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水牛睪丸曲精細管總蛋白樣品的制備方法和雙向電泳分離方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201410160031.3

申請日:

2014.04.21

公開號:

CN103951730A

公開日:

2014.07.30

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C07K 1/30申請日:20140421|||公開
IPC分類號: C07K1/30; G01N1/28; G01N27/26 主分類號: C07K1/30
申請人: 廣西大學
發明人: 張明; 黃愉淋; 付強; 黃德倫
地址: 530004 廣西壯族自治區南寧市西鄉塘區大學路100號
優先權:
專利代理機構: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104 代理人: 楊立華
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410160031.3

授權公告號:

||||||

法律狀態公告日:

2016.02.10|||2014.08.27|||2014.07.30

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種水牛睪丸曲精細管總蛋白樣品的制備方法,該法屬于裂解液提取-丙酮沉淀方法,且方法簡單易行、快速可靠,結合使用組合酶有效消化和去除了睪丸肌肉組織、結締組織等多種組織成分以及DNA等,最終將大量白色的睪丸曲精細管富集出來,獲得的曲精細管較純且不含其它雜質,提取的總蛋白質量較好,適合于雙向電泳分析。據此,發明人通過不斷摸索和優化雙向電泳技術體系,從而建立了一套水牛睪丸曲精細管總蛋白樣品的雙向電泳分離方法,該法可獲得質量較好、分辨率較高的雙向電泳圖譜,對于后續的質譜分析和蛋白鑒定具有非常重要的應用價值。

權利要求書

權利要求書
1.  一種水牛睪丸曲精細管總蛋白樣品的制備方法,其特征在于包括以下步驟:
(1)用體積濃度75%酒精消毒水牛陰囊皮膚,切開陰囊并剝離其周圍組織,取出睪丸,置于37℃生理鹽水中保存并迅速帶回實驗室;用PBS反復沖洗3次,去掉被膜、白膜,剪取一小塊睪丸實質,用鑷子將組織慢慢撕開并置于15mL玻璃管中;
(2)向步驟(1)的15mL玻璃管中加入膠原酶Ⅳ和DNaseⅠ的混合酶溶液,使睪丸組織與混合酶溶液的質量體積比為1:10,置于37℃搖床上震搖2~3h,直到看到大量白色的曲精細管富集于管底時停止搖晃,輕輕倒掉上清液,用PBS溶液沖洗2~3次,將純化后的曲精細管樣品分裝于1.5mL離心管中;
(3)向步驟(2)的1.5mL離心管中加入純化的曲精細管樣品3~5倍體積的蛋白裂解液,冰浴下震搖30min至曲精細管樣品充分裂解,4℃、12000g離心10min,收集上清液;(4)向步驟(3)收集的上清液中加入4倍預冷丙酮,-20℃靜置2~3h或過夜,4℃、12000g離心30min,棄上清,再用預冷丙酮洗滌沉淀2~3次,室溫放置10min使殘余丙酮盡可能完全揮發,蛋白沉淀用水化液復溶,Bradford法測定蛋白質濃度,-80℃保存備用。

2.  根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于步驟(2)的混合酶溶液按以下步驟配制:將膠原酶Ⅳ和DNaseⅠ用PBS進行溶解分別制成濃度1mg/mL和300μg/mL的溶液,然后按照體積比10:3混合,即得。

3.  根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于步驟(3)的蛋白裂解液組成為7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%CHAPS和1%DTT。

4.  根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于步驟(4)的水化液的組成為8mol/L尿素和2%CHAPS。

5.  用于權利要求1所述水牛睪丸曲精細管總蛋白樣品的雙向電泳分離方法,其特征在于包括以下步驟:
(5)取步驟(4)中得到的蛋白質樣品350μg,選取24cm、pH4~7的IPG膠條進行第一向固相pH梯度等電聚焦,在蛋白質樣品中加入2.25μL IPG Buffer和0.01g DTT,并根據蛋白質樣品上樣體積加入適量水化液使上樣總體積達到450μL;
(6)將步驟(5)中混合均勻的450μL上樣溶液緩慢加入膠條槽中,IPG膠條膠面朝下輕輕蓋住樣品混合液,避免產生氣泡,最后加入2~3mL Immobiline DryStrip礦物油覆蓋防止溶液揮發,蓋上蓋子水平放置于聚焦儀上進行等電聚焦;
(7)將步驟(6)中等電聚焦后的IPG膠條放入15mL平衡液I中,于搖床上平衡15min, 再使用等體積的平衡液II平衡15min;
(8)將步驟(7)中平衡好的膠條轉移至12.5%的SDS-PAGE凝膠頂端進行第二向垂直電泳,以恒流15mA/gel電泳15min后,增大電流至25mA/gel,直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部停止電泳。

6.  根據權利要求5所述的雙向電泳分離方法,其特征在于還包括以下步驟:
(9)步驟(8)中第二向SDS-PAGE電泳結束后,取出玻璃板,將凝膠剝離后進行硝酸銀染色,染色結束后,使用Image Scanner掃描儀掃描凝膠并將圖像保存,應用Image Master2D platinum軟件分析圖像。

7.  根據權利要求6所述的雙向電泳分離方法,其特征在于步驟(5)的水化液的組成為8mol/L尿素和2%CHAPS。

8.  根據權利要求7所述的雙向電泳分離方法,其特征在于步驟(6)中等電聚焦按以下程序進行:30V,6h、60V,6h、200V,1h、500V,1h、1000V,1h、8000V,1h、80000Vhs,10h、1000V,10h。

9.  根據權利要求8所述的雙向電泳分離方法,其特征在于步驟(7)中平衡液I的的組成為6mol/L尿素,2%SDS,1.5mol/L Tris-HCl,87%甘油,1%DTT;平衡液II的組成為6mol/L尿素,2%SDS,1.5mol/L Tris-HCl,87%甘油,4%IAA。

關 鍵 詞:
水牛 睪丸 精細 蛋白 樣品 制備 方法 雙向 電泳 分離
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