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一種動態實時測量細胞膜電位的方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201410134171.3

申請日:

2014.04.03

公開號:

CN103954659A

公開日:

2014.07.30

當前法律狀態:

終止

有效性:

無權

法律詳情: 未繳年費專利權終止IPC(主分類):G01N 27/26申請日:20140403授權公告日:20160831終止日期:20170403|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):G01N 27/26申請日:20140403|||公開
IPC分類號: G01N27/26 主分類號: G01N27/26
申請人: 西安電子科技大學
發明人: 張鵬; 黃辰; 張毅奕; 馬曉華; 郝躍
地址: 710071 陜西省西安市太白南路二號西安電子科技大學西大樓南翼113室微電子學院寬帶隙半導體技術國家重點學科實驗室
優先權:
專利代理機構: 北京市京大律師事務所 11321 代理人: 張璐;方曉明
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410134171.3

授權公告號:

|||||||||

法律狀態公告日:

2018.04.17|||2016.08.31|||2014.08.27|||2014.07.30

法律狀態類型:

專利權的終止|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及一種動態實時測量細胞膜電位的方法,包括如下步驟:1)將從已獲得的人體臍帶靜脈血中分離出來的細胞在體外進行培養;2)將培養后的細胞注入到微流室中繼續進行培養;3)利用微注射泵在微流室中進行精確的流量控制;4)利用微流室內的氮化鎵(GaN)高電子遷移率晶體管(HEMT)器件測量流體表面的粘滯度,進而計算出細胞膜電位。在使用本發明測量細胞膜電位的過程中,將作為生物傳感器的HEMT器件和微流室、微注射泵、儲液瓶相連,在微注射泵提供動態流體環境的前提下,通過HEMT器件實時監測流體環境下的活體多細胞膜電位。

權利要求書

權利要求書
1.  一種動態實時測量細胞膜電位的方法,所述方法包括如下步驟:
1)將從已獲得的人體臍帶靜脈血中分離出來的細胞在體外進行培養;
2)將所述培養后的細胞注入到微流室中繼續進行培養;
3)利用微注射泵在微流室中進行精確的流量控制;
4)利用所述微流室內的氮化鎵(GaN)高電子遷移率晶體管(HEMT)器件測量流體表面的粘滯度,進而計算出細胞膜電位。

2.  根據權利要求1所述的方法,需要將所述微流室、微注射泵和儲液瓶依次連接,構成一個封閉的循環系統;所述微流室作為液體流動和細胞注入之用,所述微流室內的液體通過所述微注射泵傳輸給所述儲液瓶,所述作為生物傳感器的HEMT器件與所述微流室耦合,用于檢測所述微流室內細胞在動態條件下的實時細胞膜電位。

3.  根據權利要求1所述的方法,其中所述的從已獲得的人體臍帶靜脈血中分離細胞的方法為:
1)在無菌條件下,將已獲得的新鮮的人體臍帶靜脈血加入1g/L膠原酶和2.5g/L胰蛋白酶(1:1)(V/V)的混合液15mL,置于37℃水浴箱中孵育8min;
2)將步驟1)得到的液體收集入離心管,用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗臍靜脈2次,將沖洗后的液體一同收集入離心管,1000r/min離心10min,取上清液,加入完全培養液重懸細胞;
3)取0.1mL細胞懸液用4g/L臺盼藍染色后作活細胞計數;
4)將2×104/L細胞接種到24孔板中,每孔加入完全培養液1mL,置于37℃、950mL/L O2、50mL/L CO2培養箱內靜置培養,并采用臺盼藍排斥法,將0.1mL混勻的內皮細胞懸液與4g/L臺盼藍0.9mL混勻后,取1滴在顯微鏡下計數100個細胞。

4.  根據權利要求1所述的方法,其中所述的將已分離活體細胞注入到微流室內繼續培養的方法為:用酒精對HEMT器件消毒后,使用纖連蛋白溶液(fibronectin)進行處理30min,并使用PBS沖洗,然后接種細胞,使 細胞密度達到5000~12000cells/mm2,并保證細胞全程置于含5%CO2的37℃恒溫箱中。

5.  根據權利要求1所述的方法,其中所述的利用微注射泵在微流室中進行精確的流量控制的方法為:采用微注射泵與細胞膜電位檢測裝置連接形成血液動力系統,該系統架設在37℃恒溫箱中維持溫度穩定,實驗中使用PBS作為流體,并且實驗全程通入含5%CO2的空氣以保持流體環境的酸堿度。

6.  根據權利要求1所述的方法,其中所述的用微流室內的HEMT器件測量流體表面的粘滯度,進而計算出細胞膜電位的方法為:
1)器件裸柵上培養的細胞受到的剪切力由以下公式推導:
τ=6wh2]]>
其中τ為細胞受到的剪切力,單位為dyne/cm2;η為流體即培養液的粘滯度(viscosity),單位為g/(cm·s);Q為流體每秒的流量,單位為cm3/s;w為器件的柵寬,h為微流室內壁高度;
2)采用半導體測試分析儀器,來測試HEMT器件的源漏電流,并通過如下公式,轉化成對應的細胞膜電位:
VJD=ΔVGS=ΔIDS(gm)VDS]]>
為細胞膜電位,為所8加漏源電壓VDS下,且柵電壓VGS在-70mV~0V處對應的HEMT器件跨導。由于柵電壓的變化較小,可認為為一個常數,由預先測量得到。

7.  根據權利要求6所述的測量細胞膜電位的方法,所述預先測量為:對在同一晶圓上、且采用相同版圖的常規三端HEMT器件,加相同漏源電壓VDS,測試其轉移曲線(VG-ID),得到柵電壓在-70mV~0V處對應的器件跨導值。

說明書

說明書一種動態實時測量細胞膜電位的方法
技術領域
本發明涉及一種動態實時測量細胞膜電位的方法。
背景技術
人體體液流動會對細胞會產生剪應力,進而引起細胞電位的變化。剪切力能影響人體內皮細胞生物學特性的許多方面,與多種心血管疾病相關。因此,檢測細胞膜電位是否變化具有重要的生理學和病理學研究意義。
目前,測量剪切力下的細胞膜電位的方法主要包括熒光染料法、微電極陣列法和膜片鉗方法。
熒光染料法是利用熒光強度在剪切力作用下會發生改變,并且與膜片鉗得到的細胞膜電位變化趨勢相同的性質,來測量細胞膜電位的一種方法。但這種方法反應時間和精度都有較大差距,且目前無法證明熒光強度能夠代替細胞膜電位表征細胞的電生理現象。
微電極陣列法采用集成電路硅工藝,通過微電極陣列能夠表征大體積的單個肌細胞或神經細胞的動作電位。但這種方法存在測量準備時間長、測量準確度和靈敏度低的缺點。
膜片鉗方法是目前最常用的方法,它是通過玻璃微電極測量單細胞的膜內外的電壓或電流差,并通過一定的放大和轉換,得到細胞膜電位。但是這種技術具有以下先天性不足:生物組織是由大量細胞緊密排列形成的,而膜片鉗只能測量單細胞,并不能表征實際的多細胞膜電位對剪切力的響應情況;測量時會破壞細胞膜,改變細胞的特性,短時間內細胞將死亡,這樣就限制了對細胞膜動作電位以及離子通道早期發生現象的研究;在流體環境下測試時,由于剪切力的存在,細胞容易從膜片鉗脫落;膜片鉗技術每次只能記錄一個細胞(或一對細胞),每天只能獲得的數據量僅為幾到幾十個,耗時耗力。
綜上所述,熒光染料法、微電極陣列法和膜片鉗方法均無法解決活體多細胞膜電位的測量問題,來準確表征剪切力對細胞膜電位的影響。
因此,需要一種具有檢測快速、靈敏度高、實時測量、結果準確、生物兼容性高、多細胞活體測量等多重優點的方法,來進行細胞膜電位的測量。
發明內容
因此,為解決現有技術中存在的上述問題而完成了本發明,本發明的目的之一在于提供一種實時的準確測量剪切力影響的活體多細胞膜電位的方法,該方法使用了氮化鎵(GaN)高電子遷移率晶體管(HEMT)、微流室技術和微注射泵技術,將從人體臍帶靜脈血中分離出來的細胞在體外進行培養,然后注入到微流室中繼續進行培養,最后利用微注射泵在微流室中進行精確的流量控制,用微流室內的HEMT器件測量流體表面的粘滯度,進而計算出細胞膜電位,實現了一種動態模擬多細胞環境并實時監測流體環境下的活體多細胞膜電位的方法。
在使用本發明測量細胞膜電位的過程中,將作為生物傳感器的HEMT器件和微流室、微注射泵、儲液瓶相連,在微注射泵提供動態流體環境的前提下,通過HEMT器件實時監測流體環境下的活體多細胞膜電位。
本發明中應用于生物傳感器的HEMT器件的結構為:底層為藍寶石材料,底層向上依次為1.6μm左右的GaN緩沖層,1.2nm AlN插入層,8~15nm左右的AlGaN勢壘層和1.5nm GaN帽層,勢壘層鋁組分在25%~40%之間。帽層以上為Si3N4鈍化層,鈍化層中間被蝕刻出一塊長方形槽狀的裸柵區域,裸柵區域無電極引出,尺寸在10μm~10mm范圍內。
如本領域技術人員所熟知或容易想到的上述HEMT器件的藍寶石襯底也可采用其他具有相似功能的材料,如碳化硅(SiC)材料。
本發明中HEMT器件的制造工藝為:
(1)臺面刻蝕,采用ICP方法刻蝕異質結材料形成器件的臺面隔離;
(2)淀積源漏極歐姆金屬,采用電子束蒸發的方法獲得歐姆金屬層,歐姆金屬采用Ti/Al/Ni/Au四層結構,并在830℃下退火形成合金,獲得良好的源漏極歐姆接觸;
(3)采用PECVD方法淀積Si3N4材料作為鈍化層;
(4)光刻并采用ICP方法刻蝕Si3N4,露出裸柵區域。
本發明中微流室的結構為:在HEMT器件上方覆蓋了用高分子聚合材料制造的與裸柵相同的槽狀圖形,槽內安裝微流室。微流室材料選用聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)材料,除此以外,還可采用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA),聚酰亞胺(polyimide)等材料。微流室反應室尺寸設計與器件柵極圖形保持一致。微流室兩側有封接口,作為液體流動和細胞注入之用。 微流室用于培養細胞,培養完成后連接微注射泵,以提供精確的流量控制。微流室兩端有兩個直徑在0.1mm~0.5mm左右的小孔,能夠與外部相連。微流室部件與HEMT器件封接,得到一個密閉的通道,溶液能夠在通道中流動,形成流體動力學下的細胞膜電位檢測裝置。
本發明中微流室的制作工藝為:先采用光刻的方法或反應離子刻蝕(RIE)的方法制造出微流室凸突的陽模,然后在陽模上澆鑄PDMS,在約50℃溫度下固化后使PDMS從陽模上剝離,即可制得微流室部件。微流室兩端的小孔采用鉆孔法或其他方法得到。微流室部件與HEMT芯片封接工藝采用熱壓法或粘合法等方法。
本發明中活體細胞的分離方法為:在無菌條件下,向已獲取的新鮮的人體臍帶靜脈血中加入1g/L膠原酶和2.5g/L胰蛋白酶(1:1)(V/V)的混合液15mL,置于37℃水浴箱中孵育8min,將消化液收集入離心管,用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗臍靜脈2次,將沖洗液一同收集入離心管,1000r/min離心10min,取上清液,加入完全培養液重懸細胞,取0.1mL細胞懸液用4g/L臺盼藍染色后作活細胞計數。將2×104/L細胞接種到24孔板中,每孔加入完全培養液1mL,置于37℃、950mL/L O2、50mL/L CO2培養箱內靜置培養,并采用臺盼藍排斥法,將0.1mL混勻的內皮細胞懸液與4g/L臺盼藍0.9mL混勻后,取1滴在顯微鏡下計數100個細胞。當細胞懸液中細胞存活率大于95%時,可用于進行原代細胞培養。
本發明中活體細胞的培養方法為:用酒精對HEMT器件消毒后,使用纖連蛋白溶液(fibronectin)進行處理30min,以增強細胞的附著度。并使用PBS沖洗,并接種細胞,使細胞密度達到5000~12000cells/mm2,并保證細胞全程置于含5%CO2的37℃恒溫箱中。
本發明中裝置的使用方法為:采用微注射泵與細胞膜電位檢測裝置連接形成血液動力系統,該系統架設在37℃恒溫箱中維持溫度穩定,實驗中使用PBS作為流體,并且實驗全程通入含5%CO2的空氣以保持流體環境的酸堿度。
本發明中器件裸柵上培養的細胞受到的剪切力由以下公式推導:
τ=6wh2]]>
其中τ為細胞受到的剪切力,單位為dyne/cm2;η為流體即培養液的粘滯度(viscosity),單位為g/(cm·s);Q為流體每秒的流量,單位為cm3/s;w為器件的柵寬,h為微流室內壁高度。通過調節泵的每秒流量,即可得所需的剪切力。
本發明中裝置采用半導體測試分析儀器,如Keithley4200SCS,來測試HEMT器件的源漏電流,并可通過如下公式,轉化成對應的細胞膜電位。
VJD=ΔVGS=ΔIDS(gm)VDS]]>
其中,為細胞膜電位,為所加漏源電壓VDS下,且柵電壓VGS在-70mV~0V處對應的HEMT器件跨導。由于柵電壓的變化較小,可認為為一個常數,由預先測量得到。預先測量方法為:對在同一晶圓上、且采用相同版圖的常規三端HEMT器件,加相同漏源電壓VDS,測試其轉移曲線(VG-ID),得到柵電壓在-70mV~0V處對應的器件跨導值。
附圖說明
圖1為本發明的工作流程圖。
圖2為本發明的測量原理圖
具體實施方式
下面結合附圖對本發明作進一步說明。本發明的實施方式包括但不限于下屬案例。
實施例1
如圖1、2所示,一種準確測量剪切力影響的活體多細胞膜電位的裝置,包括HEMT器件傳感器、微流室、微注射泵和儲液瓶。
本實施例中,將活體細胞從人臍帶靜脈中分離出來,培養繁殖后,注入微流室進行培養和鍵合。將裝置置于37℃恒溫箱中,用微注射泵將液體注入微流室。實驗中使用PBS作為流體,并且實驗全程通入含5%CO2的空氣以保持流體環境的酸堿度。利用HEMT器件測量流體的粘滯度,并利用下述公式進行計算,得到細胞膜電位與時間的關系。
本發明中器件裸柵上培養的細胞受到的剪切力由以下公式推導:
τ=6wh2]]>
其中τ為細胞受到的剪切力,單位為dyne/cm2;η為流體即培養液的粘滯度(viscosity),單位為g/(cm·s);Q為流體每秒的流量,單位為cm3/s;w為器件的柵寬,h為微流室高度。通過調節泵的每秒流量,即可得所需的剪切力。
本發明中裝置采用半導體測試分析儀器,如Keithley4200SCS,來測試 HEMT器件的源漏電流,并可通過如下公式,轉化成對應的細胞膜電位。
VJD=ΔVGS=ΔIDS(gm)VDS]]>
其中,為細胞膜電位,為所加漏源電壓VDS下,且柵電壓VGS在-70mV~0V處對應的HEMT器件跨導。由于柵電壓的變化較小,可認為為一個常數,由預先測量得到。預先測量方法為:對在同一晶圓上、且采用相同版圖的常規三端HEMT器件,加相同漏源電壓VDS,測試其轉移曲線(VG-ID),得到柵電壓在-70mV~0V處對應的器件跨導值。
盡管已經通過描述本發明的典型實施例達到說明的目的,本領域技術人員將會理解的是,在不脫離如從屬權利要求中公開的本發明的范圍和主旨的情況下,可以進行各種修正、添加和替代。

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