鬼佬大哥大
  • / 10
  • 下載費用:30 金幣  

SAMSN1蛋白在制備膠質母細胞瘤預后評估試劑或試劑盒中的應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201410140083.4

申請日:

2014.04.09

公開號:

CN103954768A

公開日:

2014.07.30

當前法律狀態:

駁回

有效性:

無權

法律詳情: 發明專利申請公布后的駁回IPC(主分類):G01N 33/68申請公布日:20140730|||實質審查的生效IPC(主分類):G01N 33/68申請日:20140409|||公開
IPC分類號: G01N33/68 主分類號: G01N33/68
申請人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
發明人: 嚴勇; 陳菊祥; 盧亦成; 徐濤; 王洪祥; 秦榮
地址: 200433 上海市楊浦區翔殷路800號
優先權:
專利代理機構: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268 代理人: 趙青
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201410140083.4

授權公告號:

||||||

法律狀態公告日:

2016.12.14|||2014.08.27|||2014.07.30

法律狀態類型:

發明專利申請公布后的駁回|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及生物技術領域,本發明提供了SAMSN1蛋白的新的用途,特別是SAMSN1蛋白在制備膠質母細胞瘤預后評估試劑或試劑盒中的應用。本發明采用免疫組化方法檢測SAMSN1蛋白在膠質母細胞瘤組織中的相對表達量,能夠判斷膠質母細胞瘤患者的生存預后。基于SAMSN1蛋白的相對表達量與膠質母細胞瘤的這種相關性,以該蛋白作為分子標記對其表達量進行檢測可以用于指導膠質母細胞瘤的預后判斷。

權利要求書

權利要求書
1.  SAMSN1蛋白在制備膠質母細胞瘤預后評估試劑或試劑盒中的應用。

2.  根據權利要求1所述的SAMSN1蛋白在制備膠質母細胞瘤預后評估試劑或試劑盒中的應用,其特征在于,該應用是以常規方法制備SAMSN1蛋白的抗體,建立檢測SAMSN1蛋白的定量方法及配套的試劑或試劑盒。

3.  根據權利要求2所述的SAMSN1蛋白在制備膠質母細胞瘤預后評估試劑或試劑盒中的應用,其特征在于,所述的SAMSN1蛋白的抗體,是單克隆抗體或多克隆抗體。

4.  根據權利要求2所述的SAMSN1蛋白在制備膠質母細胞瘤預后評估試劑或試劑盒中的應用,其特征在于,該應用是指將SAMSN1蛋白作為分子標記,利用SAMSN1單克隆抗體或多克隆抗體,以及免疫組化實驗試劑,分析SAMSN1蛋白在膠質母細胞瘤組織中的相對表達量。

5.  根據權利要求2至4任一所述的SAMSN1蛋白在制備膠質母細胞瘤預后評估試劑或試劑盒中的應用,其特征在于,所述的配套的試劑或免疫組化實驗試劑包括:二甲苯,乙醇,3%H2O2甲醇液,1%BSA封閉液,DAB顯色試劑,蘇木素和辣根過氧化物酶。

6.  根據權利要求2至4任一所述的SAMSN1蛋白在制備膠質母細胞瘤預后評估試劑或試劑盒中的應用,其特征在于,該應用是利用該試劑或試劑盒,體外檢測SAMSN1蛋白在膠質母細胞瘤組織中的表達量的方法,該方法包括以下步驟:
(a)利用本試劑盒中的免疫組化實驗試劑標記羊抗兔IgG將膠質母細胞瘤組織切片進行免疫組化染色;
(b)光鏡下觀察膠質母細細胞瘤組織染色情況,對腫瘤細胞胞漿中SAMSN1抗體染色情況進行積分;
(c)根據評分判斷SAMSN1在膠質母細胞瘤中高表達或低表達。

說明書

說明書SAMSN1蛋白在制備膠質母細胞瘤預后評估試劑或試劑盒中的應用
技術領域
本發明屬于生物技術領域,涉及一種SAMSN1蛋白的新的用途,具體地說,涉及SAMSN1蛋白在制備膠質母細胞瘤預后評估試劑或試劑盒中的應用。
背景技術
腦膠質瘤是中樞神經系統最為常見的原發腫瘤,膠質母細胞瘤(Gliobalstoma multiforme,GBM)是其中最多見且惡性程度最高的類型。目前,經典的病理形態學方法仍是膠質母細胞瘤診斷、分類的主要方法,存在諸多不足。比如,同樣診斷為GBM的病例中,雖然多數患者生存期為1年左右,但也有一些患者生存期可達3年以上。在接受的治療方案大致相同的前提下,膠質母細胞瘤患者預后的差異性提示該腫瘤在遺傳學背景和病理機制可能存在若干亞型,但目前尚缺少有效的指標來區分GBM亞型和準確判斷預后。
本領域迫切需要尋找能區分膠質母細胞瘤分子亞型及準確判斷預后的相關基因和/或蛋白,這方面的研究對臨床治療膠質母細胞瘤及預防腫瘤復發具有重要意義。
SAMSN1蛋白(SAM結構域、SH3結構域和核定位信號1,GeneID:64092)的功能目前仍不十分清楚,推測具有接頭蛋白功能,可與其他分子結合,在信號傳導級聯反應中發揮作用,并可能參與介導相關分子的細胞核內定位。有研究顯示,SAMSN1參與免疫細胞的活化和分化過程;在正常的腦組織中,SAMSN1存在一定量的低水平表達;與髓系白血病、多發性骨髓瘤的病理機制相關;但在實體腫瘤中SAMSN1的作用尚不明確。(參見文獻:von HM,Gohla A,Janssen KP,Iritani BM,Beer-Hammer S.Immunoinhibitory adapter protein Src homology domain3lymphocyte protein2(SLy2)regulates actin dynamics and B cell spreading.J Biol Chem.2011.286(15):13489-501.;Claudio JO,Zhu YX,Benn SJ,et al.HACS1encodes a novel SH3-SAM adaptor protein differentially expressed in normal and malignant hematopoietic cells.Oncogene.2001.20(38):5373-7.)
迄今為止,膠質母細胞瘤的發生的分子機制仍不清楚,有效的診斷、分型、治療和預后判斷靶點也十分有限。
目前尚無文獻報道SAMSN1與膠質母細胞瘤病理機制或預后判定相關。
發明內容
本發明的目的在于提供SAMSN1蛋白的新的用途,特別是SAMSN1蛋白在制備膠質母細胞瘤預后評估試劑或試劑盒中的應用。
本發明人經過廣泛而深入的研究,首次發現,采用免疫組化方法檢測SAMSN1蛋白在膠質母細胞瘤組織中的相對表達量,能夠判斷膠質母細胞瘤患者的生存預后。基于SAMSN1蛋白的相對表達量與膠質母細胞瘤的這種相關性,以該蛋白作為分子標記對其表達量進行檢測可以用于指導膠質母細胞瘤的預后判斷。
本發明提供了SAMSN1蛋白在制備膠質母細胞瘤預后評估試劑或試劑盒中的應用。
所述的應用,是以常規方法制備SAMSN1蛋白的抗體,建立檢測SAMSN1蛋白的定量方法及配套的試劑或試劑盒。
所述的SAMSN1蛋白的抗體,是單克隆抗體或多克隆抗體。
所述的應用,是指將SAMSN1蛋白作為分子標記,利用SAMSN1單克隆抗體或多克隆抗體,以及免疫組化實驗試劑,分析SAMSN1蛋白在膠質母細胞瘤組織中的相對表達量。
利用特異性抗SAMSN1蛋白的抗體,包括單克隆抗體和多克隆抗體,用于制備確定膠質母細胞瘤手術預后的制劑或試劑盒,這對于本領域技術人員來說是顯而易見的。
所述的SAMSN1多克隆抗體為商品化抗體,制備方法參見文獻Yokoyama,W.M.,Christensen,M.,Santos,G.D.and Miller,D.2006.Production of Monoclonal Antibodies.Current Protocols in Immunology.74:2.5.1–2.5.25。
所述的應用,配套的試劑或試劑盒還包括免疫組化實驗試劑,即二甲苯,乙醇,3%H2O2甲醇液,1%BSA封閉液,DAB顯色試劑,蘇木素和辣根過氧化物酶。
進一步地,本發明還提供了利用上述配套的試劑或試劑盒,體外檢測SAMSN1蛋白在膠質母細胞瘤組織中的表達量的方法,該方法包括以下步驟:
(a)利用本試劑盒中的免疫組化實驗試劑(二甲苯,乙醇,3%H2O2甲醇液,1%BSA封閉液,DAB顯色試劑,蘇木素和辣根過氧化物酶)標記羊抗兔IgG將膠質母細胞瘤組織切片進行免疫組化染色;
(b)光鏡下觀察膠質母細細胞瘤組織染色情況,對腫瘤細胞胞漿中SAMSN1抗體染色情況進行積分;
(c)根據評分判斷SAMSN1在膠質母細胞瘤中高表達或低表達。
所述的該方法具體步驟如下:
(1)制備膠質母細胞瘤組織石蠟切片,60℃烤箱過夜;
(2)切片脫臘至水;
(二甲苯①10min→二甲苯②10min→二甲苯③10min→100%乙醇5min→95%乙醇5min→85%乙醇5min→75%乙醇5min→雙蒸水5min)
(3)3%H2O2甲醇液,室溫放置20min;
(4)雙蒸水洗5min×3;
(5)抗原修復:切片放入0.01M檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中煮沸5min,停火10min,再煮沸5min;
(6)自然冷卻至室溫,雙蒸水洗5min×3;
(7)1%BSA封閉30min,37℃;
(8)甩去血清封閉液,滴加一抗(山羊抗人SAMSN1多克隆抗體),37攝氏度持續一小時;
(9)4℃取出,室溫復溫15min,然后0.01M PBS洗5min×4;
(10)滴加二抗(Envision二抗試劑盒),根據二抗試劑盒說明書孵育。
(11)0.01M PBS洗5min×4,DAB顯色2-10min,鏡下觀察;
(12)雙蒸水終止顯色,蘇木素復染10秒;
(13)分化后自來水返藍,蒸餾水浸泡;
(14)脫水透明,蓋玻片覆蓋;
(15)顯微鏡下觀察陽性染色,每個標本隨機選擇5個高倍鏡視野,每個視野計數100個細胞,計算陽性細胞所在百分率。以細胞漿內出現黃色染色為陽性,按照染色的深淺,分為三個等級,其中淺黃色記為1分,棕 黃色記為2分,棕褐色記為3分;以細胞漿內出現黃色染色的細胞為陽性細胞,計算100個細胞中的陽性細胞的數量,分值評分標準:陽性細胞的比例≤10%記為0分,≤60%記為1分,≤90%記為2分,>90%記為3分。以染色積分乘以陽性率積分,即為該樣本點中SAMSN1在相應細胞組分中表達量的終積分。
(16)SAMSN1在胞漿內的積分≤5為低表達,>5為高表達。
本發明的SAMSN1蛋白與膠質母細胞瘤相關性的發現為預測膠質母細胞瘤復發風險以及患者術后的生存或死亡提供一條全新的途徑,對判斷膠質母細胞瘤患者預后具有重要作用,對于膠質母細胞瘤病人術后監控和序貫治療也具有重要的指導意義。當免疫組化評分高于5分時,膠質母細胞瘤易出現復發,患者術后生存期短、易死亡。
本發明利用免疫組化技術、系統評分測定膠質母細胞瘤腫瘤組織中SAMSN1蛋白的表達水平,并結合術后隨訪信息,確定SAMSN1蛋白表達水平與手術后膠質母細胞瘤患者預后存在相關性,SAMSN1蛋白能用于制備判斷膠質母細胞瘤患者預后的蛋白質分子標記,對于膠質母細胞瘤的分子分型、病人術后監控和序貫治療也具有重要的指導意義。
附圖說明
圖1為SAMSN1在膠質母細胞瘤組織(A)和正常腦組織(B)中的免疫組化染色結果圖;腫瘤組織中可見SAMSN1強陽性著色,正常腦組織弱著色。
圖2為SAMSN1在膠質母細胞瘤組織和正常腦組織中的表達結果圖;顯示SAMSN1在正常腦組織和膠質母細胞瘤組織中的表達積分值分別為1.69±1.30和5.86±3.02,兩者之間的差異具有顯著的統計學意義(p<0.01)。圖3為SAMSN1在膠質母細胞瘤組織中免疫組化染色結果圖;可見腫瘤細胞胞漿中SAMSN1呈廣泛的強陽性著色(積分>5),腫瘤組織中SAMSN1高表達。
圖4為SAMSN1在膠質母細胞瘤組織中免疫組化染色結果圖;可見腫瘤細胞胞漿中SAMSN1呈散在的陽性著色(積分<5),腫瘤組織中SAMSN1低表達。
圖5為SAMSN1表達對113例膠質母細胞瘤生存期的影響曲線圖;其中A 為SAMSN1高表達和低表達兩組患者之間總體生存期(OS)的差異;B為SAMSN1高表達和低表達兩組患者之間無進展生存期(PFS)的差異。
具體實施方式
下面結合本發明的附圖和實施例對本發明的實施作詳細說明,以下實施例是在以本發明技術方案為前提下進行實施,給出了詳細的實施方式和具體的操作過程,但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。
在以下實施例中,膠質母細胞瘤患者的腫瘤組織標本均來自上海長征醫院,由2名病理科醫生明確為膠質母細胞瘤。
實施例1:
隨機選取113例膠質母細胞瘤患者術后腫瘤組織和16例因手術需要切除的正常腦組織的石蠟切片(腫瘤組織切片均來自上海長征醫院,由2名病理科醫生確診為膠質母細胞瘤;正常腦組織來自腦外傷患者因病情需要行內減壓切除的腦組織,標本的獲取均通過第二軍醫大學倫理審批),本發明采用免疫組化方法檢測SAMSN1蛋白在膠質母細胞瘤組織和正常腦組織中的表達情況并評分,具體步驟為:
(1)制備膠質母細胞瘤組織石蠟切片,60℃烤箱過夜;
(2)切片脫臘至水;
(二甲苯①10min→二甲苯②10min→二甲苯③10min→100%乙醇5min→95%乙醇5min→85%乙醇5min→75%乙醇5min→雙蒸水5min)
(3)3%H2O2甲醇液,室溫放置20min;
(4)雙蒸水洗5min×3;
(5)抗原修復:切片放入0.01M檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中煮沸5min,停火10min,再煮沸5min;
(6)自然冷卻至室溫,雙蒸水洗5min×3;
(7)1%BSA封閉30min,37℃;
(8)甩去血清封閉液,滴加一抗(山羊抗人SAMSN1多克隆抗體,購自Abgent公司,型號AF1955a),37攝氏度持續一小時;
(9)4℃取出,室溫復溫15min,然后0.01M PBS洗5min×4;
(10)滴加二抗(Envision二抗試劑盒,購自丹麥DAKO公司,型號GK500705),根據二抗試劑盒說明書孵育。
(11)0.01M PBS洗5min×4,DAB顯色2-10min,鏡下觀察;
(12)雙蒸水終止顯色,蘇木素復染10秒;
(13)分化后自來水返藍,蒸餾水浸泡;
(14)脫水透明,蓋玻片覆蓋;
(15)顯微鏡下觀察陽性染色,每個標本隨機選擇5個高倍鏡視野,每個視野計數100個細胞,計算陽性細胞所在百分率。以細胞漿內出現黃色染色為陽性,按照染色的深淺,分為三個等級,其中淺黃色記為1分,棕黃色記為2分,棕褐色記為3分;以細胞漿內出現黃色染色的細胞為陽性細胞,計算100個細胞中的陽性細胞的數量,分值評分標準:陽性細胞的比例≤10%記為0分,≤60%記為1分,≤90%記為2分,>90%記為3分。以染色積分乘以陽性率積分,即為該樣本點中SAMSN1在相應細胞組分中表達量的終積分。
(16)如圖1所示,腫瘤細胞胞漿中可見SAMSN1呈廣泛的強陽性染色(圖1A),呈現顯著高表達。對照的正常腦組織弱著色(圖1B),經多組實驗驗證,如圖2所示,SAMSN1在膠質母細胞瘤組織和正常腦組織中的表達積分值分別為1.69±1.30和5.86±3.02,兩者之間的差異具有顯著的統計學意義(p<0.01)。
實施例2:
隨機取膠質母細胞瘤患者手術切除的腫瘤標本,制備膠質母細胞瘤患者腫瘤的組織切片,采用以上免疫組化方法的試驗步驟檢測SAMSN1蛋白在膠質母細胞瘤組織中的相對表達量,計算免疫組化評分。共檢測113例膠質母細胞瘤組織,發現SAMSN1在77例(68.14%)膠質母細胞瘤組織中的表達積分高于5分。依據SAMSN1表達高低(當免疫組化評分高于5分為高表達,低于5分為低表達)將膠質母細胞瘤患者分組,繪制總體生存曲線圖(圖5A)和無進展生存曲線圖(圖5B)。結果表明腫瘤中SAMSN1呈高表達的患者手術后總體生存時間和無進展生存時間均明顯短于低表達者。
實施例3:
樣本:某膠質母細胞癌患者腫瘤的組織切片,采用以上免疫組化方法 的試驗步驟檢測SAMSN1蛋白在膠質母細胞瘤組織中的相對表達量。膠質母細胞瘤組織的顯微圖片如圖3所示。經計算,該組織的免疫組化評分為9。
經術后隨訪知,該患者術后6個月腫瘤復發并死亡,生存期僅6個月。
實施例4:
樣本:某膠質母細胞瘤患者腫瘤的組織切片,采用以上免疫組化方法的試驗步驟檢測SAMSN1蛋白在膠質母細胞瘤組織中的相對表達量。膠質母細胞瘤組織的顯微圖片如圖4所示。經計算,該組織的免疫組化評分為0。
經術后隨訪知,該患者術后37個月仍健在,且無腫瘤復發。
由以上試驗結果可知,通過采用免疫組化的方法檢測SAMSN1蛋白分子相對表達量能預測膠質母細胞瘤患者術后的無進展生存時間和總體生存時間。當免疫組化評分高于5時,膠質母細胞瘤易出現復發,患者術后易死亡。顯然,SAMSN1蛋白與膠質母細胞瘤具有相關性,因此,以SAMSN1蛋白作為蛋白質分子標記對其表達量進行檢測能預測膠質母細胞瘤手術后復發等事件,并判斷預后。相應的,特異性抗SAMSN1蛋白的抗體,包括單克隆抗體和多克隆抗體,能用于制備確定膠質母細胞瘤手術預后的制劑或試劑盒,這對于本領域技術人員來說是顯而易見的。
以上已對本發明創造的較佳實施例進行了具體說明,但本發明創造并不限于所述實施例,熟悉本領域的技術人員在不違背本發明創造精神的前提下還可作出種種的等同的變型或替換,這些等同的變型或替換均包含在本申請權利要求所限定的范圍內。

關 鍵 詞:
SAMSN1 蛋白 制備 膠質 細胞 預后 評估 試劑 試劑盒 中的 應用
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
關于本文
本文標題:SAMSN1蛋白在制備膠質母細胞瘤預后評估試劑或試劑盒中的應用.pdf
鏈接地址:http://www.wwszu.club/p-6140762.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
鬼佬大哥大