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一種具有解酒功效的中藥材及活性因子的高通量篩選方法.pdf

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一種 具有 解酒 功效 中藥材 活性 因子 通量 篩選 方法
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摘要
申請專利號:

CN201410255847.4

申請日:

2014.06.11

公開號:

CN103983598A

公開日:

2014.08.13

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):G01N 21/33申請日:20140611|||公開
IPC分類號: G01N21/33 主分類號: G01N21/33
申請人: 勁牌有限公司
發明人: 劉源才; 賴富麗; 熊瑜; 馮聲寶
地址: 435100 湖北省黃石市大冶市大冶大道169號
優先權:
專利代理機構: 黃石市三益專利商標事務所 42109 代理人: 瞿暉
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410255847.4

授權公告號:

||||||

法律狀態公告日:

2016.03.09|||2014.09.10|||2014.08.13

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種具有解酒功效的中藥材及活性因子的高通量篩選方法,是先將待篩選的若干種中藥材分別粉碎,再分別用有機溶劑提取40-60分鐘,離心分離,得若干上清液;此上清液即作為待測樣本溶液;再在微孔板中加入反應體系;將空白對照樣品和待測樣品一起置于酶標儀中震蕩孵育30min后,迅速在每孔中加入0.04~0.2mmol/L的乙醛溶液15μL,搖勻后立即開始測定各樣品在340nm處的吸光值;利用酶標儀自帶軟件記錄吸光度值并繪制出空白對應樣品及待測樣品吸光度值變化曲線;得出樣品曲線凈面積NetAUC值;本發明方法一次可篩選上百種甚至幾百種中藥材,快速、準確率高,操作方便。

權利要求書

權利要求書
1.  一種具有解酒功效的中藥材及活性因子的高通量篩選方法,其特征在于包括下述步驟:
  a.將待篩選的若干種中藥材分別粉碎至20~100目,分別用30%~90%乙醇、甲醇或丙酮中的一種,提取40-60分鐘,離心分離,得若干上清液;或將待篩選的若干活性因子分別用30%~90%乙醇、甲醇或丙酮中的一種,提取40-60分鐘,離心分離,得若干上清液;此上清液即作為待測樣本溶液;
  b.在微孔板中的每個微孔中加入下述反應體系:50-200mmol/L、pH7.8-8.5的磷酸鉀緩沖液75-90μL,0.1~0.5mmol/L的二硫蘇糖醇10-15μL,0.1~2mg/ml乙醛脫氫酶20-25μL,0.0625~20mmol/L  NAD+溶液30μL;
   c.再在上述其中一個微孔中加入90 mmol/L、pH8.5的磷酸鉀緩沖溶液25μL作為空白對照樣品,余下微孔中一一加入步驟a.所制備的待測樣本溶液25μL,作為待測樣品并編號;然后一起置于酶標儀中震蕩孵育30min后,迅速在每孔中加入0.04~0.2 mmol/L的乙醛溶液15μL,搖勻后立即開始測定各樣品在340nm處的吸光值;
   d.利用酶標儀自帶軟件記錄吸光度值并繪制出空白對照樣品及待測樣品吸光度值變化曲線;將所得到的待測樣品曲線的積分面積減去空白對照樣品的曲線積分面積,得出待測樣品曲線凈面積Net AUC值,此值即為激活率;激活率為正數時證明該樣品中所加入的中藥材或活性因子具有激活乙醛脫氫酶的能力,也說明該藥材或活性因子具有解酒的功效;反之,激活率為負數時,說明該樣品中所加入的中藥材或活性因子不具備激活或具有抑制乙醛脫氫酶的能力,也說明該藥材或活性因子不具有解酒的功效。

2.  根據權利要求1所述的一種具有解酒功效的中藥材及活性因子的高通量篩選方法,其特征在于包括下述步驟:
  a.將待篩選的若干種中藥材分別粉碎至100目,分別用70%乙醇提取60分鐘,離心分離,得若干上清液;或將待篩選的若干活性因子分別用70%乙醇溶解,離心分離,得若干上清液;上述所得的上清液即作為待測樣本溶液;
   b.在微孔板中的每個微孔中加入下述反應體系:100mmol/L、pH8.5的磷酸鉀緩沖液90μL, 0.5mmol/L的二硫蘇糖醇10μL,1mg/ml乙醛脫氫酶25μL,10mmol/L  NAD+溶液30μL;
   c.再在上述其中一個微孔中加入90 mmol/L、pH8.5的磷酸鉀緩沖溶液25μL作為空白對照樣品,余下微孔中一一加入步驟a.所制得的待測樣本溶液25μL,作為待測樣品并編號;然后一起置于酶標儀中震蕩孵育30min后,迅速在每孔中加入0.1mmol/L的乙醛溶液15μL,搖勻后立即開始測定各樣品在340nm處的吸光值;
   d.利用酶標儀自帶軟件記錄吸光度值并繪制出空白對照樣品及待測樣品吸光度值變化曲線;將所得到的待測樣品曲線的積分面積減去空白對照樣品的曲線積分面積,得出待測樣品曲線凈面積Net AUC值,此值即為激活率;激活率為正數時證明該樣品中所加入的中藥材或活性因子具有激活乙醛脫氫酶的能力,也說明該藥材或活性因子具有解酒的功效;反之,激活率為負數時,說明該樣品中所加入的中藥材或活性因子不具備激活或具有抑制乙醛脫氫酶的能力,也說明該藥材或活性因子不具有解酒的功效。

3.  根據權利要求1或2所述的一種具有解酒功效的中藥材及活性因子的高通量篩選方法,其特征在于:所述的活性因子是單體化合物或復合物。

說明書

說明書一種具有解酒功效的中藥材及活性因子的高通量篩選方法
技術領域
本發明涉及一種高通量篩選活性物質的方法,具體是一種具有解酒功效的中藥材及活性因子的高通量篩選方法。
背景技術
中國是一個具有深厚酒文化底蘊的國家,大小喜事、聚會以及各種節日都離不開酒。但過量飲酒給人類健康和社會治安造成危害的報道已屢見不鮮。傳統中藥用于解酒有悠久的歷史,目前,我國常用中藥材達幾百種,如何從常用中藥材中尋找具有一定解酒功效的中藥,并將其開發成具有解酒功效,安全方便的藥物或保健品,使醉酒者服用后可快速起效,已成為相關行業開發解酒產品的主要途徑。現在常規的篩選方法一次只能篩選一種中藥,耗時長,試劑用量大,不能滿足企業產品開發的需求。
發明內容
本發明的目的就是提供一種高效、快捷、簡便的具有解酒功效的中藥材及活性因子的高通量篩選方法。
本發明采用的技術方案包括下述步驟:
a. 將待篩選的若干種中藥材分別粉碎至20~100目,分別用30%~90%乙醇、甲醇或丙酮中的一種提取40-60分鐘,離心分離,得若干上清液;或將待篩選的若干活性因子分別用30%~90%乙醇、甲醇或丙酮中的一種提取40-60分鐘,離心分離,得若干上清液;此上清液即作為待測樣本溶液;
b. 在微孔板中的每個微孔中加入下述反應體系:50-200mmol/L、pH7.8-8.5的磷酸鉀緩沖液75-90μL,0.1~0.5mmol/L的二硫蘇糖醇10-15μL,0.1~2mg/ml乙醛脫氫酶20-25μL,0.0625~20mmol/L  NAD+溶液30μL;
c. 再在上述其中一個微孔中加入90 mmol/L、pH8.5的磷酸鉀緩沖溶液25μL作為空白對照樣品,余下微孔中一一加入各待測樣本溶液25μL作為待測樣品并編號;然后一起置于酶標儀中震蕩孵育30min后,迅速在每孔中加入0.04~0.2 mmol/L的乙醛溶液15μL,搖勻后立即開始測定各樣品在340nm處的吸光值;
d. 利用酶標儀自帶軟件記錄吸光度值并繪制出空白對照樣品及待測樣品吸光度值變化曲線;將所得到的待測樣品曲線的積分面積減去空白對照樣品的曲線積分面積,得出待測樣品曲線凈面積Net AUC值,此值即為激活率;激活率為正數時證明該樣品中所加入的中藥材或活性因子具有激活乙醛脫氫酶的能力,也說明該藥材或活性因子具有解酒的功效;反之,激活率為負數時,說明該樣品中所加入的中藥材或活性因子不具備激活或具有抑制乙醛脫氫酶的能力,也說明該藥材或活性因子不具有解酒的功效。
本發明的優選方法包括下述步驟:
a.將待篩選的若干種中藥材分別粉碎至100目,分別用70%乙醇提取60分鐘,離心分離,得若干上清液;或將待篩選的若干活性因子分別用70%乙醇溶解,離心分離,得若干上清液;上述所得的上清液即作為待測樣本溶液;
b.在微孔板中的每個微孔中加入下述反應體系:100mmol/L、pH8.5的磷酸鉀緩沖液90μL, 0.5mmol/L的二硫蘇糖醇10μL,1mg/ml乙醛脫氫酶25μL,10mmol/LNAD+溶液30μL;
c.再在上述其中一個微孔中加入90 mmol/L、pH8.5的磷酸鉀緩沖溶液25μL作為空白對照樣品,余下微孔中一一加入各待測樣本溶液25μL作為待測樣品并編號;然后一起置于酶標儀中震蕩孵育30min后,迅速在每孔中加入0.1mmol/L的乙醛溶液15μL,搖勻后立即開始測定各樣品在340nm處的吸光值;
d.利用酶標儀自帶軟件記錄吸光度值并繪制出空白對照樣品及待測樣品吸光度值變化曲線;將所得到的待測樣品曲線的積分面積減去空白對照樣品的曲線積分面積,得出待測樣品曲線凈面積Net AUC值,此值即為激活率;激活率為正數時證明該樣品中所加入的中藥材或活性因子具有激活乙醛脫氫酶的能力,也說明該藥材或活性因子具有解酒的功效;反之,激活率為負數時,說明該樣品中所加入的中藥材或活性因子不具備激活或具有抑制乙醛脫氫酶的能力,也說明該藥材或活性因子不具有解酒的功效。
本發明中所述的活性因子是單體化合物或復合物。
本發明的方法是基于以下原理來實現的:乙醇(酒精)通過胃和腸道吸收進入人體血液循環,然后再進行代謝分解,乙醇氧化成乙醛,乙醛在乙醛脫氫酶和NAD+(氧化態輔酶I)作用下,氧化成乙酸,同時NAD+還原成NADH(還原態輔酶I),而NADH在340nm處有吸收而其他反應物在此波長下均無吸收。利用酶標儀測定此波長下生成物吸光度的大小及變化,即可以預測加入物質對乙醛脫氫酶(ALDH)的作用,從而篩選得到具有解酒功效的中藥材及活性因子。
本發明與現有技術相比,具有以下特點:
1.本發明首次利用高通量方法對具有解酒功效的中藥材或活性因子進行篩選,根據需要選擇不同規格的微孔板,一次最多可篩選上百種或幾百種中藥材或活性因子,耗時短,精確率高,試劑用量少;
2.選用的反應體系更簡單,操作方便;
3.本發明選用96孔微孔板作為反應容器,根據輔酶I變化吸收值來篩選乙醛脫氫酶活性,進而篩選具有解酒功效的中藥材或活性因子活性因子,為開發解酒產品提供一定依據。
附圖說明
圖1是空白對照樣品及加入百合樣品后在一定時間內的吸光度值變化曲線。
圖中:1—空白對照樣品曲線,2—百合樣品曲線。
具體實施方式
為了進一步說明本發明專利內容,以具體實施例說明。
實施例1  
1.將待篩選的95種中藥材(見表1待篩選藥材清單)分別粉碎過100目藥典篩后,分別用70%乙醇提取60分鐘,離心分離(6000rpm,15min),得各藥材的上清液;此上清液即為待測樣本溶液(為操作方便,可先將此上清液轉入微孔板中,并根據檢測需要作適當稀釋,也可不經過此步驟);
表1 待篩選藥材清單

2.在微孔板中的每個微孔中加入下述反應體系:100mmol/L、pH8.5的磷酸鉀緩沖液90μL, 0.5mmol/L的二硫蘇糖醇10μL,1mg/ml乙醛脫氫酶25μL,10mmol/LNAD+溶液30μL;
3.再在上述其中一個微孔中加入90 mmol/L、pH8.5的磷酸鉀緩沖溶液25μL作為空白對照樣品,余下微孔中一一加入步驟1.所制得的各待測樣本溶液25μL作為待測樣品并編號;然后一起置于酶標儀中震蕩孵育30min后,迅速在每孔中加入0.1mmol/L的乙醛溶液15μL,搖勻后立即開始測定各樣品在340nm處的吸光值;
4.利用酶標儀自帶軟件記錄95個待測樣品及空白對照樣品的吸光度值,初始吸光度值記為f0,每一分鐘測定一次,持續90分鐘,每個樣品的吸光度值分別記為f1,f2 …f90,當fX達到最大值且穩定不變時反應結束,反應時間記為Tmax,其Δ吸收值標記為A,An=fn - f0(n=1,2,3…90)。待測樣品A值的增長曲線的積分面積扣除空白對照樣品A值的曲線面積,得出待測樣品的曲線凈面積(Net AUC)。公式計算出Net AUC值,此值即為激活率;激活率為正數時即證明該樣品中所加入的中藥材具有解酒的功效;為負數時,說明不具備解酒的功效。
本實施例中,百合的激活率為65%,為正數,因此,具有解酒功效,且活性最高。激活率為正數的中藥還有:葛根、葛花、麥芽、雞內金、半夏;其它藥材的激活率均為負數,因此,不具有解酒功效。
將所篩選出的活性最高的百合提取液進行小鼠醉酒實驗顯示,給予百合提取液的實驗組小鼠醉酒率明顯降低,說明用本發明方法篩選的中藥材確實具有解酒的功效,也說明本發明方法用于具有解酒功效中藥材的篩選是切實可行的。
實施例2
1.將待篩選的5種活性因子(葛根素、二氫楊梅素、枸杞提取物、桑葉提取物、番茄紅素),分別用70%乙醇溶解,離心分離(7500rpm,10min)后,得上清液;此上清液即為待測樣本溶液;
2. 在微孔板中的每個微孔中加入下述反應體系:100mmol/L、pH8.5的磷酸鉀緩沖液90μL, 0.5mmol/L的二硫蘇糖醇10μL,1mg/ml乙醛脫氫酶25μL,10mmol/L  NAD+溶液30μL;
3.再在上述其中一個微孔中加入90 mmol/L、pH8.5的磷酸鉀緩沖溶液25μL作為空白對照樣品,余下微孔中一一加入步驟1.所制得的各待測樣本溶液25μL作為待測樣品并編號;然后一起置于酶標儀中震蕩孵育30min后,迅速在每孔中加入0.1mmol/L的乙醛溶液15μL,搖勻后立即開始測定各樣品在340nm處的吸光值;
4.利用酶標儀自帶軟件記錄吸光度值,初始吸光度值記為f0,每一分鐘測定一次,持續90分鐘,每個樣品的吸光度值分別記為f1,f2 …f90,當fX達到最大值且穩定不變時反應結束,反應時間記為tmax,其Δ吸收值標記為A,An=fn - f0(n=1,2,3…90)。待測樣品A值的增長曲線的積分面積扣除空白對應樣品A值的曲線面積,得出待測樣品的曲線凈面積(Net AUC)公式計算出Net AUC值,此值即為激活率;激活率為正數時即證明該樣品中所加入的活性因子具有解酒的功效;為負數時,說明不具備解酒的功效。   內容來自專利網www.wwszu.club轉載請標明出處

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