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用檢測病毒細胞感染量評價細胞系源豬瘟活疫苗免疫效力的方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201410146130.6

申請日:

2014.04.11

公開號:

CN103954760A

公開日:

2014.07.30

當前法律狀態:

撤回

有效性:

無權

法律詳情: 發明專利申請公布后的視為撤回IPC(主分類):G01N 33/577申請公布日:20140730|||實質審查的生效IPC(主分類):G01N 33/577申請日:20140411|||公開
IPC分類號: G01N33/577; G01N33/569 主分類號: G01N33/577
申請人: 中國獸醫藥品監察所; 廣東永順生物制藥股份有限公司
發明人: 寧宜寶; 王海光; 林旭埜; 馮忠澤; 張毓金; 吳文福; 賴月輝; 陳堅; 王芳; 陳瑞愛; 孫進忠; 漆世華
地址: 100081 北京市海淀區中關村南大街8號
優先權:
專利代理機構: 北京君智知識產權代理事務所 11305 代理人: 鄭明
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410146130.6

授權公告號:

||||||

法律狀態公告日:

2016.09.14|||2014.08.27|||2014.07.30

法律狀態類型:

發明專利申請公布后的視為撤回|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及一種細胞系源豬瘟活疫苗免疫效力檢驗方法。本發明主要涉及一種用將豬瘟疫苗稀釋后接種適宜的敏感傳代細胞,然后使用抗原捕獲ELISA檢測不同稀釋度疫苗中活病毒在感染細胞后增殖的子代病毒,計算疫苗病毒的最高細胞感染劑量,建立了豬瘟疫苗病毒的細胞感染量(CID)的效力檢驗方法;比對效力檢驗,用本發明提供CID法和現行質量標準兔體感染量檢測結果分別為:12批豬睪丸細胞系源豬瘟活疫苗每頭份均含4×105CID和2.6~3.0×104RID之間,3批牛睪丸原代細胞源豬瘟活疫苗每頭份均低于4×104CID和7.0~8.0×103RID;試驗證明:本實驗室建立的ELISA檢測CID的結果與現行質量標準兔體感染量檢測結果存在良好的相關性,能夠較好反映疫苗中活病毒的含量,有望成為RID的替代方法。

權利要求書

權利要求書
1.  一種用檢測豬瘟疫苗中所含病毒細胞感染量來評價細胞系源豬瘟活疫苗免疫效力的方法,其特征在于:該方法是將豬瘟疫苗中豬瘟兔化弱毒稀釋后接種適宜的細胞系,通過細胞增殖一定時間后用于疫苗中病毒細胞感染劑量的測定,該方法檢測到的是活的具有感染性的豬瘟兔化弱毒,其檢測結果與疫苗免疫原性直接相關。

2.  如權利要求1所述的一種用檢測病毒細胞感染量評價細胞系源豬瘟活疫苗免疫效力的方法,其特征在于:是用豬瘟疫苗病毒感染細胞后12天收獲的細胞上清或細胞裂解液用于豬瘟疫苗中病毒細胞感染劑量的測定。

3.  如權利要求1所述的一種細胞系源豬瘟活疫苗免疫效力檢驗的方法,其特征在于該檢驗方法是用豬瘟抗原捕捉ELISA檢測感染細胞中豬瘟病毒抗原,評價疫苗活病毒的細胞感染量,該方法特異性強,可排除死亡病毒和消除非特異性。

4.  如權利要求1所述的一種用檢測病毒細胞感染量評價細胞系源豬瘟活疫苗免疫效力的方法,其特征在于該檢驗方法是豬瘟兔化弱毒細胞感染量測定用傳代細胞包括豬睪丸細胞、豬腎細胞等,該類細胞適合豬瘟病毒增殖。

說明書

說明書用檢測病毒細胞感染量評價細胞系源豬瘟活疫苗免疫效力的方法
技術領域
本專利涉及一種用檢測病毒細胞感染量評價細胞系源豬瘟活疫苗免疫效力的方法。屬于獸用生物制品領域。 
背景技術
豬瘟是由豬瘟病毒引起的一種豬的烈性傳染性疾病,感染后的臨床癥狀受不同因素的影響而變化多樣,從急性死亡到隱性感染均可能出現,是危害我國養豬業的一種重要動物疫病,目前主要以點狀散發流行為主,流行范圍極廣,全國各個養豬地區幾乎均有發生。我國對于豬瘟的防控措施主要以豬瘟活疫苗大規模免疫為主,這是豬瘟大規模爆發得以控制的主要原因。 
我國豬瘟兔化弱毒株制備的豬瘟活疫苗是國際上公認的最安全、有效的豬瘟疫苗之一,應用十分廣泛,在對豬瘟的防控中起到了重要的作用,其具有對不同日齡豬均安全、誘導免疫反應快和可以保護豬只抵抗豬瘟病毒強毒株的攻擊等優點。豬瘟兔化弱毒疫苗在理論上能夠產生極佳的免疫效果,但是為了能夠在臨床使用時發揮疫苗的最大作用,就必須實現對商品化疫苗質量的有效控制。疫苗質量控制的一個重要方面就是要保證所生產疫苗具有符合標準的活病毒效價,能夠確實激活被免疫動物的免疫系統。疫苗效力的定義為疫苗接種動物獲得保護自身抵抗感染的能力,或在接種疫苗動物體內誘導產生的抗體轉移到后代使新生動物獲得保護的能力。對于弱毒疫苗而言,對宿主的免疫效力是通過病毒感染宿主細胞激活免疫系統而實現的,在一定范圍內,感染宿主的疫苗毒越多,對宿主免疫系統的激活就越強。因此,豬瘟兔化弱毒疫苗的效價是可以通過確定疫苗中有感染性病毒的數量(濃度)來衡量的。 
在我國豬瘟兔化弱毒疫苗效價的判定目前采用的是以兔體定型熱法和豬免疫攻毒為基礎的動物試驗的方法,其中以兔體定型熱法的應用最為廣泛。但是該方法存在很多弊端,如:檢測結果易受兔體個體差異和環境因素影響、費時費力并且成本較高等。建立不依賴動物試驗的效檢替代方法是大勢所趨,也勢在必行。對于活疫苗而言,疫苗的效價(滴度)取決于疫苗中含有的有感染性微生物數量(濃度)。產生滿意效果的最小滴度是建立在測定最小有效劑量研究的基礎上。 
發明內容
本發明的目的在于建立一種不使用實驗動物的、重復性高的、能夠有效反映豬瘟疫苗中有感染性病毒粒子數量(濃度)的效檢替代方法 
本發明實施的技術方案 
1.一種用檢測病毒細胞感染量評價細胞系源豬瘟活疫苗免疫效力的方法,其特征在于:該方法是將傳代豬瘟疫苗稀釋后接種適宜的細胞系,疫苗中的豬瘟兔化弱毒株病毒通過細胞增殖后用于病毒細胞感染量的測定,該方法檢測到的活的具有感染性的豬瘟病毒兔化弱毒病毒,其檢測結果與疫苗免疫原性直接相關; 
2.該效檢方法是用豬瘟活疫苗中的豬瘟兔化弱毒株病毒感染細胞后的上清液或細胞裂解液用于病毒感染量的測定; 
3.該檢驗方法是用豬瘟抗原捕捉ELISA檢測感染細胞中豬瘟病毒兔化弱毒株病毒抗原,評價疫苗中病毒的細胞感染量,該方法特異性強,重復性好; 
4.該檢驗方法的檢測樣品是用細胞系包括豬睪丸細胞、豬腎細胞等擴繁的豬瘟兔化弱毒株病毒,此類細胞適合豬瘟病毒增殖。 
本發明的具體描述 
一、效檢方法的建立 
(一)檢驗樣品的制備 
按常規方法消化生長良好的豬睪丸細胞系(ST細胞),按適當細胞密度接種若干細胞培養瓶(板)。置于37℃,5%CO2溫箱中培養48h至細胞長至良好單層。將豬瘟活疫苗用細胞維持液做10倍系列稀釋至10-7。將10-4~10-7稀釋度的豬瘟兔化弱毒分別接種已培養48h長至80%~100%單層的正常ST細胞。每個稀釋度分別接種4瓶ST細胞,每瓶細胞接種4mL稀釋后的病毒液,留4瓶正常ST細胞以細胞維持液代替病毒液做相同的接毒處理作為空白對照,置于37℃、5%CO2溫箱中孵育4h后,吸棄病毒液,用維持液潤洗三次后(每次以4mL維持液潤洗)更換為6mL新鮮維持液,置于37℃、5%CO2溫箱中培養。4d后第一次收毒換液,每個稀釋度取一瓶細胞收獲一半的細胞培養液上清,剩余上清液連同細胞直接置于-20℃凍結,反復凍融三次收獲病毒液,其余每瓶細胞棄去舊維持液更換新鮮維持液6mL,置于37℃、5%CO2溫箱中繼續培養。此后每隔4d按上述方法收毒換液一次,最后一次收獲時,取一半的細胞培養液上清收獲,另一半上清液連同細胞置于-20℃凍結保存,凍融三次收獲病毒液。共收獲4次。所有收獲的樣品全部置于-20℃保存待用。 
對以上制備的所有檢測樣品采用抗原捕獲ELISA(或稱ELISA)進行檢測,并對所得到 的檢測結果進行比較。 
(二)檢測方法 
1.豬瘟抗原捕捉ELISA檢測感染細胞中豬瘟病毒 
(1)樣品的準備 
消化生長良好的ST細胞,擴大接種細胞培養瓶(板孔),置于37℃,5%CO2溫箱中培養48h至細胞長至良好單層。 
取豬瘟活疫苗凍干制品做10倍系列稀釋至10-7,取10-4~10-7稀釋度分別接種已培養48h長至80%~100%單層的ST細胞。置于37℃,5%CO2溫箱中吸附4h后,吸棄毒液,更換為含2%血清的MEM維持液,置于37℃,5%CO2溫箱中培養。每種疫苗設空白細胞對照。 
4d后做第1次收毒換液,以后每隔4d再收毒換液1次,連續收獲4次,最后一次收獲時,吸取一半的上清液,另一半上清液連同細胞一起凍結保存。所有收獲的毒液置于-20℃保存待檢。 
(2)待檢樣品的ELISA檢測 
按照IDEXX豬瘟病毒抗原撲捉ELISA檢測試劑盒/血清的說明書的說明對以上第(1)項中制備的各收次樣品進行ELISA檢測。所有樣品均采用37℃孵育2h。為了探索裂解液(BVDVSerumPlus)對檢測的影響,對部分樣品用不同比例的裂解液處理后進行ELISA檢測。 
(3)ELISA檢測操作步驟方法:按照IDEXX豬瘟病毒抗原撲捉ELISA檢測試劑盒/血清的說明書的說明書進行(見附件1)。 
結果判定 
①被檢樣品的S-N值等于或小于0.100時,判為豬瘟病毒抗原陰性。 
②被檢樣品的S-N值大于0.100,小于或等于0.300,判為可疑,之后可用豬瘟病毒特異性方法進行確認。 
③被檢樣品的S-N值大于0.300時,判為豬瘟病毒抗原陽性。 
(三)效檢用樣品收次、收獲方式和判定標準的確定 
采用豬瘟病毒抗原血清檢測試劑盒/血清(IDEXX,USA產品)對系列稀釋的疫苗接種ST細胞培養后的第一次、第二次、第三次和第四次收獲(簡稱一收、二收、三收和四收)的所有樣品進行檢測,按說明書(見附件1)對陰性、陽性和可疑樣品進行判定。采用兩種樣品處理方式進行檢測,一種為樣品原液不經過裂解液處理直接檢測,一種使用IDEXX公司提供的裂解液與樣品原液1:1混合裂解處理后進行檢測。比較裂解液處理對檢測結果的影響。以確定適用于效檢的樣品收次和收獲方式(結果見表1)。 
表1豬瘟病毒兔化弱毒株接種細胞后一~四收樣品檢測結果 

A:原液未經處理直接檢測;B:裂解液與原液1:2混合裂解處理。 
NC:正常細胞對照;“/”:ST細胞未接種;“+”:陽性;“-”:陰性;“+/-”:可疑;所有檢測按照試劑盒說明要求陰、陽性對照結果均成立,檢測符合試劑盒說明的要求。 
抗原捕獲ELISA的檢測結果表明(表1),一收和二收兩個收次凍結液(分別為10-4和10-6)和細胞上清的最高陽性稀釋度(分別為10-3和10-5)之間存在差異。三收和四收兩個收次中,凍結液和細胞上清用抗原捕獲ELISA所能檢測到的最高陽性稀釋度相同,均為10-6。其三收及之后各收次中能檢測到的陽性稀釋度達到最高并保持不變。 
從表1結果可以看出:用ELISA法檢測,在第一收樣品只能在103稀釋的樣品中檢測到病毒抗原,第二收樣品只有104(或105)稀釋的樣品中檢測到病毒抗原,在第三收后才能在106稀釋的樣品中檢測到豬瘟病毒抗原;用ELISA檢測豬瘟病毒抗原時,只有病毒達到足夠量時才能被檢測到,在第一、二收中由于接種后病毒在細胞中沒有充分增殖,所以當將樣品稀釋到106時,由于細胞中新增殖的豬瘟病毒抗原量不足以被ELISA檢測到,所以檢測均為陰性結果。 
因此,以三收上清的ELISA檢測結果作為ELISA檢測的最終判定結果,所有“可疑”樣品一律視為陰性。 
在使用本發明對豬瘟活疫苗(傳代和原代細胞源)進行效檢時應采用稀釋后的疫苗液接種ST細胞培養的三收細胞上清作為待檢測樣品,該樣品的檢測結果作為疫苗效力檢驗的效價指標。 
(四)適用于ELISA效檢方法的豬瘟活疫苗類型的確定 
1.不同類型的豬瘟疫苗進行效檢:采用已建立的疫苗效檢替代方法的操作流程對市場上隨機抽檢的14批不同廠家不同類型的豬瘟疫苗進行效檢,待檢疫苗經10倍系列稀釋后每個稀釋度接種四瓶細胞,按已建立的操作流程進行不同收次的收毒換液。每個批次疫苗的每個收次中,將同一稀釋度所接種的四瓶細胞分別收獲的樣品混合均勻后采用抗原捕獲ELISA進行檢測。以確定適用于該效檢方法的疫苗類型。 
按所建立的操作流程對14批豬瘟疫苗為市場中隨機抽取的不同廠家的豬瘟兔化弱毒ST細胞系源疫苗、豬瘟兔化弱毒牛睪丸原代細胞源疫苗和豬瘟兔化弱毒兔脾淋苗進行效檢。以三收上清的檢測結果作為判定標準(表2),ST細胞系源疫苗的陽性稀釋度均可達到10-6,牛睪丸疫苗低于ST疫苗,能達到10-5。而脾淋苗在所有稀釋度幾乎均不能檢測到陽性。因此只有細胞系源和牛睪丸細胞源的豬瘟疫苗適于使用該替代方法進行效檢,而脾淋苗沒有檢測到病毒,是病毒量太低還是其他原因,還有待進一步驗證。 
表2不同類型疫苗接種細胞后所收樣品的ELISA檢測結果 

“/”:細胞脫落死亡;“+”:陽性;“-”:陰性;“+/-”:可疑;所有檢測按照試劑盒說明要求陰、陽性對照結果均成立,檢測符合試劑盒說明的要求 
※2012-2、2012-9、2012-10、2012-11為ST細胞系豬瘟疫苗;2012-3、2012-12、2012-13為牛睪丸原代細胞豬瘟疫苗;2012-1、2012-4、2012-5、2012-6、2012-7、2012-8、2012-14為兔脾、淋組織豬瘟疫苗。 
2.ELISA效檢方法對成品疫苗的檢測:將廣東永順生產的12批豬瘟兔化弱毒ST細胞系源疫苗和3批豬瘟兔化弱毒牛睪丸疫苗按已建立的效檢替代方法操作流程經系列稀釋后分別接種易感細胞,每個稀釋度接種四瓶細胞,共做三個收次的收毒換液。在每個批次疫苗的每個收次中,將同一稀釋度所接種的四瓶細胞分別收獲的樣品進行混合后用于之后的檢測。采用抗原捕獲ELISA試劑盒對所有收獲樣品進行檢測。 
豬瘟抗原捕獲ELISA對收獲樣品的檢測:由檢測結果可見,陽性樣品比例隨收次的增加而提高,以三收細胞培養液上清最高。其中ST細胞系源豬瘟活疫苗的細胞感染量可達疫苗的10-6~10-7,而牛睪丸原代細胞源豬瘟活疫苗在10-4以上稀釋度的疫苗液接種細胞后均沒有檢測到感染細胞的病毒(見表3)。 
表3抗原捕獲ELISA對豬瘟活疫苗(細胞系和原代細胞)的不同收次樣品的檢測結果 

“/”:ST細胞未接種;“+”:陽性;“-”:陰性;“+/-”:可疑;所有檢測按照試劑盒說明要求陰、陽性對照結果均成立,檢測符合試劑盒說明的要求 
※ST2012036~ST2012056為ST細胞系疫苗;2012124~2012126為原代細胞豬瘟活疫苗。 
(五)本檢驗法與兔體定型熱法的比較 
采用已建立的疫苗效檢替代方法對適用于該方法的多個批次的成品凍干苗進行效檢,待檢疫苗經10倍系列稀釋后每個稀釋度接種四瓶細胞,按已建立的操作流程進行不同收次的收 毒換液。在每個批次疫苗的同一收次中,將同一稀釋度所接種的四瓶細胞分別收獲的樣品混合均勻后,采用抗原捕獲ELISA試劑盒對所有收獲樣品進行檢測。對同一批次的疫苗以兔體定型熱法按《中華人民共和國獸用生物制品規程》規定的方法測定每批疫苗每頭份中的兔體感染量(RID),并與效檢替代方法得到的結果進行比對。 
對每批次疫苗系列稀釋進行兔體定型熱檢測得到的每頭份RID含量與ELISA方法檢測結果的比較可見(表4),當ST細胞系源疫苗陽性稀釋度達到10-6時,每頭份中含有2.6~3.0×104RID。考慮到ST細胞系源疫苗國家質量標準為每頭份≧7,500RID,并且ST細胞系源豬瘟疫苗ELISA效檢的陽性稀釋度均能夠達到10-6,因此可將ELISA方法的質量合格標準定為疫苗陽性稀釋度≧10-6,當檢測結果陽性稀釋度≤10-5時,以兔體定型熱法確認。 
表4兔體定型熱法與效檢替代方法檢測結果 

本發明的積極意義 
本發明涉及一種用檢測病毒細胞感染量評價傳代和原代細胞源豬瘟活疫苗免疫效力的方法。將豬瘟疫苗10倍序列稀釋后接種敏感細胞系,然后使用抗原捕獲ELISA檢測不同稀釋 度豬瘟疫苗中的豬瘟病毒在感染細胞后增殖的子代病毒,計算疫苗中所含豬瘟病毒的最高細胞感染劑量(CID),建立了豬瘟疫苗病毒的CID效力檢驗方法。經過對用CID與RID兩種方法對12批豬睪丸細胞系源豬瘟活疫苗的檢驗結果進行比較發現:用本發明建立的CID法檢測,每頭份豬瘟疫苗含4×105CID,用現行質量標準RID法檢測,每頭份豬瘟疫苗含2.6~3.0×104RID,二者之間存在良好的相關性。試驗證明:本發明建立的用豬瘟抗原撲捉ELISA檢測豬瘟疫苗活病毒CID的結果能夠很好反映疫苗中活病毒的含量,與RID方法檢測的結果相關性好,可以作為RID的替代方法。 
實施例
本實施例為更好的說明本發明,對本申請要求保護的技術方案不構成限制。 
實施例1 
——檢測樣品的制備 
按常規方法消化生長良好的豬睪丸細胞系(ST細胞,來自中國獸醫微生物菌種保藏中心),按適當細胞密度接種若干細胞培養瓶(板)。置于37℃,5%CO2溫箱中培養48h至細胞長至良好單層。 
用細胞維持液將待檢的(細胞系源)豬瘟活疫苗按規定的頭份量進行溶解,取1個頭份劑量的疫苗液用細胞維持液做10倍系列稀釋至10-7。將10-2~10-7稀釋度的豬瘟疫苗液分別接種已培養48h長至80%~100%單層的正常ST細胞。每個稀釋度分別接種4瓶ST細胞,每瓶細胞接種4mL稀釋后的病毒液,留4瓶正常ST細胞以細胞維持液代替病毒液做相同的接毒處理作為空白對照,置于37℃、5%CO2溫箱中孵育4h。4h后,吸棄病毒液,用維持液洗三次后(每次以4mL維持液洗)更換為6mL新鮮維持液,置于37℃、5%CO2溫箱中培養。4d后第一次收毒換液,每個稀釋度取一瓶細胞收獲一半的細胞培養液上清,剩余上清液連同細胞直接置于-20℃凍結,反復凍融三次后收獲病毒液,其余每瓶細胞棄去舊維持液更換新鮮維持液6mL,置于37℃、5%CO2溫箱中繼續培養。此后每隔4d按上述方法收毒換液一次,共收獲4次(即一收至四收)。所有收獲的四次樣品全部置于-20℃保存待檢。 
在使用本發明對(細胞系源)豬瘟活疫苗作為效力檢驗應采用三收細胞上清樣品作為檢測樣品(見表5)。 
表5不同類型豬瘟活疫苗接種細胞后所收樣品(三收)的ELISA檢測結果 

“/”:細胞脫落死亡;“+”:陽性;“-”:陰性;“+/-”:可疑;所有檢測按照試劑盒說明要求陰、陽性對照結果均成立,檢測符合試劑盒說明的要求 
實施例2 
——采用豬瘟病毒抗原捕獲ELISA法檢測 
對全部15批細胞源豬瘟活疫苗接種的ST細胞第三收的上清樣品按照IDEXX豬瘟病毒抗原撲捉ELISA檢測試劑盒/血清的說明書的操作程序和判定標準進行ELISA檢測,并將檢測結果與RID檢測結果比較。其檢測結果見表4。. 
附件1 
——試劑盒使用說明書 
豬瘟病毒(CSFV)抗原檢測試劑盒/血清 
HerdChekCSFVAg/Serum 
名稱與用途 
IDEXX豬瘟病毒抗原檢測試劑盒/血清,是根據酶聯免疫反應原理設計的、用于檢測血清、血漿和組織樣品(扁桃體、脾臟、腸系膜淋巴結或腎臟為宜)中豬瘟病毒抗原的一種診斷試劑盒。 
概述 
豬瘟病毒(CSFV),牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和邊界病毒(Border Disease VirusBDV)是同屬于黃病毒科瘟病毒屬的3個成員。 
豬瘟作為絕對病原體和廣泛的致死性,對養豬業造成嚴重的損失。感染高致病力豬瘟病毒后,豬在出現臨床癥狀前會排出大量的病毒。耐過急性或亞急性感染的動物會產生抗體并且不再散毒。低致病力溫和病毒會造成豬的慢性感染,病豬將會持續或間歇排出病毒直至死亡。懷孕母豬與豬瘟病毒接觸后可能通過胎盤感染胎兒。先天性感染可能導致流產,木乃伊胎兒,死產和/或弱仔及畸形胎兒。低致病力病毒的先天感染導致最常見的結果是產出持續性感染的豬仔、在無疾病癥狀條件下傳播病毒以及無免疫應答。 
豬也有可能感染BVDV或BDV,盡管這些感染通常呈溫和經過并且是自限性的,而且很難檢測到病毒。IDEXXCSFV抗原檢測試劑盒對瘟病毒屬病毒有極高的敏感性,不能區分BVDV或BDV抗原,陽性檢測結果需要用CSFV特異的方法確認。 
原理微量滴定的形式是將豬瘟病毒(Erns)的單克隆抗體包被于微量板上裝配而成的。樣品中的豬瘟病毒抗原被捕獲在板子上。檢測樣品于微孔中孵育之后,捕獲的豬瘟病毒抗原由瘟病毒特異性抗體和辣根過氧化物酶標記物來檢測。然后,沒結合的酶標記物被洗掉,再加入底物和/色原體溶液。在酶的存在下,底物轉化為可以與色原體發生反應的產物并產生藍色。在加了終止液之后,產生黃色。用分光光度儀檢測在450nm[A(450)]下的單波長或者450nm和650nm[A(450/650)]雙波長下的吸光值。樣品的校正OD值由檢測樣品得到的吸光值和陰性對照的校正吸光值來計算 
試劑所有試劑要保存在2-8℃。 
1Ems單克隆抗體包被的微量反應板 2板 5板 2陽性對照 1.6ml 2.0ml 3陰性對照 1.6ml 2.0ml 4辣根過氧化物酶標記物 25ml 60ml 5濃縮組織浸泡緩沖液(2X) 115ml 2×115ml ATMB底物溶液N.12 20ml 60ml B終止液N.3 20ml 60ml C濃縮洗滌液(10×) 125ml 480ml D檢測溶液 15ml 30ml
試劑準備 
洗滌液制備 
10倍濃縮的洗滌液在使用前必須讓它恢復到18~26℃,使用時要搖勻使析出的鹽溶解。用蒸餾水或去離子水對濃縮洗滌液進行10倍稀釋(如:30ml的濃縮洗滌液要加270ml的水并充分混勻)。無菌條件下制備的洗滌液在2~8℃可保存1周。 
組織浸泡緩沖液 
濃縮組織浸泡緩沖液(2×)在使用前必須讓它恢復到18~26℃,使用時要搖勻使析出的鹽溶解。用蒸餾水或去離子水對濃縮組織浸泡緩沖液進行2倍稀釋。根據需要計算需要稀釋組織浸泡緩沖液的量。無菌條件下制備的組織浸泡緩沖液在2~8℃可保存1周。 
樣品準備 
血清和血漿 
血清和血漿(新鮮或凍結)都可用于檢測。 
組織 
最好使用新鮮的扁桃體,但如果需要,扁桃體也可冷凍保存。對送檢的每個動物處理一或兩個扁桃體,扁桃體、脾臟、腸系膜淋巴結或腎臟為宜。 
(1)用剪刀將組織剪成小塊(250mg). 
(2)將剪碎的組織置于適當的離心管或Eppendorf管中,加入1ml組織浸泡緩沖液。置于18~26℃條件下1~2小時。 
(3)1500×g離心10分鐘,取50μl上清液按照說明書進行檢測。 
組織樣品請使用過夜孵育模式操作。 
操作步驟 
在使用之前,所有的試劑盒組分都必須恢復到18-26℃。試劑應通過輕輕渦旋、旋轉混合均勻。每個樣本都使用不同的吸頭。 
1.取出用抗體包被的微量反應板,并在紀錄表上標記好每個樣本的位置。 
2.在每個反應孔中加入50μl的檢測溶液。可以用多道移液器(8或12道)加樣。 
3.在陰性對照的雙孔中各加50μl陰性對照。 
4.在陽性對照的雙孔中各加50μl陽性對照。 
5.在剩下的反應孔中分別加入50μl被檢樣品。 
6.輕彈微量反應板或用振蕩器振蕩,將反應板中的溶液混勻。 
7.樣品孵育: 
(1)血清和血漿樣品:在37℃(±3℃)的條件下孵育2小時(±5分鐘),也可在2-8℃的條件下孵育12-18小時。無論選擇哪種孵育方式,在孵育過程中應將微量反應板封閉或在濕盒內孵育,以防反應孔中的液體蒸發。 
(2)組織樣品:在2-8℃的條件下孵育過夜(12-18小時)。在孵育過程中應將微量反應板封閉或在濕盒內孵育,以防反應孔中的液體蒸發。 
8.吸出反應孔中的液體物質并棄入廢液缸中。 
9.每個反應孔加入約300μl的洗滌液進行洗滌,洗滌五次。每次洗滌后吸出所有孔中的液體。在最后一次洗滌完后,將反應板在吸水性強的物質上拍干。在洗滌時以及在加辣根過氧化物酶標記物之前要防止反應板出現干燥現象。 
10.在每個反應孔中加入100μl辣根過氧化物酶標記物。 
11.在18-26℃條件下孵育30分鐘(±3分鐘)。 
12.重復步驟8和9。 
13.在每個反應孔中加入100μlTMB底物溶液N.12。 
14.在18-26℃條件下避光孵育10分鐘(±1分鐘)。在加完第一個孔后開始計時。 
15.在每個反應孔中加入100μl的終止液N.3終止反應。在加終止液時要按加入底物溶液的順序進行滴加。 
16.將酶標儀在空氣中調零。 
17.于450nm單波長或450nm和650nm雙波測定樣本以及對照的吸光值。18.計算結果。 
結果 
陽性對照OD的平均值與陰性對照OD的平均值之差(P-N)必須大于或等于0.150OD,另外陰性對照OD的平均值必須小于或等于0.250OD,這樣實驗結果才算成立。 
若試驗結果失敗,有可能是實驗操作失誤造成,應按操作說明進行重復試驗。判斷各樣品是否含有待測抗原主要通過計算修正OD值(S-N)來決定的。 
示例見計算部分。 
注意:IDEXX提供數據分析軟件,幫助您計算平均值、S-N值以及提供綜合信息。 
計算 

結果判定 
1.被檢樣品的S-N值等于或小于0.100的,判為豬瘟病毒抗原陰性。 
2.被檢樣品的S-N值大于0.100,小于或等于0.300,判為可疑,之后可用豬瘟病毒特異性方法進行確認。 
3.被檢樣品的S-N值大于0.300的,判為豬瘟病毒抗原陽性。 

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