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采用細胞電極電化學檢測細胞增殖活性的方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201410137557.X

申請日:

2014.04.08

公開號:

CN103954663A

公開日:

2014.07.30

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):G01N 27/30申請日:20140408|||公開
IPC分類號: G01N27/30; G01N27/26 主分類號: G01N27/30
申請人: 同濟大學
發明人: 曹同成; 尹蓉; 趙國華; 顧靚
地址: 200092 上海市楊浦區四平路1239號
優先權:
專利代理機構: 上海正旦專利代理有限公司 31200 代理人: 張磊
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410137557.X

授權公告號:

||||||

法律狀態公告日:

2016.08.31|||2014.08.27|||2014.07.30

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及一種采用細胞電極電化學檢測細胞增殖活性的方法,利用雙酚A對人乳腺癌細胞(MCF-7)的作用作為細胞增殖活性的研究模型;先將多壁碳納米管滴涂在玻碳電極上固定粘纖蛋白RGDSK,隨后將細胞固定在修飾電極的表面,然后以此細胞電極為工作電極,鉑電極為輔助電極,飽和甘汞電極為參比電極,基于差分脈沖伏安法的電化學方法,檢測MCF-7細胞的增殖情況,并且根據電流與污染物的作用濃度和作用時間的繪制出線性關系曲線。與現有傳統檢測細胞增殖活性的MTT技術相比,細胞電極與傳統方法的檢測結果基本一致,同時可以避免傳統檢測過程中化學試劑對檢測人員的傷害,操作也較傳統方法快速易與操作,并且檢測結果具有良好的重現性和較高的靈敏度,為檢測污染物的細胞毒性提供了一個新平臺,具有重要的實際應用意義。

權利要求書

權利要求書
1.  一種采用細胞電極電化學檢測細胞增殖活性的方法,其特征在于具體步驟如下:
(1) MCF-7細胞的培養
用標準培養基培養細胞,5%CO2,37°C 的CO2細胞培養箱中孵育細胞,每天換液一次;細胞呈單層生長到68-72%即進行細胞傳代;去除培養瓶內的培養殘液,加入0.04%EDTA,漱洗后吸出,再加入100~200uL 0.25%胰酶(覆蓋整個瓶底),37℃孵育3-5分鐘;電鏡下觀察細胞形態變化,待細胞變圓,折光增強,用含血清培養液中止消化,反復吹打瓶壁,制成細胞懸液,移入離心管,1500rpm,室溫離心5分鐘后,去上清,用新鮮培養液懸浮沉淀;
(2) 采用BPA對MCF-7細胞的作用作為研究模型,制備MCF-7細胞電極
將玻碳電極分別用1.0,0.3,0.05微米的三氧化二鋁粉末研磨光滑,分別在體積比為濃HNO3和H2SO4以及乙醇溶液中超聲,清洗干凈的玻碳電極表面滴涂先前制備的多壁碳納米管,紅外燈下干燥后,在制備好的玻碳電極表面滴涂多肽RGDSK,將玻碳電極在37 ℃ 下恒溫培養3小時取出備用,4 ℃ 保存;隨后,將培養好的 MCF-7 細胞滴涂在玻碳電極表面,37 ℃ 恒溫培養 2小時后取出,得到MCF-7細胞電極,立即進行電化學掃描;MCF-7細胞電極用于檢測不同時間和劑量BPA作用于MCF-7細胞后,觀察細胞增殖活性的變化;
(3)基于差分脈沖伏安法的電化學方法,檢測MCF-細胞增殖情況
利用電化學工作站中三電極體系,步驟(2)制備得到的MCF-7細胞電極為工作電極、鉑片為對電極、飽和甘汞電極為參比電極進行電化學檢測,電解質為含有5mM的K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的10Mm/L的PBS溶液,利用循環伏安法和差分脈沖伏安法對裸玻碳電極和修飾后的MCF-7細胞電極做了基本的電化學表征;根據電流與污染物作用濃度和作用時間的繪制出線性關系曲線,檢測MCF-7細胞的增殖情況。

說明書

說明書采用細胞電極電化學檢測細胞增殖活性的方法
技術領域
本發明涉及屬于生物化學、電化學分析與環境監測技術領域,尤其是涉及一種采用細胞電極電化學檢測細胞增殖活性的方法。 
背景技術
在過去的40年里,大量的證據表明環境化學品如殺蟲劑和工業化學物質,已經在野生動物和人類體內起到了類激素作用。環境激素大多數為有機污染物,我們使用的農藥,如2,4-二氯苯氧乙酸、甲氧滴滴涕等有機氯農藥等。這類物質可對人體和動物體內正常的激素功能施加影響,抑制內分泌系統,使內分泌系統失調,導致各種生物生殖功能下降,進而阻礙生殖、發育等機能;有些作用于生命體的最基本單元——細胞,影響細胞的生長和代謝作用,破壞細胞正常的分裂增殖過程甚至有引發惡性腫瘤與生物絕種的危害。 
細胞的增殖過程在生物的生命中扮演著重要的作用。如果細胞增殖發生紊亂,細胞則發生癌變。在生命科學中,細胞增殖的過程采用體外培養的腫瘤細胞作為模型,在培養過程中給予一定濃度的藥物或者加入外源光照等,考察細胞質增殖活性的變化。檢測細胞增殖的方法主要包括細胞計數法、盼臺蘭染色法、以及MTT等方法。其中MTT方法是一種最易實現也是最常見的檢測細胞增殖活性的方法,它是根據測得的吸光度值(OD值)來判斷活細胞數量,OD值越大,細胞增殖活性越強。但是MTT實驗過程中,有機溶劑(例如DMSO)會對實驗人員造成一定損傷;且實驗操作中人為操作過程具有不確定性,容易對實驗結果造成影響,使得這種方法存在一定的局限性。 
電化學方法具有操作簡單、快速,成本低,可以在線監測,環境友好等特點。BPA(雙酚A)是一種典型的類雌激素性質的物質,對MCF-7細胞增殖具有促進作用。這一典型的現象能夠為我們提供一個模型體系,從而考察我們制備的電化學(細胞電極)方法相比MTT方法在檢測細胞增殖活性方面的優越性。最終,基于差分脈沖伏安法(DPV)的電化學方法,檢測了MCF-7細胞增殖的情況,與MTT實驗結果十分吻合。本文提出了一種新穎檢測細胞增殖活性的方法,為檢測污染物的細胞毒性提供了一個新平臺,具有重要的實際應用意義。 
發明內容
本發明的目的在于提供一種采用細胞電極電化學檢測細胞增殖活性的方法,本發明利用電化學方法中的差分脈沖伏安法(DPV),快速靈敏檢測MCF-7細胞增殖的情況,這與傳統的檢測細胞增殖活性的MTT實驗結果十分吻合,同時避免了傳統方法對實驗人員的毒性以及檢測的不確定性。這種新穎的檢測細胞增殖活性方法,具有檢測范圍寬,靈敏度高,重復性能好等優點,為檢測污染物的細胞毒性提供了一個新平臺,具有重要的實際應用意義。 
本發明提出的采用細胞電極電化學檢測細胞增殖活性的方法,具體步驟如下: 
(1) MCF-7細胞的培養
用標準培養基培養細胞,CO2細胞培養箱(5%CO2,37°C)孵育細胞,每天換液一次。細胞呈單層生長到70%左右即進行細胞傳代。去除培養瓶內的培養殘液,加入0.04%EDTA,漱洗后吸出,再加入100~200uL 0.25%胰酶(覆蓋整個瓶底),37℃孵育3-5分鐘。電鏡下觀察細胞形態變化,待細胞變圓,折光增強,用含血清培養液中止消化,反復吹打瓶壁,制成細胞懸液,移入離心管,1500rpm,室溫離心5分鐘后,去上清,用新鮮培養液懸浮沉淀;
(2) 采用BPA對MCF-7細胞的作用作為研究模型,制備MCF-7細胞電極
將玻碳電極分別用1.0,0.3,0.05微米的三氧化二鋁粉末研磨光滑,分別在濃HNO3:H2SO4(1:1)和乙醇溶液中超聲,清洗干凈的玻碳電極表面滴涂先前制備的多壁碳納米管,紅外燈下干燥后,在制備好的玻碳電極表面滴涂多肽RGDSK,將電極在37 ℃ 下恒溫培養3小時取出備用,4 ℃ 保存;隨后,將培養好的 MCF-7 細胞滴涂在玻碳電極表面,37 ℃ 恒溫培養 2小時后取出,得到MCF-7細胞電極,立即進行電化學掃描;MCF-7細胞電極用于檢測不同時間和劑量BPA作用于MCF-7細胞后,觀察細胞增殖活性的變化;
(3)基于差分脈沖伏安法的電化學方法,檢測MCF-細胞增殖情況
利用電化學工作站中三電極體系,步驟(2)制備得到的MCF-7細胞電極為工作電極、鉑片為對電極、飽和甘汞電極為參比電極進行電化學檢測,電解質為含有5mM的K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的10Mm/L的PBS溶液,溶液PH值為7.4,利用循環伏安法(CV)和差分脈沖伏安法(DPV)對裸玻碳電極和修飾后的MCF-7細胞電極做了基本的電化學表征。根據電流與標準溶液濃度的線性關系繪制工作曲線,檢測MCF-7細胞的增殖情況。
電極的組裝與表征 
1984年確定肽鏈RGD為纖粘連蛋白(fibronectin, FN)與其受體的特異性結合位點,具有粘結劑的作用。生物公司合成了環肽RGDSK用于細胞和基底的粘合劑,使用電阻率低、導電性能穩定的玻碳電極(GCE)作為基底電極。因此,選擇具有雌激素受體(ER)的人卵巢上皮癌細胞(MCF-7, -ER)進行體外實驗;制備合成細胞電極,電極的電鏡表征圖如圖2所示,利用快速靈敏的電化學方法進行細胞毒性的檢測,并與傳統的生物方法比較,取得了理想的結果。較傳統的MTT方法,電化學方法更加便捷和安全。
與現有技術相比,本發明具有以下的優點: 
(1)電化學方法和MTT方法的結果在很寬的范圍內都是一致的,證明了我們引入的電化學方法的準確性。
(2)電化學方法具有信號穩定,靈敏度高,對檢測人員身體無危害等特點,并且檢測結果準確,這樣避免了傳統方法的缺陷。 
(3)在檢測過程中,采用了多壁碳納米管放大電信號,粘纖蛋白RGDFK很好的將細胞與電極表面附著,提出了一種新穎的細胞電極和細胞毒性的檢測方法。 
(4)本發明的電化學檢測方法實現了對細胞毒性的檢測,采用的儀器廉價便攜,方法簡單易行,并具有較高的靈敏度,且與傳統生物方法結果一致,是電化學方法在生物領域的拓展和應用。 
附圖說明
圖1為采用分子印跡功能化的修飾電極的光電化學分析裝置的結構示意圖。 
圖2為MCF-7細胞組裝在修飾電極前后的電鏡圖。 
圖3實施例1電化學方法檢測不同時間BPA作用MCF-7細胞增殖活性及與MTT方法比較。 
圖4實施例1電化學方法檢測不同濃度BPA作用MCF-7細胞增殖活性及與MTT方法比較。 
圖5實施例2電化學方法檢測不同時間BPA作用MCF-7細胞增殖活性及與MTT方法比較。
圖6實施例2電化學方法檢測不同濃度BPA作用MCF-7細胞增殖活性及與MTT方法比較。
具體實施方式
下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。 
實施例1 
本1984年確定肽鏈RGD為纖粘連蛋白(fibronectin, FN)與其受體的特異性結合位點,具有粘結劑的作用。生物公司合成了環肽RGDSK用于細胞和基底的粘合劑,使用電阻率低、導電性能穩定的玻碳電極(GCE)作為基底電極。因此,選擇具有雌激素受體(ER)的人卵巢上皮癌細胞(MCF-7, -ER)進行體外實驗;制備合成細胞電極,電極的電鏡表征圖如圖2所示,利用快速靈敏的電化學方法進行細胞毒性的檢測,并根據細胞毒性檢測實驗的要求,設定BPA濃度效應為1000 nM、100 nM、10 nM、1 nM、0.1 nM的遞減濃度,孵育24 h,BPA對MCF-7細胞的作用效果如示意圖3所示。可以發現,隨著BPA作用濃度的不斷遞增,細胞不斷增殖,可見BPA的加入促進了細胞的增殖。且在相同的作用濃度下,進行MTT實驗,利用MTT和電化學方法所對應的增值率基本一致。示意圖4。
實施例2 
以環肽RGDSK用于細胞和基底的粘合劑,使用電阻率低、導電性能穩定的玻碳電極(GCE)作為基底電極。因此,選擇具有雌激素受體(ER)的人卵巢上皮癌細胞(MCF-7, -ER)進行體外實驗;制備合成細胞電極。實驗中,我們根據檢測細胞增殖活性的一般方法,設定檢測濃度和時間,我們可以發現,首先,BPA確實是促進了MCF-7細胞的增殖,這與文獻的報道是一致的;其次,電化學方法和MTT方法的結果在很寬的范圍內都是一致的,證明了我們引入的電化學方法的準確性。時間效應為48 h、24 h、12 h、8 h、4 h,采用1000 nM的BPA濃度,BPA對MCF-7細胞的作用效果如圖5所示。可以發現,隨著BPA作用時間的不斷遞增,細胞不斷增殖,可見BPA的加入促進了細胞的增殖。且不同的時間點,利用MTT和電化學方法所對應的增值率基本一致。示意圖6。
實施例3 
此外,我們還在其他細胞和不同環境雌激素作用的MCF-7細胞中推廣使用了這種檢測方法,我們選擇了HEK293細胞中分別加入環境污染物BPA、BDE,利用我們的細胞電極進行檢測。因為HEK293細胞對環境污染物BDE本身的響應就大于對BPA的響應,且其他實驗和文獻都發現,上述兩種污染物是抑制HEK293細胞增殖的,這與細胞電極的檢測結果是一致的。可見我們的細胞電極是可以得到通用的,但是檢測的結果不是很準確,而且與加入BPA的MCF-7細胞比較發現,其靈敏度較低,這表明我們開發的電化學方法對MCF-7細胞的專一性更強。當然,一些本身就具有電化學活性的細胞對此實驗方法并不適用,特此說明。
細胞電極采用以下步驟制作:以制備的細胞電極為工作電極,Pt電極為輔助電極,飽和甘汞電極為參比電極,在三電極體系中,將玻碳電極分別用1.0,0.3,0.05微米的三氧化二鋁粉末研磨光滑,分別在濃HNO3:H2SO4(1:1)和乙醇溶液中超聲,清洗干凈的電極表面滴涂先前制備的多壁碳納米管,紅外燈下干燥后,在制備好的電極表面滴涂多肽RGDSK,將電極在37 ℃ 下恒溫培養3小時取出備用,4 ℃ 保存。隨后,將培養好的 MCF-7 細胞滴涂在電極表面,37 ℃ 恒溫培養 2小時后取出,立即進行電化學掃描。細胞電極用于檢測不同時間和劑量BPA作用于MCF-7后,細胞增殖活性的變化。 
利用電化學工作站中三電極體系,制備的細胞電極為工作電極、鉑片為對電極、飽和甘汞電極為參比電極進行電化學檢測,電解質為含有5mM的K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的10Mm/L的PBS溶液,實驗裝置圖如圖1所示。 

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采用 細胞 電極 電化學 檢測 增殖 活性 方法
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