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一種測定刺激事件對細胞產生的影響的方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201410257790.1

申請日:

2006.04.05

公開號:

CN103983772A

公開日:

2014.08.13

當前法律狀態:

撤回

有效性:

無權

法律詳情: 發明專利申請公布后的視為撤回IPC(主分類):G01N 33/554申請公布日:20140813|||實質審查的生效IPC(主分類):G01N 33/554申請日:20060405|||公開
IPC分類號: G01N33/554; G01N33/543 主分類號: G01N33/554
申請人: 康寧股份有限公司
發明人: 方曄; A·M·菲里; N·H·方丹; J·拉希瑞; 阮寶祺
地址: 美國紐約州
優先權: 2005.04.05 US 60/668,908
專利代理機構: 上海專利商標事務所有限公司 31100 代理人: 韋東
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410257790.1

授權公告號:

||||||

法律狀態公告日:

2016.06.29|||2014.09.10|||2014.08.13

法律狀態類型:

發明專利申請公布后的視為撤回|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開一種測定刺激事件對細胞產生的影響的方法,具體涉及一種鑒定細胞狀態的方法,該方法包括:在無標記生物傳感器表面上培養細胞,由此形成細胞-生物傳感器組合;和檢測所述細胞-生物傳感器組合,所述檢測包括鑒定培養細胞所在表面的不均勻性。還公開了一種確定活細胞狀態的方法,包括用共振波導光柵生物傳感器觀測細胞成分的動態物質再分布;以及一種測試化合物對細胞的作用的方法,該方法包括:在生物傳感器上培養細胞;洗滌細胞;饑餓細胞;將化合物與細胞孵育;用生物傳感器記錄信號。

權利要求書

權利要求書
1.  一種鑒定細胞狀態的方法,該方法包括:
在無標記生物傳感器表面上培養細胞,由此形成細胞-生物傳感器組合;和
檢測所述細胞-生物傳感器組合,所述檢測包括鑒定培養細胞所在表面的不均勻性。

2.  如權利要求1所述的方法,其特征在于,所述檢測細胞-生物傳感器組合區分以下至少一種:與活細胞接觸的生物傳感器表面的區域;與受到刺激事件影響的細胞接觸的生物傳感器表面的區域;和不接觸細胞的生物傳感器表面的區域;或其組合。

3.  如權利要求2所述的方法,其特征在于,在微板的單個孔中存在多個生物傳感器,所述多個生物傳感器用或未用隔斷物物理間隔開。

4.  如權利要求3所述的方法,其特征在于,所述生物傳感器由隔斷物物理間隔開,界定孔內區室的隔斷物低于界定微板上各孔的隔斷物。

5.  一種確定活細胞狀態的方法,包括用共振波導光柵生物傳感器觀測細胞成分的動態物質再分布。

6.  一種測試化合物對細胞的作用的方法,該方法包括:
在生物傳感器上培養細胞;
洗滌細胞;
饑餓細胞;
將化合物與細胞孵育;
用生物傳感器記錄信號。

說明書

說明書一種測定刺激事件對細胞產生的影響的方法
本發明專利申請是國際申請號為PCT/US2006/013539,國際申請日為2006年4月5日,進入中國國家階段的申請號為200680019857.1,名稱為“無標記的生物傳感器和細胞”的發明專利申請的分案申請。
I.相關申請的交叉參考
本申請要求2005年4月5日提交的美國臨時申請系列號60/668,908、標題為“無標記的生物傳感器和細胞”的優先權,并將其納入作為參考。
II.背景技術
最終會為市場帶來新藥的藥物研究和開發過程是一個復雜和費用很大的過程。此外,藥物開發的最初階段利用親和結合檢測,此檢測通常在體外進行,提供有限的潛在藥物化合物對感興趣靶標產生作用的能力的信息。許多這樣的潛在前導物在基于細胞的檢測或臨床前/臨床實驗中的基于動物模型有效性的檢測中都以失敗告終,導致高的損耗率。最近,包括高含量篩選技術在內的創新的細胞基技術已在藥物和生物技術工業普及。這些檢測技術為靶標-化合物相互作用的細胞結果提供了功能性的、動力學方面的細胞基信息。所獲得的數據包括信號傳導途徑、藥物作用機制、藥效、選擇性和毒性的信息。需要使用熒光標記或發光標記以進行基于圖象的檢測的大多數現有細胞基技術通常著重于評估離散的胞內事件(如Ca2+流、cAMP產生和積累、靶標遷移、報道子基因產生等)。由于細胞功能的復雜性,細胞響應通常產生自多種信號的集合,因此基于給定的單細胞響應或信號的檢測技術往往無法產生針對藥物刺激的全部綜合細胞應答的信息。標記物的使用、或者人工增強行為的采用(如轉染或RNAi剔除)或報道子基因系統的使用可產生一種不同的闡明感興趣靶標的真實細胞生理學的途徑。基于這些原因,仍需要能夠檢測分子對活細胞的影響,如檢測分子是否影響到特定的信號途徑,如G蛋白偶聯的受體(GPCR)或表皮生長因子受體(EGFR),或分子是否引起細胞增殖,或引起細胞死亡或停止生長。無標記或非標記依賴性檢測(LID)生物傳感器的使用是有利的,因為該 生物傳感器滿足了通常很復雜的標記策略和檢測機制的需求。無標記生物傳感器對于高通量方法而言更為便利。所公開的是使用無標記生物傳感器進行任何類型的細胞檢測的方法和系統,包括檢測信號傳導途徑和細胞增殖和死亡。
III.發明內容
本發明公開了涉及無標記的生物傳感器和它們在細胞方面的用途的方法和組合物。
IV.附圖說明
納入本文并構成本說明書一部分的附圖闡述了幾個實施例,并與說明書一起闡述了所公開的組合物和方法。
圖1顯示肝細胞粘附在傳感器表面后光學波導光柵(OWG)微板的一個具體檢測方案的例子。圖象顯示采用陣列式角度(arrayed angular)訊問系統獲得的細胞培養獲得~95%細胞覆蓋率后5行(7個/行)傳感器的共振帶圖象。該陣列式角度訊問系統由用于產生光束陣列、使各光束照射OWG傳感器的發射系統和用于接收從這些傳感器反射的光束所產生的所有響應的接收系統。此系統允許同時測量多個系統中貼壁細胞的響應。此實施例是5×7,但可使用6×7、或7×7,或者任何與該光產生和接收系統相適應的配置。這些測量值可以實時獲取,時間分辨率例如是~3秒。不連續的環表示,如光顯微鏡圖象所證實的,細胞密度在此傳感器上不是一致的。
圖2a顯示用于細胞檢測的基于細胞貼壁層內刺激誘導的定向物質再分布的光學生物傳感器。所示的實施例是一種光學波導光柵傳感器,由位于折射率nA=1.50的玻璃基底之上的高折射率(nF=2.36)、厚度為dF(75mm)的Nb2O5薄膜,位于波導管薄膜之上的總折射率nA=1.37的細胞貼壁層,以及折射率為~1.33(nC)的周圍介質構成。該OWG生物傳感器是一種攸逝波傳感器,以光通過衍射光柵諧振耦合到波導之中為基礎。激光以各種角度照射該波導,光僅在特定角度耦合到波導中,取決于導向模式的有效折射率(N)。配體誘導的靶標激活導致與靶標相互作用的組分向該靶標集合、所產生的靶標復合物的移動、以及潛在的細胞骨架結構的重構(即形態學變化)。當這些移動或變化發生在非常靠近OWG傳感器表面的邊緣時(細胞在在該表面上培養),在某個時間就會產生DMR信號(如箭頭所指),可對此信號進行實時監控。細胞貼壁 層內配體誘導的定向物質再分布導致有效折射率的改變,這又會使出耦合的光(out-coupled light)發生角度偏移。圖2b顯示檢測傳感體積范圍內的刺激介導的縱向物質再分布的三層構型。細胞底部被表示為由多個相同間隔和均質的薄層組成,各層各自的折射率為ni,蛋白質濃度為Ci,距離為Zi(與傳感器表面之間的距離)。周期為Λ的光柵嵌埋在折射率為nF、厚度為dF的波導膜中。波導膜放置在折射率為ns的基底是上表面上。
圖3顯示作為刺激介導的細胞內容物的不對稱橫向再分布的函數的相變。在平面波導中傳播的被導光顯示為Z字形的波。傳感體積范圍內不均勻的橫向物質分布導致給定模式的共振峰的擴大,甚至分裂。
圖4顯示作為與傳感器表面之間的距離的函數的傳感器一導向模式的攸逝波的強度。
圖5顯示OWG傳感器的另一種對稱性。這種所謂的反對稱波導管構型由波導膜(如Nb2O5)構成,該膜由通常為1-100微米厚的納米孔二氧化硅(有或沒有玻璃底部支持)支持。該納米孔二氧化硅的有效折射率為~1.1,它的折射率低于覆蓋介質的折射率,該覆蓋介質通常是用于本發明的水溶液。
圖6顯示一些參數,基于這些參數可使用OWG生物傳感器進行細胞檢測。圖6A顯示的是示范性的用8nM EGF誘導的~95%覆蓋率的靜息態A431細胞貼壁層的時間依賴性響應,采用角度訊問系統獲得。如圖6A所示,可定義細胞內刺激誘導的定向物質再分布的動力學的6個參數是:1)總動態特征(即形狀);2)響應階段(如,在此具體實施例中有三個階段:正向物質再分布(P-DMR)、凈零定向物質再分布(net-zero DMR)和逆向物質再分布(N-DMR));3)各階段的動力學;4)P-DMR階段和N-DMR階段兩者的總持續時間;5)P-DMR階段和N-DMR階段兩者的總振幅;和6)P-DMR階段到N-DMR階段的過渡時間τ。圖6B顯示~90%覆蓋率的示范性A431細胞的典型的共振峰,采用TM0模式獲得,該圖闡述了以下另4個參數:7)峰位置;8)強度;9)形狀;和10)最大值一半的寬度(PWHM)。圖6C顯示在示范性A431細胞在其上培養到覆蓋率~95%的傳感器#5的典型的TM0共振帶圖象。使用陣列式角度訊問系統獲得這些數據,它們闡述了另5個特征:11)帶的形狀;12)位置;13)強度;14)分布;和15)寬度。所有這些參數可獨立或一起用于使用本文所揭示的傳感器的任何細胞檢測的任何給定應用中。可用這些參數的亞組合或組合來為一特定檢測或特定檢測的特定變化提供一特征,例如細胞受體實驗特征,如基于EGF 受體的實驗的特征。
圖7顯示EGF誘導的靜息態A431細胞的劑量依賴性響應。(A)并行采用我們的系統獲得的不同濃度EGF誘導的細胞響應的實時動力學。EGF的最終濃度顯示在圖中。(B)基于圖7A所示的過渡階段和終了階段之間的差異而計算得到的N-DMR信號的振幅,它是EGF濃度的函數。獲得了典型的飽和曲線。(C)從P-DMR到N-DMR時間的過渡時間τ,它是EGF濃度的函數。(D)采用非線性回歸獲得的N-DMR事件的κ值,它是EGF濃度的函數。
圖8顯示一種基于定向物質再分布的篩選和歸類針對特定靶標或信號途徑的化合物的方法。在此圖中,標記物可以是特定靶標或信號途徑或細胞功能的活化劑或滅活劑,它導致或阻止定向物質再分布或信號。虛箭頭指示兩個步驟可以互換,或組合在一起。步驟804和806可以視為是本文所討論的一種刺激事件。
圖9顯示具有各種典型組分的生物細胞的示意性圖。該細胞由含有大量細胞器官的細胞質(通常10-30μM)構成。最大的細胞器官是細胞核,其大小通常為3-10μm。細胞核里有蛋白質,最重要的蛋白質是染色質。線粒體是小細胞器,它含有一系列的折疊的膜,大小通常為0.5-1.5μm。其它細胞組分包括內質網(ER)(通常為0.1-1μm)、溶酶體(lysome)(通常為0.2-0.5μm)、過氧物酶體(通常為0.2-0.5μm),和內含體(通常~100nm)。
圖10顯示顯示了光學LID系統的圖,該系統用于根據本文所公開的方法和系統監控活細胞中的物質再分布(如GPCR遷移)。
圖11顯示分別具有不同的穿透深度:100、200和300nm的三種類型的傳感器的攸逝場(即相對響應),它作為與生物靶標與傳感器表面的距離的函數。這證明了不同穿透深度對細胞傳感的重要性,尤其對于探測細胞內的移動或DMR事件。
圖12顯示一種基于定向物質再分布而鑒定和評估靶標的方法。注意:(1)在此種情況中標記物是具體靶標的活化劑或滅活劑,它能導致或阻止定向物質再分布事件或信號;(2)所獲得的響應可用于鑒別具體細胞中的靶標水平,或評估具體信號途徑或給定的疾病細胞類型中的靶標;和(3)1206可視為是本文所公開的一種刺激事件。
圖13顯示基于定向物質再分布鑒別和評估靶標的另一種方法。注意:(1)在此種情況中標記物是具體靶標的活化劑或滅活劑,它能導致或阻止定向物質 再分布事件或信號;(2)所獲得的響應可用于鑒別具體細胞中的靶標水平,或評估具體信號途徑或給定的疾病細胞類型中的靶標;和(3)1304和1304兩者都可視為是本文所公開的一種刺激事件。
圖14顯示可用于例如圖13所述的另一種方法中的光學LID生物傳感器微板。這種特定的微板是一種多區室平板,在各孔中有嵌埋有光學生物敏感器的多區室。在此96孔微板中,各孔含有4個區室,各區室嵌埋有一個波導光柵基片,可用于容納一個類型的細胞或感興趣的靶標。四個區室被內壁分開,內壁的高度(優選100微米到2毫米)要比各孔的高度(通常是給定微板的高度)低得多,不論各區室的不同靶標是什么,具有4個區室的各孔可用于同時檢測一種藥物候選物對多個靶標或多種細胞類型的作用。灰色的線條表示基于波導光柵的生物傳感器。
圖15顯示基于定向物質再分布鑒別和評估靶標的另一種方法。注意:(1)在此種情況中標記物是具體靶標的活化劑或滅活劑,它能導致或阻止定向物質再分布事件或信號;(2)所獲得的響應可用于鑒別具體細胞中的靶標水平,或評估具體信號途徑或給定的疾病細胞類型中的靶標;和(3)1503、1504、1508和1509都可視為是本文所公開的一種刺激事件。
圖16是顯示與刺激事件導致的細胞調節相關的不同狀態的圖,所示細胞調節例如是可通過分析光學LID系統(如圖10所示的系統)的時間依賴性光學響應輸出來鑒別的生物細胞中的GPCR遷移。
圖17顯示闡述實時監控刺激事件的方法的基本步驟的流程圖,所述事件例如是使用本文所述的光學LID生物傳感器獲得的激動劑誘導的細胞受體的物質再分布,包括活細胞內的GPCR遷移。1706和1708可以視為是本文所述的一種刺激事件。
圖18顯示基于定向物質再分布的鑒別靶標的一個例子。注意:(1)此圖所示的實施例是癌細胞系A431的EGF-誘導的DMR響應與另一細胞系CHO之間的比較。(2)在如圖中所示的三種不同條件下培養的~95%覆蓋率的A431細胞貼壁層的EGF-誘導的DMR響應與在0.1%胎牛血清(FBS)培養了20小時的~95%覆蓋率的中國倉鼠卵巢細胞貼壁層的EGF-誘導的DMR響應比較。在加入50μl4x的EGF溶液(32nM)之前,用25μl的正規Hanks平衡鹽溶液(HBSS)處理被100μl培養基覆蓋的細胞至少2次,間隔15分鐘,這樣細胞達到一種穩定的狀態,表現為長時間的net-zero響應。(3)刺激事件是導致定向物質 再分布事件或信號的特定靶標(EGFR)的活化劑(如同源配體,EGF)。和(4)A431細胞內源性地過表達表皮生長因子受體(EGFR)(每個細胞~1700000拷貝)。相反,CHO細胞不內源性地表達EGFR。1801表示CHO細胞的輸出數據。1802表示在0.1%胎牛血清(FCS)培養20小時的A431的輸出數據。1803表示10%FCS中的A431細胞的輸出數據。1804表示在0.1%FCS中培養4小時的A431的輸出數據。
圖19是闡述使用本文所述的光學LID生物傳感器基于活細胞內的物質再分布來篩選針對靶標(如GPCR)的刺激事件(如激動劑事件)的方法的基本步驟的流程圖。
圖20是闡述使用本文所述的光學LID生物傳感器基于活細胞內的物質再分布來篩選針對細胞靶標,如受體,如GPCR的刺激事件(如拮抗劑事件)的方法的基本步驟的流程圖。2006和2008可視為是本文公開的刺激事件。
圖21是闡述產生可用于本文所述的任一方法的自參考(self--referencing)光學LID生物傳感器的方法的基本步驟的流程圖。
圖22是闡述產生自參考光學LID生物傳感器的另一種方法的基本步驟的流程圖,該自參考光學LID生物傳感器在同一傳感器的空間上分開的區域中容納兩種細胞類型的貼壁層,該方法可用于本文所述的任一種方法中。2212可以視為是本文所公開的刺激事件。
圖23是闡述使用本文所述的光學LID生物傳感器基于多種類型的活細胞內的物質再分布來篩選刺激事件(如激動劑誘導的受體活動,所述受體例如GPCR)的方法的基本步驟的流程圖。2306和2308可視為是本文公開的刺激事件。
圖24是闡述使用本文所述的光學LID生物傳感器基于物質再分布來篩選一系列化合物(如特定受體的潛在激動劑或拮抗劑,所述受體例如一個類型活細胞中的多種GPCR)的方法的基本步驟的流程圖。2406和2408可視為刺激事件。
圖25顯示顯示篩選干擾細胞骨架結構的調節劑的方法。2506、2508和2510可以視為是刺激事件。
圖26顯示篩選干擾膽固醇外溢的調節劑的方法的一個例子。2606、2608和2610可以視為是刺激事件。
圖27是顯示體內脂質信號傳遞和通信的示意圖。
圖28(A)顯示甲基-β-環糊精(mβCD)對LID傳感器上靜息態A431細胞和Hela細胞貼壁層的時間依賴性響應。圖28(B)顯示化合物(20nM EGF或1000nM H7)對mβCD誘導的靜息態A431細胞響應的作用。在加入mβCD溶液之前預先用相應的化合物處理該靜息態A431細胞至少40分鐘。
圖29顯示粘附在波導生物傳感器上CHO細胞層的DMSO誘導的劑量響應和時間依賴性響應。在20%DMSO,觀察到4個事件:(A)由于DMSO溶液剛加入之后指數明顯變化而產生的大的響應信號;(B)可能由于兩種液體在孔中混合而產生的小的減弱的信號;(C)可能由于DMSO滲入并替代細胞內的生物液體而導致的緩慢而穩定的增強的信號;和(D)由于高濃度DMSO的毒性引起的細胞蛋白質或其它生物分子的損失而導致的長時間的減弱的信號。
圖30顯示粘附在波導生物傳感器上的A431細胞層的DMSO誘導的劑量響應和時間依賴性響應。所觀察到的響應與在CHO細胞層上觀察到的類似。
圖31A顯示培養于Nb2O5光學波導生物傳感器上具有不同覆蓋率(30%、50%和90%)的CHO細胞層的入射耦合光的強度,它是入射角的函數。耦合模式是橫向磁場(TM0)模式。圖31B:使用TM0模式計算了半最大值峰寬,并作為CHO細胞覆蓋率的函數作圖。
圖32A和32B顯示培養在波導光柵傳感器上覆蓋率分別為5%和75%的CHO細胞層的TM0模式共振峰。圖32B:加入DMSO(最終濃度為18%)后不同時間記錄的共振峰譜。右圖中的虛箭頭顯示DMSO處理后25分鐘峰變寬并開裂。
圖33顯示全部傳感器的TM0模式共振帶圖象,其中各傳感器覆蓋有不同覆蓋率的CHO細胞層(如圖中所示)。所示圖象為用緩沖液(第2欄)和18%DMSO(第1欄)處理25分鐘后獲取。
圖34顯示全部傳感器的TM0模式共振帶圖象,其中各傳感器覆蓋有相同覆蓋率(~95%)的CHO細胞層。該圖象在用緩沖液(第2欄)和不同濃度的DMSO(第1、3欄,如圖所示)處理25分鐘后獲取。環表示~15%的DMSO對CHO細胞的毒性所誘導的峰分裂。
圖35A和35B顯示培養在波導光柵傳感器區域上和該區域之外的CHO細胞的相襯度成像(phase contrast image)。
圖36A顯示CHO細胞(培養在Nb2O5光學波導生物傳感器36小時)的TM0模式的入射耦合光(incoupled light)的強度,它是入射角的函數。初始接種的細胞數量不同,用以研究CHO細胞的增殖速率。耦合模式是橫向磁場(TM0) 模式。圖36B顯示使用TM0模式計算得到的半最大值的峰寬,并將其繪制成CHO最初接種數量的函數。
圖37顯示波導管光柵生物傳感器上,不同最初細胞接種數量,CHO細胞增殖的監測。觀察到全部傳感器TM0模式共振圖象的形狀和位置是最初接種細胞數量依賴性的,表明CHO細胞的增殖速率依賴于最初接種的細胞數量。
圖38顯示表皮生長因子受體(EGFR)信號途徑。酪氨酸激酶的表皮生長因子(EGF)受體家族由四種受體組成:RGF-R(ErbB1)、ErbB2(Neu)、ErbB3和ErbB4。EGFR家族的成員包括細胞質酪氨酸激酶結構域、單一跨膜結構域、和涉及配體結合和受體二聚作用的胞外結構域。配體與EGFR的結合導致該受體與其它家族成員形成同型二聚體或異型二聚體。各二聚體受體復合物將通過召集不同的含Src同源物2(SH2)效應蛋白來啟動不同的信號途徑。二聚體化導致自磷酸化,從而啟動不同的一系列的下游細胞信號途徑。活化的EGF-R二聚體復合物與銜接蛋白質Grb(偶聯于鳥嘌呤核苷酸釋放因子SOS)復合。該Grb-SOS復合物可直接結合到受體中的磷酸化的酪氨酸位點或通過Shc間接結合。這些蛋白質相互作用使SOS非常接近Ras,使得Ras被活化。這然后活化ERK和JNK途徑,繼而活化促進基因表達和細胞增殖的轉錄因子如c-fos、AP-1和Elk-1。EGF=表皮生長因子;EGFR=表皮生長因子受體;Shc=src同源結構域共有序列;grb2=生長因子受體結合的蛋白2;SOS=哺乳動物“無七之子”(mammalian son of sevenless);Raf=Ras活化的因子;MEK=MAP激酶激酶;MAPK=有絲分裂原活化的蛋白激酶;PI3K=磷脂酰肌醇3’激酶;PIP2=磷脂酰肌醇3,4-二磷酸;PIP3=磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸;PICγ=磷脂酶-γ;DAC=二酰基甘油;IP3=肌醇3,4,5-三磷酸;PKC=蛋白質激酶C。
圖39顯示,與靜息態CHO細胞(以CHO表示)相比,EGF-誘導的增殖(以A431表示)和靜息態A431(以A431-S表示)的P-DMR和N-DMR凈響應。
圖40顯示用不同化合物對饑餓的A431細胞層進行30分鐘的預處理對加入16nM EGF后的時間依賴性響應的作用。化合物的最終濃度為:生長激素(GH)0.5μg/ml、PD980590.1mM、PP11μM、渥曼青霉素0.1μM和發動蛋白抑制肽(DIP)50μM。
圖41顯示培養在波導生物傳感器上的饑餓A431細胞層應答16nM EGF刺激的P-DMR和N-DMR凈響應。
圖42顯示AG1478誘導的靜息態A431細胞的EGF-誘導應答的劑量依賴性 抑制。(A)不同濃度的AG1478預處理靜息態A431細胞導致32nM EGF誘導的響應出現劑量依賴性改變。(B)N-DMR信號的振幅與AG1478濃度相關。
圖43顯示Src激酶抑制劑PP1對EGF-誘導的A431細胞的DMR響應的作用。
圖44顯示Ras/MAPK途徑調節物對32nM EGF-誘導的A431細胞響應的作用。
圖45顯示蛋白激酶抑制劑對32nM EGF-誘導的A431細胞響應的作用。
圖46顯示細胞骨架調節物對32nM EGF-誘導的A431細胞響應的作用。
圖47顯示磷酸二酯酶和其它抑制劑對32nM EGF-誘導的A431細胞響應的作用。
圖48顯示使用光學生物傳感器觀察到的EGF誘導的靜息態A431細胞全部DMR信號的兩種主要作用物。細胞在室溫(22℃)條件下,EGF在A431中誘導EGFR內化、細胞形態變化和定向質量再分配。(A)用8nM四甲基若丹明標記的EGF(TMR-EGF)染色、接著用4℃酸性溶液去掉表面結合的TMR-EGF之后得到的增殖A431(10%FBS)的熒光圖象。(B)用TMR-EGF染色后的靜息態A431(0.1%FBS)的熒光圖象。(C)染色并用4℃酸性溶液除去表面結合的TMR-EGF之后的靜息態A431(0.1%FBS)的熒光圖象。(D)使用放大倍數為32倍的熒光顯微鏡檢測(固定和用得克薩斯紅標記的鬼筆環肽染色后)經16nM EGF處理指定時間的靜息態A431細胞。
圖49顯示EGF誘導的DMR信號的一種可能機制-受體內吞作用的示意圖。
圖50顯示加入皂苷之前和之后粘附在LID傳感器表面上中國倉鼠細胞(CHO)的劑量依賴性響應。
圖51顯示用不同化合物預處理、接著用皂苷處理之后CHO細胞的實時響應。
圖52顯示加入化合物之前和之后中國倉鼠卵巢(CHO)細胞的時間依賴性LID響應。
圖53顯示激動劑誘導的GPCR活化導致的物質再分布的不同動力學特征。
圖54顯示圖16所示的階段3中激動劑誘導的質量變化的化合物依賴性總響應。
圖55顯示化合物加入之前和之后中國倉鼠卵巢(CHO)細胞的時間依賴性LID響應。所有化合物的使用濃度是10μM。
圖56顯示化合物加入之前和之后過表達大鼠毒蕈堿性受體亞型1(因此將該細胞系稱為M1CHO)的經遺傳改造的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞的時間依賴 性LID響應。
圖57比較了圖16所示兩種不同細胞系的階段3的化合物依賴性同響應。
圖58顯示加入氧化震顫素M(oxotremorine M)(10μM)之前和之后兩種類型的細胞(CHO和M1CHO)的時間依賴性LID響應。加入化合物之前,用HBSS緩沖液(Invitrogen)(“無DIP”)或濃度為50μM的發動蛋白抑制肽(DIP)預先培育細胞45分鐘。
圖59顯示加入可樂定(10μM)之前和之后兩種類型的細胞(CHO和M1 CHO)的時間依賴性LID響應。加入化合物之前,用HBSS緩沖液(Invitrogen)(“無DIP”)或濃度為50μM的發動蛋白抑制肽(DIP)預先培育細胞45分鐘。
圖60顯示加入NECA(10μM)之前和之后兩種類型的細胞(CHO和M1 CHO)的時間依賴性LID響應。加入化合物之前,用HBSS緩沖液(Invitrogen)(“無DIP”)或濃度為50μM的發動蛋白抑制肽(DIP)預先培育細胞45分鐘。
圖61顯示靜息態A431細胞貼壁層內GPCR激動劑誘導的定向物質再分布。與EGF(8nM)誘導的相比,三種GPCR激動劑:緩激肽(100nM)、卡巴膽堿(10μM)和可樂定(1μM)誘導了靜息態A431細胞的時間依賴性響應。(F)10μMAG1478預處理對GPCR激動劑和EGF誘導的響應的影響。
圖62是顯示EGF誘導的EGFR活化機制和G蛋白偶聯的受體(GPCR)激動劑誘導的EFGR轉激活的一種可能機制。GPCR激動劑誘導的EGFR轉激活還可通過其它機制實現:例如蛋白激酶C途徑,或PI3K途徑。圖61所示的靜息態A431細胞的緩激肽誘導的DMR響應可通過蛋白激酶C途徑實現。
圖63顯示GPCR激動劑誘導的四類光學特征。據使用共振波導光柵生物傳感器實時監測,該光學特征與靜息態A431細胞下部的動態物質再分布相關。(a)Gq型DMR特征,以凝血酶誘導的為例(40單位/ml)。(b)Gs型DMR特征,以腎上腺素誘導的為例(25nM)。(c)Gi型DMR特征,以α-MSH(α-黑素細胞刺激激素)誘導的為例(40nM)。(d)凈-零DMR特征,以神經降壓肽誘導的為例(40nM)。實心箭頭(其余圖中亦然)表示加入激動劑溶液的時間。
圖64顯示腺苷酸環化酶活化劑毛喉素和NKH447誘導的靜息態A431細胞的光學特征。
圖65顯示用毛喉素和NKH447預處理靜息態A431細胞完全消除了25nM腎上腺素介導的DMR響應。純HBSS預處理用作陽性對照。
圖66顯示啟動Gq型特征的激動劑的有效性。分別為ATP(a、b)、SLIGLR-酰胺(c、d)、凝血酶(e、f)和SLIGKV-酰胺(g、h)作劑量依賴性動力學響應和相應的飽和曲線。最終的濃度顯示在圖中。
圖67顯示啟動Gs型信號的激動劑的有效性。分別為腎上腺素(a、b)、腺苷胺類(adenosine amine cogener)(c、d)、和NECA(e、f)作劑量依賴性動力學響應和相應的飽和曲線。
圖68顯示α-MSH(α-黑素細胞刺激激素)誘導的靜息態A431細胞的劑量依賴性動力學響應和飽和曲線。
圖69顯示低劑量(a)到高劑量(b)的LPA(油酰基-L-α-溶血磷脂酸)誘導的光學特征的轉變。
圖70顯示低劑量(a)到高劑量(b)的HTMT誘導的光學特征的轉變。將P-DMR的總振幅繪制成HTMT濃度(c)的函數,從而展示該轉變。
圖71顯示胞內Ca2+水平的最大百分比增加,繪制成PAR激動劑的函數,該百分比增加根據采用Fluo-3測定的Ca2+的熒光強度測得。
圖72顯示細胞骨架調節物對100nM胰蛋白酶(a)和40單位/ml的凝血酶(b)介導的DMR信號的作用。用于預處理細胞的這些調節物包括紅海海綿素A(latrunculin A)、松胞菌素B、鬼筆環肽和諾考達唑(nocodazole),各自濃度為10mM。僅用載體(即HBSS)預處理的細胞用作對照。
圖73顯示激酶抑制劑對200nm胰蛋白酶(a)和40單位/ml的凝血酶(b)介導的DMR信號的作用。激酶抑制劑是GF109203x(10mM)和KN-62(10mM)。
圖74顯示YFFLNRP對凝血酶(40單位/ml)、SFFLR-酰胺(20mM)和SLIGKV-酰胺(20mM)介導的DMR響應的作用,體現為P-DMR振幅,繪制成YFFLNRP濃度的函數。
圖75顯示PAR介導的Ca2+信號傳遞的交叉去敏作用。胰蛋白酶在先處理后,用凝血酶(a)、SFFLR-酰胺(b)、SLIGKV-酰胺(c)和緩激肽(d)刺激A431細胞。另一方面,在用胰蛋白酶刺激前,先用凝血酶(e)、SFFLR-酰胺(f)、SLIGKV-酰胺(g)和緩激肽(h)預先刺激A431細胞。凝血酶、胰蛋白酶、SFFLR-酰胺、SLIGKV-酰胺和緩激肽的最終濃度分別為40單位/ml、200nM、20mM、20mM、和100nM。兩次刺激之間的時間間隔大約是6分鐘。實心箭頭表示加入溶液的時間(其它圖中也指同樣的意思)。
圖76顯示PAR介導的動態物質再分布信號的交叉去敏作用。胰蛋白酶在 先處理后,用凝血酶(a)、SFFLR-酰胺(b)、SLIGKV-酰胺(c)和緩激肽(d)刺激A431細胞。另一方面,在用胰蛋白酶刺激前,先用凝血酶(e)、SFFLR-酰胺(f)、SLIGKV-酰胺(g)和緩激肽(h)預先刺激A431細胞。凝血酶、胰蛋白酶、SFFLR-酰胺、SLIGKV-酰胺和緩激肽的最終濃度分別為40單位/ml、200nM、20mM、20mM、和100nM。兩次刺激之間的時間間隔大約是1小時。
圖77顯示mβCD導致的膽固醇流失對40單位/ml凝血酶(a)和200nM胰蛋白酶(b)介導的P-和N-DMR信號的振幅的作用。為了比較,圖中也包括αCD(α-環糊精)的作用。
圖78顯示PAR信號傳遞的功能性恢復。在用mβCD除去細胞表面的膽固醇,并將細胞洗滌后,在各指定時間分別將凝血酶溶液加到孔中。實時記錄DMR信號。各圖是7次獨立響應的平均值。
圖79顯示EGF在先刺激對PAR信號傳遞的影響。(a)胰蛋白酶介導的Ca2+活化。(b)胰蛋白酶介導的DMR信號。(c)胰蛋白酶介導的DMR響應。最終的濃度是100nM EGF、100nM胰蛋白酶、和40單位/ml凝血酶。還包括僅用HBSS預處理的細胞響應,作為對照。
圖80顯示作為時間的函數的應答1mM過氧化氫的靜息態A431細胞的多個參數。(A)入射角的移動;(B)歸一化PWHM;(C)歸一化峰值強度;(D)歸一化峰面積。箭頭指加入溶液時的時間。
圖81顯示加入過氧化氫之前和之后粘附在LID傳感器表面上的靜息態A431細胞的劑量依賴性響應。
圖82顯示src抑制劑對1mM H202介導的靜息態A431細胞的DMR信號的影響。
圖83顯示靜息態細胞的不同氧化還原態對4mM H202介導的DMR響應的影響。
圖84顯示靜息態A431細胞對EGF刺激的響應。(A)作為時間的函數的入射角的動態移動。(B)作為時間函數的歸一化PWHM。(C)未用TR-鬼筆環肽處理的A431的肌動蛋白絲的染色模式。(D)用16nM EGF處理15分鐘、接著用得克薩斯紅-鬼筆環肽(phalloid)染色的A431的肌動蛋白絲的染色模式。標桿表示40mM。
圖85顯示由緩激肽通過緩激肽B2受體信號傳遞介導的靜息態A431細胞 的光學特征:TM0模式的共振峰的PWHM(A)和強度(B)。箭頭指示加入緩激肽溶液時的時間。
圖86顯示作為化合物的函數的檢測過程中兩個時間點之間的波長改變。這兩個時間點是恰在加入化合物之前(基線點)和加入化合物后5分鐘(測量點)。兩個終點之間的不同反映了緩激肽——一種緩激肽B2受體激動劑介導的P-DMR事件的總振幅。B2受體在A431細胞中內源表達。緩激肽刺激前細胞已轉為靜息態。此實施例使用384孔Coring Epic生物傳感器平板。各孔含有覆蓋率為~90%的A431細胞。半數孔用100nM的緩激肽處理,而另外半數孔僅用緩沖液HBSS處理。
圖87顯示作為化合物的函數的檢測過程中兩個時間點之間的波長改變。這兩個時間點是恰在加入化合物之前(基線點)和加入化合物后5分鐘(測量點)。兩個終點之間的不同反映了凝血酶——一種PAR1受體激動劑介導的P-DMR事件的總振幅。PAR1受體在CHO細胞中內源表達。凝血酶刺激前在DMEM培養基中培育細胞4小時,這些細胞部分靜息態。此實施例使用384孔Coring Epic生物傳感器平板。各孔含有覆蓋率為~90%的CHO細胞。半數孔用40單位/ml的凝血酶處理,而另外半數孔僅用緩沖液HBSS處理。
圖88顯示作為凝血酶濃度的函數的檢測過程中兩個時間點之間的波長改變。這兩個時間點是恰在加入化合物之前(基線點)和加入化合物后5分鐘(測量點)。用不同劑量的凝血酶處理CHO細胞。
V.具體實施方式
在公開和描述本發明的化合物、組合物、制品、設備和/或方法之前,應理解它們并不限于具體的方法或具體的生物技術方法,除非另有說明,或者它們也不限于具體的試劑(除非另有說明),因此,它們當然是可以變化的。還應理解本文所用的術語是僅僅是為了描述具體實施例的目的,而不是為了限定。
I.定義
在本說明書和附帶權利要求書中,單數形式“一”、“一種”和“該”包括復數形式,除非相關的內容已明確指出不包括。因此,例如,“一種標記物或刺激事件”包括兩種或多種這樣的標記物或刺激事件等。
在本文中,范圍可以表示為“約”一個特定值和/或“約”一個特定值到“約”另一個特定值。當表示這樣一個范圍時,另一實施例包括從一個特定值起算和/或到另一個特定值。類似地,當以近似值表示數值時,通過使用先行詞“約”,將應理解該特定數值構成了另一實施方式。還應理解的是,各范圍的端點都與另一端點有明顯關聯,且不取決于另一端點。還應理解的是,本文公開了大量的數值,各數值在本文中包括該數值本身以及用“約”限定該具體數值的形式。例如,如果公開了數值“10”,那么“約10”也被公開。還應理解的是,當一數值公開為“低于或等于”該數值,則“大于或等于該數值”或這些數值之間的可能范圍也被公開,如本領域技術人員所能適當理解的那樣。例如,如果數值“10”公開了,那么“低于或等于10”以及“大于或等于10”也被公開。還應理解的是,在整篇申請中,數據以不同的形式提供,這些數據代表了終點和起始點,以及這些數據點的任何組合的范圍。例如,如果公開了具體的數據點“10”和“15”,那么應理解大于、大于等于、小于、小于等于以及等于10和15以及10和15之間的數值也應當認為已被公開。還應理解的是,范圍之內的任何數值以及形成該范圍的數值也公開,例如,對于10到15的范圍,則認為10、11、12、13、14和15都已被公開。
“任選的”或“任選地”指接下來描述的事件或情況可能或可能不發生,說明書包括所述事件或情況發生的例子以及所述事件或情況不發生的例子。
“粘附(adhere)”和“粘附的”或者這兩個詞的其它形式指兩個物品相互接觸,在它們之間相互具有親和力,例如粘貼。基底上的細胞貼壁層指一層細胞,該細胞層例如粘附到該表面上,這樣當用緩沖液輕柔洗滌該細胞時,細胞不會變成不粘附。應理解接觸(contact)或此詞的其它形式指兩種或多種物品相互接近,以致被視為相互觸碰。接觸通常不要求粘貼。例如,在沒有粘附的情況下也可發生接觸。連接(attach)或此詞的其它形式指兩種或多種物品之間的一種比粘附更持久的狀態。它并非必須是例如共價連接,但可以是共價連接。因此,根據兩種或多種物品之間的結合的所需強度,接觸低于粘附,而粘附低于連接。應理解這些詞具有不同的含義,但除非有明確的相反說明或本領域技術人員能清楚理解其相反含義,否則這些詞語可在本說明書中在它們所出現的地方交替使用。例如,如果一句子包括“細胞粘附到生物傳感器”,應理解“細胞接觸到傳感器”和“細胞連接到傳感器”也被公開。還應理解存在多種粘附的、接觸的或理解的物品,如細胞或蛋白。
“振幅”可指特定響應的量或大小。例如,生物傳感器的輸出數據可產生具有特定振幅如強度的共振峰。
“生物學擴散限制的”指被溶液中分子擴散,和/或分子滲透或被攝取到細胞中并在到達靶標前在細胞內接著擴散限制的過程。例如,當含有化合物或刺激物的溶液被加到預先存在的用于覆蓋粘附在生物傳感器表面上的細胞的培養基中時,該化合物或刺激分子不得不擴散到所產生的混合物(該培養基和溶液)中,并花費一段時間到達該細胞。之后,根據該化合物或刺激物將與之相互作用的靶標,該化合物或刺激分子可能不得不花費額外的時間來達到該靶標,這取決于分子滲入細胞或被細胞所攝取。
“整體系數(bulk index)”指溶液或培養基的絕對折射率,由該溶液或培養基的組成決定。“整體系數變化”指當兩種混合物混合在一起、或者一種溶液加到一種培養基或另一種溶液中并與之混合時該混合溶液的折射系數(折射率)所產生的變化。
“導向模式”或“耦合模式”指光耦合進入波導基片的特定模式。在平面波導中存在兩種基本類型的導波(或模式):TEm(橫向電場或s-極化)和TMm(橫向磁場或p-極化),其中m=0、1、2……,它是模式編號。由于光學波導光柵(OWG)生物傳感器是一種攸逝波傳感器,并且是基于用衍射光柵將光共振耦合到波導中。兩種基本模式可能有不同數量的模式,例如TM0、TM1、TM2……和TE0、TE1、TE2……。可耦合到波導基片的具體模式依賴于波導的結構和給定模式的有效折射率,這取決于該模式的攸逝尾隨脈沖(evanescent tail)之中的細胞材料和整體溶液的折射率來測定。
“劑量依賴性響應”通常指隨著刺激時間如化合物的加入的變化而變化的生物傳感器輸出或生物傳感器參數的響應。
“入射耦合光”指用來照射生物傳感器從而被耦合到波導膜中的某個帶寬的光。
“無標記生物傳感器”:所公開的組合物、方法和技術的許多方面都涉及到無標記生物傳感器的使用。在本文中,無標記生物傳感器指在不需要標記物如熒光分子的情況下可檢測和/或產生產生自細胞內的事件或變化(如物質再分布)的信號的任何傳感器。無標記生物傳感器通常包括將細胞中的事件轉換成可定量的信號的光學傳感器。這些信號產生可通過多種途徑實現。例如,直接表面傳感法包括表面等離子體振子共振(SPR)(Jordan&Corn,“吸附到 化學修飾的金表面上的靜電生物聚合物的表面等離子體振子共振圖像測量”(Surface Plasmon Resonance Imaging Measurements of Electrostatic Biopolymer Adsorption onto Chemically Modified Gold Surfaces),Anal.Chem.,1997,69:1449-1456)、光柵耦合器(Morhard等,“在微模式中固定抗體以通過光衍射進行細胞檢測”(Immobilization of Antibodies in Micropatterns for Cell Detection by Optical Diffraction),Sensors and Actuators B,2000,70,232-242)、橢圓光度法(Jin等,“基于圖像橢圓光度法以使生物分子相互作用可視化的生物傳感器概念”(A Biosensor Concept Based on Imaging Ellipsometry for Visualization of Biomolecular Interactions),Analytical Biochemistry,1995,232,69-72)、攸逝波設備(Huber等,“直接光學免疫傳感(敏感性和選擇性”(Direct Optical Immunosensing(Sensitivity and Selectivity)),Sensors and Actuators B,1992,6,122-126)、和反射測定法(Brecht&Gauglitz,“光學探針和傳感器”(Optical Probes and Transducers),Biosensors and Bioelectronics,1995,10,923-936)。通常用于訊問SPR或波導光柵傳感器的儀器使用具有適當光譜或角度內容(angular content)的光束,這樣,當該光束被傳感表面反射時,共振角度或波長響應成為輸出響應的主要內容。
許多無標記生物傳感器是已知的,在本文其它地方描述了它們的例子。無標記生物傳感器的例子包括非接觸型生物傳感器、不依賴標記的檢測性生物傳感器、無標記光學生物傳感器、光學非接觸型生物傳感器、基于光學的生物傳感器、光學生物傳感器、不依賴標記的光學檢測性生物傳感器、基于波導光柵的生物傳感器、光學波導光模式(lightmode)光譜學生物傳感器、攸逝波設備。本文描述并涉及到各種無標記生物傳感器及其應用。在涉及具體無標記生物傳感器的內容中描述了無標記生物傳感器的一些具體使用方法和模式,以提供無標記生物傳感器及其應用的一些具體實施例。為了避免不必要的重復,涉及每種類型的無標記生物傳感器時不重復提及這些描述。但是,應理解,當在特定的方法或模式中使用特定的生物傳感器時,該使用表示任意無標記生物傳感器都可用于這些方法或模式,除非該使用的相關內容或性質排除了一種或多種類型的無標記生物傳感器。本文所述的任意和所有生物傳感器在任意和所有方法或模式中的這些用途(除非該用途的內容或性質排除了一種或多種類型的無標記生物傳感器)都應視為是具體考慮和已被具體公開。因此,例如,如果 記載了使用特定光柵耦合器生物傳感器分析細胞中EGF誘導的EGFR信號傳遞,那么應視為也公開了使用任何其它合適的無標記生物傳感器分析細胞中的EGF誘導的EGFR信號傳遞。因此,例如,使用基于表面等離子體振子共振的生物傳感器分析細胞中的EGF誘導的EGFR信號發出也應當視為已被公開。
“時間依賴性響應”通常是隨著時間而變化的生物傳感器輸出或生物傳感器參數的響應。
“饑餓培養基”指減弱細胞培養物的繁殖能力的任何培養基。當使用饑餓培養基培育或培養細胞時,所產生的細胞是靜息態的。
本申請參考了各種出版物。這些出版物的公開內容全文納入本申請作為參考,以更全面地描述本申請所述領域的技術水平。所公開的參考資料也被單獨或獨自納入本文,包括這些參考資料中包含的該資料所依賴的句子中所討論的材料。
II.組合物和方法
所公開的組合物、方法和技術涉及無標記光學生物傳感器領域,包括用于基于細胞的檢測和技術的波導光柵基生物傳感器。總的來說,這些方法和系統可涉及直接的光學傳感器領域,具體而言,涉及使用不依賴標記的光學檢測(LID)生物傳感器(如波導光柵基生物傳感器)的系統和方法,用于例如實時監控活細胞中化合物誘導的物質再分布,包括G蛋白偶聯受體(GPCR)激動機制和拮抗機制、表皮生長因子受體活性、細胞骨架重構、細胞死亡和細胞增殖,以及細胞信號傳遞、失敏,和活細胞內的移位,以及貼壁細胞的形態學變化、細胞脫粘附(deadhension)、細胞移動,和在生物傳感器上培養的細胞。直接光學傳感器(DOS)技術指利用光學轉換器將分子識別或細胞活動轉換成可定量的信號而不需激活熒光或發光標記物的技術。依賴于這些標記的激活和然后發射或發光的技術被稱為間接光學技術,在所公開的方法的某些實施方式中也可采用這些技術。還公開的是篩選作用于細胞(如抗細胞上的受體,如GPCR或EGFR或PDGFR或細胞因子受體)的化合物的活性的方法。
公開了利用無標記生物傳感器(如波導光柵基生物傳感器)監控和測量定向物質再分布(DMR)的組合物和方法,該組合物和方法可將此DMR與特定的細胞狀態或細胞時間或細胞活性相關聯。應理解,所公開的“細胞-生物傳感器”和“細胞-生物傳感器-制劑”可以是本文所公開的任意組合物的組合。例 如,在此公開了一種含有A431細胞、生物傳感器和EGF的細胞-生物傳感器-制劑組合。
例如,在某些公開的檢測中,可使用無標記的光學生物傳感器來檢測化合物或化合物或組合物對細胞的毒性或增殖影響,測量例如細胞表面受體(例如受體酪氨酸激酶(RTK),如表皮生長因子受體(EGFR)或血小板衍生的生長因子受體(PDGF)、或G蛋白偶聯的受體(GPCR))介導的或通過內部信號傳遞(如各種信號傳遞途徑或細胞骨架重構)介導的細胞信號轉導事件的發生。本文公開的無標記生物傳感器可用于檢測刺激介導的蛋白質靶標移位或底物聚集,例如向細胞核中,或到膜中,或到細胞質中,或到其它細胞器(如內含體、內質網(ER)或高爾基體或核),或在各種再循環途徑中,或從胞外被攝取(如配體結合、基因轉染或蛋白質轉導、吞噬、內吞等)的移位或聚集。在其它實施例中,無標記生物傳感器可用于監控不同功能性區室中和/或特定微環境中應答刺激時特定靶標或靶標復合物的再分布,或用于測量特定靶標的從頭合成,或用于檢測刺激介導的特定區室或位置的物質釋放(如由于激動劑誘導的Gq偶聯受體或Ca離子載體導致的Ca動員)。就此而言,靶標指將被追蹤或作為檢測的一部分的分子或細胞組分。在其它實施例中,無標記光學生物傳感器可用于監控靶標分子或靶標復合物(如細菌、病毒、噬菌體、脂質顆粒或外體顆粒等等)從一個細胞轉運到另一個細胞(如通過間隙連接或離子通道),或通過例如已知稱為胞吞的過程或控制釋放過程如凋亡或通過細胞表面膜上的人造孔的擴散而從周圍環境中轉運出或轉運到該周圍環境。某些實施方式中,采用和鑒定數據收集過程中某時間點,由此可通過收集例如僅僅一個、兩個或三個分開的時間點的數據來完成測定,這些時間點的數據反應預測監控過程中發生的可能是例如刺激引起的某類細胞事件,這樣,可將這些組合物和方法適用于高通量方法。
在某些實施例中,所公開的組合物、方法和技術涉及基于波導光柵的生物傳感器用于監控作用于生物傳感器上貼壁活細胞的化合物的吸附、分布和/或毒性的的用途及使用方法。
在某些實施例中,所公開的組合物、方法和技術涉及使用給定導向模式的光學波導光模式光譜學(OWLS)或共振峰譜、或共振帶成像與角度的或波長訊問相組合的篩選細胞增殖的抑制劑或活化劑的方法。這種方法可用于高通量篩選。
在某些實施例中,所公開的組合物、方法和技術涉及使用給定模式的光學波導光模式光譜學(OWLS)或共振峰光譜學或的給定模式的共振帶成像繼續高通量篩選化合物毒性的方法,以及涉及本文所述的其它方法。
所公開的組合物、方法和技術可使用基于光學的生物傳感器來監控作用于生物傳感器上貼壁活細胞的化合物的吸附、分布和/或毒性。在另一實施例中,所公開的組合物、方法和技術提供了篩選或監控作用于粘附在光學傳感器上多個可空間尋址區域之上或單個孔中的多個生物傳感器之上的多種類型的細胞的化合物的吸附、分布和/或毒性的方法。
所公開的組合物、方法和技術公開了一種實時的和無標記的檢測,用于化合物吸附、分布和/或毒性篩選和表征。這些方法可用于多種不同檢測(如ADME/Tox、功能性檢測)中,且實際上可將多種不同的檢測整合成一個檢測模式。
在某些實施例中,所公開的組合物、方法和技術提供了無標記的測量,這種測量適用于高通量篩選化合物對細胞增殖的作用。在某些實施例中,所公開的組合物、方法和技術利用給定模式的光學波導光模式光譜學(OWLS)或共振峰光譜學或給定模式的共振帶成像而不是單獨使用波長或角度改變來高通量地篩選細胞增殖的抑制劑或活化劑。這種方法利用了一給定傳感器的入射耦合峰的半最大值峰寬(PWHM)依賴于細胞密度的關系。在所公開的組合物、方法和技術的某些實施方式中,微板內所有傳感器的入射耦合共振帶的圖像可在同一時間采集,并作為高通量手段用于根據它們對細胞增殖的作用而篩選化合物。
公開了使用光學生物傳感器篩選細胞信號發出途徑的調節物的方法。這些方法可用于細胞表面(例如RTK或GPCR)以及用于細胞內發生的信號發出事件。
公開了使用光學生物傳感器篩選細胞骨架組分的調節物的方法。這些方法以測量細胞骨架組分的調節物誘導的大分子從透化細胞中釋放為基礎。具體而言,這些方法利用特定的化學物質或生物物質(如皂苷、鏈球菌溶血素O等)使活細胞的質膜具有足夠孔隙,從而使細胞內的可溶性蛋白質散逸。用破壞細胞骨架的調節物處理細胞導致生物分子進一步釋放,其中包括隨后被細胞骨架封鎖蛋白質和RNA,結果導致可由光學生物傳感器檢測到的物質流失。
提供了光學生物傳感器以及怎樣以不同的配置和組合使用它們的討論,所述光學生物傳感器如無標記光學生物傳感器,如光學波導光模式光譜學和波導 光柵及生物傳感器。接著討論了物質再分布和這種物質再分布是如何與光學生物傳感器相關。還提供了關于可使用本文所述的光學生物傳感器進行示例性細胞檢測的討論,以及這些檢測的增加和修改,如首先使用無標記光學生物傳感器進行檢測,但接著將特定類型的標記物偶聯到檢測中的一種或多種試劑,之后可將該試劑用于第二個或另外的檢測。
公開了可用于進行可進行化合物篩選和表征的無標記功能性細胞檢測(如基于GPCR的細胞檢測)的方法。所公開的方法允許技術人員在不需要遺傳工程加工細胞以使其過表達感興趣的受體的情況下研究活細胞內的內源性GPCR,雖然在某些實施方式中優選使用過表達感興趣GPCR的細胞以獲得高敏感性和最佳的檢測結果。
所公開的方法能夠使用單個傳感器或多個傳感器實施多個基于細胞的檢測,以比較化合物對源自不同親代細胞或相同親代細胞的至少兩種不同類型的細胞(即給定的特定類型的細胞)的功能。這些方法的優點包括提高了通量。
公開了可使用單個傳感器或多個傳感器實施多個檢測的方法,以證實在特定細胞靶標參與了所測量的刺激引起的信號傳遞或細胞事件。這些方法可使用具有至少兩個不同區域的單個傳感器:一個沒有修飾,而另一個具有修飾;或者可使用在相同區室或分開的區室中的至少兩個傳感器:一個沒有修飾,而另一個具有修飾。傳感器的修飾區域例如可具有印刷或沉積的點,該點含有試劑/基因或干擾RMA(RNAi)或反義寡核苷酸或反義/反基因肽核酸(PNA)或蛋白質或抗體,這樣當細胞在這些區域上培養并覆蓋這些區域時,粘附的細胞或攝取這些試劑/物質,并被轉染。這些方法被稱為定位表面介導的轉染。一旦被這些物質轉染,細胞中的特定靶標就會通過表面介導的基因轉染或蛋白質送遞過表達,或通過反義/反基因抑制或RNA干擾或剔除或抗體阻斷而被下調。本文至少將US2004/0023391A1和US6,544,790中細胞送遞方法中所涉及的物質納入本文作為參考。定位表面介導的轉染使得可檢測具有或不具有特定靶標的特定類型細胞的刺激誘導的響應。定位表面介導的轉染可視為是一種刺激事件。因此,本方法可用于證實特定細胞靶標是否參與到使用無標記光學生物傳感器測量的信號或細胞事件中。可采用現有技術的方法將物質沉積或印刷到傳感器表面上,這些現有技術方法包括但不限于接觸型印刷,如針式印刷技術(US5807522A或US6101946A)或微印記方法(美國專利5,731,152)、毛細分配設備(美國專利5,807,522)和微滴定設備(美國專利5,601,980),或 非接觸型印刷,如壓電驅動的印刷或微米/納米分配設備(US6656432B1、EP0895082B1或US6399396B1)。
公開了利用多個穿透深度實施基于無標記生物傳感器的細胞檢測的方法。此外,公開了可讓技術人員以單一或多項檢測模式進行這些檢測的設備。
根據OWLS,TM模式的PWHM變化要比TE模式的PWHM變化對表面不均勻性更敏感。當細胞開始在表面上普展時,PWHM增加,在約50%細胞覆蓋率時達到最大值,之后衰減到最初水平。
如本文所公開的,已顯示可實時監控化合物對接近細胞-傳感器界面的高度鋪滿的細胞層的吸附、分布和毒性,如使用光學生物傳感器測量得到的化合物毒性誘導的波長或角度改變所證明。
公開了研究用光學生物傳感器測量的反應性氧物質(ROS)的細胞功能的方法。此外,公開了評估培養的細胞的氧化還原狀態的方法,以及篩選影響培養的細胞的氧化還原狀態以及ROS信號傳遞的調節物的方法。反應性氧物質是諸如過氧化物之類的分子、諸如次氯酸鹽離子之類的離子、諸如羥基之類的基團,以及同時是離子和基團的過氧化物陰離子。具有氧化其它物質的能力的物質被認為是氧化性的,稱為氧化劑。氧化劑通常是具有高氧化數元素的化學物質(如H2O2、MnO4-、CrO3、Cr2O72-、OsO4),或者是可通過氧化物質而獲得一個或兩個額外電子的高負電性物質(O2,O3,F2,Cl2,Br2)。反應性氧物質通過幾種不同的機制形成:(1)離子化輻射與生物分子的相互作用;(2)作為細胞呼吸的不可避免的副產物(如一些電子通過呼吸鏈從主通道中逃逸(尤其在它們通過輔酶Q時)而直接將氧分子還原成過氧化物陰離子);(3)在噬菌細胞如嗜中性粒細胞和巨噬細胞(如NADPH氧化酶(在兩種類型的噬菌細胞中);或髓過氧物酶(僅在嗜中性粒細胞中))中由指定的酶合成。ROS是必需的,但重要的是限制ROS生產不能過度,因為ROS在細胞中執行重要的功能。例如:(1)甲狀腺細胞必須生產過氧化氫,以在甲狀腺素的合成中將碘原子連接到甲狀腺球蛋白上。(2)巨噬細胞和嗜中性粒細胞必須產生ROS,以殺死它們通過噬菌作用吞噬的一些類型的細菌。(3)嗜中性粒細胞(而不是巨噬細胞)也通過使用髓過氧物酶而將吞噬的致病原殺死,該酶催化過氧化氫(產生自過氧化物陰離子)與氯離子的反應,產生強的殺菌劑次氯酸鹽離子。(4)許多生物能量通過氧化還原反應被保存和釋放。光合成涉及二氧化碳還原成糖,和水氧化成分子氧。逆反應,即呼吸,則將糖氧化,產生二氧化碳和水。作為一 些中間步驟,還原的碳化合物被用來還原煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+),后者則對質子梯度的產生有貢獻,該質子梯度驅動了三磷酸腺苷(ATP)的合成,并通過氧的還原得以維持。在動物細胞中,線粒體執行類似的功能。術語氧化還原態通常用于描述生物系統如細胞或器官中NAD+/NADH和NADP+/NADPH的平衡。氧化還原態表現為幾組代謝物(如乳酸和丙酮酸、β-羥基丁酸和乙酰乙酸)的平衡,這些代謝物的相互轉換依賴于這些比例。多種有害的情形下會產生異常的氧化還原態,如缺氧、休克和膿毒癥。應理解,此段落所討論的所有分子、化合物和組合物的流動和作用都可用本文所述的方法鑒定,或將它們用于本文所公開的方法中。
公開了檢測靶標家族成員(如CPGR、RTK和其它)之間以及不同靶標類別之間(如CPGR和RTP之間)的交叉通話(cross communication)的方法。細胞相互之間需要溝通,而不管它們離得近還是遠。胞外信號傳遞分子調控細胞之間的相互作用。基本的機制需要一個配體(信號傳遞分子)與其受體相互作用,從而將胞外信號轉化成胞內信號。此過程被稱為信號轉導,可以幾種形式出現。首先,如果信號需要傳遍整個生物體,則信號傳遞分子被分泌到血液中。例如,內分泌信號傳遞要求細胞合成和分泌激素到循環系統中。然后,該激素被質膜上或胞質內的特定靶細胞蛋白(受體)識別。其次,在其它情形中,信號需要在局部發揮作用。例如,旁分泌信號發出分子(局部介體)可由相鄰的細胞釋放,通過ECM局部擴散,然后刺激鄰近的靶細胞。例如,生長和分化因子被認為主要作為旁分泌信號分子起作用。溝通的第三種形式是神經信號發出。這種類型的信號傳導可長距離發生,但其傳遞是通過稱為軸突的長細胞過程實現。神經元信號可作用于靶細胞或其它神經元細胞。信號通過軸突如電脈沖一樣傳遞,到達軸突末端后,它被轉換成稱為神經遞質的化學信號。第四類信號轉導是所有信號轉導中距離最短的。它通常不需要釋放分泌的分子。例如,接觸依賴性信號傳遞要求在錨定于信號傳遞細胞的質膜上的信號傳遞分子與嵌埋于靶細胞的質膜內的受體分子結合時完成轉導。接觸依賴性信號發出還可以以細胞與胞外基質相互作用的形式發生。由于其特化的功能以及其有限的受體,各細胞能夠對有限的一組信號作出應答。此外,各細胞對信號分子可作出不同的應答。在這種情況下,例如,神經遞質乙酰膽堿可刺激一種類型的肌肉細胞收縮(骨骼)或抑制另一類型的細胞的收縮(心臟)。乙酰膽堿還可刺激某些細胞分泌它們分泌小泡的內容物。或者,類似的受體可激活不同的胞內信 號傳遞途徑,或著,配體結合不同的受體。在一線性模型中可以看到信號傳遞途徑是這樣的:信息的主流連續地從受體通過中間步驟的線性鏈到達特定的功能細胞。但是,由于細胞生物學很復雜,信號傳遞不是線性的信息流,取而代之的是,由刺激介導的信號傳遞由大量的指令構成,這些指令由涉及擴散步驟的反饋(可擴散反饋系統)相連接,或與信號發出蛋白和/或支架蛋白的復合物物理連接。例如,可在正反饋環和負反饋環中看到可擴散反饋指令,鈣和肌醇三磷酸受體籍此調節胞質鈣濃度。這些正反饋環和負反饋環在信號傳遞的交叉溝通中起重要作用。例如,已證明許多促有絲分裂GPCR的信號傳遞以負反饋途徑或正反饋途徑與EGFR信號發出交叉溝通。這些GPCR的活化也導致相同細胞中EGFR通過蛋白激酶C或作為銜接蛋白質的β-抑制蛋白而活化。
公開了基于至少兩個終點測量值高通量篩選抗特定靶標或一類靶標的調節物的方法。
a)OWLS在監測細胞死亡中的應用
本發明組合物、方法和技術公開使用給定模式的光學波導光模式光譜學或共振峰譜或共振帶成像來高通量篩選化合物毒性。公開了適用于使用基于光學的生物傳感器高通量篩選化合物毒性的測量方法。可使用所公開的方法、組合物和技術來監測細胞或細胞群的健康狀況。術語“健康狀況”指細胞生存能力和細胞功能方面的總體狀態。當其健康狀態受損時,細胞有多種表現行使:如細胞分裂下降,細胞功能如蛋白質或mRNA生產下降,細胞信號傳遞下降,和/或例如與細胞死亡相關的蛋白質增加。以往,采用檢測細胞膜完整性,或特定靶蛋白(如線粒體脫氫酶)的功能,或特定基因產物的合成,或DNA或RNA中標記核苷酸的摻入,或細胞核中染色體完整性的熒光染色方法或其它方法來評估細胞健康。在某些實施方式中,這些方法利用了給定傳感器的入射耦合峰的半最大值寬度(PWHM)依賴于細胞密度、細胞死亡情況和由于化合物毒性而被改變的細胞層不均勻性的關系。化合物毒性導致在波導膜表面上形成三種細胞種群,分別是活的、受影響的和死亡細胞。所產生的表面不均勻性增加導致共振峰變寬,甚至分裂。共振峰變寬和分裂可作為化合物毒性的特征。可在細胞接觸化合物后的某個時間收集共振峰譜或整個傳感器共振圖形,并進行分析。
所公開的組合物、方法和技術提供了監測作用于培養于光學傳感器上的細胞層的化合物的吸收、分布和毒性的方法。這些方法可涉及使用光學生物傳感 器實時測量細胞層在應答給予細胞或與細胞一起培養的化合物時由于物質再分布而發生的角度或波長改變。這些方法可用于研究細胞毒性和凋亡的動力學和機制。還公開了高通量方法。
2.監測細胞死亡的高通量方法
在某些實施方式中,這些方法利用可同時監測多個波導光柵生物傳感器,和/或可獲得多個生物傳感器的給定導向模式的共振峰譜,和/或可展示多個生物傳感器的給定導向模式的共振帶圖像的光學訊問系統。例如,對于光學角度訊問系統,可參見2003年6月24日提交的美國專利申請號10/602,304(2004年12月30日公開,公開號為US-2004-0263841)、2004年12月21日提交的美國專利申請11/019,439和N.Fontaine等的美國專利申請“光學訊問系統和2-D傳感器陣列方法”(OPTICAL INTERROGATION SYSTEM AND METHOD FOR2-D SENSOR ARRAYS)(2005年4月5日提交),所有這些文獻的全文(至少關于生物傳感器及其用途方面的內容)被納入本文作為參考。
美國專利申請號10/602,304(公開號US-2004-0263841)、2004年12月21日提交的美國專利申請11/019,439和N.Fontaine等的美國專利申請“光學訊問系統和2-D傳感器陣列方法”(2005年4月5日提交)提供了一發射系統和一接收系統,該發射系統用于產生一陣列的光束,各光束以~200μm×3000μm的照射面積照射RWG傳感器,該接收系統用于接收由這些傳感器反射的光束的角度顯示的所有響應。此系統允許例如7×7孔傳感器以3秒的速率同時采樣(圖1顯示了一個例子)。這意味著96孔微板中96份樣品的細胞健康評估可在幾秒內完成。2004年11月18日N.Fontaine等提交的美國申請10/993,565和Y.Fang等于2005年4月5日提交的“消除位于微板中的波導光柵基生物傳感器和所得的微板之間的色亮度干擾的方法”(METHOD FOR ELIMINATING CROSSTALK BETWEEN WAVEGUIDE GRATING-BASED BIOSENSORS LOCATED IN A MICROPLATE AND THE RESULTING MICROPLATE)(兩者的全文(至少涉及生物傳感器、掃描設備以及微板的內容)納入本文作為參考)的另一示例性系統使用陣列式光纖來產生陣列式光,這樣各束光照射一個生物傳感器,并從接收來自該生物傳感器的響應;且該系統使用受控掃描模塊依次收集來自單個傳感器內多個區域以及來自多個生物傳感器的響應。該系統可在約30秒內完成細胞健康狀態評估。
3.基于光學的生物傳感器
基于光學的生物傳感器已被用來檢測各種生物分子之間的相互作用,包括寡核苷酸、抗體-抗原相互作用、激素-受體相互作用、和酶-底物相互作用。描述使用光學無標記技術進行基于細胞的檢測的報告相對較少。例如,已使用光學波導光柵基生物傳感器來研究動物細胞的粘附可擴展(J.J.Ramsden,等,“動物細胞的粘附和擴展動力學”(Kinetics of Adhesion and Spreading of Animal Cells),Biotechnol.Bioeng.1994,43,939-945);和已使用表面等離子體振子共振(SPR)來研究配體誘導的活細胞的胞內反應(M.Hide,等,“使用表面等離子體振子共振基生物傳感器實時分析活肥大細胞的配體誘導的細胞表面和胞內反應”(Real-time Analysis of Ligand-Induced Cell Surface and Intracellular Reactions of Living Mast Cells Using a Surface Plasmon Resonance-Based Biosensor),Anal.Biochem.2002,302,28-37)。
基于光學的生物傳感器通常由兩個組件構成:高度特異的識別元件和將分子識別事件轉換成可定量的信號的光學轉換器。直接表面傳感法包括表面等離子體振子共振(SPR)(Jordan&Corn,“吸附到化學修飾的金表面上的靜電生物聚合物的表面等離子體振子共振圖像測量”(Surface Plasmon Resonance Imaging Measurements of Electrostatic Biopolymer Adsorption onto Chemically Modified Gold Surfaces),Anal.Chem.,1997,69:1449-1456)、光柵耦合器(Morhard等,“在微模式中固定抗體以通過光衍射進行細胞檢測”(Immobilization of Antibodies in Micropatterns for Cell Detection by Optical Diffraction),Sensors and Actuators B,2000,70,232-242)、橢圓光度法(Jin等,“基于圖像橢圓光度法以使生物分子相互作用可視化的生物傳感器概念”(A Biosensor Concept Based on Imaging Ellipsometry for Visualization of Biomolecular Interactions),Analytical Biochemistry,1995,232,69-72)、衰減波設備(Huber等,“直接光學免疫傳感(敏感性和選擇性”(Direct Optical Immunosensing(Sensitivity and Selectivity)),Sensors and Actuators B,1992,6,122-126)、和反射測定法(Brecht&Gauglitz,“光學探針和傳感器”(Optical Probes and Transducers),Biosensors and Bioelectronics,1995,10,923-936)。通常用于訊問SPR或波導光柵傳感器的儀器使用具有適當光譜或角度含量 (angular content)的光束,這樣,當該光束被傳感表面反射時,共振角度或波長響應成為輸出的響應中的主要內容。一個共有特征是SPR和光柵耦合器(即OWG或RWG)技術都對傳感器表面上或附近的折射率變化敏感。
這種技術作為生物傳感器的一個主要應用是原位監測不同表面特征和不同溶液特征條件下特定分析物的界面行為。此技術允許無標記檢測,這與大多數需要特異性標記以讀出相互作用的信號的當前技術不同。與標記相關的缺點是標記不僅僅需要大量的勞動和成倍,而且還潛在地干擾靶生物物質或化合物的生物學性質,使數據解譯困難,而且還可能在檢測中產生錯誤信息。但是,如本文所公開的,當使用無標記展示技術時,或當標記與本文所公開的無標記技術結合使用時,可減少這些缺點。還應理解的是,本文所公開的任意傳感器可以各種方式使用,包括例如以多路復用的方式使用,當使用多孔板如修飾的96孔微板時就可實現多路復用(multiplexing)。如本文所公開的,無標記生物傳感器如RWG或OWG生物傳感器可與細胞結合使用,并監測細胞的活動。細胞可培養在生物傳感器上,這樣所培養的細胞粘附到生物傳感器,與細胞在常規的平板上培養并粘附到平板的底部表面非常相似。當細胞培養在所公開的傳感器上時,生物傳感器的輸出會改變。圖1顯示一例培養在該系統上的細胞的輸出。圖2顯示光學波導光柵傳感器。在此圖中,細胞培養在傳感器的上面。當光源如激光以各種角度射向傳感器時,在一組特定的角度,光將耦合到傳感器中。在其它角度,光將直接反射,或者透過傳感器。如本文所述,在細胞操作如刺激細胞表面上的受體之后,在細胞內發生物質再分布。這種物質再分布引起許多事情,其中之一是改變光耦合到傳感器中的角度。這種角度變化可用來鑒定細胞中發生的事件,且應理解,如本文所描述的,基于細胞內發生的物質再分布,就生物傳感器相關的輸出而言,特定的事件具有特征特征。
與通常需要標記和長的培養步驟的常規細胞增殖檢測不同,所公開的組合物、方法和技術的某些實施方式提供了不需要任何標記物的基于給定導向模式的光學波導光模式光譜學(OWLS)或共振峰光譜學或給定導向模式的共振帶成像的方法。此外,在某些實施方式中,所公開的組合物、方法和技術消除了任何額外處理步驟,包括試劑反應和洗滌步驟。此外,在某些實施方式中,所公開的組合物、方法和技術如細胞增殖檢測可在不存在或僅存在感興趣的化合物的標準培養條件下實施,而不會有幾乎所有常規方法通常所需的任何其它試劑的干擾。其它試劑的存在可導致檢測結果的錯誤解讀:(J.J.Ramsden,等, “動物細胞的粘附和擴展動力學”(Kinetics of Adhesion and Spreading of Animal Cells),Biotechnol.Bioeng.1994,43,939-945);因為這些試劑本身可能對細胞增殖有直接的影響(M.Hide,等,“使用表面等離子體振子共振基生物傳感器實時分析活肥大細胞的配體誘導的細胞表面和胞內反應”(Real-time Analysis of Ligand-Induced Cell Surface and Intracellular Reactions of Living Mast Cells Using a Surface Plasmon Resonance-Based Biosensor),Anal.Biochem.2002,302,28-37)。待篩選的化合物可能對這些試劑而不是細胞增殖有影響。例如,直接抑制細胞線粒體脫氫酶的化合物可能抑制MTT轉化,從而在使用MTT篩選針對另一感興趣的特定靶標時導致假陽性。
在某些實施方式中,所公開的組合物、方法和技術提供了超高通量篩選方法,用于找出抑制劑和活化劑,這與當前其它的無標記細胞增殖檢測不同(包括涉及實時測量細胞增殖導致的角度和波長轉移的光學波導傳感方法)。由于細胞增殖通常是個緩慢的過程(如這個過程需要許多小時、天甚至周)且通常需要在37℃培養,除了本文公開的檢測之外的無標記增殖檢測(通常在室溫采集信號)難以實現高通量篩選。
本文公開的方法可提供準確的測量值,而不需要額外的試劑,且這些方法易于使用,并易于與其它功能性篩選整合。例如,可能不需要保存或操作放射性物質或其它物質(如光敏感性熒光化合物)。
雖然其他人已使用光學波導基生物傳感器來進行細胞增殖檢測,但他們使用光學波導基生物傳感器來監測,就給定數量的起始細胞,不同濃度化合物存在下的粘附而導致的傳感器波長改變(Cunningham,B.T.等,“BIND系統的無標記檢測”(Label-Free Assays on the BIND System),J.Biomol.Screening2004,9,481-490,和美國專利申請出版物US20030068657A1,“進行使用比色共振反射光學生物傳感器的檢測的無標記方法”(Label-free methods for performing assays using a colorimetric resonant reflectance optical biosensor),SRU Biosystems LLC的Lin,Bo等)。在某些情況下可使用這些方法檢測化合物對細胞增殖的IC50值。但是,這些方法并不像本文所公開的方法那樣適用于高通量篩選。如本文所公開的,基于波導的生物傳感器可不僅可用于監測活細胞中由G蛋白偶聯的受體(GPCR)或受體酪氨酸激酶如EGFR的活化導致的激動劑誘導的定向物質再分布,而且還可用于研究導致定向物質 再分布的信號傳遞途徑或細胞機制。
a)OWLS和細胞毒性
根據OWLS,波導表面上的模式和不均勻性可導致入射耦合峰譜變寬,并產生細微結構。不再是傳感器上均勻表面固定化所產生的各模式的尖銳共振峰,實驗上和理論上觀察到的具有生物物質或材料不均勻附著的傳感器的細微結構包括但不限于與各模式的主共振峰一同出現的至少一個肩峰(即第二個峰),和各模式的明顯分開的雙(或更多個)峰(見Horvath,R.等,“用于光學波導光模式光譜學應用的波導表面上的模式和不均勻性的影響”(Effect of patterns and inhomogeneities on the surface of waveguides used for optical waveguide lightmode spectroscopy applications),Appl.Phys.B.2001,72,441-447;Voros,J.、Graf,R.等,“基于光學波導技術的在線毒理學傳感器的可行性研究”(Feasibility Study of an Online Toxicological Sensor Based on the Optical Waveguide Technique),Biosensors&Bioelectronics2000,15,423-429,這些文獻納入本文作為參考)。先前,研究者已觀察到,細胞在波導上附著和鋪展期間,入射耦合峰變寬,同時光柵上規則的微結構造成峰的遷移和分裂。共振峰的變寬已被用作為細胞粘附和擴展的指印。
4.光學生物傳感器和細胞中的物質再分布
通常用于訊問SPR或波導光柵傳感器的儀器使用具有適當光譜或角度含量的光束,這樣當該光束被傳感表面反射時,共振角度或波長響應在輸出響應中是占優的。具體而言,用作傳感器的平面光學波導由基底、波導膜和覆蓋介質構成,其中該覆蓋介質是將通過測定折射率而表征的物質。該基于平面波導的生物傳感器可用來檢測隨著在該波導中傳播的電磁場延伸到周圍介質中成為攸逝電磁場時該波導周圍介質中的變化(深度指滲透滲透或感測容積)。當在傳感容積內發生物質再分布時,觀察到響應變化,反映為反射光束中的角度或光譜變化。可測量角度變化以獲得物質再分布響應信號的動力學。此外,由于上述原因,不同的細胞響應將對總的物質再分布信號作出不同的貢獻。例如,在傳感器表面上或附近細胞與胞外基質脫離,因此,這種脫離所產生的響應明顯大于發生在細胞內而產生的響應。
生物細胞是復雜的結構,其組分的大小范圍從幾納米到幾十微米,如圖9所述。細胞由含有各種細胞器的細胞質(通常為5-30μM)構成。最大的細胞器是細胞核,其大小通常為3-10μM。細胞核里具有DNA-蛋白復合物和蛋白質,最重要的是染色質。線粒體是小的細胞器,含有一系列折疊的膜,大小通常為0.1-1.5μm。其他細胞組分包括內質網(ER)(通常為0.1-1μm)、溶酶體(通常為0.2-0.5μm)、過氧物酶體(通常為0.2-0.5μm),內含體(通常~100nm),和高爾基體。
a)基于光學波導光束的表面傳感技術
可交換使用共振波導光柵傳感器(RWG)和光學波導光柵(OWG)。RWG生物傳感器是一種攸逝波傳感器,以光通過衍射光柵諧振耦合到波導之中為基礎。基于RWG的表面傳感技術利用了攸逝場的優點,它在波導表面之外的穿透不超過一個波長,從而在給定譜帶寬上對固定化的化學或生物分子的吸附作出選擇性應答。
光學LID生物傳感器的一個例子(如圖10的1004)是SPR傳感器1004或基于波導光柵的傳感器1004。也可使用其他基于光學的生物傳感器,例如橢圓光度法設備、衰減波設備和反射測定法設備。關于這兩者類型的光學LID生物傳感器的結構和操作的更詳細的討論在美國專利4,815,843(“選擇性檢測氣體、液體、固體和多孔樣品中的物質和/或折射率變化的光學傳感器”(Optical Sensor for Selective Detection of Substances and/or for the Detection of Refractive Index Changes in Gaseous,Liquid,Solid and Porous Samples))和K.Tiefenthaler等的“集成光學開關和氣相傳感器”(Integrated Optical Switches and Gas Sensors,Opt.Lett.10,第4期,1984年4月,pp.137-139)提供,本文將他們的全文,至少是關于生物傳感器的材料,納入作為參考。尤其是2005年7月20日提交的美國專利申請60/701,445(“無標記高通量生物分子篩選系統和方法”(Label-Free High Throughput Biomolecular Screen System and Method))和N.Fontaine等于2004年12月21日提交的美國專利11/019,439(“光學訊問系統和2-D傳感器陣列方法”(OPTICAL INTERROGATION SYSTEM AND METHOD FOR2-D SENSOR ARRAYS))(2005年4月5日提交)中公開的光學生物傳感器,所有這些都被全文(至少關于生物傳感器及其用途)納入作為參考。
(1)對稱波導光柵生物傳感器
對稱波導光柵生物傳感器的一個例子是光柵耦合器或耦合的生物傳感器。光柵耦合的生物傳感器的例子可見Jordan&Corn,“吸附到化學修飾的金表面上的靜電生物聚合物的表面等離子體振子共振圖像測量”,Anal.Chem.,1997,69:1449-1456;Morhard等,“在微模式中固定抗體以通過光衍射進行細胞檢測”,Sensors and Actuators B,2000,70,232-242;和Tiefenthaler,K.和W.Lukosz,“作為集成光學化學傳感器的光柵耦合器的靈敏性”(Sensitivity of grating couplers as integrated optical chemical sensors),J.Opt.Soc.Am.B,1989,6,209-220。所有這些文獻的全文(至少涉及光柵耦合的生物傳感器的材料)納入本文作為參考。
光柵耦合器生物傳感器是以光通過衍射光柵諧振耦合到波導中為基礎的攸逝波傳感器。光柵耦合器傳感器由波導和衍射光柵構成。圖2a顯示了一種典型的四層波導生物傳感器,它由位于較低折射率(1737玻璃的ns=1.50)的基底之上的高折射率(Nb2O5的nF=2.36)、厚度為dF的薄膜構成。固定在波導膜上的是折射率(nA)在1.4左右、厚度為dA的生物物質貼壁層,在整個傳感器結構頂部的是覆蓋介質,為折射率(nC)大約為1.5的生物溶液。在此常規構型中,波導薄膜的折射率至少比低折射率基底的折射率高1%,例如,高1%、5%、10%、20%、30%、50%、70%或100%。低折射率基底的折射率比覆蓋介質的折射率高(例如)5%、7%、10%、15%、20%、30%或50%。用于細胞基檢測的覆蓋介質(通常是水性介質)的折射率通常大約為1.32、1.35和1.38。
平面波導中的導波或模式是TEm(橫向電場或s-極化)和TMm(橫向磁場或p-極化),其中m=0、1、2……,它是模式編號。給定導向模式指例如TM0、TE0、TM1、TE1等。激光以各種角度照射波導,光僅在導向模式的有效折射率所確定的特定角度(稱為N)耦合到波導中。由于光模式的攸逝尾隨脈沖在基底和覆蓋介質中傳播(但仍沿著該膜),光模式同時經歷并感知所有介質。這意味著行進中的光模式所經歷的折射率是三種折射率的加權混合值。有效折射率N可根據以下四層波導的模式方程計算出數值,假設薄貼壁層的厚度低于光的波長(dA<<λ)(Tiefenthaler,K.和W.Lukosz,“作為集成光學化學傳感器的光柵耦合器的靈敏性”J.Opt.Soc.Am.B,1989,6,209-220),則該方程可寫成以下形式:
0?πm-k(nF2-N2)0.5(dF+dAnA2-nC2nF2-nC2[(N/nC)2+(N/nA)2-1(N/nC)2+(N/nF)2-1]σ)+arctan[(nFnS)2(N2-nS2nF2-N2)0.5]+arctan[(nFnC)2(N2-nC2nF2-N2)0.5]---(1)]]>
其中,k=2π/λ,λ是導向光的真空波長,σ是模式類型數,對于TE等于1,對于TM模式則等于0。
如果通過表面起伏光柵(surface-relief grating)耦合到波導中,N可由入射耦合角度計算:
(±)N=Nairsin(θ)+lλ/Λ          (2)
其中,Nair=1.003,指空氣的折射率;θ指空氣中測量的入射角;λ指波長;Λ指光柵周期(grating period);l=±1、±2……,為衍射級。此方程左側的加減號分別指導向模式以+x和–x方向傳播。
150.光柵區域中波導內的誘導的有效折射率變化△N導致△θ變化,如以下方程所述:
△N=naircos(θ)△θ        (3)
由于激光耦合到波導膜的平面并平行于該平面傳播,這就在鄰近界面的液體中產生了電磁場(即攸逝波)。攸逝波的振幅(Em)隨著與該界面之間的距離d的增加而指數性減弱:
Em(d)=Em(0)exp(-dΔZC)---(4)]]>
其中,
ΔZC=1-σk(N2-nC2)0.5+σ[(N/nF)2+(N/nC)2-1]-1k(N2-nC2)0.5---(5)]]>
是高強度波導模式進入覆蓋介質中的穿透深度。
如果滿足兩個條件,那么,給定模式類型僅作以導波形式傳播:(a)波導膜的折射率得至少不周圍基底和覆蓋介質折射率大1%;和(b)波導膜的厚度大于很好限定的值,即閾值厚度dC:
dC=1k(NF2-nmax2)0.5(πm+arctan((nFnmin)2σ(nmax2-nmin2nF2-nmax2)0.5))---(6)]]>
其中,Nmin=min{ns,nC}和nmax=max{ns,nC}。已知當膜厚度接近閾值厚度時,模式的有效折射率N接近nmax。此外,方程5暗示,在閾值厚度,具有較大折射率的膜那一側穿透深度趨向無窮大,而在另一側穿透深度將是有限的。在這 種情況下,deff也是無限的。
再次,當波導光柵生物傳感器為常規的波導構型時,光在波導傳感器中傳播產生的指數性衰減的攸逝波場僅能以高強度滲透到覆蓋介質50-200nm的深度。這一數值依賴于界面上存在的介質的折射率、照射波長以及光柵結構。當入射角等于臨界值(critical value)時,dC趨向無窮大,折射光的波陣面與表面垂直。
考慮到四層波導具有以下參數:nF=2.37(Nb2O5層),nS=1.51(1737玻璃),nC=1.333(水溶液),nA=1.37(細胞),dA=500nm(培養的細胞的平均厚度),dF=157nm,波長830nm,光柵周期530nm,我們得到:(1)TE0模式的閾值厚度為27nm、TM0的為69nm,TM1模式的為252nm、TM1模式的為294nm,表明這種傳感器僅支持TR0和TM0模式;(2)TE0的穿透深度為78nm、TM0模式的為112nm。這意味著(1)我們僅監測細胞貼壁層底部,如圖2a細胞內部的虛箭頭所指示的;(2)當靶標或復合物較接近傳感器表面時,與它們與傳感器表面較遠相比,某些質量的靶標和復合物更能影響到總響應,如圖4所示。圖4顯示滲透到介質中的攸逝波的強度隨著距離增加而指數性減弱。由于較高敏感性的緣故,本申請中大多數示例采用TM0模式,除非另有說明。
(2)反對稱波導光柵生物傳感器
在前述具有常規構型的波導傳感器中,基底折射率(如玻璃基底,通常nS~1.5)通常高于水性覆蓋介質的折射率(通常~1.33)。在這種對稱波導傳感器中傳播的光的指數性衰減的攸逝波場滲透入覆蓋介質不深(通常~50-200nm)。基底一側的攸逝波尾隨脈沖比覆蓋介質一側的更長更強。這限制了對分析物的響應,因為敏感性依賴于分析物粘附層中傳播的模式能所占的分數。將模式的特征(profile)反轉有可能克服這種限制,并允許較大(較長)的穿透深度,從而可分析形態學或胞內組分。Horvath等(US20030109055A1和Horvath,R.、Lindvold,L.R.和Larsen,N.B.的“水溶液中反對稱波導傳感的證明”(“Demonstration of Reverse Symmetry Waveguide Sensing in Aqueous Solutions”,Applied Physics B,2002,74,383-393,其中的文獻納入作為參考)已證明所謂的反對稱波導的可行性。反對稱波導的原理以使波導基底的折射率低于覆蓋波導膜的介質的折射率(即,對于水溶液,通常為1.33)為基礎,如圖2a所示。如圖5所示,可通過三種不同的幾何構造實現 反對稱:(1)沉積在具有微觀結構的支持物上的薄的波導薄膜;(2)沉積在中孔或納米孔支持物上的薄波導薄膜,其中這種納米孔基底的折射率大約為1.15;和沉積在納米結構化的支持物上的薄波導薄膜。通過使用這些反構型,當膜厚度接近這兩種波導的閾值厚度時,覆蓋介質穿透深度明顯超過常規波導的穿透深度。此外,通過控制膜厚度,探測深度可以得到控制,且可無限增大。
(3)光學檢測系統
在某些實施例中,當使用光學波導生物傳感器時,光學檢測系統可以是角度訊問、波長訊問或由它們的變形而來的系統,例如陣列式角度訊問系統或掃描波長訊問系統(2004年11月18日N.Fontaine等提交的美國申請10/993,565和Y.Fang等于2005年3月31日提交的“消除位于微板中的波導光柵基生物傳感器和所得的微板之間的色亮度干擾的方法”,兩者的全文(至少涉及生物傳感器、掃描設備以及微板的內容)納入本文作為參考)。2003年6月24日提交的美國專利申請號10/602,304(2004年12月30日公開,公開號為US-2004-0263841)、2004年12月21日提交的美國專利申請11/019,439和N.Fontaine等的美國專利申請“光學訊問系統和2-D傳感器陣列方法”(OPTICAL INTERROGATION SYSTEM AND METHOD FOR2-D SENSOR ARRAYS)(2005年4月5日提交),所有這些文獻的全文(至少關于生物傳感器及其用途方面的內容)被納入本文作為參考。
可用于構成微板中含特定構型OWG生物傳感器的平板的例子是96孔康寧Epic生物傳感器微板,其中各孔含有嵌埋于玻璃支持基底底部表面中的光學波導光柵(OWG)生物傳感器。
由于受導模式的攸逝波場投入到覆蓋的液體中的緣故,波導模式對覆蓋環境極度敏感。當在波導表面上發生細胞事件時(例如生物材料從能透過的細胞中控制釋放),由于質量損失,導致覆蓋介質的折射率發生變化,根據Maxwell電磁方程,波導模式的傳播常數也必然變化。因為上述波導光柵結構的相期匹配(phase matching)條件,入射光的優選耦合角度(或波長)必然隨著波導傳播常數的變化而變化。可監測這些宏觀的物理變化來指示微觀的細胞事件。
b)光學波導光模式光譜學(OWLS)理論
光柵耦合器生物傳感器是以光通過衍射光柵諧振耦合到波導中為基礎的 攸逝波傳感器。受導模式完全通過內部反射在平面波導中傳播,可將此描述為Z型波。在通過一個完整Z字形后,只有對給定波導結構和固定的極化和波長,普通波與兩次反射波之間的相差才是膜中光的波矢(β)的χ要素的函數。通過自洽性標準測定,β值可根據以下模式方程計算(Horvath,R.等,“用于光學波導光模式光譜學應用的波導表面上的模式和不均勻性的影響”,Appl.Phys.B.2001,72,441-447):
πm?dF(k2nF2-β2)0.5-arctan[(nFnS)2ρ(β2-k2nS2k2nF2-β2)0.5]-arctan[(nFnC)2ρ(β2-k2nC2k2nF2-β2)0.5]---(7)]]>
其中,k=2π/λ,λ是導向光的真空波長;ρ是導向類型數,TE模式中等于1,TM模式中等于0。nF、nS和nC分別是膜、基底和覆蓋介質的折射率。波導中模式傳播方向是χ,m=0、1、2……,它是第m種波導模式的模式指數。在Z形波長模型中,各光線代表一個平面波(P.K.Tien.,“檢測光路和光線波導中新的波現象”(Integrated Optics and New Wave Phenomena in Optical Waveguides”,Rev.Mod.Phys.1977,49,361)。如果光耦合到波導中,則僅需要考慮Z形波擊中膜表面的那些點的耦合,以及可使用簡單的光線光學的那些點的耦合。
如圖3所示,假設一個Z字波期間的相移是Φ(β),n個Z字形之后的波振幅(An(β))將是幾何級數的:
An(β)=A0(β)Σj=0n-1eijΦ(β)=A0(β)G(β)---(8)]]>
其中,i表示虛數單位,和
G(β)=einΦ(β)-1e(β)-1---(9)]]>

Φ(βm)=2πm,m=0,1,2.....      (10)
假設整個光柵長度都被照射,則耦合長度L等于光柵長度,完整Z字波的 總數n可用下式計算:
n=Lk2nF2-β22dFβ---(11)]]>
以角度αO照射光柵,則產生具有β0的波導模式:
β0=knairsin(α0)+2π/Λ     (12)
其中nair是空氣的折射率,Λ是光柵周期。由于光柵和激光束的限定寬度,當用平面波以角度αO照射光柵時,可使用平面波分布來描述衍射的光。由此達的到在βO處的一個峰,根據光學不確定性原理計算得到其半最大值峰寬(PWHM)約為2π/L(Tiefenthaler,K.和W.Lukosz,“作為集成光學化學傳感器的光柵耦合器的靈敏性”,J.Opt.Soc.Am.B,1989,6,209-220)。
n個節段之后的耦合光的強度(In(β))與光的振幅的絕對平方成正比|G(β)|2=IG(β)。耦合光強度I(α)和入射角(也可使用光學波導光模式光譜學(OWLS)技術測定)之間的關系可使用下述方程計算:
I(α)=∫Id(β,α)IG(β)dβ     (13)
其中Id(β,α)是一級衍射的強度分布。
Id(β,α)=|sin(0.5-0.5L(knairsin(α)+2πΛ))β-(knairsin(α)+2πΛ)|2---(14)]]>
c)縱向物質再分布和橫向物質再分布
活細胞高度活躍,大多數細胞器,例如響應信號傳遞分子或途徑的活化,在細胞內廣泛運動。例如,微管可長距離轉運細胞器。一個刺激可導致被致密包裹的細胞器在細胞于其上培養的傳感器表面的很外圍的區域做亞微米級的移動,這種移動導致細胞內的物質再分布。可將應答信號刺激的這種移動稱為“轉運”或“移位”或“再分布”。這種轉運或移位或再分布事件通常與物質再分布有關。可使用光學生物傳感器檢測物質再分布,并將與物質再分布相關的信號稱為定向物質再分布(DMR)信號。
由于刺激可導致細胞內容物在三維方向動態再分布,因此通過入射角或波長的變化來監測細胞響應對于使用生物傳感器進行細胞傳感而言可能是不夠的。為了簡化分析,可將動態物質再分布分成兩種類型:縱向物質再分布,發生在與傳感器表面垂直的方向上;和橫向或水平物質再分布,發生在與傳感器 表面平行的方向上。應理解,特定的刺激事件可引起這兩種物質再分布之一或兩者。
如入射角或共振波長的動態變化所暗示的,DMR信號主要是由于發生在垂直于傳感器表面的方向上的細胞內容物的再分布,因為傳感器對平行于傳感器攸逝波方向的物質再分布最敏感。這種DMR也稱為縱向物質再分布。具體而言,在平行于傳感器表面且垂直于傳感器攸逝波方向上發生的刺激事件誘導的物質再分布可導致細胞層內質量均勻性發生變化,從而導致共振峰、共振帶圖像和/或OWLS譜發生變化。可檢測這些變化,并用作刺激事件或化合物對刺激事件誘導的細胞響應的作用的特征。該物質再分布被稱為橫向物質再分布。
如圖2和3所示,細胞直接在共振波導管光柵(RWG)生物傳感器表面上培養。外源信號介導了特定細胞信號傳遞的活化,在許多情況下導致細胞內容物的動態再分布,相當于動態物質再分布。當DMR發生在傳感容積(即攸逝波的穿透深度)范圍內時,它會被顯示出來,從而被RWG生物傳感器實時監測到——一種對傳感器表面附近局部折射率變化敏感的無標記技術。由于其可測量多個參數的能力,生物傳感器具有為細胞傳感提供高信息內容的潛力。這些參數包括角度變化(最常見的輸出中的一種)、強度、半最大值峰寬(PWHM)和共振峰的面積。此外,由于我們的角度訊問系統的獨特設計(該系統使用~200μm×3000μm的光束照射各傳感器),各傳感器的共振帶圖像可提供其它有用的信息:整個傳感器不同位置上的細胞的細胞狀態(如密度和粘附程度)的一致性以及細胞響應的均勻性。
RWG生物傳感器利用光通過衍射光柵共振耦合到波導中而產生的攸逝波。由于只有基底-膜和介質-膜界面上的內部反射,被導光可視為傳播方向都平行于波導的一種或多種光模式。波導的折射率比其周圍基質的折射率高。因為被導光模式具有覆蓋所有層的橫向振幅,各模式的有效折射率N是所有層的折射率的加權和:
N=fN(nF,nS,nC,nad,dF,dad,λ,m,σ)    (15)
其中,nF、nS、nC和nad分別是波導、基底、覆蓋基質和細胞貼壁層的折射率。dF和dad分別是波導膜和細胞層的有效厚度。λ是所使用的光的真空波長。M=0、1、2……,它是模式數。σ是模式類型數,對于TE(橫向電場或s-極化)它等于1,對于TM模式(橫向磁場或p-極化)它等于1。
由于細胞與表面相互作用的性質和細胞結構和功能的復雜性的緣故,貼壁 細胞的光學傳感是獨特的和非常有挑戰性的。已知一些類型的細胞可粘附在表面上,主要通過三種類型的接觸:焦點接觸、鄰近接觸和胞外基質(ECM)接觸。焦點接觸是粘附的細胞膜的狹窄區域(如0.2μM×10μm)與基底表面的距離在10-15nm。鄰近接觸指細胞膜區域與基底的距離在1-50nm,而ECM接觸指細胞膜區域與基底的距離為100nm或更遠。因此,人們可以理解傳感器仍可感測覆蓋基質,即使細胞覆蓋率很高(~95%)。但是,已知活細胞含有~70%的水,并且,在哺乳動物細胞內,大多數胞內生物大分子通過絲狀網絡而高度組織化,它們在空間上被限制在適當位點上。此外,細胞的高度通常超過入射光的波長(在此λ=830nm),而穿透深度通常遠小于細胞的高度。因此,用于細胞傳感的生物傳感器可視為是一種三層構型:基底、波導和細胞層。
可由三層波導管的給定模式的模式方程計算有效折射率N的數值(Tiefenthaler,K.和W.Lukosz,“作為集成光學化學傳感器的光柵耦合器的靈敏性”,J.Opt.Soc.Am.B,1989,6,209-220):
0?πm-kdF(nF2-N2)+arctan[(nFnS)2σ(N2-nS2nF2-N2)0.5]+arctan[(nFnC)2σ(N2-nC2nF2-N2)0.5]---(16)]]>
其中,波矢k=2πm/λ。
被導光模式平行于平面波導管的表面傳播,產生延伸進入膜兩側低折射率介質的電磁場(即攸逝波),該電磁場的特征是指數性衰減。攸逝波的振幅(Em)隨著與界面的距離z增加而指數性衰減:
Em(d)=Em(0)exp(-zΔZC)---(17)]]>
其中:
ΔZC=1-σk(N2-nC2)0.5+σ[(N/nF)2+(N/nC)2-1]-1k(N2-nC2)0.5---(18)]]>
是波導管模式的攸逝波尾隨脈沖深入覆蓋介質的穿透深度。基于所使用的生物傳感器的構型和細胞性質的獨特性,本文所用的TM0模式的穿透深度是~120nm,意味著我們僅監測細胞的底部。
蛋白質和/或分子集合體的移位常見于許多外源信號啟動的細胞響應。移位使得可對特定靶標引起的細胞信號發出的振幅、持續事件以及動力學進行準確控制。此外,有時,外源刺激還可引起細胞狀況例如粘附程度和細胞骨架結構發生變化。當這些變化在傳感容積范圍內時,模式折射率N由于覆蓋介質和攸逝波尾隨脈沖之間的相互作用被改變。
對垂直于傳感器表面但平行于導向模式的攸逝波尾隨脈沖的方向上的細 胞內容物再分布(稱為縱向物質再分布),假定給定時間用光探測的細胞的粘附程度和構型相似,則可將貼壁細胞的底部分成多個相同間隔且均勻的薄層。各層具有各自的折射率ni,且離傳感器表面的距離為zi(圖2b)。因為單位面積A視為是恒定的,并由光學生物傳感器的空間分辨率所確定,因此所有的層可視為具有相同的體積,其中該空間分辨率受限于入射光的物理大小以及被導波在波導中的傳播長度。細胞內給定體積的折射率主要由生物分子(主要是蛋白質)的濃度決定(Beuthan J,O.Minet,J.Helfmann,M.Herrig和G.Muller.,1996,“生物細胞中折射率的空間變化”(The spatial variation of the refractive index in biological cells),Phys.Med.Biol.41:369-382):
ni=no+αCi       (19)
其中no是溶劑的折射率,它是恒定的,大約等于細胞中的水的折射率。α是比折射系數增量,對于蛋白質而言大約是0.0018,對于細胞中的其他溶質如鈉而言是0.0016。Ci是層i中的溶質的濃度(g/100ml)。雖然蛋白質和其他溶質的折射系數增量類似,但是各層的折射率仍主要受到蛋白質的影響,這是因為蛋白質的濃度(以每體積重量計)遠遠大于其他溶質。因此,均勻層i的折射率變化△ni近似形成一個分片連續函數(piece-wise continuous function):
△ni=α△Ci         (20)
傳感容積內的加權折射率變化△nc是△ni與加權因子exp(-z/△Zc)的積分:
ΔnC=&Integral;0Δn(z)e(-zΔZC)dz&Integral;0e(-zΔZC)dz---(21)]]>
從z=0到z=∞積分,在用式(7)取代△n(z)并進行重排后,我們得到:
ΔnC=αΣiΔCi[e-ziΔZC-e-zi-1ΔZC]---(22)]]>
由于在大多數情況下△nc是生物傳感器傳感的細胞的折射率的一小部分(通常低于20%),因此對于第一階(order),有效折射率的變化是:
△N=S(C)△nc        (23)
其中,S(C)是對覆蓋介質(即細胞)的敏感度:
S(C)=&PartialD;N/&PartialD;Nc=nCN[nF2-N2nF2-nC2]ΔzCdeff[2N2nC2-1]σ---(24)]]>
deff是有效波導厚度,由下式計算:
deff=dF+∑△zC     (25)
將方程9和11代入方程12,得到以下檢測信號的方程:
ΔN=nCN[nF2-N2nF2-nC2]ΔzCdeff[2N2nC2-1]σαΣiΔCi[e-ZiΔZC-e-Zi+1ΔZC]---(26)]]>
方程26表明:(i)有效折射率的變化以及由此導致的與所測入射角變化相關的光學特征主要對傳感容積內的縱向物質再分布敏感;(ii)有效折射率的變化直接是刺激介導的蛋白質重新定位而導致的蛋白質濃度變化的函數,而不是離子運動如Ca2+流入和Ca2+流出的函數;(iii)與遠離傳感器表面相比,靶標或某些物質的復合物向傳感器表面的重新定位對總響應貢獻更大;(iv)光學特征是一整合的信號,它是離開傳感器表面不同距離處發生的物質再分布的作用之和。由于細胞信號傳遞的復雜性,同不同靶標介導的不同細胞信號傳遞的活化可能產生類似的總DMR信號。但是,由于參與特定信號傳遞的是一組獨特的細胞靶標,用一組預定選擇性抑制劑組介導進行抑制的方案提供了一種將特定刺激活化的細胞信號傳遞的特異性進行分類類的方法。
如上面所討論的,當細胞應答刺激時,入射角度或共振波長的改變主要由傳感容積內縱向物質再分布來決定。由于生物傳感器的橫向分辨率差的緣故,橫向物質再分布可能難由這些改變來分辨。但是,因為光束和激光束的限定寬度,因此當用平面波以角度α0照射光柵時,可使用平面波分布來描述衍射的光,如RWLS理論部分所討論的。當沒有任何貼壁層存在時,由此發現βO處一個PWHM約為2π/L的峰(根據光學不確定性原理計算)。使用這些方程構建的模型獲得了有趣的發現,這些發現表明共振峰(或譜)的形狀帶有關于物質分布的橫向不均勻性的有價值的信息。這種橫向不均勻性不強烈擾亂覆蓋介質的折射率,但明顯改變了共振峰的形狀。
已知某些外源信號可引起單細胞和多細胞水平的顯著的不對稱橫向物質再分布。例如,不同群體的細胞可對對細胞有毒性的化合物發出不一致的應答,而單個貼壁細胞在一些細胞過程中(如細胞遷移和浸潤)可經歷某些細胞靶標或分子集合體的不均勻分布。我們假定,當不對稱橫向物質再分布發生時,該再分布還可導致共振峰的細微結構和形狀發生改變。
d)細胞信號傳遞和細胞生理學中的動態物質再分布
活細胞由復雜的和動態的蛋白質絲狀網絡構成,該網絡稱為細胞骨架,在真核生物細胞的整個細胞質中延伸。細胞骨架參與執行不同的細胞活動,例如為維持細胞形狀提供抗張強度,為信號傳遞和通信提供“途徑”或“泊位”,和為細胞運動、胞內轉運和細胞分裂提供力量。有三種細胞骨架纖維:肌動蛋白纖維、中間纖維和微管,各自執行不同的生物學功能。在這些纖維中,肌動蛋白纖維高度集中在質膜之下,因為它們保持細胞形狀、形成細胞質凸起,并參與一些細胞與細胞或細胞與基質的連接、信號轉導和肌肉收縮。
已知在哺乳動物細胞中,大多數的胞內生物大分子通過纖維網絡基質高度組織化,并在空間上定位于相應的位置。此外,細胞蛋白質的定位受到緊密控制,以調節蛋白質相互作用的特異性和效率,從而在空間上隔開蛋白質活化和滅活機制,并確定特定的細胞功能和應答。在應答刺激時,根據信號傳遞的性質及其網絡相互作用、細胞狀況和細胞內容物,常常會發生細胞蛋白質的再定位,這種再定位有時是顯著的。蛋白質和分子集合體的再定位不僅對于細胞信號傳遞是重要的(通過實現精確控制信號的振幅、持續時間和動力學),而且對于細胞功能如遷移、侵入、生長、周期、分化、生存和死亡也是重要的。
一個很好的例子是G蛋白偶聯受體(GPCR)信號傳遞。GPCR是膜結合蛋白質超家族。在未刺激細胞中,內源GPCR主要位于細胞表面上。在接觸配體后,細胞作出應答,產生受到胞內信號傳遞和調節機制緊密和精確控制的一系列時空事件。這些事件導致GPCR信號發出周期期間有序的、有引導的、定向的和動態的細胞內容物再分布。監測細胞內容物的動態再分布已提供了關于GPCR信號傳遞方面的認識,并提供了一個有力的篩選GPCR的手段。例如,激動劑刺激后β2-腎上腺素受體-GFP偶聯物再定位的直接展示引起了將這種方法作為直接篩選策略的興趣。這些通信試驗(trafficking assay)中的一種是得自Xsira Pharmaceuticals Inc(其前身是Norak Biosciences)的Transfluor技術。這種技術使用高分辨率熒光成像來監測響應某化合物的熒光標記的抑制蛋白的胞內定位。熒光標記的抑制蛋白的再定位可視為是激動刺激的指示。
許多這類事件在細胞的底部發生(這可由光學生物傳感器得以證實),結果產生了與動態這類再分布(DMR)相關的光學信號。DMR信號是活細胞的新的生理學響應。理論分析表明,由入射角或波長轉移所示的光學特征主要對傳感容積中的縱向物質再分布(稱為DMR)敏感,而涉及共振峰的形狀(如半最大值峰寬、強度和面積)的光學輸出參數則對刺激誘導的橫向物質再分布敏感。 由于透入細胞層的攸逝波尾隨脈沖的指數性衰減,與靶標或某些物質的復合物遠離傳感器表面相比,當這些靶標或某些物質的復合物更接近傳感器表面時,它們對總響應的貢獻更大。此外,向著傳感器表面移動的靶標或某些物質的復合物的再定位導致信號增加,而遠離該表面移動的靶標或復合物的再定位則導致信號下降。
已發現,通過特定靶標介導的DMR信號依賴于細胞狀況如粘附程度,和細胞狀態(state)(如增殖和靜息態狀態)。由于傳感器共振峰的寬度或位置對細胞密度和活力敏感,因此可檢測可能顯著影響檢測結果的細胞的生物學狀況(status)(如細胞活力、細胞密度和粘附程度),由此提高檢測的再現性。
定性評價一種給定方法是否適合系統生物學應用的三項主要內容是:多元化能力、多參數分析的能力以及定量系統應答特征(profile)的能力。由于光學生物傳感器是無標記的和非侵入性的,因此基于生物傳感器的細胞檢測能夠多元化。例如,A431中,激動劑誘導的內源緩激肽B2受體(P2Y受體)以及蛋白酶活化受體(PAR)的活化產生類似的Gq-型光學特征(圖66)。此外,由于光學生物傳感器提供了多響應的整合,特定靶標介導的DMR信號傳遞還可用于表征其下游的信號傳遞靶標。例如,A431中EGF誘導的DMR可用來表征靶向其下游靶標之一的MEK1的化合物(圖44)。這些結果表明基于生物傳感器的細胞檢測具有多元化特性。
光學生物傳感器為分析配體誘導的DMR響應提供了多個參數。這些參數包括對縱向物質再分布敏感的反射光角度或波長改變、和定義主要對橫向物質再分布敏感的共振峰形狀的參數。這些參數的組合還可提供關于配體對所檢測的細胞的作用的詳細信息(例子顯示在圖80、84和85中,其中圖80涉及反應性氧物質信號傳遞,圖84涉及EGFR信號傳遞,圖85涉及緩激肽B2信號傳遞)。此外,由于生物傳感器是非侵入性的,因此基于生物傳感器的細胞檢測可容易地與其它技術整合,例如與質譜和熒光成像整合。這些技術還可證實化合物或配體對細胞的作用。
特定靶標介導的DMR信號是一種整合的可定量的信號,它是得自離傳感器表面不同距離的位置上發生的物質再分布的作用之和。由于細胞信號傳遞的復雜性,不同靶標介導的不同細胞信號傳遞的活化可能產生類似的總DMR信號。但是,由于參與特定信號傳遞的是一組獨特的細胞靶標,用預定選擇性抑制劑介導抑制的方案提供了一種將特定刺激活化的細胞信號傳遞的特異性進行分 類的方法。因此,可將DMR響應視為獨特的和理想的讀出數據,用于活細胞的系統生物學研究(例子顯示在涉及EGFR信號傳遞的圖38-47和涉及A431細胞PAR信號傳遞的圖71-79中)。這些研究顯示,對不同靶標的調節導致EGF誘導的DMR信號的不同減弱。在應答表皮生長因子(EGF)刺激時,發現靜息態A431細胞的DMR響應對于EGF濃度是可飽和的,且能夠完全被特定的強效EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1478所抑制。各種已知抑制劑/藥物對靜息態A431細胞的DMR響應的作用主要將細胞響應與主要通過MEK進行的Ras/有絲分裂原活化的蛋白(MAP)激酶途徑聯系起來。
5.細胞檢測
公開了光學無標記生物傳感器進行任何細胞檢測的用途和方法,例如檢測細胞死亡、檢測細胞增殖、檢測受體活化或抑制、檢測細胞膜完整性、檢測脂質體信號傳遞、檢測細胞信號傳遞、檢測反應性物質信號傳遞、評估細胞氧化還原態的檢測、研究不同靶標之間的交叉通話的檢測、使用終點測量值的高通量化合物篩選試驗、以及檢測核信號傳遞或活性,或者例如檢測細胞骨架重構。這些檢測使用到一個或多個生物傳感器輸出參數,所述參數可用于形成該檢測的特征或可用來根據檢測以及一個或多個步驟作出決定。
生物傳感器可產生的不同形式的輸出值,例如像素、角度改變或波長改變。該輸出值可是輸出數據的形式,該輸出數據是一種輸出信息,是就一組特定條件采集的數據,可保存或實時分析。當使用時,生物傳感器產生數據輸出,該數據輸出通常以圖形的方式呈現,例如響應單位與時間相關的圖(作為一個例子,可見圖6A以及本文公開的許多其它附圖)。當使用角度訊問檢測系統時,響應單位可以是角度變化(以度計),或當使用波長訊問檢測系統時,響應單位是波長改變(以皮米計),或當使用利用CCD照相機的角度訊問檢測系統來采集生物傳感器的共振帶圖像時,響應單位是像素位置遷移(以像素計)。此外,當采用給定模式的共振峰譜時,響應單位可以是作為入射耦合角(見圖6B)或波長的函數的入射耦合光的強度。在另一實施方式中,當使用利用CCD照相機的角度訊問檢測系統來采集生物傳感器的共振帶圖像時(見圖6C),響應單位可以像素中的位置或位置強度。生物傳感器輸出參數或生物傳感器輸出數據參數分別是生物傳感器輸出值或輸出數據的任意特征,可測量這些特征,并可使用它們分析生物傳感器輸出值或生物傳感器輸出數據。在某些實施方式中, 生物傳感器輸出參數還可以是可鑒定的并可在多個檢測中通用的特征。特征可以是任意的生物傳感器輸出參數或參數組合,可作為特定檢測的表征。例如,特征可采用刺激事件后峰值強度,或可以是刺激事件后峰值強度的位置,或可以是半最大峰值強度的位置。該信號然后可用于例如比較兩種不同化合物對細胞培養物的影響,或單個化合物對兩種不同的細胞培養物的影響,而不是用于比較全部輸出數據。因此,特征可出現在單個時間點或單個波長或單個波角度或它們的任意組合,這取決于所檢測的是什么(見上述關于響應單元的討論)。
a)生物傳感器輸出參數
圖6描述了可使用的大量不同的生物傳感器輸出參數。例如,定義細胞內刺激誘導的定向物質再分布的動力學的六個參數可以是總動態(即形狀),響應階段(在此具體實施例中,有三個涉及細胞響應的主要階段:正向物質再分布(P-DMR,圖6A的C點到D點)、凈零定向物質再分布(net-zero DMR,圖6A的D點到E點)和逆向物質再分布(N-DMR,圖6A的E點到F點到G點)),各階段的動力學、總持續時間,P-DMR階段和N-DMR階段兩者的總振幅,和P-DMR階段到N-DMR階段的過渡時間τ(圖6A)。其它生物傳感器輸出參數可由共振峰獲得(圖6B)。例如,可使用峰位置、強度、峰形狀和半最大值峰寬(PWHM)(圖6B)。生物傳感器輸出參數還可從生物傳感器的共振帶圖像獲得。使用陣列式角度訊問系統獲得數據,這些數據闡述另外5種特征:帶形狀、位置、強度、分布和寬度。對于使用本文所公開的生物傳感器的任意細胞檢測的任意給定應用,所有這些參數可分別或一起使用。任意亞組或組合中這些參數的使用可為給定檢測或特定檢測中的給定變化提供一特征,如細胞受體檢測的特征,以及為之后的基于EGF受體的檢測提供特定的特征。
(1)與刺激誘導的定向物質再分布動力學相關的參數
有大量的生物傳感器輸出參數與刺激階段的DMR的動力學相關。這些參數著眼于對細胞施加刺激事件時生物傳感器數據輸出發生變化的速率。刺激事件是可改變細胞狀態的任何事件,如將分子加到培養基中、從培養基中除去分子、溫度變化或pH變化、輻射細胞。刺激事件可產生刺激效果,這種效果可以是刺激事件導致的細胞的任意效果,如定向物質再分布。刺激事件可以是化合物、化學的、生化的或生物學的以及聚合物。生化的或生物學的刺激事件可以是肽、 合成肽或天然肽。例如,許多不同的肽以信號分子起作用,包括促炎肽緩激肽、蛋白酶凝血酶和血壓調節肽血管緊張肽。雖然這三種蛋白質的序列和生理學不同,且通過不同的細胞表面受體起作用,但是它們具有同一類細胞表面受體,即G蛋白偶聯的受體(GOCR)。GPCR的其它多肽配體包括血管升壓素、催產素、促生長素抑制素、神經肽Y、GnRH、促黃體生成激素、促卵泡激素、甲狀旁腺素、增食因子(orexins)、硬骨魚緊張肽II、內啡肽、腦啡肽以及其它配體。GPCR是一廣譜且多樣的基因家族,它們不僅應答肽配體,還應答小分子神經遞質(乙酰膽堿、多巴胺、5-羥色胺和腎上腺素)、光、臭氣物質、味道、脂質體、核苷酸和離子。GPCR使用的主要的信號傳遞機制是與與下游次級信使系統(包括胞內鈣釋放和cAMP生產)相連的G蛋白GTP酶蛋白相互作用。肽GPCR使用的胞內信號傳遞系統與所有GPCR使用的那些系統類似,通常根據它們與之相互作用的G蛋白以及所活化的次級信使系統將它們歸類。對于Gs偶聯的GPCR,受體引起的G蛋白Gs的活化刺激了下游的腺苷酸環化酶活化和cAMP的生產,而Gi偶聯的受體則抑制cAMP的生產。cAMP生產的一個關鍵結果是蛋白酶A的活化。Gq偶聯的受體刺激磷脂酶C,釋放IP3和二酰基甘油。IP3結合ER中的受體,引起胞內鈣釋放,結果活化了蛋白激酶C、鈣調蛋白依賴性途徑。除了這些GPCR次級信使信號傳遞系統外,GPCR途徑還表現出與包括酪氨酸激酶生長因子受體和map激酶途徑在內的其它信號傳遞途徑的串話。受體酪氨酸激酶如EGF受體或粘著斑復合物(focal adhesion complex)的轉激活可通過銜接蛋白Shc、Grb2和Sos以及下游Map激酶活化的Erk1和Erk2來刺激ras活化。Src激酶還可在ras和map激酶途徑中通過GPCR起到必需的中間角色作用。
發生一些刺激事件而數據輸出沒有發生變化是可能的。這種情況仍舊是一種刺激事件,因為細胞的狀態已經以某些可能已導致定向物質再分布或導致細胞或細胞培養物發生變化的方式發生了改變。
應理解,可如本文所公開的測定任意檢測或任意細胞狀態的特定特征。本文公開了許多不同檢測的“特征”,但對于本文所實施的任意檢測,該檢測的“特征”可被測定。任意給定的檢測可存在一種以上的“特征”,而各特征都可如本文所述被測定。在采集生物傳感器輸出數據并考慮一個或多個參數后,可獲得給定檢測的信號。可能需要進行多個實驗,以鑒定最佳的特征,且也可能需要在不同條件下進行實驗,以找出最佳的特征,但這都是可以實現的。應 理解,本文所公開的任意方法可具有“鑒定”或“測定”或“提供”例如加給這些方法的特征的步驟。
(a)總體動態
可以考慮的一個參數是數據輸出的總動態學特征。該總動態學參數觀察數據收集的全部動力學圖像。可觀察的總動態學的一個方面是數據輸出隨時間而產生的曲線形狀的改變。因此,數據輸出產生的曲線形狀在發生刺激事件后可能變化或維持不便。
變化的方向表明整個物質分布;例如,正向DMR(P-DMR)階段表明在傳感器的攸逝波尾隨脈沖內的質量增加;凈-零DMR表明傳感器攸逝波尾隨脈沖內質量幾乎沒有凈值變化;而逆向DMR表明傳感器攸逝波尾隨脈沖內質量凈值降低。使用光學生物傳感器獲得的刺激誘導的細胞響應的總態可由單階段(P-DMR或N-DMR或凈-零DMR)、或兩階段(如兩個階段可以是這三個階段的任意組合)、或三階段、或多階段(如在時間過程中可出現一個以上N-DMR)組成。
(b)響應階段
可觀測到的作為時間的函數的另一參數是數據輸出中出現的階段變化。無標記生物傳感器產生可作圖(將是一曲線)的數據輸出。該曲線將在例如數據從增加狀態轉變為減少狀態或從減少轉變為增加的數據處具有拐點。這些變化稱為階段過渡,發生的時間以及它們的形狀可用作例如生物傳感器輸出參數。例如,存在正向物質再分布(P-DMR)、凈零定向物質再分布(net-zero DMR)和逆向物質再分布(N-DMR)。P-DMR、N-DMR和NZ-DMR的振幅可分別測量為生物傳感器輸出參數(例如可參見圖6A和圖7)。
(c)動力學
另一生物傳感器輸出參數可以是數據輸出的任意方面的動力學,例如,完成階段過渡的速率;例如,階段過渡多快能夠完成或數據輸出花費多長時間結束。可測量的動力學的另一例子是全部階段的數據輸出所花費的時間長度。另一例子是一個或兩個P-DMR和N-DMR階段的總持續時間。另一例子是獲取一個或兩個P-DMR和N-DMR階段的總振幅所需的速率或時間。另一例子是從P-DMR到N-DMR階段的過渡時間τ(圖6A,其它圖也提供了所有這些類型的動力學參 數的許多例子)。也可測量P-DMR和N-DMR事件或階段兩者的動力學。例如,用表皮生長因子(EGF)刺激人靜息態人表皮樣癌A431產生了由至少三個階段組成的動力學響應,如圖6A和7A所示。如圖6A和7A所證明,EGF濃度越高,P-DMR和N-DMR兩者的信號振幅越大,P-DMR和N-DMR事件也都越快,從P-DMR到N-DMR事件的過渡時間也越短。當P-DMR事件的振幅顯示與EGF濃度具有復雜的關系時,N-DMR信號的振幅清楚顯示對EGF濃度是可飽和的,產生~1.45nM的EC50(見圖7B)。發現以秒計的過渡時間τ隨著EGF濃度C的增加而指數性下降(見圖7C)。此外,N-DMR信號的衰減可用非線性回歸擬合。所獲得的單階段衰減常數κ也是可飽和的,產生5.76nM的Kd(見圖7D)。
(2)共振峰相關的參數
給定導向模式的共振峰是一類通過觀測例如光強度與光耦合到生物傳感器中的角度,或光強度與光耦合到生物傳感器中的波長而產生的數據輸出。光學波導光模式譜是一類觀測光強度與光耦合到傳感器中角度而產生的數據輸出,這是如下測得的:使用多種角度的光照射生物傳感器并監測作為角度函數的耦合光的強度。在此光譜中,多個導向模式的多個共振峰同時出現。由于共振峰和OWLS光譜所基于的原理相同,因此可交替使用給定導向模式的共振峰或多個導向模式的OWLS光譜。在生物傳感器中,當發生特定波長的光或產生了以特定角度撞擊生物傳感器的光時,從光源發出的光耦合到生物傳感器中,這種耦合增強了生物傳感器產生的信號。作為耦合光角度或波長的函數的這種強度變化被稱為共振峰(例如參見圖6B)。傳感器的不同給定模式可產生具有不同特征的類似共振峰。有大量的定義給定模式的共振峰或共振光譜的不同參數,這些參數與這種峰相關聯可用來評估DMR或細胞效應。下文討論和這些參數的一個亞組。
(a)峰位置
當繪制數據輸出圖時,在例如光耦合進入生物傳感器的特定波長或特定的入射角處出現共振峰的最高峰。由于應答刺激事件而發生的物質再分布或細胞事件的緣故,峰出現的角度或波長的位置可能發生改變。例如,在特定受體如EGF受體的潛在生長因子的存在下,培養細胞的共振峰的位置可增加或降低耦合的角度或耦合的波長,這將導致共振峰的中心位置發生改變。應理解,可測 量峰值強度的位置,而且這個位置也是個很好測量的點,也可測量該共振峰上的任意點的位置,例如測量75%峰值強度或50%峰值強度或25%峰值強度或66%峰值強度或45%峰值強度(應認為公開了1-100%峰值強度范圍內的所有水平的峰值強度)的位置。但是,當使用除峰值強度之外的一個點時,總會有一個在峰值強度之前和一個在峰值強度之后的例如45%峰值強度的位置。因此,對于任意強度,除了峰值強度之外,峰內總是會存在兩個該強度的位置。可使用這些非峰值強度的位置作為生物傳感器輸出參數,而人們僅需要知道該強度的位置是在峰值強度之前還是之后即可。
(b)強度
與共振峰特定強度的位置可用作生物傳感器輸出參數一樣,強度自身的量也可作為生物傳感器輸出參數。一個特別相關的強度是給定模式共振峰的最大強度。與位置一樣,最大強度的大小在對細胞或細胞培養物具有特定作用的刺激事件存在下可發生變化,且這種變化可可測量并用作特征。與共振峰值位置一樣,也可測量峰內任意強度或位置的共振峰強度。例如,最大強度的50%或最大強度的30%或最大強度的70%或最大強度的1-100%之間的任意百分數的強度可用作生物傳感器輸出參數。同樣地,與強度的位置類似,如果使用最大強度之外的強度,例如45%最大強度,在共振峰內也總會存在兩個此強度位置。與強度位置參數相同,可也使用非最大強度而僅需考慮該強度是最大強度之前還是之后的強度。
例如,原細胞覆蓋率約為50%(在~50%的覆蓋率,傳感器表面上的細胞往往產生最大PWHM值)時,抑制劑和活化劑的存在并培養后都會導致覆蓋率覆蓋率半最大值峰寬(PWHM)下降;但是,另一生物傳感器輸出數據,例如總角度變化(即共振峰中心位置)可用來區分是抑制劑,是活化劑還是根本沒有作用的分子。PWHM是峰上最大強度(高度)的一半處兩點之間的連線的長度,如圖6B所示。當所有傳感器上的細胞密度基本相同或近乎相同時,與細胞根本沒有被處理的傳感器相比,抑制劑(例如細胞增殖的抑制劑)引起的角度改變往往小于根本沒有處理的細胞的角度改變,而活化劑引起的角度改變則往往大于無處理細胞的改變。如果所有化合物的濃度都相同,則可通過它們對PWHM值的影響而確定它們抑制(作為抑制劑)或刺激(作為活化劑)細胞增殖的潛力或能力。結合共振峰中心位置的變化,PWHM變化的預定值可用于篩選出抑制 劑或活化劑。根據用于檢測給定模式的共振峰的訊問系統,PWHM值的單位可以不同。PWHM變化的程度可以是例如一千分之一、二千分之一、三千分之一、五千分之一、七千分之一、或萬分之一。
(c)峰形狀
可使用的另一生物傳感器輸出參數是整個峰的形狀或某些強度之間或某些強度處的峰的形狀。例如,最大峰強度一半處的峰的形狀或任意其它強度(如30%、40%、70%或88%,或20-100%之間的任意百分數)的峰形狀可用作生物傳感器輸出參數。該形狀可通過特定強度之下或之上的峰面積來表征。例如,在最大峰強度一半處有一個峰值強度之前的點和一個峰值強度之后的點。可在這兩個點之間畫條線,可確定共振峰內這條線之上的面積或共振峰內這條線之下的面積,形成生物傳感器輸出參數。應理解,給定峰的積分面積也可用來分析化合物對細胞的作用。
另一與性質相關的生物傳感器輸出參數是特定峰強度的共振峰寬度。例如,通過測量共振峰上峰值強度之前的50%峰值強度點峰值強度之后的50%峰值強度點之間連線的長度來確定最大峰強度一半處的共振峰寬度(HMPW)。然后可將該測量值用作生物傳感器輸出參數。應理解,可通過這種方式測定20%到100%峰值強度之間的任意強度的共振峰寬度。(這方面的實施例可見全部的附圖,例如圖6B)。
(3)涉及生物傳感器共振帶圖像的參數
迄今為止,大多數的光學生物傳感器監測靶分子與固定在傳感器表面上的探針分子之間的結合、傳感器表面上細胞附著或或細胞活力(一次一種監測)。對于多個生物傳感器上的結合事件或細胞附著或細胞活力,研究者通常在時間上依次監測這些事件。因此,很難進行不同傳感器之間的直接比較。此外,不論是波長訊問還是角度訊問,這些檢測系統都使用小光點(small spot)(~100-500μm直徑)激光來照射傳感器。響應或共振峰代表了照射區域細胞響應的平均值。對于96孔生物傳感器微板(如康寧的Epic微板),各RWG傳感器大約是3×3mm2,并位于各孔的底部,而對于384孔微板形式,傳感器的直徑通常為1×1mm2。因此,使用當前的傳感器技術獲得的響應僅代表少部分的傳感器表面。理想的是,檢測系統應不僅允許同時監測粘附在多個生物傳感器上 的活細胞的響應,還應允許來自各個傳感器上相對較大區域或多個區域的信號問詢。
通過成像光學訊問系統(如CCD照相機)獲得的共振帶是一類觀測例如單個傳感器上確定的位置處反射(如出耦合)光的強度與物理位置而獲得的數據輸出。將反射光直接與入偶合光相關聯。或者,可通過掃描訊問系統以使用小激光光點照射傳感器、以一維或二維掃描整個傳感器、然后收集給定導向模式的共振峰的方式收集共振帶。作為傳感器內位置的函數的共振峰或光強度最終可重新組合,形成傳感器的共振帶。在生物傳感器中,當出現光的特定波長,或當產生以特定角度撞擊生物傳感器的光時,出耦合(outcoupled)的光作為傳感器表面上/附近的折射率變化的函數而改變,這種改變導致成像系統采集的各傳感器的共振帶的特征發生改變。此外,使用共振帶可直接展示培養后細胞在整個傳感器表面上的不均勻附著(例如,見圖1所示的環狀共振帶)。在理想的多孔生物傳感器微板中,各傳感器的位置的相對關系便于與其它生物傳感器標準化(歸一化),即各傳感器依微板上各孔的中心行對齊、列對齊。因此,所獲得的共振帶圖像可用作細胞粘附或應答刺激的細胞變化的內部參考。因此,給定模式的各傳感器的這種共振帶提供了另額外與共振帶相關的參數以用來評估DMR或細胞作用。下文討論了這些參數的一個亞組。
(a)帶形狀
可使用的另一生物傳感器輸出參數是給定模式的各生物傳感器的共振帶的形狀。該形狀有各傳感器大面積上的強度分布來限定。如圖1和本文其它附圖所示,可使用該形狀指示大面積上附著細胞的均勻性或應答刺激的細胞變化(例如,如圖1所示,各共振帶代表~200mm×3000mm的整個傳感器的響應。
(b)位置
與給定模式的各傳感器的共振峰的位置類似,可將各共振帶的位置作為生物傳感器輸出參數。可使用成像軟件定量強度,以產生各帶最大強度的中心位置。該位置可用來檢測應答刺激或化合物處理的細胞變化。
(c)強度
與共振帶的位置一樣,使用成像系統采集的出耦合光的強度可作為生物傳 感器輸出參數。整個帶的平均強度或各成像帶中各像素的絕對強度可用來檢測細胞附著的質量和評估細胞響應。
(d)分布
采用成像系統采集的具有特定角度或波長的出耦合光的分布可作為生物傳感器輸出參數。此參數可用于評估沒有固定細胞或探針分子時傳感器自身的表面特征,并用于檢測傳感器表面整個照射面積上細胞附著的質量。此外,當整個區域的細胞密度相同時,此參數可用于檢測化合物對細胞的影響的一致性;或當在照射面積中一個區域的細胞密度不同于另一個區域的密度時,此參數可用于檢測細胞密度對化合物誘導的細胞響應的影響。
(e)寬度
與給定模式的共振峰的PWHM相同,使用成像系統獲得的共振帶的寬度可用作生物傳感器輸出參數。此參數具有幾乎與共振峰的PWHM值完全相同的特征及有用的信息內容,但與共振峰僅存在一個PWHM不同的是,人們可獲得該傳感器照射面積多個區域的多個帶寬。與采用共振帶圖像獲得的其它參數類似,該寬度可用于上述應用。
對于使用本文所公開的生物傳感器的任何細胞檢測的任何給定應用,所有這些參數可獨立或一起使用。參數以各種亞組合或組合形式的使用可為給定檢測或特定檢測的給定變化提供特征(如細胞受體檢測特征),以及為之后的基于EGF受體的檢測的特定特征。
b)細胞和細胞內容物操作
細胞是生物系統的基礎結構單元。因此,理解細胞對于理解亞細胞現象(如細胞生物學、生物化學和分子生物學)和多細胞現象(如生理學)是必需的。通過分析細胞,生物學家已認識到不同靶分子之間的許多復雜的功能性關系。靶分子可以是任意生物學分子,包括DNA、RNA、脂質體、蛋白質和碳水化合物等,以及這些分子的集合體。此外,生物學家也已知道使用細胞來理解基本細胞生物學原理和篩選治療人類疾病、提高人健康的藥物候選物的價值。
使用光學生物傳感器可分析細胞或將細胞用于分析。本質上,待分析的細胞可以是任意細胞類型。可在所公開的任一方法中分析任意類型的細胞。待分 析的細胞可直接獲得自生物體或體外培養的細胞。具有靶標的細胞可以是任意從生殖細胞系或體細胞系、全能或多能細胞、分裂或未分裂細胞、軟組織細胞或上皮細胞、無限增殖或轉化的細胞。迄今為止,已有許多現成穩定的無限增殖細胞系。這些穩定的細胞系衍生自許多不同的生物體、組織和發育階段。可從美國典型培養物保藏中心以及其它保藏中心獲得這一大類細胞的樣品。細胞通常包括所有至少部分被膜雙層結構所包圍并能復制和分裂成兩個或多個實體的生物體或其后代。
細胞的例子包括真核生物細胞,即具有細胞核的細胞,包括從動物、植物、真菌、酵母和原生動物的細胞;無核細胞或其突變衍生物或后代,如網織紅血球和成熟的紅血球等;其去核衍生物;以及前述任意細胞的融合細胞。此外,細胞可包括配子,如蛋、精子等。細胞還可包括原核生物,如細菌和結構菌(archactacteria)。
合適的細胞可來自任何合適的生物體,包括為了研究(如基礎的、臨床和生物技術研究)、藥物設計、藥物開發、和/或其它經濟、政治或人道主義理由而進行研究的任意生物體。示例性的生物體包括哺乳動物,如猿、貓、母牛、狗、馬、人、猴、小鼠、豬和綿羊等。示例性的生物體還包括非哺乳動物類脊椎動物,如鳥、爬行動物、兩棲動物(如青蛙,如爪蟾(Xenopus laevis)),和魚(如kout、鮭魚、金魚和斑馬魚)等。示例性的生物體還不堪非哺乳動物無脊椎動物,如果蠅物種(如D.melanogaster和D.simulans)、線蟲類(如C.elegans)、海膽類(如Strongylocentrotus purpuratus)和粘液菌類(如Dictyostelium discoideum)。示例性的生物體還不堪單細胞真核生物,如酵母(如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、畢赤酵母(Pichia pastoris)和白色念球菌(Candida albicans))和原生動物(如致病性或非致病性原生動物)。示例性生物體還包括植物,如擬南芥(Arabidopsis thaliana)、稻米、玉米、馬鈴薯、豆、火炬松以及非脈管植物。
合適的細胞可以是直接獲自野生型、突變型、轉基因、嵌合受精卵、桑椹胚、囊胚、胚胎、胎兒、新生兒、青少年、成年或任何生物體的其它發育階段的初級細胞(primary cell)。初級細胞可起源自不同的細胞類型、組織、器官或生物體的各區域,或可以是它們的混合物。例子包括血液干細胞、B-和T-淋巴細胞、紅血球、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、粒細胞、巨核 細胞、巨噬細胞、脂肪細胞、膠質細胞、星形細胞、成神經細胞、神經元、骨骼成肌細胞或肌小管。平滑肌成肌細胞、心臟成肌細胞、成纖維細胞、成骨細胞、骨細胞、內分泌細胞、外分泌細胞、內皮細胞、角化細胞、軟骨細胞、衍生自內胚層、中胚層或外胚層的細胞,和/或胚胎外衍生物,如滋養層。
合適的細胞可得自任何來源的一種或多種組織。組織通常包括生物體中臨時或穩定地空間上接近的各種細胞群體,或其培養的外植體。這種空間接近可天然發生和/或人工形成,可代表天然或正常的狀態和/或誘導的或患病狀態等。人工形成的接近可包括移植、植入的和/或移植的組織(包括器官或組織移植、異種移植物、同種異體移植物等)和從個體生物體內取出的組織,如皮膚移植物等。患病組織包括由于(1)遺傳缺陷;(2)環境損害,如污染物、毒素或輻射;(3)生長失控;(4)異常分化;(5)異常細胞遷移;(6)感染,如被病毒、細菌、原生動物、酵母、真菌和/或寄生蟲的感染;或(7)它們的任意組合而導致異常的組織。
適用于本發明的示例性患病組織是采用外科手術獲得的或從液體吸出物(針刺活組織檢查)獲得的腫瘤材料。組織可以是獲自野生型、突變型、轉基因、嵌合受精卵、桑椹胚、囊胚、胚胎、胎兒、新生兒、青少年或成年生物體的任意組織。合適的出生后組織例子包括(1)肌肉,包括心肌、平滑肌和骨骼肌;(2)獲自中樞神經系統或外周神經系統如脊髓或腦的神經組織;(3)其它心臟組織;(4)腎;(5)肝;(6)脾;消化系統的任意部分,包括食道、胃、小腸和大腸,和結腸;(a)胰腺;(9)膀胱;(10)循環系統組織,包括心臟、靜脈、動脈和造血系統的細胞;(11)免疫組織,如胸腺和淋巴結;(12)腎上腺;(13)骨;(14)軟骨;和(15)各種上皮組織,如乳房上皮等等。組織還包括上述各種組織的天然或人為的組合。
在將其用于光學生物傳感器之前,可將組織部分或完全分散成單個細胞,或者可將涂布在整個傳感器上或某些部分上。
本發明的一些應用適用于使用得自出生前或出生后的人或其它動物的細胞進行的臨床診斷。出生前細胞的例子包括得自羊水、卵裂球、絨毛膜絨毛、胎兒血和其它胎兒組織的細胞。出生后的細胞例子包括得自骨髓吸出的淋巴細液、全血、血清、血漿、胸腔積液、皮膚活檢組織、腫瘤活檢組織或外科手術的細胞。出生后細胞的其它例子包括得自體液和/或分泌物如尿、糞便、唾液、粘液、痰、眼淚、汗液、精液、脊髓液、乳液、唾液等的細胞,或從前述組織 獲得的細胞。
除從原代細胞和組織或其培養衍生物獲得外,合適的細胞還可得自已建立的細胞系。這些已建立的細胞系可采用任何合適的方法制備,包括病毒、致癌的、物理的、化學的、突變的、自發的和/或轉基因(kansgenic)轉化。此外,細胞可包括經合適方法改變的已建立的細胞系的已鑒定或未鑒定的衍生物,所述方法例如遺傳改造(如通過物理的和/或化學的處理、輻射、轉介(transaction)、傳染或注射)和外遺傳的修飾(如通過甲基化或其它分子修飾、kansposon功能、染色體印記、酵母雜交類型轉換和/或端粒沉默)。
細胞可以是干細胞或已分化細胞。已分化細胞類型包括脂肪細胞、成纖維細胞、肌細胞、心肌細胞、內皮細胞、神經元、神經膠質、血細胞、巨核細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、肥大細胞、白細胞、粒細胞、角化細胞、軟骨細胞、造骨細胞、破骨細胞、肝細胞、以及內分泌或外分泌腺的細胞。干細胞可以是最近從捐獻者獲得的干細胞,在某些優選實施例中,干細胞是自體干細胞。干細胞還可以得自已建立的體外繁殖的干細胞系。合適的干細胞包括胚胎干細胞和成人干細胞,不論是全能、多能還是較低發育能力的干細胞。干細胞優選得自哺乳動物的干細胞,如嚙齒動物(如小鼠或大鼠)、靈長類動物(如猴、黑猩猩或人)、豬和反芻動物(如母牛、綿羊和山羊)。
通常,根據其起源、基因型、無限增殖化方法、培養條件和曾經所在的環境,各細胞系具有不同的特征。因此,沒有一個細胞系適用于所有的實驗或化合物篩選。例如,特定靶標的表達水平在不同細胞類型中可能明顯不同;在一些例子中,通過特定靶標(如EGFR)的信號傳遞途徑在不同細胞類型中明顯不同。因此,可以看到,通過特定靶標產生效果的調節物可能產生極其不同的細胞響應(包括物質再分布)。由于某些原因,可能需要對特定類型的細胞進行遺傳再造從而使得特定靶標能夠被受控表達或減少或剔除,在一些情況下,可對特定的信號傳遞途徑進行干預。有許多現有技術可產生這種遺傳再造的細胞。例如,在轉染試劑或其它物理方法的幫助下,用靶基因或靶分子轉染可使特定靶標的表達水平增加,而用抗靶標抗體或反義、反靶標基因寡核苷酸及其衍生物,或肽抑制劑,或干擾RNA(RNAi)轉染細胞則可抑制靶標分子。此外,需要新的技術來確定依賴于細胞環境的細胞信號傳遞或細胞響應。受體酪氨酸激酶信號傳遞很好地闡述了細胞信號傳遞對細胞環境的依賴性。因應答RTK刺 激而在細胞表面產生的信號強烈依賴于細胞環境。當在不同的細胞或在特定細胞系的不同分化階段中表達時,相同的RTK將誘導完全不同的響應(見J.Schlessinger的綜述“受體酪氨酸激酶引起的細胞信號發出”(Cell signaling by receptor tyrosine kinases),Cell2000,103,211-225)。例如,在早期發育階段,FGFR1在控制細胞遷移(中胚層模式形成(patterning)和原胚層形成起關鍵作用的一個過程)等方面起到重要作用。另一方面,刺激成纖維細胞中的FGFR1將導致細胞增殖,而刺激神經元細胞中表達的FGFR1則誘導細胞生存和分化。對于這些觀察結果,最合理的解釋是不同細胞表達介導這些不同響應的細胞類型特異性效應蛋白和轉錄因子。根據這一觀點,RTK及其信號傳遞途徑能夠加入到多個過程中,從而在不同細胞環境中調節不同的效應蛋白和轉錄因子的活性。換言之,獲得了RTK活化的信號傳遞盒,用于應它們的激活,將信息由細胞表面傳遞到細胞核和其它細胞區室。
術語“培養”包括將細胞置于各種條件下。雖然“培養”細胞常常指使一個或多個細胞活著或生長,但在某些情況下,在一種或多種條件下培養細胞可實際上殺死一個或多個細胞。
c)一般方法步驟
進行本文公開的細胞檢測的一般方法可參見圖8。在此一般方法中,人們可提供無標記光學生物傳感器(801)。然后,直接將細胞培養在此生物傳感器上(802),直到獲得所需的覆蓋率(從1%到100%以及這兩個數值之間的各百分比的覆蓋率)。然后,任選地,可添加緩沖溶液(803)。還可將待測的化合物或組合物加到培養在生物傳感器上細胞中。這是一個刺激事件(804)。然后,使用本文所述的各種生物傳感器輸出參數,可訊問該生物傳感器,并收集數據,從而可監測細胞對刺激事件的響應(504)。
總的來說,在此公開的是使用無標記生物傳感器(如光學非標記依賴性檢測(LID)生物傳感器)實施基于活細胞的檢測,以監測粘附在該光學LID生物傳感器上的活細胞內物質再分布。總的來說,所公開的方法可包括大量的不同的步驟。例如,該方法可包括提供無標記光學生物傳感器,如光學LID生物傳感器。該方法一般還涉及在本文所討論的生物傳感器上培養細胞。細胞的培養通常在可覆蓋光學生物傳感器的細胞培養基中進行。在某些實施方式中,細胞可附著到生物傳感器的表面,就象它們附著到例如培養皿上一樣。當細胞培 養在生物傳感器上時,它們可生長到如本文所討論的任何覆蓋率,然后可對這些細胞實施各種檢測。例如,可將細胞與測試化合物或一組測試化合物或組合物(如調節物,如受體的激動劑或拮抗劑或信號轉導途徑的活化劑或抑制劑,或潛在的調節物、激動劑、拮抗劑、活化劑或抑制劑)一起培養,以測定這些化合物或組合物對細胞或對細胞內的特定靶標的影響。調節物可以是任何增強或降低特定事件的分子。激動劑是諸如化合物或組合物之類的分子,它以天然配體影響該受體的方式的相關方式影響該受體。通常,這會啟動該受體或將其活化。拮抗劑是一種分子(如化合物)或組合物,它以導致天然配體的作用減弱或消除的方式作用于受體。通常,拮抗劑是受體的抑制劑或阻遏物。應理解,有些激動劑在天然配體或配體類似物不存在的情況下起作用,而另一些則在配體或配體類似物的存在下起作用。例如,拮抗劑可以是天然配體的競爭性抑制劑,或者可以是非競爭性抑制劑。
在細胞培養過程中的任意時間點,可按照預先設定使用生物傳感器檢測細胞,例如提供特定光譜或特定角度的光。可以各種方法收集生物傳感器的輸出,包括時間依賴性方式。例如,可實施這樣的步驟:訊問光學LID生物傳感器以獲得指示活細胞內物質再分布的時間依賴性光學應答,由此可監測活細胞內激動劑誘導的GPCR活化。
可在各種方法實施過程中的任意時間點實施至少一次將緩沖溶液加到光學LID生物傳感器上的細胞培養基中的步驟。這些緩沖液可用來使培養基或生物傳感器或細胞穩定。通常根據調節物-靶標相互作用或刺激事件-靶標相互作用來選用緩沖液,以實現最佳的檢測結果。
還應理解,可采用這些方法來篩選調節(即活化或抑制)活細胞信號轉導途徑、調節特定細胞表面受體如GPCR或EGFR的分子。
還應理解,在某些實施方式中,可以平行或依次的方式進行用一種以上化合物的孵育。例如,可將一種生物傳感器-細胞培養物復合物與一種已知調節物一起培育,由此產生本文所述由一組參數的組成的特定特征,然后可將另一化合物或組合物與該生物傳感器-細胞-調節物混合物一起培育,通常在訊問后,通過尋找該生物傳感器的特征或其輸出數據的變化來確定該化合物對調節劑活性的影響。應理解,涉及化合物或緩沖液的所有步驟可以逐漸增量的方式進行,以找出組合物的濃度對生物傳感器輸出的影響。
可使用本文所述的各種生物傳感器實施這些方法,但可將一特定生物傳感 器制成自參考的生物傳感器,這種生物傳感器是一種不僅能夠收集細胞檢測的輸出數據,而且還能夠收集相對于從該生物傳感器上收集到的數據的對照數據。這可通過許多方式實現,包括使用阻止培養細胞附著的粘貼物(stamp)封閉光學LID生物傳感器的一部分表面,然后將包含在細胞培養基中的活細胞加到該光學LID生物傳感器上未被封閉的那部分表面,使活細胞能夠附著到這部分未被封閉的表面;然后從該光學LID生物傳感器表面上移除所述粘貼物。
自參考方法的一個變化形式是在第一次培養的細胞已粘附到生物傳感器之后移除該粘貼物,然后將加入第二細胞培養基,以在生物傳感器上之前被粘貼物所保護的位置上產生第二細胞培養物。第二種細胞可以是不同類型的細胞,或可以是相同類型但處于不同階段的細胞等,但第二種細胞的培養與第一種細胞不相關。應理解,有多少粘貼物,這樣的操作就可以進行多少次。因此,例如,如果在生物傳感器上已使用了四個分開的粘貼物,那么如果依次去除這些粘貼物并依次向該傳感器添加另一細胞種群的話,則最多可在該生物傳感器上獲得5種細胞培養物。自參考方法和系統可減少或消除對環境溫度、壓力波動和其它環境變化的不利的敏感性,且能提供關于特定靶標或細胞類型的確認信息。
應理解,不僅能夠分析多種化合物對不同細胞類型的影響以及單個化合物對不同細胞類型的影響,還可以分析例如具有不同受體的細胞以及它們是如何被調節的,并將其相互比較。還可以通過提供具有多個生物傳感器的設備如具有不同生物傳感器的室來實現多元化。
還應理解,如果例如生物傳感器上培養的不同細胞中存在多種不同的受體,則可提供特異性的分子,如特異性拮抗劑,然后例如可測試一種或多種化合物。這類方法將提供關于例如哪種受體拮抗劑受到哪種化合物影響的信息。
公開了系統,該系統包括:訊問系統;和光學非標記依賴性檢測(LID)生物傳感器;其中所述訊問系統向所述光學LID生物傳感器發出光束,并接收來自所述光學LID生物傳感器的光束,該訊問系統由此能夠監測該光學LID生物傳感器表面上的活細胞內的物質再分布。
還公開了這樣的系統,其中所述訊問系統還能夠在實施了以下步驟后監測活細胞內的細胞調節,如激動劑誘導的G蛋白偶聯受體(GPCR)活化:提供光學LID生物傳感器;將包含于細胞培養基中的活細胞覆蓋到該光學LID生物傳感器上以使細胞能夠附著到該光學LID生物傳感器的表面;施加含有化合物的 溶液到光學LID生物傳感器表面上的細胞培養基中;訊問該光學LID生物傳感器,獲得時間依賴性光學響應,該響應指示活細胞的物質再分布,使得人們能控制活細胞內激動劑誘導的GPCR活化導致的物質再分布。還公開的是包括向光學LID生物傳感器溶液表面上的細胞介質施加至少一次緩沖溶液的系統。
應理解,本文所討論的任意方法步驟可用于實施這些步驟的系統。
還應理解,可實時監測光學輸出信號,但時間間隔不同(例如,1秒、3秒、5秒、10秒、15秒、30秒、60秒、2分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘、2小時、5小時、10小時、24小時)。
還應理解,在將化合物加到細胞中之前和之后,檢測過程中僅測量兩個點。分析光學輸出參數的不同。
d)細胞增殖檢測中生物傳感器的應用
表征促進或阻滯細胞阻滯的試劑是細胞生物學和藥物開發研究中極其重要的領域。過去已采用了幾種方法。錐蟲藍染色是評價作為細胞存活的指示的細胞膜完整性的一個簡單方法,但該方法需要在顯微鏡下計算死亡細胞的數量,且不能用于高通量篩選。許多細胞增殖檢測要么通過在增殖(即細胞分裂)期間加入3H-胸苷或5-溴-2’-脫氧尿苷(BrdU,胸苷類似物)到細胞中,要么通過測量裂解細胞的總核酸或蛋白含量來估算細胞的數量。將5-溴-2’-脫氧尿苷加到新合成的DNA中使得可使用熒光標記的抗-BrdU抗體或某些核酸染色(如Hoechst33342、TO-PRO-3和LDS751)間接檢測快速增殖的細胞,從而促進已在BrdU標記期間經歷了細胞周期的S-期的細胞的鑒別。另一最常見的檢測是MTT細胞增殖檢測。比色MTT檢測以黃色四唑鹽(MTT)轉換成不溶的紫色甲晶體為基礎,由僅在活著的和存在代謝活動的細胞中起作用的細胞線粒體脫氫酶的還原作用實現該轉換。將細胞與MTT試劑培養大約2-4小時后,將去污劑溶液加到細胞中,使有顏色的甲晶體增溶。使用平板閱讀器在570nm波長下讀取樣品。所產生的顏色的量與存活的細胞數量直接成正比。活細胞數量的擴大導致線粒體脫氫酶活性增加,結果導致形成的甲染料的量增加。
之前的檢測類型很費時,因為它們需要長時間的培養步驟。例如,許多常規的基于BrdU的方案需要DNA變性,以使抗BrdU抗體能夠接近BrdU表位。DNA變性通常通過加熱(>90℃)或用酸(2–4M HCl)來實現。這種苛刻的 處理通常使多參數分析難以實施,因為其它的細胞結構和抗原在這種處理過程中也難以保存。此外,這些常規檢測可用于檢測某些細胞類型;不同細胞類型需要不同的培養方案,以獲得最佳的檢測結果。
e)高通量篩選的特征
公開了適用于高通量篩選調節或影響細胞或細胞增殖或細胞死亡中的一個或多個信號傳遞途徑的化合物的方法。這些高通量方法基于這樣的理解:即可如本文所討論,使用多種不同參數評估生物傳感器輸出數據。如本文所討論的,特定細胞或細胞內特定受體或特定細胞事件如死亡、增殖或信號發出途徑的調節可具有特定的特征。這種特征可有本文所述的一種或多種生物傳感器輸出參數組成。重要的是,對于高通量方法,在方法進行期間有這樣一個時間點,在該時間點采集到的生物傳感器輸出參數數據是細胞狀態表征,所述狀態例如即信號傳遞途徑已被激活或滅火或細胞已死亡或細胞正在增殖。此時間點可以是這樣一個時刻,此時有一組生物傳感器輸出參數可用來定義所述特征。
可在例如具有許多生物傳感器的設備(如達49孔,或96孔或更多)中采用高通量方法。還應理解,可具有生物傳感器輸出參數事件的這些方法收集1小時、30分鐘、12分鐘、11分鐘、10分鐘、9分鐘、8分鐘、7分鐘、6分鐘、5分鐘、4分鐘、3分鐘、2分鐘、1分鐘、59秒或59秒內或各秒內到1秒內的生物傳感器上細胞培養物的刺激事件。還優選的是,所有整板的生物傳感器的信息收集也在這些時間內完成,但這不是必須的。
除了與數據收集持續時間和平行檢測的樣品數量相關的特征之外,使用本文所公開的方法和系統的數據分析或所得結果的集合展現可以是,例如,可就地收集和呈現的共振帶圖像和預定的時間點。
(1)細胞覆蓋率
對于本文公開的這些方法,尤其是高通量篩選,它們的一個關鍵性參數是所使用的起始細胞的數量。起始細胞的數量應當在一個臨界范圍內,這樣,正常培養條件下波導基底上所產生的細胞密度可使人們能夠檢測細胞數量的變化,包括增加和減少。應理解,細胞密度越大,生物傳感器產生的輸出信號越多,因為平板上存在越多的細胞,則在任意給定事件如刺激事件后所測得的DMR事件也越多。因此,細胞的數量可改變例如共振峰的特征(如強度、PWHM、形 狀和/或位置),和/或共振帶圖像的特征(如帶形狀、寬度、強度、分布和/或位置),和/或DMR事件的幅度(如P-DMR和/或N-DMR)。例如,覆蓋率可以是30-100%、30-70%、40-60%、45-55%或約50%,但是,覆蓋率可以是30-100%之間的任意百分數,例如38、57、63、88、75、95或99%。對于不同的應用,可改變優選的覆蓋率,以獲得最佳的性能。例如,對于細胞增殖檢測,通常,優選的覆蓋率是約50%,但不同細胞類型或不同檢測的覆蓋率可稍微不同。在這些條件下,正常條件下培養的細胞的PWHM接近最大值,這樣可結合相同時間角度/波長改變或共振峰/帶位置測評干擾細胞增殖的調節物,不管該調節物對細胞增殖是促進劑還是抑制劑。在此,兩種調節劑都導致PWHM下降,但是與未處理的細胞相比,促進劑加大了角度變化,而抑制劑則減小角度變化。對于受體檢測或其它涉及細胞信號發出和網絡相互作用的應用,細胞的覆蓋率可在30%到~99%范圍內變化,取決于將監測的細胞事件。例如,對于細胞凋亡研究,細胞覆蓋率可以為~10%到~99%。對于GPCR篩選或EGFR篩選,細胞覆蓋率優選在50%到~99%的范圍內。
(a)對細胞增殖的干擾
本發明方法可用整板的探測在短時間,例如在60秒,50秒,40秒,30秒,20秒,10秒內或每秒至1秒內影響細胞增殖的化合物。在一個實施例中,揭示了檢測化合物影響細胞增殖的效果的方法,包括:(a)提供第一和第二無標記光學生物傳感器;(b)在所述第一傳感器上放置特定接種數量的細胞,這樣,在細胞生長條件下經最佳培養,附著的細胞達到理想的覆蓋率(confluency);(c)將相同與接種數量的相同細胞放置在含特定濃度本發明化合物的所述培養基中;(d)在相同條件下培養細胞至所述第一傳感器的細胞密度達到理想密度;(e)用光學查詢(interrogation)系統收集光輸出參數。理想密度優選為40%-70%;特別優選為45%-55%。光查詢系統優選平行查詢系統或掃描查詢系統。另一方面揭示了作為抑制劑或活化劑的化合物,它們影響特定類型細胞增殖速度,得到不同數量的附著于傳感器的細胞。所附細胞密度的不同引起不同的光學波導光模光譜。根據角度改變(angular shift)和PWMH兩個參數,可以區分抑制劑和催化劑。
f)生物傳感器在細胞毒性篩選中的應用
藥物發現已經成為工業化過程,針對作用于選定靶點的活性在大量化合物庫中進行篩選。這些初級篩選出的大量活性化合物形成了藥物發展的一個瓶頸。第一輪的中標者經常不能滿足人類治療學要求的安全和功效標準,因此需要后續的優化篩選,指導獲得可用于人的產品。優化需要化驗吸收,分布,新陳代謝,排出(排泄),和毒性特征,即(ADME/Tox)。ADME/Tox篩選,目前占據30億美元的市場份額,由于大部分首選化合物(lead compound)和藥物因毒性而無法通過,它在藥物發現和發展背景中成為主角。開發過程中,新藥總數的30%因毒性和副作用而被廢棄。ADME/Tox篩選本可以阻止幾種市售或處方藥引起的死亡(Zechnich,A.D.et al。(1994)West.J.Med.160,321-5)。鑒于目前市場上安全抗組胺劑的數量和藥物學家對早期ADME/Tox篩選中越來越多的關注,上述意料之外的毒性提供了一個很好的案例教學。由于大部分首選化合物和藥物因毒性被廢,ADME/Tox篩選在藥物發現和發展背景中成為主角。化合物庫包含的化合物有一系列積極和消極作用,這種假設是ADME/Tox篩選的基礎。其中候選藥物的有益特點包括高特異性,低毒性,好的口服吸收和半衰期。早期高通量ADME/Tox篩選的目的是在早期開發過程中從毒性方面區分“好的”和“壞的”化合物。藥物篩選過程中的問題的早發現(identification of problems)為目前的制藥工業提供了一個極大的成本節約機會。
ADME/Tox篩選是通常用于描述測試腸道吸收,在器官的分布,肝臟新陳代謝,腎臟排泄和毒性特征等化合物性質的成套測試的術語。ADME/Tox篩選通常在藥物開發過程的晚期開展,-在發現”中標化合物”的初期階段之后的過程的絕對后期。當藥物開發目標數量少,且制藥企業間高通量篩選化驗點的較少時,這種設定是可行的。隨著藥物發現空間規范的變化,藥物靶點數量和高通量篩選化驗點增加了。因此,業界迫切希望能夠快速有效的優選(triage)或確定可能無法通過ADME和毒性篩選的“潛在中標者”。這樣,ADME/Tox篩選需要在藥物發現和發展過程中較早階段進行,例如初次篩選(高通量篩選)和次級篩選。此外,預測藥物吸收,毒性和生理效果的集成方法(integrated approach)將非常有助于藥物發現和發展過程。
(1)實時監測化合物吸收,分配和毒性
ADME/Tox篩選包括測試關于腸道吸收,器官分布,肝臟代謝,腎臟排泄和毒 性特征的化合物性質。傳統HTS篩選中與化合物吸收和毒性相關的信息一般被放棄或缺失;另外,化合物吸收和毒性引起的效應會使數據分析復雜化。不斷增多的高容量篩選技術的應用開始將毒性篩選和功能性篩選直接相連。
所揭示的成分,方法和技術的一方面是為了消除目前ADME/Tox篩選和采用以無標記光學傳感器進行的細胞實驗進行的功能篩選之間的斷口。
在一個實施例中,公開了實時監測細胞吸附和毒性的方法,包括:(a)提供基于光學的無標記生物傳感器;(b)放置包含在培養基中的細胞,其中該細胞附著到該生物傳感器的表面上;(c)將含有化合物的溶液施用到細胞培養基中;(d)監測培養在該生物傳感器上的細胞的響應。所公開的方法的特征還包括(c)任選地給該細胞介質施加至少一次緩沖溶液。此外,所公開的方法還可在分析中加入本文所討論的一個以上生物傳感器輸出參數。實際上,可實施使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15或更多個生物傳感器輸出參數的方法,且在某些實施例中,可能需要使用一個以上參數來精確獲得例如檢測或細胞狀態的特征。此外,在某些實施方式中,該特征的生物傳感器數據輸出參數可在刺激事件或生物傳感器事件輸出收集后少于1小時、50分鐘、40分鐘、25分鐘、10分鐘、9分鐘、8分鐘、7分鐘、6分鐘、5分鐘、4分鐘、3分鐘、2分鐘、1分鐘、59秒或59秒內的各秒到1秒內出現。
g)用生物傳感器監測細胞活性
公開了與無標記光學生物傳感器(包括基于波導光柵的生物傳感器)領域相關的組合物、方法和技術。公開的組合物、方法和技術還與基于細胞的試驗領域相關。因為可用的傳感器的穿透深度小以及攸逝波的特性,只有發生在鄰近傳感器表面處的細胞粘附層中刺激誘導的DMR導致有效折射指數的改變,這種改變繼而造成從傳感器中發出的折射光的角度改變。可檢測這種角度改變以獲得DMR響應信號的動力學。此外,正因如此,不同的細胞響應對總物質再分布信號的影響也不同。例如,細胞脫離細胞外基質發生在傳感器表面處或其附近,因此比發生在細胞內部產生的響應大得多。公開了利用光學生物傳感器基于傳感器的傳感體積內質量的再分布來檢測細胞活性和化合物-/刺激物-誘導的細胞變化的方法。例如,公開的組合物、方法和技術與以下用途和方法有關:利用基于光學的生物傳感器監測配體與受體酪氨酸激酶(RTKs)的結合以及相 繼的(sequential)信號傳遞事件,包括信號內化、實時分子運動或細胞內的組裝、和/或細胞骨架重構和細胞形態變化。公開了篩選可在活細胞中干涉這些信號傳遞事件之一的化合物或調節劑的方法。
本發明利用基于光學的生物傳感器(包括基于波導的生物傳感器)監測或研究配體與受體酪氨酸激酶(RTKs)(一個細胞表面受體家族)的結合以及活細胞中的幾種相繼信號傳遞事件。公開了篩選有可能干涉這些信號傳遞事件(例如,結合、相繼的磷酸化、內化/細胞骨架重構和細胞解吸附)的化合物或調節劑的方法。在另一種實施方式中,公開了確認一種化合物針對活細胞中一種特定受體的生理或藥理作用的方法。
公開了用于化合物篩選和表征(profiling)的、基于細胞的、實時和無標記的功能性受體酪氨酸激酶檢測方法。公開的方法允許人們同時研究受體信號傳遞途徑中三種主要事件的動力學:配體結合、磷酸化和內化/細胞骨架重構。根據本發明的方法還可用于篩選可干涉這些信號傳遞事件的化合物或對其進行分類。在又一種實施方式中,公開了基于(調節劑)獨特的特性(如光學輸出參數所定義的)來篩選信號途徑中多個靶標的調節劑的方法,所述調節劑干擾檢測到的DMR信號。
已證明EGF受體系統的計算機模型在理解受體途徑不同部分的復雜相互作用中非常有用。然而,對于細胞內的這些信號傳遞和運輸的動力學的直接檢測,現在只有有限的試驗數據。缺少對信號傳遞事件動力學的直接檢測限制了對這些模型的驗證。因此,需要可同時研究細胞信號傳遞事件的方法和技術以進一步理解EGFR信號傳遞。
(1)物質再分布監測
如此處所公開的,可實時監測化合物在接近細胞-傳感器界面的某個鋪滿度的細胞層的吸收、分布和毒性。因為基于光學的生物傳感器固有的有限穿透傳感特性(50-500nM)(即,傳感體積),該體積內發生的傳感器可感知的物質再分布導致響應變化,這種變化可被觀察為折射光束中角度或光譜的變化。這種傳感器響應可被記錄為時間的函數和溶液組成變化。以這種方式,可分析導致在傳感體積內的物質再分布的任何刺激事件的動力學或由刺激事件引起的效果。應理解,待檢測細胞的鋪滿度對高靈敏度檢測很重要。對本文所述的光學檢測,所需的靈敏度越高,所允許的細胞鋪滿度越重要。對于刺激事 件誘導的物質再分布監測,細胞鋪滿度優選在30-100%范圍內。或者可為70-99%。本文公開的方法應用于不同用途時(細胞增殖、化合物毒性、細胞凋亡、化合物吸收和代謝、細胞信號傳遞途徑激活、細胞形態變化、細胞解吸附和運動、受體和靶標(分子組裝)活化和運動,等)可能需要不同的細胞覆蓋率(即細胞密度)以獲得最佳試驗結果。另外,不同的細胞類型和不同的靶/信號傳遞途徑活化可能需要不同的細胞覆蓋率以獲得最佳的細胞響應和功能。應理解這種覆蓋率不限制試驗步驟或方法。
h)細胞組分和生物傳感器
生物細胞,如圖9的示意圖中所示,是復雜的結構,其組分的大小在納米到幾十微米范圍內。細胞,如圖10所示的1008,通常有含有各種細胞器的細胞質(通常在5-30μM范圍內)。通常,最大的細胞器是細胞核,其范圍可在3-10μm。核含有DNA、RNA、蛋白質和核酸-蛋白質復合體,如DNA-蛋白質或RNA-蛋白質復合物。一種很重要的DNA-蛋白質復合物是染色體。線粒體是由一系列折疊的膜(大小通常在0.5-1.5μm范圍內)組成的小細胞器。其它細胞組分包括例如內質網(ER)(通常0.2-1μm)、溶酶體(通常0.2-0.5μm)、過氧化物酶體(通常0.2-0.5μm)、內含體(通常約100nm)和高爾基體。活細胞,例如1008,是高度動態的,大多數細胞器在細胞內廣泛運動。例如,微管可在很長距離內運輸細胞器。刺激物可導致密集的細胞器在培養細胞(如1008)的傳感器表面(如1010)的恰好邊緣處做亞微米運動;這種運動導致細胞(如1008)內物質再分布,如1006。物質再分布(如1006)可被光學生物傳感器(如1014)待測;與物質再分布(如1006)有關的信號稱為定向物質再分布(DMR)信號。由于的生物傳感器(如光學LID傳感器1014)傳播的作為瞬逝電磁場的電磁場可伸入周圍介質(例如貼壁細胞1008)的范圍有限(幾十到幾百納米),在某些情況下,只可檢測到一部分物質再分布(如1006),因為穿透深度不足以穿透整個細胞或多個細胞(例如在細胞層中)。電磁場可延伸的具體稱為穿透深度或傳感體積。某些情況下,只可檢測與生物傳感器表面(如1010)一定距離內的下層貼壁細胞。
(例如)當分泌型細胞器占據其位于質膜下的對接位點,或質膜處的細胞內小泡到達其細胞溶質中的加工位置時,可發生細胞運輸。在任一方向上,細胞器通常必須穿透質膜下所謂的肌動蛋白皮層,一種達幾百納米厚的肌動蛋白 絲密集網狀組織。肌動蛋白絲總是組裝和分解,因此這種網狀組織是動態的,可透過細胞器。調控組裝和分解的控制機制也調控肌動蛋白皮層的可透過性。
胞泌小泡可將受體插入到質膜中并將配體釋放到胞外空間。胞內小泡攜帶已結合配體的受體至內部加工位置。質膜穴樣凹陷是質膜結合的載體,猜測其在細胞信號傳遞中發揮作用。脂類伐被認為作為小漂浮島位于質膜中,在脂類伐中選擇性的膜蛋白私下交換信號。最后,如本文公開的,膜受體是相同的。它們可嵌在大分子復合物中,這些復合物不停募集和釋放下游效應器分子。
細胞組分或細胞外刺激物的運輸不僅發生在質膜處,還通過信號傳遞發生在細胞內和多個細胞內區室和細胞器中。這些事件包括(1)蛋白質靶標或底物向核、膜、細胞溶質,通過再循環途徑,至或自其它細胞器,從胞外空間攝取(配體結合、基因轉染、傳染和蛋白質遞送)募集;(2)各種功能性區室內新合成的細胞內組分在確定的微環境內以及介導的釋放位置的再分布。這些細胞事件可導致在信號傳遞循環中某些時間發生定向物質再分布。
(3)細胞監測的多種穿透深度
大多數或所有細胞區室是高度動態的,在毫秒至分鐘的時間范圍內發揮功能,有時在發揮功能后迅速分散。為了觀察由單個細胞器和信號傳遞復合物介導的信號傳遞事件,通常需要體內方法使單個細胞器顯影、檢測少數分子并在時間和空間上以高解析度報告它們的功能。熒光顯微術是迄今為止的一個很自然的選擇,因為一些細胞器可被染料特異性染色,并且越來越多的蛋白已與熒光蛋白例如綠色熒光蛋白(GFP)偶聯而不影響其功能。然而,很多質膜事件涉及與瞬時募集到質膜上的胞質蛋白的相互作用。因為即使當共聚焦顯微鏡聚焦于質膜時可觀察到細胞內將近半微米的深度,這些和更經典的熒光顯微鏡顯示出來自細胞溶質的強“背景”熒光,使來自靠近質膜的微小結構或分子組件的較弱熒光變得模糊。
經刺激,活細胞可經歷非常多的細胞事件,包括但不限于,配體/化合物結合到受體或細胞內靶標,細胞組分的運動和移位,細胞信號傳遞分子的相互作用,細胞器或分子組件的活性改變甚至移動,第二信使的產生,細胞骨架重構和甚至顯著的細胞形態變化。例如,GPCR參與一系列的細胞信號傳遞途徑。配體結合啟動一系列細胞內和細胞信號傳遞事件,包括受體構象變化,受體寡聚化,G蛋白活化(GDP-GTP在Gα亞單位上互換,Gα和Gβγ解離,G蛋白與受 體分離,產生Gα-和Gβγ信號傳遞復合物),和導致產生第二信使(Ca2+移動,產生肌醇三磷酸,和/或細胞內cAMP水平的調節)并最終導致具體基因表達變化的下游信號傳遞活化。配體介導的GPCR活化還導致GPCR從細胞表面脫敏、很多細胞內蛋白的運輸,以及靶細胞的表型、形態和物理特性的變化。這些變化可以是靜態的、長久的或動態的(例如,循環或擺動)。不同的信號傳遞事件顯示出顯著不同的動力學,從毫秒(例如GPCR構象變化)至幾十秒(例如Ca2+流)至甚至幾十分鐘(例如基因表達或形態變化)。雖然它們的特征(例如動力學)不同,這些事件可導致物質再分布。而且,用光學生物傳感器獲得的光學輸出參數一般代表大量細胞事件的總體平均響應,不同的細胞事件對總輸出參數的貢獻不同。細胞總的DMR響應對穿透深度的依賴將是何處和何時發生DMR信號的極為有用的指示。
如上所述,光學生物傳感器,依賴于傳感器結構和性質,在表層介質產生有限的穿透深度(通常50-500nm),并且只可檢測高(tall)細胞(直徑約10微米)或細菌(直徑約1微米)的底層部分。因此,檢測質量主要與生物體和表面的接觸區、近質膜區和傳感器表面附近發生的形態變化有關。為了探測與質膜相距較遠的細胞內不同區室或細胞器的運動或活性、或整個生物體的折射率,需要將穿透深度延伸到(能夠檢測)這些變化。圖11顯示了依賴于穿透深度的傳感器攸逝波的行為。它強調了穿透深度對細胞監測的重要性。因為光學輸出信號或參數是對刺激誘導的細胞響應的一種整合的(intergrated)和代表性讀數,多種細胞事件如受體胞吞或靶復合物移動或細胞形態變化或細胞解吸附或移動對用光學生物傳感器獲得的總體響應的貢獻可能不同。這些事件可發生在與傳感器表面相關的不同位置。因此,通過利用多種穿透深度來監測由同一種刺激事件誘導的細胞響應,可了解各事件對總體響應的貢獻,并因此了解細胞響應的機制。
公開了可用于監測響應于刺激(而產生)的細胞DMR信號的方法。在一種實施方式中,該方法包括傳感器的不同模式以檢測特定細胞類型響應于具體刺激(而產生)的總DMR信號。傳感器的不同給定模式產生靈敏度不同的不同穿透深度(例如,TM0模式傾向于比TE0模式產生更長的穿透厚度,例如對于給定的傳感器TM0模式的穿透深度為120nm,對于同一傳感器TE0模式約為90nm)。在另一種實施方式中,公開的方法可將具有不同波導和光柵結構及性質并產生不同穿透深度的至少兩種生物傳感器用于給定的模式以檢測細胞的總DMR信 號。在另一種實施方式中,公開的方法可用傳統的對稱和反相對稱波導光柵生物傳感器來檢測細胞的總DMR信號。運輸信號或定向物質再分布(DMR)信號對穿透深度的靈敏度可用作特征(signature)來鑒定特定的細胞運輸事件。本發明方法包括對生物傳感器構型和結構的修飾,或對具體波導傳感器的穿透深度進行“細調”,提供了以高靈敏度和細胞內區室特異性監測或檢測具體細胞運輸事件的有用手段。具體說,應用具有不同穿透深度的多個傳感器可描述各細胞DMR或運輸事件的特征標記。對于具體的運輸或DMR事件,本發明允許人們以更高的Z-軸空間解析度和更高的靈敏度監測或檢測該事件。
(4)用光學生物傳感器進行多路(multiplexed)細胞試驗
標準的篩選方法,一次檢測一種靶標,已成功用于鑒別有效的藥物候選物。然而,產生的關于化合物選擇性的信息非常之少。當前,在藥物開發過程的下游進行選擇性研究;由于不良結合在該階段排除一些化合物,使藥物開發過程費錢費時。需要平行檢測化合物對多個靶標的活性的多靶標篩選以在藥物開發過程的早期解決化合物選擇性的問題。基于這些考慮,以及靶標鑒定腳步的加快和化合物文庫的擴充,需要可進行多靶標篩選的新技術。
公開了可進行多靶標和多細胞篩選的方法。一種實施方式中,本發明方法利用整合的光學輸出參數作為針對多類靶標或同類靶標的多個家族成員篩選化合物的手段。例如,EGF介導的通過EGFR的人A431細胞Ras/MAPK途徑的活化產生獨特的DMR特征;多類靶標包括EGFR、Src激酶、MEK1/2、地那明和肌動蛋白絲在總DMR特征中發揮不同作用。此外,在另一個例子中,在A431細胞中,Ras/MAPK途徑的活化可通過幾個GPCR激動劑誘導的EGFR轉活介導,導致與EGF誘導的響應類似的DMR特征;因此,可篩選和檢測GPCR類靶標的多個家族成員。
另一種實施方式中,本發明公開了在單個傳感器的不同區域上順序培養至少兩種類型細胞的方法,這些細胞可用于用光學生物傳感器進行的多路細胞試驗。所述細胞可以是不同類型的細胞,或生理相關的、或疾病相關的、或病理相關的。細胞也可以起源于同類型的細胞,或未修飾的,或經遺傳再工程化或類似的在工程化,如敲除或抑制或過度表達特定的感興趣靶標的細胞。例如,可用中國倉鼠卵巢(CHO)細胞和經再工程化的CHO細胞。如圖12所示,可提供生物傳感器(1201),然后可物理隔離(block)該生物傳感器的一部分(1202), 從而即使將細胞放置在該生物傳感器上,細胞也不會在該部分生物傳感器上生長。然后可將A細胞類型的細胞培養基放置在未隔離區域(1203)并允許其在上面生長。然后不再隔離生物傳感器上被隔離的區域,可施加第二種細胞,例如細胞類型B的培養基,從而細胞類型B在曾經被隔離的區域生長(805)。然后可提供含有能夠產生刺激事件的分子的溶液(1206)。然后運行該生物傳感器,從兩個區域(起初未隔離的區域和曾被隔離的區域)收集數據并比較。可通過放置橡皮圖章(rubber stamp)覆蓋一部分傳感器來實現隔離,或通過放置具有給定數目的柱形結構(posts或columns)的蓋板來實現隔離。柱形結構的末端可由軟材料如橡膠制成的末端組成,從而當柱形結構的末端接觸部分傳感器表面時不會破壞傳感器的性質或對其不利。柱形結構的數目和位置與給定傳感器微板的形式相適應。或者,可將一個裝置放入傳感器微量滴定板中來實現隔離,從而各傳感器可被分為至少兩個區室。例如,所述裝置可以是具有給定數目微柱體的蓋板;在各柱體(或總柱體)末端可具有撓性材料如聚合物制成的薄壁(通常1mm)。一旦將柱體置入各孔中,微柱體的底部接觸傳感器的中心區域,兩邊均接觸各孔的內壁。蓋板優選含有給定數目的流體通道;各通道與各微柱體或部分微柱體連接。
在又一實施方式中,公開了利用物理上分離的多個生物傳感器的方法,各生物傳感器可用于容納一種類型的細胞。最初的細胞貼壁之后,可將通用培養基加到含有多個生物傳感器的小室中。如圖13和14所示的方法提供所公開方法的一種改進形式,此改進與生物傳感器位于小室(例如微板的孔)中具體的位點有關。如果采用含有多孔微量滴定板(各孔中有多個區室,各區室有生物傳感器)的裝置,則可將不同類型的細胞置于各個不同小室中,允許對各孔或生物傳感器分析不同的細胞或條件設置(1302)。然后可任選將通用培養基放入各孔以覆蓋所有生物傳感器,或各區室可用不同介質,所公開的這兩種方式可任意組合(1303)。溶液1303可含有標記物,如可產生刺激事件的分子,或可施加含有可產生刺激事件的一種或多種分子的第二溶液(1304)。然后可監測并詢問生物傳感器(一個或多個),收集并比較各區室或傳感器產生的結果。在一種具體實施方式中,本發明提供一種獨特類型的生物傳感器微量滴定板,如圖14所示的例子,一種嵌有光學生物傳感器的多區室多孔微量滴定板,其中各孔中含有四個區室,各區室可具有嵌入的一種波導光柵基材。各區室可用于容納單一類型的細胞。可用內壁分隔四個區室,內壁高度(優選在100微 米和2毫米之間)通常比各孔高度(任何給定微量滴定板的典型高度)低得多,從而具有四個區室的各孔可用于同時檢測一種藥物候選物對多個靶標或多種細胞類型的作用。可用物理屏障分隔小孔中的區室,從而當一種細胞介質溶液施加于一個區室時,從而當一種細胞介質(medium)溶液施加于一個區室并在所述區室停留時不與相鄰區室交叉污染。應理解區室可以是2、3、4、5、6或更多個。可用更高的物理屏障分隔具有多個區室的各孔,例如用常規微量滴定板的塑料壁,從而可將相對大體積的共用溶液加入各孔覆蓋所有區室并用于單個試驗。
在另一種實施方式中,公開了一種方法,該方法可利用位置和表面介導的轉染在單個傳感器或單個小室或單個孔中的多個傳感器來產生多種類型的細胞。對于單個傳感器,選擇預定的區域沉積材料,從而一旦細胞生長并貼壁,細胞可攝取所述材料并因此產生修飾的或再工程化的細胞,這種細胞有別于生長并粘附在沒有沉積所述材料的其它區域的原始細胞。所述材料可優選是靶基因,或反義寡核苷酸和其衍生物,或反基因寡核苷酸和其衍生物,或干擾RNA(單鏈或雙鏈或任何類型),或抗體,或蛋白,或蛋白結構域,或藥物,或肽。對于待被細胞遞送或攝取的不同類型的材料,可用具體的轉染試劑來達到最佳效果。可如US2004/0023391A1和US6,544,790中所述實現這些方法或組合物,這兩篇文獻以全文納入本文,但至少納入與遞送入細胞的方法有關的材料。
在另一種實施方式中,公開了一種方法,該方法可利用位置和表面介導的轉染在單個傳感器或單個小室或單個孔中的多個傳感器來產生多種類型的細胞。對于單個傳感器,選擇預定的區域沉積材料,從而一旦細胞生長并貼壁,細胞可攝取所述材料并因此產生修飾的或再工程化的細胞,這種細胞有別于生長并粘附在沒有沉積所述材料的其它區域的原始細胞。所述材料可優選是靶基因,或反義寡核苷酸和其衍生物,或反基因寡核苷酸和其衍生物,或干擾RNA(單鏈或雙鏈或任何類型),或抗體,或蛋白,或蛋白結構域,或藥物,或肽。對于待被細胞遞送或攝取的不同類型的材料,可用具體的轉染試劑來達到最佳效果。可如US2004/0023391A1和US6,544,790中所述實現這些方法或組合物,這兩篇文獻以全文納入本文,但至少納入與遞送入細胞的方法有關的材料。可用接觸印刷技術(如針印刷技術)、戳記裝置或非接觸印刷技術如分配器裝置或系統實現材料的沉積。對于物理屏障分隔的同一孔中的多個生物傳感 器,可用微量滴定板分配器實現含有材料的溶液的直接沉積。可如US5807522A、US6101946A、美國專利號5,731,152、美國專利號5,807,522、美國專利號5,601,980、US6656432B1、EP0895082B1或US6399396B1中所述實現這些方法,這些文獻全文納入本文,但至少納入與將所述材料遞送到基材表面的方法有關的材料。
另一種實施方式中,公開了一種方法,該方法可將定位溶液(position solution)轉染技術用于位于不同傳感器上的細胞,所述不同傳感器在同一小孔中但被物理屏障分隔。這些方法可將與轉染試劑混合的材料直接引入各區室中,在區室中細胞被預先培養并粘附到傳感器上。例如,將含有DNA的轉染試劑溶液加入各區室,區室中的細胞已被放置在底部基材上。
(5)用光學生物傳感器鑒別靶標
藥物靶標包括在具體疾病的發生和發展中發揮重要作用的大多數蛋白。直到最近,藥物研究者們只限于研究約500個生物學靶標(Drews,J.,“Drug Discovery:A Historical Perspective”Science2000,287,1960-1963)。隨著人類基因組測序的完成,可用和潛在的生物學靶標的數目正急速增加。基于基因組學方法發現的潛在靶標的數目使人們非常需要靶標評價技術。然而,傳統的藥物發現方法已經并且也只能解決有限數目的靶標家族。這種情況提示傳統方法已變得非常局限。也就是說,這些方法不能迅速產生滿足大藥物公司商業目標所需數目的新藥(例如,每年三至五種)。傳統的方法不可能為重大疾病(例如心血管疾病、神經退行性疾病、癌癥和2型糖尿病)或其它遠未滿足的藥物需要提供突破性治療。基于這些原因,靶標評價已稱為基因組學研究中增長最快和最重要的領域之一。在靶蛋白和疾病之間建立更強的聯系將使藥物進展到臨床試驗時的失敗率更低,已證明有價值藥物靶標的靶標數目更少將使成功率更大。此外,獲得對蛋白質功能了解的更快速的手段將縮短靶標評價過程。
在藥物發現中,靶標評價一般包括三個主要的、重要階段:1)靶標篩選,2)靶標鑒定,和3)靶標確認。作為靶標評價中的第一和/或早期階段,靶標篩選階段包括鑒定可能與疾病過程相關的分子(例如通過基因表達分析鑒定到特定基因的上調)。靶標鑒定包括鑒定非常清楚地在疾病過程中發揮作用的分子。這樣,這種方法提供了更大的確定性,但仍然存在這樣一種可能,即鑒定 到的靶標不是最好的或不連接于最好的結合位點以干擾疾病過程,或者它們不是“可作藥的”,亦即這種靶標不適合作為藥物靶標,因為它們不在疾病或癌癥中發揮支配性作用,或者藥物對該靶標的修飾可產生不利副作用。如果這些(前面兩步)都成功了,則可進入靶標確認階段,該階段確定在所選分子中哪個分子如果被調節則導致表型改變,從而暗示其可能具有治療性靶標的價值。
在一種實施方式中,公開了一種方法,該方法可用于基于光學生物傳感器監測的物質再分布的靶標鑒定和評價。(例如)與信號傳遞途徑活化、細胞運動性和表型改變相關的物質再分布可用作與特定靶標相關的疾病的指征,因為這些改變中的很多涉及腫瘤進展和轉移。一種實施方式中,該方法包括比較兩種類型細胞的通過特定靶標產生的刺激事件介導的DMR響應。如圖15所示,可提供光學生物傳感器(1501)。然后,可將含有特定類型細胞(細胞A(1502))的細胞培養基置于該傳感器上。然后任選提供緩沖溶液(1503)。可加入例如配制在溶液(1504)中的具體標記物,該標記物是刺激事件,如特定途徑或受體或細胞的調節劑或潛在調節劑。然后可用生物傳感器監測細胞響應(1505)。可用第二種細胞類型或細胞培養物(1507)在第二傳感器(1506)上進行同樣的一組步驟。詢問第二生物傳感器(1510)后,可對兩種響應(1505)和(1510)進行比較(1511)。
圖12顯示基于定向物質再分布進行靶標鑒定和評價的另一種可選方法。可提供生物傳感器(1201),然后可物理隔離一部分該生物傳感器(1202)從而即使將細胞置于該生物傳感器,細胞也不會在該部分生物傳感器上生長。然后可將具有細胞類型A的細胞培養基置于未隔離區(1203)并使其在上面生長。然后任選不再隔離生物傳感器上被隔離的區域,施加第二種細胞,例如細胞類型B的細胞培養基,從而細胞類型B在曾經被隔離的區域生長(1205)。然后可提供含有能夠產生刺激事件的分子的溶液(1206)。然后運行該生物傳感器,從兩個區域(起初未隔離的區域和曾被隔離的區域)收集數據并比較(1207)。
圖13顯示基于定向物質再分布進行靶標鑒定和評價的另一種可選方法。圖13提供所公開方法的一種改進形式,此改進與生物傳感器位于小室(例如微板的孔)中具體的位點有關。如果采用含有多個小室的裝置并使用多個生物傳感器,則可將不同類型的細胞置于各個不同生物傳感器上,從而能對各孔或生物傳感器分析不同的細胞或不同條件設置(1302)。然后可任選將通用培養基放入各孔以覆蓋所有生物傳感器,或各小室可用不同培養基,所公開的這兩 種方式可任意組合(1303)。溶液1303可含有標記物,如可產生刺激事件的分子,或可施加含有可產生刺激事件的一種或多種分子的第二溶液(1304)。然后可監測并詢問生物傳感器(一個或多個),收集并比較各區室或傳感器產生的結果(1305)。
與圖2a所示類似,圖10提供的圖顯示示范性無標記生物傳感器及其基本組件。光學LID系統1000包括詢問系統1002和光學LID生物傳感器1004,詢問系統1002由控制光、電子和用于數據產生、收集和分析的其它模塊組成,光學LID生物傳感器1004可用于檢測和監測物質再分布。當沿著(align with)傳感器攸逝波的方向發生物質再分布時,產生稱為定向物質再分布的信號并可被收集和分析。然而,如一些輸出參數如PWHM、共振帶寬和形狀等所示,光學生物傳感器也可能檢測到沿著傳感器表面或與該表面平行發生的物質再分布。例如,分子如GPCR1020的移位或分子裝配的發生可開始于面向傳感器的細胞表面至細胞內區室如內含體或ER。這些運動,如活細胞1008(只顯示一個)中所示的的箭頭1006,一般導致傳感器內傳感體積(由穿透深度定義)的減少。在一種優選實施方式中,詢問系統1002詢問光學LID生物傳感器1004(例如,SPR傳感器1004,波導光柵傳感器1004),從而可檢測和監測活細胞1008中的物質再分布。這可通過以下方式實現:發射光束1012至光學LID生物傳感器1004,從而當光束1012被傳感表面1010反射時,表征物質再分布的共振角或波長響應在反射束1014中占優勢,所述光束1012具有本文所述的合適光譜或角度。因此,當在活細胞1008中有可檢測的物質再分布時,光學LID生物傳感器1004可感知響應的變化,該變化被觀察為反射束1014的角度或波長改變。光學響應可記錄為時間的函數。以這種方式,如本文所述,可分析導致活細胞1008內發生物質再分布的任何事件的動力學生物傳感器輸出參數或任何其它參數。
參考圖16,該圖顯示光學LID系統1000用于監測刺激事件,如位于光學LID生物傳感器1014上表面上的活細胞1008(只顯示了一個)中G蛋白偶聯受體1602(GPCRs1602)的激動劑誘導的移位。具體說,該圖顯示了部分由于活細胞1008內的靶標GPCR1602移位造成的激動劑誘導和時間依賴性的光學響應1601。細胞粘附于基于波導的生物傳感器1014的上表面1010。清楚起見,在標記為“C”的部分未顯示詢問系統1002。
可以看出,靜息態的GPCR1602位于細胞表面1604(質膜1604),而GPCR 激酶1606(GRK1606)和抑制蛋白(arrestin)1608均勻分布在活細胞1008的細胞溶質中(見圖“A”)。經激動劑激活后,GPCR1602活化由α、β和γ亞單位組成的異源三聚體G蛋白。Gα和Gβγ亞單位解離,引起質膜1604處GRK1606向受體1602募集。然后,GRK1606磷酸化GPCR1602的羧基末端。另外,β-抑制蛋白1608(一種相對豐富的細胞內蛋白),在胞質中迅速移位(在分鐘級別)到質膜1604處的活化的GPCR1602,結合GRK-磷酸化受體,將受體與其相應(cognate)G蛋白解偶聯。然后β-抑制蛋白1608結合到脫敏的GPCR1602并移位到細胞表面1604處的網格蛋白小窩(clathrin-coated pits),此處1602在籠形蛋白包裹的小泡(CVV)中內化(見圖“B”)。最后,整個1602和1606復合物被遞送到內含體1610(細胞內小泡1610)(見圖“C”)。該過程稱為移位。關于GPCR移位的更多信息,可參考以下三篇文章:Pierce,K.L.等,“Seven-transmembrane receptors.”Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2002,3,639-650,整體納入本文,至少針對與移位相關的部分。
應理解,這些移位事件導致某個時間點活細胞1008內定向質量分布(例如,向細胞表面或離開細胞表面),因此在延長的時間段中產生不同的光學響應。可導致定向質量分布的另一個可能的生物學事件是由于GPCR活化引起的細胞形態變化。細胞形態變化包括細胞骨架重構以及細胞貼壁(狀態)的變化。細胞骨架是復雜的蛋白絲網絡,延伸經過真核細胞的細胞質,參與執行這些細胞中的多種活性。除了為這些細胞提供抗張強度之外,細胞骨架還使肌肉能夠收縮、進行細胞運動、并參與細胞內信號傳遞和運輸、細胞分裂和細胞形狀變化。G蛋白偶聯受體(GPCR)的活化導致至少兩個獨立事件,理論上講這些事件可對細胞骨架重構產生作用。第一個事件是細胞內信號傳遞途徑的活化,第二個事件是受體介導的胞吞作用(即移位),其發生在大多數GPCR的激動劑活化之后。然后,激動劑/GPCR結合之后發生的細胞內信號傳遞途徑的活化又導致另外兩組相關的事件。第一組過程導致細胞內第二信號傳遞途徑(G蛋白→效應子→信使)的活化,而第二組的機制通過影響第一組事件調控細胞內信號傳遞的程度。這些機制包括磷酸化/脫敏、內化和膜結合受體的下調。假定兩組事件均導致細胞中肌動蛋白絲重構。例如,GPCR活化后,各種形式的G蛋白(例如Gα和Gβγ)可與F肌動蛋白絲結合;這些和其它信號傳遞分子可與肌動蛋白絲解離。通過受體介導的胞吞而發生的膜結合受體的內化也可導致肌動蛋白絲的動態變化。
再參考圖16,根據本發明,可通過從光學LID系統1000分析光學響應1601來鑒定和監測活細胞1008中與GPCR移位相關的不同狀態。實際上,從圖16所示的光學響應1601可鑒定三種不同事件。可看到的三種主要事件包括:(1)加入激動劑后,信號1601由于折光率體積指數變化發生非常大的快速減少(bulk index of refraction changes)(即,該例子中化合物溶液相對于細胞培養基的折射系數較低,因此加入化合物導致LID信號降低);(2)過渡階段,響應信號1601變化慢,持續約20分鐘:該階段可能與細胞信號傳遞途徑活化相關,包括但不限于,已活化的受體1602被GRKs1606磷酸化,抑制蛋白結合,受體從網格蛋白小窩(chathrin-coated pits)脫敏,和/或其它細胞響應;和(3)響應信號1601緩慢減少,持續約50分鐘,對應于GPCR復合物1602和1608移位到內含體1602或其它細胞響應如細胞骨架重構。其它情況下,緊跟起始步驟之后發生的另外的事件可能很明顯(例如,圖16);它是一種快速波動的響應信號1601,主要是化合物在細胞培養基中的加入和/或擴散和/或細胞表面處細胞內組分向活化的GPCR募集造成的。下面參考圖17所示的方法1700描述光學LID系統1002如何進行這種測試的細節。
圖18表示用DMR進行把靶標鑒定的例子。圖18中,不管CHO細胞培養在含有10%胎牛血清(FBS)(數據未顯示)還是0.1%FBS(至少16小時)的培養基中(1801),除了將50ml EGF溶液加入到150ml細胞培養基中之后立即發生的信號快速變化(通常持續少于20秒)之外,EGF刺激未引起顯著的DMR。這種快速變化是由于體積指數變化。相反,當發生刺激事件時,例如加入EGF,EGF-誘導的A431細胞的響應強烈依賴于培養條件。在0.1% FBS中饑餓20小時的A431細胞用EGF處理產生時間依賴性響應(1802),該響應由三個連續相組成,提供3種生物傳感器輸出參數:(i)陽性相,信號增加(P-DMR)(點C-D),(ii)凈-零(net-zero)相(點D-E),和(iii)衰減相,信號減少(N-DMR)(點E-F-G),在體積指數變化的最初快速相之后。相反,與處于靜息態的A431細胞相比,增殖中的A431細胞(10%FBS)只產生P-DMR相(1803),而用0.1%FBS只處理4小時的A431細胞產生類似的響應(1804),但動力學發生改變,振幅小得多。這些結果表明可基于標記物-誘導的DMR響應,例如使用細胞信號傳遞途徑(在該具體實例中是EGF)的活化物或抑制物,來鑒定或評價給定細胞類型中的靶標(例如,EGFR)。
i)細胞信號傳遞
可用本文公開的系統和方法監測細胞信號傳遞。例如,參考圖17,該流程圖顯示了根據本發明的方法用光學LID生物傳感器1004在活細胞1008中實時監測由激動劑誘導的GPCR活化引起的物質再分布的方法1700的基本步驟。方法1700包括下述步驟:(a)提供光學LID生物傳感器1004(步驟1702);(b)將一定數目的活細胞1008置于覆蓋光學LID生物傳感器1004的介質中,從而活細胞1008粘附到光學LID生物傳感器1004的表面1010(步驟1704);(c)任選至少施加一次緩沖溶液至細胞培養基(步驟1706);(d)將含有化合物(激動劑)的溶液加入細胞培養基(步驟1708);和(e)詢問光學LID生物傳感器1004,監測培養在光學LID生物傳感器1004上的活細胞1008的時間依賴性光學響應1601(步驟1710)。
應理解,如果進行步驟1706,在加入化合物之前將緩沖溶液(與用于配制感興趣化合物的緩沖溶液相同)施加到活細胞1008,則由于活細胞1008對環境改變發生的響應而引起的任何不利作用可被最小化。這是可能的,因為培養在光學LID生物傳感器1004上的活細胞1008是活的、動態的,這表示它們可感知周圍介質組合物中的變化以及溫度的變化并對這些變化做出響應。然而,因為活細胞1008感知到緩沖液的加入等變化,如果不加入另外的化合物,它們可能對介質組合物中的那些變化產生抗性。
還應理解,實時方法1700提供了可量化的信息,同樣重要的是,它提供了由于GPCR活化造成的細胞內的物質再分布的動力學。與篩選GPCR的傳統方法不同,該方法1700更易于操作,更靈敏,不依賴于標記,可用于所有GPCRs1002,而不需要事先知道天然配體或者給定的受體如何偶聯于下游信號傳遞途徑。
還應理解,步驟1704中應優化細胞的數目使得在優化的條件下培養一定時間后,這些細胞粘附在光學LID傳感器1004的表面1010上并達到高覆蓋率(任選大于75%),以獲得高靈敏度。
參考圖19,該流程圖顯示了根據本發明采用光學LID生物傳感器1004、基于活細胞1008中的物質再分布,篩選針對靶標GPCR1002的激動劑的方法1900。方法1900包括下述步驟:(a)提供光學LID生物傳感器1004(步驟1902);(b)將一定數目的活細胞1008置于覆蓋光學LID生物傳感器1004的培養基中,從而活細胞1008粘附到光學LID生物傳感器1004的表面1010 (步驟1904);(c)向細胞培養基中施加一定濃度含有拮抗劑的溶液一段時間,直到光學LID生物傳感器1004變得穩定(步驟1906),所述拮抗劑的親和力已知;(d)將含有化合物(激動劑)的溶液加入細胞培養基(步驟1908),其中該化合物濃度足夠高到可與結合于受體的拮抗劑競爭并使拮抗劑脫離受體;和(e)詢問光學LID生物傳感器1004,監測培養在光學LID生物傳感器1004上的活細胞1008的時間依賴性光學響應1601(步驟1910)。
應理解,該方法1900中,通過預先施加針對活細胞1008中一種受體的拮抗劑可有效篩選化合物針對該特定受體的激動性。而且還應理解,該方法1900與先前的方法1800類似,只有一個區別就是方法1900需要事先知道化合物對活細胞中其相應受體的功能性。例如,需要知道該拮抗劑是否抑制GPCR1020活化,或該拮抗劑是否活化GPCR1020從而導致移位。
參考圖20,該流程圖顯示了根據本發明采用光學LID生物傳感器1004、基于活細胞1008中的物質再分布,篩選針對靶標GPCR1020的拮抗劑的方法2000。方法2000包括下述步驟:(a)提供光學LID生物傳感器1004(步驟2002);(b)將一定數目的活細胞1008置于覆蓋光學LID生物傳感器1004的培養基中,從而活細胞1008粘附到光學LID生物傳感器1004的表面1010(步驟2004);(c)向細胞培養基中施加一定濃度含有激動劑的溶液一段較短時間,從而不會發生移位(步驟2006),所述激動劑的親和力已知;(d)所述較短時間后,將一定濃度含有化合物的溶液加入細胞培養基(步驟2008);和(e)詢問光學LID生物傳感器1004,監測培養在光學LID生物傳感器1004上的活細胞1008的時間依賴性光學響應1601。應理解,和方法1900類似,該方法2000需要預先知道活細胞1008中的靶GPCR1020(的一些信息),還需要預先選擇針對該特定GPCR1020的拮抗劑或拮抗劑預先處理活細胞1008。
應理解,步驟2006和步驟2008可組合為一個步驟;即,可將細胞中靶標GPCR的已知激動劑與化合物一起加入。還應理解,與方法1700類似,可先加入待測試化合物,然后加入已知激動劑。
方法1700、1900和2000中的每一個還可用自參照(self-referencing)光學LID生物傳感器1004進一步強化。眾所周知,光學LID生物傳感器1004的性能一般受傳感器的設計和特性、光學、以及環境變動(包括環境氣溫和氣壓)的影響。采用自參照光學LID生物傳感器1004的一個主要優點是上表面1010既有參照區又有樣品區,樣品區可用于檢測活細胞1008中的物質再分布, 同時可用參照區(未粘附活細胞1008)參照出干擾性(spurious)變化,這些干擾性變化對活細胞1008中物質再分布的檢測有不利影響。
一種實施方式中,可根據圖21所示方法2100制備自參照光學LID生物傳感器1004。可通過以下步驟制備自參照光學LID生物傳感器1004:(a)提供光學LID生物傳感器1004(步驟2102);(b)用軟印模(如橡膠印模)物理隔離光學LID生物傳感器1004的表面1010的一個區域(參照區)(步驟2104);(c)將一定數目的活細胞置于覆蓋光學LID生物傳感器1004未隔離區(樣品區)的培養基中(步驟2106);和(d)活細胞1008粘附到光學LID生物傳感器1004未隔離區之后移除軟印模(步驟2108)。這時,可如方法1800、1900和2000所述進行基于活細胞的試驗。應理解,可用不同的方法來制備用于細胞研究的自參照LID傳感器。例如,可用物理屏障將傳感器分成兩部分,介質中的細胞只施加并覆蓋其中的一個部分。細胞貼壁后,移除物理屏障。
現在參照本文公開方法的另一個特征,眾所周知,多路細胞試驗已變得日益重要,不僅是因為通量日益增加,還因為從單個試驗獲得的大量的和確定的信息。因此,希望本發明方法可以多路模式進行,在某一個時間進行多個試驗。
一種實施方式中,采用圖22所示的方法2200,可加強本發明方法以在同一時間進行多個基于活細胞的試驗。根據方法2200,可監測多種類型的活性1008中由于激動劑誘導的GPCR活化引起的物質再分布,步驟如下:(a)提供光學LID生物傳感器1004(步驟2202);(b)用印模隔離光學LID生物傳感器1004上表面1010的一部分,印模阻止活細胞1008粘附到光學LID生物傳感器1004的所述部分上(步驟2204);(c)將第一種類型的活細胞1008置于覆蓋光學LID生物傳感器1004未隔離部分的培養基中,從而活細胞1008能夠粘附于光學LID生物傳感器1004的表面1010的未隔離部分(步驟2206);(d)從光學LID生物傳感器1004上表面1010移除印模(步驟2208);(e)將第二種類型的活細胞1008置于覆蓋光學LID生物傳感器1004的培養基中,從而第二種類型的活細胞1008能夠粘附于光學LID生物傳感器1004的上表面1010上剛剛解除隔離的部分(步驟2210);(f)向位于光學LID生物傳感器1004的上表面1010上的細胞培養基中施加含有化合物的溶液(步驟2212);和(g)詢問光學LID生物傳感器1004以監測時間依賴性光學響應1601,其代表了光學LID生物傳感器1004上的兩種類型活細胞1008內的物質再分布(步驟2214)。
應理解,這兩種類型的細胞可與例如以下細胞相關:中國倉鼠卵巢(CHO)細胞和含有過度表達靶受體的工程化CHO細胞。該方法不僅可進行多路細胞試驗,而且因為兩種細胞除靶受體表達水平之外其余都相同,所以通過比較同一化合物施加于兩種不同細胞時產生的光學響應,該方法還可提供關于化合物對靶受體作用的確切結果。
另一種實施方式中,采用圖23所示的方法2300,可加強本發明方法以在同一時間進行多個基于活細胞的試驗。根據方法2300,可監測多種類型的活性1008中由于激動劑誘導的GPCR活化引起的物質再分布,步驟如下:(a)提供含有光學LID生物傳感器1004陣列的小室(微量滴定板)(步驟2302);(b)將第一種類型的活細胞1008置于覆蓋一個或多個光學LID生物傳感器1004的細胞培養基中,從而第一種類型的活細胞1008能夠粘附于一個或多個光學LID生物傳感器1004的表面1010(步驟2304);(c)將第二種類型的活細胞1008置于覆蓋一個或多個未覆蓋的光學LID生物傳感器的培養基中,從而第二種類型的活細胞1008能夠粘附于所述一個或多個未覆蓋的光學LID生物傳感器1004的表面1010(步驟2306);(d)向位于光學LID生物傳感器1004的上表面1010上的細胞培養基中施加含有化合物的溶液(步驟2310);和(e)詢問覆蓋的光學LID生物傳感器1010以監測時間依賴性光學響應1601,其代表了各覆蓋的光學LID生物傳感器1004上的活細胞1008內的物質再分布(步驟2312)。
應理解,可將含有不同靶受體基因的不同DNA載體以及轉染試劑陣列置于LID傳感器上;放置一種類型的細胞,然后覆蓋這些載體和轉染試劑使細胞吸收這些基因。因此,只有各位點上覆蓋的細胞被轉染并因此形成轉染的細胞簇(US6544790B1“Reverse transfection method”(“反向轉染方法”))。類似地,可將一系列功能性受體蛋白與蛋白遞送試劑復合,然后用于類似的轉染細胞簇(US2004/0023391A1“Methods and devices for protein delivery”(“蛋白質遞送的方法和裝置”)).利用當前技術,這兩種形式的轉染細胞簇均可用于化合物篩選。
另一種實施方式中,采用圖24所示的方法2400,可進一步加強本發明方法以在同一時間在一種類型的細胞中進行多個靶標篩選。根據方法2400,可篩選一種類型的活細胞1008中針對多個GPCR1020的激動劑,步驟如下:(a)提供光學LID生物傳感器1004(步驟2402);(b)將活細胞1008置于覆蓋 光學LID生物傳感器1004的細胞培養基中,從而活細胞1008能夠粘附于光學LID生物傳感器1004的表面1010(步驟2404);(c)施加(多種)拮抗劑的混合(cocktail)溶液(步驟2406);(d)向位于光學LID生物傳感器1004的上表面1010上的細胞培養基中施加含有化合物的溶液(步驟2408);和(e)詢問光學LID生物傳感器1004以監測時間依賴性光學響應1601,其代表了活細胞1008內的物質再分布(步驟24)。
應理解,通過改進方法2400,類似的方法可用于在相同的細胞系中篩選針對多個受體的拮抗劑。不采用步驟2406中拮抗劑的混合溶液,而可采用感興趣化合物的溶液;同時,激動劑的混合溶液用于代替步驟2408中的化合物溶液。
(1)運輸動力學研究的重要性
與細胞信號傳遞途徑、相關的細胞活性和其它細胞變化有關的動力學不僅對于理解細胞生物學和生理很重要,而且對于細胞試驗的開發和藥物發現也很重要。例如,EGFR信號傳遞網絡包括的反應從幾乎是瞬時的反應(配體結合后的受體磷酸化)到持續很多分鐘的反應(小泡的形成或溶酶體分裂)或某些細胞系的形態變化。EGFR的運輸在很多步驟被調控,包括胞吞、早期內含體分揀和溶酶體靶向。內化之后,EGFR被轉回質膜或被運輸到晚期或多泡內含體。晚期內含體中的受體再被分揀到溶酶體進行降解或循環回細胞表面。受體的占據(結合)狀態表明它們能夠參與分揀過程的各步驟。雖然EGFR信號級聯的主要分層結構和其活化順序已經公知,但對于控制這么多種細胞響應(如細胞生長、存活或分化)的復雜動力學網絡和關鍵信號傳遞事件的了解很少。可監測對配體介導的EGFR活化的細胞響應的實時動力學的技術將大大有利于了解信號級聯和網絡的動力學。
(2)G-蛋白偶聯受體途徑
GPCR屬于細胞表面受體家族,是設計新藥物化合物最常針對的靶點之一。因為GPCR可將外源信號(即刺激物例如新藥的存在)轉導為細胞內響應,這使它們極有價值作為藥物靶點和用于新藥測試。
GPCR參與多種細胞信號傳遞途徑。配體結合啟動了一系列細胞內和細胞信號傳遞事件,包括受體構象變化,受體寡聚化,G蛋白活化(GDP-GTP在Gα亞 單位上互換,Gα和Gβγ解離,G蛋白與受體分離,產生Gα-和Gβγ信號傳遞復合物),和導致產生第二信使(Ca2+移動,產生肌醇三磷酸,和/或細胞內cAMP水平的調節)并最終導致具體基因表達變化的下游信號傳遞活化。配體介導的GPCR活化還導致GPCR從細胞表面脫敏、很多細胞內蛋白的運輸,以及靶細胞的表型、形態和物理特性的變化。這些變化可以是靜態的、長久的或動態的(例如,循環或擺動)。不同的信號傳遞事件顯示出顯著不同的動力學,從毫秒(例如GPCR構象變化)至幾十秒(例如Ca2+流)至甚至幾十分鐘(例如基因表達或形態變化)。現有的GPCR試驗包括配體-受體結合試驗、第二信使(Ca2+、IP3的cAMP)試驗、蛋白相互作用試驗、移位試驗和報告基因試驗。因為GPCR活化最終導致蛋白運輸和/或形態變化,所以需要可研究任意化合物通過GPCR對細胞表面的作用以及被作用的細胞的后續事件(例如,運輸和/或形態變化)的方法。
(3)受體酪氨酸激酶(RTK)信號傳遞途徑
(a)RTK的多樣性
在所有真核生物中,一大類基因編碼的蛋白質的功能是作為跨膜細胞表面受體。基于它們識別的配體、誘導的生物學反應以及其一級結構,膜受體可分為不同的家族。一個很大的細胞表面受體家族具有內在受體酪氨酸激酶(RTKs)活性,催化ATP的磷酸根轉移到靶蛋白酪氨酸的羥基上。RTKs在很多基本細胞過程的控制中發揮重要作用,這些細胞過程包括細胞周期、細胞遷移、細胞代謝和存活、以及細胞增殖和分化。
受體酪氨酸激酶(RTKs)屬于蛋白酪氨酸激酶(PTKs)的一個超家族。PTKs是一個很大的、多樣性的多基因家族。它們的主要功能包括調控生物體的多細胞方面。與生長、分化、貼壁、運動和死亡有關的細胞至細胞的信號常常通過酪氨酸激酶傳遞。相反,很多絲氨酸/蘇氨酸家族,如周期蛋白依賴性激酶和MAP激酶,在真核生物中是保守的,調控單細胞和多細胞生物體中的過程。人類中,已證明酪氨酸激酶在很多疾病狀態(包括糖尿病和癌癥)的發展中發揮重要作用。歷史上,酪氨酸激酶確定了一類致癌基因的原型,參與大多數人類惡性腫瘤。酪氨酸激酶基因還與很多先天性綜合征有關。酪氨酸激酶含有高度保守的催化結構域,與蛋白絲氨酸/蘇氨酸和雙特異性激酶中類似,但它還有獨特的亞結構域基序清楚地表征這些成員是酪氨酸激酶。已在海綿動物、刺胞 動物、線蟲、環節動物、節肢動物、棘皮動物、脊索動物以及其它動物中鑒定到酪氨酸激酶。基于內含子/外顯子結構或系統發生序列分析,人類的酪氨酸激酶可分類為20種受體和10種非受體類別。
所有受體酪氨酸激酶都含有通常是糖基化的并參與受體二聚化的胞外配體結合結構域。該配體結合結構域通過一個跨膜螺旋連接于胞質酪氨酸激酶結構域。胞質結構域含有保守的蛋白酪氨酸激酶(PTK)核心和另外的調控序列,它們自身磷酸化并被異源蛋白激酶磷酸化。RTK可進一步分類為幾個受體亞家族:例如,胰島素受體(IR)家族、表皮生長因子(EGF)受體家族、PDGF受體家族。受體酪氨酸激酶的表皮生長因子(EGF)家族由四個受體組成:EGF-R(ErbB1)、ErbB2(Neu)、ErbB3和ErbB4。
(b)RTK的二聚化
除RTK的胰島素受體(IR)家族之外,所有已知的RTK(例如表皮生長因子(EGF)受體、PDGF受體)在質膜中都是單體。配體結合誘導了這些受體的二聚化,導致其細胞質結構域的自身磷酸化。IR家族成員是形成22-異二聚體的兩條多肽鏈通過二硫鍵連接的二聚體。胰島素結合于IR的胞外結構域,誘導四元的異源四聚體結構重構,導致胞質結構域的自身磷酸化增加。
雖然所有RTK都通過二聚化活化,但不同配體誘導形成不同的活化二聚體狀態。具體的配體限定二聚體對;二聚體對繼而限定信號傳遞途徑。生長激素(GH)和GH受體(GHR)的復合、促紅細胞生成素(EPO)和EPO受體(EPOR)的復合的結構研究表明,這些細胞因子是二價的,一個配體同時結合于兩個受體分子,形成1:2(配體:受體)復合物。受體二聚化被另外的受體:受體相互作用進一步穩定。只有RTK和細胞因子受體的胞外和細胞質結構域均具有獨特構型的某些形式的受體二聚體導致反式自身磷酸化和PTK刺激。
(c)EGFR
EGR受體,如上所述由四個成員組成,屬于受體酪氨酸激酶家族,事實上在哺乳動物所有器官中都表達。在胚胎和出生后發育以及腫瘤進展中,EGF受體發揮的作用很復雜。除它們在生長和發育中的作用之外,EGFR受體還參與轉活過程,和其它受體如GPCR有交叉。
(d)EGFR信號傳遞途徑
EGFR和其相應配體的結合導致產生很多細胞內信號(如圖38所示)。配體結合后,最初的變化是受體二聚化形成同二聚體或與其它家族成員的異二聚體,受體激酶活性的活化和受體在細胞質結構域的酪氨酸殘基上的自身磷酸化。受體自身磷酸化為很多二級信號蛋白產生了停泊位點,這些二級信號蛋白帶有特定的蛋白相互作用結構域如Src同源區2(SH2)結構域,其與磷酸化的酪氨酸殘基特異性相互作用。各二聚化的受體復合物通過募集不同的含有SH2的效應子蛋白而啟動不同的信號傳遞途徑。作為這種相互作用的結果,這些二級信號蛋白自身被活化并引發很多下游信號。例如,活化的EGF-R二聚體與接頭蛋白Grb復合,Grb偶聯于鳥嘌呤核苷酸釋放因子SOS。Grb-SOS復合物可直接結合受體中的磷酸酪氨酸位點,或通過Shc間接結合。這些蛋白相互作用使SOS非常靠近Ras,從而使Ras活化。這又繼而活化ERK和JNK信號傳遞途徑,它們繼而活化轉錄因子,例如c-fos、AP-1和Elk-1,這些轉錄因子促進基因表達并有助于細胞增殖。促進細胞增殖的一個具體途徑包括信號蛋白Shc、Grb2、Sos、Ras、Raf、MEK、ERK和ERK/MAPK,稱為Ras/MAPK途徑。
(i)EGFR信號傳遞和物質再分布
EGFR的配體包括EGF、TGF-α、雙調蛋白、肝素結合EGF樣生長因子、β-動物纖維素和表皮調節蛋白(epiregulin)。EGFR可被很多不同配體之中任何一個的結合而活化,各配體似乎刺激產生多少不同的生物反應。而且,隨著受體微環境例如小泡內pH值的不同,不同的EGFR配體結合受體的能力不同。
結合后,活化的EGFR迅速被胞吞作用內化。受體介導的胞吞作用可使細胞表面受體特異性去除、從質膜卸除并使它們靶向內含體,在那里它們被分揀以使之下調或進行再循環。胞吞之后,受體-配體復合物經過幾個不同的區室,這些區室中的小泡內環境不同。受體在細胞區室間移動(稱為運輸)對復合物活性具有重要作用。不同細胞內區室對一些EGFR激酶底物的可獲得性也不同。不同的胞吞區室中底物可獲得性和依賴配體的活性之間的聯合關系暗示,運輸能夠“解碼”各配體獨特的信息。而且,配體-受體相互作用的持續性控制受體運輸。因此,受體胞吞和降解是控制信號大小、反應特異性和反應持久性的重要機制
配體誘導的EGFR內化是一個可飽和的過程,EGFR表達水平的增加超過某 個閾值將導致受體內化的削弱。
EGF受體的內化可通過誘導途徑或組成型途徑。通過誘導途徑形成的小泡稱為被膜小窩(coated-pit)介導的早期內含體(EE)小泡。所有EE小泡都經過分揀階段,它們可返回細胞表面或合并到晚期內含體(LE)中。當EE小泡再循環回到質膜(PM)時,所有它的受體都成為PM的一部分,任何未結合的配體都被釋放到胞外介質中。類似地,當EE細胞合并入LE時,其所有內含物都被轉移到LE。再循環回到質膜的速率和合并入晚期內含體的速率取決于EE小泡的類型。胞吞小泡以很快的速率或延時之后(即,緩慢)被再循環回到質膜。一般,被膜小窩EE小泡緩慢再循環回到質膜,很大百分比的被膜小窩EE小泡合并到LE。相反,組成型EE小泡具有更快的再循環速率,因此它們大多數返回到質膜。受體在LE中經過第二階段的分揀,被標記然后降解并送到溶酶體,或者再循環回到細胞表面。小的囊泡以一定速率從執行分揀的內含體逃脫。這種囊泡或融合入溶酶體使其內含物被降解,或再循環回到質膜。從機械學上講,從晚期內含體再循環的受體可能經過高爾基體。這些胞吞過程的凈結果導致EGFR活化后細胞中的定向物質再分布。
取決于具體細胞系中的細胞情況,配體誘導的EGFR活化可導致不同的信號傳遞途徑或多個信號傳遞途徑,其中一個信號途徑相對于其它信號途徑占優勢。而且,各細胞系的EGFR表達水平可能不同。因此,不同細胞系中,細胞中由配體誘導的EGFR活化而介導的物質再分布可能不同。例如,人表皮樣癌A431細胞已知可內源性過度表達EGFR(~1,700,000拷貝/細胞),因此已被用作EGFR信號傳遞的理想模型(D.W.Barnes,“Epidermal growth factor inhibits growth of A431human epidermoid carcinoma in serum-free cell culture,”J.Cell.Biol.1982,93,1–4)。EGF結合之后,A431中的EGFR被活化,導致通過不同途徑(包括Ras/MAPK途徑)導致多種細胞響應。例如,37℃用EGF刺激休眠的A431細胞導致受體胞吞、可折射的(refractile)形態變化和細胞從胞外基質脫離(Z.Lu,G.Jiang,P.Blume-Jensen,and T.Hunter,“Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase,”Mol.Cell Biol.2001,21,4016–4031,和Y.Danjo和I.K.Gipson,“Actin‘purse string’filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the  epithelial wound,providing coordinated cell movement,”J.Cell Sci.1998,111,3323–3332)。另外,受體胞吞是弱化EGF信號的重要細胞過程,雖然一些證據暗示EGF受體復合物在內含體區室中繼續進行信號傳遞。胞吞過程包括多個步驟:細胞內組分募集到活化的受體,產生的復合物隨后內化到內含體,內化的受體復合物在幾個細胞內區室間移動,最終降解和再循環回到細胞表面。此外,因為這些配體的大小、細胞表面受體的密度、所用細胞系(如A431細胞系)的密度和形態以及活化后受體的運輸,在RTK途徑中有很多信號傳遞事件導致定向物質再分布。例如,配體結合到細胞表面EGFR導致細胞表面的質量增加;隨后的自身磷酸化和細胞內組分與活化的EGFR的相互作用導致短時期內物質再分布的凈零變化。活化的受體的運輸導致各細胞不同區室內顯著的物質再分布。
物質再分布的另一個可能來源是細胞骨架重構。例如,受體募集到質膜處的網格蛋白小窩啟動EGFR運輸過程,網格蛋白小窩是將網格蛋白和接頭組裝到質膜細胞溶質表面上的蛋白網格而形成的結構。網格蛋白多聚化成六角形陣列中為組織接頭提供了骨架,接頭識別內化受體的細胞質結構域的序列基序。雖然連接肌動蛋白絲和胞吞機器的具體組分還不清楚,但據信肌動蛋白細胞骨架有助于網格蛋白小窩的形成。皮層肌動蛋白(Cortactin)是F-肌動蛋白相關蛋白,位于培養細胞的質膜褶皺處,是大GTPase發動蛋白(dynamin)的直接結合配對蛋白。皮層肌動蛋白和肌動蛋白、發動蛋白一起,是受體介導的胞吞機制的重要組分(Bajzer,Z.,等,“Binding internalization,and intracellular processing of proteins interacting with recycling receptors–a kinetic analysis”,J.Biol.Chem.1989,264:13623–13631)。
(ii)EGFR的組成型活性
據認為,受體單體與受體二聚體平衡。很有限的一部分受體二聚體胞外和胞質結構域的四聚結構構型與反式-自身磷酸化和PTK活性的刺激相容(活性二聚體)。結合于胞外結構域的配體穩定了活性二聚體的形成并因此穩定了PTK刺激。已提出,即使不存在配體結合,也存在活性二聚體,因為即使不存在配體結合,RTK的自身磷酸化也可被蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制劑加強或被受體過度表達而加強。實驗顯示,每分鐘質膜上2%的未結合(無配體)受體和15% 配體結合的受體被內化。而且,在用含相對低濃度生長因子如胎牛血清(FBS)(低于0.5重量%)或無FBS的培養基培養獲得的休眠A431細胞中,由于其為組成型,仍然有一定程度的EGFR磷酸化。
圖7表示EGF刺激導致強烈的劑量依賴性動態響應(見圖7A);EGF濃度增加時,限定響應的三種主要生物傳感器參數顯著改變。EGF濃度越高,1)P-DMR和N-DMR信號的振幅越大,2)P-DMR和N-DMR事件的動力學越快,和3)導致P-DMR至N-DMR事件轉換的時間(轉換時間τ)越短。當P-DMR事件的振幅顯示與EGF濃度的并發(complicate)關系時,N-DMR信號的振幅顯示對EGF的強烈和可飽和性劑量依賴,產生EC50為約1.45nM(見圖7b)。隨著EGF濃度增加,發現以秒計算的轉換時間τ呈指數減少(見圖7c):另外,N-DMR信號的衰減可用非線性回歸擬合。獲得的一相衰減常數κ也產生通常的可飽和反應,Kd為5.76nM(見圖7d)。那些劑量依賴性動力學參數(轉換時間和N-DMR相的衰減常數)和以前與靶基因C-fos在HeLa細胞中表達的動力學和EGFR胞吞的動力學有關的實驗數據和計算機預測很好的吻合(Schoeberl,B.,C.Eichler-Jonsson,E.D.Gilles,and G.Muller.“Computational modeling of the dynamics of the MAP kinase cascade activated by surface and internalized EGF receptors”.Nat.Biotech.2000,20:370–375)。這些結果表明,EGF誘導的細胞形態改變和受體胞吞是DMR事件,DMR是EGFR活化依賴性事件。
(e)PDGFR
與EGFR類似,血小板衍生的生長因子(PDGF)已證明可驅動細胞反應,包括增殖、存活、移動和細胞外基質的沉積以及組織重塑因子。敲除研究證明,對PDGF的很多細胞響應在小鼠發育過程中是很重要的。有兩種配體,PDGFa和PDGFb,兩種受體,PDGF受體α和PDGF受體β(分別是PDGFRα和PDGFRβ)。PDGFb和PDGFRβ對維管系統中支持細胞的發育很重要,而胚胎發生過程中更廣泛地需要PDGFa和PDGFRα,它們在很多情況下發揮重要作用,包括中樞神經系統、神經嵴和器官發育。
PDGF信號傳遞網絡由四種配體PDGFA-D和兩種受體PDGFRα和PDGFRβ組成。所有的PDGF都作為分泌型、二硫鍵連接的同二聚體發揮作用,但只有PDGFA和B可形成功能性異二聚體。PDGFR也可作為同或異二聚體發揮功能,體外試 驗已證明配體對αβ和ββ受體的親和性不同。所有已知的PDGF都具有特征性“PDGF結構域”,包括參與分子間和分子內鍵的八個保守性半胱氨酸。
PDGFR是受體酪氨酸激酶,就象EGFR一樣。各受體在胞外配體結合結構域有五個免疫球蛋白重復,在胞質區有一個分裂酪氨酸激酶結構域。配體結合之后,PDGFR二聚化,激活酪氨酸激酶結構域,然后在受體胞質結構域自身磷酸化幾個酪氨酸殘基。這為信號蛋白和接頭創造了停泊位點,這些信號蛋白和接頭在PDGFR結合后啟動信號傳遞。兩種受體可活化很多同樣重要的信號傳遞途徑,包括Ras-MAPK(分裂素活化的蛋白激酶),磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和磷脂酶C途徑。然而,與PDGFRα和PDGFRβ相互作用的蛋白譜有輕微差別,導致它們在體外的功能性有一些差別。
與EGFR信號傳遞途徑類似,PDGFR的活化也可導致可被光學生物傳感器監測并分析的顯著物質再分布。
(f)其它RTK
酪氨酸激酶主要可分為受體酪蛋白激酶(RTK),例如EGFR、PDGFR、FGFR、IR,和非-受體酪蛋白激酶(NRTK),例如SRC、ABL、FAK和Janus激酶。除EGFR和PDGFR之外,其它受體酪氨酸激酶包括胰島素受體、胰島素樣生長因子I受體(IFG-1R)、神經生長因子受體(NGFR)、成纖維細胞生長因子受體(FGFRs)。類似地,這些RTK不僅是細胞表面跨膜受體,而且是具有激酶活性的酶。受體酪蛋白激酶的結構組織顯示多結構域的細胞外配體(用于傳遞配體特異性)、單通路(single pass)跨膜螺旋和含有酪氨酸激酶結構域的細胞溶質部分。激酶結構域在N端和C端都有規則序列。
NRTK細胞溶質蛋白,顯示可觀的結構可變性。NRTK具有激酶結構域,并且常具有幾個另外的信號傳遞或蛋白-蛋白相互作用結構域如SH2、SH3和PH結構域。酪氨酸激酶跨越約300個殘基,其N末端部分(lobe)由5條鏈的β片層和一個α螺旋組成,C末端是一個大的胞質結構域,主要是α螺旋。ATP結合到兩個末端部分(lobe)之間的裂口中,含有酪氨酸的蛋白質底物序列與C末端部分(lobe)的殘基相互作用。通過配體結合于細胞外結構域,然后受體二聚化,促進細胞溶質結構域的轉磷酸化,從而活化RTK,而NRTK的活化機制要更為復雜,包括異源蛋白-蛋白相互作用以發生轉磷酸。
(4)細胞骨架調節
細胞骨架是細胞質中含有的獨特的細胞“架構”或“骨骼”。細胞骨架是復雜和動態的蛋白纖絲網絡,延伸經過真核細胞的細胞質。細胞骨架參與執行細胞中的多種活性。它通過為細胞提供抗張強度而維持細胞形狀。它還引起一些運動(利用鞭毛和纖毛等結構),在細胞內運輸(例如,小泡和細胞器的運動)和細胞分裂中發揮重要作用。通過提供“軌道”使細胞可在上面移動細胞器、染色體和其它物質,細胞骨架參與細胞內信號傳遞和運輸。
細胞骨架賦予真核細胞形狀和組織。細胞骨架的長纖維是亞單位的多聚體。組成細胞骨架的主要纖維類型是微絲、微管和中間絲。(i)微絲是由一串蛋白組成的扭曲雙鏈,通常7nm至12cm長。蛋白是肌動蛋白。其功能有助于肌肉收縮、細胞形狀和細胞質中的運動。(ii)中間絲由八個亞單位組成索狀。這些蛋白的結構在不同組織類型中也不同。該組分有助于維持形狀、支持神經細胞延伸和粘附細胞。(iii)微管是由形成螺旋的兩部分亞單位的管構成。它由微管蛋白組成,有助于染色體移動、細胞器移動、纖毛和鞭毛的移動。例如,在腸內皮細胞中,存在所有這三種類型的纖維。微絲伸入絨毛中,賦予細胞表面以形狀。微管從中心體長出至細胞周緣(pheriphery)。中間絲通過橋粒連接相鄰細胞。
(a)細胞骨架結構
細胞骨架是細胞的“架構”或“骨骼”,象所有其它細胞器一樣,包含在細胞質中。它是一種動態結構,維持細胞形狀,引起一些運動(利用鞭毛和纖毛等結構),在細胞內運輸(例如,小泡和細胞器的運動)和細胞分裂中發揮重要作用。真核細胞有三種細胞骨架蛋白絲:肌動蛋白絲、中間絲和微管(Janmey,P.A.(1998).The cytoskeleton and cell signaling:component localization and mechanical coupling.Physiol.Rev.78,763-781))。肌動蛋白絲直徑約7nm。該蛋白絲由兩個肌動蛋白鏈組成螺旋狀。它們主要集中于質膜下,因為它們保持細胞形狀,形成胞質突起(如偽突起和微絨毛),參與一些細胞-細胞或細胞-基質的連接以及信號的轉導。它們對于胞質分裂(和肌球蛋白一起)以及肌肉收縮也非常重要。中間絲直徑約8-11納米。它們是細胞骨架中更穩定(強烈結合)和異源的組分。它們組織細胞內部的三維結構(例如,它們是核膜或肌節的結構成分)。它們也參與一些細胞-細胞和 細胞-基質的連接。微管是約25nm的中空圓柱狀結構,由13根原絲組成,這些原絲是α和β微管蛋白的多聚體。它們的行為非常動態,結合GTP以進行多聚化。它們由中心粒組織。這些蛋白絲在細胞內運輸(與動力蛋白和驅動蛋白一起,運輸細胞器如線粒體或小泡)和有絲分裂紡錘體中發揮重要作用。
(b)生物物質從經透化處理的細胞中有控制地釋放
關于生物物質從經透化處理的細胞中有控制地釋放的描述可見Negrutskii,B.S.和Deutscher,M.P.(1992)“A sequester pool of aminoacyl-tRNA in mammalian cells”Proc.Natl.Acad.Sci.USA89,3601-3604;Negrutskii,B.S.,Stapulionis,R.和Deutscher,M.P.(1994)“Supramolecular organization of the mammalian translation system”Proc.Natl.Acad.Sci.USA89,3601-3604,整體納入本文作為參考,至少針對與生物物質從經透化處理的細胞中有控制地釋放相關的描述。
活細胞是一個大分子的集合。很多研究已證明,內源性大分子通過直接結合于細胞骨架成分而在哺乳動物胞質中具有高度組織性。細胞骨架,尤其是肌動蛋白微絲網絡在維持這種組織性方面具有重要作用。
經透化處理的細胞已被用于檢測細胞結構。用很多化學品或生物制品處理細胞可在細胞表面上形成孔,產生透化的細胞。這些化學品或生物制品包括去污劑如皂苷和菲律賓菌素(filipin),或毒素如毛地黃皂苷或鏈球菌溶血素O。然而,與其它成孔試劑相比,如果仔細滴定,皂苷對內部膜造成的損傷最小,并且可產生很均勻的透化細胞群(>97%)。皂苷是一種衍生自植物的糖苷,以其可使質膜產生允許可溶性蛋白分散的足夠的孔隙而知名。雖然皂苷處理的細胞會損失一部分生物大分子,但產生的透化細胞仍然保持了活細胞的大部分生物功能。這一點已得到以下事實的支持:雖然蛋白質合成是一個很復雜的過程,但這些透化細胞中的蛋白質合成保持較高水平,說明該系統保持了完整細胞的很多原有結構完整性。這是因為大部分大分子是作為有組織的細胞結構而被隔絕的(sequestered),所以它們不會從這些透化細胞中釋放出來。例如,在透化細胞中,翻譯機器的組分,如tRNA、氨酰-tRNA合成酶、和EFl通常是高度隔絕的。不但蛋白質合成機器被細胞骨架隔絕,細胞的很多其它組分也穩定地或瞬時地與細胞結構相結合;這些瞬間結合的組分可從透化細胞中部分釋放出來。
然而,微絲被破壞之后,蛋白質合成顯著減少,伴隨著這些翻譯組分從細胞中釋放。另外,細胞骨架結構破壞之后,很多其它隔絕的生物大分子也從透化細胞中釋放出來。這些從透化細胞中再被釋放的物質引起質量損失;因此導致LID傳感器表面上的細胞層的有效折射率變化,這種變化可被LID傳感器檢測到。因此,用光學生物傳感器獲得的變化可用于指示干擾細胞骨架結構的調節劑。
通常,篩選干擾細胞骨架結構的調節劑的方法主要基于采用體外試驗的結合親和性檢測,包括肌動蛋白結合蛋白試驗、微管穩定性/去穩定性試驗和肌動蛋白/微管多聚化試驗。其它方法基于高分辨率熒光顯像技術,直接觀察細胞內骨架結構,或者在化合物處理后檢測細胞運動性,或檢測細胞骨架相互作用標記物蛋白如Cdc42或Rho的活化。
本文公開了無標記檢測方法,采用光學生物傳感器篩選干擾細胞骨架結構的調節劑。
公開了光學生物傳感器領域的一些方法,在某些實施方式中,公開了采用光學標記獨立性檢測(LID)生物傳感器(例如基于波導光柵的生物傳感器)實時監測化合物誘導的細胞內組分釋放的系統和方法,所述細胞內組分在透化細胞和功能性細胞中被細胞骨架隔絕。公開了一種方法,采用化學品或生物制品產生可允許可溶性蛋白質擴散通過的透化細胞。公開了使用光學LID生物傳感器篩選細胞骨架組分的調節劑的系統和方法。
與所有研究細胞骨架結構的現有試驗技術不同,本文公開的方法提供無標記的實時方法來篩選干擾細胞骨架結構的調節劑。此外,與所有研究細胞骨架結構的現有的基于細胞的試驗不同,本發明方法利用保持了活細胞的大多數生物功能、但比活細胞簡單得多的透化細胞。與一般針對單個靶標篩選調節劑的基于熒光顯像的試驗不同,本發明方法提供多路能力,即可篩選細胞中干擾多個靶標的調節劑。與完全內反射熒光顯像技術結合,本發明方法提供高信息含量的篩選,包括動力學、親和性、涉及的靶標以及毒性。
圖25表示基于實時檢測化合物誘導的細胞內組分釋放的方法的實施例,所述細胞內組分在透化和功能性細胞中被細胞骨架隔絕。該方法包括使用成孔劑(如皂苷)產生允許可溶性蛋白質擴散通過的透化細胞。已知用很多成孔劑處理細胞可產生透化細胞。因為細胞內大分子通過直接結合于細胞骨架成分而在哺乳動物細胞質中具有高度組織性,所以雖然皂苷處理的細胞損失了一部分 生物大分子,但透化細胞通過細胞骨架超-集合的結構隔絕細胞內機器而仍然保留了活細胞的大多數生物功能。然而,微絲被破壞之后,蛋白質合成顯著減少,伴隨著這些翻譯組分從細胞中釋放。另外,細胞骨架結構破壞之后,很多其它隔絕的生物大分子也從透化細胞中釋放出來。這些從透化細胞中再被釋放的物質引起質量損失;因此導致LID生物傳感器表面上的細胞層的有效折射率變化,這種變化可被LID生物傳感器檢測到。因此,用光學生物傳感器獲得的變化可用于指示干擾細胞骨架結構的調節劑。一種實施方式中,可用圖25所示的方法2500篩選擾細胞骨架結構的調節劑。根據方法2500,可監測由于成孔劑如皂苷在活細胞1008中誘導的細胞表面膜成孔而造成的物質再分布,步驟如下:(a)提供光學LID生物傳感器1004(步驟2502);(b)將細胞培養基中的活細胞1008置于所述生物傳感器1004上(步驟2504);(c)任選施加緩沖溶液(步驟2506);(d)將含有化合物的溶液加入覆蓋的光學LID生物傳感器1004上表面1010上的細胞培養基中(步驟2508);施加含有成孔劑的溶液(步驟2510);和(e)詢問覆蓋的光學LID生物傳感器1010,監測時間依賴性光學響應,其表明了透化細胞1008中的物質再分布(步驟2512)。成孔劑是接觸細胞時可導致細胞表面膜形成孔隙的化學或生物化合物或組合物。
通常,本文所述用光學生物傳感器進行的與細胞功能或活性相關的檢測或試驗可實時進行。雖然很多光學輸出信號可用于細胞監測和檢測,與刺激誘導的定向物質再分布動力學相關的輸出參數是實時監測細胞信號傳遞及其結果的兩個參數。
細胞信號傳遞途徑,包括但不限于Ras/MAPK途徑、cAMP途徑、GPCR信號傳遞途徑、RhoA途徑、Akt途徑、整聯蛋白(intregin)途徑、GPCR弱化途徑、G蛋白途徑、Ca途徑、磷脂酶C途徑、細胞轉化途徑、細胞遷移途徑、細胞粘附途徑等,可與用光學生物傳感器檢測到的DMR信號相關。例如,MAPK激酶途徑的活化已鑒定為在細胞擴展或移動過程中利用整聯蛋白調控基因表達從而導致細胞形態變化的一種機制。上皮細胞響應于細胞外基質(ECM),引起整聯蛋白介導的FAK磷酸化,繼而磷酸化周圍的蛋白(樁蛋白(paxillin)、Fyn/shc、和src),導致信號放大。FAK還結合PI-3激酶,并在MAP激酶途徑的上游。當MAP激酶或PI-3激酶被抑制,阻斷了肌動蛋白的重新組織。Src磷酸化p190RhoGAP,使其GAP功能失活(使RhoGTP保持更長久的活性),促 進進一步信號放大。活化的RhoGTP結合下游激酶如與Rho結合的卷曲的含卷曲蛋白激酶(p160ROCK)和p140透明(diaphanous)(p140Dia),從而增加肌動蛋白多聚化和收縮。肌動蛋白的重新組織有助于整聯蛋白成簇,產生更多ECM結合,增加FAK活化和其它信號傳遞事件。因為細胞信號傳遞途徑及其在細胞中產生的結果強烈依賴于細胞背景,因此應理解對于給定的細胞類型,通過特定和預定的靶標活化給定的信號途徑可能不導致任何DMR(即,刺激可能只導致凈零DMR相),或一些情況下,引起的DMR響應和使用不同細胞系時獲得的響應不同。而且,通過不同靶標(例如,GPCR和RTK)引起的刺激介導的特定信號傳遞途徑的活化可導致同一種細胞類型相同或不同的DMR響應。換句話說,由通過特定靶標引起的刺激介導的DMR代表了多種細胞信號網絡相互作用的整合的和代表性的結果。而且,刺激誘導的細胞響應可能還依賴于細胞條件(例如,增殖vs休眠狀態,或分化vs未分化,細胞周期狀態――G1vs其它狀態,等)。一些情況下,粘附于傳感器表面的細胞可能需要預先處理以達到希望的狀態。例如,為了研究某些靶標對某具體信號傳遞途徑造成的最終導致細胞生長和增殖和/或分化的刺激誘導性活化,優選細胞處于休眠狀態。為了達到休眠狀態,需要用只有很少或沒有任何生長因子或刺激細胞生長和增殖的類似因子的培養基預處理處于增殖狀態的細胞。因為細胞的功能和動態,預處理時間對達到希望的狀態也很重要。
本文公開了具體用于研究細胞途徑的活化及其結果的方法,該方法需要預處理細胞使其達到休眠狀態而非增殖狀態。RTK可作為例子。一種實施方式中,公開了實時監測細胞中的配體結合以及相繼的信號傳遞事件的方法,包括:(a)提供基于光學的無標記生物傳感器;(b)將具有受體酪蛋白激酶的細胞置于傳感器表面;細胞懸浮在含有生物傳感器表面的細胞貼壁和生長所需某濃度血清的培養基中;(c)任選在37℃不含或含有低濃度血清的培養基中培養貼壁細胞使其饑餓;(d)將具有一層所述細胞的生物傳感器置于檢測系統中,監測響應;(e)任選在某時間中向細胞培養基中至少施加一次緩沖溶液;(f)任選向培養基中施加含有RTK配體的溶液;和(g)監測所述貼壁細胞層的時間依賴性響應。優選對具有RTK的細胞進行饑餓處理以使細胞對配體的響應最大化,因為在血清中可找到很多生長因子。這些生長因子包括PDGF(血小板衍生的生長因子)、EGF、胰島素、TGF-α、胰島素樣生長因子I(IGF-I)、和神經生長因子(NGF)。不含或含有低濃度(~0.5%)血清或牛血清白蛋白(BSA) 的培養基可用于使細胞饑餓。饑餓時間通常包括過夜饑餓。應理解,本文公開的這些方法不限于RTK信號傳遞途徑;可用于很多其它類型的靶標,如促有絲分裂的GPCR及其配體。
另一種實施方式中,公開的方法用于檢測和確定細胞中RTK的表達水平和細胞表面表達水平,該方法包括:(a)提供具有多孔的微量滴定板,各孔具有嵌在底部的基于光學的無標記生物傳感器;(b)提供多種類型的細胞;(c)將懸浮在培養基中的一種類型的細胞置于至少一個孔中;(d)在合適的培養基中培養細胞使其貼壁和生長直到達到一定水平的鋪滿度;(e)將具有生物傳感器的微量滴定板(各生物傳感器覆蓋有一層細胞)置于檢測系統中,監測響應;(f)向培養基中施加含有RTK配體的溶液;(g)監測和比較不同細胞類型的細胞層的時間依賴性響應。不同細胞類型可能需要不同培養基。對于同一類型的細胞,可用不同的培養基研究培養基對感興趣的RTK在細胞表面表達水平的影響。
另一種實施方式中,公開的方法利用光學生物傳感器確定配體對RTK的效力,該方法包括:(a)提供具有多孔的微量滴定板,各孔具有嵌在底部的基于光學的無標記生物傳感器;(b)在培養基中提供一定數目的、具有相對高水平RTK表達的細胞,使細胞以所需覆蓋率粘附于各生物傳感器;(c)更換培養基使粘附的細胞饑餓一段時間;(d)將具有生物傳感器的微量滴定板(各生物傳感器覆蓋有一層細胞)置于檢測系統中,監測響應;(f)向覆蓋各生物傳感器的培養基中施加含有不同濃度配體的溶液;(g)監測和比較細胞的劑量-和時間-依賴性響應。劑量依賴性結合和DMR信號及其相應的動力學可用于確定配體對感興趣RTK的效力。應理解,這些方法也可用于確定抑制劑對下游靶標的效力,所述下游信號在由于RTK或其它信號分子的活化以及后續細胞變化而產生的總DMR信號中有重要作用。例如,休眠A431細胞的EGF誘導的DMR信號可被以下信號細調或受其影響:下游信號例如MEK1/2、或肌動蛋白絲多聚化、或發動蛋白或受體激酶活性,或上游信號分子如某些GPCR激動劑包括氯化氨甲酰膽堿。也可利用靶標調節劑獨特的DMR特征或其對獲得的總DMR信號的作用來檢測調節劑的效力。
還公開了影響RTK信號傳遞的調節劑的篩選方法。該方法包括:(a)提供基于光學的無標記生物傳感器;(b)將具有感興趣RTK的一定數目的細胞置于培養基中覆蓋所述生物傳感器從而細胞粘附于生物傳感器表面;(c)用 所述生物傳感器監測細胞響應;(d)向細胞培養基中施加一定濃度含有化合物的溶液;(e)施加含有RTK配體的溶液并連續監測生物傳感器上培養的細胞的時間依賴性響應。
(5)檢測膽固醇運輸
細胞膜上膽固醇正確的細胞內分布對哺乳動物細胞的很多生物功能非常重要,其中包括信號傳遞和膜運輸。膽固醇在膜運輸中的突出作用正變得日益明顯。例如,位于質膜上的膽固醇耗竭抑制網格蛋白介導的胞吞,但小泡再循環似乎不受影響。既然直接檢測膽固醇不可行,已開發了幾種間接方法來研究膽固醇的細胞內分布和脂類信號傳遞。利用非浸透(impermeant)淬滅劑進行熒光甾醇的發射淬滅已用于確定膽固醇在質膜中的跨膜雙層(transbilyar)分布。然而,這種方法并不理想,部分是因為熒光膽固醇類似物相比膽固醇在性質上可能有量上的差別。而且,雖然膽固醇在水中溶解度很差,但它能夠以可察覺的速率自發地從膜上解吸附。大多數時候它會回到同一個質膜,但它也可結合到存在的任何其它疏水結合位點。
可將3H-醋酸鹽摻入活細胞中并在不同時間檢測分離的膜中3H膽固醇的量來確定新合成膽固醇的運輸和分布。放射性標記的膽固醇和膽固醇酯可被遞送到脂蛋白。可用直接化學方法如氣相色譜-質譜或間接方法如基于膽固醇氧化酶的試驗來檢測總膽固醇。為了應用檢測膽固醇運輸和分布的這些方法,必須純化感興趣的各種細胞器。獲得高度純化的膜部分一般非常困難;耗時的純化過程可能增加膽固醇轉移的風險。當細胞器可被容易地分離時,例如對于ER和質膜,這些方法非常有用,當涉及內含體或高爾基體膜等細胞器時,這些方法可能很難翻譯。
菲律賓菌素染色已廣泛用于檢測完整細胞里多種膜細胞器中的膽固醇,因為這種熒光去污劑選擇性結合膽固醇但不結合膽固醇酯。菲律賓菌素是一種較弱的熒光基團,可用冷電荷耦合(cooled charge-coupled)器件照相機來檢測。然而,菲律賓菌素染色只能提供膽固醇分布的定性信息,因為熒光強度不一定與膽固醇含量成線性相關。另一個限制是膽固醇與菲律賓菌素孵育的過程中可能發生再分布。因此,從采用菲律賓菌素的試驗中不可能定量膽固醇的細胞內分布。
已發展了一些專門技術如膽固醇氧化酶試驗來定量質膜中的膽固醇。如果 該酶進入細胞內區室(例如由于活細胞胞吞或膜破裂)或試驗中膽固醇移動到質膜中,則該試驗會過高估計質膜上膽固醇的量。雖然已開發了很多方法檢測細胞中的膽固醇分布,但所有這些方法(結果)的解釋都有各種程度的不確定性。因此需要比較幾種不同方法的結果以獲得對細胞內膽固醇分布的可信分析。
膽固醇不僅可從細胞中的一個位置或區室運輸到另一個位置或區室。它還可被稱為反向膽固醇運輸的過程分泌到細胞外。反向膽固醇運輸的第一步是游離膽固醇從周圍細胞的質膜中流出到細胞外的接納體(acceptor)。膽固醇的這種運動受細胞的因子和細胞外因子的控制。很多研究已聚焦于細胞膽固醇的細胞外接納體,具體地說是聚焦于這些接受體的修飾如何能夠正向加強膽固醇流出。一般相信反向膽固醇運輸由高密度脂蛋白(HDL)介導。對于含有磷脂的接納體如HDL,限速步驟是膽固醇分子從質膜解吸附。
膽固醇從周圍細胞中移出至少通過兩種途徑。膽固醇接納體(它們已經含有磷脂),如HDL顆粒或PL-apoA-1盤片,可通過膜膽固醇供體和接納體顆粒之間的濃度梯度通過擴散使膽固醇移動。因此膜孔擴散模型是一種雙向物質運輸模型,不需要接納體顆粒結合或穿透細胞質膜。清道夫受體B1型(SR-B1)的表達水平與膽固醇流出到HDL或磷脂顆粒的速率相關。SR-B1刺激膽固醇流出的能力似乎不依賴于受體-配體結合,可能反應了對膜膽固醇結構域的組織的影響,這種影響有助于膽固醇向接納體顆粒的膜孔擴散。
或者,含有較少脂類的膽固醇接納體如apoA-1與質膜直接作用,同時抽取膽固醇和磷脂。膽固醇流出到不含脂類的apoA-1的過程很大程度依賴于ATP結合表達盒轉運蛋白A1(ABCA1)的表達。雖然ABCA1在apoA-1介導的膽固醇流出中的重要性已非常清楚,但對其在膽固醇輸出中的確切功能仍然存有爭議,最近的研究暗示其作為apoA-1受體、細胞內膽固醇轉運蛋白或參與誘導膜脂類分布的變化,這種變化有助于apoA-1在細胞表面停泊。
本文公開的方法可用于檢測膽固醇運輸,或用于(例如)篩選影響膽固醇運輸(例如流出或攝取)的分子。圖26顯示了篩選干涉膽固醇流出的調節劑的方法的實施例。該方法基于實時檢測化合物對膽固醇流出的影響。質膜上或細胞內庫中膽固醇含量的耗竭導致細胞表面微絨毛的消失,造成貼壁細胞呈扁平狀。細胞扁平狀產生正的DMR相,信號增加。基于這種生物學作用,我們利用從細胞表面抽取膽固醇的試劑(例如甲基-β-環糊精(mβCD)或高密度脂 蛋白(HDLs))、或結合或隔離細胞表面上的膽固醇的試劑(例如相對低濃度的皂苷)作為標記物。光學生物傳感器獲得的變化可用于指示干涉膽固醇流出的調節劑。圖27提供了膽固醇途徑的示意圖。
圖28的結果表明,用mβCD處理A431和HeLa細胞均產生可用LID生物傳感器獲得的類似的時間依賴性響應。這兩種細胞類型的差別是由于與細胞表面結合的膽固醇含量不同。用EGF預處理A431顯著抑制mβCD誘導的響應。這時因為EGF結合于細胞表面的EGFR導致該受體的大量胞吞;受體胞吞引起細胞表面膽固醇含量的降低。類似地,用H7(一種蛋白激酶A、C和G的抑制劑)預處理A431也抑制mβCD誘導的響應。這是因為蛋白激酶是細胞表面上膽固醇含量的重要調控者。
(6)分析活性自由基信號傳遞和細胞氧化還原狀態
分子氧(雙氧;O2)對于所有需氧生物體的存活非常重要。需氧能量代謝依賴于氧化磷酸化,這是一個線粒體電子傳遞(通過多組分NADH脫氫酶復合物)的氧化還原能量被轉換為ATP的高能磷酸鍵的過程。O2作為細胞色素-C氧化酶的最終電子接納體,細胞色素-C氧化酶是線粒體酶學復合物中的最后一個酶組分,催化O2的四電子還原,成為H2O。可在這些(或其他)電子傳遞反應中形成O2的部分還原和高度反應性的代謝物。這些代謝物包括超氧陰離子(O2·)和過氧化氫(H2O2),分別通過O2的一電子和二電子還原而形成。在過渡金屬離子的存在下,可形成更具反應性的羥基自由基(OH·)。因為它們相對于分子O2具有較高的反應性,因此O2的這些部分還原代謝物通常稱為“活性氧自由基”(ROS)。
ROS對細胞功能具有雙重作用。ROS起初被認為是代謝的毒性副產物,可能引起對脂類、蛋白質和DNA的損傷。為了保護細胞不受ROS的潛在損傷作用,細胞有幾種抗氧化酶,如過氧化物岐化酶(將O2·還原為H2O2)、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶(將H2O2還原為H2O)。因此,氧應力可廣泛定義為氧化劑的產生和細胞抗氧化以防止氧化傷害的能力。氧應力參與很多人類疾病,包括動脈粥樣硬化、肺纖維化、癌癥、神經退行性疾病和衰老。
雖然一般認為ROS是呼吸的毒性副產物,但最近的證據暗示,ROS的產生可能是細胞信號和調控的重要參與者。在哺乳動物細胞中,最近已證明很多細胞外刺激誘導ROS細胞內濃度的瞬時增加,特異性抑制ROS的產生將導致刺激 物依賴性信號傳遞的完全阻斷。ROS產生的下游效應是蛋白質或多或少可逆性的氧化。硫醇,由于它們能夠被可逆性氧化,被認為是氧化脅迫的關鍵靶標。氧還敏感性蛋白,包括蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)作為活性位點賴氨酸,是很多氧化劑(包括H2O2)特異性氧化的靶標,這種修飾可被細胞內的還原劑逆轉。ROS對PTP的抑制有助于蛋白酪氨酸磷酸化介導的受體酪氨酸激酶(RTK)信號的傳播(通常與增殖性刺激物有關)。
ROS在細胞功能調控中作為必需的生物分子這一作用與其作為代謝有毒副產物這一作用的明顯矛盾可能至少部分與產生的ROS濃度的不同有關。當細胞中產生的ROS超過其抗氧化能力時,可能發生對細胞分子如脂類、蛋白質和DNA的損傷。
ROS的高度反應性和相對不穩定性使它們在生物系統中極難被檢出或測定。因此,針對ROS和自由基產生的很多評估(試驗)都是通過間接檢測ROS與細胞組分如脂類、蛋白質或DNA相互作用產生的各種終產物進行的。鑒定特定ROS的大多數方法是基于與各種“探測”分子(例如產生熒光的探針、化學發光探針或顯色探針)的作用,所述探測分子被氧化性修飾以產生發光或熒光信號。這些方法可能很復雜,因為在同一細胞中有可能具有多種形式的活性氧。此外,氧化氮自由基可使探針的光學性質產生與其他氧分子造成的同樣的變化。定量分析也很困難,因為:1)谷胱甘肽的細胞內濃度高,可形成硫醇或亞磺酰自由基、或捕獲或還原氧自由基;2)金屬的濃度可變,這可催化或抑制自由基反應;和3)存在其他自由基淬滅劑如精胺。
公開了實時監測化合物對H2O2誘導活細胞內動態物質再分布(DMR)的作用的方法。為了研究ROS信號,利用了各種細胞靶標的很多已知的和特異性的調節劑預處理細胞一定的時間(通常是一小時)。然后可根據調節劑對H2O2誘導的DMR信號的作用繪制出ROS信號傳遞網絡。為篩選調節細胞氧化還原狀態的化合物,用化合物預處理細胞較長的時間(通常從過夜至數天)。可通過H2O2誘導的DMR信號來檢測化合物對細胞氧化還原狀態的作用。
與檢測ROS信號傳遞和氧化還原狀態的所有現有試驗技術不同,本發明提供無標記和實時的方法來篩選干涉ROS信號傳遞和其網絡相互作用的調節劑。本發明還延伸到應用基于光學生物傳感器的細胞傳感。
細胞中ROS的產生來自酶學和非酶學來源。任何電子傳遞蛋白或酶學系統都可形成作為電子傳遞反應“副產物”的ROS。酶學來源包括:
(i)線粒體中的細胞代謝。線粒體中ROS的產生占還原條件下總O2消耗的約1-2%。因為線粒體中SOD濃度高,O2·在線粒體中的濃度保持在很低的穩態水平,不可能逃出細胞質。最近幾年,線粒體ROS介導細胞信號的能力,特別是關于凋亡調控,受到了很大重視。已表明線粒體可能作為“O2傳感器”介導低氧誘導的基因轉錄。
(ii)內質網(ER)中脂類和蛋白質的生物合成。ER是脂類和蛋白質生物合成主要涉及的另一種膜結合的細胞內細胞器。滑面內質網(缺少結合的核糖體)含有酶,包括催化一系列反應使脂溶性藥物和其他有害的代謝產物解毒的細胞色素P-450。細胞色素P-450可氧化不飽和脂肪酸和外源性化學物質,還原分子O2產生O2·和/或H2O2。
(iii)來自核膜的ROS。核膜含有細胞色素氧化酶和電子運輸系統,與ER類似,但是它們的功能未知。有一種假設是電子從這些酶系統中泄漏,產生可體內損害細胞DNA的ROS。
(iv)過氧化物酶體中H2O2的產生。過氧化物酶體是總細胞H2O2產生的重要來源。它們含有很多產生H2O2的酶,包括葡糖酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、尿酸氧化酶、L-醇酸氧化酶和脂酰輔酶A氧化酶。過氧化物酶體的過氧化氫酶利用這些氧化酶產生的H2O2在“過氧化”反應中氧化很多其他底物。這些類型的氧化反應在肝臟和腎臟細胞中尤其重要,在這些細胞中,過氧化物酶體使進入循環的很多毒性分子(包括乙醇)解毒。過氧化物酶體中進行的氧化反應的另一個主要功能是氧化脂肪酸,在哺乳動物細胞中這種氧化發生在線粒體和過氧化物酶體中。這些細胞內細胞器中產生的H2O2只有一小部分似乎逃過了過氧化物酶體的過氧化氫酶。
(v)來自可溶性酶的ROS。在催化循環中,可溶性酶,例如,黃嘌呤氧化酶、醛氧化酶、雙氫乳清酸酯脫氫酶、黃素蛋白脫氫酶和色氨酸雙加氧酶可產生ROS。
(vi)來自小分子的ROS。小分子,例如多巴胺、腎上腺素、黃素和氫醌的自身氧化可以是細胞內ROS產生的重要來源。大多數情況下,這些自身氧化反應的直接產物是O2·。
(vii)來自質膜相關酶的ROS。質膜相關的氧化酶(例如吞噬細胞的(phagocytic)NADPH氧化酶)已表明是大多數生長因子-和/或細胞因子-刺激產生的氧化劑的來源,雖然精確的酶來源還沒有完全鑒定到。
(viii)來自信號傳遞的ROS。已報道,結合不同種類受體的很多細胞因子和生長因子可在細胞中產生ROS。
(ix)來自環境的ROS。外源性ROS也可被引入活細胞中。例如,外源H2O2能夠通過質膜擴散到細胞中。
ROS在從受體到核的不同水平上調節許多信號途徑。雖然較不清楚,在過去十年已鑒定了許多細胞靶標,使其范圍擴大。受體激酶和磷酸酶可能是氧化應激的靶標。生長因子受體最常被配體誘導的二聚化或寡聚化活化,這些作用使其胞質激酶結構域自磷酸化。已經良好演示了響應紫外光,依賴于配體的受體依賴性成簇和活化,該作用可能是由ROS介導的。已顯示外源H2O2(通常以毫摩爾范圍)誘導酪氨酸磷酸化和PDGF-、PDGF-和EGF受體的活化。EGF受體的溶血磷脂酸誘導的反式激活可能是由形成ROS中間物介導的。由于大部分生長因子和細胞因子似乎在質膜上或其附近產生ROS,磷脂代謝物可能是氧化還原信號傳遞的重要靶標。例如,二酰基甘油的氧化形式在PKC活化中比其非氧化形式更有效。另外,內皮細胞和成纖維細胞中,PKC活化和蛋白質酪氨酸磷酸化似乎需要H2O2誘導的PLD活化。屬于Src家族(Src激酶)和Janus激酶(JAK)家族的非RTK也是至少外源加入的氧化劑的靶標。
ROS信號傳遞也能觸發許多細胞類型,包括平滑肌細胞中胞內Ca2+的改變。另外,ROS信號傳遞能夠參與MAPK途徑。外源氧化劑可激活ERK MAPK途徑。該作用的機制未明,精確的分子靶標也是未知的。一些研究提示,ROS介導的ERK活化可能是生長因子受體、Src激酶和/或p21Ras水平的上游事件。該作用的另一種可能機制可能是蛋白質酪氨酸磷酸酶(PTP)和/或蛋白質磷酸酶A的氧化劑誘導的失活。
還有許多其它胞內靶標也被鑒定為氧化響應分子。這些靶標包括NF-κB(一種轉錄因子,調節許多與免疫和炎癥反應有關的基因)、活化蛋白-1(AP-1)(一種轉錄復合物,是由Fos-Jun或Jun-Jun蛋白二聚化形成的)、和其它轉錄因子,其中相似氧化還原機制調節DNA結合,例如Sp-1、c-Myb、p53和egr-1。
ROS信號傳遞主要涉及兩種一般作用機制:1)胞內氧化還原態的改變,和2)蛋白質氧化修飾。
在一個實施例中,本發明提供了一種使用光學生物傳感器篩選能干擾ROS信號傳遞的化合物的方法。該方法涉及用過氧化氫作為外源ROS來介導培養細胞層底部部分的物質再分布。該方法包括下列步驟:提供非光學標記依賴性檢 測(LID)生物傳感器,它能測定多個光學輸出參數;在生物傳感器表面培養細胞;在細胞中加入調節物溶液;在細胞中加入外源反應性氧物質溶液;監測所述光學輸出參數。所述調節物加到所述細胞中,并且孵育一段較短時間(例如30min、60min、1小時、3小時、6小時、24小時、2日、3日、5日等)。所述反應性氧物質是過氧化氫。
6.除了無標記細胞實驗
a)與標記技術聯合,使用無標記生物傳感器的兩部分實驗
還可聯合常規標記技術(例如熒光)使用公開的無標記生物傳感器區室基于細胞的實驗來提供對生物樣本的多參數信息。
非標記依賴性檢測包括包括一套不需要標記任何分析物就可測定生物分子事件的技術。兩種最常用的技術基于質譜(MS)和使用表面質子共振(SPR)或如本文所述的光柵耦合波導測定折射率(RI)改變。本文公開的是含有一種裝置的系統,該裝置與光學生物傳感器結合,該傳感器含有具有電介質涂層的光柵,以同時測量折射率和熒光的改變(共焦或漸逝場)。
雖然基于RI的非標記依賴性檢測(RILID)方法提供了相對于標記技術更顯著的優點,其限制是不能直接將事件與特定的物質關聯。例如,與熒光不同,所需蛋白質和某些不良蛋白質的結合在性質上提供了同樣“類型”的信號(指標改變)。無標記檢測法本身因此是不具有特異性的。為了克服這種不確定性,將RILID法與MS結合,能鑒定結合的物質。
RILID測量可實時進行,通常由其能力限制,一般能檢測基質表面約200nm內或更小距離內的事件,橫向分辨率為約10μm。熒光能使得多種物質被標記(使用不同熒光染料或顆粒),并可以在可檢測約200nm內的漸逝模式使用(使用全內反射熒光或光柵耦合波導),或以可檢測約10μm內的共焦模式使用,具有卓越的橫向分辨率(在遠場內降至約300nm或在近場內小于100nm)。公開了用RILID作為另一種生物檢測“通道”,使用兩種技術的組合-無標記生物傳感器和標記,兩者的時空分辨率相同,但其中一種對物質具有特異性(標記,即熒光),另一種無物質特異性(無標記生物傳感器,RILID)。這種組合本身夠強,因為它能夠分解復雜的生物檢測事件,例如當研究細胞內生物途徑時遇到的那些事件。例如,配體與受體(例如GPCR)的結合可誘導胞內級聯,從而可能導致折射率曲線隨時間復雜改變。可通過熒光使用不同報道系統或標 記在細胞、細胞器(例如使用細胞器特異性染料來探測ER、Golgi、或核)、蛋白質(例如GFP-β-捕獲蛋白的移位)、或DNA水平(基因表達,使用熒光原位雜交,FISH)來檢測這些級聯中的一個或多個。將LID信號與多色熒光時空關聯可提供有關途徑的重要線索。另外,某些熒光報道物和/或標記通常互相是不兼容的。公開的方法能分析這種關聯,并能改進實驗,從而不再需要一種或多種熒光報道物,因為能通過RILID.309獲得信息。公開了使用基于平面型波導的生物傳感器的多模式檢測系統。該系統不僅監測折射率的改變(由生物物質在結合和隨后活化和細胞應答后的凈變引起的折射光的波長或角度改變指示),還可以監測熒光(或化學發光、生物發光、磷光或電致發光等)的改變。還提供了檢測系統,它提供用于藥物開發和基礎研究中的超高含量分析。
目前的生物分析技術通常僅提供一種參數。結果,多個不同實驗輸出的結果必須重復整理,以指導有關藥物開發(或診斷)的決定。該過程既費時又容易誤導。多參數檢測設法用分析技術的組合獲得有關幾個方面的信息,從而提供一途徑(或多個途徑)中多個步驟的線索,以及可能的藥物化合物對它們的調節。多參數檢測與多路方式不同,多路方式意味著用一種技術(或組合,例如放射和熒光標記的組合)同時檢測多種生物物質的結合或活化以監測途徑中的同一步驟。多參數檢測聯合多路分析(例如反向轉染分析)可能同時對多個樣本上提供多種類型的信息。光柵耦合波導在用RILID和熒光多參數檢測平臺上有特別的優點。
III.組合物
公開了要用來制備公開的組合物,以及在本文所述方法中使用的組合物的成分。本文公開了這些和其它物質,應理解當公開這些物質的組合、子集、相互作用、組等,而沒有明確公開特別引用各種成分及其集合組合時,本文特別考慮了各物質并對其進行了描述。例如,如果公開并討論了一種特定受體,可針對許多分子(包括所討論的受體)對其進行許多修改,特別考慮的是受體可能的每種和全部組合和排列,除非相反說明。因此,如果公開了分子A、B和C組,也公開了分子D、E和F組,而且公開了組合分子的例子A-D,那么即使沒有單獨陳述,分別且綜合考慮每種分子,意味著視為公開了組合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F。該概念應用于本申請的所有方面,包括但不限于,制備和使用所公開組合物的方法中的步驟。因此,如果存在許多額外的步驟, 應理解每一個這些額外步驟都可和公開方法的任何特定實施方式或實施方式的組合一起實施。
1.用公開的組合物/組合化學篩選鑒定的組合物
(a)組合化學
可用公開的組合物作為任何組合技術的靶標,以鑒定與公開的化合物以理想方式作用的分子或大分子。本文公開的核酸、肽、和相關分子可用作組合方法的靶標。還公開了組合物可通過組合技術或篩選技術鑒定,其中本文公開的組合物或其部分被用作組合或篩選方案的靶標。
應理解當聯合組合技術或篩選方法使用公開的組合物時,能鑒定出具有特定所需性質(例如抑制或刺激或靶分子功能)的分子(例如大分子)。當用于公開的組合物(例如公開的細胞)時,也公開了鑒定和分離出的分子。因此,本文也視用涉及公開的組合物(例如公開的細胞)的組合或篩選方法產生的產品也被公開了。
人們理解,如本文所述的鑒定分子的方法可用高通量方法進行。例如,可用熒光共振能量轉移(FRET)快速鑒定相互作用,從而鑒定推定的抑制劑。該技術的原理是:當兩個分子空間上靠近,即以超出背景的水平相互作用時,產生信號或信號可熄滅。然后,可進行各種實驗,包括例如,加入推定的抑制劑。如果抑制劑與兩種信號分子之間的相互作用競爭,可迅速(in space)使信號分子相互分離,從而導致信號減弱或增強,視所使用的信號類型而定。可將減弱或增強的信號與推定抑制劑的存在與否關聯。可使用任何信號傳遞手段。例如,公開了鑒定任何兩種公開的分子之間的相互作用的抑制劑的方法,包括將第一種分子和第二種分子在推定的抑制劑存在下相互接觸,其中第一種分子或第二種分子含有熒光供體,其中第一或第二種分子(通常不含供體的分子)含有熒光受體;在推定抑制劑存在下或在推定抑制劑不存在的情況下測定熒光共振能量轉移(FRET),其中推定抑制劑存在下,FRET與不存在推定抑制劑的情況下相比減弱,表明推定的抑制劑抑制兩種分子之間的結合。這類方法也可用細胞系統進行。
具有給定功能的催化性或配體結合性的寡核苷酸分子可分離自隨機寡核苷酸的復雜混合物,它被稱為“體外遺傳學”(Szostak,TIBS19:89,1992)。合成攜帶隨機和給定序列的分子集合,對復雜混合物(例如100μg100寡核苷 酸RNA的約1015條不同序列)進行篩選和富集過程。通過重復循環的親和層析和PCR擴增與柱上的配體相結合的分子,Ellington和Szostak(1990)估計1010RNA分子之一以與小分子染料結合的方式折疊。也分離了具有這種配體結合行為的DNA分子(Ellington和Szostak,1992;Bock等,1992)。對于小有機分子、蛋白質、抗體和其它本領域技術人員已知的大分子來說,存在類似目標的技術。篩選具有所需活性的分子組,不論基于小有機文庫、寡核苷酸、或抗體,被廣泛稱為組合化學。組合技術特別適用于鑒定分子之間的結合相互作用和分離具有特定結合活性的分子,當大分子是核酸時,這種分子常被稱為適體。
有許多分離具有原始活性或具有改變的活性蛋白質的方法。例如,已用噬菌體展示文庫分離了許多與特定靶標相互作用的肽(見例如美國專利6,031,071;5,824,520;5,596,079;和5,565,332,在此引入至少它們與噬菌體展示相關的物質和與組合化學有關的方法以供參考)。
分離具有給定功能的蛋白質的優選方法如Roberts和Szostak所述(Roberts R.W.和Szostak J.W.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94(23)12997-302(1997))。該組合化學方法結合蛋白質的功能力和核酸的遺傳力。產生RNA分子,其中將嘌呤霉素與RNA分子的3'末端共價結合。該修飾RNA分子的體外翻譯得到由要翻譯的RNA編碼的正確的蛋白質。另外,由于嘌呤霉素(一種不能延伸的肽酰基受體)的結合,延伸的肽鏈與和RNA結合的嘌呤霉素結合。因此,蛋白質分子與編碼它的遺傳物質結合。此刻,可進行正常體外選擇程序來分離功能性肽。一旦肽功能的選擇程序完成,進行常規核酸操縱程序,來擴增編碼所選功能性肽的核酸。遺傳物質擴增后,轉錄新RNA,3'末端帶有嘌呤霉素,翻譯新RNA,進行另一輪功能性選擇循環。如此,可以重復方式,就和核酸選擇技術一樣進行蛋白質選擇。翻譯出的蛋白質由與嘌呤霉素結合的RNA序列控制。該序列可以是任何經最佳翻譯(即沒有終止密碼子等)工程改造的隨機序列,或可以是已知RNA分子的簡并序列,以尋求已知蛋白的改進或改變的功能。核酸擴增和體外翻譯的條件是本領域技術人員熟知的,優選如Roberts和Szostak所述(Roberts R.W.和Szostak J.W.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94(23)12997-302(1997))進行。
另一種優選的設計分離肽的組合方法的優選方法如Cohen等(Cohen B.A.,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(24):14272-7(1998))所述。該方 法利用和改變了雙雜交技術。酵母雙雜交系統用于檢測和分析蛋白:蛋白相互作用。雙雜交系統最初在酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中公開,是一種鑒定新調控分子,特別是對于感興趣蛋白的強大分子遺傳技術(Fields and Song,Nature340:245-6(1989))。Cohen等修改了這種技術,從而能鑒定出合成或工程改造的新肽序列之間的相互作用,這些肽與選定的分子結合。這類技術的益處是在胞內環境中進行篩選。該方法利用肽分子文庫,這些分子與酸性活化域結合。用本領域技術人員熟知的方法,聯合各種組合文庫,人們能夠分離和表征與所需靶標結合或相互作用的小分子或大分子。可用競爭性結合研究(本領域技術人員熟知的)比較這些化合物的相對結合親和力,鑒定最佳化合物。
制備組合文庫和篩選組合文庫以分離與所需靶標結合的分子的技術是本領域技術人員熟知的。代表性的技術和方法可見(但不限于)美國專利5,084,824,5,288,514,5,449,754,5,506,337,5,539,083,5,545,568,5,556,762,5,565,324,5,565,332,5,573,905,5,618,825,5,619,680,5,627,210,5,646,285,5,663,046,5,670,326,5,677,195,5,683,899,5,688,696,5,688,997,5,698,685,5,712,146,5,721,099,5,723,598,5,741,713,5,792,431,5,807,683,5,807,754,5,821,130,5,831,014,5,834,195,5,834,318,5,834,588,5,840,500,5,847,150,5,856,107,5,856,496,5,859,190,5,864,010,5,874,443,5,877,214,5,880,972,5,886,126,5,886,127,5,891,737,5,916,899,5,919,955,5,925,527,5,939,268,5,942,387,5,945,070,5,948,696,5,958,702,5,958,792,5,962,337,5,965,719,5,972,719,5,976,894,5,980,704,5,985,356,5,999,086,6,001,579,6,004,617,6,008,321,6,017,768,6,025,371,6,030,917,6,040,193,6,045,671,6,045,755,6,060,596,和6,061,636。
可用許多不同合成技術,從廣泛的分子陣列制備組合文庫。例如,稠合的2,4-嘧啶二酮(美國專利6,025,371)二氫苯并吡喃(美國專利6,017,768和5,821,130),酰胺醇(美國專利5,976,894),羥基-氨基酸酰胺(美國專利5,972,719)糖類(美國專利5,965,719),1,4-苯并二吖庚因-2,5-二酮(美國專利5,962,337),環化物(美國專利5,958,792),二芳基氨基酸酰胺(美國專利5,948,696),噻吩(美國專利5,942,387),三環四氫喹啉(美國專利5,925,527),苯并呋喃(美國專利5,919,955),異喹啉(美國專 利5,916,899),乙內酰脲和硫代乙內酰脲(美國專利5,859,190),吲哚(美國專利5,856,496),咪唑-吡啶-吲哚和咪唑-吡啶-苯并噻吩(美國專利5,856,107)取代的2-亞甲基-2,3-二氫噻唑(美國專利5,847,150),喹啉(美國專利5,840,500),PNA(美國專利5,831,014),含標簽(美國專利5,721,099),聚酮化合物(美國專利5,712,146),嗎啉代亞基(美國專利5,698,685和5,506,337),磺酰胺(美國專利5,618,825),和苯并二吖庚因(美國專利5,288,514)。
如本文所用的,組合方法和文庫包括常規篩選方法和文庫,以及重復過程中使用的方法和文庫。
b)計算機輔助藥物設計
可用公開的化合物作為任何分子建模技術的靶標,來鑒定公開的組合物的結構,或鑒定可能或實際分子,例如小分子,它們與公開的組合物以理想方式相互作用。本文公開的核酸、肽、和相關分子可用作任何分子建模程序或方法的靶標。
應理解,當在建模技術中應用公開的組合物時,可鑒定具有特定所需性質(例如已知或刺激或靶向分子功能)的分子(例如大分子)。當用于公開的組合物(例如公開的細胞)時,還公開了鑒定和分離出的分子。因此,本文也視為公開了與公開的組合物(例如公開的細胞)有關的用分子建模法產生的產品。
因此,一種分離與所選分子結合的分子的方法是通過合理設計。這是通過結構信息和計算機建模實現的。計算機建模技術使得所選分子的三維原子結構可視化,而合理設計與分子將相互作用的新化合物。三維構建通常依賴于來自所選分子的X光晶體分析或NMR顯影得到的數據。分子動力學需要力場數據。計算機圖形系統能預測新化合物會如何與靶分子連接,并能夠實驗性操縱化合物和靶分子的結構,來優化結合特異性。當在其中之一或兩種中產生微小改變,預測分子-化合物相互作用會怎樣,需要分子機制軟件和計算增強計算機,通常與分子設計程序和用戶之間的方便用戶使用的菜單控制界面結合。
分子建模系統的例子是CHARMm和QUANTA程序,Polygen Corporation,Waltham,MA。CHARMm進行能量最小化和分子動力學操作。QUANTA進行構建、圖形建模和分子結構分析。QUANTA能實現分子之間行為的互動構建、修飾、可視化和分析。
許多文章回顧了與特定蛋白質互相作用的藥物的計算機建模,例如Rotivinen等,1988Acta Pharmaceutica Fennica97,159-166;Ripka,New Scientist54-57(June16,1988);McKinaly和Rossmann,1989Annu.Rev.Pharmacol._Toxiciol.29,111-122;Perry和Davies,QSAR:Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design pp.189-193(Alan R.Liss,Inc.1989);Lewis和Dean,1989Proc.R.Soc.Lond.236,125-140和141-162;以及有關核酸組分的模式酶,Askew,等,1989J.Am.Chem.Soc.111,1082-1090。其它篩選和圖形描述化合物的計算機程序可購自下列公司,例如BioDesign,Inc.,Pasadena,CA.,Allelix,Inc,Mississauga,Ontario,Canada,和Hypercube,Inc.,Cambridge,Ontario。雖然這些主要是設計用于對特定蛋白質有特異性的藥物的,它們也可適應設計與已鑒定出的DNA或RNA的特定區域相互作用的分子。
雖然以上描述了設計和產生可改變結合的化合物,人們還可篩選已知化合物(包括天然產物或合成化合物)、生物活性物質(包括蛋白質)的文庫,以獲得改變底物結合或酶活性的化合物。
2.試劑盒
本文公開了試劑盒,它們涉及可用于實施本文公開的方法的試劑。試劑盒可包含任何本文所述的試劑或試劑組合,或可理解在實施所公開的方法時需要或有益的任何試劑。例如,試劑盒可包括在方法的一些實施方式中所述的進行擴增反應的引物,以及如所需使用引物必需的緩沖液和酶。
IV.制備組合物的方法
除非另外說明,本文所述的組合物和進行所述方法所需的組合物可用任何本領域技術人員已知的用于特定試劑或化合物的方法制備。
1.核酸合成
例如,用作引物的核酸(如寡核苷酸)可用標準化學合成方法制備,或可用酶法或任何其它已知方法制備。這些方法包括從標準酶消化,然后核苷酸片段分離(見例如,Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y., 1989)第5、6章)到純合成方法,例如通過使用Milligen或Beckman System1Plus DNA合成儀(例如Milligen-Biosearch,Burlington,MA的8700型自動化合成儀或或ABI Model380B)氰基乙基亞磷酰胺法。用于制備寡核苷酸的合成法如Ikuta等,Ann.Rev.Biochem.53:323-356(1984)所述(磷酸三酯和亞磷酸三酯法)和Narang等,Methods Enzymol.,65:610-620(1980)(磷酸三酯法)。可用已知方法,如Nielsen等,Bioconjug.Chem.5:3-7(1994)所述的那些制備蛋白質核酸分子。
2.肽合成
制備所述蛋白質(例如SEQ ID NO:23)的方法之一是通過蛋白質化學技術連接兩條或多條肽或多肽。例如,可用目前可得的實驗儀器,使用Fmoc(9-芴甲氧羰基)或Boc(叔丁氧羰基)化學來化學合成肽或多肽(Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA)。本領域技術人員可輕易理解,對應于所述蛋白質的肽或多肽可以用標準化學反應合成。例如,可合成肽或多肽,但不將其從合成樹脂上切下,而肽或多肽的另一部分可合成,隨后從樹脂上切下,從而暴露出在其它片段上功能性封閉的端基。通過肽縮合反應,這兩個片段可以通過羧基和氨基末端的肽鍵共價結合,形成抗體或其片段(Grant GA(1992)Synthetic Peptides:A User Guide.W.H.Freeman and Co.,N.Y.(1992);Bodansky M.和Trost B.編(1993)Principles of Peptide Synthesis.Springer-Verlag Inc.,NY(在此至少引入有關肽合成的部分以供參考))。另外,肽或多肽可在體內如所述單獨合成。一旦被分離后,這些獨立的肽或多肽各自通過類似的肽縮合反應連接形成肽或其片段。
例如,克隆或合成肽區段的酶連接能使短肽片段連接產生大肽片段、多肽或完整的肽結構域(Abrahmsen L等,Biochemistry,30:4151(1991))。此外,合成肽的天然化學連接可用于從較短的肽片段合成性構建大肽或多肽。該方法包括兩步化學反應(Dawson等,Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation.Science,266:776-779(1994))。第一步是未保護的合成性肽-硫酯和另一種含有氨基末端Cys殘基的未保護的肽區段的化學選擇反應,得到硫酯連接的中間物作為最初共價產物。不改變反應條件,該中間物經過自發快速的分子間反應,在連接位點形成天然肽鍵(Baggiolini M.等(1992)FEBS Lett.307:97-101;Clark-Lewis I等,J.Biol.Chem., 269:16075(1994);Clark-Lewis I等,Biochemistry,30:3128(1991);Rajarathnam K等,Biochemistry33:6623-30(1994))。
此外,未保護的肽區段化學連接,其中肽區段之間形成的鍵是化學連接的結果,它是非天然(非肽)鍵(Schnolzer,M等,Science,256:221(1992))。該技術用于合成蛋白質結構域的類似物以及大量具有完全生物活性的較純的蛋白質(deLisle Milton RC等,Techniques in Protein Chemistry IV.Academic Press,New York,pp.257-267(1992))。
3.制備組合物的方法權利要求
公開了制備組合物的方法和制備形成組合物的中間物的方法。有許多方法可用于制備這些組合物,例如合成性化學方法和標準分子生物學方法。應理解,制備這些和其它公開的組合物的方法已被具體公開。公開了用任何公開的核酸轉化細胞產生的細胞。公開了用任何非天然存在的公開的核酸轉化細胞產生的細胞。
公開了任何由任一公開的核酸表達產生的肽。公開了任何通過表達任何公開的核酸產生的公開的肽。公開了任何通過表達任一非天然存在的公開的核酸產生的公開的肽。
公開了通過用任何本文所述核酸分子轉染動物內細胞獲得的動物。公開了通過用任何本文所述的核酸分子轉染動物內的細胞獲得的動物,其中所述動物是哺乳動物。還公開了通過用任何本文所述的核酸分子轉染動物內的細胞獲得的動物,其中所述哺乳動物是小鼠、大鼠、家兔、乳牛、綿羊、豬和靈長類。
還公開了通過將本文公開的任何細胞加入動物而產生的動物。
V.使用組合物的方法
1.使用組合物作為研究工具的方法
如本文所述,可用所述組合物作為微陣列試劑或作為檢測或分析現存微陣列的試劑。可在任何已知方法中用公開的組合物分離或鑒定單核苷酸多形性。組合物還可用于任何與芯片/微陣列相關的已知篩選分析方法。組合物還可以任何使用組合物的計算機可讀實施方式的已知途徑使用,例如,研究相關性或進行與所述組合物有關的分子建模分析。
VI.一些實施方式的說明
公開了一種測試細胞上的刺激事件的作用的方法,包括提供無標記生物傳感器,在生物傳感器上培養細胞,對培養的細胞提供刺激事件,收集來自生物傳感器的生物傳感器輸出數據。
還公開了一種篩選影響細胞存活或增殖的化合物的方法,該方法基于生物傳感器表面細胞的不均一性。
一種篩選影響對細胞的刺激事件作用的調節劑的方法,包括提供無標記生物傳感器,在生物傳感器上培養細胞,與含有化合物的溶液孵育一段特定和預定的時間,對培養的細胞提供刺激事件,收集來自生物傳感器的生物傳感器輸出數據。
還提供了包括提供檢測系統的分析細胞的方法,提供多個生物傳感器,將細胞置于培養基中,在生物傳感器上培養細胞至至少70%鋪滿度,加入化合物溶液,測定生物傳感器中出現耦合的入射角或波長,其中測量發生在10分鐘以內。
還公開了監測化合物毒性的方法,包括:(a)提供基于光學的無標記生物傳感器;(b)將細胞置于培養基中,其中細胞附著于生物傳感器表面;(c)在細胞培養基中加入含有化合物的溶液;(d)監測生物傳感器上培養的細胞的反應。
還公開了監測化合物對細胞的作用的方法,包括(a)孵育細胞和化合物,其中細胞結合于無標記生物傳感器,(b)鑒定化合物對細胞的作用,其中該鑒定步驟包括觀察和分析無標記生物傳感器的輸出。
還公開了一種監測化合物對細胞的作用的方法,包括(a)孵育細胞和化合物,其中細胞結合于無標記生物傳感器,(b)鑒定化合物對細胞的作用,其中該鑒定步驟包括觀察和分析無標記生物傳感器的輸出,其中將輸出與特征輸出比較。
還提供了一種實時監測化合物吸收和毒性的方法,包括步驟:(a)提供基于光學的生物傳感器;(b)將一定數量的細胞置于培養基中,以覆蓋生物傳感器,從而使細胞結合在生物傳感器表面上;(c)在細胞培養基上加上含有化合物的溶液;(e)監測在生物傳感器上培養的細胞的時間依賴性響應。
還公開了一種鑒定細胞狀態的方法,包括步驟:(a)在生物傳感器表面培養細胞,形成細胞-生物傳感器組合物,(b)分析細胞-生物傳感器組合物, 其中分析步驟包括鑒定細胞培養表面的不均一性。
還公開了用生物傳感器在細胞上高通量篩選化合物毒性的方法,包括步驟:(a)提供生物傳感器;(b)將細胞置于每個孔中,覆蓋生物傳感器,從而使細胞附著于生物傳感器表面,并達到高鋪滿度;(c)在每個孔的細胞培養基中加入化合物溶液;(d)在某一時間收集光學波導光模式譜,(e)將各化合物的PWHM和對照孔(其中細胞沒有接觸任何化合物)比較,用單數據點評估化合物毒性。
還公開了一種評估化合物毒性的方法,包括(a)提供基于光學的無標記生物傳感器,它與具有孔的微量滴定板結合;(b)將細胞和細胞培養基置于每孔內,其中細胞覆蓋生物傳感器,從而使細胞附著于生物傳感器表面;(c)將化合物溶液加到每孔的細胞培養基中;(d)在指定的時間,收集各孔全部傳感器面積上TM0模式共振角帶的圖像。
還公開了使用光學生物傳感器,高通量篩選化合物對細胞增殖的作用的方法,包括(a)提供生物傳感器;(b)使細胞與生物傳感器接觸,形成細胞-生物傳感器組合物,從而在一段時間的細胞生長后,細胞鋪滿度達到45%-55%,(c)孵育化合物和細胞-生物傳感器組合物,形成化合物-細胞-生物傳感器復合物,(d)收集生物傳感器的輸出,(d)從輸出獲得PWHM,(e)將各化合物-細胞-生物傳感器復合物的PWHM和對照比較,對照中細胞-生物傳感器組合物不接觸化合物,其中PWHM的下降表明化合物對細胞有影響。
還公開了一種實時監測細胞內配體結合和隨后信號傳遞事件的方法,包括:(a)提供基于光學的無標記生物傳感器;(b)將具有受體酪氨酸激酶(RTK)的細胞置于傳感器表面;細胞懸浮在含有一定濃度(細胞在生物傳感器表面附著和生長必需的)血清的培養基中;(c)可任選的在不含血清或其它生長因子、或不含任何血清或其它生長因子的培養液中孵育細胞過夜,以達到細胞的休眠狀態;(d)將具有一層細胞的生物傳感器置于檢測系統中,監測應答;(e)監測在加入含有刺激物的溶液,或隔開一段特定的時間依次加入兩種溶液(第一種含有化合物,第二種含有配體或標記物)之前和之后,()粘附細胞層的時間依賴反應。
還公開了一種測量或測定細胞中受體酪氨酸激酶(RTK)的表達水平和細胞-表面表達水平的方法,包括:(a)提供具有多孔的微量滴定板,每個孔含有嵌入底部的基于光學的無標記生物傳感器;(b)提供多種細胞;(c)將一 類細胞懸浮在至少一個孔的培養基中;(d)在合適的培養基中培育細胞,使其附著和生長,直到達到一定程度的鋪滿度;(e)將具有生物傳感器,每個生物傳感器被一層細胞覆蓋的微量滴定板置于檢測系統中,監測反應;(f)在培養基中加入含有RTK配體的溶液;(g)監測和比較不同類型細胞層的時間依賴反應。
還公開了一種檢測配體與RTK(結合)能力的方法,包括:(a)提供具有多孔的微量滴定板,每個孔含有嵌入底部的基于光學的無標記生物傳感器;(b)在培養基中提供一定數目具有較高RTK表達水平的細胞,使細胞以所需鋪滿度度附著在各生物傳感器上;(c)交換培養基,以使粘附細胞饑餓一段時間;(d)將具有生物傳感器,每個生物傳感器被一層細胞覆蓋的微量滴定板置于檢測系統中,監測反應;(f)在覆蓋每個生物傳感器的培養基中加入含有不同濃度配體的溶液;(g)監測和比較細胞的劑量和時間依賴反應。
還公開了篩選影響受體酪氨酸激酶(RTK)信號傳遞的調節劑的方法,包括:(a)提供基于光學的無標記生物傳感器;(b)將一定數量的具有感興趣的RTK的細胞置于培養基中,以覆蓋生物傳感器,使得細胞附著在生物傳感器表面上;(c)用生物傳感器監測細胞反應;(d)在細胞培養基中加入含一定濃度的化合物的溶液;(e)加入含有RTK配體的溶液,連續監測在生物傳感器上培養的細胞的時間依賴反應。
還公開了一種分析細胞中細胞骨架排列的方法,包括:提供光學標記非依賴檢測(LID)生物傳感器,監測附著于光學LID生物傳感器表面的細胞的生物物質釋放。
還公開了一種分析細胞骨架重排的方法,包括:提供光學LID生物傳感器;將活細胞置于細胞培養基中,以覆蓋光學LID生物傳感器,從而使活細胞附著于光學LID生物傳感器表面;在位于光學LID生物傳感器表面的細胞培養基中加入含有成孔試劑的溶液;和詢問光學LID生物傳感器,以獲得指示細胞的生物物質喪失的時間依賴性光學反應。
還公開了一種分析細胞骨架結構的方法,包括:提供光學LID生物傳感器;將活細胞置于細胞培養基中,以覆蓋光學LID生物傳感器,從而使活細胞附著于光學LID生物傳感器表面;在位于光學LID生物傳感器表面的細胞培養基中加入含有化合物的溶液;在位于光學LID生物傳感器表面的細胞培養基中加入含有成孔試劑的溶液;和詢問光學LID生物傳感器,以獲得指示細胞的生物物 質喪失的時間依賴性光學反應,從而使人能篩選能干涉細胞內細胞骨架結構的調節劑。
還公開了分析細胞骨架結構的方法,包括:提供光學LID生物傳感器;將活細胞置于細胞培養基中,以覆蓋光學LID生物傳感器,從而使活細胞附著于光學LID生物傳感器表面;在位于光學LID生物傳感器表面的細胞培養基中加入含有成孔試劑的溶液;在位于光學LID生物傳感器表面的細胞培養基中加入含有化合物的溶液;和詢問光學LID生物傳感器,以獲得指示細胞的生物物質喪失的時間依賴性光學反應,從而使人能篩選能干涉細胞內細胞骨架結構的調節劑。
公開了測試刺激事件對細胞的作用的方法,包括提供無標記生物傳感器,在生物傳感器上孵育細胞,對孵育的細胞提供刺激事件,收集來自生物傳感器的生物傳感器輸出。
還公開了鑒定細胞狀態的方法,該方法包括在無標記生物傳感器表面培養細胞,形成細胞-生物傳感器組合物,分析細胞-生物傳感器組合物,其中該分析包括鑒定培養細胞的表面的不均一性。
還公開了方法,其中孵育細胞涉及培養細胞,其中刺激作用是通過生物傳感器輸出鑒定的。
還公開了方法,可包括一些方法,其中細胞培養到20-99%鋪滿度,其中細胞培養到30-80%鋪滿度,其中細胞培養到40-65%鋪滿度,其中細胞培養到70-99%鋪滿度,其中細胞培養到80-95%鋪滿度。
還公開了可包括一些方法的方法,其中細胞是粘附細胞,其中細胞與生物傳感器接觸,其中細胞附著于生物傳感器。
還公開了方法,其中刺激事件包括在細胞培養物中加入化合物,其中化合物調節細胞的細胞信號途徑,其中調節激活細胞信號途徑,其中調節抑制細胞信號途徑,其中化合物調節細胞上的細胞表面受體,其中化合物是受體的激動劑,和其中化合物是受體的拮抗劑。
還公開了方法,可包括其中細胞表面受體是離子通道、受體酪氨酸激酶、細胞因子受體、整聯蛋白受體、Na+/H+交換蛋白受體、或免疫受體,其中細胞表面受體是G蛋白偶聯受體(GPCR)、表皮生長因子受體(EGFR)、血小板衍生生長因子受體(PDGFR)、成纖維細胞生長因子受體(FGF)、或血管內皮生長因子受體(VEGFR),其中化合物調節細胞內的細胞骨架成分,其中化合物 使細胞骨架結構去穩定,其中化合物穩定細胞骨架結構,其中化合物調節胞內酶、胞內激酶、胞內細胞器、胞內蛋白質、或胞外基質,其中化合物在化合物溶液中加入。
還公開了還能包括測定是否化合物對細胞有毒的方法。
還公開了方法,可包括一些方法,其中測試多種化合物,以篩選對細胞有毒的化合物,其中通過生物傳感器輸出監測化合物的毒性水平。
還公開了方法,可包括其中通過生物傳感器輸出監測細胞,以檢測化合物的作用。
還公開了方法,可包括一些方法,其中通過生物傳感器輸出監測化合物吸收。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器可穿透細胞至100nm深,其中生物傳感器可穿透細胞至100nm、200nm、300或500nm深,其中生物傳感器可接受來自胞內不同穿透深度的數據,其中穿透深度達500nm。
還公開了方法,可包括一些方法,其中用生物傳感器輸出鑒定細胞狀態。
還公開了方法,還包括測定是否刺激事件影響細胞存活或增殖。
還公開了方法,可包括一些方法,其中測試多種化合物來篩選對細胞有毒的化合物,其中監測化合物對細胞的作用,其中化合物是抗癌化合物。
還公開了方法,可包括一些方法,其中收集來自生物傳感器的生物傳感器輸出包括收集生物傳感器輸出參數。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器輸出參數是與生物傳感器輸出動力學有關的參數。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器輸出參數包括分析生物傳感器輸出的總體動力學,其中分析總體動力學包括分析在完成相變時從一個相變為另一個相的速度,其中分析總體動力學包括分析完成生物傳感器輸出的時間長度,其中分析總體動力學包括分析生物傳感器輸出的整個時期的時間長度,其中分析總體動力學包括分析P-DMR階段的總持續時間,其中分析總體動力學包括分析N-DMR階段的總持續時間,其中分析總體動力學包括分析獲得P-DMR的總振幅的速率,其中分析總體動力學包括分析獲得N-DMR的總振幅的速率,其中分析總體動力學包括分析從N-DMR到P-DMR的速率,其中分析總體動力學包括分析從P-DMR階段到N-DMR階段、凈零到N-DMR階段、凈零到P-DMR階段、P-DMR到凈零相、N-DMR到凈零、或P-DMR到凈零的過渡時間t。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器輸出參數包括分析生物傳感器輸出相,其中分析相包括分析相變,其中分析相包括分析正向物質再分布(P-DMR)信號,其中分析相包括分析反向物質再分布(N-DMR)信號,其中分析相包括分析凈零向物質再分布(凈零DMR),其中分析相包括分析正向物質再分布(P-DMR)信號的形狀,其中分析相包括分析正向物質再分布(P-DMR)信號的振幅,其中分析相包括分析反向物質再分布(P-DMR)信號的形狀,其中分析相包括分析反向物質再分布(P-DMR)信號的振幅。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器輸出參數包括生物傳感器輸出的全面動力學,其中分析全面動力學包括分析生物傳感器輸出產生的整條曲線的形狀。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器輸出參數是與共振峰有關的參數。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器輸出參數包括分析在光耦合生物傳感器時,光強vs入射角。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器輸出參數包括分析在光耦合生物傳感器時的光強vs光波長。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器輸出參數包括分析峰位置。
還公開了方法,可包括一些方法,其中分析峰位置包括分析在最大強度位置之前的半最大峰強度位置。
還公開了方法,可包括一些方法,其中分析峰位置包括分析在最大強度位置之后的半最大峰強度位置。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器輸出參數包括分析共振峰上一點的強度。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器輸出參數包括分析最大強度的強度。
還公開了方法,可包括一些方法,其中分析共振峰強度包括分析在共振峰上,峰值強度之前發生的半最大峰強度的強度。
還公開了方法,可包括一些方法,其中分析共振峰強度包括分析在共振峰上,峰值強度之后發生的半最大峰強度的強度。
還公開了方法,可包括一些方法,其中該方法還包括收集第二生物傳感器 輸出參數。
還公開了方法,可包括一些方法,其中第二生物傳感器輸出參數包括分析峰位置。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器輸出參數包括分析峰形。
還公開了方法,可包括一些方法,其中分析峰形包括測定共振峰下面積。
還公開了方法,可包括一些方法,其中共振峰下面積僅包括在共振峰上存在的半最大強度點之間連線以上的面積。
還公開了方法,可包括一些方法,其中分析峰形包括分析半最大強度點的共振峰寬度。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器輸出參數是與共振帶圖像有關的參數。
還公開了方法,可包括一些方法,其中共振帶圖像是通過用穿過生物傳感器的光點對生物傳感器進行光照,并對穿過生物傳感器的入射耦合光強分布作圖。
還公開了方法,可包括一些方法,其中入射耦合光強度分布由CCD照相機顯像。
還公開了方法,可包括一些方法,其中有關共振帶圖像的參數是帶形、帶位置、帶強度或光強分布。
還公開了方法,可包括一些方法,其中分析了半最大峰寬(PWHM)聯合最大強度位置。
還公開了方法,還進一步包括將培養的細胞與化合物一起孵育。
還公開了方法,可進一步包括確定是否化合物影響刺激事件對細胞的作用。
還公開了方法,可進一步包括測定化合物對刺激事件對細胞作用的影響。
還公開了方法,可包括一些方法,其中篩選一種或多種額外化合物來測定是否化合物影響刺激事件對細胞的作用。
還公開了方法,可包括一些方法,其中收集生物傳感器輸出短于10分鐘,其中生物傳感器輸出的收集短于5分鐘、1分鐘、30秒、10秒、5秒或1秒。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器輸出的收集時間基本與刺激作用的生物擴散限制時間相同。
還公開了方法,可包括一些方法,其中包括提供檢測系統。
還公開了方法,可包括一些方法,其中提供多個無標記生物傳感器,其中在每兩個或多個生物傳感器上培養細胞,其中對兩個或多個生物傳感器提供刺激事件,其中從兩個或多個生物傳感器收集生物傳感器輸出。
還公開了方法,可包括一些方法,其中監測細胞穿透深度的多樣性。
還公開了方法,可包括一些方法,其中每個生物傳感器具有一種穿透深度。
還公開了方法,可包括一些方法,其中同時收集來自兩個或多個生物傳感器的生物傳感器輸出。
還公開了方法,可包括一些方法,其中同時培養細胞。
還公開了方法,可包括一些方法,其中對兩個或多個生物傳感器同時提供刺激事件。
還公開了方法,可包括一些方法,其中在多個生物傳感器上孵育多種不同的細胞。
還公開了方法,可包括一些方法,其中多種細胞包括至少兩個不同的細胞,因為至少細胞之一經遺傳工程改造。
還公開了方法,可包括一些方法,其中多種細胞類型中的各細胞類型由多個生物傳感器中的不同生物傳感器檢測。
還公開了方法,可包括一些方法,其中細胞培養到至少70%鋪滿度。
還公開了方法,可包括一些方法,其中細胞包括多個細胞。
還公開了方法,還包括在細胞中加入緩沖液,其中緩沖液與細胞類型和刺激事件類型兼容。
還公開了方法,可包括一些方法,其中收集生物傳感器輸出包括使生物傳感器與可變入射角的光接觸,在光入射耦合時測量入射角。
還公開了方法,可包括一些方法,其中收集生物傳感器輸出包括使生物傳感器與可變波長的光接觸,在光入射耦合時測量波長。
還公開了方法,可包括一些方法,其中細胞是增殖期、休眠期、分化期、或在特定的細胞周期狀態。
還公開了方法,可包括一些方法,其中通過在生長培養基中培養細胞,使細胞為增殖期。
還公開了方法,可包括一些方法,其中通過在饑餓培養基中培養細胞,使細胞為休眠期。
還公開了方法,還包括分析生物傳感器輸出。
還公開了方法,可包括一些方法,其中監測以1秒、3秒、5秒、10秒、20秒、30秒、1分鐘、或5分鐘的采樣速率連續進行。
還公開了方法,還包括鑒定刺激事件對細胞的作用。
還公開了方法,可包括一些方法,其中鑒定作用包括將生物傳感器輸出與特征輸出比較。
還公開了方法,可包括一些方法,其中特征輸出包括至少以下相之一的動態物質再分布:正-DMR、反-DMR和凈零-DMR階段。
還公開了方法,可包括一些方法,其中細胞是從一細胞系產生的。
還公開了方法,可包括一些方法,其中細胞系是遺傳工程改造的變體細胞系。
還公開了方法,可包括一些方法,其中刺激事件包括在細胞培養物中加入一種化合物,其中作用是化合物對細胞吸收、分布、代謝或毒性的作用。
還公開了方法,可包括一些方法,其中刺激事件包括在細胞培養物中加入一種化合物,其中測定化合物的作用包括功能性評估化合物對細胞的作用,和鑒定化合物對細胞吸收、分布、代謝、排出或毒性的作用。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器輸出與細胞物質再分布的改變有關。
還公開了方法,可包括一些方法,其中可觀察作為生物傳感器反射光束的角度或光譜變化的生物傳感器輸出。
還公開了方法,可包括一些方法,其中收集生物傳感器輸出包括監測培養細胞的時間依賴性響應。
還公開了方法,可包括一些方法,其中細胞達到至少80%鋪滿度。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器嵌入微量滴定板。
還公開了方法,可包括一些方法,其中細胞在生物傳感器上生長至少1小時、5小時、10小時、16小時、24小時、36小時、1周或2周。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器能分辨在與存活細胞接觸的生物傳感器表面的一定區域、與被刺激事件影響的細胞接觸的生物傳感器表面的一定區域、和不接觸細胞的生物傳感器表面的一定區域。
還公開了方法,可包括一些方法,其中被影響的細胞釋放出一部分胞內成分或是死細胞。
還公開了方法,還包括將細胞-生物傳感器與化合物一起孵育。
還公開了方法,可包括一些方法,其中化合物是化學物質、生物化學物質、生物分子、藥物或聚合物。
還公開了方法,可包括一些方法,其中分析是在與化合物一起孵育后進行的。
還公開了方法,可包括一些方法,其中分析是在少于或等于60秒、45秒、30秒、15秒、10秒、5秒、4秒、3秒、2秒、或1秒中發生的。
還公開了方法,可包括一些方法,其中不均一性是通過從生物傳感器收集生物傳感器輸出測定的,其中生物傳感器輸出包括具有最大強度的導向模式共振峰,和比較半最大強度的峰寬(PWHM)。
還公開了方法,可包括一些方法,其中導向模式是橫向磁場模式。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器是單數形式或多路(multiplexed)形式。
還公開了方法,可包括一些方法,其中當生物傳感器是復數形式,其中生物傳感器嵌于微量滴定板的一個或多個孔中。
還公開了方法,可包括一些方法,其中在微量滴定板的一個孔中有一個生物傳感器。
還公開了方法,可包括一些方法,其中在微量滴定板的一個孔中有多個生物傳感器,其中生物傳感器用或不用屏障物理分隔。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器用屏障物理分隔,其中在孔中確定區室的屏障比確定微量滴定板孔的屏障要低。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器是光學波導生物傳感器。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器是光學波導光柵生物傳感器。
還公開了方法,可包括一些方法,其中在兩個或多個孔的每一個中培養細胞,其中對兩個或多個孔提供刺激事件,其中刺激事件包括在兩個或多個孔中加入化合物,其中從兩個或多個孔中收集生物傳感器輸出,其中將兩個或多個孔的PWHM與對照孔比較,其中對對照孔不提供刺激事件。
還公開了方法,可包括一些方法,其中以每孔高于1、2、3、4、5、10、15、30、45、或60秒的速率收集生物傳感器輸出。
還公開了方法,可包括一些方法,其中以每分鐘多于60、30、15、10、7、5、4、3、2或1孔的速率收集生物傳感器輸出。
還公開了方法,可包括一些方法,其中以每孔高于1、2、3、4、5、10、15、30、45、或60秒的速率比較孔的PWHM。
還公開了方法,可包括一些方法,其中以每分鐘多于60、30、15、10、7、5、4、3、2或1孔的速率比較孔的PWHM。
還公開了方法,可包括一些方法,其中可用單數據點評估化合物毒性。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器輸出是時間依賴性PWHM改變。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器是光學生物傳感器。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器是基于光學的生物傳感器。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器是無標記生物傳感器。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器結合于培養細胞的系統。
還公開了方法,可包括一些方法,其中系統是平板。
還公開了方法,可包括一些方法,其中平板是多孔平板。
還公開了方法,可包括一些方法,其中平板是微量滴定板。
還公開了方法,可包括一些方法,其中在兩個或多個孔的每個中培養細胞,其中微量滴定板由孔組成,其中生物傳感器輸出是在指定時刻每孔總傳感器區域的TM0模式共振角帶的圖像。
還公開了方法,可包括一些方法,其中細胞達到70%鋪滿度。
還公開了方法,可包括一些方法,其中刺激事件包括在兩個或多個孔中加入化合物,其中將加入化合物的孔的TM0模式共振角帶的寬度與未加化合物的TM0模式共振角帶寬度比較,比較TM0模式共振角帶的寬度。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器是基于波導的生物傳感器。
還公開了方法,可包括一些方法,其中基于波導的生物傳感器是基于Nb2O5的光學生物傳感器。
還公開了方法,可包括一些方法,其中細胞是粘附細胞。
還公開了方法,可包括一些方法,其中細胞生長到30%、40%、50%或90%鋪滿度。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器輸出是光學波導光模式譜(OWLS),導向模式的共振峰、或導向模式的共振帶圖像。
還公開了方法,可包括一些方法,其中PWHM的下降表示化合物對細胞有毒。
還公開了方法,可包括一些方法,其中PWHM變寬表示化合物對細胞有毒。
還公開了方法,可包括一些方法,其中PWHM分裂表示化合物對細胞有毒。
還公開了方法,可包括一些方法,其中共振帶變寬表示化合物對細胞有毒。
還公開了方法,可包括一些方法,其中細胞達到至少70%鋪滿度。
還公開了方法,可包括一些方法,其中PWHM的下降表示化合物對細胞有影響。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器與微量滴定板結合。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器嵌入微量滴定板各孔底部。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器是基于光學的無標記生物傳感器。
還公開了方法,可包括一些方法,其中細胞-生物傳感器被化合物覆蓋。
還公開了方法,可包括一些方法,其中化合物在溶液中。
還公開了方法,可包括一些方法,其中起始細胞數能實現增殖增加或增殖減少的分析。
還公開了方法,可包括一些方法,其中細胞數在不存在化合物的情況下達到30-70%鋪滿度。
還公開了方法,可包括一些方法,其中細胞數達到40-60%鋪滿度。
還公開了方法,可包括一些方法,其中細胞數達到45-55%鋪滿度。
還公開了方法,可包括一些方法,其中細胞數達到50%鋪滿度。
還公開了方法,可包括一些方法,其中在生物傳感器上培養的細胞器在和化合物孵育之前含有至少1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、或70,000個細胞。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器輸出在單個時間點收集。
還公開了方法,可包括一些方法,其中收集的生物傳感器輸出是一種譜。
還公開了方法,可包括一些方法,其中收集的生物傳感器輸出是各生物傳 感器全部面積的TM0模式共振角帶圖像。
還公開了方法,可包括一些方法,其中收集的生物傳感器輸出是各生物傳感器全部面積的TM0模式共振角帶圖像。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器輸出包括總角度漂移,其中總角度漂移的下降表明化合物是細胞增殖的抑制劑。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器輸出包括總角度漂移,其中總角度漂移的上升表明化合物是細胞增殖的抑制劑。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器輸出包括入射耦合光的強度,其中入射耦合光的強度對入射光角度作圖。
還公開了方法,可包括一些方法,其中細胞在生物傳感器上培養至少1小時、5小時、10小時、16小時、24小時、36小時、1周或2周。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器輸出包括耦合模式。
還公開了方法,可包括一些方法,其中耦合模式是橫向磁場模式(TM0)。
還公開了方法,可包括一些方法,其中TM0模式對最初細胞接種數作圖。
還公開了方法,可包括一些方法,其中細胞含有受體酪氨酸激酶(RTK),其中細胞懸浮在含血清的培養基中,血清濃度使得細胞在生物傳感器表面附著并生長,其中細胞附著在生物傳感器表面。
還公開了方法,還包括通過將細胞在37℃饑餓培養基中培養,饑餓粘附細胞,其中饑餓培養基是含有低濃度血清的培養基。
還公開了方法,還包括在培養基中至少加入一次緩沖液。
還公開了方法,可包括一些方法,其中刺激事件包括將RTK配體加入到培養基中。
還公開了方法,可包括一些方法,其中培養基缺乏PDGF(血小板衍生生長因子)、EGF、胰島素、TGF-α、胰島素樣生長因子I(IGF-I)、和神經生長因子(NGF)。
還公開了方法,可包括一些方法,其中饑餓培養基具有濃度低于約0.1%的血清或胎牛血清(FBS)。
還公開了方法,可包括一些方法,其中時間依賴性響應發生至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,36,或48小時。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器嵌入具有多個孔的微量 滴定板底部,其中在兩個或多個孔的各孔中培養不同類型的細胞,其中對兩個或多個孔提供刺激事件,其中刺激事件是在兩個或多個孔中加入RTK配體,其中從兩個或多個孔中收集生物傳感器輸出,其中生物傳感器輸出是不同類型細胞的時間依賴性響應。
還公開了方法,可包括一些方法,其中不同類型的細胞需要不同培養條件。
還公開了方法,可包括一些方法,其中在不同類型的細胞中測量或測定RTK的表達水平或細胞表面表達水平。
還公開了方法,還包括將培養的細胞與一種化合物一起孵育,測定化合物是否調節RTK信號傳遞。
還公開了方法,可包括一些方法,其中細胞具有相對高表達水平的RTK,其中生物傳感器嵌入具有多個孔的微量滴定板底部,其中在兩個或多個孔的各孔中培養細胞,其中對兩個或多個孔提供刺激事件,其中刺激事件是在兩個或多個孔中加入RTK配體,其中在兩個或多個孔中加入不同濃度的RTK配體,其中從兩個或多個孔中收集生物傳感器輸出,其中生物傳感器輸出是不同類型細胞的劑量和時間依賴性響應。
還公開了方法,可包括一些方法,其中比較了細胞的劑量和時間依賴性響應。
還公開了方法,可包括一些方法,其中測定了配體的能力。
還公開了方法,還包括分析生物傳感器輸出,以獲得來自細胞的生物物質釋放,從而分析細胞中細胞骨架的狀態。
還公開了方法,可包括一些方法,其中細胞的生物物質釋放依賴于細胞的成孔試劑誘導的通透性。
還公開了方法,還包括在細胞培養物中加入成孔試劑。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器輸出是時間依賴性光學反應。
還公開了方法,可包括一些方法,其中所述成孔試劑是化學試劑或生物化合物,可導致細胞表面膜中形成孔。
還公開了方法,可包括一些方法,其中成孔試劑是皂苷、毛地黃皂苷、菲律賓菌素或鏈球菌溶血素O。
還公開了方法,還包括在細胞培養物中加入成孔試劑后在細胞培養物中加入化合物。
還公開了方法,可包括一些方法,其中篩選一種或多種化合物,以確定是否化合物能干涉細胞內的細胞骨架結構。
還公開了方法,還包括在細胞培養物中加入成孔試劑前在細胞培養物中加入化合物。
還公開了方法,可包括一些方法,其中篩選一種或多種化合物,以確定是否化合物能干涉細胞內的細胞骨架結構。
還公開了方法,還包括步驟:用能檢測標記的裝置檢測標記。
還公開了方法,可包括一些方法,其中標記是熒光標記、放射性標記、或磷光標記。
還公開了方法,可包括一些方法,其中檢測標記的步驟與監測生物傳感器的步驟同時發生。
還公開了方法,可包括一些方法,其中生物傳感器具有兩個區,第一個沉積有不含物質的混合物,第二個沉積有含物質的混合物,從而當細胞在傳感器上孵育時,覆蓋第二個區域的細胞被物質轉染。
還公開了方法,可包括一些方法,其中物質是靶基因、靶蛋白、靶蛋白和標記蛋白的融合蛋白、針對靶標的RNAi、針對靶標的抗體、反義寡核苷酸及其衍生物、反基因寡核苷酸及其衍生物。
還公開了方法,可包括一些方法,其中標記蛋白是His-標記、GFP蛋白或其衍生物。
還公開了方法,可包括一些方法,其中物質與試劑復合,從而使當細胞附著在傳感器存在物質的區域時,細胞能攝取該物質。
還公開了方法,可包括一些方法,其中通過將含有物質的混合物選擇性沉積在沿光柵結構的傳感器表面一半形成區域。
還公開了測定活細胞狀態的方法,包括觀察細胞內含物的動態物質再分布,其中觀察步驟在共振波導光柵生物傳感器上發生。
還公開了測試化合物對細胞的作用的方法,包括在生物傳感器上培養細胞,首先洗滌細胞,饑餓細胞,將化合物與細胞孵育,并用生物傳感器記錄信號。
還公開了方法605,還包括在饑餓步驟后用緩沖液漂洗步驟,或其中細胞生長至高于90%鋪滿度,或其中洗滌細胞兩次,或其中饑餓細胞包括將其僅在DMEM中培養,或其中饑餓細胞進行1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,30,35,40小時,或其中饑餓細胞進行過夜,或其中漂洗緩沖液包含1x常規Hank's平衡鹽緩沖液,20mM HEPES緩沖液,在2.5mM丙磺舒的存在下,pH7.0,或其中信號是鈣信號,或其中在6分鐘內每隔6秒記錄鈣信號,或其中生物傳感器包括HTS7000BioAssay讀數儀,或其中方法在室溫下進行,或其中生物傳感器是EpicTM角度訊問系統,或其中生物傳感器以橫向磁場模式使用,或其中生物傳感器以p-極化TM0模式使用,或其中化合物用漂洗緩沖液稀釋,或其中漂洗緩沖液含有1x常規Hank's平衡鹽緩沖液,20mM HEPES緩沖液,pH7.0,或其中饑餓細胞發生在不含FBS的緩沖液中,或其中化合物是在溶液中,該溶液含有低于0.05%的DMSO,或其中饑餓步驟在37℃下發生,或其中饑餓步驟還在空氣/5%CO2下發生,或其中在化合物溶液和細胞孵育之前,細胞用不含化合物的化合物溶液預處理,直到達到穩態,或其中生物傳感器識別共振帶中央位置的像素密度改變,或其中生物傳感器測量共振帶的角度漂移,或還包括將生物傳感器數據對時間作圖的步驟,或其中增加的信號(P-DMR)意味著傳感體積(sensing volume)內生物分子量的增加,減弱的信號(N-DMR)意味著傳感體積內生物分子量的下降,或該方法識別細胞和化合物的特征,或其中特征包括P-DMR階段,然后是N-DMR階段,其中P-DMR階段的發生速率比N-DMR階段的衰變速率要高,或其中特征包括P-DMR階段,直到P-DMR階段達到評估平臺,或其中特征包括兩個連續的P-DMR事件,其中升高水平的第一個P-DMR階段的發生速率比對第二個升高水平的P-DMR階段的速率要高,或其中特征不包括高于噪聲水平的任何DMR信號,或還包括將生物傳感器的信號對化合物濃度作圖的步驟。
可將細胞培育到20-99%鋪滿度,30-80%鋪滿度,40-65%鋪滿度,70-99%鋪滿度,和80-95%鋪滿度。細胞可以是粘附細胞。粘附細胞是可附著在生物傳感器表面的細胞。刺激事件可包括在細胞培養物中加入化合物。化合物可調節細胞的細胞信號途徑。調節可活化細胞信號途徑。調節可抑制細胞信號途徑。化合物可調節細胞上的細胞表面受體。化合物調節可以是受體的激動劑。化合物調節可以是受體的拮抗劑。細胞表面受體可以是G蛋白偶聯受體(GPCR)、離子通道、受體酪氨酸激酶、細胞因子受體、整聯蛋白受體、Na+/H+交換蛋白受體、和免疫受體。受體酪氨酸激酶可以是表皮生長因子受體(EGFR)、血小板衍生生長因子受體(PDGFR)、成纖維細胞生長因子受體(FGF)、胰島素受 體、血管內皮生長因子受體(VEGFR)。
化合物可以調節細胞內的細胞骨架成分。調節物使細胞骨架結構去穩定。調節物穩定細胞骨架結構。化合物可以調節胞內酶、胞內激酶、胞內細胞器、或胞內蛋白。化合物可調節胞外基質。
收集來自生物傳感器的生物傳感器輸出數據步驟包括收集生物傳感器輸出數據參數。生物傳感器輸出數據參數是與刺激事件的動力學有關的參數。生物傳感器輸出參數可以包括分析生物傳感器輸出數據的總體動力學。分析總體動力學可包括分析相變完成的速率。分析總體動力學可包括分析完成數據輸出所需的時間。分析總體動力學可包括分析數據輸出總相所需的時間長度。分析總體動力學可包括分析P-DMR階段的總持續時間。分析總體動力學可包括分析N-DMR階段的總持續時間。分析總體動力學可包括分析獲得P-DMR全幅值的速率。分析總體動力學可包括分析獲得N-DMR全幅值的總時間長度。分析總體動力學可包括分析獲得P-DMR全幅值的總時間長度。分析總體動力學可包括分析從P到N-DMR階段的過渡時間τ。
生物傳感器輸出參數可包括分析生物傳感器輸出數據的相。分析相可包括分析相變。分析相可包括分析正向物質再分布(P-DMR)信號。分析相可包括分析反向物質再分布(N-DMR)信號。分析相可包括分析凈零向物質再分布(凈零DMR)。分析相可包括分析正向物質再分布(P-DMR)信號的形狀。分析相可包括分析正向物質再分布(P-DMR)信號的振幅。分析相可包括分析反向物質再分布(N-DMR)信號的形狀。分析相可包括分析反向物質再分布(N-DMR)信號的振幅。
生物傳感器輸出參數可包括生物傳感器輸出數據的全面動力學。分析全面動力學可包括分析生物傳感器輸出產生的整條曲線的形狀。生物傳感器輸出參數是與共振峰有關的參數。生物傳感器輸出參數可包括分析在光耦合生物傳感器時,光強對入射角。生物傳感器輸出參數可包括分析在光耦合生物傳感器時的光強對光波長。生物傳感器輸出參數可包括分析峰位置。分析峰位置可包括分析在峰值強度位置之前的半最大峰強度位置。分析峰位置可包括分析在峰值強度位置之后的半最大峰強度位置。
生物傳感器輸出參數可包括分析共振峰上一點的強度。分析共振峰強度可包括分析峰強度的強度。分析共振峰強度可包括分析在共振峰上,峰值強度之前發生的半最大峰強度的強度。分析共振峰強度可包括分析在共振峰上,峰值 強度之后發生的半最大峰強度的強度。
該方法還可包括收集第二生物傳感器輸出參數。第二生物傳感器輸出參數可包括分析峰位置。生物傳感器輸出參數可包括分析峰形。分析峰形可包括測定共振峰下面積。共振峰下面積可僅包括在共振峰上存在的半最大強度點之間連線以上的面積。分析峰形可包括分析半最大強度點的共振峰寬度。生物傳感器輸出參數可以是與共振帶圖像有關的參數。可通過用穿過生物傳感器的光點對生物傳感器進行光照,并用接收系統對穿過生物傳感器的入射耦合光強分布作圖收集共振帶圖像。接收系統可以是CCD照相機。有關共振帶圖像的參數可以是帶形、帶位置、帶強度或光強分布。
可分析半最大峰寬(PWHM)聯合最大強度位置。可同時分析生物傳感器。從各孔的生物傳感器收集數據點的時間可小于1小時、30分鐘、5分鐘、1分鐘、30秒、10秒、5秒、2秒、1秒,而且是生物擴散限制的。可通過在生長培養基中培養細胞,使細胞為增殖期,或可通過在饑餓培養基中培養細胞,使細胞為休眠期,或是分化狀態,或特定的細胞周期狀態。饑餓培養基是任何降低細胞培養物細胞增殖能力的培養基。
方法還可包括在細胞培養基中至少一次加入緩沖液的步驟,其中所用的緩沖液可基于根據細胞類型和靶標-化合物相互作用的性質的最佳分析。可以連續方式,以1秒、3秒、5秒、10秒、20秒、30秒、1分鐘、或5分鐘、30分鐘的采樣速率進行監測。特征輸出可包括動態物質再分布反應,包括三個相中的至少一個:正-DMR、反-DMR、和凈零-DMR階段。可從細胞系產生細胞,或是遺傳工程改造的變體細胞系。可分析化合物在細胞上的吸收、分布、代謝和毒性來測定化合物的作用。作用可包括化合物在細胞上的功能評估,并鑒定對細胞的吸收、分布、代謝、排出和毒性的作用。
生物傳感器輸出與細胞物質再分布的改變有關。可觀察作為生物傳感器反射光束的角度或光譜變化的生物傳感器輸出。該方法還包括在細胞培養基中至少一次加入緩沖液。化合物可以是抗癌化合物,或可能的抗癌化合物。在生物傳感器上可有至少10x105個細胞。細胞可達到至少80%鋪滿度。生物傳感器可嵌入微量滴定板。細胞可在生物傳感器上生長至少1小時、5小時、10小時、16小時、24小時、36小時、1周或2周。生物傳感器能分辨與存活細胞接觸的生物傳感器表面的一定區域。被影響的細胞可釋放出一部分胞內成分或是死細胞。
該方法還包括將細胞-生物傳感器與化合物一起孵育。化合物是化學物質、生物化學物質、生物分子、藥物或聚合物。該方法還包括在與化合物一起孵育后進行分析。可在少于或等于60秒、45秒、30秒、15秒、10秒、5秒、4秒、3秒、2秒、或1秒中內進行分析。不均一性可通過從生物傳感器收集輸出測定(其中該輸出產生具有最大強度的導向模式共振峰),和比較半最大強度的峰寬(PWHM)來測定。導向模式是橫向磁場模式。
生物傳感器可以是單數形式或復數形式。當生物傳感器是復數形式,生物傳感器可嵌于微量滴定板的一些孔中。在微量滴定板的一個孔中可有一個生物傳感器。在微量滴定板的一個孔中可有多個生物傳感器,其中生物傳感器可用或不用屏障物理分隔。當生物傳感器用屏障物理分隔時,確定區室的屏障可比確定微量滴定板孔的屏障要低。生物傳感器可以是光學波導生物傳感器。生物傳感器是光學波導光柵生物傳感器。
該方法還可進一步包括收集時間依賴性PWHM改變。光學波導光模式譜可以是導向橫向磁場模式的共振峰。生物傳感器可以是光學生物傳感器。生物傳感器可以是基于光學的生物傳感器。生物傳感器可以是無標記生物傳感器。生物傳感器可與培養細胞的系統結合。系統可以是平板。平板可以是具有多孔的平板。平板可以是微量滴定板。細胞可達到70%鋪滿度。
方法還可包括步驟:獲得TM0模式共振角帶的寬度,將加入化合物的孔的TM0模式共振角帶的寬度與未加化合物的TM0模式共振角帶寬度比較,比較TM0模式共振角帶的寬度。生物傳感器可以是基于波導的生物傳感器。基于波導的生物傳感器可以是基于Nb2O5的光學生物傳感器。細胞可以是粘附細胞。細胞可生長到30%、50%或90%鋪滿度。生物傳感器輸出可以是光學波導光模式譜(OWLS)、或導向模式的共振峰、或導向模式的共振帶圖像。PWHM的變化可表示化合物對細胞有毒。PWHM變寬可表示化合物對細胞有毒。PWHM分裂可表示化合物對細胞有毒。共振帶變寬可表示化合物對細胞有毒。細胞可達到至少70%鋪滿度。生物傳感器可與微量滴定板結合。生物傳感器可嵌入微量滴定板各孔底部。生物傳感器可以是基于光學的無標記生物傳感器。細胞-生物傳感器可被化合物覆蓋。化合物可在溶液中。起始細胞數能實現增殖增加或增殖減少的分析。細胞數在不存在化合物的情況下可達到30-70%鋪滿度。細胞數可達到40-60%鋪滿度。細胞數可達到45-55%鋪滿度。細胞數可達到50%鋪滿度。在生物傳感器上培養的細胞器在和化合物孵育之前可含有至少1000、2000、3000、 4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、或70,000個細胞。
輸出可在單個時間點收集。收集的生物傳感器輸出可以是一種譜。收集的生物傳感器輸出可以是各生物傳感器全部面積的TM0模式共振角帶圖像。收集的生物傳感器輸出可以是各生物傳感器全部面積的TM0模式共振角帶圖像。該方法還包括獲得提供總角度漂移的輸出,其中總角度漂移的下降表明化合物是細胞增殖的抑制劑。該方法還包括獲得提供總角度漂移的輸出,其中總角度漂移的上升表明化合物是細胞增殖的抑制劑。收集的輸出可獲得入射耦合光的強度,其中入射耦合光的強度對入射光角度作圖。細胞在生物傳感器上培養至少1小時、5小時、10小時、16小時、24小時、36小時、或過夜。
輸出可以是耦合模式。耦合模式可以是橫向磁場模式(TM0)。TM0模式還可對最初細胞接種數作圖。該方法還包括37℃在含有低濃度血清的培養基中饑餓粘附的細胞一定時間。該方法還包括在細胞培養基中加入至少一次緩沖溶液一定的時間。該方法還可包括在培養基中加入含有RTK配體的溶液。細胞培養基可缺乏PDGF(血小板衍生生長因子)、EGF、胰島素、TGF-α、胰島素樣生長因子I(IGF-I)、和神經生長因子(NGF)。饑餓培養基可具有濃度低于約0.1%的血清或牛血清白蛋白(BSA)。時間依賴性響應可發生至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,36,或48小時。不同類型的細胞可需要不同培養條件。監測的細胞生物物質釋放可依賴于細胞的成孔試劑誘導的通透性。成孔試劑是化學試劑或生物物質,可導致細胞表面膜中形成孔。成孔試劑可以是皂苷、毛地黃皂苷、菲律賓菌素或鏈球菌溶血素O。
VII.實施例
列出下列實施例是為了給本領域一般技術人員提供有關于本文所要求的化合物、組合物、制品、裝置和/或方法是如何制備和評估的完整公開和描述,純粹是示范性的,不意味著限制公開內容。已常識確保數據(例如量、溫度等)的準確性,但仍可能存在一些錯誤和誤差。除非另外說明,份是重量份,溫度是℃,或在環境溫度下,壓力是或接近大氣壓。
1.實施例1基于生物傳感器的細胞毒性篩選
常根據化合物的細胞毒性和抗增殖作用來表征化合物,以表征可能的抗癌藥。此類的一種表型是當細胞接觸細胞毒性劑(包括二甲基亞砜(DMSO))時,質膜完整性受損。使用基于波導的生物傳感器技術,可檢測監測DMSO對中國倉鼠卵巢(CHO)和A431細胞的作用是否可行。約10X105個細胞置于Corning Epic LID微板的各孔中。這些細胞在血清培養基中培養過夜,以確保細胞附著在基材表面,并達到至少80%鋪滿度。檢測了細胞對不同濃度DMSO(1%、2%、5%、10%、15%、18%、和20%)的反應。高濃度的(約≥25%)DMSO導致體積指數改變,超過了所用傳感器的最大動態范圍,信號喪失。對每種細胞系進行至少兩組實驗。
a)材料和方法
所有細胞系購自美國典型培養物保藏中心。DMSO獲自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)。動物細胞的活/死細胞存活試劑盒獲自Molecular Probes(Eugene,Oregon)。
在補充有10%胎牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的Dulbecco's改良Eagle's培養基(DMEM)中培養A431和CHO-K1細胞。對于細胞培養,將約10x105個細胞(A431或CHO-K1)懸浮在200μl培養基中,置于96孔Corning Epic生物傳感器微量滴定板的各孔中,37℃,空氣/5%CO2培養過夜。分析前,細胞用對應培養基洗滌一次。分析中,100μl培養基中的細胞中加入兩個含有20mM HEPES,pH7.4的25μl HBSS緩沖液,各分離至少15分鐘,然后加入50μlDMSO溶液。在所有這些步驟中,用平行角訊問系統監測細胞反應的實時動力學。
分析后,立刻用供應商推薦的方案對相應得到的細胞進行活/死染色。染色后,用熒光顯微鏡檢(Zeiss Axioplan熒光顯微鏡)觀察處理和未處理細胞的形態和熒光分布。
b)結果
結果顯示,附著在生物傳感器上的細胞產生類似的反應曲線。如圖29所示,CHO細胞層的DMSO誘導的劑量響應和時間依賴性響應曲線表明,DMSO濃度小于20%時,反應基本無特征,除了在引入DMSO溶液后反應逐漸下降。注意 到有最初和迅速的增加時期,這是由于引入所有濃度的DMSO后體積指數改變。然而,當DMSO濃度達到20%,觀察到4個事件:(A)由于DMSO溶液加入之后立即發生的由于體積指數的變化而產生的大的響應信號;(B)可能由于兩種液體在孔中的混合而產生的小的減弱的信號;(C)可能由于DMSO在某些濃度下滲入并替代細胞內的生物液體而導致的緩慢而穩定的增強的信號;和(D)由于高濃度DMSO的毒性引起的細胞蛋白質或其它生物分子的喪失并因此導致的細胞表面膜喪失完整性而產生的長時間的減弱的信號。已知折射率值是:對于該研究中使用的水相緩沖液系統,1.3328;DMSO,1.437;和蛋白質約1.5。另外,在細胞中有約70%(重量)的生物液,它主要有水組成,具有1.3328的折射指數。另外30%含有蛋白質、DNA、RNA、脂類分子。還已知當DMSO濃度低于10%時,細胞膜在實驗持續過程中不受DMSO顯著影響;然而當DMSO濃度在10%-20%之間時,受損細胞膜百分數增加。在較高濃度,幾乎所有細胞膜都受損(Beske,O.,等,“A novel encoded particle technology that enables simultaneous interrogation of multiple cell types”,J.Biomol.Screening.2004,9,173-185))。
類似的劑量響應曲線在作用于A431細胞的DMSO中也觀察到(圖30)。CHO細胞和A431細胞系之間的事件B的不同行為可能是由于兩種類型的細胞在基材上的粘附和形態不同。CHO細胞傾向于比A431細胞鋪開少,導致A431粘附在基材上的層更薄,意味著當組成事件D的受影響細胞的物質喪失在兩種細胞系中相似時,生物液交換事件(事件C)比生物再分布事件要較不明顯。
2.實施例2用光學傳感器HT篩選化合物毒性
a)高通量篩選化合物毒性的方法
本發明的一個方面提供了適合用無標記光學傳感器高通量篩選化合物毒性和凋亡的方法。該方法使人能夠在幾秒鐘內檢測整個平板的化合物毒性。
該方法的原理基于一個事實,即給定化合物的毒性能導致細胞滲漏,甚至死亡。這因而導致培養細胞的傳感器表面的不均一性。在毒性研究過程中,生物傳感器感應三種區域:具有活細胞的區域,具有死亡或正在死亡細胞的區域(其中死細胞傾向喪失其胞內成分,導致折射率改變),和無細胞區域。不均一性的形成可導致給定導向模式的共振峰的PWHM改變,或共振帶圖像的寬度和分布的改變,這都依賴于細胞密度。在特定情況(在膜表面培養的細胞具有 朝向,或具有某類優選結構,或某些區域的細胞對毒性化合物敏感)下,化合物毒性可導致產生精細結構,例如肩部(shoulders)(導致共振峰和帶變寬),甚至分裂共振峰。
考慮細胞在波導傳感器平板上預培養并達到高度鋪滿度(>75%),傳感器大部分感應折射指數約為1.37的活細胞以及折射指數約為1.33的覆蓋的培養基。TM0峰的PWHM較低。在加入毒性化合物后,細胞開始受到影響。受影響的細胞同時產生物理和生理改變(即形態學、形狀和胞內成分重排)。最終受影響細胞死亡。在化合物處理一段時間后,有混合群的細胞:活細胞、受影響細胞和死亡細胞。因此,隨著化合物處理后時間增加,TM0峰的PWHM開始從其較低水平上升,在某一時刻達到其最大值,并開始再次衰減到其原始的較低水平,而且總體響應(即角度或波長漂移)也下降。達到其最大值的動力學視細胞系和化合物作用于細胞的機制而定。該過程是細胞粘附和鋪開過程的逆向過程。
在一個實施例中,本發明提供了一種使用光學生物傳感器高通量篩選對細胞的化合物毒性的方法,包括:(a)提供在每孔底部嵌入有基于光學的無標記生物傳感器的微量滴定板;(b)將細胞置于每孔中,以覆蓋生物傳感器,從而使細胞附著在生物傳感器表面,并達到高度鋪滿度;(c)在每孔的細胞培養基中加入化合物溶液;(e)在某一時刻收集光學波導光模式譜。將各化合物的PWHM與對照孔比較,該孔中細胞不接觸任何化合物溶液,可用單數據點評估化合物的毒性。如必需,還可記錄時間依賴性PWHM改變以研究動力學。
在另一個實施例中,本發明提供了另一種評估化合物毒性的方法,包括:(a)提供在每孔底部嵌入有基于光學的無標記生物傳感器的微量滴定板;(b)將細胞置于每孔中,以覆蓋生物傳感器,從而使細胞附著在生物傳感器表面,并達到所需的鋪滿度;(c)在每孔的細胞培養基中加入化合物溶液;(e)在某一時刻收集各孔的整個傳感器區域的TM0模式共振角帶圖像。將用化合物溶液處理的傳感器的共振帶寬度與對照孔的比較,對照孔中細胞不接觸任何化合物溶液;可評估化合物毒性。
根據細胞毒性和抗增殖效果描述化合物常用于描述可能的抗癌藥。一種表型是當細胞接觸細胞毒性劑(包括二甲亞砜(DMSO))時,質膜完整性受損。使用基于波導的生物傳感器技術,用高通量方法檢測了在中國倉鼠卵巢(CHO)和A431細胞上監測DMSO的效果的可行性。
圖31A顯示培養于Nb2O5基光學波導生物傳感器上具有不同鋪滿度度(30 %、50%和90%)的CHO細胞層的入射耦合光的強度,它是入射角的函數。耦合模式是橫向磁場(TM0)模式。圖31B顯示了計算TM0模式的半最大峰寬(PWHM),并對CHO細胞鋪滿度度作圖。隨著細胞鋪滿度度增加,PWHM增加,在約50%鋪滿度時達到最大值,然后開始下降到起始值。值得注意的是,在所有鋪滿度水平上,細胞的入射耦合峰具有小肩峰,但對于沒有細胞附著的傳感器來說并沒有。這可能是由于CHO細胞傾向于附著于具有優選朝向的光柵傳感器表面(見圖35A)。
圖32顯示在波導光柵傳感器上培養的具有兩種不同鋪滿度度,5%(左)和75%(右)的CHO細胞層的TM0模式共振峰。在加入DMSO后(最終濃度為18%),在不同時刻記錄共振峰譜。對于小于約25%的細胞密度,PWHM值不隨時間改變。然而,當傳感器上細胞鋪滿度度高(>70%)時,PWHM起初上升,隨后下降。不僅共振峰變寬,在DMSO處理后約25分鐘時出現肩部等細微結構,甚至共振峰分裂。有趣的是,響應DMSO處理的共振峰變寬和峰形改變是動態過程,提示DMSO誘導的細胞響應與某些細胞信號途徑,例如凋亡一致。
圖33顯示了不同鋪滿度度的CHO細胞層覆蓋的整個傳感器的TM0模式共振帶圖像。在用緩沖液(2欄)、18%DMSO(1欄)處理25分鐘后取得圖像。圖像提示(i)用緩沖液處理的細胞不導致整個傳感器的共振帶有任何改變,不論細胞的鋪滿度度如何;(ii)用18%DMSO處理的細胞產生鋪滿度度依賴性的共振帶變寬。當細胞鋪滿度度高于70%,DMSO-誘導的共振帶變寬。這些結果提示,可用共振帶變寬作為化合物毒性的特征;細胞密度或鋪滿度度對于使得這類評估有效是重要的。與共振峰譜相似,響應DMSO處理的共振帶圖像變寬或形狀改變是動態過程,提示DMSO-誘導的細胞響應可能與某些細胞信號途徑,例如凋亡有關。更重要的是,微量滴定板中的所有96個傳感器的共振帶圖像可在3秒內收集,提示基于共振帶圖像或譜的本發明方法提供了細胞毒性評估和化合物毒性篩選的超高通量技術。
圖34顯示了以相同鋪滿度度(約95%)的CHO細胞層覆蓋整個傳感器的TM0模式共振帶圖像。在用緩沖液(欄2的6個孔)和不同濃度的DMSO(1欄中的6個孔,3欄中的6個孔,如圖34所示)處理25分鐘后獲得圖像。結果顯示,DMSO的毒性作用依賴于濃度;僅較高濃度導致顯著的細胞毒性,如帶形改變所示。特別有趣的發現是當所用的DMSO濃度為約15%時,出現第二條共振帶,可能是由于CHO細胞培養物在傳感器上的優選朝向。CHO細胞似乎在培養條件 下與光柵結構的排列一致(見圖35)。發現這些結果與常規活/死細胞染色法一致,并用該方法驗證(數據未顯示)。
3.實施例3高通量增殖分析
圖36A顯示當三種不同接種數的細胞用于在常規培養條件下培養36小時,在波導光柵傳感器表面培養的CHO細胞作為入射角函數的入射耦合光強度。耦合模式是橫向磁場(TM0)模式。圖36B顯示計算TM0模式的半最大峰寬(PWHM)并對CHO最初接種數量作圖。隨著細胞的最初接種數增加,PWHM增加,在20000-30000最初接種細胞處達到最大值(對應鋪滿度度約為50%),并開始下降到起始值。值得注意的是,在所有鋪滿度水平,細胞的入射耦合峰有明顯肩峰,但對于沒有細胞附著的傳感器沒有。這也可能是由于CHO傾向于以優選朝向附著在光柵傳感器表面(見圖35)。有趣的是,這里所示的結果與在固定時間段后,用不同接種數的細胞以達到不同細胞密度獲得的一致(見圖31),提示該方法是可再現的。
圖37顯示在波導光柵傳感器上培養36小時(不同的孔含有不同起始接種數的細胞)后,CHO細胞覆蓋的整個傳感器的TM0模式共振帶圖像。觀察整個傳感器的TM0模式共振帶圖像的形狀和位置依賴于最初接種的細胞數,提示傳感器對細胞密度敏感;CHO細胞的增殖速率依賴于最初接種的細胞數,如在用Molecular Probes的活/死細胞試劑盒染色后,用熒光顯微鏡進行細胞密度分析驗證的。對最初接種數為10000、20000、30000、40000和50000個細胞,對應的鋪滿度度分別是5%、30%、55%、75%、95%。
4.實施例4用生物傳感器進行細胞信號途徑研究
a)材料和方法
所有細胞系購自美國典型培養物保藏中心。所有化學物質購自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO),或Tocris Chemical Co.(St.Louis,MO)。
在補充有10%胎牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的Dulbecco's改良Eagle's培養基(DMEM)中培養A431和CHO-K1細胞。對于細胞培養,將一定數量的細胞(2x105-1x106個細胞,A431或CHO-K1)懸浮在200μl培養基中,置于96孔Corning Epic生物傳感器微量滴定板的各孔中,37℃,空氣/5%CO2培養一段時間,直到細胞密度達到約90%或以上(除非另外說明)。得到的 細胞被稱為“增殖性”細胞。通過將所需鋪滿度度的增殖性細胞在不含或很少(約0.1%胎牛血清(FBS))的培養基中培養至少16小時獲得“休眠性”細胞。
直接將增殖性或休眠性細胞用于分析,或用對應的培養基洗滌一次再用于分析(兩者都不導致細胞響應中的明顯差異)。在分析過程中,將100μl培養基中的細胞中加入兩個含有20mM HEPES,pH7.4的25μl HBSS緩沖液中,各分離至少15分鐘,然后加入50μl含有刺激物的溶液。在所有步驟中,使用平行角度訊問系統監測細胞反應實時動態。為了化合物作用研究,使用改變的方案,即用50μl培養基開始,然后進行如下依次處理:25μlHBSS緩沖液兩次(每次分離至少15分鐘)、50μl化合物溶液、和最后50μl含刺激物的溶液。
所用的傳感器是96孔Corning Epic生物傳感器微量滴定板(如圖1和圖2a所示),并直接用于細胞培養物。所用的檢測系統是06-24-2003提交的美國專利申請號10/602,304(于12-30-2004出版,公開號為US-2004-0263841)、12-21-2004提交的美國專利申請號11/019,439、和N.Fontaine等于2005年3月31日提交的美國專利申請“OPTICAL INTERROGATION SYSTEM AND METHOD FOR2-D SENSOR ARRAYS”中的那些,在此完整引入以供參考,至少是生物傳感器及其用途的部分。
b)結果
(1)實時監測配體結合和隨后的RTK信號傳遞事件
圖6A顯示休眠或饑餓A431細胞層在加入8nM EGF之前和之后的時間依賴性響應(用光學生物傳感器監測)。A431細胞系是癌細胞系,內源過度表達EGFR。將含有10%胎牛血清(FCS)的Dulbecco's改良Eagle's培養基(DMEM)中的A431細胞加到微量滴定板的各孔中,在各孔底部具有波導生物傳感器。細胞37℃培養過夜,用僅含0.1%血清的培養基交換血清培養基,繼續培養細胞另18小時。在室溫下(約20℃)進行整個時間過程。加入EGF(A)后,EGF處理休眠A431細胞(通過在0.1%胎牛血清(FBS)中培養18小時獲得),產生由三個不同的依次相組成的時間依賴性響應:(i)信號增加的正相(P-DMR)(圖6A的點C到D),(ii)凈零相(點D到E),和(iii)具有下降信號的衰變相(N-DMR)(點E到F到G)。注意到信號有迅速的響應改變,持續小于20秒(圖6A的點B到C),它在孔中加入50ml EGF時發生。該迅速改變主要是由于體積指數(bulk index)改變,臨時覆蓋了任何DMR信號。測得的P-DMR 信號主要是由于胞內成分向活化的EGFR募集,以及由于在EGFR活化后質膜內陷造成細胞扁平,而細胞脫離和受體內化是N-DMR事件的兩個主要原因。然而P-DMR事件可能還與和細胞功能無關的事件有關,包括細胞培養基和化合物溶液之間的溶液擴散和溫度差異。
上述步驟在響應曲線中的動力學與文獻中所報道的EGF-誘導的EGFR信號傳導的配體結合、磷酸化和運輸事件(B.Schoeberl,C.Eichler-Jonsson,E.D.Gilles,G.Muller,“Computational Modeling of the Dynamics of the MAP Kinase Cascade Activated by Surface and Internalized EGF Receptors,”Nat.Biotech.20,370(2002))一致。生物學和生物化學研究已顯示在37℃,EGF-結合受體可在5-20分鐘內內化入位于靠近細胞膜內面的早期內含體。然后,這些EGFR與其它成分復合,被運輸到晚期內含體(20-60分鐘)和溶酶體(>60分鐘)降解,兩者都與細胞膜的內面相對較遠(即在運輸過程中,這些受體朝離開傳感器表面的方向移動)。受體和配體通過不同區室存在連續流動;多個步驟顯示它們的完全動態分布。由于迅速內化,EGF結合的受體僅在細胞表面停留相對較短的時間(約3分鐘)。
(2)測定EGFR表達水平和細胞表面表達的方法
內源過度表達表皮生長因子受體(EGFR,約1,700,000拷貝/細胞)的A431細胞是EGFR信號傳導的廣泛研究的模型(A.Glading,P.Chang,D.A.Lauffenburger,和A.Wells,“Epidermal growth factor receptor activation of calpain is required for fibroblast motility and occurs via an ERK/MAP kinase signaling pathway,”J.Biol.Chem.2000,275:2390–2398)。用EGF在室溫或37℃刺激休眠A431細胞最終導致受體內吞,折射形態學改變和細胞從胞外基質上脫離(Z.Lu,G.Jiang,P.Blume-Jensen,和T.Hunter,“Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase,”Mol.Cell Biol.2001,21,4016–4031)。因此,EGF刺激導致A431細胞中顯著的物質再分布,如用陣列訊問系統實時測量的(見圖6A、圖18)。結果顯示了A431細胞的EGF-誘導的DMR響應強烈依賴于培養條件。在0.1%FBS中培養20小時的A431細胞的EGF處理產生了由三個不同的依次相組成的時間依賴性響應:(i)信號增加的正 相(P-DMR)(圖6A的點C到D),(ii)凈零相(點D到E),和(iii)具有下降信號的衰變相(N-DMR)(點E到F)。然而,與休眠A431細胞相比,用0.1%FBS處理僅4小時的A431細胞產生類似響應,但動力學改變,幅度小得多。相反的,增殖性A431細胞(用10%FBS培養)僅產生響應EGF刺激的P-DMR事件。此外,休眠或增殖性中國倉鼠卵巢(CHO)細胞都未觀察到顯著響應,與CHO細胞不內源性表達EGFR的事實一致(E.Livneh,R.Prywes,O.Kashle,N.Reiss,I.Sasson,Y.Mory,A.Ullrich,and J.Schlessinger,“Reconstitution of human epidermal growth factor receptors and its deletion mutants in cultured hamster cells,”J.Biol.Chem.1986,261,12490–12497)。這些結果提示EGF-誘導的DMR信號依賴于EGFR。
圖39總結了這三種類型細胞的P-DMR和N-DMR。結果顯示,當CHO細胞與EGF孵育時,沒有清楚的P-DMR或B-DMR信號,與CHO細胞不表達EGFR的事實一致。相反,對于休眠A431細胞,用EGF刺激誘導的P-DMR和N-DMR信號分別是3.08和2.34。然而,未饑餓(即增殖性)A431細胞產生小得多的P-DMR信號,沒有明顯N-DMR。這些結果確認了血清生長培養基影響EGFR細胞表面表達水平這一事實;由于血清含有EGF和許多其它生長因子,較高血清培養基得到較低細胞表面EGFR表達。
(3)測定配體對RTK的能力的方法
如圖7所示,用不同濃度的EGF刺激都導致類似的響應(圖7A);然而,三種限定響應的主要參數顯示明顯傾向于所用的EGF濃度。EGF濃度越高,(i)P-DMR和N-DMR信號的幅度越大,(ii)P-DMR和N-DMR事件越快,和(iii)從P-DMR到N-DMR事件的過渡時間τ越短。P-DMR事件涉及細胞功能相關和其它影響。可能的影響包括但不限于由于處理引起的細胞扁平、細胞膜內陷、胞內成分募集和細胞骨架重建,和EGF結合(程度較小)。非細胞功能相關事件(包括細胞培養基和化合物溶液的溶液擴散和溫度差異)也可能影響分析。因此,我們觀察到總P-DMR幅度與EGF濃度的復雜關系。當P-DMR事件的幅度顯示與EGF濃度有復雜關系時,N-DMR信號的幅度清楚的對EGF濃度飽和,得到約1.45nM的EC50(圖7B)。發現過渡時間τ(秒)跟隨EGF的遞增濃度C指數下降(圖7C):
τ(C)=946*e-0.144C+1130
另外,N-DMR信號的衰變可與非線性回歸擬合。獲得的一相衰變常數κ也是可飽和的,得到Kd5.76nM(圖7D)。結果表明(i)EGF誘導的DMR信號依賴于EGFR活化;(ii)可用光學生物傳感器基于配體誘導的物質再分布信號測定配體能力。
(4)篩選在不同階段影響RTK信號傳導的調節物的方法
圖40顯示用不同化合物預處理對饑餓的A431細胞層8nM EGF誘導的信號傳導的時間依賴性響應的影響。圖41總結了不同情況下結合和DMR信號的凈變化。結果顯示,細胞可通透的發動蛋白抑制肽(DIP)(Burke,P.,等,“Regulation of epidermal growth factor receptor signaling by endocytosis and intracellular trafficking”,Mol.Biol.Cell.2001,12:1897–1910)完全封閉N-DMR信號,但以慢得多的動力學使P-DMR信號輕微增加。DIP是一種GTPase發動蛋白的細胞可通透抑制劑,競爭性抑制發動蛋白與突觸特異性蛋白質(amphiphysin)的結合,防止胞內吞(Burke,P.,等,“Regulation of epidermal growth factor receptor signaling by endocytosis and intracellular trafficking”,Mol.Biol.Cell.2001,12:1897–1910)。這些觀察結果提示,N-DMR信號涉及受體移位及其相關細胞形態學改變,因為EGF-誘導的EGFR內化主要是通過發動蛋白依賴性途徑發生的,并涉及細胞骨架重排,而發動蛋白與活化EGFR的偶聯影響EGF結合親和力。DIP存在下,總P-DMR信號比不存在DIP時高50%,提示在P-DMR期間(圖6A的C到D),有一些活化的EGFR已被內化。已知EGF結合的受體由于迅速內化,37℃下僅在細胞表面停留較短時間(約3分鐘)。此外,估計在運輸過程中,形成的各48.7%包被的(coated)和96.2%的光滑小窩(smooth pit)的EE循環回到細胞表面,即通過披有網格蛋白的小窩使受體內化足夠引起大部分內吞。因此,通過包被的小窩EE小泡進行受體內化是受體在細胞內聚集的主要機制,當配體存在于系統中時,情況尤其如此。
用渥曼青霉素預處理饑餓的A431細胞對P-DMR和N-DMR信號及其動力學沒有任何明顯影響。渥曼青霉素是磷酯酰肌醇3-激酶(PI 3-激酶)的一種強選擇性細胞可通透的不可逆抑制劑,其IC50是2-4nM(Powis,等,“Wortmannin,a potent and selective inhibitor of phosphatidylinositol-3-kinase”,(1994)Cancer Res.54 2419)。這提示PLC-γ途徑的封閉不影響細胞響應 EGF刺激的兩種事件。
用生長激素(GH)、PD98059和PP1預處理饑餓的A431細胞(也見圖43)不顯著降低結合和DMR信號,但也導致P-DMR和N-DMR事件的動力學下降。PD98059是特異性的有絲分裂原活化的蛋白激酶激酶(MAPKK/MEK),通過與MEK的無活性形式結合起作用,因此防止它被cRAF或MEK激酶磷酸化(IC50=2-7μM)(Alessi,等,“PD98059is a specific inhibitor of the activation of mitogen-activated protein kinase kinase in vitro and in vivo”,November17,1995,J.Biol.Chem.,Vol.270,No.46,pg.27489-27494)。用PD98059封閉MAPKK可能減少信號大小以及有EGFR和EGF結合的細胞響應的持續時間。PP1是Src家族酪氨酸激酶的強抑制劑,抑制p56lck和p59fynT(IC50分別為5和6nM),也中度抑制p38、CSK、PDGF受體、RET衍生的癌蛋白、c-Kit和Bcr-Ab1(Liu等,Structural basis for selective inhibition of Src family kinases by PP1”,(1999)Chem.Biol.6,671)。表皮生長因子(EGF)與其受體結合,導致網格蛋白重鏈在酪氨酸1477處(位于控制網格蛋白裝配的結構域中)快速磷酸化。EGF介導網格蛋白磷酸化,隨后網格蛋白重分布到細胞周質,是EGF受體(EGFR)信號傳導下游活化SRC激酶的產物。在缺乏SRC激酶的細胞、或用特異性SRC家族激酶抑制劑處理過的細胞中,網格蛋白磷酸化和再分布的EGF刺激沒有發生,EGF胞內吞延遲。這都和目前的觀察一致。
生長激素(GH)是四螺旋束蛋白,它和許多類激素和細胞因子具有結構相似性,包括促乳素和各種白介素以及集落刺激因子(Huang,Y.,等,“Growth hormone-induced phosphorylation of epidermal growth factor(EGF)receptor in3T3-F442A cells”,J.Biol.Chem.278,18902-18913)。GH通過與GH受體(GHR)(一種細胞因子受體超家族的細胞表面糖蛋白成員)相互作用,發揮其復雜的體細胞和代謝調節作用。近來的研究提示,在GHR和EGFR家族成員之間有交集,信號傳遞受體似乎全異類型的例子(分別是細胞因子受體和酪氨酸激酶受體家族)。GH導致表皮生長因子受體(EGFR;ErbB-1)及其家族成員ErbB-2磷酸化。顯示GH-誘導的EGFR酪氨酸磷酸化需要JAK2,但不是EGFR的激酶活性。GH導致基底水平和EGF-誘導的ErbB-2酪氨酸激酶活化和酪氨酸磷酸化的減少,提示GH導致ErbB2的ERK途徑依賴性磷酸化,從而使其對響應EGF的活化去敏化。熒光顯微鏡研究表明,EGFR-氰基熒光蛋白嵌 合體的EGF-誘導的胞內再分布由于GH共處理顯著減少。這也與目前的觀察結果一致(Huang,Y.,等,“Growth hormone-induced phosphorylation of epidermal growth factor(EGF)receptor in3T3-F442A cells”,J.Biol.Chem.278,18902-18913)。
(5)AG1478對休眠A431細胞中EGF-誘導的響應的劑量依賴性抑制
圖42顯示了AG1478誘導的對休眠A431細胞中EGF-誘導的響應的劑量依賴型抑制。為了確認這些DMR事件依賴于受體磷酸化,使用強的特異性EGFR激酶抑制劑――酪氨酸磷酸化抑制劑AG1478。A431在不含任何FBS的培養基中預先饑餓20小時,與在0.1%FBS培養基中饑餓相同時間的細胞相比,P-DMR事件的動力學顯著加快,過渡時間更短(圖42A)。用不同濃度的AG1479預處理A431細胞1小時,導致對EGF-誘導的響應的劑量依賴型抑制,用N-DMR信號的幅度對AG1478作圖,得到IC50為約194nM的典型抑制曲線(圖42a和b)。然而,用0.5%二甲亞砜預處理A431對EGF誘導的響應影響很小(數據未顯示)。這些數據表明,EGFR激酶磷酸化是EGF-誘導的DMR改變所需的;用光學生物傳感器獲得的DMR信號可用于測定在所測定的DMR事件起到重要作用的調節劑的能力。
(6)Ras/MAPK途徑調節劑對休眠A431細胞中32nM EGF-誘導的響應的影響
EGF調節細胞增殖和分化,用(至少部分)有絲分裂原活化的蛋白激酶作為下游信號。另外,ERK活化似乎代表EGFR活化下游的全局負信號,這對于去粘附是重要的。因此,檢測了靶向Ras-MAPK途徑的抑制劑,包括MEK抑制劑U0126、p38MAPK抑制劑SB203580和SB20219和JNK抑制劑SP600125的作用(見圖44)。U0126顯著抑制P-DMR和N-DMR信號的幅度,延遲時間為τ。這提示MEK1/2抑制妨礙了導致N-DMR信號的細胞脫離和運動,與先前研究一致。然而,當MEK1/2抑制時,活化EGFR的胞內吞還會發生。由于胞內吞與細胞脫離和運動相比,遠離傳感器表面,胞內吞應對整體響應的影響小得多。因此,用MEK1/2抑制劑預處理的休眠A431的EGF誘導的響應與受體胞內吞一致。這還得到響應動力學的支持,它與計算機建模的結果一致。相反,SB203580和SB20219都僅導致部分弱化,而SP600125幾乎對EGF-誘導的反應沒有影響。 這些結果表明,在休眠A431中,DMR響應的EGF刺激涉及Raf-MEK途徑,并通過MEK發展。
(7)蛋白激酶抑制劑對休眠A431細胞用32nM EGF誘導的響應的影響
由于EGFR信號傳導涉及各種其它的蛋白質激酶,檢測了蛋白質激酶抑制劑對EGF-誘導的響應的影響。用1μM渥曼青霉素(強選擇性PI3K抑制劑)、1μM KT5720(強選擇性蛋白激酶A抑制劑)、10μM KT5823(蛋白激酶G的選擇性抑制劑)、和10μM KN62(CaM激酶II的選擇性抑制劑)預處理A431對響應幾乎沒有影響。相反,用GF109203x(蛋白激酶C的選擇性抑制劑)顯示部分弱化響應(圖45)。這些結果表明,是蛋白激酶C,而不是PI3K、蛋白激酶A和CaM II改變了EGF刺激DMR改變的能力。
(8)細胞骨架調節劑對休眠A431細胞用32nM EGF誘導的響應的影響
由于在響應EGF刺激的細胞中靶標的運輸和形態改變需要細胞骨架結構的重建,檢測了細胞骨架調節劑對EGF誘導的DMR響應的作用(見圖46)。用肌動蛋白絲破壞劑(松胞菌素B或紅海海綿素A),預處理A431,完全消除了N-DMR信號,并導致動力學顯著緩慢的延長的P-DMR階段。兩種毒素以不同機制擾亂組裝和分解:松胞菌素B捕獲肌動蛋白絲,并最終導致肌動蛋白絲分解,而紅海海綿素A隔絕肌動蛋白單體,導致肌動蛋白絲分解。然而,穩定性聚合F-肌動蛋白劑鬼筆環肽或微管破壞劑長春新堿和噻氨酯噠唑(數據未顯示)對于EGF-誘導的響應幾乎沒有影響。這些結果確認,導致N-DMR信號的細胞運動并不是由于先前存在的肌動蛋白的重組織,而是由于肌動蛋白聚合,不依賴于微管裝配。相反,由于胞內蛋白的運輸需要肌動蛋白絲,P-DMR信號至少部分是由于胞內成分募集到活化受體上引起的。額外證據來自細胞膜可通透性發動蛋白抑制肽(DIPC)的作用。用50μM DIPC預處理A431導致用松胞菌素B和紅海海綿素A預處理的細胞相似的響應,但動力學較快。
(9)磷酸二酯酶抑制劑對休眠A431細胞用32nM EGF誘導的響應的影響
環AMP(cAMP)作為胞內第二信使的一個例子,調節無數細胞功能,例如代謝、收縮性、運動性、和幾乎全部細胞類型中的轉錄。先前研究顯示,cAMP途徑與依賴于細胞背景的生長因子刺激的MAP激酶活性有交集并弱化該活性。 由于磷酸二酯酶(PDE)調節細胞內的cAMP水平,用PDE抑制劑cilostamride、米利酮、Ro20-1724、R(-)-咯利普蘭和扎達維林(各10μM)研究PDE在EGF-誘導的響應中的作用。這些抑制劑都對響應沒有明顯的作用(見圖47),提示cAMP與總DMR響應無關。先前的研究顯示,蛋白激酶A可拮抗Raf-1活性,因此通過調節PDE活性而調節Ras-MAPK。然而,在休眠細胞中,Raf-1顯示組成型磷酸化,對PKA抑制劑不敏感,和我們的觀察結果一致,即PKA抑制劑KT5720(圖45)和PDE4抑制劑Ro20-1724和R(-)-咯利普蘭對EGF-誘導的DMR信號幾乎沒有影響。
(10)室溫下(22℃),A431細胞中EGF誘導的EGFR內化,細胞形態學改變,和定向物質再分布
在室溫下,用EGF刺激A431細胞觸發通過受體二聚化和隨后的自磷酸化的EGFR活化,最終導致受體內吞(見圖48A-C),折射形態改變(見圖48D),和定向物質再分布(見圖2A、圖18等)。通過用酸剝離法選擇性除去表面結合的四甲基rhodimine標記的EGF(TMR-EGF),檢測了EGFR內化的程度,并發現依賴于細胞培養條件。在休眠細胞中比增殖細胞中發現高得多的細胞表面和內化受體。固定后用得克薩斯紅-鬼筆環肽染色觀察休眠細胞EGF-誘導的形態改變。先前研究顯示,37℃的A431顯示EGF處理后時間依賴性折射形態改變,并從胞外基質上脫落。與這些研究一致,肌動蛋白重建在EGF處理后約15分鐘開始改變,該改變在刺激延長時變得更劇烈,如細胞邊緣的纖絲肌動蛋白的邊緣所示。
(11)示范性作圖顯示EGF-誘導DMR信號的一種可能機制-受體內吞
肌動蛋白細胞骨骼在胞內吞中的可能作用。圖49的模型描述了皮質肌動蛋白細胞骨架是如何參與內吞過程的不同步驟的,這些步驟涉及內吞界面和細胞骨架組織的分子的可能功能。受體被其同源配體(例如EGF)活化后,在受體內吞中有三個主要步驟:(1)胞內機械的空間組織。細胞骨架結構可組織或抑制內吞機械的側向運動。質膜的變形和內陷可由細胞骨架支持。2)可能需要溶解質膜下的皮質肌動蛋白屏障。肌動蛋白聚合可提供在胞內小泡形成時驅動膜分裂的力。和(3)肌動蛋白聚合可促進新形成的胞內小泡通過形成彗星狀的尾部移動入胞質。
5.實施例5篩選細胞骨架調節劑的方法
成孔試劑包括去污劑(例如皂甙和菲律賓菌素)、或毒素(例如毛地黃皂苷或鏈球菌溶血素O)。熟知用這些試劑處理細胞可導致在細胞表面膜中形成孔;得到的通透的細胞可釋放一定量的胞內物質,主要是可溶性蛋白質。然而,有許多生物物質仍然留在這些通透的細胞中,因為它們被細胞骨架結構直接結合或聯合而阻止了。事實上,這些通透的細胞仍然具有活細胞的許多生物功能,例如蛋白質合成。用能破壞細胞骨架結構的化合物處理細胞能導致這些通透的細胞釋放顯著更多的生物物質。
細胞骨架是蛋白質纖絲的復雜和動態網絡,伸展在整個真核細胞的細胞質內。細胞骨架與執行多種細胞內的活動有關。它通過對細胞提供張力強度維持細胞形狀。它還能使一些細胞運動(使用例如鞭毛和纖毛等結構),并在胞內運輸(例如小泡和細胞器運動)和細胞分裂中起到重要作用。通過提供細胞能移動細胞器、染色體和其它物質的“軌道”,細胞骨架參與胞內信號傳導和運輸。
圖50提供了附著在LID傳感器表面的CHO細胞響應皂甙,作為時間函數的劑量依賴型應答。在不同濃度下加入皂甙,明顯響應不同。在低濃度下,幾乎沒有響應。當皂甙濃度高于約20μg/ml時,信號降低,然后響應增加。最初增加的信號很可能是由于細胞在傳感器表面展平,導致傳感器的感應體積內的質量增加;而下降的信號很可能反映了細胞喪失生物物質;另一種可能性是由于細胞成分的重排和/或形態改變,導致傳感器感應體積內質量凈下降。在測試的最高濃度,沒有最初增加的信號;相反,僅有具有比其它較低濃度要強得多的響應的下降信號。
用較高濃度皂苷處理的細胞的通透性可用Texas紅-鬼筆環肽染色不同濃度的皂苷處理后的CHO細胞,用熒光圖像驗證(數據未顯示)。Texas紅-X鬼筆環肽是一種F-肌動蛋白的高親和探針,是用偶聯的蘑菇毒素制備的。用Texas紅-鬼筆環肽染色需要細胞是可通透的,通常是在甲醛固定后進行的。這是由于熒光鬼筆環肽偶聯物不能滲透入大部分活細胞,雖然未標記的鬼筆環肽能穿透細胞膜。用高濃度皂苷處理后的細胞內的強熒光表明孔形成,以及細胞是通透的。基于該研究,選擇67μg/ml濃度的皂苷用于化合物篩選。
圖51顯示了在用不同化合物預處理后,CHO細胞的皂苷誘導和時間依賴性 響應。結果顯示這些化合物可主要分成四類:(i)導致生物物質喪失的化合物(例如松胞菌素B),如N-DMR信號增加的動力學和幅度驗證的;(ii)對皂苷誘導的響應沒有作用的化合物(例如發動蛋白抑制肽、布雷菲德菌素A);(iii)在皂苷處理的細胞中延遲生物物質喪失,但在較長時間后有相似總改變的化合物(例如鬼筆環肽);和(iv)阻止生物物質由于皂苷引起的喪失的化合物(例如長春新堿)。這些觀察結果與這些化合物的已知性質一致。松胞菌素B捕獲肌動蛋白絲,防止裝配,并由于肌動蛋白絲的動態性質,最終導致肌動蛋白絲分解。相反,鬼筆環肽與F-肌動蛋白結合,促進肌動蛋白聚合。長春新堿通過與微管蛋白結合抑制微管裝配,并誘導螺旋聚集物的自我結合。發動蛋白抑制肽(DIPC)和布雷菲德菌素A不和肌動蛋白或其它纖絲結合。這些結果也提示肌動蛋白絲,而不是其它纖絲提供了大部分生物大分子螯合位點。
皂苷處理后,用得克薩斯紅-鬼筆環肽染色揭示,松胞菌素B預處理的細胞和用其它化合物預處理的細胞相比,有相似的染色模式(數據未顯示)。這可能是由于可得的熒光解析度有限。然而,鬼筆環肽預處理的細胞的染色顯著更低。這是由于未標記的鬼筆環肽阻礙標記的鬼筆環肽對F-肌動蛋白的染色。
6.實施例6:用無標記光學生物傳感器進行G蛋白偶聯受體(GPCR)細胞試驗的系統和方法
圖52-60以多幅圖表顯示了用來證明光學LID系統可用于監測活細胞內物質再分布(例如CPCR移位)的數項不同實驗的結果。如本文所述,可在一光學LID生物傳感器表面上對這些移位進行定位。圖52-60中的數據是用一光學波導光柵傳感系統和LID微板(Nb2O5板)(Corning Incorporated制造)獲得的。圖52顯示據光學LID系統1000監測,中國倉鼠卵巢細胞108(CHO1008)中數種激動劑誘導的應答。已知,CHO細胞1008內源性表達β-腎上腺素能受體、α2-腎上腺素能受體、P2Y-受體以及β-抑制蛋白抑制蛋白和GRK。還已知,CHO細胞1008內毒蕈堿受體內源性表達水平很低。本實驗中,在微板的每孔中加入約5×104個CHO細胞1008,該微板上具有光學LID生物傳感器陣列1004。然后,CHO細胞1008在150μl血清培養基中培養24小時以確保CHO細胞1008粘附到基片表面1010上。該圖顯示CHO細胞對4種不同被檢化合物的光學反應,所述4種被檢化合物是:(1)ATP(100μM),P2Y受體激動劑;(2)可樂定(Clonidine)(10μM),α2-腎上腺素能受體激動劑;(3)腎上腺素(100μM), β-腎上腺素能受體激動劑;和(4)氧化震顫素(oxotremorine)(10μM),毒蕈堿受體激動劑。由于毒蕈堿受體在CHO細胞1008內的內源性表達水平很低,氧化震顫素M(毒蕈堿受體激動劑)被作為對照。各激動劑直接加入含有不同的含有血清培養基的孔中。然后用光學LID系統采集光學反應信息。
結果,根據加入ATP、可樂定和腎上腺素這三種激動劑后的光學反應顯示,這些貼壁CHO細胞表現出相似的動力學特征和轉變。圖53中,該過程后期的動力學分析顯示:三種激動劑(ATP、可樂定和腎上腺素)都導致一個類似、緩慢的過程。圖54中顯示了由這些激動劑引起的圖16所示第3期(Stage3)的轉變。這些類似的轉變可能反應了這樣一個事實:作為GPCR移位的關鍵組分的β-抑制蛋白移位可能是CHO細胞者的限制性因素,因為網格蛋白包涂的小窩的大小與β-抑制蛋白的相似。圖55所示是波導生物傳感器上CHO活細胞單層的配體-和時間-依賴性反應的實驗結果。所用激動劑包括:(1)可樂定;(2)氧化震顫素M;(3)NECA;還用了太蘭澤平(telenzepine),一種M1受體拮抗劑。
圖56所示是波導生物傳感器104上,穩定地過表達大鼠毒蕈堿受體亞型1(M1)的CHO活細胞單層108的配體-和時間-依賴性反應的實驗結果。所用激動劑包括:(1)可樂定;(2)氧化震顫素M;(3)NECA;還用了太蘭澤平(telenzepine),一種M1受體拮抗劑。圖57顯示波導生物傳感器104上,沒有(CHO)或過表達大鼠毒蕈堿受體亞型1的CHO活細胞(M1CHO)內配體誘導的總變化。圖52和54-56所示的結果表明:(1)CHO細胞和M1-CHO細胞內都有α2-腎上腺素能受體表達;并且,它們的激動劑(可樂定)誘導了物質再分布信號;(2)M1受體表達在CHO細胞內很低或幾乎沒有,但在M1-CHO細胞內很高,因為其激動劑(氧化震顫素M)在M1-CHO細胞內導致明顯更大的反應,而其拮抗劑(太蘭澤平)則沒有。
圖58中的實驗結果顯示,發動蛋白磷酸化抑制劑(發動蛋白抑制肽,DIP)預孵育對于氧化震顫素M誘導的波導生物傳感器上不表達或穩定過表達大鼠毒蕈堿受體亞型1(M1 CHO)的CHO活細胞單層的時間依賴性響應的影響。結果顯示,DIP預孵育在兩種細胞系中都幾乎完全消除了氧化震顫素M誘導的物質再分布,提示:氧化震顫素M誘導的物質再分布是發動蛋白依賴性的。大多數激動劑誘導的GPCR移位都具有這樣的發動蛋白依賴性。
圖59中的實驗結果顯示,發動蛋白磷酸化抑制劑(發動蛋白抑制肽,DIP) 預孵育對于可樂定誘導的波導生物傳感器上不表達或穩定過表達大鼠毒蕈堿受體亞型1(M1 CHO)的CHO活細胞單層的時間依賴性響應的影響。結果顯示,DIP預孵育在兩種細胞系中都幾乎完全消除了可樂定誘導的物質再分布,提示:可樂定誘導的物質再分布也是發動蛋白依賴性的。
圖60中的實驗結果顯示,發動蛋白磷酸化抑制劑(發動蛋白抑制肽,DIP)預孵育對于NECA誘導的波導生物傳感器104上不表達或穩定過表達大鼠毒蕈堿受體亞型1(M1 CHO)的CHO活細胞單層108的時間依賴性響應的影響。結果顯示,DIP預孵育對NECA誘導的響應幾乎沒有影響,NECA在兩種細胞系中通過非發動蛋白依賴性途徑誘導物質再分布信號。圖61顯示靜息A431細胞貼層中GPCR激動劑誘導的定向物質再分布。與EGF(8nM)的誘導結果相比,三種GPCR激動劑:緩激肽(100nM)、卡巴唑(10mM)和可樂定(1mM)在靜息A431細胞中誘導時間依賴性響應。(F)以10mM AG1478預處理A431細胞對于GPCR激動劑-和EGF-誘導的響應的影響。
圖62圖示了EGF-誘導的EGFR激活和GPCR激動劑誘導的EGFR的轉活化。已知,EGFR是多種信號傳遞系統中一個重要的下游元素,所述信號傳遞系統包括促有絲分裂G蛋白偶聯受體(GPCR)、細胞因子受體、整合素和膜去極化劑和應力誘導劑所用的那些。此前的研究已證明,A431內源性表達緩激肽B2(Bradykinin B2)受體、毒蕈堿受體和α2-腎上腺素能受體。用GPCR激動劑、緩激肽、可樂定和卡巴可(carbachol)刺激靜息態的A431產生了兩條不同的DMR曲線。卡巴可刺激和可樂定刺激所致反應與低濃度(2-8nM)EGF所致反應的特征幾乎相同。不出所料,用10μM AG1478預處理A431完全消除了N-DMR階段(phase),并且顯著降低P-DMR階段的動力學特征。相反,緩激肽刺激導致一個極快的P-DMR階段(100秒之內)和短得多的過渡時間τ。,用AG1478預處理A431只能部分削弱反應。與此前他人的研究結果一致的是,(i)GPCR激動劑刺激能夠通過不同的機制與Ras-MAPK串話(crosstalk),但這取決于特定的細胞環境,(2)GPCR激動劑誘導的EGFR轉激活可利用產生的Ras/MAPK激活特征信號來檢測。由于GPCR激動劑引發的EGFR轉激活所引起的DMR信號堪與EGF刺激引起的相比,這種轉激活可作為一種信號傳遞放大機制,由此可以在其天然環境中研究GPCR信號傳遞和篩選內源性靶GPCR的激動劑和拮抗劑。不同GPCR激動劑所致DMR反應的不同動力學特征表明,不同的GPCR可能通過不同的機制轉激活Ras/MAPK通路,這可能依賴于受體所偶聯的G蛋白和 細胞環境。
圖62顯示表皮生長因子受體(EGFR)信號傳遞途徑。EGFR家族成員具有胞質酪氨酸激酶結構域、單個跨膜結構域和一個參與配體結合和受體二聚化的胞外域。配體與EGFR的結合導致受體與其它家族成員形成均二聚體或異二聚體。每個二元受體復合物將通過聚集不同的含Src同源(SH2)效應蛋白引發不同的信號傳遞途徑。二聚化的結果是自磷酸化啟動一系列下游細胞信號傳遞途徑。被激活的EGF-R二聚體與鳥苷酸釋放因子SOS偶聯的銜接蛋白Grb結合。Grb-SOS復合物能夠直接結合或通過Shc間接結合受體的磷酸酪氨酸位點。這些蛋白質間的相互作用將SOS帶至Ras附近,使得Ras被激活。接著,ERK和JNK信號傳遞途徑因此被激活,繼而激活諸如c-fos、AP-1和Elk-1等促進基因表達和細胞增殖的轉錄因子。EGF=表皮生長因子,EGFR=表皮生長因子受體,Shc=src同源結構域共有序列,grb2=生長因子受體結合蛋白2,SOS=哺乳動物“無七之子”(son of sevenless),Raf=Ras激活因子,MEK=MAP激酶激酶,MAPK=促分裂原活化蛋白激酶,P13K=磷脂酰肌醇-3’激酶,PIP2=磷脂酰肌醇3,4-二磷酸酯,PIP3=磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸酯,PLCγ=磷酯酶-γ,DAG=二酰基甘油,IP3=肌醇3,4,5-三磷酸酯,PKC=蛋白激酶C。圖61顯示GPCR誘導的EGFR轉激活。Src家族激酶被GPCR激發的受體酪氨酸激酶轉激活作用所激活。最易理解的GPCR與受體酪氨酸激酶之間串話的機制包括:繼膜相關ADAM家族MMP被激活后,GPCR激發蛋白質水解而釋放諸如HB-EGF等配體。被轉激活的EGF受體(EGFR1/2)聚集Shc和Grb2/mSos復合物,令它們成為GRCR誘導的Ras活化復合物的組裝平臺。EGF受體的轉激活可解釋許多系統中GPCR引發的cRaf-1、MEK1/2、ERK1/2MAP激酶級聯活化。Src家族激酶應EGF受體活化而被激活,在此種形式GPCR信號傳遞的下游起著重要作用。此外,有證據表明,Src參與不甚了解的GPCR激發的MMP活化,尤其是Gβγ亞基依賴途徑。
7.實施例7:多模式檢測方法
光柵耦合器生物傳感器是攸逝波傳感器,是基于通過衍射光柵將光與波導共振耦合(參考本文關于不同生物傳感器的論述)。例如,作為生物傳感器的光柵耦合器傳感器通常由導向多層組合和衍射光柵構成。通常,一四層波導生物傳感器的組成包括高折射率(nF)材料(例如折射率約2.36的Nb2O5)薄膜, 薄膜厚度為dF,該薄膜之下是折射率(nS)低于薄膜但高于覆蓋介質的基底(例如1737玻璃,Corning編號,折射率約1.50),覆蓋介質是折射率約為1.35(nC)的生物溶液。優選透明基底,以便使入射光可從基底一側進入。一層生物物質粘附層,固定化在波導膜上,折射率約1.4(nA),厚度為dA。固定化的生物物質包括但不限于抗體、抗原、受體、肽、噬菌體、“單鏈”DNA(RNA)-片斷、基因、基因片斷、靶、蛋白質、結合蛋白、酶、抑制劑、核酸、核苷酸、寡核苷酸、變應原、病原、糖、代謝物、激素、活性成分、低分子量分子、脂質、信號、細胞和細菌。
平面波導中的導波或導向模式是TEm(橫向電場或s-極化波)和TMm(橫向磁場或p-極化波),其中,m=0、1、2……,表示模式編號。激光從不同角度照射波導,光只在特定角度與波導耦合,這些角度決定于導向模式的有效折射率。被耦合的激光平行于波導膜平面的表面傳播,在與界面相鄰的液體中產生電磁場。只有在滿足兩項條件時,給定模式類型才以導波的形式傳播:(a)波導膜的折射率必須比其周圍的基底和覆蓋介質的折射率高至少1%;(2)波導膜的厚度大于一既定值,即閾值厚度dC。
波導光柵生物傳感器由至少一個波導光柵結構單元或至少一個傳感器位置構成。生物傳感器可與一微板相連,板上各孔內含有至少一個波導光柵結構。
在此揭示的方法中,樣品中的分析物或被標記或未被標記。當分析物被標記時,可以各種方式標記,例如使分析物帶上能夠因光(具有寬和/或窄的激發光譜)激發或化學/電化學激活而發熒光、化學發光、生物發光、發磷光或電光的部分。當分析物本身未被標記,用被標記的結合伴侶作為參比配體,所述結合伴侶能夠以適當的親和力結合固定化探針分子的特異性結合位點。參比配體用來測定分析物對探針分子的相對活性或親和力。
非標記依賴性檢測分析物和/或參比配體與光柵區域內固定化探針分子結合的方法是基于折射率改變造成的反射光波長或角度變化(參考US4815843或US5479260)。標記依賴性檢測參比配體與探針分子結合或分析物和參比配體與探針分子競爭性結合的方法是基于顏色的變化(例如熒光、化學發光、生物發光、發磷光或電光等)。
可采用兩種不同的示例性方法實現標記依賴性檢測。方法之一中,用波導光柵基片在波導膜內傳播光,同時產生透過固定化探針分子所在側的攸逝波。透過的攸逝波以不同效率激發被標記的分析物或被標記的參比配體,所述效率 取決于被標記分子與波導膜表面之間的距離。被標記分子距離所述表面越近,激發效率越高。特別是,攸逝場激發提高了整個平面波導表面上表面-結合熒光團的激發機率/效率(Budach,W.:Abel,A.P.;Bruno,A.E.;Neuschafer,D.;“平面波導-用于多點寡核苷酸雜交熒光試驗的高效傳感平臺”,Anal.Chem.1999,71(16):3347-3345;和P.L.;Lee,J.E.;Wood,L.L.;Saavedra,S.S.,“波導線性二向色性和熒光各向異性引起的Langmuir-Blodgett膜內的二極分布”,J.Phys.Chem.,1996,100:775-784)。這與基于聚焦顯微鏡的發光檢測原理相反,后者中,光源聚焦于具有一定體量的元件,由此產生局部強電場(即落射熒光)。這樣,波導光柵結構成為兩種檢測中的核心部件:基于傳感器表面特定分子吸附所致攸逝場傳播介質中折射率變化的非標記依賴性檢測和基于顏色變化(強度、強度分布、內部反射熒光總強度等)的標記依賴性檢測,它們具有超高靈敏度,因為攸逝波隨著靶標或靶標復合物(不論標記與否)距離的增加指數性衰減。
這種方法,在以基于熒光的檢測為目的時,要求將傳感器特別設計為在將光與波導耦合的同時激發熒光團。具有獨特結構(例如光柵結構、周期、深度、波導膜的性能和厚度、傳感器構造等)的給定傳感器往往使特定波長的激光以近乎垂直角耦合進入傳感器。這種垂直耦合對于細胞傳感來說尤其適宜,因為細胞被介質所覆蓋,而大多數涉及液體處理的設備都希望液體改變的角度是垂直的。然而,有待激發的熒光分子通常需要具有特定波長范圍的特定光源。例如,Cy3要求激發光在530-560nm波長范圍。為了用同一光源檢測DMR信號和熒光,需將傳感器調整為能夠將同一光源與波導耦合。這樣,傳播光的攸逝波就能夠被用來激發穿透深度或傳感體積以內的熒光分子。
第二種方法采用單獨的激發光源來專門激發已結合的被標記分析物或參比配體,用一單獨的發射檢測裝置來采集發射光。該方法對于波導傳感器設計的要求相對寬松,適用于多種不同的傳感器設計。
8.實施例8:內源性GPCR在A431細胞內的特征分析
細胞組分的動態再分布,即動態物質再分布(DMR),常見于許多細胞過程中,例如刺激引起的通過G蛋白偶聯受體(GPCR)進行的信號傳遞。DMR可用共振波導光柵(RWG)生物傳感器來放大,所得DMR信號提供了一種新的已整合的信息以用于感測實際生理環境中的活細胞。用RWG生物傳感器和一組 GPCR激動劑激活內源GPCR,通過研究由此介導的靜息A431細胞的DMR信號確定了各類GPCR(基于受體偶聯的G蛋白:Gq,Gs和Gi)的獨特DMR特征。DMR信號取決于激動劑的劑量和內源受體的表達水平。就一小組GPCR激動劑觀測到這種由一種DMR信號到另一種的劑量依賴性轉變。結合其制作GPCR信號傳遞網絡相互作用和調節圖譜的能力,無標記和非侵入性生物傳感器能夠進行實時動力學測定,因而可用于GPCR藥物開發和脫孤化。
G蛋白偶聯受體(GPCR)是一超家族膜蛋白,其成員蛋白具有相同的結構基元,該基元具有七個跨膜結構域,一個胞外N末端和一個胞內C末端。GPCR被認為與諸如心血管病、呼吸、胃腸道、神經、精神和代謝紊亂等大多數疾病的發展和演化有關。GPCR代表著人類基因組中最大的可藥靶(druggable target)家族,且已被證明是小分子藥物開發最具有前景的領域,因為GPCR占目前藥物靶的約50%,2000年的相關銷售額超過六百億美元。鑒于目前GPCR類藥物只針對已知的約200種CPCR中的近25%,而且還有約140種新近鑒定的孤立受體,因此,GPCR作為一類靶分子為藥物開發提供了廣泛的機會。
包括光、離子、神經遞質和激素在內的多種外源刺激通過GPCR調節細胞的生理學和病理生理學過程。激動劑介導的GPCR活化引發與它們所偶聯的G蛋白及其它調節蛋白的動態相互作用,由此控制胞內反應級聯。根據偶聯的G蛋白亞型,可將GPCR分成三族:Gq,Gs和Gi。通過GPCR介導的由配體誘導的細胞事件通常由受體構象和寡聚狀態的改變開始,接著是G蛋白活化(Gα亞基上的GDP-GTP轉換,Gα和Gβγ解離,G蛋白從受體上解偶聯,Gα-和Gβγ-信號傳遞復合物的生成)以及導致第二信使生成的下游信號傳遞途徑活化(Ga2+激活,肌醇三磷酸的生成和/或胞內cAMP水平調節)。然后,GPCR信號傳遞引起特定基因的表達,并通過內吞作用使細胞表面上的GPCR失敏;其中許多涉及到大量胞內蛋白質的動態轉運。最終,靶細胞的表型、形態和物理特征被改變。這些信號傳遞和調節機制通常行使著及時而準確的控制,由此控制著各種細胞反應。結果,所有GPCR信號傳遞在這一點上幾乎都是相同的,即:在信號傳遞周期中,細胞成分發生了有序且受到調節的動態再分布。監測細胞成分的動態再分布就能夠看清楚GPCR信號傳遞過程,并且是進行GPCR篩選的高效手段。
a)材料與方法
(1)材料
腺苷胺類(Adenosine amine cogener,ADAC),大麻素(anadamide),ATP,白介素-8(IL-8),干擾素-γ-可誘導蛋白-10(IP-10),油酰-L-α-溶血磷脂酸(LPA),NECA,諾考達唑(Nocodazole),凝血酶,胰蛋白酶和UK14304購自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)。A-77636,BRL54443,可樂定,腎上腺素,HTMT馬來酸氫酯(HTMT dimaleate),Isoprenternol,氧化震顫素M,羥甲唑啉(Oxymetazoline)和SKF38392購自Molecular Probes(Eugene,OR)。血管緊張素II,Apelin1-17,Apelin1-13,鈴蟾肽(Bombesin),緩激肽(bradykinin),DAMGO,強啡肽A,內皮素-1,甘丙肽(Galanin),GLIGKV-酰胺,GLIGLR-酰胺,胰高血糖素,α-黑色素細胞刺激因子(α-MSH),莫替林,神經激肽A,神經介肽N,神經肽Y,神經降壓素,孤菲肽(nociceptin),SFFLR-酰胺,物質P,尾加壓素Ⅱ和YFLLNRP-酰胺得自Bachem(King of Prussia,PA)。EpicTM96孔和384孔生物傳感器微板得自Corning Inc(Corning,NY),使用前用高強度UV消毒(UVO-清洗機,Jelight Company Inc.,Laguna Hills,CA)6分鐘。
將人表皮癌A431細胞(美國典型培養物保藏中心)培養在含10%胎牛血清(FBS)、4.5g/L葡萄糖、2mM谷胺酰胺和抗生素的Dulbecco改進Eagle’s培養基(DMEM)中。將第3至第5代的細胞(約3-7.5×104細胞)在200μl含10%FBS的DMEM培養基中形成的懸液加入96孔微板的各孔中。類似地,將50μl生長培養基中~1-2×104個細胞加到384孔微板中。37℃、空氣/5%CO2條件下培養,直至覆蓋率達約95%(約2-4天)。
(2)Fluo-3 Ca2+激活試驗
將第3至第5代A431細胞在CostarTM96孔微板上培養至覆蓋率約95%,洗滌兩次,純用DMEM餓養過夜,用含2.5mM丙磺舒(probenicid)的1×HBSS(1倍常規Hank平衡鹽溶液,20mM HEPES緩沖液,pH7.0)洗滌,在含有4μMFluo-3的同一緩沖液中室溫下標記1小時。然后,用緩沖液洗滌細胞兩次,將細胞維持在含有2.5mM丙磺舒的100μl1×HBSS中。向細胞平板添加100μl GPCR激動劑溶液,從而開始檢測,用HTS7000BioAssay Reader(PerkinElmer Life Science,Boston,MA)記錄6分鐘的鈣信號,每隔6秒記錄一次。試驗在室溫下進行,以便直接與光學傳感數據進行比較。
(3)動態物質再分布(DMR)光學生物傳感器試驗
各項研究均采用配備有橫向磁場或p-極化TM0模式的EpicTM角度訊問系統。增加了數步操作來盡可能減少非期望結果。首先,為了盡可能消除加入化合物溶液時的整體折射率改變,用不含丙磺舒的1×HBSS緩沖液稀釋化合物,但餓養細胞時占用DMEM緩沖液。第二,當在室溫下將含有細胞的傳感器培養板放入系統時,為了促進細胞響應并迅速達到穩定狀態,先用不含FBS的DMEM緩沖液將細胞餓養一段時間(通常20±2小時),并且,不洗滌細胞,直接將靜息態細胞用于試驗。第三,盡可能將各化合物溶液中DMSO的濃度降低到低于0.05%,但在指定試驗中可使用較高濃度DMSO。
在動力學特征測定中,37℃、空氣/5%CO2條件下純用DMEM餓養培養的細胞(覆蓋率約95%)20小時。然后,將含有細胞的傳感器微板放入光學系統,記錄室溫下加入溶液之前和之后的細胞響應。在化合物研究中,各孔中的細胞先用50μl的化合物溶液或1×HBSS預處理直至其達到穩定的狀態(即沒有明顯的物質再分布,通常在1小時之內),然后才添加50μl的GPCR激動劑。全部研究在室溫下進行,微板上始終加蓋,僅在添加溶液時短時(數秒)打開,這是為了盡可能減少溫度波動和蒸發冷卻。本文所述響應單位指:據CCD相機成像,各傳感器共振帶中心位以像素計的變化;據采用甘油和二甲亞砜的濃度依賴性響應曲線的一實驗標定方法,1個單位等于~5.82×10-4折射率變化。應理解,根據操作參數和試驗的需要,也可以確定其它單位。
b)結果與討論
(1)A431細胞的內源性GPCR和它們的信號傳遞
用A431細胞作為模型系統研究配體誘導的三種主要GPCR(Gq、Gs和Gi偶聯受體)在實際生理條件下的光學特征。該方法主要以A431中已知的內源受體為基礎,并結合了用許多其它不同類型GPCR的已知激動劑小文庫進行的隨機篩選。某特定GPCR很可能能夠通過一種以上受體偶聯的G蛋白進行信號轉換,甚至通過其它非G蛋白信號傳遞途徑轉換。
A431細胞中的已知內源性GPCR包括緩激肽B2受體,β2腎上腺素能受體,腺苷受體A1、A2A和A2B,組胺受體H1,蛋白酶活化受體PAR1和PAR2,嘌呤能受體P2Y1、P2Y4、P2Y6、和P2Y11,LPA受體LPA1、LPA2和LPA3,和鈴蟾肽受體BRS1。其他人的RT-PCR研究顯示,A431內源性表達至少四個P2Y受體家族成員:P2Y1 (較低)、P2Y4、P2Y6、和P2Y11,但也有研究提出也有P2Y2內源性表達。
這些受體中,B2受體、P2Y受體、PAR受體、LPA2和LPA3、以及BRS1是主要的Gq-偶聯受體,A2A、A2B和β2則是GS-偶聯受體。對于A431中H1受體的信號傳遞途徑知之甚少。有趣的是,關于A431中內源性Gi-偶聯受體的文獻報道很少。一個例子是A1受體。雖然已知LPA1主要通過Gi途徑傳遞信號,但沒有關于A431中LPA1信號傳遞機制的文獻報道。
(2)A431中內源性GPCR活化的光學特征
用一組激動劑分別刺激靜息A431細胞。記錄并分析劑量依賴性動力學響應。在典型的動力學測定中,實時監測每個傳感器的激動劑誘導的共振光角位移,并作為時間的函數制圖。信號(P-DMR)增強表示傳感體積(~120nm)內生物分子量增加;相反,信號(P-DMR)減弱表示傳感體積(~120nm)內生物分子量減少。傳感體積,即穿透深度,是波導膜內耦合光的固有特性,它產生延伸進入細胞層和介質的攸逝波。
圖63顯示了GPCR激動劑誘導的4種A431細胞光學響應。如圖63a所示,第一種光學特征展示兩個主要階段:一個信號迅速增強(圖63a,點A至B)的P-DMR階段和此后一個信號緩慢衰減(圖63a,點B至C)的N-DMR階段。產生這種光學特征的激動劑包括B2受體激動劑緩激肽,P2Y受體激動劑ATP和PAR激動劑凝血酶、胰蛋白酶、GLIGLR-酰胺、GLIGKV-酰胺和SFFLR-酰胺。用Fluo-3進行的傳統Ca2+激活試驗顯示,根據細胞內Fluo-3熒光強度的改變,所有這些激動劑都劑量依賴性地提高胞內Ca2+水平。結合關于緩激肽介導的A431響應的細胞機制的詳細分析,這些結果提示:這種光學特征是Gq-偶聯受體活化的結果,該活化導致Ca2+的迅速激活以及下游信號傳遞事件。
第二種光學特征展示一個主要階段(圖63b):P-DMR階段,其中,信號緩慢增強至一高位平臺(63b:點B至點C)。許多時候會有一個初期階段,期間,信號緩慢減弱并小幅振蕩,這在加入激動劑溶液之后(63b:點A至點B)就出現。完成初期階段的時間通常比加入化合物溶液所誘導的長得多(~數秒)。當加入化合物溶液時,化合物溶液與DMEM介質(如果存在)之間折射率不匹配導致產生一個與整體折射率(bulk index)改變相關的快速階段。產生這種光學特征的激動劑包括β2激動劑腎上腺素和Isoprenternol以及A2A和A2B激動劑NECA。傳統Ca2+激活試驗顯示,所有這些激動劑都不引起胞內Ca2+水 平的明顯改變(數據未顯示)。另一方面,毛喉素和NKH447這兩種腺苷酸環化酶活化劑都產生與β2和A2激動劑所誘導的相似的光學特征(圖64)。已知這兩種化合物都能激活腺苷酸環化酶,提高胞內cAMP(Gs-偶聯受體信號傳遞中的第二信使)的水平。用10μM毛喉素或NKH447預處理靜息細胞完全消除了腎上腺素介導的DMR響應(圖65),這表明,這兩種化合物引起的細胞響應與所述激動劑共享相同的下游信號傳遞途徑。這些結果提示:這種光學特征是Gs-偶聯受體活化的結果,該活化引起胞內cAMP累積及下游信號傳遞事件。
第三種光學特征展示兩次連續的P-DMR事件(圖63c):一個升至高水平的快速P-DMR階段(圖63c:A點到B點),和后一個信號升至另一個高位平臺的P-DMR階段(圖63c:B點到C點)。在靶向已知內源性GPCR的這些激動劑中,只有LPA受體激動劑LPA當其劑量低于約500nM時產生這種光學特征。其它也引發這種響應的激動劑包括MC受體α-MSH。可將這種光學特征認為是Gi-偶聯受體活化的結果,因為,不出所料,它與Gs-偶聯受體的光學特征相似。Gi和Gs信號傳遞都會調節胞內cAMP水平,但調節方向相反。
第四種光學特征沒有任何明顯的DMR信號(圖63d),這與單用HBSS誘導的相似。按照典型方法,每種激動劑在1nM至10μM的五個劑量接受監測,并且,至少進行兩次獨立實驗確保結果正確。這一類別的激動劑包括A-77636,SCH23390和SKF38392(DRD1),大麻素(CNR1和CNR2),血管緊張素II(AGTR1),Apelin1-17和Apelin1-13(AGTRL1),BRL54443(HTR1E/F),可樂定和UK14304(ADRA2A、B和C),DAMGO和強啡肽A(OPRM1和OPRK1),內皮素-1(EDNRA和EDNRB),甘丙肽(GALR1和GALR2),胰高血糖素(GCGR),白介素-8(CXCR1),IP-10(CXCR3),莫替林(motilin)(MOTR),P物質(TACR1),神經激肽A(TACR2),神經介肽N和神經降壓素(NTSE1),神經肽Y(NPY1、2、4、5、6R),孤菲肽(OPRL1),羥甲唑啉(ADRA1A)和尾加壓素Ⅱ(GRP14)。括號內是這些肽所靶向的受體。這些激動劑沒有產生明顯的DMR信號表明,它們的相應受體在A431細胞中無表達或低表達。IL-8刺激幾乎無DMR信號(數據未顯示)提示:內源性CXCR1在A431細胞內的表達水平比較低。另一種可能性是,A431細胞的IL-8組成性分泌水平很低。
鈴蟾肽受體亞型1(BRS1)也曾被報道在A431細胞中內源性表達。Fluo-3試驗顯示,鈴蟾肽引起20±5%(n=5,數據未顯示)的最大胞內Ca2+水平提高,這表明鈴蟾肽引發Gq信號傳遞。不出所料,用鈴蟾肽刺激靜息A431引起劑量 依賴性Gq型光學特征(數據未顯示),但振幅比緩激肽、ATP或任一種PAR激動劑所介導的小得多。據測定,表觀IC50約為1nM。鈴蟾肽誘導的小幅DMR信號提示:BRS1在A431細胞內表達水平較低。
(3)測定激動劑激活A431中內源性GPCR的效力
接著,測定了產生明顯DMR信號的激動劑的效力。由于有時候A431中表達一個以上亞族受體,并且,某個激動劑能夠以不同的效力激活多個亞族受體,所以,先用激動劑溶液的5倍濃度系列來測定細胞響應。大多數情況下,再用一個激動劑溶液兩倍濃度系列來準確測定激動劑的EC50值。將DMR信號的振幅繪制成與激動劑濃度相關的圖,并用Prism分析,計算EC50。
圖66匯總了靶向內源性Gq-偶聯受體的各激動劑的劑量依賴性響應。由于對與激動劑濃度相關的P-DMR和N-DMR信號振幅分析獲得的EC50幾乎相同,只繪制了P-DMR信號并就得出的激動劑效力進行了討論。所有飽和曲線與單結合位點非線性回歸擬合良好,得到一個表觀EC50。據測定,ATP、緩激肽和凝血酶的表觀EC50分別為2.2±0.6μM(n=3),10.0±1.2nM(n=3)和9.6±2.0單位/ml(n=3)。作為比較,還用Ca2+通量試驗測定了這些激動劑的EC50值(數據未顯示),發現與光學生物傳感器試驗所得的一致。已知胞外ATP是離子型P2X和G蛋白偶聯P2Y受體的強激動劑。因為RWG生物傳感器對于細胞生物大分子而非離子的再分布最敏感,并且,ATP-介導的光學特征與緩激肽和PAR激動劑所誘導的相似,所以推斷:內源性P2Y主要導致ATP介導的DMR信號。另一方面,B2而非B1受體在A431中內源性表達,并且,B2受體導致緩激肽的大多數生理活性和病理生理活性。凝血酶是PAR1的激動劑,SLIGLR-酰胺和SLIGKV-酰胺是PAR2-特異性激動劑。然而,SFFLR-酰胺和胰蛋白酶似乎既可激活PAR1又可激活PAR2。
圖67匯總了激活內源性Gs-偶聯受體的激動劑的劑量依賴性響應。此處,將緩慢增強的P-DMR信號的振幅作為激動劑函數的濃度作圖。NECA和腎上腺素的表觀EC50分別為21.5±1.2nM(n=3)和6.0±1.4nM(n=3)。NECA是A2A、A2B和A1受體的激動劑,與它們的親和力分別為20、330和14nM。已有報道:在數個細胞系(包括A431)中,A1和A2腺苷受體共存并對腺苷環化酶具有相反的作用。在A431中,腺苷激發兩階段性響應:低劑量(<~10μM)通過A1受體抑制集落形成,高劑量(至100μM)通過A2受體逐漸逆轉這種抑制。這樣,這種雙 重效應為實現對信號傳遞途徑的互逆控制和微調提供了可能。由于NECA對A1和A2A的親和力相近,NECA誘導的光學特征顯示Gs-信號傳遞占優。用腺苷胺類(ADAC)進一步區分效應,ADAC是一種腺苷受體選擇性激動劑,對A1、A2A和A3的親和力分別為0.85、210和285nM。我們特別關注的是高劑量ADAC。結果顯示,在高劑量(>50nM),ADAC劑量依賴性地激發典型的Gs-型光學特征,表觀有效EC50為3.7±1.1μM(n=3)。另一方面,由于A431內源性表達大量β2受體(~40,000拷貝/細胞),觀測到的腎上腺素誘導的DMR信號專一指向β2活化。腎上腺素結合β2的EC50為5-20nM。
圖68顯示α-MSH誘導的劑量依賴性響應。此處,繪制兩個P-DMR活動與激動劑濃度相關的圖。據測定,α-MSH的表觀EC50為9.0±1.6nM(n=3),與文獻記載的一致。
我們系統地研究了大量不同GPCR的激動劑刺激靜息A431細胞產生的光學特征。激動劑的選擇一定程度上是以已知的A431內源性GPCR為基礎的。結果顯示,所選激動劑介導的光學特征可歸入三大類(見圖63a、b和c),此外,還有與僅用載體(即HBSS)處理所得相似的第四種光學特征(圖63d)。三種不同的特征被用于清楚地區分導致這些光學特征產生的細胞信號傳遞機制。首先,用傳統的第二信使試驗(Fluo-3試驗)將激動劑根據其引起Ca2+激活的能力進行分類。第二,用兩種腺苷酸環化酶(AC)活化劑(毛喉素和NKH447)刺激靜息態的A431細胞。研究GPCR激動劑介導的光學特征與腺苷酸環化酶活化劑介導的光學特征之間的相似度,據此相似度指認Gs-介導的信號傳遞。第三,對一組已知調節劑對于特定激動劑所誘導光學特征的作用進行全面鑒定,從而揭示其細胞機制和信號傳遞網絡相互作用。根據這些研究,確定了以下三類GPCR信號傳遞的三大類光學特征:Gq-、Gs-和Gi-信號傳遞。由于關于A431細胞內源性Gi-偶聯受體的信息很少,雖然HTMT誘導的劑量依賴性響應提供了有力的支持,但Gi-型光學特征有待進一步確認。
除IL-8之外,所有靶向A431內已知GPCR的激動劑都產生了明顯的DMR響應。用RWG生物傳感器測定的它們的效力與Fluo-3試驗(如果可以進行或有此文獻記錄)的結果一致,這提示:MRCAT可用于準確測定激動劑的效力。
(4)激動劑介導的細胞響應的特征轉變
CPCR信號傳遞是復雜的,取決于細胞狀態和環境、激動劑的選擇性和受體 的表達水平和類型。根據細胞狀態和環境,某特定GPCR的激活可能通過一種以上G蛋白引發細胞響應。例如,用緩激肽誘導的內源性緩激肽B2受體活化在A431細胞內通過Gq-和Gs-兩種途徑介導細胞信號傳遞;這兩種信號傳遞途徑交互調節。本發明發現,通過B2受體介導的信號傳遞既依賴于A431細胞的狀態,又依賴于緩激肽的劑量。在增殖狀態下,低劑量(<100nM)緩激肽優先引發Gs-介導的信號傳遞,高劑量(>100nM)則優先引發Gq-信號傳遞。另一方面,用于刺激靜息A431細胞(用0.1%FBS處理約20小時)時,0.5nM至約100nM的緩激肽既介導Gs-途徑又介導Gq-途徑。相反,完全靜息的A431細胞(用不含任何FBS或其它生長因子的DMEM培養基處理約20小時)對各種劑量的緩激肽都有響應,且都以Gq-信號傳遞為主(數據未顯示)。
可確定,包括LPA和HTMT在內的某些激動劑引發的DMR信號具有較為復雜的劑量依賴性。圖69顯示LPA誘導的劑量依賴性響應。在低劑量LPA,完全靜息的A431細胞對LPA刺激的響應為典型的Gi-型光學特征,并在高劑量LPA逐漸轉變為Gq-型光學特征。一種可能是,LPA在低劑量優先激活產生Gi-型光學特征的LPA1受體。隨著LPA濃度升高,內源性LPA2和LPA3受體被激活,于是發生Gq-介導的信號傳遞。
圖70顯示HTMT誘導的劑量依賴性光學特征。HTMT是H1和H2受體的激動劑。在低劑量(<~40nM),HTMT劑量依賴性地產生典型的Gi-型光學特征(圖70b)。隨著HTMT濃度升高至80nM,DMR相關光學特征減弱并變得幾乎穩定(即沒有明顯的DMR)。HTMT濃度進一步升高使特征轉變成了典型的Gs-型光學特征(圖70b)。將作為HTMT濃度的函數的P-DMR信號振幅作圖,該圖清楚地顯示了這一轉變(圖73c)。由于Gs-信號傳遞導致胞內cAMP累積,而Gi-信號測定引起相反的效果,可以想見,HTMT可能通過不同的受體以不同的效力激活Gs-和Gi-兩種信號傳遞。至少,就RWG生物傳感器監測到的動態物質再分布而言,Gs-和Gi-信號傳遞之間的微妙平衡決定了最終的細胞響應。
9.實施例9:探測不同靶之間的交叉通話
不同的靶之間常會發生交叉通話,這在亞族成員靶之間更為常見。例如,EGFR可由某些GPCR激動劑轉激活。而且,一個靶(例如GPCR)的活化劑可以激活另一密切相關的靶。
蛋白酶激活受體(PAR)包含一新的G蛋白偶聯受體(GPCR)家族,該基 組迄今為止包括PAR1、PAR2、PAR3和PAR4。PAR采用一種獨特的蛋白水解機制來活化,而非通過可逆的配體結合來激活。凝血酶和胰蛋白酶等絲氨酸蛋白酶以位點特異性方式剪切受體的胞外N末端外結構域(exodomain)。在人類中,PAR1、PAR2、PAR3和PAR4的活化剪切位點分別是殘基41-42(R↓SFLLRN),36-37(R↓SLIGKV),38-39(K↓TFRGAP)和47-48(R↓GYPGQV)。剪切暴露出一個新的N末端,然后由該末端作為限制(tethered)配體序列。該限制配體結構域與受體分子內結合并激活受體,由此引發信號傳遞。激活PAR的蛋白酶包括凝血因子(例如凝血酶,凝血因子VIIa和Xa),炎性細胞的蛋白酶(肥大細胞胰蛋白酶(Tryptase),中性粒細胞組織蛋白酶G)和表皮組織的酶(胰蛋白酶)。四種PAR中,三種(PAR1、PAR3和PAR4)主由由凝血酶激活,PAR2則由胰蛋白酶樣蛋白酶(例如肥大細胞胰蛋白酶和凝血因子Xa)激活。對應于限制配體序列前5個或前6個氨基酸的合成肽(PAR活化的肽或PAR-AP)可直接激活除PAR3之外的PAR。由于這些合成肽的受體激動劑功能不涉及蛋白水解,PAR-AP可用于研究PAR的生理學和病理生理學功能。
PAR存在于大量正常和患病組織和細胞中,包括皮膚、血小板、內皮細胞、胃腸道、腦和肺。大多數細胞表達多種PAR。例如,一個例子是A431細胞,該細胞內源性表達PAR1和PAR2。然而,對于A431細胞內的PAR信號傳遞途徑卻知之甚少,雖然表皮癌細胞表達可能是潛在PAR活化劑的包括人呼吸道(airway)胰蛋白酶樣蛋白酶在內的多種絲氨酸蛋白酶。
a)材料與方法
(1)試劑
凝血酶、胰蛋白酶、紅海海綿素A、松胞菌素B、鬼筆環肽(phalloidin)、諾考達唑(nocodazole)、甲基-β-環糊精(mβCD)、α-環糊精(αCD)、N-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)和表皮生長因子(EGF)購自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)。KN-62和GF109203x得自Tocris Chemical Co.(St.Louis,MO)。Fluo-3和得克薩斯紅(Texas red)-鬼筆環肽(TR-鬼筆環肽)得自Molecular Probes(Eugene,OR)。SFFLR-酰胺、GLIGKV-酰胺、GLIGLR-酰胺、緩激肽和YFLLNRP-酰胺得自Bachem(King of Prussia,PA)。EpicTM96孔生物傳感器微板得自Corning Inc(Corning,NY),使用前用高強度UV消毒(UVO-清洗機,Jelight Company Inc.,Laguna Hills,CA)6分 鐘。
(2)細胞培養物
將人表皮癌細胞A431細胞(美國典型培養物保藏中心)培養在含有10%胎牛血清(FBS)、4.5g/L葡萄糖、2mM谷胺酰胺和抗生素的DMEM培養基中。將第3至第5代的細胞(約3-7.5×104細胞)在200μl含10%FBS的DMEM培養基中形成的懸液加入96孔微板的各孔中,37℃、空氣/5%CO2條件下培養,直至覆蓋率達約95%(約2-4天)。
(3)Fluo-3 Ca2+激活試驗
將第3至第5代A431細胞在CostarTM96孔微板上培養至覆蓋率約95%,洗滌兩次,純用DMEM餓養過夜,用含2.5mM丙磺舒(probenicid)的1×HBSS(1倍常規Hank平衡鹽溶液,20mM HEPES緩沖液,pH7.0)洗滌,在含有4μMFluo-3的同一緩沖液中室溫下標記1小時。然后,用緩沖液洗滌細胞兩次,將細胞維持在含有2.5mM丙磺舒的100μl 1×HBSS中。通過向細胞培養板添加50μl PAR激動劑從而開始了試驗,用HTS7000BioAssay Reader(PerkinElmer Life Science,Boston,MA)記錄6分鐘的鈣信號,每隔6秒記錄一次。試驗在室溫下進行,以便直接與光學傳感數據進行比較。
(4)動態物質再分布(DMR)光學生物傳感器試驗
各項研究均采用配備有橫向磁場或p-極化TM0模式的EpicTM角度訊問系統。培養后,純用DMEM餓養細胞(覆蓋率約95%)20小時,洗滌兩次后維持于100μl DMEM中。然后,將含有細胞的傳感器微板放入光學系統,記錄加入溶液之前和之后的細胞響應。在化合物研究中,細胞先用50μl的化合物溶液或1×HBSS預處理各孔中的細胞直至其達到穩定期(即沒有明顯的物質再分布,通常在1小時之內),然后才添加50μl的PAR激動劑。用1×HBSS配置化合物溶液或PAR激動劑溶液以使細胞培養基與化合物溶液的折射率相互匹配,從而盡可能減小加入溶液致整體折射率變化造成的非期望效應,當這種效應發生時可能會暫時遮蔽所有DMR信號。全部研究在室溫下進行,微板上始終加蓋,僅在添加溶液時短時(數秒)打開,這是為了盡可能減少溫度波動和蒸發冷卻。本文所述效應單位指:據CCD相機成像,各傳感器共振帶中心位置 以像素計的改變;據采用甘油和二甲亞砜的濃度依賴性效應曲線的一實驗標定方法,1個單位等于~5.82×10-4的折射率改變。
(5)熒光成像
將細胞接種在EpicTM96孔微板上,用無血清DMEM培養基餓養一夜,用胰蛋白酶或凝血酶處理一定時間以示蹤,用4%仲甲醛定影,在含0.2%Triton的磷酸鹽緩沖液(PBS)中透化,用1%牛血清白蛋白(BSA)封閉。然后,用0.5μM得克薩斯紅標記的鬼筆環肽室溫下培養細胞1小時,洗滌。最終洗滌并計數后,用Zeiss Axioplan熒光顯微鏡的40倍目鏡觀察細胞。
b)結果
(1)PAR激動劑在A431細胞中介導胞內Ca2+升高
根據Fluo-3熒光強度增加,靜息A431細胞內,凝血酶、胰蛋白酶、PAR1-AP(SFFLR-酰胺)和PAR2-AP(GLIGKV-酰胺和GLIGLR-酰胺)都濃度依賴性地誘導胞內Ca2+〔[Ca2+]i〕迅速的瞬時性升高。根據非線性回歸和Scatchar分析,全部PAR激動劑介導的飽和曲線非常符合單結合位點。據測定,凝血酶、SFFLR-酰胺、胰蛋白酶、SLIGLR-酰胺和SLIGKV-酰胺的EC50分別為6±1單位/ml(相當于60±10nM),5.0±0.4μM,45.7±5.8nM,2.5±0.3μM和3.8±0.4μM。凝血酶、SFFLR-酰胺、胰蛋白酶、SLIGKV-酰胺和SLIGLR-酰胺誘導的最大[Ca2+]i升幅分別48.2±3.5%,74.3±3.9%,100±6.3%,52±6.3%和64±3.7%(圖71)。胰蛋白酶引起的最大[Ca2+]i升幅約為凝血酶的兩倍。另一方面,胰蛋白酶引起的最大[Ca2+]i升幅也比兩種PAR2-AP引起的高得多。而且,用SFFLR-酰胺(20μM)與SLIGKV-酰胺(20μM)的混合物刺激A431所誘導的[Ca2+]i升幅為102±5.4%,與單用200nM胰蛋白酶的效果相似。有意思的是,濃度高達160μM的PAR1特異性部分激動劑YFLLRNP也沒有誘導任何明顯的[Ca2+]i升高,但用80μMYFLLRNP預處理細胞抑制200nM胰蛋白酶介導的[Ca2+]i升高(48.3±4.5%,n=5)。發現YFLLRNP在適當濃度(<~100μM)選擇性地通過PAR1激活G12/13信號傳遞級聯,造成血小板形狀改變,但不刺激人血小板中的Gq或Gs信號傳遞途徑。以上結果提示,胰蛋白酶能激活除PAR2之外的PAR。凝血酶、SFFLR-酰胺、胰蛋白酶、SLIGKV-酰胺和SLIGLR-酰胺誘導最大響應所需的濃度分別為40單位/ml,20μM,400nM,20μM和20μM。
(2)PAR激動劑介導A431細胞中肌動蛋白絲的重構
已知,PAR活化在諸如LNCaP等數種細胞系中可能是通過Rho家族蛋白的活化而引起細胞骨架結構重構。由于本發明光學傳感系統的獨特設計:采用一光帶(200×3000μm的維度,注意:這是目前本發明角度訊問中的配置;用來照射的光通常在約50μm至5mm范圍內)照射各生物傳感器(這意味著,DMR相關光學特征是該照明區域內的所有細胞的平均值),研究了PAR激動劑對高覆蓋率(>90%)細胞的細胞骨架結構的影響。據得克薩斯紅-X-鬼筆環肽染色圖案(數據未顯示)顯示,用凝血酶或胰蛋白酶刺激覆蓋率約95%的靜息A431細胞誘導了肌動蛋白絲的重構。靜息A431細胞顯示典型的染色圖案-肌動蛋白絲表現為被最大程度拉長并均勻分布于整個細胞質。用100nM胰蛋白酶或40單位/ml凝血酶處理細胞在約10分鐘后引發顯著的細胞骨架重構,并在約30分鐘后變得明顯。凝血酶或胰蛋白酶刺激后30分鐘,肌動蛋白絲變得主要集中在細胞邊緣。以上結果表明:凝血酶和胰蛋白酶都在A431細胞內介導肌動蛋白絲重構。
(3)PAR激動劑在A431細胞中介導顯著的動態物質再分布
本發明證明5種受檢PAR激動劑都產生Gq-型光學特征,都會在一定的激動劑濃度達到飽和。基于非線性回歸和Scatchard分析,與Ca2+激活結果相似,用光學生物傳感器試驗獲得的PAR激動劑介導DMR信號的飽和曲線也非常符合單位點結合模式。值得注意的是,對于胰蛋白酶,關注的是其在低劑量(<2000nM)誘導的DMR信號,因為其在高濃度(>2000nM)引起明顯的細胞從生物傳感器表面脫附(數據未顯示)。
由于細胞活性的許多重要方面,包括轉運、信號傳遞和形態改變,都以細胞骨架結構重排為前提,所以對細胞骨架調整在PAR激動劑誘導的光學特征響應中的作用進行研究(圖72)。紅海海綿素A預處理A431細胞徹底抑制凝血酶或胰蛋白酶介導的DMR信號,但松胞菌素B抑制效應的效力弱得多。已知,這兩種試劑采用不同的機制引起肌動蛋白解體:松胞菌素B給肌動蛋白絲加帽(cap),紅海海綿素A則封鎖隔離肌動蛋白單體。這一區別可能使毒素各具不同的能力來調節受體信號傳遞,通過或者影響內吞作用或者影響信號傳遞元件的組裝。相反,穩定性聚合F-肌動蛋白試劑鬼筆環肽和微管干擾劑諾考達唑 對凝血酶和胰蛋白酶介導的響應都沒有顯著作用。
引起調節細胞骨架重構的Rho活化的PAR胞內信號傳遞似乎涉及兩條主要的信號傳遞途徑:引起磷酸肌醇水解和鈣依賴性Rho活化的Gq-偶聯途徑,和通過G12/13-偶聯p115Rho-GEF的非鈣依賴性Rho直接活化。因此,對靶向Ca2+信號傳遞的調節劑的作用進行了研究。所用調節劑是強PKC抑制劑GF109203x和強Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II(CaMKII)抑制劑KN-62(圖73)。GF109203x對于凝血酶和胰蛋白酶介導的DMR都沒有明顯影響。但是,KN-62預處理對凝血酶和胰蛋白酶介導的DMR信號有不同的影響。KN-62輕度抑制凝血酶介導的DMR信號,但幾乎徹底消除了胰蛋白酶介導的DMR信號。為了調查KN-62直接抑制胰蛋白酶活性的可能性,采用了BAEE水解試驗。結果顯示,KN-62對胰蛋白酶的活性沒有任何明顯的影響(數據未顯示)。
724.還研究了PAR1特異性部分激動劑YFFLRNRP的作用,此前顯示該激動劑激活G12/13,引起細胞形態改變但不激活人血小板中Gq-介導的Ca2+信號傳遞。YFFLRNRP只在高劑量刺激產生明顯的DMR信號(數據未顯示)。YFFLRNRP劑量依賴性地抑制凝血酶、SFFLR-酰胺和胰蛋白酶介導的DMR信號(圖74)。在最高試驗濃度,YFFLRNRP幾乎徹底阻斷了凝血酶介導的DMR信號,但只部分減弱SFFLR-酰胺和胰蛋白酶介導的DMR信號。相反,YFFLRNRP對PAR2-AP GLIGKV介導的DMR信號幾乎沒有影響。總之,以上結果提示,細胞骨架重構主要是由通過PAR2活化的Gq-介導Ca2+信號傳遞引起的,而不是通過PAR1活化的非Ca2+依賴性機制。
(4)受體失敏和PAR激動劑的交叉失敏
由于A431至少內源性表達PAR1和PAR2,而且,凝血酶和胰蛋白酶都能高效激活一種以上受體,所以對多種PAR激動劑組合的后續刺激引起的受體失敏和交叉失敏進行了研究,用Fluo-3檢測的[Ca2+]i升高程度或用光學生物傳感器測定的DMR信號來評價。Ca2+激活試驗的間隔為6分鐘,DMR光學實驗為1小時左右。
圖75匯總了依次受到多種PAR激動劑組合刺激的A431中[Ca2+]i的主要結果。一旦A431受到胰蛋白酶的刺激,此后使用其它PAR激動劑(40單位/ml凝血酶,20μM SFFLR-酰胺,20μM GLIGKV-酰胺,20μM GLIGLR-酰胺或200nM胰蛋白酶)都幾乎不誘導[Ca2+]i升高(圖75a-c,數據未顯示)。相反,受檢 的PAR激動劑都不影響緩激肽在后刺激介導[Ca2+]i升高,緩激肽是A431內源性表達的B2受體激動劑(圖79d),這提示:胰蛋白酶在先刺激抑制PAR激動劑響應不是因為膜蛋白的非特異性消化。另一方面,40單位/ml凝血酶在先刺激徹底阻抑40單位/ml凝血酶介導的[Ca2+]i升高,但只輕度抑制胰蛋白酶誘導[Ca2+]i升高,但是,SFFLR-酰胺、GLIGKV-酰胺或GLIGLR-酰胺的在先刺激顯著削弱但不完全消除胰蛋白酶誘導的[Ca2+]i升高(圖79e-g;數據未顯示)。而且,先用凝血酶刺激后,PAR2-AP SFFLR-酰胺誘導的[Ca2+]i升高(48.5±3.8%)與沒有在先刺激時的(52.0±6.3%)相近。相反,先用凝血酶刺激只部分阻抑SFFLR-酰胺誘導的[Ca2+]i升高(32±4.3%),這與此前其它研究人員的以下觀察結果一致:SFFLR-酰胺能夠激活PAR1和PAR2(Blackhart,B.D.;Emilsson,K.;Nguyen,D.;Teng,G.W.;Martelli,A.J.;Nysted,S.;Sundelin,J.;Scarborough,R.M.J.Biol.Chem.,1996,271,16466-16471)。因此,胰蛋白酶可導致對PAR1-AP和PAR2-AP的響應性失敏,但凝血酶不會使對PAR2-AP的響應性失敏。
圖76匯總了RWG生物傳感器實時觀測所得依次受到多種PAR激動劑組合刺激的A431的DMR響應主要結果。胰蛋白酶在先刺激完全消除胰蛋白酶(數據未顯示)或凝血酶誘導的DMR信號(圖76a),顯著抑制三種PAR-AP(SFFLR-酰胺、GLIGKV-酰胺或GLIGLR-酰胺)介導的DMR信號(圖76b-c,數據未顯示)。相反,胰蛋白酶預處理對緩激肽介導的DMR幾乎沒有影響(圖76d)。另一方面,先用凝血酶、SFFLR-酰胺、GLIGKV-酰胺或GLIGLR-酰胺刺激顯著抑制但不完全消除胰蛋白酶誘導的DMR信號(圖76e-g,數據未顯示)。而且,先用凝血酶刺激后,兩種PAR2-AP(SLIGKV-酰胺和SLIGLR-酰胺)誘導的DMR信號與沒有在先刺激時的相似(數據未顯示)。總之,以上結果顯示,凝血酶主要激活PAR1,胰蛋白酶激活PAR1和PAR2兩者。
(5)凝血酶和胰蛋白酶介導的[Ca2+]i升高和DMR信號對細胞內膽固醇水平敏感
由于細胞膽固醇水平對包括GPCR信號傳遞在內的許多細胞功能具有重要意義,所以對mβCD引起的膽固醇降低對凝血酶和胰蛋白酶介導的胞內Ca2+升高和DMR信號的影響進行了研究。用mβCD預處理靜息A431細胞劑量依賴性地抑制胰蛋白酶或凝血酶介導的[Ca2+]i升高(數據未顯示)。兩者的劑量依賴性抑 制曲線都與單相衰減非線性回歸擬合良好;與以下事實一致:mβCD引起膽固醇分子透過細胞膜迅速外排。另一方面,非活性環糊精立體異構體αCD高達8mM也不影響胰蛋白酶和凝血酶介導的響應(數據未顯示)。
類似的,用mβCD預處理A431也劑量依賴性地改變了凝血酶或胰蛋白酶誘導的光學特征(圖77)。與Ca2+激活試驗測得的相似,mβCD劑量依賴性地抑制凝血酶介導的DMR,但與之不同的是,mβCD對胰蛋白酶介導的DMR的抑制表現出復雜的特征:隨著mβCD劑量升高,信號的減弱逐漸衰減。這一區別提示:胰蛋白酶介導的DMR比凝血酶所介導的具有更為復雜的細胞機制。相反,非活性環糊精立體異構體αCD高達8mM時對兩種激動劑誘導的DMR信號的影響仍然微乎其微。然而,高劑量的αCD(>10mM)引起大量細胞從生物傳感器表面脫附(數據未顯示)。還研究了用mβCD降低膽固醇后PAR的功能回復。該實驗以經mβCD處理的細胞在去除含mβCD的培養基后細胞表面膽固醇的及時恢復為基礎。為此,用5mM mβCD處理靜息A431細胞15分鐘以確保去除所有細胞表面膽固醇,然后純用DMEM培養基洗滌經處理的細胞三次。然后,用100μl培養基維持細胞,并放入光學系統。培養15分鐘使細胞達到適度穩定的狀態后,在特定時間向各孔加入100μl凝血酶溶液(80單位/ml)。記錄整個試驗期間的光學響應。如圖78所示,結果顯示,凝血酶誘導的DMR信號依賴于細胞表面膽固醇去除后的時間。凝血酶誘導的DMR信號逐漸恢復直至原先的水平(不去除膽固醇所得的水平)。凝血酶誘導的光學特征的這種時間依賴性恢復強烈暗示:膽固醇輔助微結構域的形成是動態的和可逆的,細胞膜上膽固醇的濃度在PAR信號傳遞調節中具有重要作用。
(6)EGFR與PAR之間的交叉通話
由于某些GPCR轉激活EGFR,所以研究了EGF對PAR信號傳遞的影響。EGF在先刺激對胰蛋白酶(圖79a)或凝血酶(數據未顯示)介導[Ca2+]i升高的影響微乎其微。然而,在EGF充分激活EGFR的100nM,EGF完全阻抑胰蛋白酶(圖79b)或凝血酶(圖79c)介導的DMR反應中的N-DMR,但僅減弱P-DMR。以上結果顯示,EGFR和PAR之間可能存在交叉通話,至少就調節肌動蛋白絲重構而言是這樣。
總之,為了搞清楚A431細胞中PAR信號傳遞的機制,用5種PAR激動劑(凝血酶、PAR1-AP FLLLR-酰胺、胰蛋白酶、PAR2-AP GLIGLR-酰胺和GLIGKV- 酰胺)和1種PAR1特異性部分激動劑YFLLRNP刺激A431細胞。檢測包括[Ca2+]i水平和動態物質再分布在內的細胞響應。有三項證據支持這樣的結論:凝血酶主要激活PAR1,胰蛋白酶激活PAR1和PAR2兩者。第一,兩種被檢PAR激動劑引起的[Ca2+]i升高和DMR都具有劑量依賴性和飽和性,這提示A431細胞內存在PAR1和PAR2信號傳遞。與其它PAR激動劑所介導的相比,胰蛋白酶介導更強的[Ca2+]i升高和DMR信號,這提示:胰蛋白酶可能激活非PAR2受體。SFFLR-酰胺和GLIGKV-酰胺混合物介導的[Ca2+]i升高與單用胰蛋白酶所介導的相似,進一步強化了這一可能性:胰蛋白酶在A431細胞中既激活PAR1又激活PAR2。第二項證據來自這樣的觀測結果:先用胰蛋白酶刺激機會完全阻抑除緩激肽(B2受體激動劑)之外任一PAR激動劑介導的[Ca2+]i升高,由此提示:和PAR2一樣,PAR1也被胰蛋白酶剪切和激活。另一方面,先用凝血酶處理僅輕度抑制[Ca2+]i升高,但顯著抑制胰蛋白酶介導的DMR信號。有意思的是,延長胰蛋白酶在先處理時間(~1小時)完全抑制凝血酶介導的A431細胞的DMR響應,這提示:在胰蛋白酶持續刺激1小時后,沒有完整的凝血酶活化受體恢復。然而,與[Ca2+]i測定不同,延長胰蛋白酶在先刺激只部分抑制全部三種PAR-AP介導的DMR信號,這暗示:可能有部分PAR2受體被恢復。已知SFFLR-酰胺能夠活化PAR1和PAR2兩者。還已知,受體蛋白水解和磷酸化通過受體內化作用和抑制胞內信號轉導調節PAR的活性。根據細胞環境,細胞表面功能性受體的恢復可能需要數十分鐘至數小時。第三項證據來自YFFLRNP的效果。先用YFFLRNP進行的刺激劑量依賴性地抑制凝血酶、SFFLR-酰胺或胰蛋白酶介導的DMR信號,但不抑制PAR2-AP SLIGKV-酰胺介導的信號。在最高劑量(729μM),YFFLRNP完全阻抑凝血酶介導的DMR信號,但只部分抑制SFFLR-酰胺或胰蛋白酶介導的信號。總之,以上結果顯示,在A431細胞中,胰蛋白酶不僅激活PAR2還激活PAR1。據報道,PAR1、PAR3和PAR4是凝血酶受體,而胰蛋白酶除PAR2之外還能夠激活PAR1和PAR4。
德克薩斯州紅-X-鬼筆環肽染色的肌動蛋白絲和RWG生物傳感器顯示的動態物質再分布支持PAR1和PAR2活化在A431細胞細胞骨架重構中的作用。PAR1活化已被證明在包括血小板和LNCaP在內的多種類型細胞中引起細胞骨架重構。用凝血酶或胰蛋白酶刺激A431細胞引起顯著的肌動蛋白絲重排:由拉長肌動蛋白絲無規分布變為集中在細胞邊緣附近。而且,被檢PAR激動劑都誘導生物傳感器表面上貼附細胞底部明顯的物質再分布。肌動蛋白干擾劑紅海海綿 素A和松胞菌素B能夠選擇性削弱凝血酶或胰蛋白酶所介導的DMR信號,但肌動蛋白聚合促進劑鬼筆環肽或微管調節劑諾考達唑則不能,這提示了在A431細胞中肌動蛋白絲重排在DMR響應中的作用,也由此提示了PAR信號傳遞在細胞骨架重構中的作用。人血小板受凝血酶作用會發生多種分布和形態改變,在其中,PAR1已被證明能夠通過p115Rho-GEF活化RhoA,p115Rho-GEF是一種GTP轉換因子(GEF),它結合PAR1-偶聯的G蛋白,G12/13。在A431細胞中,YFFLRNP(一種PAR1特異性部分激動劑,據報道,其特異性活化G12/13但不活化Gq)被發現能夠誘導與其它PAR激動劑相似的DMR信號(數據未顯示)。而且,YFFLRNP預處理A431細胞劑量依賴性地減弱凝血酶和SFFLR-酰胺介導的DMR信號,但對PAR2-AP GLIGKV-酰胺的信號沒有影響。以上結果提示,A431中PAR1的活化可能還通過G12/13引發細胞骨架重構。另一方面,胰蛋白酶介導的細胞骨架重構可能是由G12/13依賴性和Gq依賴性兩種途徑引起的,因為胰蛋白酶介導的DMR信號對CaMKII抑制劑KN-62和PAR1特異性部分激動劑YFFLRNP都敏感。一種可能性是,胰蛋白酶依賴于通過PAR2活化的Gq信號傳遞途徑而不是通過PAR1活化的G12/13信號傳遞途徑誘導細胞骨架重構。
細胞表面的膽固醇傾向于與包括鞘脂類和飽和磷酯在內的其它脂類一起形成微結構域,選擇性地將眾多信號傳遞蛋白區室化。用mβCD而不是其非活性立體異構體αCD處理細胞削弱了PAR信號,包括凝血酶和胰蛋白酶誘導的Ca2+激活和動態物質再分布。EGF在先刺激的效果提示:膽固醇損耗轉激活EGFR至少引起凝血酶或胰蛋白酶介導的N-DRM事件的減弱。此外,膽固醇損耗能夠減弱Ca2+激活暗示:質膜中的膽固醇通過Gq-信號傳遞途徑調節PAR1和PAR2信號傳遞兩者。已知,膽固醇抽提導致PAR信號傳遞中兩種重要分子PtdIns4,5-P2和Gq的區室化缺失。膽固醇損耗引起的Ca2+激活抑制可能是PtdIns和Gq離域(delocalization)的直接結果。如前所述,PAR介導的DMR信號可能還涉及與Gq途徑無關的其他途徑。然而,去除膽固醇能夠完全阻抑胰蛋白酶和凝血酶介導的DMR提示:膽固醇損耗可能還削弱其它信號傳遞途徑,例如G12/13途徑。以上發現與其它研究人員此前的以下觀測結果一致:A4.1細胞的膜邊緣波動(membrane raffling)需要膽固醇。有意思的是,功能恢復實驗顯示,膽固醇裝配的微結構域是動態和可逆的。
胰蛋白酶、凝血酶或PAR-AP介導的Ca2+信號傳遞和動態物質再分布提示:在A431細胞中,凝血酶介導PAR1信號傳遞,胰蛋白酶激活PAR1和PAR2兩者。 PAR1和PAR2兩者的激活引起細胞骨架結構重構,但可能是通過不同的機制。Gq和Ca2+-依賴性機制被認為是PAR2-介導的細胞骨架重排的機制,而包括G12/13在內的其它信號傳遞途徑則可能引起PAR1-介導的重排。而且,在A431中,細胞表面的膽固醇在調節PAR信號傳遞方面具有重要作用。以上發現提示:PAR信號傳遞可能對腫瘤浸潤和轉移具有重要意義。本發明強烈增強了RWG生物傳感器在揭示細胞信號傳遞及其網絡交互作用方面的巨大潛力。
實施例10:活性氧類信號傳遞和細胞氧化還原狀態的研究
ROS在不同水平調節大量從受體到細胞核的信號傳遞途徑。在過去十年中,已經鑒定到了細胞靶,并在不斷增加,雖然對它們尚知之甚少。受體激酶和磷酸酶可能是氧化應激的目標(靶)。生長因子受體,最常見的,是被配體誘導的二聚化或寡聚化所誘導,所述二聚化或寡聚化引起其胞質激酶結構域的自磷酸化。還已很好證明了紫外線引起受體的非配體依賴性簇化和活化,而這一效果似乎是由ROS介導的。有數據顯示,外源性H2O2(通常以mM計)誘導PDGF-受體和EGF受體的酪氨酸磷酸化和活化。溶血磷脂酸誘導的EGF受體轉激活似乎是由ROS的即時形成介導的。因為大多數生長因子和細胞因子似乎在質膜或其附近產生ROS,磷脂代謝物是氧化還原信號傳遞潛在的重要靶標。例如,氧化態的二酰基甘油激活PKC比其非氧化態更有效。此外,PKC活化和蛋白質酪氨酸磷酸化似乎是內皮細胞和成纖維細胞內H2O2-誘導的PLD活化所必需的。屬于Src家族(Src激酶)和Janus激酶(JAK)家族的非RTKs也是靶標,至少是外源性加入的氧化劑的靶標。
此項研究中,所有光學響應都是用波長訊問系統監測的。RWG生物傳感器的構成包括用于生化試驗的三個主要部件:EpicTM傳感器微板,RWG檢測器,和液體操作系統。傳感器微板的構成包括裝在一給定SBS格式(例如96孔或384孔)塑料孔板上的玻璃底板,這樣的微板能夠進行高通量的篩選。在一96孔EpicTM傳感器微板中,每孔有一個約3×3mm2的RWG傳感器。RWG傳感器的構成包括一層介電材料薄膜,該薄膜位于呈現光柵的玻璃基片上。
波長訊問檢測器系統位于集成光纖的正中。用通過光纖和準直透鏡以公稱垂直入射角透過微板底部而產生的一寬帶光源照射光柵表面的一個小區域。將用于記錄反射光的檢測光纖與照射光纖捆綁在一起。一系列8個照射/探測頭線形排開,這樣,可以一次采集同一微板上同一列內8個孔的反射波譜。通過 空間-控制的移動,整個微板移動通過各照射/探測頭,使得每個傳感器被多次經過,各一列依次通過。由此采集到一系列反射光譜,并用其進行分析。由于該檢測系統測定細胞響應刺激而誘導的反射光波長改變,該方法被稱為波長訊問系統。
圖80顯示用角度訊問系統監測所得,1mM H2O2引起的靜息A431細胞的多項光學輸出參數。H2O2刺激引發傳感器傳感體積內顯著的物質再分布(圖84A)。DMR信號由兩個主要事件組成:一個包括以下三個階段的初峰:物質信號增強(P-DMR),過渡階段和衰減物質信號(N-DMR);和長時間的增強物質信號,直至達到一平臺水平。另一方面,H2O2刺激還稍微增強TM0模式共振峰的PWHM,這表明細胞層底部物質再分布的不均勻性增加。與PWHM一致的是,刺激后,峰強度隨時間略微降低,積分面積則基本保持不變。
圖81顯示不同劑量H2O2引起的A431細胞的動態物質再分布信號,用波長訊問系統監測波長改變所得。如圖81a和b所示,H2O2刺激的光學特征非常依賴于其劑量。當H2O2的濃度約為8mM或以下,細胞對H2O2的響應是一典型的兩事件曲線:一個初峰和一個長時間的增強物質信號。然而,當H2O2的濃度約為16mM或以上時,細胞對H2O2的響應具有獨特特征:初期的增強物質信號,然后是相對穩定的過渡階段,最后是衰減物質信號。后期的衰減物質信號與活/死細胞染色結果非常符合(數據未顯示),這表明:經高劑量H2O2處理的細胞發生了細胞凋亡-一個造成細胞物質流失的過程。
圖82顯示src激酶調節劑對1mM H2O2介導的細胞響應的作用。結果顯示,兩種特異性src激酶抑制劑,PP1和PP2,顯著抑制H2O2介導的細胞響應,但是作為陰性對照的PP3不影響響應。由此提示,Src激酶參與H2O2介導的DMR信號;以及,光學生物傳感器可用來篩選影響ROS信號傳遞的調節劑。
圖83顯示靜息A431細胞不同氧化還原狀態對H2O2介導的DMR信號的影響。用不同的初始接種細胞數量和不同的培養時間形成不同的氧化還原狀態。如下制備低氧化還原活性細胞:每孔75,000個細胞,普通條件下培養3天,然后用0%胎牛血清(FBS)餓養一夜,如下制備高氧化還原活性細胞:每孔10,000個細胞,普通條件下培養10天,然后用0%FBS)餓養一夜。根據光學顯微鏡鏡檢,細胞密度相近(~95%)。如圖83所示,兩種不同氧化還原狀態的細胞對4mM H2O2具有不同的響應。在低氧化還原活性狀態細胞中,H2O2引發典型的DMR信號,最終增加細胞底部的物質。然而,在高氧化還原活性狀態細胞中, 相同濃度的H2O2介導凋亡(即,最終,細胞物質流失)細胞的特征性DMR信號。以上結果顯示,光學生物傳感器可用于區分培養的細胞的氧化還原狀態,并可用于篩選細胞氧化還原狀態的調節劑。
實施例11:細胞檢測中多項光學輸出參數的分析
實時、平行記錄數種已知細胞響應和過程(包括貼壁、鋪展、脫附和通過EGFR或緩激肽B2受體的細胞信號傳遞)的多項光學輸出參數。這些光學數據包括入射角變化和描述共振峰的三個參數:強度、PWHM和面積。由于TM0模式的高靈敏度和信息含量,只用它進行全部信息采集和分析。
a)TM0峰的形狀
如圖31所示,CHO細胞TM0峰的形狀和位置取決于細胞覆蓋率。隨著細胞覆蓋率的提高,共振峰向高入射角方向移動。PWHM值,描述峰的形狀狀的參數之一,也表現為細胞覆蓋率依賴性(圖31b)。當細胞覆蓋率約為50%時,PWHM達到最大值;PWHM最大值比高于75%的高密度時(有或沒有細胞單層)的PWHM值高約35%。值得注意的是,以上數據是在細胞在生長培養基培養約2天后、充分鋪展后測得的。
貼壁CHO細胞的TM0峰還對DMSO(高劑量時具有毒性)敏感。如圖32a所示,用18%DMSO處理增殖細胞(用10%FBS誘導)時,TM0峰的形狀和位置表現出動態改變。用DMSO處理后,在監測期間(約3小時),峰的強度和面積都增加。然而,峰的位置(即入射角)表現出動態特征:入射角起初向物質增加的方向移動(例如25分鐘),然后向物質減少方向移動(例如40和120min)。類似的,峰的形狀起初變寬且顯示出復雜的細微結構(例如25分鐘),最后收窄(例如40和120分鐘)。已將出現復雜的峰結構表示為傳感器表面或其附近出現大規模的物質無規不均勻性,由此表明,在DMSO處理后的特定時期內,生物傳感器探測到了表面不均勻性的升高。DMSO處理后25分鐘的CHO細胞活/死亡染色結果顯示存在混合細胞群:活細胞、死細胞和受影響細胞(圖32b),表明CHO細胞似乎對DMSO處理有不同的響應。以上結果顯示,TM0峰的形狀可用于研究傳感體積內不均勻的橫向物質再分布。
(b)細胞貼壁和鋪展
用光學成像技術,用SPR和RWG之類光學生物傳感器很好地研究了細胞在表面上的貼壁和鋪展。細胞開始與表面相互作用是通過最初的接觸和附著,此時,細胞通常仍然是懸浮狀態時的圓形。然后,附著細胞發生形態改變,即已知的鋪展-細胞擴大其與表面的接觸面積的過程。附著和鋪展都有賴于表面的性質和細胞懸浮于其中的培養基的性質。由于細胞貼壁和鋪展都引起傳感體積內明顯的縱向和橫向物質再分布,我們首先鑒定沒有和有長春新堿條件下,5%FBS中,A431細胞的貼壁和鋪展。長春新堿是一種植物堿(plant alkaoid),通過結合微管蛋白抑制微管組裝。
我們研究了室溫下(25℃),沒有和有長春新堿條件下,5%FBS中,A431細胞的貼壁和鋪展。結果顯示,沒有長春新堿時,入射角改變表現出三個主要階段(數據未顯示)。加入細胞溶液后,信號立即、迅速增強,這可能是三個事件造成的:細胞溶液的加入引起整體折射率改變,血清蛋白質在傳感器表面的固定化,以及細胞沉淀后與表面接觸。此后,出現一個長時間的增強信號,反映緩慢的細胞鋪展過程。最后達到一飽和水平。該飽和水平(16.8±0.6單位,n=3)比類似密度充分鋪展細胞的水平(22.6±1.0單位,n=3)低得多。另一方面,歸一后的PWHM也是動態的,具有獨特的特征(數據未顯示)。加入細胞溶液后,PWHM值開始升高。約20分鐘后,PWHM開始回落,在2小時內回落至其原點水平,然后是緩慢的持續增長,直至達到一平臺水平。PWHM的終點值比起點值高約25%,表明細胞尚未完全鋪展,即使是在環境條件下用生物傳感器進行了20小時的檢測之后。光學顯微鏡成像證實了這一點(數據未顯示)。以上數據提示:(i)室溫下,A431cells似乎不能達到最佳程度的貼壁;(ii)細胞通過多個步驟與表面相互作用,每一步都具有其獨特的特征;和(iii)鋪展步驟明切增加傳感體積內的物質,表明細胞與表面的接觸增加。
100nM長春新堿顯著改變光學特征。長春新堿不僅抑制初始響應和總響應,而且降低細胞鋪展的動力學特征(數據未顯示)。有長春新堿時,入射角的總變化比沒有長春新堿時小約20%。有意思的是,長春新堿還改變PWHM值的動態特征(數據未顯示)。與沒有長春新堿時不同,PWHM一開始先降低,并在低值維持約3小時,然后升高,直至到達一平臺,這表明:長春新堿主要影響細胞貼壁和鋪展過程中的初期步驟。以上結果顯示,生物傳感器不僅能夠揭示細胞與表面的相互作用,而且能夠區分改變細胞貼壁和鋪展過程的能力不同的化合物。
(c)EGFR信號傳遞
如前所述,通過分析多種已知調節劑對EGF所介導DMR信號的調節已獲得了豐富的信息。結果顯示,在靜息A431細胞中,EGF介導的DMR需要EGFR酪氨酸激酶活性、肌動蛋白聚合和發動蛋白(dynamin)活性,并且主要通過MEK進行。通過平行多項參數測定,鑒定了EGF介導的EGFR信號傳遞的光學特征。如圖84a所示,特別有意義的是高劑量EGF誘導的體現為角度變化的細胞響應。用超過的32nM的高劑量EGF刺激時,靜息A431細胞出現一個新的DMR信號階段。最初的快速P-DMR(增強信號)之后是短暫的過渡階段和長時間的衰減N-DMR(信號減弱),除此之外,在細胞最終達到平臺值(與16nM或32nM誘導的水平相似)之前,還有一個部分回復RP-DMR階段(增強信號)。一種可能性是,在高劑量EGF刺激后,細胞經歷了一段脫附過程,然后是一段部分再附著過程。
因為EGF介導某些細胞靶標(例如PI3K,EGF-誘導的細胞遷移的重要因素)的不對稱橫向再分布,平行監測了描述共振峰的多項參數。然而,不同劑量的EGF刺激后,三項參數似乎都保持不變(圖85b;僅顯示PWHM),這表明:EGF刺激不增加細胞底部橫向物質再分布的不均勻性。這與肌動蛋白絲的TR-鬼筆環肽染色結果不一致(圖85c和d)。這些圖像顯示,在橫向上,EGF介導肌動蛋白絲明顯重排。無法測到EGF引發的橫向物質再分布不均勻性表明,不對稱再分布可能主要在探測容積之外發生。
b)緩激肽B2受體信號傳遞
緩激肽B2受體是一種G蛋白-偶聯受體,并引起緩激肽(BK)的大多數生理學和病理生理學作用。緩激肽(BK)似乎是包括促有絲分裂和抗促有絲分裂效應等多種生理學和病理生理學響應介體。A431細胞內源性表達緩激肽B2受體,但不表達B1受體。在此鑒定了BK刺激產生的靜息A431細胞光學特征,結果顯示,BK刺激引起A431細胞的動態物質再分布;其動力學特征、振幅和持續時間取決于細胞培養條件、BK劑量和細胞環境。如圖86所示,對靜息A431細胞的BK刺激產生PWHM的快速升高,然后緩慢回落至原點水平,而峰強度則產生與PWHM和角度變化的相反的動態響應。而且,這兩項參數的變化也是BK劑量依賴性的,而且,其動態特征和動力學特征與此前報導的DMR信號相似。 以上結果提示:與EGF-介導的細胞響應相比,BK刺激引起細胞成分更顯著的不對稱再分布,這繼而增加了細胞底部橫向物質再分布的不均勻性。
總之,RWG生物傳感器為探測活細胞提供了豐富的信息。理論分析揭示:測得的光學特征是綜合響應,可作為顯示結果,用于研究天然環境中的細胞而不需要標記。已經對數種細胞響應和過程,包括貼壁、鋪展、脫附、通過EGFR和緩激肽B2受體的細胞信號傳遞進行了全面研究。通過對多項光學輸出參數的平行動力學測定鑒定了細胞底部縱向和橫向上刺激誘導的動態物質再分布的獨特特征。已發現,細胞貼壁和鋪展涉及多個步驟;長春新堿能夠通過干擾初期步驟來調節細胞貼壁和鋪展。出乎意料的是,EGF不引發明顯的不對稱橫向物質再分布,至少在細胞底部是這樣。這提示,EGF誘導的細胞成分不對稱再分布(細胞遷移的重要過程)發生在細胞上部而非底部。然而,增加生物傳感器的穿透深度(例如反向波導構型)應能允許檢測這樣的橫向再分布。但是,多參數監控必將增加多個維度,從而能夠區分刺激誘導的細胞事件。
有意思的是,緩激肽在A431細胞中誘導的B2受體活化引發了縱向和橫向兩個方向的物質再分布。
實施例12:用終點測定高通量篩選作用于內源性GPCR的化合物
此處所述為適用于高通量篩選調節或影響細胞中、細胞增殖中或細胞死亡中一種或多種信號傳遞途徑的化合物的方法。這些高通量方法是基于這樣的理解:如本文中所述,可用多種不同的參數來分析生物傳感器的輸出數據。而且,如本文所述,特定細胞、細胞內的特定受體或特定細胞事件例如死亡或增殖或信號傳遞途徑調節可具有特定的特征。如本文所述,該特征可由一個或多個生物傳感器輸出參數構成。重要的是,對于高通量方法來說,在方法過程中有一個時間點,在該時間點采集的生物傳感器輸出參數將可反映出細胞的狀態,即,某信號傳遞途徑被激活或關閉,細胞已死亡或正在增殖。該個點可以是有可用于構成特征的一組生物傳感器輸出數據特征的時刻。
配體誘導的DMR信號通常延續較長時間(數十分鐘)。因此,動力學測定似乎不適合高通量(HT)篩選類應用。然而,基于某特定配體誘導的DMR信號的總體動態學特征和很好表征的動力學特征,可以容易地開發出用于HTS應用的終點測定方法。基于兩種GPCRs(A431細胞內的緩激肽B2受體和CHO細胞內 蛋白酶活化受體亞型1(PAR1))的光學特征,用兩種終點測定開發了高通量篩選方法。
圖86顯示試驗期間作為化合物的函數的兩個時間點之間的波長改變。這兩個時間點是:臨加入化合物前(基線點)和加入化合物后5分鐘(測定點)。兩點間的差別反映緩激肽(緩激肽B2受體激動劑)介導的P-DMR過程的總振幅。B2受體在A431細胞內內源性表達。在緩激肽刺激前,該細胞已轉入靜息態。本實施例采用384孔Coring Epic生物傳感器平板。每孔含有A431細胞,覆蓋率約為90%。半數孔用100nM的緩激肽處理,另半數孔只用HBSS緩沖液處理。結果顯示,經100nM緩激肽處理細胞的波長總變化為約800pm,經HBSS緩沖液處理細胞響應的振幅小得多(約-10pm)。該試驗窗口非常大(~810pm),而該試驗的波動性卻很小(經緩激肽處理細胞的CV約為~6%)。
圖87顯示試驗期間作為化合物函數的兩個時間點之間的波長改變。這兩個時間點是:臨加入化合物前(基線點)和加入化合物后5分鐘(測定點)。兩點間的差別反映緩激肽(緩激肽B2受體激動劑)介導的P-DMR過程的總振幅。兩點間的差別反映凝血酶(PAR1受體激動劑)介導的P-DMR過程的總振幅。此處使用另一細胞系-CHO細胞。PAR1受體在CHO細胞中內源性表達。在凝血酶刺激前,通過在DMEM培養基中培養細胞4小時使部分細胞轉入靜息態。本實施例采用384孔Coring Epic生物傳感器平板。每孔含有CHO細胞,覆蓋率約為90%。半數孔用40單位/ml的凝血酶處理,另半數孔只用HBSS緩沖液處理。由于激動劑在A431細胞中誘導的B2活化和在CHO誘導的PAR1活化都引發Gq信號傳遞,該試驗結果的重要性在于:Gq-型光學特征至少在這兩種細胞系中是普遍存在的。用相同的終點測定就能夠篩選作用于不同細胞內不同內源性靶標的CPCR調節劑。
圖88顯示試驗期間作為化合物函數的兩個時間點之間的波長改變。這兩個時間點是:臨加入化合物前(基線點)和加入化合物后5分鐘(測定點)。用不同劑量的凝血酶處理CHO細胞。結果顯示,用終點測定法,細胞劑量依賴性地對凝血酶刺激做出響應,產生的表觀EC50為12.5單位/ml。該試驗結果提示:終點測定不僅能夠高通量地篩選GPCR調節劑,而且能夠確定實際生理學條件下,GPCR激動劑對內源性GPCR的激動活性和效力。與對單個細胞響應或特定標記靶標進行試驗的傳統方法不同,基于生物傳感器的細胞試驗適用于大規模、基于多個靶標地選擇強效配體。一旦鑒定到一個獨特的DMR特征并確定 了其通過特定狀態細胞內的一類特定靶標與一特定的信號傳遞相關聯,就可對化合物文庫進行篩選。可根據它們的光學特征對化合物進行分類。這樣的篩選可用于化合物分類。
或者,因為產生給定類型光學特征的化合物可能是同一類內源性受體例如Gq偶聯受體的激動劑。可對此類化合物在先刺激對受體特異性激動劑誘導的DMR信號的作用進行研究,并用來指示靶標特異性。這樣的篩選可用于基于靶標的篩選。
鑒定正確的主要結構(lead structure)是藥物開發中的關鍵步驟。一旦選定了主要結構,就可用本文所述光學生物傳感器來系統地研究其對活細胞的作用。例如,可用信號傳遞途徑中一組靶標的多種已知調節劑來研究所述主要結構所誘導DMR信號的調節特征,從而使該主要結構與特定的靶標或信號傳遞途徑相關聯。一旦確立了所述關聯,就可用生物傳感器對主要結構進行優化。因為通過某個靶標的細胞信號傳遞是復雜的,還可進一步將主要結構優化成只選擇性調節某受體的某一種特定聚合狀態,或某一特定途徑或某種細胞狀態途徑。

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