本發明的某些實施方式中,第二提取緩沖液包含有機溶劑。在本發明的某些實施方式中,第二提取緩沖液包含選自于苯、甲苯、二甲苯、己烷、庚烷、辛烷、環己烷、1,4-二氧六烷、氯仿、二乙醚、二異丙醚和二異丁基醚、四氯化碳、二甲基甲酰胺(DMF)、氯甲烷和二氯甲烷或它們的任何組合中的溶劑。在本發明的某些實施方式中,第二 提取緩沖液包含烷烴。在本發明的某些實施方式中,第二提取緩沖液包含己烷。在本發明的某些實施方式中,第二提取緩沖液包含乙腈。在本發明的某些實施方式中,第二提取緩沖液包含異丙醇。
在本發明的某些實施方式中,所述第一提取緩沖液包含極性質子溶劑。在本發明的某些實施方式中,所述第一提取緩沖液包含有機溶劑。在本發明的某些實施方式中,所述第一提取緩沖液包含選自于甲酸、正丁醇、異丙醇、正丙醇,乙醇、甲醇、乙酸、三氯乙酸(TCA)以及水或它們的任何組合中的溶劑。在本發明的某些實施方式中,所述溶劑包含醇。在本發明的某些實施方式中,所述醇是甲醇。
在本發明的某些實施方式中,所述第一提取緩沖液包含表面活性劑。
在本發明的某些實施方式中,所述第一提取緩沖液包含去垢劑。在本發明的某些實施方式中,該去垢劑是溫和的去垢劑。在本發明的某些實施方式中,第一提取緩沖液為水性溶液。在本發明的某些實施方式中,第一提取緩沖液包含類固醇酸。在本發明的某些實施方式中,所述類固醇酸是膽汁酸。在本發明的某些實施方式中,所述膽汁酸包括選自于牛黃膽酸(taurochloric acid)、甘氨膽酸、膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸和石膽酸或它們的任何組合中的酸。在本發明的某些實施方式中,所述膽汁酸包括脫氧膽酸。在本發明的某些實施方式中,所述脫氧膽酸是鹽。在本發明的某些實施方式中,脫氧膽酸鹽包含I族金屬的無機離子。在本發明的某些實施方式中,脫氧膽酸鹽的無機離子包括選自于Li+、Na+和K+的鹽的無機離子。在本發明的某些實施方式中,脫氧膽酸鹽的無機離子包括作為鈉離子的無機離子。
在本發明的某些實施方式中,所述樣品包括生物樣品。在本發明的某些實施方式中,所述生物樣品是基于細胞的樣品。在本發明的某些實施方式中,所述樣品包括哺乳動物樣品或兩棲動物樣品。在本發明的某些實施方式中,所述樣品包括選自于人類樣品、非人靈長類動物樣品和嚙齒動物樣品的樣品。在本發明的某些實施方式中,所述樣品是來自選自小鼠、大鼠、豚鼠、兔和人的受試者的樣品。
在本發明的某些實施方式中,所述光譜分析通過使用選自于吸收光譜法、熒光X射線光譜法、火焰光譜法、可見光譜法、紫外光譜法、紅外光譜法、近紅外光譜法、拉曼光譜法、相干反斯托克斯拉曼光譜法(CARS)、核磁共振光譜法、光子發射光譜法和穆斯堡爾光譜的光譜技術進行。在本發明的某些實施方式中,所述光譜技術是紫外光譜法。在本發明的某些實施方式中,紫外光譜法是在270nm至280nm的一個或多個波長處進行。在本發明的某些實施方式中,該紫外光譜法是在273nm至277nm的一個或多個波長處進行。在本發明的某些實施方式中,該紫外光譜法是在275nm波長處進行。在本發明的某些實施方式中,該紫外光譜法是在270nm至280nm之間的波長處進行,例如270nm、271nm、272nm、273nm、274nm、275nm、276nm、277nm、278nm、279nm或280nm。
在本發明的某些實施方式中,所述第一提取緩沖液的體積與第二提取緩沖液的體積之比是5:1至1:1(v/v)(例如,5:1、4:1、3:1、2:1或1:1,或僅由這些值包括的任何范圍,例如4:1至1:1或4:1至2:1)。
在本發明的某些實施方式中,所述表面活性劑或去垢劑與第一提取緩沖液的體積的比率為50:1至1:1(v/v)(例如,大約45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1.15:1、10:1、5:1、2:1、1:1;或僅由那些值值包括的任何范圍,例如,40:1至10:1、40:1至5:1、40:1至2:1、40:1至1:1、35:1至10:1、35:1至5:1、35:1至5:1、35:1至1:1、25:1至10:1、25:1至5:1、20:1至5:1、15:1至5:1、10:1至5:1、10:1至2:1、或10:1至1:1)。
在本發明的某些實施方式中,在添加第一提取緩沖液、第二提取緩沖液或第一和第二提取緩沖液兩者后將樣品加熱至50-100℃,例如約50-100℃、約55-90℃、約60-85℃、約60-80℃、約55-75℃、約60-70℃、約62-68℃、約63-67℃、約64-66℃或約65℃。在某些實施方式中,將樣品加熱到約55℃、約56℃、約57℃、約58℃、約59℃、約60℃、約61℃、約62℃、約63℃、約64℃、約65℃、約66℃、 約67℃、約68℃、約69℃或約70℃。在某些實施方式中,在添加第一提取緩沖液和第二提取緩沖液后,所述樣品被加熱至相同的溫度。在某些實施方式中,在添加第一提取緩沖液和第二提取緩沖液后,所述樣品被加熱至不同的溫度。在某些實施方式中,所述的樣品被加熱至少5秒、至少10秒、至少15秒、至少20秒、至少30秒、至少40秒、至少50秒、至少60秒、至少75秒、至少90秒、至少105秒或至少120秒的時間,也就是小于該范圍的上限但大于零的一個秒數。
在本發明的某些實施方式中,添加第一提取緩沖液和第二提取緩沖液后,所述樣品被加熱相同的時間量。在某些實施方式中,在添加第一提取緩沖液和第二提取緩沖液后,所述樣品被加熱不同的時間量。
在某些實施方式中,與沒有被加熱的對照樣品相比,加熱樣品提高CoQ10的提取至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%或至少50%。
在本發明的某些實施方式中,所述樣品通過機械攪拌混合。在本發明的某些實施方式中,所述樣品通過超聲處理混合。在本發明的某些實施方式中,所述樣品通過磁力攪拌混合。在某些實施方式中,樣品在加入所述第一提取緩沖液后混合。在某些實施方式中,樣品在加入所述第二提取緩沖液后混合。在某些實施方式中,樣品在加入所述第一提取緩沖液和所述第二提取緩沖液后混合。
在本發明的某些實施方式中,在加入所述第二提取緩沖液后向樣品中加入無機鹽。在某些實施方式中,無機鹽包括NaCl。在某些實施方式中,在加入第二提取緩沖液后,向樣品添加飽和的鹽水溶液。在某些實施方式中,所述鹽被添加至約1mM至約50mM的終濃度,即至約1mM至約10mM、約1mM至約20mM、約1mM至約30mM、約1mM至約40mM、約5mM至約50mM、約10mM至約40mM、約20mM至約50mM、約10mM至約25mM、約15mM至約35mM的濃度;或僅由這些值包括的任何值的范圍,如在約10mM至20mM之間。
在本發明的某些實施方式中,在第二提取緩沖液的光譜分析前過濾所述樣品。
在本發明的某些實施方式中,在10分鐘內、在5分鐘內、1分鐘內或在30秒內完成整個方法。
本發明提供了用于實施前述權利要求中任一項所述的方法的試劑盒。在某些實施方式中,所述試劑盒包括以下的至少兩個:第一提取緩沖液,第二次提取緩沖液。在另一個方面,該試劑盒還包括CoQ10。在另一個方面,所述試劑盒包含第一提取緩沖液,第二提取緩沖液和使用說明書。
在另一個方面,本發明提供了使用氧化的和還原的氘化CoQ10內標的新方法。在某些實施方式中,本發明提供了用于測定CoQ10和CoQ10H2的量的LC-MS/MS方法。
在一些實施方式中,本發明提供了一種用于測定樣品中輔酶Q10(CoQ10)的量的方法,所述方法包括:
a)向樣品中加入已知量的氘化的輔酶Q10(CoQ10-d6);
b)通過質譜檢測CoQ10和CoQ10-d6;和
c)通過將其與已知量的檢測到的CoQ10-d6相比較來測定檢測到的CoQ10的量。
在一些實施方式中,本發明還提供了一種用于測定樣品中還原形式的CoQ10(CoQ10H2)的量的方法,所述方法包括:
a)向樣品中加入已知量的還原形式的氘化輔酶Q10(CoQ10H2-d6);
b)通過質譜檢測CoQ10H2和CoQ10H2-d6;和
c)通過將其與已知量的檢測到的CoQ10H2-d6相比較來測定檢測到的CoQ10H2的量。
在其他的實施方式中,本發明還提供了一種用于同時測定樣品中CoQ10和CoQ10H2的量的方法,所述方法包括:
a)向樣品中加入已知量的CoQ10-d6和CoQ10H2-d6;
b)通過質譜檢測CoQ10、CoQ10H2、CoQ10-d6和CoQ10H2-d6; 和
c)通過將其與已知量的檢測到的CoQ10H2-d6相比較來測定檢測到的CoQ10的量;和
d)通過將其與已知量的檢測到的CoQ10H2-d6相比較來測定檢測到的CoQ10H2的量。
而在其它的實施方式中,本發明提供了一種用于測定樣品中CoQ10H2氧化的程度的方法,所述方法包括:
a)向樣品中加入已知量的CoQ10H2-d6和/或CoQ10-d6;
b)通過質譜測量樣品中CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的相對量;和
c)將CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的理論相對量與在步驟b中測得的CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的相對量相比較。
在另一個方面,本發明提供了一種用于測定樣品中CoQ10H2氧化的程度的方法,所述方法包括:
a)向樣品中加入已知量的CoQ10H2-d6和/或CoQ10-d6;
b)在第一時間和第二時間通過質譜測量樣品中CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的相對量
c)將在第一時間相同樣品中存在的CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的理論相對量與在第二時間相同樣品中存在的CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的相對量相比較;
其中在第一時間和第二時間的CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的相對量的改變指示樣品承受的氧化的程度。
在一些實施方式中,通過將CoQ10-d6與一種或多種還原劑進行反應而獲得CoQ10H2-d6。在一個具體實施方式中,還原劑是硼氫化鈉。
在一些實施方式中,在樣品采集后立即將CoQ10-d6和/或CoQ10H2-d6加入到樣品中。
在一個實施方式中,本發明提供了一種用于測定樣品中的CoQ10的量的方法,所述方法包括:
a)提供樣品;
b)向樣品中加入已知量的CoQ10-d6;
c)提取樣品;
d)任選地將樣品進行液相色譜分析;
e)通過質譜檢測CoQ10和CoQ10-d6;和
f)通過將其與已知量的檢測到的CoQ10-d6相比較來測定檢測到的CoQ10的量。
在另一個實施方式中,本發明提供了一種用于測定樣品中CoQ10H2的量的方法,所述方法包括:
a)提供樣品;
b)向樣品中加入已知量的CoQ10H2-d6;
c)提取樣品;
d)任選地將樣品進行液相色譜分析;
e)通過質譜檢測CoQ10H2和CoQ10H2-d6;和
f)通過將其與已知量的檢測到的CoQ10H2-d6相比較來測定檢測到的CoQ10H2的量。
而在另一個實施方式中,本發明提供了一種用于測定樣品中的CoQ10和CoQ10H2的量的方法,所述方法包括:
a)提供樣品;
b)向樣品中加入已知量的CoQ10-d6和CoQ10H2-d6;
c)提取樣品;
d)任選地將樣品進行液相色譜;
e)通過質譜檢測CoQ10、CoQ10-d6、CoQ10H2和CoQ10H2-d6;
f)通過將其與已知量的檢測到的CoQ10-d6相比較來測定檢測到的CoQ10的量;和
g)通過將其與已知量的檢測到的CoQ10H2-d6相比較來測定檢測到的CoQ10H2的量。
在一些實施方式中,步驟c包括向樣品中加入提取緩沖液,例如,第一提取緩沖液。在一個具體的實施方式中,該提取緩沖液,例如,第一提取緩沖液含有1-丙醇。在其它實施方式中,提取緩沖液包含異 丙醇、甲醇、乙醇、乙腈或丙酮。在一個實施方式中,用提取緩沖液例如1-丙醇提取后通過質譜分析用于提取的溶劑。
在進一步的實施方式中,步驟c還包括加入第二提取緩沖液,其導致樣品的相分離。在一個實施方式中,步驟c包括:
i.向樣品中加入第一提取緩沖液和第二提取緩沖液;
ii.混合樣品;和
iii.將第二提取層用于后續步驟。
在一個實施方式中,步驟c包括:
i.向樣品中加入第一提取緩沖液;
ii.加熱并混合樣品;
iii.向樣品中加入第二提取緩沖液,其導致樣品的相分離;
iv.加熱并混合樣品;
v.冷卻樣品至環境溫度;和
vi.將第二提取緩沖液層用于后續步驟。
在一些實施方式中,在減弱的光下實施步驟b-d。在一些實施方式中,使用預冷的溶劑實施步驟b-d。在一些實施方式中,使用預冷的低溫模塊實施步驟b-d。在一些實施方式中,將該低溫模塊預冷卻約1小時至約48小時,例如,約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約28小時、約32小時、約36小時、約40小時、約44小時或約48小時。
在某些實施方式中,該樣品是生物樣品。在一個具體的實施方式中,所述生物樣品是血漿。在另一個具體的實施方式中,所述生物樣品是血清。在另一個具體的實施方式中,所述生物樣品是組織。而在另一個實施方式中,所述生物樣品是體液,如血液、尿液、唾液或鼻粘液。在一個實施方式中,所述生物樣品是人類樣品。
在一些實施方式中,本發明還提供了用于實施本發明的質譜方法的試劑盒。在一些實施方式中,所述試劑盒包含提取緩沖液,例如, 1-丙醇。在一些實施方式中,所述試劑盒包含CoQ10-d6。在另一個實施方式中,所述試劑盒包含CoQ10-d6和一種或多種還原劑。在一個具體的實施方式中,還原劑是硼氫化鈉。在進一步的實施方式中,所述試劑盒包含提取緩沖液(例如1-丙醇)、CoQ10-d6和還原劑(例如硼氫化鈉)。
以下提供了其它的實施方式。
附圖簡要說明
圖1顯示了在乙腈、2-丙醇和己烷每一個中OD275值針對指示濃度的CoQ10繪制的代表性標準曲線。提供了用于每條線的方程。
圖2顯示了在己烷中OD275值針對指示濃度的CoQ10繪制的代表性標準曲線。
圖3A-E顯示了(A)未處理的HepG2細胞;(B)用丙醇中50μM的CoQ10處理的HepG2細胞;(C)用丙醇中100μM的CoQ10處理的HepG2細胞;(D)用CoQ10遞送制劑中50μM的CoQ10處理的HepG2細胞;或(E)用CoQ10遞送制劑中100μM的CoQ10處理的HepG2細胞的一式三份CoQ10濃度(pM/細胞)和平均值的代表性結果的圖表;所述細胞在CoQ10的存在下培養指示的時間并使用本發明的方法進行提取。
圖4顯示了CoQ10-和CoQ10H2的標準曲線,樣品用作為稀釋劑的己烷樣品和己烷重構的CoQ10-和CoQ10H2儲備液制備。
圖5顯示了CoQ10-和CoQ10H2的標準曲線,樣品使用作為稀釋劑的水和甲醇重構的CoQ10-和CoQ10H2儲備液制備。
圖6顯示了血漿樣品中總CoQ10的標準曲線和代表性色譜圖。
圖7顯示了細胞上清液中總CoQ10的代表性色譜圖。
圖8顯示了洗鼻液中總CoQ10的標準曲線和代表性色譜圖。
圖9顯示了組織樣品中總CoQ10的標準曲線和代表性色譜圖。
圖10顯示了血清樣品中CoQ10-和CoQ10H2的標準曲線。
圖11顯示了血清樣品中CoQ10-和CoQ10H2的代表性色譜圖。
圖12顯示了血漿樣品中CoQ10-和CoQ10H2的標準曲線。
圖13顯示了血漿樣品中CoQ10-和CoQ10H2的代表性色譜圖。
詳細說明
本發明涉及用于從生物樣品,優選基于細胞的樣品,快速和有效地提取CoQ10以(優選定量地)檢測樣品中CoQ10的方法。該方法可以容易地適應用于高通量和/或自動化的篩選方法。
為了優化可讀性并幫助理解本文所述的本發明,也許考慮一下本文中所使用的術語和短語的下列定義是有益的。
I.定義
本發明提供的檢測方法可用于檢測輔酶Q10(CoQ10)和它的結構變體。例如,CoQ10可能以完全氧化的形式(泛醌)、部分氧化的形式(泛半醌)和完全還原的形式(泛醇)存在。此外,雖然如上所示的CoQ10有10個類異戊二烯單元,本文提供的方法可用于檢測具有大約8-12個(例如,8、9、10、11、12)個類異戊二烯單元的結構上類似于CoQ10的化合物,因為環結構是使用本發明優選的分光光度法進行檢測的。
如本文所使用的總“CoQ10”指的是樣品中存在的氧化的和還原的CoQ10的總量。
如本文使用的“溶劑”通常理解為一種液體,其溶解固體或液體而產生溶液。在指定的溫度下,溶質可溶解于一定體積的溶劑中。如本文所使用的,溶劑不必完全溶解所有樣品,只要不溶解的成分不干擾樣品中CoQ10的提取和檢測。例如,當使用基于全細胞的樣品時,可以形成包括蛋白質和/或核酸的沉淀物。
基于化學特性、溶劑化/反應機制、總電荷、電荷分布等,溶劑可以細分為各種不同的組。例如,溶劑可以分為非極性溶劑和極性溶劑的組,極性溶劑可進一步細分為極性非質子溶劑和極性質子溶劑。
下面闡述的溶劑是按照增加的極性排序的,如通過介電常數所定義的。高于水的溶劑性質以粗體顯示。
表1.有機溶劑


“非極性溶劑”是在其中(幾乎)沒有鍵的極性,或者其中鍵對稱地排列的溶劑,從而導致在所有方向上平衡的電荷引力。例如,氯仿具有相對強的極性鍵,然而,偶極矩相等的三個極性鍵的三角形平面排列使得該分子是非極性的。可選地,在烷烴中,鍵具有弱偶極矩并 且幾乎沒有鍵極性,使得它們是非極性的。非極性溶劑包括,但不限于,鏈烷烴、苯、甲苯、二甲苯、己烷、庚烷、辛烷、環己烷、1,4-二氧六環、氯仿、乙醚、二異丙醚和二異丁基醚。
烷烴(也稱為鏈烷烴或飽和烴)是僅由元素碳(C)和氫(H)組成的化合物(即,碳氫化合物),其中這些原子僅由單鍵連接在一起(即它們是飽和化合物)。烷烴屬于其成員相差14的恒定相對分子質量的同系有機化合物。每一個碳原子必須有4個鍵(不管是C-H或C-C鍵),并且每個氫原子必須連接到一個碳原子(H-C鍵)。其結果是,烷烴通常是非常穩定的,并且幾乎沒有生物活性。一系列相連的碳原子被稱為碳骨架或碳主鏈。在一般情況下,碳原子的數目通常被用來定義烷烴的大小(例如,C2烷烴)。
最簡單的烷烴是甲烷,CH4。在理論上對于可以被連接在一起的碳原子的數目是沒有限制的,唯一的限制是該分子是飽和的,并且是烴。飽和的油和蠟是較大的烷烴的例子,其中碳骨架中的碳數目往往是大于10的。如本文所用的,低級烷烴具有1至6個碳原子。高級烷烴具有至少7個碳原子,優選7至12個碳原子。如本文中所使用的,中級烷烴具有4-8個碳原子,或在某些實施方式中,5、6或7個碳原子。
直鏈烷烴通常由前綴n-(代表正的)表示,其中存在非線性的異構體。雖然這不是嚴格必需的,該用法仍然在其中直鏈和支鏈異構體之間存在重要的性能差異的情況下是普遍的,例如,n-己烷或2-或3-乙基戊烷。該系列的成員(以碳原子數計)的命名如下:甲烷,CH4-一個碳和四個氫原子;乙烷,C2H6-兩個碳和六個氫;丙烷,C3H8-三個碳和8個氫;丁烷,C4H10-四個碳和10個氫;戊烷,C5H12-五個碳和12個氫;和己烷,C6H14-六個碳和14個氫。如本文中所使用的,除非使用n-前綴,烷烴被理解為是指具有指定數目的碳原子的一種或多種碳化合物,且可包括所確定的烷烴的混合群體(例如,己烷被理解為包括n-己烷、2-甲基戊烷、3-甲基戊烷和環己烷中的任何一種;以及各種己烷以任何比率的任何組合)。
本文所用的“質子溶劑”通過氫鍵使陰離子強烈溶劑化。質子溶劑具有酸性氫,盡管它們可能是非常弱的酸。更一般地,含有可離解的H+的任何分子溶劑被稱為極性質子溶劑。這類溶劑的分子可以貢獻H+(質子)。質子溶劑通過使與陽離子的未共享電子對和通過與陰離子的氫鍵結合來穩定離子。
“極性質子溶劑”有利于SN1反應機制,因為溶劑具有結合于氧(如羥基中)或氮(如在胺基中)的氫原子。如本文所使用的極性質子溶劑往往具有高的介電常數和高的極性。極性質子溶劑包括醇類。
“醇”是其中的羥基官能團(-OH)被連接到碳原子上的任何有機化合物,其中該碳原子通常連接其它碳原子或氫原子。醇分子中的羥基(OH)官能團(具有-OH基團中的可離解質子)使得醇成為極性質子溶劑。
醇包括,例如,具有通式CnH2n+1OH的非環狀醇,其中n≥1。后綴-ol出現在其中羥基基團是具有最高優先級的官能團的所有的物質的IUPAC化學名稱中;在其中存在更高優先級的官能團的物質中,前綴羥基-(hydroxy-)將出現在IUPAC命名中。在非系統性的名稱(例如對乙酰氨基酚或膽固醇)中的后綴-ol通常也表示該物質包括羥基官能團,并因此可以被稱為醇,但許多物質(如檸檬酸、乳酸或蔗糖)含有一個或多個羥基官能團。如本文所用的,醇可以通過存在的碳數目而表征,低級醇具有1-6個碳(即在上式的非環狀醇中n=1-6),中級醇具有4-8個碳,和高級醇具有至少7個碳,優選具有7-12個碳。一些醇包括,但不限于,甲醇(CH3OH)、乙醇(C2H5OH)、丙醇(C3H7OH)和戊醇(C5H11OH)。除非使用n-前綴,如本文中所使用的,醇應被理解為是指具有指定數目的碳的一種或多種碳化合物,并且可以包括所確定的醇的混合群體。
“極性非質子溶劑”是具有與質子溶劑相同的離子離解力,但缺乏酸性氫的溶劑。因此,極性非質子溶劑不使陰離子溶劑化,這可能抑制后續的化學反應。這些溶劑通常具有中間介電常數和極性。典型的非質子溶劑不顯示氫鍵結合和不具有酸性氫,但能夠穩定離子。親核 試劑在非質子溶劑中比在質子溶劑中更具反應性。
“有機溶劑”是其中包括至少一個碳原子的溶劑。
如本文中所使用的“去垢劑”是易于在水中形成膠束的兩性小分子。通常去垢劑根據它們的親水/疏水特性和離子性基團被歸類。去垢劑通過限制聚集及溶解脂質和其他疏水性分子可用于膜的透化作用/溶解作用,器官或組織的去細胞化,保持純化蛋白質的穩定性。去垢劑的實例可以在例如,2010McCutcheon's Emulsifiers&Detergents North American edition(McCutcheon's Emulsifiers and Detergents)中找到,其通過引用并入本文。“溫和的去垢劑”通常被認為是不破壞溶液中蛋白質的結構的去垢劑。這使得可以測定蛋白質的功能。“溫和的去垢劑”通常具有有利于一個或另一個(如大的頭基,短脂族鏈)的極性/非極性側鏈比率。在一般情況下,非離子型和兩性離子型去垢劑比離子型去垢劑更加溫和。在離子型去垢劑中,膽汁酸和膽汁鹽被認為是溫和的去垢劑。陰離子去垢劑不是溫和的去垢劑。
離子型去垢劑的特征在于它們的帶電的親水性頭基。離子型去垢劑可以是陰離子型或陽離子型的。離子型去垢劑傾向于破壞分子間和分子內的蛋白質-蛋白質相互作用。陽離子去垢劑包括,但不限于,包含所選擇的季胺的陽離子表面活性劑溶液。所選擇的季胺通過季胺氫氧化物和磷酸、硫酸、甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸和檸檬酸組成的組中的酸的反應產生,例如,烷基三甲基銨或烷基芐基二甲基銨,其中所述的烷基含有12、14、16或18個碳。離子型去垢劑包括脫氧膽酸、十二烷基硫酸鈉(SDS)和十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)。
非離子型(或兩性離子)去垢劑的特征在于它們不帶(凈)電荷的親水性頭基。它們是基于聚乙二醇(即系列),糖苷(如辛基硫代葡萄糖苷、麥芽糖苷),膽汁酸如脫氧膽酸(DOC),脂類()或膦氧化物(例如,無機磷化合物如磷酰三氯(CL3P=O)或具有式OPR3的有機磷化合物,其中R=烷基或芳基)。其他的非離子型去垢劑包括乙氧基化脂肪醇 醚和月桂基醚、乙氧基化烷基酚、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、改性的乙氧基化和/或丙氧基化直鏈醇、聚乙二醇單油酸酯化合物、聚山梨酯化合物和酚類脂肪醇醚。
本文所用的“表面活性劑”被理解為是降低液體的表面張力的化合物,其使得更容易擴散并且降低兩種液體間或者液體和固體之間的界面張力。表面活性劑還可以充當去垢劑、潤濕劑、乳化劑、發泡劑和分散劑中的一種或多種。
術語表面活性劑是表面活性試劑的混合。表面活性劑通常是兩性的有機化合物,這意味著它們同時含有疏水性基團(尾)和親水性基團(頭)。因此,表面活性劑分子中同時含有水不溶性(或油溶性)成分和水溶性成分。表面活性劑分子遷移到水表面,其中不溶性的疏水性基團可以延伸到整體水相的外面,或者進入空氣或者(如果水與油混合的話)進入到油相中,而水溶性的頭基保留在水相中。這種表面活性劑分子在表面處的排列和聚集起到改變水在水/空氣或水/油界面處的表面性質的作用。
膽汁酸是通過形成膠束使脂肪溶劑化的類固醇酸。膽汁酸可用作去垢劑和表面活性劑。膽汁酸是指質子化(-COOH)的形式。膽汁鹽指的是去質子化的或離子化(-COO-)的形式,并且通常與甘氨酸或牛磺酸偶聯。偶聯的膽汁酸在中性pH下對乳化油脂更有效,因為它們比未偶聯的膽汁酸更加離子化。膽汁鹽常用作去垢劑以在蛋白質純化和組織化學方法中使脂質溶劑化。膽汁鹽也可以用作表面活性劑。除非上下文中另有明確說明,如本文使用的膽汁酸被理解為包括膽汁酸鹽。膽汁酸包括,但不限于,膽酸、鵝脫氧膽酸、乙醇酸、牛磺膽酸、脫氧膽酸和石膽酸。在研究中脫氧膽酸用作去垢劑以用于分離膜結合蛋白。脫氧膽酸鈉(脫氧膽酸的鈉鹽)經常被用來作為生物去垢劑來裂解細胞及增溶細胞和膜成分。
“臨界膠束濃度”或“CMC”指的是能夠形成膠束的兩親性分子如表面活性劑或去垢劑的內在特性,以及起到自發和動態形成膠束的功能所需的膽汁酸量的溶液中兩性分子的內在特性。表面活性劑(或能夠 形成膠束的任何兩親分子)一旦引入到系統中,他們開始分配成界面,從而通過a)降低界面能量(按面積×表面張力計算的)和b)通過從水的接觸中除去表面活性劑的疏水部分降低系統的自由能。隨后,當表面活性劑的表面覆蓋率增加和表面自由能(表面張力)減小時,表面活性劑聚集成膠束,從而通過減小表面活性劑的疏水部分與水的接觸面積降低系統的自由能。當達到CMC時,表面活性劑的任何進一步增加會提高膠束的數目。在本文所提供的方法中,表面活性劑使用的典型濃度使得在樣品中達到臨界膠束濃度。
如本文所用的“鹽”是離子化合物,其中離子的比例使得電荷抵消,從而使總體化合物是電中性的。“無機鹽”包括,例如包括氧化物、碳酸鹽、硫酸鹽和鹵化物的鹽。鹵化物包括氟化物(F-)、氯化物(Cl-)、溴化物(Br-)、碘化物(I-)和砹化物(At-)。無機鹵化物鹽包括,例如,氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、碘化鉀(KI)、氯化鋰(LiCl)、氯化銅(II)(CuCl2)、氯化銀(AgCl)和氟化氯(ClF)。如本文所用的,“鹽水溶液”是無機鹽溶液。
本文中所使用的“飽和溶液”通過其物理化學性的典型定義理解為不能溶解更多的物質且其額外量將呈現為沉淀的物質溶液。這種最大濃度點(飽和點)取決于液體的溫度以及所涉及的物質的化學性質。如本文中所使用的,飽和度將在環境溫度下測定。
如本文所使用的“第一提取緩沖液”包括極性質子溶劑和/或有機溶劑。用于第一提取緩沖液的極性質子溶劑包括,但不限于,醇類,其包括非環狀醇,如丁醇、丙醇(即,異丙醇和/或正-丙醇)、乙醇、甲醇、己醇、辛醇等;甲酸、乙酸和水。如本文所使用的,第一溶劑促進蛋白質的結構破壞,細胞結構破壞(例如,通過在細胞膜中產生孔),促進至少蛋白質的有限提取和促進蛋白質沉淀中的至少一種。如本文所使用的,第一溶劑促進蛋白質的結構破壞,細胞結構破壞(例如,通過在細胞膜中產生孔),促進至少蛋白質的有限提取和促進蛋白質沉淀中的至少兩種。如本文所使用的,第一溶劑促進蛋白質的結構破壞,細胞結構破壞(例如,通過在細胞膜中產生孔),促進至少 蛋白質的有限提取和促進蛋白質沉淀中的至少三種。如本文所使用的,第一溶劑促進蛋白質的結構破壞,細胞結構破壞(例如,通過在細胞膜中產生孔),促進至少蛋白質的有限提取和促進蛋白質沉淀中的全部。第一提取緩沖液與第二提取緩沖液不同。在某些實施方式中,所述第一提取緩沖液不是甲醇。
如本文所使用的“第二提取緩沖液”包括非極性溶劑,例如有機溶劑。第二提取緩沖液可包括,但不限于,苯、甲苯、二甲苯、己烷、庚烷、辛烷、己烷類、環己烷、1,4-二氧六環、氯仿、乙醚、異丙醚、二異丁基醚。第二提取緩沖液也可包括烷烴,例如己烷。在某些實施方式中,第二提取緩沖液是極性非質子溶劑,如乙腈。如本文中所使用的,所述第二溶劑促進CoQ10從第一提取緩沖液分離。第二提取緩沖液與所述第一提取緩沖液不同。
在本文中使用的術語“樣品”以其最廣泛的含義使用。如本文使用的“生物樣品”包括,但不限于,可以溶解在任選地含有表面活性劑或去垢劑的第一提取緩沖液中的來自活體生物或先前的活物的任何量的物質。此種活體生物包括但不限于,哺乳動物、人、非人靈長類、小鼠、大鼠、猴、狗、兔和其他動物;植物;單細胞生物,如酵母和細菌。這樣的物質包括,但不限于,血液(例如,全血)、血漿、血清、尿、羊水、滑液、內皮細胞、白細胞、單核細胞、其他細胞、器官、組織、骨髓、淋巴結和脾,例如,來自切除的組織或活檢標本;和如通過離心從任何體液收集的細胞;和原代的和永生化的細胞和細胞系。樣品可以包括新鮮樣品和歷史樣品。如本文中所使用的“基于細胞的樣品”被理解為其中用于檢測的樣品中存在的基本上所有CoQ10(例如,至少90%、至少95%、至少98%、至少99%)存在于樣品的細胞內(即,不是在血清、細胞外液、細胞培養介質中)的樣品。在某些實施方式中,本文提供的方法用于檢測基于細胞的樣品中的CoQ10。
如本文中所使用的和化學中理解的“分光光度法”或“光譜分析”是材料的反射或透射性能隨波長變化的定量測量。如本文所用,分光 光度法涉及可見光、近紫外光和近紅外光的透射和檢測。優選地,分光光度方法用于測定在特定波長下吸收光的混合物組分的濃度,而不必將被檢測的成分與混合物中的其他組分分離(例如,通過大小分離或沉淀)。優選地,本文所提供的分光光度測定方法不包括或需要使用基于大小的排除或分離方法(例如,色譜法或質譜法)從細胞裂解物中分離CoQ10,以允許檢測樣品中的CoQ10。
光譜分析選自于吸收光譜法、熒光X射線光譜法、火焰光譜法、可見光譜法、紫外光譜法、紅外光譜法、近紅外光譜法、拉曼光譜法、相干反斯托克斯拉曼光譜法(CARS)、核磁共振光譜法、光子發射光譜法和穆斯堡爾光譜法。優選地在波長接近或等于275納米(如270-280納米;272-278納米;274-276納米)處采用紫外光譜法檢測CoQ10。在一些實施方式中,在270納米和280納米之間的任何波長處檢測CoQ10,例如270納米、271納米、272納米、273納米、274納米、275納米、276納米、277納米、278納米、279納米或280納米。
如本文所用的,本文所用的CoQ10的“分離”理解為是指在溶劑中,CoQ10不含至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的天然與CoQ10一起存在的物質(例如,細胞組分,生物樣品組分)。
如本文使用的“測定…量”是執行檢測在樣品中分析物(例如,CoQ10)的存在或不存在的步驟。在某些實施方式中,樣品中被測定的分析物的量可以為沒有或低于方法的檢測限度。在某些實施方式中,CoQ10的量可以大于方法的線性檢測范圍。在這種情況下,可在分光光度分析之前將樣品稀釋在適當緩沖液中。
如本文所使用的術語“對照樣品”是指任何臨床相關的對比樣品,包括,例如,來自未患癌癥或其他疾病的健康受試者的樣品,來自具有比待評估受試者較輕或較慢進展的癌癥或其他疾病的受試者的樣品,來自具有一些其他類型的癌癥或疾病的受試者的樣品,來自治療前的受試者的樣品,非病變組織(例如,非腫瘤組織)的樣品,來自相同的來源且接近腫瘤部位的樣品,等等。對照樣品可以包括源自一 個或多個受試者的樣品。對照樣品也可以是在較早的時間點從待評估的受試者獲得的樣品。例如,對照樣品可以是在癌癥或其他疾病發作之前,在疾病的早期階段或者在施用治療或者一部分治療前從待評估的受試者獲取的樣品。對照樣品可以是純化的樣品、化學化合物(例如,CoQ10)、試劑盒提供的蛋白質和/或核酸。這樣的對照樣品可以被稀釋,例如,系列稀釋以允許對試驗樣品中的分析物定量測量。對照樣品也可以是來自動物模型或者來自從疾病的動物模型中得到的組織或細胞系的樣品。由于組織之間CoQ10的水平不同,對照可以是組織特異性的對照。由一組測量值組成的對照樣品的CoQ10水平可以例如,根據任何適當的統計量度確定,諸如,例如,包括平均值、中位數或常見值的中心趨勢量度。
術語“對照水平”指的是CoQ10的公認的或預先確定的水平,可以是臨界值或用于生成標準曲線的一系列值,其用于與用于測定樣品(如來自受試者的樣品)的CoQ10水平的分光光度讀數進行比較。例如,在一個實施方式中,CoQ10的對照水平是基于來自患有或疑似患有特定疾病的受試者的樣品中CoQ10的水平。在另一個實施方式中,CoQ10的對照水平是基于來自具有特定疾病進展速率的受試者的樣品中的水平。在另一個實施方式中,CoQ10的對照水平是基于來自未受影響(即非疾病)的受試者(也就是說,其沒有被診斷或沒有預計會具有特定疾病的受試者)的樣品中的CoQ10水平。在再另一個實施方式中,CoQ10的對照水平是基于來自施用治療之前的受試者的樣品中的CoQ10水平。在另一個實施方式中,CoQ10的對照水平是基于來自未接觸測試化合物的患有疾病或病癥的受試者的樣品中的CoQ10水平。在一個實施方式中,對照是標準化的對照,諸如,例如,使用來自未患特定疾病或病癥的、或診斷患有特定疾病或病癥的受試者群體的或者在臨近異常組織的正常組織(例如,鄰近腫瘤組織的正常組織)中的CoQ10水平平均值預先確定的對照。對照水平也可以是范圍,例如,通常在正常或對照組織中檢測到的水平;或者對照值可以包括在正常范圍的端部的值,例如,相對于正常的上限或正常的 下限檢測的量。
“基線”是指當患者進入研究時或在治療開始時的CoQ10水平并用于與在治療過程中或治療后患者可能具有的CoQ10水平相區分。基線水平可以用作對照水平。
如本文所用的“與對照樣品或受試者相比的改變”被理解為被檢測到的CoQ10的水平為與正常的、未處理的或對照樣品的樣品有統計學差異的水平。對照樣品包括,例如,培養中的細胞(特別是未處理或介質處理的細胞)、一個或更個實驗室試驗動物或一個或多個人類受試者。選擇和測試對照樣品的方法在本領域技術人員的技術能力范圍之內。分析物可以是天然存在的物質,其典型地是由細胞或生物體表達或產生的(例如,CoQ10、抗體、蛋白質),或由報道構建體產生的物質(例如,β-半乳糖苷酶或熒光素酶)。根據用于檢測的方法,變化的量和量度可以不同。與對照的參照樣品相比的改變也可以包括與疾病(如癌癥)相關的或診斷該疾病的一種或多種體征或癥狀的變化。統計顯著性的確定在本領域技術人員的能力范圍內,例如,構成陽性結果的與平均值的標準偏差的數量。
如本文所使用的,“混合”等理解為合并或摻混多種組分,例如,兩種或多種液體。混合可以是連續的或間斷的。混合可以,例如,通過攪動其中含有組分的容器(即,機械攪拌)、通過磁力攪拌器、通過超聲處理、通過渦旋或者其導致組分有效混合的任何其他方法進行。在優選的實施方式中,優選的是不產生干擾隨后檢測方法的氣泡的混合方法,特別是存在表面活性劑或去垢劑的情況中。在某些實施方式中,可以包括消泡劑以減少或防止發泡,只要消泡劑不干擾CoQ10的檢測。
如本文所使用的,“環境溫度”應理解為在實驗室中的環境溫度,例如,通常為約15℃至約30℃,優選約18℃到約25℃。如本文所用的,冷卻至“環境溫度”是冷卻到允許本發明的處理樣品的含水層和有機層相分離的溫度。可以采用水浴、溫度模塊、鼓風機或其他設備進行冷卻;或簡單地通過允許樣品達到環境溫度進行冷卻。
如本文所使用的,“加熱”樣品被理解為將樣品溫度增加至約50℃至約100℃、約55℃至約90℃、60℃至約80℃、約60℃至約70℃、約62℃至約68℃、約63℃至約67℃或約65℃;或任何所提供的值包括的范圍。加熱可以使用水浴、溫度模塊、鼓風機、孵育器或其它裝置來執行。
提取效率被確定為使用本發明的方法提取的CoQ10量相對于使用單獨甲醇提取的CoQ10量的效率,單獨甲醇提取常規地在使用質譜方法檢測CoQ10之前用于CoQ10提取。在某些實施方式中,提取后,用分光光度法檢測CoQ10。在某些實施方式中,提取后,用LC/MS/MS檢測CoQ10。在某些實施方案中,提取后,用分光光度法檢測一個樣品的CoQ10,和將LC/MS/MS用于其它樣品。提取效率表示為比使用單獨甲醇的提取方法提高的效率倍數,例如,效率提高約2-、3-、4-、5-、7-、10-、15-、20-、25-、30-、40-、50-、75-或100倍或更高。
如本文所使用的“自動化”被理解為由機器所進行的,并不需要手工的樣品或試劑處理的過程。可以理解,需要某些樣品和設備的準備以允許通過機器處理樣品,例如,確定分析的樣品的適當量、將樣品置于適當的容器中以進行處理、將試劑載入儀器中、對機器編程和數據分析。如本文中所使用的,如果所有要求保護的步驟是自動的,則該過程是自動化的。
如本文所用,輔酶Q10氧化形式的同位素標記的類似物(CoQ10-d6)是具有下述結構式的化合物:

如本文所用的,輔酶Q10還原形式的同位素標記的類似物(CoQ10H2-d6)是具有下述結構式的化合物:

在一些實施方式中,CoQ10H2-d6是通過CoQ10-d6與一種或多種還原劑反應而合成的。在一些實施方式中,還原劑是硼氫化鈉(NaBH4)。
如本文使用的,“內標”應理解為是以已知量直接加入含分析物的每個樣品中的化學物質。分析物的存在量然后相對于作為校準物的內標測定。
在一些實施方式中,內標是同位素標記的內標,并且是分析物分子的同位素標記的形式。由分析物所產生的質譜信號不同于由同位素 標記的標準產生的質譜信號,該差異依賴于摻入分析物的同位素標記形式中的同位素原子的數目。在一些實施例中,CoQ10-d6是起到內標功能的CoQ10的同位素標記形式。在一些實施例中,CoQ10H2-d6是起到內標功能的CoQ10H2的同位素標記形式。
如本文使用的術語“質譜法”或“MS”指的是通過其質量來鑒定化合物的分析技術。MS是指基于其質荷比或“m/z”過濾、檢測和測量離子的方法。MS技術一般包括:(1)電離化合物以形成帶電荷的化合物;和(2)檢測帶電荷的化合物的分子量,和計算質荷比。可以通過任何合適的手段離子化和檢測該化合物。“質譜儀”一般包括離子發生器和離子檢測器。在一般情況下,一種或多種目的分子被電離,且離子隨后被引入質譜儀,在其中,由于磁場和電場的組合,離子遵循取決于質量(“m“)和電荷(”z“)的空間路徑。參見,例如,6,204,500號美國專利,題為“Mass Spectrometry From Surfaces”;6,107,623,題為“Methods and Apparatus for Tandem Mass Spectrometry”;6,268,144,題為“DNA Diagnostics Based On Mass Spectrometry”;6,124,137,題為“Surface-Enhanced Photolabile Attachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes”;Wright等,Prostate Cancer and Prostatic Diseases 1999,2:264-76;以及Merchant和Weinberger,Electrophoresis2000,21:1164-67。
如本文使用的術語“在負離子模式下操作”指的是其中生成和檢測負離子的質譜方法。在本文中使用的術語“在正離子模式下操作”指的是在其中生成和檢測正離子的質譜方法。
如本文使用的術語“離子化”或“電離”是指產生具有等于一個或多個電子單位的凈電荷的分析物離子的過程。負離子是那些具有一個或多個電子單位的凈負電荷的離子,而正離子是那些具有一個或多個電子單位的凈正電荷的離子。
如本文使用的術語“電子電離”或“EI”是指其中在氣相或蒸汽相的目的分析物與電子流相互作用的方法。電子與被分析物的沖擊產生分析物離子,其然后可進行質譜分析。
如本文使用的術語“化學電離”或“CI”是指其中試劑氣體(例如氨)經受電子碰撞,以及分析物離子通過試劑氣體離子與分析物分子的相互作用而形成的方法。
本文所用的術語“快速原子轟擊”或“FAB”是指其中高能原子(通常是氙或氬)束撞擊非揮發性樣品的方法,從而解吸和電離樣品中包含的分子。測試樣品被溶解在粘性液體基質中,如甘油、硫代甘油、間硝基芐醇、18-冠-6冠醚、2-硝基苯基辛基醚、環丁砜、二乙醇胺和三乙醇胺。化合物或樣品的合適基質的選擇是經驗的過程。
如本文使用的術語“基質輔助激光解吸電離”或“MALDI”是指其中非揮發性樣品被暴露于激光照射的方法,其通過各種電離途徑(包括光致電離、質子化、去質子化和群集衰變)解吸和電離在樣品中的分析物。對于MALDI,將樣品與能量吸收基質混合,其有利于分析物分子的解吸。
本文使用的術語“表面增強激光解吸電離”或“SELDI”指的是其中非揮發性樣品被暴露于激光照射的另一種方法,其通過各種電離途徑(包括光致電離、質子化、去質子化和群集衰變)解吸和電離樣品中的分析物。對于SELDI,樣品通常是結合于優先保留一個或多個目的分析物的表面。如MALDI中一樣,這個過程也可以采用能量吸收材料以促進離子化。
如本文使用的術語“電噴霧電離”或“ESI”是指其中將溶液沿短的毛細管的長度傳遞到施加有高的正或負電勢的端部的方法。到達管的末端的溶液被氣化(霧化)成在溶劑蒸氣中的非常小的溶液液滴的噴射或噴霧。這種液滴的輕霧流經被稍微加熱以防止冷凝和蒸發溶劑的蒸發室。隨著液滴變得更小,電表面電荷密度增加直至相同電荷之間的自然斥力引起離子以及中性分子被釋放。
如本文所用的術語“大氣壓化學電離”或“APCI”指的是類似于ESI的質譜方法;然而,APCI通過在大氣壓力下等離子體內發生的離子分子反應產生離子。等離子體通過噴霧毛細管和反電極之間的放電維持。然后離子通常通過使用一組差異抽吸排氣階段被提取到質量分析 器中。干燥和預熱的N2氣體的逆流可以用于改善溶劑的除去。在APCI中的氣相電離用于分析低極性物質可能比ESI更有效。
如本文所用的術語“大氣壓光致電離”或“APPI”是指其中用于分子M光電離的機制是光子吸收和電子噴射而形成分子離子M+的質譜形式。因為光子能量通常僅高于電離電勢,分子離子不容易發生離解。在許多情況下,可以不需要色譜分析而分析樣品,從而節省很多時間和費用。在水蒸汽或質子溶劑存在下,分子離子可以提取H以形成MH+。如果M有很高的質子親和力,這往往會發生。這并不影響定量精度,因為M+和MH+的總和是恒定的。在質子溶劑中的藥物化合物通常被觀察為MH+,而非極性化合物如萘或睪酮通常形成M+。參見,例如,Robb等,Anal.Chem.2000,72(15):3653-3659。
如本文使用的術語“感應耦合等離子體”或“ICP”是指其中樣品在足夠高的溫度與部分電離的氣體相互作用以使得大多數元素被霧化和電離的方法。
如本文所用的術語“場解吸”是指其中非揮發性測試樣品被放置在電離表面上和強電場被用于產生分析物離子的方法。如本文所使用的“解吸”是指分析物從表面除去和/或分析物進入氣相中。激光二極管熱解吸(LDTD)是其中含有分析物的樣品由激光脈沖熱解吸到氣相中的技術。激光打擊具有金屬基底的特制96孔平板的背面。激光脈沖加熱基底且熱量導致樣品轉移到氣相中。氣相樣品然后可吸入到電離源中,其中所述氣相樣品電離以備用于質譜儀中的分析。當使用LDTD時,可通過本領域已知的任何合適的技術來實現氣相樣品的電離,例如通過電暈放電電離(例如通過APCI)。
如本文使用的術語“選擇性離子監測”是用于質譜儀的檢測模式,其中只檢測在相對窄的質量范圍內的離子,通常為約一個質量單位。
如本文所用的“多反應模式”有時被稱為“選擇反應監測”或“多反應監測”,是用于質譜儀的檢測模式,其中前體離子和一種或多種碎片離子被選擇性地檢測。
如本文使用的術語“量化的下限”、“定量的下限”或“LLOQ”指的是 其中測量變成為有定量意義的點。在該LOQ處的分析物反應是可識別的,離散的和可重復的,具有小于20%的相對標準偏差(RSD%)和80%至120%的準確度。
如本文使用的術語“檢測限”或“LOD”是測量值大于與之相關聯的不確定性的點。LOD是其中值超出與其測量相關的不確定性的點,并且被定義為在零濃度下的平均值RSD的三倍。
如本文使用的“琥珀色小瓶”是由琥珀色玻璃制成的小瓶。在一些實施例中,琥珀色小瓶用于使包含在其中的樣品避光。
如本文使用的“低溫模塊”是可以保持試管持續冷卻長時間段的試管架。
如本文所用的“試劑盒”包括以在合適的包裝內用于實施本發明方法的兩種或更多種試劑。例如,試劑盒可包括液體或凍干形式的裂解緩沖液、第一提取緩沖液、第二提取緩沖液和去垢劑或表面活性劑中的任何一種或多種。在某些實施方式中,所述試劑盒可包括表面活性劑和/或用作對照的CoQ10,例如,以允許生成標準曲線。試劑盒還可以包括用于執行本發明方法的說明書。
如本文所用的“獲得”在本文中理解為制造、購買或以其他方式擁有。
除非本文另有定義,與本公開結合使用的科學和技術術語應當具有由本領域普通技術人員通常理解的含義。該術語的含義和范圍應當是清楚的;然而,在存在任何潛在歧義的情況下,本文提供的定義優先于任何字典或外部定義。
此外,除非上下文另有要求,單數術語應包括復數,且復數術語應包括單數。“一”、“一個”和“該”應當理解為包括復數和單數,除非另有說明或從上下文中顯而易見。如本文中所使用的“或”應被理解為包括的,除非另有說明或從上下文中顯而易見。
此外,如“元件”或“組分”的術語涵蓋包含一個單元的全部元件和組分,而且涵蓋包括多于一個子單元的元件和組分,除非另有特別聲明。
術語“包括”和“包含”等不是限制性的,且應該被理解為允許包括其它成分或步驟。術語“如”在本文中用于指短語“諸如但不限于”,并且可以與之互換使用。
如本文使用的“基本上由......組成”等應理解為是將化合物、方法或試劑盒限制至指定的材料或步驟“以及那些不實質性影響本發明的基本和新穎特性”的材料或步驟。例如,提取方法可以基本上由使用第一提取緩沖液、第二提取緩沖液、去垢劑以及任選的鹽的提取組成而沒有進一步的提取或純化步驟。然而,也可以包括其它步驟,例如轉移或混合樣品。
除非上下文另有說明,本文的所有值可以理解為由術語“約”來修飾。可接受的變異量取決于特定的值,但通常被認為是在平均值的兩個標準差之內。“約”可被理解為最高10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.1%或0.01%的變異。本文所提供的范圍應理解為包括范圍內的所有值,或者該范圍內的范圍或值的任意子集。例如,1-10應理解為包括1、2、3、4、5、6、7、8、9和10,或這些值的任何范圍或子集,以及適當時的分數值。類似地,如“高達”某一值所提供的范圍被理解為包括從零至該范圍的上端的值;且“小于”應理解為包括從該數至零的值,例如,小于5被理解為5、4、3、2、1或0或者5至0的范圍內的值的分數部分。“一個或多于一個”被理解為包括一個和大于1的所有值,例如,1、2、3、5、6、7、8等,或從1開始的任何特定值。
“至少一部分”應理解為時間、體積或從其中獲得該部分的其他實體的某些分數(例如,至少約1%)至基本上其全部(例如,約100%)或其全部。例如,在孵育期中混合或加熱的樣品不需要在整個孵育期中混合或加熱。同樣地,通常少于全部第二提取緩沖液的部分被分析以測定在從樣品所提取的CoQ10的濃度。
當提供了液體的比率或液體物質的百分溶液/懸浮液時,除非另外說明,該比率是體積-體積比。當提供了固體物質的百分溶液時,除非另有說明,該比率是重量-體積比。
本文的變量的任何定義中的化學基團列表的記載包括該變量作為所列基團的任何單一基團或組合的定義。本文的變量或方面的實施方向的記載包括該實施方式作為任何單一實施方式或與任何其他實施方式或其部分的組合。當沒有提供立體化學時,所有立體異構體、外消旋混合物或單一立體異構體均包括在術語中。當提供了結構和該結構的名稱兩者時,在不一致的情況下,該結構優于名稱。
本文所提供的任何實施方式、方法或試劑盒可與本文所提供的任何其它實施方式、方法或試劑盒組合。
II.方法和用途
提取方法
本文提供了用于測定生物樣品中CoQ10的量的方法和試劑盒。本文提供的提取方法也可與非分光光度的檢測方法一起使用,包括其中在檢測之前輔酶Q10基于大小與樣品中的其它成分分離的方法。
本發明提供了快速、有效的檢測樣品中CoQ10的方法。本文提供的方法可以適應于自動化的高通量篩選方法,例如,用于臨床實驗室中。這通過使用本文提供的方法獲得高水平的CoQ10提取并且通過使用不需要基于分子量分離CoQ10或檢測CoQ10的光譜學方法檢測CoQ10而成為可能,這使得該方法能夠適用于高通量篩選方法。本文所提供的提取方法也可與包括在檢測之前通過大小(例如,液相色譜法)分離CoQ10的CoQ10檢測方法一起使用。在一些實施方式中,液相色譜之后是存在于樣品中的CoQ10的質譜分析。然而,本發明的優選方法不包括基于大小將CoQ10與樣品中存在的其它成分分離的步驟。
在某些實施方式中,提供的方法包括向樣品(如組織樣品或細胞樣品)加入第一提取緩沖液和第二提取緩沖液。然后使得相分離,并且CoQ10被保留在第二提取緩沖液層中。然后光譜分析第二提取層以測定存在于樣品中的CoQ10量。
在某些實施方式中,同時向樣品中加入第一提取緩沖液和第二提 取緩沖液(例如,作為乳液,依次添加,在添加之間沒有預定的孵育時間,例如,在彼此的30秒內、在彼此的20秒內、在彼此的10秒內;沒有定義的步驟,例如,其間的混合和/或在加熱)。在某些實施方式中,在通過例如機械攪拌、超聲處理或用磁力攪拌器將各組分充分混合在一起之前將所述第一和第二提取緩沖液加入到樣品中。在某些實施方式中,在加入第二提取緩沖液之前,將樣品與第一次提取緩沖液一起孵育。在某些實施方式中,將表面活性劑或去垢劑加入到樣品中。在某些實施方式中,在向樣品中加入第一提取緩沖液之前,將表面活性劑或去垢劑與所述第一提取緩沖液混合。在某些實施方式中,與第一提取緩沖液同時將所述表面活性劑或去垢劑加入到樣品中,并任選地與第二提取緩沖液同間添加。在某些實施方式中,在加入第二提取緩沖液后將無機鹽加入到樣品中。在某些實施方式中,無機鹽是氯化物鹽,如氯化鈉。在某些實施方式中,鹽以飽和鹽溶液(優選在水中)的形式加入。在某些實施方式中,所述鹽存在的終濃度為約1mM至約50mM(例如,約5mM至約45mM、約10mM至約35mM、約1mM至約10mM、約1mM至約25mM、約10mM至約50mM、約25mM至約50mM、約20mM至約30mM、約15mM至約35mM;或由提供的值所包括的任何范圍)。
在某些實施方式中,在與第一提取緩沖液的孵育期的至少一部分期間內將樣品加熱,并且任選地與表面活性劑或去垢劑一起,在孵育期的至少一部分期間。在某些實施方式中,在孵育期的至少一部分期間內將樣品混合。在某些實施方式中,在加入第二提取緩沖液后將樣品混合和/或加熱。在某些實施方式中,樣品在加入所述第一和第二提取緩沖液及任選的表面活性劑或去垢劑后孵育。在某些實施方式中,在第一提取緩沖液的存在下加熱樣品。在某些實施方式中,在第二提取緩沖液的存在下加熱樣品。在某些實施方式中,在第一和第二提取緩沖液的存在下加熱樣品。在某些實施方式中,在第一緩沖液或第二緩沖液或者第一和第二緩沖液兩者中將樣品加熱至少5秒、至少10秒、至少15秒、至少20秒、至少30秒、至少40秒、至少50秒、 至少60秒、至少75秒、至少90秒、至少105秒或至少120秒。在某些實施方式中,與在提取過程中不加熱的樣品相比,所述加熱步驟將提取的CoQ10量提高至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%或至少50%,或更多。
第一提取緩沖液與第二提取緩沖液的物理性質的差異導致第一和第二提取緩沖液的自發相分離。在某些實施方式中,可通過主動地或被動地將加熱的樣品冷卻至環境溫度(即,標準的實驗室溫度、自動化的高通量分析裝置內的溫度)來促進分配。在相分配時,CoQ10存在于所述第二提取相中,也就是說,在非極性溶劑中。
在某些實施方式中,分配后,從樣品中移除至少一部分第二提取相以利于光譜分析。在某些實施方式中,將第二提取相移到石英容器(例如,小池,適當形狀的管)中用于在275納米的波長下讀取以定量檢測CoQ10的存在。本發明提供了優于其他用于檢測CoQ10的定量方法的優勢,其中所述其他方法需要基于大小將CoQ10與樣品的基本上所有的其它組分分離以使其能夠進行檢測,例如,使用色譜方法或質譜方法,其需要從混合物中分離分子物質,例如通過柱或電噴霧,然后檢測和鑒定混合物中物質的各種成分。本文提供的提取方法使得能夠定量檢測樣品中的CoQ10,而不基于分子量而檢測CoQ10。結果,該方法很容易適應于高通量方法,并且可以快速地進行(例如,在約10分鐘或更少時間內;在約5分鐘或更少時間內;在約2分鐘或更少時間內;在約1分鐘或更少時間內;在大約30秒或更少時間內)。
本文提供的提取方法在從樣品材料(例如,典型的生物材料,例如在培養中生長的或來自受試者樣品的細胞)中提取CoQ10中是高效的。提取效率被測定為使用本發明的方法提取的CoQ10的量相對于使用單獨甲醇提取的CoQ10的量,單獨甲醇提取是在檢測之前使用液相色譜法之后是質譜方法常規用于CoQ10提取的方法。提取效率表示為相對于使用單獨甲醇的提取方法和優選地使用單獨甲醇的提取方法隨后用液相色譜分離和質譜檢測方法的效率倍數提高。使用 本發明的方法,提取的效率為至少2-、3-、4-、5-、7-、10-、15-、20-、25-、30-、40-、50-、75-或100倍或更高。在某些實施方式中,提取的效率是至少或約5-、11-、14-、28-、82-、545-或1863-倍或更高。
使用的樣品量和提取的體積取決于許多因素,其中包括,但不限于,可用樣品量、用于分光光度分析的提取小瓶和比色池的體積。例如,當樣品被人工處理時,通常使用較大的體積,而當使用自動方法時,可以使用較小的樣品體積。
第一提取緩沖液與第二提取緩沖液的比例優選為約5:1至約1:1(v/v)(例如,5:1、4:1、3:1、2:1、1:1,或者在該任何值所包括的范圍內的分數值,如4.5:1、3.3:1、2.1:1)。當存在時,表面活性劑或去垢劑與所述第一提取緩沖液的比例優選為約1:50至約1:1(體積/體積)(1:50、1:45、1:40、1:35、1:30、1:25、1:20、1:15、1:10、1:5、1:1)。表面活性劑或去垢劑的濃度優選為約0.01mM至約10mM(例如,約0.01mM至約1mM、約1mM至約10mM、約0.1mM至約5mM、約0.01mM至約2mM、約0.1mM至約7.5mM、約1mM至約10mM或由所提供的任何值所包括的范圍)。可以理解,某些去垢劑和表面活性劑是具有近似分子量的混合的聚合物,并因此可以只提供近似的摩爾濃度。
利用CoQ10-d6和CoQ10H2-d6作為內標
本文還提供了使用質譜如LC-MS/MS檢測和定量樣品中氧化和還原形式的CoQ10的方法。可以分別地檢測和定量樣品中氧化和還原形式的CoQ10或者它們可在單一分析運行中被同時檢測和定量。在一個具體實施方式中,可以使用本發明的方法定量樣品中存在的還原的CoQ10(CoQ10H2)的量。這些方法允許CoQ10H2被精確和可靠的量化,這是重要的,因為CoQ10H2是CoQ10的生物活性形式。
在一些實施方式中,檢測和定量氧化和還原形式的CoQ10的方法可以與本文中描述的樣品提取方法或與其它提取方法相結合。例如,在一些實施方式中,可以通過使用一種提取緩沖液,例如,1-丙醇, 提取樣品來檢測和定量樣品(例如,生物樣品)中的氧化和還原形式的CoQ10。在其他實施方式中,可以通過根據本文描述的方法使用第一和第二提取緩沖液提取樣品來檢測和定量樣品(例如,生物樣品)中的氧化和還原形式的CoQ10。
氧化和還原形式的CoQ10的定量通過使用其相應的同位素標記的形式作為內標實現,例如,氧化的和還原的氘化CoQ10。在一些實施方式中,CoQ10-d6作為內標用于測定樣品中CoQ10的量。在一些實施方式中,CoQ10H2-d6被用作內標用于測定樣品中CoQ10H2的量。在一些實施方式中,將CoQ10-d6和CoQ10H2-d6都加入到樣品中用于同時測定樣品中所含的CoQ10和CoQ10H2的量。可以根據加入到樣品中的已知量的CoQ10-d6和根據由CoQ10和CoQ10-d6產生的相對質譜信號計算樣品中CoQ10的量。類似地,可以根據加入到樣品中的已知量CoQ10H2-d6和根據由CoQ10H2和CoQ10H2-d6產生的相對質譜信號計算樣品中CoQ10H2的量。
使用CoQ10-d6作為內標用于定量樣品中的CoQ10以及使用CoQ10H2-d6用于定量樣品中的CoQ10H2提供了優于使用CoQ10-d6或類似物如CoQ9或CoQ11作為內標用于同時定量CoQ10和CoQ10H2的已知方法的優勢。具體而言,本文所描述的定量方法提供了CoQ10H2定量的更高精確度,因為在該方法中用作內標的CoQ10H2-d6具有與CoQ10H2非常相似的性質,例如,提取回收率、電離反應和色譜保留時間,但還產生不同的質譜信號。與此相反,使用CoQ10-d6、CoQ9或CoQ11作為內標定量CoQ10H2導致量化偏差和較低的精度。
可以在樣品處理過程中的任何點,將內標例如CoQ10-d6或CoQ10H2-d6添加到樣品中。在一些實施方式中,在樣品處理的開始(例如,提取時)將內標添加到各樣品。在一些實施方式中,所述樣品包含血液,和在血漿提取之前將內標添加到樣品中。
將被添加到各樣品中的內標例如,CoQ10-d6或CoQ10H2-d6的量不應干擾由分析物CoQ10或CoQ10H2產生的質譜信號。在一些實施 方式中,被添加到各樣品的CoQ10-d6或CoQ10H2-d6的量應導致在劑量反應曲線的線性范圍內的CoQ10-d6或CoQ10H2-d6濃度。在一個優選實施方式中,被添加到各樣品的CoQ10-d6或CoQ10H2-d6的量應產生20至2500ng/mL之間的濃度(例如,50至2000ng/mL,或100至1500ng/mL或100至1000ng/mL)。
在一些實施方式中,本發明提供用于測定在樣品處理(例如,樣品提取)過程中或者作為其結果發生的CoQ10H2降解的程度的方法。CoQ10H2降解的例子是CoQ10H2的氧化以產生部分氧化的形式(泛半醌,CoQ10H)或完全氧化形式(泛醌,CoQ10)。暴露于發生在樣品處理過程中和將樣品引入質譜儀中以檢測CoQ10和/或CoQ10H2之前發生的光和高溫可以加重CoQ10H2的降解。在一些實施方式中,可以基于樣品處理前加入到樣品中的已知量CoQ10H2-d6和基于測得的由氧化導致的剩余CoQ10H2-d6與CoQ10H-d6和CoQ10-d6的相對信號計算CoQ10H2氧化的程度。在一個優選的實施方式中,通過成為氧化的CoQ10H2-d6的量和在樣品處理過程中所產生的CoQ10-d6的量調整在樣品中測得的CoQ10和CoQ10H2的量。
使用質譜和內標檢測CoQ10和CoQ10H2的方法
在某些實施方式中,本發明提供了一種用于測定CoQ10和CoQ10H2的量的LC-MS/MS方法。對于兩種形式,這種方法在20-2500ng/mL的臨床相關范圍內是線性的,r2>0.99。這兩種形式的%CV及批間和批內分析的檢測精度/準確度值在10%以下。
在一些實施方式中,本發明提供了用于測定樣品中CoQ10和/或CoQ10H2的量的方法,所述方法包括:
a)提供樣品;
b)任選向樣品添加已知量的CoQ10-d6和/或CoQ10H2-d6;
c)處理樣品;
d)任選地將樣品進行液相色譜法;
e)通過質譜檢測CoQ10和/或CoQ10H2及(如適用)CoQ10-d6 和CoQ10H2-d6;和
f)通過將其與已知量的檢測到的CoQ10H2-d6比較來測定樣品中檢測的CoQ10和/或CoQ10H2的量。
在一些實施方式中,整個方法是在降低的光下并使用琥珀色小瓶進行的以盡量減少CoQ10H2的降解。在一些實施方式中,使用預冷卻的收集管進行樣品采集以盡量減少溫度引起的CoQ10H2降解。在進一步的實施方式中,可以將收集管預先冷卻至0℃至-20℃的溫度。在優選的實施方式中,可以將收集管預先冷卻至-20℃。在另一個實施方式中,可以將收集管預先冷卻至約-20℃至約-80℃,例如約-20℃、約-25℃、約-30℃、約-35℃、約-40℃、約-45℃、約-50℃、約-55℃、約-60℃、約-65℃、約-70℃、約-75℃或約-80℃。
在一些實施方式中,樣品是血液,例如,在含肝素鋰作為抗凝劑的預冷BD管中收集并立即使用本領域已知的可用于從血液中提取血漿的標準方法處理的人血。在進一步的實施方式中,在收集血液樣品30分鐘內,優選地15分鐘內分離血漿。在可選的實施方式中,樣品是血液,例如,人的血液,其被收集在預冷卻的肝素化小瓶中并保持在低溫下。
在一些實施方式中,其中血液樣品沒有在采集后的30分鐘內處理以提取血漿,步驟c可包括使用在本領域中已知的任何血漿提取方法提取血漿。
在一些實施方式中,步驟c可以包括蛋白質沉淀以從樣品除去大部分蛋白質,從而在上清液中留下CoQ10、CoQ10H2和他們的同位素標記的類似物(如適用)。可將樣品離心以從沉淀的蛋白質分離液體上清液;可選地,樣品可以被過濾以除去沉淀的蛋白質。然后可將得到的上清液或濾液直接用于質譜分析;或者可選地,用于液相色譜法和隨后的質譜分析。
在其它實施方式中,步驟c可以包括使用單一溶劑提取的蛋白質沉淀。在一些實施方式中,用于提取的溶劑被選擇以使得分析物分子,例如CoQ10和CoQ10H2,放置在溶劑中一段時間時是穩定的,例如, 沒有顯著程度的降解。在一些實施方式中,該時間長度可以長達6小時,如5分鐘、10分鐘、30分鐘、60分鐘、2小時、4小時或6小時。在一些實施方式中,所述溶劑可以是己烷、甲醇或1-丙醇。在一些實施方式中,使用預冷卻的試管、預冷卻的低溫模塊和預冷卻的溶劑進行步驟c以盡量減少溫度引起的CoQ10H2的降解。在進一步的實施方式中,可以將試管、低溫模塊和溶劑預冷卻到約0℃至約-20℃的溫度,例如,約-2℃、約-5℃、約-10℃、約-12℃、約-15℃或約-20℃。在優選實施方式中,可以將試管、低溫模塊和溶劑預冷卻到約-20℃的溫度。在另一個實施方式中,可以將試管、低溫模塊和溶劑預冷卻至約-20℃至約-80℃,例如約-20℃、約-25℃、約-30℃、約-35℃、約-40℃、約-45℃、約-50℃、約-55℃、約-60℃、約-65℃、約-70℃、約-75℃或約-80℃。
在一些實施方式中,步驟c可以包括,如在本申請其它地方描述的,使用第一提取緩沖液和第二提取緩沖液的樣品提取。
在一些實施方式中,可在步驟d中將所提取的樣品進一步進行液相色譜以分離CoQ10和CoQ10H2及他們的同位素標記的類似物(如適用)。傳統的色譜分析依賴于柱填充,其中通過該柱的樣品的層流是從樣品分離目的分析物的基礎。本領域技術人員將能夠選擇適合用于CoQ10和CoQ10H2的LC,包括HPLC、儀器和柱。色譜柱通常包括介質(即,填充材料)以利于化學成分的分離(即分餾)。該介質可包括微小顆粒,或可包括具有多孔通道的單片材料。該介質的表面通常包括與各種化學部分相互作用的鍵合表面以促進化學成分的分離。一種合適的鍵合表面是疏水性鍵合表面,如烷基鍵合、氰基鍵合的表面或高純度的二氧化硅表面。烷基鍵合的表面可以包括C-4、C-8、C-12或C-18的鍵合烷基。在優選的實施方式中,柱是C18微粒填充柱(例如Agilent C18 Zorbax柱)。層析柱包括用于接收樣品的入口端口和用于排出包括分餾的樣品的流出物的出口端口。
可使用導致CoQ10和CoQ10H2有效分離的任何層析方法。在一些實施方式中,使用等度洗脫模式(即,其中流動相的組成保持恒定) 完成CoQ10和CoQ10H2從反相柱的洗脫。在一些實施方式中,流動相的組成為30:70至90:10A:B,其中A為5mM的甲酸銨和B為1-丙醇。流動相的組成可通過用任何其它具有相似極性的溶劑來替代5mM甲酸銨和1-丙醇來改變,其包括,但不限于乙醇、2-丙醇、丙酮或乙腈。在一個優選實施方式中,流動相的組成為80:20A:B,其中A為5mM的甲酸銨和B為1-丙醇,和色譜分離進行5分鐘。
在一些實施方式中,可以在色譜過程中檢測到CoQ10和CoQ10H2及他們的同位素標記的類似物(如適用)。在一些實施方式中,檢測可以包括光譜檢測。優選采用紫外光譜法在接近或等于275納米(如270-280納米;272-278納米;274-276納米)的波長處檢測CoQ10。
在優選的實施方式中,在色譜分離后直接將洗脫的CoQ10和CoQ10H2及他們的同位素標記的類似物(如適用)進樣到質譜儀中。在一個可選的實施方式中,可首先收集含有洗脫的CoQ10和CoQ10H2及他們的同位素標記的類似物(如適用)的色譜級分,然后在單獨步驟中將其引入到質譜儀中。
在步驟e中,使用質譜檢測CoQ10和CoQ10H2及他們的同位素標記的類似物(如適用)。在質譜分析過程中,可通過本領域技術人員已知的任何方法對CoQ10和CoQ10H2進行電離。優選使用包括用于電離分餾的樣品并產生帶電分子進行進一步分析的離子源的質譜儀進行質譜分析。例如,可以通過電子電離、化學電離、電噴霧電離(ESI)、光子電離、大氣壓化學電離(APCI)、光致電離、大氣壓光電離(APPI)、激光二極管熱解吸(LDTD)、快速原子轟擊(FAB)、液體二次電離(LSI)、基質輔助激光解吸電離(MALDI)、場電離、場解吸、熱噴射/等離子噴霧電離、表面增強激光解吸電離(SELDI)、電感耦合等離子體(ICP)和粒子束電離進行樣品的電離。本領域技術人員將理解,可以基于待測定的分析物、樣品類型、檢測器類型、正與負模式的選擇等確定電離方法的選擇。
CoQ10和CoQ10H2及他們的同位素標記的類似物可在正或負模式中電離。在一個優選實施方式中,使用ESI在正離子模式下中電離 CoQ10和CoQ10H2及他們的同位素標記的類似物。
一般在質譜技術中,在樣品被電離后,可以分析由此產生的帶正或負電荷的離子以測定質荷比。用于測定質荷比的合適的分析儀包括四極桿分析儀、離子阱分析儀和飛行時間的分析儀。示例性的離子阱方法被描述于Bartolucci,等,Rapid Commun.Mass Spectrom.2000,14:967-73中。
可以使用幾種檢測方式來檢測離子。例如,所選的離子可以被檢測到,即使用選擇性離子監測模式(SIM),或可選地,可以監測由碰撞誘導的解離或中性損失所得的質量轉變(mass transition),例如,多反應監測(MRM)或選擇反應監測(SRM)。在一些實施方式中,使用四極桿分析儀測定質荷比。例如,在“四極”或“四極離子阱”儀器中,振蕩射頻場中的離子經受與電極之間施加的直流電壓、RF信號幅度和質/荷比成比例的力。可以選擇電壓和幅度以使得只有具有特定質/荷比的離子沿四極桿的長度移動,而所有其它離子被偏轉。因此,四極桿儀器對于注入儀器中的離子可以同時作為“質量過濾器”,和作為“質量檢測器”發揮作用。
通過使用“串聯質譜法”或“MS/MS”可以提高MS技術的分辨率。在該技術中,從目的分子產生的前體離子(也稱為母離子)可以在MS儀器進行過濾,并且隨后前體離子斷裂以得到一個或多個碎片離子(也稱為子離子或產物離子),然后在第二MS過程中對其進行分析。通過仔細地選擇前體離子,只有由特定分析物產生的離子被傳遞給碎裂腔,其中與惰性氣體原子的碰撞產生碎片離子。
操作串聯質譜儀的可選模式包括產物離子掃描和前體離子掃描。對于這些操作模式的說明參見,例如,E.Michael Thurman等,Chromatographic-Mass Spectrometric Food Analysis for Trace Determination of Pesticide Residues,Chapter 8(Amadeo R.Fernandez-Alba,ed.,Elsevier 2005)(387)。
通過本領域中已知的許多方法,分析物測定的結果可以與原始樣品中分析物的量相關。例如,假定取樣和分析參數被仔細控制,給定 離子的相對豐度可以與將相對豐度轉換為原始分子的絕對量的表進行比較。可選地,外標可與樣品一起運行,并在由這些標準產生的離子的基礎上構建標準曲線。使用這樣的標準曲線,給定離子的相對豐度可被轉換成原始分子的絕對量。在某些優選的實施方式中,內標被用于生成標準曲線以用于計算維生素D代謝物的量。產生和使用這種標準曲線的方法是本領域眾所周知的,和普通技術人員能夠選擇合適的內標。例如,在優選的實施方式中,CoQ10-d6和CoQ10H2-d6可以用作內標。將離子的量與原始分子的量相關聯的許多其他的方法是本領域的普通技術人員所熟知的。
可以利用自動化機器進行該方法的一個或多個步驟。在某些實施方式中,在線執行一個或多個純化步驟,更優選地可以用在線的方式進行所有的純化和質譜步驟。
在一些實施方式中,如MS/MS,其中前體離子分離用于進一步碎裂,碰撞活化解離(CAD)經常被用來產生碎片離子用于進一步檢測。在CAD中,前體離子通過與惰性氣體碰撞獲得能量,并隨后通過被稱為“單分子分解”的過程而破裂。足夠的能量必須被沉積在所述前體離子中以便使得離子內的某些鍵可能由于增加的振動能量而被打破。
在一些實施方式中,通過使用如下的多反應監測(MRM)的質譜法檢測樣品中的CoQ10和CoQ10H2。樣品(例如,包含步驟d的色譜級分和溶劑的樣品)進入MS/MS分析儀的噴霧器接口和在接口的加熱帶電管道被轉變成蒸氣。通過向溶劑/分析物混合物施加大電壓使樣品中包含的分析物(CoQ10和CoQ10H2及他們的同位素標記的類似物(如適用))電離。隨著分析物離開接口的帶電管道,溶劑/分析物混合物霧化和溶劑蒸發,留下分析物離子。該離子,例如前體離子,通過儀器的孔并進入第一四極。四極1和3(Q1和Q3)是質量過濾器,允許根據質荷比(m/z)選擇離子(即,在Q1和Q3中分別選擇“前體”和“片段”離子)。四極2(Q2)是碰撞池,離子在其中破碎。質譜儀的第一四極(Q1)選擇具有衍生的目的維生素D代謝物的質荷比率的分子。具有正確的質量/電荷比的前體離子被允許傳遞到碰撞 室(Q2)中,而具有任何其它質/荷比的不需要的離子與四極的側面碰撞和被消除。在一些實施方式中,CoQ10的前體產物離子可以是m/z 863.4的離子,和CoQ10H2的前體產物離子可以是m/z 865.4的離子。使用本領域公知的標準方法,普通技術人員能夠鑒別可以被用于在四極2(Q2)中進一步碎裂的CoQ10、CoQ10H2、CoQ10-d6和CoQ10H2-d6的特定前體離子的一種或多種碎片離子。
進入Q2的前體離子與中性氬氣分子碰撞并碎裂。產生的碎片離子(即,產物離子)傳送到四極3(Q3)中,其中分析物的碎片離子被選擇,而其它離子被除去。在一些實施方式中,m/z 197的產物離子對于CoQ10和CoQ10H2被同時檢測。
該方法可以包括在正或負離子模式下進行的MS/MS;優選正離子模式。使用本領域公知的標準方法,普通技術人員能夠識別可以用于在四極3(Q3)中選擇的CoQ10、CoQ10H2、CoQ10-d6和CoQ10H2-d6的特定前體離子的一種或多種碎片離子。
當離子與檢測器碰撞,它們產生被轉換成數字信號的電子脈沖。所獲取的數據被傳遞到計算機,其繪出隨時間收集的離子計數的圖。可以測量對應于特定離子的峰下面積或這些峰值的幅度,并與目的分析物的量相關聯。在某些實施方式中,測量碎片離子和/或前體離子的曲線下面積或者峰幅度以測定CoQ10或CoQ10H2的量。如上所述使用基于內標(例如,CoQ10-d6或CoQ10H2-d6)的一個或多個離子峰的校準標準曲線,給定離子的相對豐度可轉換成原始分析物的絕對量。
下面的實施例用來說明本發明的方法,而不應被理解為限制本發明的范圍。
實施例
實施例1--材料和方法
細胞培養
用于CoQ10定量的分析法被用來測定CoQ10處理各種不同時間 后各種細胞系中的CoQ10水平。在該研究中使用的細胞系是正常的人主動脈平滑肌細胞(HASMC),肝癌細胞系HepG2和人胰腺癌細胞系PaCa2。所有的細胞系是可商購的,并根據來自細胞系的生產商/供應商的說明保存。
制備CoQ10的標準溶液
制備500μM的CoQ10儲備液:在15mL的錐形管中稱取4.32mg的CoQ10,加入10ml正己烷,在65℃的水浴中加熱該管直到CoQ10溶解,和輕輕搖動該管以混合溶液。通過在己烷中稀釋該儲備液制備100μM和50μM的CoQ10儲備液。
試劑組合物
緩沖液A(第一提取緩沖液):100%甲醇
緩沖液B(表面活性劑/去垢劑):1mM的脫氧膽酸鈉
緩沖液C(第二提取緩沖液):100%己烷
一般方法:標準溶液的提取/分析
步驟1:如上面所描述的,在己烷中制備500μM的CoQ10儲備溶液并用來在合適的緩沖液中制備100μM和50μM的CoQ10溶液以用于細胞處理或在檢測分析方法中直接使用。
步驟2:將在緩沖液A中200μL的各種濃度的CoQ10或單獨的緩沖液A等分到玻璃小瓶并將10μL的緩沖液B加入到每個小瓶中。在預定時間點收集用各種濃度的CoQ10處理的細胞并洗滌。將細胞團樣品(例如,約105-107個細胞)與200μL緩沖液A和10μL緩沖液B相結合,并在緩沖液混合物中重新懸浮細胞團。在將緩沖液A和B與細胞混合時,樣品混合物變成不透明的。然后將混合物轉移到玻璃小瓶中。
步驟3:來自步驟2的玻璃小瓶被加熱至65℃1分鐘。加熱時樣品轉澄清,然后當冷卻至室溫時又變得不透明。
步驟4:將緩沖液C的200μL等分試樣加入到每個小瓶中。將小瓶再次升溫至65℃。在小瓶中的溶液自發地分成兩個相,具有含基本上所有的CoQ10物質的第二提取緩沖液層(上層)。
步驟5:移出50μL上部提取層的樣品并在275nm處在紫外分光光度計上進行分析。通過與標準曲線相比較來測定每一個樣品中的CoQ10的量。
實施例2--生成各種溶劑中CoQ10濃度的標準曲線
對各種溶劑系統進行了測試以優化提取過程。為了確定使用CoQ10紫外分光檢測進行分析的過程中溶劑系統的最佳的光譜特性,通過光譜法生成標準曲線。使用已知濃度的CoQ10對三種不同的溶劑(2-丙醇、乙腈和己烷)進行測試。
為了制備標準曲線,在適當的溶劑中制備50μM的CoQ10儲備液和進行儲備液的系列稀釋。在UV分光光度計中在275nm處測量來自系列稀釋的各樣品的OD275和在曲線圖上描繪。標準曲線制備的結果列于表2和圖1中。
表2-在不同溶劑中的各種不同濃度的CoQ10的OD275

進行數據的線性回歸分析以產生標準曲線。這些結果表明,2-丙醇和乙腈溶液的光譜是相同的,且己烷溶液在曲線圖的上部稍微偏 移。所有三種溶劑提供可以在主要濃度范圍內與線性方程擬合的結果。三個標準曲線中的任何一個可被用于基于OD275確定在適當的溶劑中的CoQ10濃度。
實施例3—暴露于不同濃度的CoQ10的組織培養細胞中CoQ10的定量
從細胞樣品提取CoQ10
在實驗性試驗中,在6孔板的每個孔中接種約1×106個HASMC、HepG2或PaCa2細胞。在接種時,將細胞用在異丙醇中的規定濃度的CoQ10(一式三份)或專有的CoQ10遞送制劑處理3、6或24小時。在規定的孵育時間后,將細胞用冷的TPBS(具有100mM Tris的PBS,pH 7.4)洗滌,通過胰蛋白酶消化收獲,用1ml的TPBS洗滌(2次),并通過1500RPM離心沉淀。胰蛋白酶消化后立即將細胞計數以確定樣品中存活細胞的總數。
將細胞沉淀重懸在200μL的緩沖液A(第一提取緩沖液)和10μL的緩沖液B(表面活性劑/去垢劑)中。在添加緩沖液B時,樣品變得不透明并形成沉淀。將再懸浮的細胞轉移到硼硅酸鹽小瓶。對于不含細胞的對照樣品,將含CoQ10的溶液加入到玻璃小瓶中,并加入己烷以使體積為200μL,和然后加入10μL緩沖液B。
將小瓶在水浴中在65℃下溫育2分鐘,在溫育進行大約一半時輕輕混合。在溫育過程中,樣品從渾濁變為澄清。將樣品從水浴中取出,并向小瓶中添加200μL的緩沖液C(第二提取緩沖液)。樣品分為兩相,極性的和非極性的。頂部的非極性層是澄清的,而在小瓶的底部形成白色沉淀物。將樣品再次在65℃下加熱1分鐘,在溫育進行大約一半時輕輕混合。將溶液冷卻至室溫,并將75μL的上層相的部分試樣放入石英比色皿中和在275nm的波長處通過紫外分光光度法分析。記錄吸收值。
標準曲線的生成
對于生物樣品中CoQ10的定量評估,基本上如上所述(實施例2) 生成標準曲線。對于CoQ10的各個獨立測定值,標準曲線是通過在己烷中制備50μM的CoQ10儲備液,和對儲備材料進行系列稀釋產生的。在紫外線光譜儀中在275nm的波長處測定來自系列稀釋的每個樣品并繪制在曲線圖上。代表性的標準曲線示于圖2中。
使用冪級數以擬合標準品的標準曲線,并確定方程式。曲線不擬合典型的線性回歸形式。這種線性的缺乏證明對于每個實驗生成標準曲線的益處以及優選從落在曲線的線性部分內的OD275讀數計算未知樣品中CoQ10濃度的重要性。使用來自所提取的樣品的OD275值,針對所生成的標準曲線來確定CoQ10的量。
數據分析
對于本研究,所有細胞樣品一式三份重復。CoQ10提取和OD275測量由不參與細胞的CoQ10處理或收獲的人進行。作為所使用的方法的初始基準,分析數據的再現性。
沒有經過CoQ10處理的而僅僅在接種后的指定時間收獲的Hep2G細胞對于所有重復的樣品給出了高度可再現的結果(見圖3A)。這證明了提取和檢測方法的再現性。
關于再現性,在一式三份孔中用各種濃度的CoQ10進行3、6和24小時的處理后收集的細胞中看到更大的變異。如示于圖3B-E中,基本上在24小時的時間點觀察到Hep2G細胞中最大的CoQ10量的變異。
該結果也根據遞送介質對于CoQ10攝取至細胞中的效率進行了分析。這些結果總結于下表3中。從數據中可以明顯看出,基本上當用CoQ10在CoQ10專門遞送制劑中遞送時,與丙醇相比24小時后細胞中存在的CoQ10明顯更多。根據每細胞的CoQ10的pM數計算CoQ10的量;因此,在細胞內CoQ10中觀察到的差異不是細胞生存力對兩種載體響應的差異或在培養中增殖時間差異的結果。雖然存在標準的統計偏差,通過使用本文所提供的方法獲得的數據被證明是統計學上可靠的,并且該方法是可重復的。
表3:CoQ10處理的Hep2G細胞中CoQ10平均水平的總結(pM/細胞)

實施例4--生物樣品中CoQ10定量的體外分光光度法對LC/MS/MS(MRM)法的比較
為了進一步驗證用于生物樣品中CoQ10的定量評估的分光光度法的效用,使用HASMC、HepG2和PaCa2細胞系重復以上所述的實驗。此外,使用用于分析的三種細胞類型中的每一種制備第二組細胞樣品來使用本領域中常規使用的LC/MS/MS方法測定CoQ10水平。簡言之,接種細胞,并如上所述用在異丙醇或CoQ10專門遞送制劑中的CoQ10處理細胞,并在接種后3、6或24小時收獲。用上述的方法對任一細胞沉淀進行提取,重懸細胞于緩沖液A和B中,并用緩沖液C提取CoQ10,或者將細胞沉淀送到診斷實驗室(IriSys Research&Development Inc)進行CoQ10的定量評估,其使用單獨甲醇提取隨后通過LC/MS/MS檢測。
下表4中總結了來自兩種分析的數據。很明顯,在每一個測試樣品中和所有的處理條件下,使用單獨甲醇隨后用LC/MS/MS檢測的生物樣品的CoQ10提取與本文所描述的提取方法后分光光度法檢測相比產生低估的CoQ10水平。這些結果證明,本文所提供的用于生物樣品中CoQ10的提取和定量的方法與目前使用的技術相比所具有的 效率。這些結果也證明,使用專門CoQ10遞送制劑比異丙醇更有效地將CoQ10送送至細胞。
表4--CoQ10的分光光度法和LC/MS/MS檢測的比較




為了便于比較在細胞中檢測到的CoQ10量,計算使用本文所提供的提取與分光光度方法檢測的每細胞CoQ10濃度與使用單獨甲醇提取隨后LC/MS/MS檢測的方法檢測的每細胞CoQ10量相比較的倍數差異。其結果列于下面的表5中。
表5--使用OD275與LC/MS/MS檢測的細胞中CoQ10的倍數差異

處理細胞類型制劑倍數差異未處理HepG2異丙醇28100μMHepG2異丙醇82100μMHepG2CoQ10遞送制劑5未處理HASMC異丙醇545未處理PaCa2異丙醇1863100μMPaCa2異丙醇11100μMPaCa2CoQ10遞送制劑14

可容易地觀察到,本文所提供的提取和檢測方法比本領域中常規使用的LC/MS/MS方法在生物樣品中檢測到顯著更多的CoQ10。
實施例5--用于檢測CoQ10和CoQ10H2的質譜參數的確定
氧化的CoQ10的分析
方法:
將5.04mg的CoQ10溶于1mL丙酮中,得到5mg/mL的CoQ10濃度。將100μL等份的該溶液與900μL異丙醇混合以得到≈0.5mg/mL的CoQ10濃度。將200μL等份的該溶液與10μL甲酸混合并直接注入到質譜儀中。對于質譜分析,在正ESI模式中進行Q1掃描。
結果:
在m/z 863.4處觀察到氧化形式的分子離子峰。在m/z 885.4處觀察到還原形式的輔酶Q10(CoQ10H2)的可能的峰。在199.2Da觀察到假峰,這可能是由質譜儀中的先前注射或分子沿內表面的累積引起的。
對于m/z 863.4在150–800Da范圍內進行產物離子掃描,在m/z197.0處顯示單一的主要產物離子峰。
在m/z 865.4處的峰可能對應于還原形式的CoQ10(CoQ10H2)。在Q1掃描中觀察到此峰,但不如863.4Da峰一樣強。在此峰上執行的產物離子掃描顯示m/z 197.0作為主要產物峰。這對應于輔酶Q10的基本環結構。
進行對m/z 197的前體離子掃描,并給出863.9Da作為主要前體峰。當850-900Da的m/z范圍被放大時,觀察到863.9的大峰,864.7Da的低強度峰和865.8的非常低強度的峰。這些峰對應于CoQ10的完全氧化形式(CoQ10)、部分還原形式(CoQ10H)以及完全還原形式(CoQ10H2)。
還原的CoQ10的分析
方法:
將5.032mg的CoQ10溶解在1mL的己烷中以得到5mg/mL母液的儲備液。取100μL等分試樣加入到900μL的己烷中以得到500μg/mL濃度的第二儲備液。用1.9mL己烷稀釋100μL的第二儲備液,然后與50μL甲醇和20mg硼氫化鈉混合。將還原反應物攪拌3分鐘, 并在室溫下黑暗中靜置5分鐘。接著將含100mM的EDTA的1mL水加入到反應中。CoQ10H2的最終濃度為25μg/mL。對于質譜分析,在正ESI模式中進行Q1掃描。
結果:
用于還原形式的CoQ10的Q1掃描并未發現任何一致的和可能與分子的結構相關的分子離子峰。沒有觀察到任何預期的峰。對于這一點的可能原因是在還原過程的最后一步中EDTA的添加。EDTA可以連接到分子離子上,并形成不一致的加合物,導致不能再現的結果。
為了解決EDTA引起的不一致結果,重復上述還原步驟,但在最后的步驟中加入1mL不含EDTA的水。然后將反應物與5mM甲酸銨的甲醇溶液混合,并注入到質譜儀中。
在該注入中觀察到兩組峰,一組在863.8、864.8和865.8m/z處和另一組在880.4、881.3和882.4m/z處。這些峰對應于輔酶Q10的完全氧化形式(CoQ10)、部分還原形式(CoQ10H)和完全還原形式(CoQ10H2)。
在880.4、881.4和882.4m/z也觀察到峰組,其對應于在863.8、864.8和865.8m/z處的分子峰的氨化加合物。對于所有上述峰值的產物離子掃描顯示197.0為主要/唯一產物離子。
197.0的前體離子掃描顯示全部以上兩個m/z組的峰。由于氨加合物形成的該峰組顯示出更高的強度,并以此作為前體離子用于完成質譜儀的參數。
實施例6--用于檢測CoQ10和CoQ10H2的色譜參數的確定
方法:
將1mg的CoQ10溶解在1mL己烷中,將100μL此溶液加入到900μL的己烷中,產生100μg/mL的儲備溶液。
對于還原反應,用1.9mL己烷稀釋100μL的儲備溶液,并與50μL甲醇和20mg硼氫化鈉混合。將反應物攪拌3分鐘,并在室溫下黑暗中儲存5分鐘。通過反應物顏色從黃色變到無色,在視覺上確認 氧化至還原形式的完全轉化。接著,加入1mL的水并混合。將反應物以13000rpm離心2分鐘以分離各層。收集含有濃度5μg/mL的CoQ10H2的頂部己烷層(CoQ10H2儲備液)。
在另一個管中重復上述反應而不加入硼氫化鈉。收集含有濃度5μg/mL的CoQ10的頂部己烷層(CoQ10儲備液)。
使用10mM的甲酸銨甲醇溶液作為流動相A,1-丙醇作為流動相B和C18Zorbax柱進行液相色譜。以1:1的比例混合含CoQ10和CoQ10H2的儲備液和注入色譜儀中。使用其中流動相A和B以20:80;50:50;80:20比例混合的流動相進行三個等度的5分鐘運行。80:20的比例產生CoQ10和CoQ10H2峰的最佳分離。
實施例7-標準曲線
表6--用于標準曲線的樣品的制備

使用在實施例6中所述的方法,用流動相A:B 80:20通過液相色 譜方法分離樣品。圖4所示是對于CoQ10和CoQ10H2得到的標準曲線。
當用于標準曲線的樣品使用HPLC級水代替己烷作為稀釋劑,采用同樣的LC-MS/MS條件制備,并且被用于運行時,在對于還原和氧化形式的CoQ10的任何濃度下沒有看到可檢測的面積指標。
使用用于從水中提取CoQ10的不同提取溶劑重復上面的實驗。所測試的提取溶劑為100%的異丙醇、100%己烷和20:80的乙醇:己烷。使用各種提取溶劑提取用于標準曲線的三組樣品。據觀察,用相同的提取溶劑提取的所有樣品中回收的面積相似,但各提取溶劑組的面積回收不同。沒有提取溶劑在面積指標和摻入濃度之間給出線性關系。經證實,HPLC級水與己烷中的標準不是一致的,這可能是由于水的高極性。
為了解決己烷和水的不混溶性的問題,在溫和氮氣流中蒸發己烷中的CoQ10和CoQ10H2儲備液,并重新溶解在甲醇中。然后將這些重構的標準用于制備用于標準曲線的樣品,用HPLC水作為稀釋劑,并使用上述的LC-MS/MS方法分析標準。這些樣品當針對濃度作圖時得到面積響應的線性曲線,如示于圖6中。
使用如上所述的相同程序,CoQ10-d6內標也還原。當用己烷蒸發并甲醇重溶解制備內標的系列稀釋時,觀察到類似的線性關系。
己烷中的CoQ10和CoQ10H2儲備液蒸發和在甲醇中重溶解。己烷中的CoQ10-d6和CoQ10H2-d6儲備液也被蒸發和在甲醇中重溶解。然后將這些重構的標準用于制備用于標準曲線的樣品,用HPLC水作為稀釋劑。將100μL的各樣品等分至新管中,并用上述三種不同的提取溶劑提取。對于相同的提取溶劑組內的所有濃度的面積響應被發現是相似的,面積響應和濃度之間沒有線性關系。
將己烷中的CoQ10、CoQ10H2、CoQ10-d6和CoQ10H2-d6儲備液蒸發和重溶于甲醇中。然后將重構的標準用于制備用于標準曲線的樣品,用血漿作為稀釋劑,以得到CoQ10和CoQ10H2的19-2500ng/mL的線性濃度范圍。將20μL的25μg/mL的CoQ10-d6和CoQ10H2-d6 加入到每個管中。隨后,用1ml的乙醇:己烷20:80提取各樣品。將每個樣品劇烈渦旋4-5分鐘,離心,并移取150μL的頂層放入LC-MS/MS小瓶中用于分析。所有上述步驟使用冷卻至-20℃的低溫模塊盡可能快地進行,并注入來自每個管的10μL用于LC-MS/MS分析。
在面積比率和摻入濃度之間觀察到線性關系。由于氧化和還原形式的高濃度,峰之間存在重疊,且因此沒有觀察到基線分離。
在下面的實驗中,50μL的標準被用作起始點和使用1.5mL的提取溶劑。嘗試不同的注射量。注入3μL的標準給出了具有線性響應和r2值≥0.99的基線分離色譜。
實施例8--血漿樣品中總CoQ10的定量
在該實驗中,測定不同血漿樣品中的總CoQ10的量。將各血漿樣品的單一異丙醇提取用于提取CoQ10,其隨后用LC-MS/MS定量。構建如圖6的曲線圖所示的標準曲線,其中使用含有0、3、5、10、50、100、300、500、800和1000μg/mL的CoQ10的樣品,分析一式兩份地進行。對于CoQ10濃度范圍在5至800μg/mL內的樣品,用于標準曲線的樣品中CoQ10濃度測量的計算的%精度為從91.3%至113%。各自含有未知量的CoQ10的血漿樣品的分析結果被列于下面的表7中。
表7-血漿樣品中CoQ10


實施例9--細胞上清液中總CoQ10的定量
本實驗設計用于評估培養的細胞在暴露于含有CoQ10的制劑后對CoQ10的攝取。根據已知的方案培養Caco-2細胞并暴露于含有CoQ10的制劑0、1、2、3、4和6小時。洗滌和裂解后,將細胞裂解液用異丙醇提取,并通過LC/MS測定提取物中CoQ10的量。如圖7的曲線圖中所示的標準曲線使用含有0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、3、5、7和10μg/mL的CoQ10的樣品構建。對于具有0.5至10μg/mL的CoQ10濃度范圍的樣品,用于標準曲線的樣品中CoQ10濃度測量的計算的%精度為從87.6%至107%。摻雜細胞培養基(未知樣品A-H)和細胞上清液(未知樣品的I-L)的分析結果列于下表中。
表8-在培養細胞裂解液中的CoQ10


實施例10--洗鼻液中總CoQ10的定量
本實驗設計用于評估在施用專用的CoQ10鼻制劑后鼻腔內粘膜對CoQ10的攝取。將專用制劑向大鼠鼻內給藥后,在30分鐘和在1小時后從大鼠鼻腔收集粘液和液體,用異丙醇提取,并通過LC-MS/MS測定提取物中CoQ10的量。使用含有0、1、5、10、50、100、300、800和1000μg/mL的CoQ10的樣品構建如圖8的曲線圖中所示的標準曲線。對于所有標準樣品,計算的用于標準曲線的樣品中CoQ10濃度測量的%精度是從90.5%至114%。細胞提取物的分析結果示于下表中,其中M1、M2、M3、M4和M5指不同的大鼠個體。
表9--洗鼻液中的CoQ10


實施例11--組織中總CoQ10的定量
本實驗設計用于測定施用專用CoQ10制劑的小鼠的不同的組織中存在的CoQ10的量。給藥后,在0.5、1、3、8、24或48小時將小鼠處死。將肺、肝臟和腎臟勻漿,并將勻漿液用異丙醇提取。通過LC-MS/MS測定提取物中CoQ10的量。圖9中的曲線圖所示的標準曲線用含有1、5、10、50、100、300和600μg/mL的CoQ10的樣品構建。對于所有標準樣品,計算的用于標準曲線的樣品中CoQ10濃度測量的%精度是從90.2%至121%。組織提取物的分析結果示于下表中,其中P1和P2是指兩個小鼠個體。
表10--組織中的CoQ10


實施例12--血清中氧化和還原形式的CoQ10的定量
在該實驗中,對血清樣品中氧化和還原形式的CoQ10的量進行測定。在樣品中摻入CoQ10-d6和CoQ10H2-d6內標,使用1-丙醇的單一提取從每個血清樣品提取CoQ10和CoQ10H2,用LC-MS/MS定量CoQ10和CoQ10H2。使用柱Agilent C181-Poroshell(2.1μ粒徑)和具有5mM甲酸銨的甲醇:1-丙醇80:20作為流動相實施色譜分離。質譜方法包括在單次運行中同時定量還原和氧化形式的CoQ10,其對于氧化形式的CoQ10通過監測m/z 880到m/z 197的過渡和對于還原形式的CoQ10通過監測m/z 882到m/z 197的過渡而完成。所有樣品均用冷卻的低溫模塊操作以最小化CoQ10H2的氧化。標準曲線是使用含有0、20、40、158、313、625、1250和2500ng/mL的CoQ10的樣品(樣品L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7和L8)構建的。還分析了來自美國國家標準與技術研究所的標準(NIST1、NIST2和NIST3)。對于所有標準樣品,計算的用于標準曲線的樣品中CoQ10濃度測量的%精度是從86.5%至118%。用于氧化的CoQ10和還原的CoQ10(CoQ10H2)的標準曲線和代表性色譜圖分別示于圖10和11中,且原始質譜數據列于下表11中。對應于標有“-ox”的樣品的所有數據都為氧化形式的CoQ10,而對應于標“-red”的樣品的數據與還原形式的CoQ10對應。標記QC1、QC2和QC3的樣品對應于含有血清的質量對照樣品,其摻入與用于制備標準曲線的樣品不同批次的CoQ10。
表11--血清中氧化和還原形式CoQ10定量的原始數據



實施例13--血漿中氧化和還原形式的CoQ10的定量
在該實驗中,對血漿樣品中氧化和還原形式的CoQ10的量進行測定。在樣品中摻入CoQ10-d6和CoQ10H2-d6內標,使用己烷和1-丙醇提取從各血漿樣品提取CoQ10和CoQ10H2,用LC-MS/MS定量CoQ10和CoQ10H2。使用柱Agilent C181-Poroshell(2.1μ粒徑)和具有5mM甲酸銨的甲醇:1-丙醇80:20作為流動相實施色譜分離。質譜方法包括在單一運行中同時定量還原和氧化形式的CoQ10,其對于氧化形式的CoQ10通過監測m/z 880到m/z 197的過渡和對于還原形式的CoQ10通過監測m/z 882到m/z 197的過渡而完成。所有樣品均用冷卻的低溫模塊操作以最小化CoQ10H2的氧化。標準曲線使用含有0、20、158、625、1250和2500ng/mL的CoQ10的樣品(樣品L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7和L8)構建。對于所有標準樣品,計算的用于標準曲線的樣品中CoQ10濃度測量的%精度是從84.8%至119%。氧化的CoQ10和還原的CoQ10(CoQ10H2)的標準曲線和代表性色譜圖分別示于圖12和13中,和原始質譜數據列于下表12中。對應于標有“-ox”的樣品的所有數據為氧化形式的CoQ10,而對應于標記 “-red”的樣品數據與還原形式的CoQ10對應。標記QC1、QC2和QC3的樣品對應于含有血漿的質量對照樣品,其摻入與用于制備標準曲線的樣品不同批次的CoQ10。
表12--血漿中氧化和還原形式的CoQ10定量的原始數據


IV.等同
本領域的技術人員可以認識到或者能夠只使用常規實驗確定許多本文所述的具體的實施方式和方法的等同方式。這些等同方式意在被包含在以下的權利要求的范圍中。
V.相關參考
在本申請中引用的所有出版物和專利文獻用于所有目的在相關部分通過引用而引入,其程度就像每個單獨的出版物或專利文件被單獨指示一樣。對于本文中各種參考文獻的引用,申請人并不是承認任何特定的參考文獻對于其公開內容是“現有技術”。應當理解的是,雖然本發明已結合了它們的詳細說明進行描述,但前面的描述意在說明而不是限制本公開的范圍,這是由所附的權利要求的范圍所定義的。其它方面、優點和修改均在所附權利要求及其等同物的范圍之內。
所有圖形以說明的方式提供,而不是以限制的方式。雖然提供了具體的實施例,該描述是說明性的而不是限制性的。前述實施方式的任一個或多個特征可以與本發明的任何其他實施方式的一個或多個 特征以任何方式進行組合。此外,本發明的許多變化對于閱讀本公開內容的本領域技術人員是清楚的。

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