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一種用于直接檢測呋喃它酮代謝物AMOZ的快速免疫檢測方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201410154389.5

申請日:

2014.04.17

公開號:

CN103954749A

公開日:

2014.07.30

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):G01N 33/53申請日:20140417|||公開
IPC分類號: G01N33/53; C07K14/795; C07K14/77; C07K14/765; C07K16/44 主分類號: G01N33/53
申請人: 華南農業大學
發明人: 孫遠明; 劉鳳銀; 徐振林; 沈玉棟; 雷紅濤; 王弘; 楊金易; 肖治理
地址: 510642 廣東省廣州市天河區五山路483號
優先權:
專利代理機構: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102 代理人: 林麗明
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410154389.5

授權公告號:

||||||

法律狀態公告日:

2015.11.11|||2014.08.27|||2014.07.30

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種用于直接檢測呋喃它酮代謝物AMOZ的快速免疫檢測方法,包括AMOZ半抗原、人工抗原、抗體等的制備及其應用。所述AMOZ半抗原具有式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示分子結構,所述AMOZ人工抗原具有式(Ⅲ)或式(Ⅳ)所示分子結構。采用本發明抗原得到的抗體可以特異性識別AMOZ,抗體的效價為1:64000,最低檢測限為0.852ng/mL,半抑制濃度為15.26ng/mL,可以直接用于AMOZ的檢測,克服傳統酶聯免疫方法需要對AMOZ進行衍生化的特點,更簡便、快速及低成本。本發明的抗原及抗體在食品中AMOZ的殘留檢測上具有廣泛的應用前景。

權利要求書

權利要求書
1.  一種直接檢測呋喃它酮代謝物AMOZ的快速免疫檢測方法,其特征在于,包括如下步驟:
S1.將具有式(Ⅲ)所示分子結構的AMOZ人工抗原作為免疫原免疫動物制備AMOZ的多克隆抗體;
S2將具有式(Ⅳ)所示分子結構的AMOZ人工抗原作為包被原包被在微孔板上,將步驟S1制備得到的AMOZ的多克隆抗體加入微孔板中;
S3.采用競爭ELISA測定待測樣品中AMOZ的含量;


2.  根據權利要求1所述快速免疫檢測方法,其特征在于,式(Ⅲ)所示分子結構的AMOZ人工抗原是由式(Ⅰ)所示分子結構的AMOZ半抗原與載體蛋白偶聯得到,式(Ⅳ)所示分子結構的AMOZ人工抗原是由式(Ⅱ)所示分子結構的包被半抗原與載體蛋白偶聯得到;。

3.  根據權利要求2所述快速免疫檢測方法,其特征在于,式(Ⅰ)所示分子結構的AMOZ半抗原的制備方法,包括如下步驟:將AMOZ和乙醛酸分別溶于無水乙醇中,攪拌過程中將乙醛酸的乙醇溶液滴加到AMOZ的乙醇溶液中,AMOZ和乙醛酸的摩爾比為1:1.2;室溫攪拌過夜,反應結束,真空抽濾,依次用乙醇和乙醚洗滌2次,取沉淀、干燥獲得式(Ⅰ)所示AMOZ半抗原。

4.  根據權利要求2所述快速免疫檢測方法,其特征在于,式(Ⅱ)所示分子結構的包被半抗原的制備方法,包括如下步驟:將AMOZ和順丁烯二酸酐分別溶于無水乙醇中,攪拌過程中將順丁烯二酸酐的乙醇溶液滴加到AMOZ的乙醇溶液中,AMOZ和順丁烯二酸酐的摩爾比為1:1.2;室溫攪拌過夜,反應結束,真空抽濾,依次用乙醇和乙醚洗滌2次,取沉淀、干燥獲得式(Ⅱ)所示包被半抗原。

5.  根據權利要求2所述快速免疫檢測方法,其特征在于,所述載體蛋白為牛血清蛋白、匙孔血藍蛋白或卵清蛋白。

6.  根據權利要求1所述快速免疫檢測方法,其特征在于,S1所述AMOZ的多克隆抗體的效價為1:64000,最低檢測限為0.852 ng/mL,半抑制濃度為15.26 ng/mL。

說明書

說明書一種用于直接檢測呋喃它酮代謝物AMOZ的快速免疫檢測方法
技術領域
本發明屬于食品安全免疫檢測技術領域,更具體地,涉及一種用于直接檢測呋喃它酮代謝物AMOZ的快速免疫檢測方法。
背景技術
AMOZ是硝基呋喃類抗生素呋喃它酮的代謝物,是非法使用硝基呋喃類抗生素的指示物,是一類具有潛在致畸、致癌和致突變的物質。歐盟已于1995年禁止在食用動物中使用硝基呋喃類抗生素,又在1997年將所有的硝基呋喃類抗生素全部列為違禁藥物,我國亦于2002年頒布了禁止使用硝基呋喃類抗生素的禁令。之后歐盟又于2003年通過了2003/181/EC委員會決議,建立了用于禽肉產品和水產品中硝基呋喃類藥物代謝物的各種檢測方法的最小要求性能限值為1μg/kg。現在,為保證食品安全,國內外的監管機構將注意力集中在了AMOZ的檢測上,建立快速、簡單、廉價、有效的AMOZ檢測方法已刻不容緩。
    目前國內外檢測AMOZ的方法主要有色譜方法及其聯用技術、分光光度法、免疫分析法等。前兩種屬于儀器分析檢測技術,存在著周期長、專業性強、費用高等不足,很難適應許多場合快速檢測的需要,在應用上不能廣泛推廣。而現在報道的基于抗原—抗體特異性結合檢測AMOZ的免疫分析方法在檢測之前均需對檢測對象進行衍生化處理,存在著前處理操作復雜繁瑣、成本高及回收率偏低等不足,限制了其應用。
    基于抗原-抗體識別的免疫分析技術在小分子化學性污染物檢測領域占有重要地位,已經成功應用于農藥、獸藥、生物毒素等的快速檢測,為保障食品安全發揮了重要作用。但是,大量實踐證明:當化合物(半抗原)的分子量<300 Da時,其高特異性高親和力的抗體制備難度增大。由于AMOZ分子量很小(201.22 Da),即使將其與載體蛋白偶聯,其高特異性高親和力抗體的制備難度也相對很大,因此,目前關于AMOZ免疫分析檢測技術的報道大都是需對其進行衍生化的間接檢測,而關于直接檢測AMOZ的免疫分析檢測技術則鮮有報道。
    2009年,Pimpitak 等人報道了一種檢測強化蝦樣品中AMOZ殘留量的方法。他們將AMOZ與3-羧酸苯甲醛衍生化制備免疫半抗原CPAMOZ,通過抗原制備、動物免疫以及單克隆抗體制備獲得單克隆抗體,該抗體雖然能夠識別AMOZ,但是識別靈敏度低,比其對半抗原CPAMOZ的靈敏度低23倍。基于該抗體他們建立了間接檢測AMOZ的免疫分析方法,即在檢測前對其進行衍生化(將AMOZ與2-硝基苯甲醛衍生化為NPAMOZ),衍生化的時間需要十多個小時,十分費時。
    抗體是免疫分析的核心試劑,本課題組以一種新型的AMOZ半抗原,將其與載體蛋白偶聯制備人工抗原,并進行抗體制備,獲得了特異性識別AMOZ的抗體。同時為了提高對AMOZ分析的靈敏度,設計了一個與免疫半抗原不同結構的包被半抗原,基于此建立了一種異源免疫分析方法,該方法可以實現對AMOZ的直接檢測,無需衍生化,同時只對AMOZ的原型呋喃它酮有交叉(CR=188.2%),與其它硝基呋喃類抗生素的原型及其衍生物無交叉現象,考慮到樣品前處理采用水提的方式,呋喃它酮本身不能溶于水,對實際樣品的檢測影響不大,不會造成假陽性,可以用于實際樣品的檢測。
發明內容
本發明要解決的技術問題是克服傳統的AMOZ免疫分析技術中均需對其進行衍生化處理的缺陷,提供一種AMOZ半抗原、人工抗原和高特異性抗體。
    本發明的第二個目的是提供所述AMOZ半抗原、人工抗原和特異性抗體的制備方法。
    本發明的第三個目的是提供一種可以對AMOZ進行直接快速檢測的免疫分析方法。
    本發明的目的通過以下技術方案予以實現:
一種AMOZ半抗原,所述AMOZ半抗原具有式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示分子結構:
 
所述AMOZ半抗原的制備方法為:將AMOZ和乙醛酸或順丁烯二酸酐分別溶于無水乙醇中,攪拌過程中將乙醛酸或順丁烯二酸酐的乙醇溶液滴加到AMOZ的乙醇溶液中,AMOZ和乙醛酸或順丁烯二酸酐的摩爾比為1:1.2;室溫攪拌過夜,反應結束,真空抽濾,依次用乙醇和乙醚洗滌2次,取沉淀、干燥獲得式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示AMOZ半抗原。
一種AMOZ人工抗原,所述AMOZ人工抗原具有式(Ⅲ)或式(Ⅳ)所示分子結構:
 
優選地,本發明所述人工抗原的制備方法為:采用活潑酯偶聯法將如上具有式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示分子結構的AMOZ半抗原與載體蛋白偶聯制備得到具有式(Ⅲ)或式(Ⅳ)所示分子結構的AMOZ人工抗原。
更優選地,本發明所述人工抗原的制備方法為:將具有式(Ⅰ)或(Ⅱ)所示分子結構的AMOZ半抗原溶于二甲基甲酰胺(DMF)中,攪拌加入1,3-二環己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺,4℃下磁力攪拌反應過夜,離心后取上清;攪拌條件下,將上清液逐滴滴加到載體蛋白的PBS(0.01M,pH 7.4)緩沖溶液中,4℃下磁力攪拌反應12h;離心后取上清。4℃下用生理鹽水透析3天得目標產物。所述AMOZ半抗原與載體蛋白的摩爾比為100:1。
優選地,所述載體蛋白為匙孔血藍蛋白(KLH)、牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)。
本發明同時提供所述AMOZ特異性單克隆抗體或多克隆抗體,以及所述AMOZ人工抗原和特異性抗體在AMOZ免疫檢測方面的應用。
    一種直接檢測呋喃它酮代謝物AMOZ的快速免疫分析方法,包括如下步驟:
S1.將權利要求3具有式(Ⅲ)所示分子結構的AMOZ人工抗原免疫動物制備AMOZ的多克隆抗體;
S2權利要求3具有式(Ⅳ)所示分子結構的AMOZ人工抗原作為包被原包被在微孔板上,將步驟S1制備得到的AMOZ的多克隆抗體加入微孔板中;
S3.采用競爭ELISA測定待測樣品中AMOZ的含量。
 本發明建立了一種異源包被的酶聯免疫檢測方法,可直接用于AMOZ的檢測,無需衍生化處理。 
本發明的有益效果是:
本發明最大的創新點就是把兩個半抗原進行了組合,建立異源包被(免疫半抗原用式(I)所示半抗原,包被半抗原用式(Ⅱ)所示半抗原,傳統的方法是免疫半抗原和包被半抗原都采用式(I)所示半抗原或都采用式(Ⅱ)所示半抗原。而本發明發現只有將式(I)所示半抗原作為免疫半抗原、式(Ⅱ)所示半抗原作為包被半抗原這種組合才能用于直接檢測AMOZ,其他組合均不行。
現有的AMOZ檢測方法以儀器法居多,而儀器法周期長、專業性強、費用高操作繁復,前處理復雜,成本高。現有的免疫分析檢測方法均需在檢測前對AMOZ進行衍生化處理,存在前處理操作復雜繁瑣、成本高及回收率偏低等不足。本發明提供了一種對AMOZ進行直接檢測的快速免疫分析方法,闡述了AMOZ半抗原、人工抗原、特異性抗體的制備方法與應用。其思路是將AMOZ衍生化,獲得具有雙鍵剛性支撐手臂的衍生物。以該衍生物為半抗原,進而制備人工抗原,免疫動物獲得特異性抗體。該抗體可以特異性識別AMOZ本身,進而對 AMOZ進行直接檢測,無需衍生化。該思路的有益效果體現在:(1)引入具有剛性支撐作用的雙鍵手臂,使得AMOZ的結構特征明顯增強,有利于刺激動物免疫應答產生特異性更強、靈敏度更高的抗體;(2)所使用的衍生劑可以與AMOZ的肼胺鍵發生快速、高效的酰胺化縮合,衍生條件簡單、快速、重復性好;(3)本發明提供的AMOZ的快速檢測方法最低檢測限可達到0.852ng/mL。
附圖說明
圖1. AMOZ半抗原HⅠ及其免疫抗原、載體蛋白紫外掃描圖。
圖2. AMOZ半抗原HⅡ及其包被抗原、載體蛋白紫外掃描圖。
圖3.以人工抗原Ⅲ為免疫原制備的抗體、人工抗原Ⅳ為包被原建立的對AMOZ的抑制曲線。
具體實施方式
    下面結合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發明,除非特別說明,本發明采用的試劑、方法和儀器為本技術領域常規的試劑、方法和儀器。
實施例1  半抗原HⅠ的制備:
    取604mg(3mmol)AMOZ、 266.5mg(3.6mmol)乙醛酸分別溶于2mL無水乙醇中,攪拌過程中將乙醛酸的乙醇溶液滴加到AMOZ的乙醇溶液中,室溫攪拌反應過夜。反應結束,真空抽濾,依次用2mL乙醇和乙醚洗滌濾餅2次,取沉淀,得到白色固體目標物HⅠ540.2mg,產率為70%。ESI-MS analysis (positive)m/z 258.7 [M+H]+;1H NMR (600MHz, d5-Pyridine, TMS): δ 7.56 (s, 1H), 4.99-4.97 (m, 1H), 4.16 (t, J=8.8Hz, 1H), 3.79 (dd, J1=6.7, J2=8.8, 1H), 3.68-3.64 (m, 4H), 2.66 (dd, J1=6.1, J2=13.5, 1H), 2.62 (dd, J1=5.5, J2=13.4, 1H), 2.51-2.46 (m, 4H)。
實施例2  半抗原HⅡ的制備方法
    取604mg (3mmol)AMOZ、353mg(3.6mmol)順丁烯二酸酐分別溶于2mL無水乙醇中,攪拌過程中將順丁烯二酸酐的乙醇溶液滴加到AMOZ的乙醇溶液中,室溫攪拌反應過夜。反應結束,真空抽濾,依次用2mL乙醇和乙醚洗滌濾餅2次,取沉淀,得到白色固體目標物HⅡ566mg,產率為63%。ESI-MS analysis (negative)m/z 298.6 [M-H]-;1H NMR (500MHz, d6-DMSO, TMS): δ 6.32 (d, J=2.9Hz, 2H), 4.86–4.78 (m, 1H), 3.74 (t, J =8.1Hz, 2H), 3.58 (s, J= 4.6 Hz, 4H), 3.43 (t, J = 7.7 Hz, 1H )。
實施例3  免疫原/包被原的制備
    免疫原與包被原的制備不同之處在于半抗原的結構和載體蛋白種類,所述免疫原采用半抗原HⅠ,載體蛋白采用牛血清蛋白(BSA);所述包被原采用半抗原HⅡ,載體蛋白采用卵清蛋白(OVA)。
    免疫原的制備方法。活潑酯法:取半抗原HⅠ10mg(0.04mmol),溶于500μL二甲基甲酰胺(DMF)中,攪拌加入20.6mg(0.1mmol)1,3-二環己基碳二亞胺(DCC)和11.5mg(0.1mmol)N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),4℃下磁力攪拌反應過夜,離心后取上清為A液。稱取20mg載體蛋白BSA溶于2mL PBS溶液(0.1mol/L,pH 7.4)中,攪拌溶解制備B液。磁力攪拌下,吸取A液384μL逐滴滴加到B液中,4℃下攪拌反應12h。離心后,取上清液,4℃下PBS透析3d,每天早晚2次更換透析液。得到免疫原HⅠ—BSA。用PBS調整濃度為1mg/mL,每管500μL分裝于0.5mL離心管中。凍存于—20℃冰箱中,備用。
包被原的制備方法。活潑酯法:半抗原HⅡ15mg(0.05mmol),溶于1.5mL二甲基甲酰胺(DMF)中,攪拌加入24.8 mg(0.12mmol)1,3-二環己基碳二亞胺(DCC)和13.8mg(0.12mmol)N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),4℃下磁力攪拌反應過夜,離心后取上清為A液。稱取20mg載體蛋白OVA溶于5mL PBS溶液(0.1mol/L,pH 7.4)中,攪拌溶解制備B液。磁力攪拌下,吸取A液1.329mL逐滴滴加到B液中,4℃下攪拌反應12h。離心后,取上清液,4℃下PBS透析3d,每天早晚2次更換透析液。得到免疫原HⅡ—OVA。用PBS調整濃度為1mg/mL,每管500μL分裝于0.5mL離心管中。凍存于-20℃冰箱中,備用。
    對載體蛋白、半抗原HⅠ、半抗原 HⅡ及其相應的免疫原和包被原進行紫外掃描鑒定(220nm ~ 350nm),發現免疫原和包被原同時具備半抗原和載體蛋白的特征吸收峰(見圖1和圖2),說明免疫原和包被原偶聯成功。
實施例4  抗體的制備及鑒定
    將免疫原與等劑量的免疫佐劑(第1次用完全弗氏佐劑,之后均用不完全弗氏佐劑)混合乳化,采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳緣靜脈多種注射方式免疫6只體重為2.5~3kg的健康新西蘭大白兔。第一次免疫間隔一個月后每三周加強免疫一次。第三次加強免疫后1周耳緣靜脈取血,并利用ic-ELISA測定血清效價。當效價不再上升時,采用耳緣靜脈加強免疫。兩天后心臟采血,室溫靜置0.5~1h,于4℃、12000r/min下離心10min,取上清分裝于離心管中,于-20℃下保存備用。
    間接競爭ELISA測定抗體陽性滴度以2.1倍于陰性血清的測定值為準,結果表明半抗原HⅠ對應的抗血清(Ab-HⅠ)效價為1:64000。
實施例5  抗體的特異性及靈敏度
    依據如上效果,使用抗血清(Ab-HⅠ)建立ELISA標準曲線;使用磷酸鹽吐溫緩沖溶液PBST(0.01 mol/L,Tween-20 0.0125%,pH 5.4)作為所有樣品的稀釋液;使用HⅡ—OVA作為包被原;將50μL系列濃度的藥物標準品和50μL適當稀釋倍數的AMOZ特異性多克隆抗體加入到96孔酶標板中,競爭反應后通過酶標分析儀測定吸光度(OD)。以OD值為縱坐標,相應標準品濃度對數值為橫坐標,應用originPro 7.5 軟件四參數對數函數進行曲線擬合:
y= (A-D)/[1+(x /C)B]+D        (1)
其中,A和D分別代表藥物濃度最小和最大時的吸光值;C為中點標準品濃度,當標準品濃度等于C時的OD值為(A+D)/2,正處于曲線的拐點處,半數抑制量濃度為IC50;B表示曲線的陡峭程度,稱斜率因子;以IC10為檢測限,以IC20~IC80為檢測范圍。以標準品AMOZ建立ELISA的標準曲線,結果如圖3,相關標準曲線參數見表1。結合附圖及附表可知,以AMOZ標準品建立的標準曲線具備典型的S型曲線,檢測靈敏度較好,因此該方法可以用于直接檢測食品中AMOZ的含量。
表1  抗血清(Ab-H Ⅰ)對AMOZ的檢測參數
免疫原IC50(ng/mL)線性范圍(ng/mL)最低檢測限(ng/mL)相關系數R2HⅠ—BSA15.262.47~94.210.8520.997
表2  抗血清(Ab-H Ⅰ)對AMOZ及其結構類似物的交叉反應率
競爭物交叉反應率(%)AMOZ100AOZ<0.1AHD<0.1SEM<0.1鹽酸呋喃它酮(原藥)188.2呋喃唑酮<0.1呋喃妥因<0.1呋喃西林<0.1
實施例6    
    S1.免疫原與包被原的制備:所述免疫原采用半抗原HⅡ,載體蛋白采用牛血清蛋白(BSA);所述包被原采用半抗原HⅠ,載體蛋白采用卵清蛋白(OVA)。免疫原與包被原的制備方法參照實施例3的步驟。
S2.抗體制備:以HⅡ-BSA作為免疫原免疫新西蘭大白兔,制備AMOZ特異性多克隆抗體,抗體制備參照實施例4的步驟;
S3.以HⅠ-OVA作為包被原包被酶標板,將50μL系列濃度的藥物標準品和50μL適當稀釋倍數的AMOZ特異性多克隆抗體加入到96孔酶標板中,采用競爭ELISA測定待測樣品中AMOZ的含量。具體步驟參照實施例5.
本實施例發現:以HⅡ-BSA作為免疫原,HⅠ-OVA作為包被原的組合不能用于直接檢測AMOZ,檢測效果不靈敏。

關 鍵 詞:
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