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利用HPLC檢測木聚糖合成中Β1,4木糖轉移酶活性的方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201410150610.X

申請日:

2014.04.15

公開號:

CN103954701A

公開日:

2014.07.30

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):G01N 30/02申請日:20140415|||公開
IPC分類號: G01N30/02 主分類號: G01N30/02
申請人: 華南農業大學
發明人: 吳藹民; 趙先海; 鄧小梅; 陳曉陽; 宋麗麗
地址: 510642 廣東省廣州市天河區五山路483號
優先權:
專利代理機構: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245 代理人: 蘇運貞
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410150610.X

授權公告號:

||||||

法律狀態公告日:

2015.12.09|||2014.08.27|||2014.07.30

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開一種利用HPLC檢測木聚糖合成中β-1,4-木糖轉移酶活性的方法。本發明通過提取植物微囊體,利用微囊體中存在的β-1,4-木糖轉移酶,進行Xyln-AA與UDP-Xyl的加成反應,然后利用HPLC進行加成產物的檢測,探討XylT在植物中的活性。由于XylT是木聚糖合成的關鍵酶,木聚糖是生物質半纖維素的主要成分,理解木聚糖的合成機理有利于更好地利用生物質半纖維素。本發明為深入研究木聚糖合成機理和調節半纖維素中木聚糖成分提供了一種可靠的途徑,可根據需要,通過篩選木聚糖合成缺陷型植株,研究調節木聚糖形成的基因,或通過調節影響XylT合成的關鍵基因,來滿足對材料中半纖維素不同含量的需求。

權利要求書

權利要求書
1.  一種利用HPLC檢測木聚糖合成中β-1,4-木糖轉移酶活性的方法,其特征在于包括以下步驟:
(1)將植物莖部去皮,加入提取液,4℃勻漿,過濾,收集濾液,將濾液離心,取上清液進行離心,得到的沉淀為細胞的膜結構,加入含有蛋白酶抑制劑的提取液懸浮沉淀,得到微囊體;利用BCA法測定得到的微囊體的蛋白濃度;-80℃保存;
(2)以尿苷二磷酸木糖和含熒光基團的低聚木糖為底物,利用步驟(1)中制備的微囊體的蛋白活性進行加成反應,反應產物進行酶失活處理,離心后,取上清,過濾,收集濾液,即為加成產物;
(3)取步驟(2)得到的加成產物和標準品分別進行高效液相色譜檢測,通過對照各寡聚產物與標準品的保留時間獲得加成產物構成譜;
(4)對步驟(2)得到的加成產物進行酶失活處理,然后離心,棄沉淀,取上清液,進行酶解,酶解產物進行高效液相色譜分析,可驗證加成產物糖苷鍵的結構;
(5)對步驟(2)得到加成產物,進行純化,然后進行MALDI-TOF-MS分析,通過比對分子量得知加成產物為不同聚合度的木糖。

2.  根據權利要求1所述的利用HPLC檢測木聚糖合成中β-1,4-木糖轉移酶活性的方法,其特征在于:
步驟(2)中所述的含熒光基團的低聚木糖通過如下步驟制備:
①配制衍生反應試劑:30mg/mL熒光基團2-氨基苯甲酸和20mg/mL氰基硼氫化鈉溶解在MABS中,得到衍生反應試劑;其中,MABS為:24mg/mL醋酸鈉和20mg/mL硼酸溶解在甲醇溶液中,MABS要現配現用;
②標記反應:將低聚木糖與步驟①中得到的衍生反應試劑按照質量體積比1mg:1mL混合,在80℃反應80min,過量的衍生試劑通過加入乙醚混合后萃取三次去除上層溶液,底層為熒光基團2-氨基苯甲酸標記的低聚木糖,再通過Sep-Pak C18萃取萃取小柱純化,得到將低聚木糖的還原末端標記熒光基團2-氨基苯甲酸成含熒光基團的低聚木糖,通過高效液相色譜中紫外檢測;
所述的純化通過如下步驟進行:按體積百分比:Sep-Pak C18固相萃取小柱用含0.1%甲酸的60%乙腈洗過后,用10mL1%甲酸活化小柱,100μL反應產物和等量的水混合上柱,再用10mL1%甲酸洗柱,最后用2mL含0.1%甲酸的 60%乙腈洗脫低聚木糖,得到純化的產物;純化的產物用氮氣吹干后,溶解于20~100μL水備用。

3.  根據權利要求1所述的利用HPLC檢測木聚糖合成中β-1,4-木糖轉移酶活性的方法,其特征在于:
步驟(1)中所述的將植物莖部去皮,加入提取液,植物與提取液的質量體積比為(2~5)g:1mL;
步驟(1)中所述的植物為黃梁木(Neolamarckia cadamba(Rubiaceae))或蘆筍(Asparagus officinalis L.)。

4.  根據權利要求1所述的利用HPLC檢測木聚糖合成中β-1,4-木糖轉移酶活性的方法,其特征在于:
步驟(1)中所述的提取液的組成成分為100mM pH6.8的Hepes-KOH buffer,1mM DTT,1mM EDTA,0.1mM MnCl2,0.4M蔗糖;
步驟(1)中所述的過濾通過濾布進行過濾;
步驟(1)中所述的將濾液離心的條件為10000g,4℃離心10min;
步驟(1)中所述的取上清液進行離心的條件為100000g,4℃離心1h;
步驟(1)中所述的含有蛋白酶抑制劑的提取液為蛋白酶抑制劑的終濃度是1×cocktail的提取液;
所述的加入含有蛋白酶抑制劑的提取液懸浮沉淀,植物與含有蛋白酶抑制劑的提取液的重量體積比為1g:20μL。

5.  根據權利要求1所述的利用HPLC檢測木聚糖合成中β-1,4-木糖轉移酶活性的方法,其特征在于:
步驟(2)中的反應的體系為:50mM pH6.8的Hepes-KOH buffer,5mMMnCl2,1mM DTT,0.5%Triton X-100,0.1mM UDP-Xyl,0.5μM Xyln-AA,4μg/μL微囊體,共90μL;20℃反應30mim~6h;所述的酶失活處理為用5μL終濃度是0.017M的乙酸進行酶失活處理5min。

6.  根據權利要求1所述的利用HPLC檢測木聚糖合成中β-1,4-木糖轉移酶活性的方法,其特征在于:
步驟(2)中所述的離心的條件為3000g離心3min;
步驟(2)中所述的過濾通過0.22μm濾膜過濾;
步驟(3)中所述的標準品為含有Xyl1-AA~Xyl6-AA,其終濃度均為0.1mM。

7.  根據權利要求1所述的利用HPLC檢測木聚糖合成中β-1,4-木糖轉移酶活性的方法,其特征在于:
步驟(3)和(4)中所述的高效液相色譜的色譜,其中,高效液相色譜的色譜柱為2.1mm×250mm,1.8μm的ZORBAX Eclipse XDB-C18柱,流動相:A相為50mM pH4.3的乙酸鈉水溶液,B相為色譜純乙腈;分析條件:流速為0.5mL/min,柱溫為20℃,檢測器:Agilent1100HPLC systems,Ex320nm,Em420nm,進樣量為5μL,記錄時間為42min,洗脫方式為梯度洗脫。

8.  根據權利要求7所述的利用HPLC檢測木聚糖合成中β-1,4-木糖轉移酶活性的方法,其特征在于:
所述的梯度洗脫為:0,5min,25min,30min,35min,42min;相應的B相的體積變化為:0%,8%,20%,40%,100%,0%。

9.  根據權利要求1所述的利用HPLC檢測木聚糖合成中β-1,4-木糖轉移酶活性的方法,其特征在于:
步驟(4)中所述的進行酶失活處理的條件為100℃處理3min;
步驟(4)中所述的離心的條件為12000g離心5min;
步驟(4)中所述的酶解的反應體系為50mM pH6.0的乙酸鈉水溶液和9U木聚糖內切酶或0.01U木聚糖外切酶,30μL,10μL上清液,共40μL;37℃反應6h;反應產物用5μL0.1M乙酸鈉水溶液處理后過0.22μm濾膜,得到酶解產物。

10.  根據權利要求1所述的利用HPLC檢測木聚糖合成中β-1,4-木糖轉移酶活性的方法,其特征在于:
步驟(5)中所述的純化的步驟為:按體積百分比:Sep-Pak C18固相萃取小柱用含0.1%甲酸的60%乙腈洗過后,用10mL1%甲酸活化小柱,100μL加成產物和等量的水混合上柱,最后用2mL含0.1%甲酸的60%乙腈洗脫低聚木糖,得到純化的加成產物;純化的加成產物用氮氣吹干后溶解于20μL水,取1μL和等量的MALDI基質混合,在樣品板上干燥,進行MALDI-TOF-MS分析;
所述的MALDI基質為0.2M2,5-二羥基苯甲酸,0.06M1-羥基異喹啉,體積比50%乙腈。

說明書

說明書利用HPLC檢測木聚糖合成中β-1,4-木糖轉移酶活性的方法
技術領域
本發明屬于生物檢測領域,特別涉及一種利用HPLC檢測木聚糖合成中β-1,4-木糖轉移酶(Xylosyltransferase,XylT)活性的方法。
背景技術
纖維素、半纖維素和木素是農林生物質資源的主要組份,了解它們在植物體內的合成過程有利于更好地利用這些生物質資源。木聚糖為單子葉和雙子葉植物次生壁的主要半纖維素,主鏈為β-1,4-糖苷鍵連接的D-吡喃式木聚糖,XylT為催化尿苷二磷酸木糖(UDP-Xylose,UDP-Xyl)加成到木聚糖主鏈上的關鍵酶,定位于內膜,可促進木聚糖主鏈的延長。
涉及木聚糖主鏈延長的木糖轉移酶(XylT)基因的研究較晚,2007年才有第一篇文章,且主要是通過核磁共振(NMR)及分子量分析(SEC)。雖然有報道可以通過同位素分析測定XylT的加成反應,但方法繁瑣,需要較嚴格的實驗條件,不易操作。
目前已報道的涉及XylT活性的基因主要有IRX9,IRX10,IRX14等,它們可能通過復合體的方式行使功能。建立一套有效的測定方法,不但可以促進XylT復合體的形成及木聚糖合成機理的研究,還可以為體外合成低聚木糖等生物材料提供方便。
發明內容
為了克服現有技術的缺點與不足,本發明的目的在于提供一種利用HPLC檢測木聚糖合成中β-1,4-木糖轉移酶活性的方法。該方法具有穩定性和精密度高,重現性好等優點,能客觀真實地反映XylT加成反應產物的組分。
本發明的目的通過下述技術方案實現:一種利用HPLC檢測木聚糖合成中β-1,4-木糖轉移酶活性的方法,包括以下步驟:
(1)制備微囊體;
(2)以尿苷二磷酸木糖(UDP-Xyl)和含熒光基團的低聚木糖(Xyln-AA)為底物,利用步驟(1)中制備的微囊體的蛋白活性進行加成反應,反應產物進 行酶失活處理,離心后,取上清,過濾,收集濾液,即為加成產物;
(3)取步驟(2)得到的加成產物和標準品分別進行高效液相色譜(HPLC)檢測,通過對照各寡聚產物與標準品的保留時間獲得加成產物構成譜;
(4)對步驟(2)得到的加成產物進行酶失活處理,然后離心,棄沉淀,取上清液,進行酶解,酶解產物進行高效液相色譜(HPLC)分析,可驗證加成產物糖苷鍵的結構;
(5)對步驟(2)得到加成產物,進行純化,然后進行MALDI-TOF-MS分析,通過比對分子量得知加成產物為不同聚合度的木糖。
步驟(2)中所述的含熒光基團的低聚木糖(Xyln-AA)優選通過如下步驟制備:
①配制衍生反應試劑:30mg/mL熒光基團2-氨基苯甲酸(Anthranilic Acid,AA)和20mg/mL氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)溶解在MABS中,得到衍生反應試劑;其中,甲醇醋酸硼酸溶液(Methanol Acetate Borate Solution,MABS)為:24mg/mL醋酸鈉和20mg/mL硼酸溶解在甲醇溶液中,MABS要現配現用;
②標記反應:將低聚木糖(Xyln)與步驟①中得到的衍生反應試劑按照質量體積比1mg:1mL混合,在80℃反應80min,過量的衍生試劑通過加入乙醚混合后萃取三次去除上層溶液,底層為熒光基團2-氨基苯甲酸(AA)標記的低聚木糖,再通過Sep-Pak C18萃取萃取小柱純化,得到將低聚木糖(Xyln)的還原末端標記熒光基團2-氨基苯甲酸(Anthranilic Acid,AA)成含熒光基團的特異性好且穩定的低聚木糖(Xyln-AA),可以通過高效液相色譜(HPLC)中紫外檢測。
所述的純化優選通過如下步驟進行:Sep-Pak C18Plus short cartridge(Sep-Pak C18固相萃取小柱)用60%(v/v)乙腈(含0.1%甲酸,v/v)洗過后,用10mL1%(v/v)甲酸活化小柱,100μL反應產物和等量的水混合上柱,再用10mL1%(v/v)甲酸洗柱,最后用2mL60%乙腈(v/v)(含0.1%甲酸,v/v)洗脫低聚木糖,得到純化的產物;純化的產物用氮氣吹干后,溶解于20~100μL水備用。
所述的微囊體優選通過如下步驟制備:將植物莖部去皮,加入提取液,4℃勻漿,過濾,收集濾液,將濾液離心,取上清液進行離心,得到的沉淀為細胞的膜結構,加入含有蛋白酶抑制劑的提取液懸浮沉淀,得到微囊體;利用BCA法測定得到的微囊體的蛋白濃度;-80℃保存;
所述的將植物莖部去皮,加入提取液,植物與提取液的質量體積比(g/mL) 優選為(2~5):1;更優選為2:1;
所述的提取液的組成成分優選為100mM pH6.8的Hepes-KOH buffer,1mMDTT,1mM EDTA,0.1mM MnCl2,0.4M蔗糖;
所述的植物優選為黃梁木(Neolamarckia cadamba(Rubiaceae))或蘆筍(Asparagus officinalis L.),但不限于這些植物;
所述的過濾優選通過濾布進行過濾;
所述的將濾液離心的條件優選為10000g,4℃離心10min;
所述的取上清液進行離心的條件優選為100000g,4℃離心1h;
所述的含有蛋白酶抑制劑的提取液優選為蛋白酶抑制劑的終濃度是1×cocktail的提取液;
所述的加入含有蛋白酶抑制劑的提取液懸浮沉淀,植物與含有蛋白酶抑制劑的提取液的重量體積比優選為1g:20μL;
步驟(2)中的反應的體系為:90μL(50mM pH6.8的Hepes-KOH buffer,5mM MnCl2,1mM DTT,0.5%Triton X-100,0.1mM UDP-Xyl,0.5μM Xyln-AA,4μg/μL微囊體),20℃反應30mim~6h;所述的酶失活處理優選為用5μL終濃度是0.017M的乙酸進行酶失活處理5min;
步驟(2)中所述的離心的條件優選為3000g離心3min;
步驟(2)中所述的過濾優選通過0.22μm濾膜過濾;
步驟(3)中所述的標準品為含有Xyl1-AA~Xyl6-AA,其終濃度均為0.1mM;
步驟(3)和(4)中所述的高效液相色譜的色譜,其中,高效液相色譜的色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(2.1mm×250mm,1.8μm),流動相:A相為50mM乙酸鈉水溶液(pH4.3),B相為色譜純乙腈;分析條件:流速為0.5mL/min,柱溫為20℃,檢測器:Agilent1100HPLC systems,Ex320nm,Em420nm,進樣量為5μL,記錄時間為42min,洗脫方式為梯度洗脫;
所述的梯度洗脫為:0,5min,25min,30min,35min,42min;相應的B相的體積變化為:0%,8%,20%,40%,100%,0%;
步驟(4)中所述的進行酶失活處理的條件優選為100℃處理3min;
步驟(4)中所述的離心的條件優選為12000g離心5min;
步驟(4)中所述的酶解的反應體系優選為30μL(50mM pH6.0的乙酸鈉水溶液,9U木聚糖內切酶或0.01U木聚糖外切酶),10μL上清液,共40μL;37℃反應6h;反應產物用5μL0.1M乙酸鈉水溶液處理后過0.22μm濾膜,得到酶解產物;其中,木聚糖內切酶(endo-β-xylanase)具有內切β-1,4-糖苷鍵的功能, 木聚糖外切酶(exo-β-xylosidase)具有外切β-1,4-糖苷鍵的功能的;
步驟(5)中所述的純化的步驟優選為:Sep-Pak C18Plus short cartridge(Sep-Pak C18固相萃取小柱)用60%乙腈(v/v)(含0.1%甲酸,v/v)洗過后,用10mL1%(v/v)甲酸活化小柱,100μL加成產物和等量的水混合上柱,最后用2mL60%(v/v)乙腈(含0.1%甲酸,v/v)洗脫低聚木糖,得到純化的加成產物;純化的加成產物用氮氣吹干后溶解于20μL水,取1μL和等量的MALDI基質(0.2M2,5-二羥基苯甲酸,0.06M1-羥基異喹啉,50%(v/v)乙腈)混合,在樣品板上干燥,進行MALDI-TOF-MS分析。
本發明的機理是:半纖維素是自然界僅次于纖維素的植物多糖,而禾本科單子葉和雙子葉植物半纖維素主要是木聚糖。木聚糖的主鏈合成主要有β-1,4-木糖轉移酶(或者可以定義為木聚糖合酶)完成。我們首先通過在低聚木糖的還原末端標記熒光基團,再通過提取微囊體,利用微囊體中的β-1,4-木糖轉移酶活性催化低聚木糖的加成反應,最后經過高效液相色譜檢測產物的組成譜,根據產物的組成譜與標準樣品譜的比對推測反應產物,以反應產物體現木聚糖合酶活性。
本發明相對于現有技術,具有如下的優點及效果:
(1)將熒光基團2-氨基苯甲酸(Anthranilic Acid,AA)連接到低聚木糖(Xyln)上,以得到含熒光集團的Xyln-AA作為木糖加成反應的底物,通過熒光檢測器(Ex320nm,Em420nm)可區分加成反應產物的組分,以此來反映XylT活性。為闡明木聚糖合成的機理,建立了一種準確快速的測定方法。
(2)XylT是木聚糖合成時的關鍵酶,建立測定XylT活性的方法對于研究木聚糖合成的機理有很大意義,利用多重轉基因與生物化學等分析,可以幫助我們分析涉及XylT活性的關鍵基因,這有利于我們進一步了解半纖維素木聚糖的合成,也為將來體外合成低聚木糖打下基礎;
(3)本發明采用的高效液相色譜(HPLC)法,操作簡單,能夠準確快速方便的檢測到木聚糖的加成反應;提供了一整套從提取微囊體到檢測提取到的微囊體中XylT活性的方法,具有準確性、靈敏度高及重現性好等特點。
(4)本發明通過提取植物微囊體,利用微囊體中存在的木糖轉移酶XylT,進行Xyln-AA與UDP-Xyl的加成反應,然后利用HPLC進行加成產物的檢測,探討XylT在植物中的活性。本發明為深入研究木聚糖合成機理和調節半纖維素中木聚糖成分提供了一種可靠的途徑,可根據我們實驗的需要,通過篩選木聚糖合成缺陷型植株,研究調節木聚糖形成的基因,或通過調節影響XylT合成的 關鍵基因,如IRX9,IRX10,IRX14等,來滿足對植物中半纖維素不同含量的需求。目前國內還沒有同類技術的報道,國外最近才有極少數類似報道但只應用于模式植物擬南芥,本發明經驗證可應用于木本植物和草本植物,并且實驗中的主要技術與之不同。
附圖說明
圖1為標準樣品經HPLC檢測圖。
圖2為黃梁木上、中、下三個部位微囊體XylT加成產物經HPLC檢測圖。
圖3為黃梁木下部微囊體不同反應時間XylT加成產物經HPLC檢測圖。
圖4為黃梁木下部微囊體不同受體XylT加成產物經HPLC檢測圖。
圖5為黃梁木微囊體加成反應產物酶解產物經HPLC檢測圖。
圖6為黃梁木微囊體加成反應產物的MALDI-TOF-MS檢測圖。
圖7為蘆筍微囊體不同反應時間XylT加成產物經HPLC檢測圖。
圖8為蘆筍微囊體不同受體XylT加成產物經HPLC檢測圖。
圖9為蘆筍微囊體加成反應產物酶解產物經HPLC檢測圖。
圖10為蘆筍微囊體加成反應產物的MALDI-TOF-MS檢測圖。
圖11為木聚糖/低聚木糖逐級加成反應示意圖。
具體實施方式
下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述,但本發明的實施方式不限于此。
所述技術領域的普通實驗人員依據以上本發明公開的內容和各參數所取范圍,均可實現本發明的目的。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規條件。
實施例1含熒光基團的低聚木糖(Xyln-AA)的標記
①配制衍生反應試劑:30mg/mL熒光基團2-氨基苯甲酸(Anthranilic Acid,AA)和20mg/mL氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)溶解在MABS中,得到衍生反
應試劑;其中,MABS(甲醇Methanol,醋酸Acetate,硼酸Borate混合溶液)
為:24mg/mL醋酸鈉和20mg/mL硼酸溶解在甲醇溶液中,MABS要現配現用;
②標記反應:將低聚木糖(Xyln,n為1~6)(購自美國佐治亞大學碳水化合物研究中心,http://www.ccrc.uga.edu/services/index.php)與步驟①中得到的衍 生反應試劑按照質量體積比1mg:1mL混合,在80℃反應80min,過量的衍生試劑通過加入乙醚(diethyl ether,分析純)混合后萃取三次去除上層溶液,底層為AA標記的低聚木糖,再通過Sep-Pak C18萃取萃取小柱純化,得到將低聚木糖(Xyln,n為1~6)的還原末端標記熒光基團2-氨基苯甲酸(Anthranilic Acid,AA)成含熒光基團的特異性好且穩定的低聚木糖(Xyln-AA,n為1~6),可以通過高效液相色譜(HPLC)中紫外檢測。
所述的純化通過如下步驟進行:Sep-Pak C18Plus short cartridge(Sep-Pak C18固相萃取小柱)用60%乙腈(v/v)(含0.1%甲酸,v/v)洗過后,用10mL1%(v/v)甲酸活化小柱,100μL反應產物和等量的水混合上柱,再用10mL1%(v/v)甲酸洗柱,最后用2mL60%(v/v)乙腈(含0.1%甲酸,v/v)洗脫低聚木糖,得到純化的產物;純化的產物用氮氣吹干去除有機物后,溶解于20~100μL水備用。
實施例2建立HPLC檢測Xyln-AA的方法
(1)配制Xyl1-AA~Xyl6-AA的單個標準樣品和混合標準樣品,每個組分終濃度皆為0.1mM。
(2)用HPLC測定每個標準樣品和混合標準樣品的出峰時間。色譜條件為:色譜柱ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(2.1mm×250mm,1.8μm)(Agilent,購自安捷倫科技有限公司),流動相:A相為50mM乙酸鈉水溶液(pH4.3),B相為色譜純乙腈(Honeywell,霍尼韋爾,99.99%純,購自上海鼎國生物技術有限公司),流速:0.5mL/min,柱溫:20℃,檢測器:Agilent1100HPLC systems(購自安捷倫科技有限公司),Ex320nm,Em420nm,進樣量5μL,記錄時間:42min。梯度洗脫程序為:0~5min(8%B相),5~25min(20%B相),25~30min(40%B相),30~35min(100%B相),35~42min(0%B相)(按體積百分比),后運行5min。具體見下表1,結果如圖1。
表1梯度洗脫程序

實施例3黃梁木XylT活性分析
1、黃梁木微囊體提取
取一年生黃梁木(Neolamarckia cadamba(Rubiaceae)(采于廣州市天河公園內)上中下三個部位的去皮莖段,分別于提取液(100mM pH6.8的Hepes-KOHbuffer,1mM DTT,1mM EDTA,0.1mM MnCl2,0.4M蔗糖;其中,100mM pH6.8的Hepes-KOH buffer是將23.831g4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶解在去離子水中,定容至1L,用KOH調節100mM Hepes溶液的pH至6.8。)在4℃高速組織搗碎機(型號DS-1,購自上海標本模型廠)中勻漿(植物與提取液的重量體積比為2g:1mL),用濾布(cat.475855,Miracloth,Calbiochem公司)進行過濾,得到的濾液在10000g,4℃下離心10min,收集上清液,將上清液進一步在100000g,4℃下離心1h,得到的沉淀為細胞的膜結構,加入含有蛋白酶抑制劑(終濃度為1×cocktail,Roch公司,Pancreas extract胰浸膏0.015~0.03mg/mL,Pronase鏈酶蛋白酶0.0015~0.003mg/mL,Thermolysin嗜熱菌蛋白酶0.0008mg/mL,Chymotrysin胰凝乳蛋白酶0.0015mg/mL,Trypsin胰蛋白酶0.0002
mg/mL,Papain木瓜蛋白酶1.0mg/mL)的提取液懸浮沉淀(植物與含有蛋白酶抑制劑的提取液的重量體積比為1g:20μL),得到微囊體。利用BCA法測定得到的微囊體蛋白濃度。-80℃保存。
蛋白質定量試劑盒(BCA法),購自Pierce公司;具體操作步驟按照說明書進行。
2、黃梁木微囊體XylT活性的檢測
以下加成反應皆在如下體系中進行:90μL(50mM pH6.8的Hepes-KOHbuffer,5mM MnCl2,1mM DTT,0.5%(v/v)Triton X-100,0.1mM UDP-Xyl,0.5μM Xyln-AA,4μg/μL微囊體),反應溫度為20℃。反應完成以后產物通過0.22μm濾膜過濾,取5μL在HPLC上檢測加成產物,檢測方法如實施例2所述。木聚糖/低聚木糖逐級加成反應如圖11所示。
加成反應(1):不同部位的微囊體XylT活性檢測,配制分別含有上、中、下三個部位微囊體的反應體系,以Xyl5-AA為受體,反應時間為6h,結果如圖2所示。
加成反應(2):下部微囊體以Xyl5-AA為受體,不同加成反應時間的活性檢測,反應時間分別為0.5h,3h,6h,9h,結果如圖3。
加成反應(3):下部微囊體以不同聚合度的低聚木糖(Xyl1-AA,Xyl2-AA, Xyl3-AA,Xyl4-AA,Xyl5-AA,Xyl6-AA)為底物,反應6h的活性檢測,結果如圖4。
3、加成產物驗證
對步驟2中加成反應(2)的6h加成產物進行酶解分析。對步驟2中加成反應(2)的6h得到的加成產物進行100℃酶失活處理3min,然后12000g離心5min,棄沉淀,取上清液,進行酶解。酶解的反應體系為:30μL(50mM pH6.0的乙酸鈉水溶液,9U木聚糖內切酶或0.01U木聚糖外切酶),10μL上清液,共40μL;37℃,6h。反應產物用0.1M乙酸鈉水溶液(5μL)處理后過0.22μm濾膜,得到酶解產物,HPLC分析酶解產物,結果如圖5。
對步驟2中加成反應(2)的6h加成產物進行MALDI-TOF-MS分析。加成產物純化Sep-Pak C18Plus short cartridge(Sep-Pak C18固相萃取小柱)(Waters公司)用60%(v/v)乙腈(含0.1%甲酸,v/v)洗過后,用10mL1%(v/v)甲酸活化小柱,100μL加成產物和等量的水混合上柱,最后用2mL60%(v/v)乙腈(含0.1%甲酸,v/v)洗脫低聚木糖,得到純化的加成產物。純化的加成產物用氮氣吹干去除有機物后,溶解于20μL水,取1μL和等量的MALDI基質(0.2M2,5-二羥基苯甲酸,0.06M1-羥基異喹啉,50%(v/v)乙腈)混合,在樣品板上干燥,進行MALDI-TOF-MS分析,結果如圖6。
實施例4蘆筍XylT活性分析
蘆筍(Asparagus officinalis L.)(蘆筍,市售)XylT活性分析過程與黃梁木類似。也分為微囊體的提取,XylT活性檢測,加成產物驗證三個步驟。提取的蘆筍微囊體以Xyl4-AA為受體,反應時間分別為0.5h,2h,6h,10h,加成反應結果見圖7。提取的蘆筍微囊體以不同聚合度的低聚木糖(Xyl1-AA,Xyl2-AA,Xyl3-AA,Xyl4-AA,Xyl5-AA,Xyl6-AA)為受體,反應時間為1h,加成反應結果見圖8。對以Xyl4-AA為受體,反應時間6h的加成產物進行酶解分析,結果見圖9。對以Xyl4-AA為受體,反應時間6h的加成產物進行MALDI-TOF-MS分析,結果見圖10。
上述實施例為本發明較佳的實施方式,但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制,其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化,均應為等效的置換方式,都包含在本發明的保護范圍之內。

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