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一種DAB2IP蛋白的ELISA檢測方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201410052911.9

申請日:

2014.02.17

公開號:

CN103983784A

公開日:

2014.08.13

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):G01N 33/68申請日:20140217|||公開
IPC分類號: G01N33/68 主分類號: G01N33/68
申請人: 中國科學院福建物質結構研究所
發明人: 吳允昆; 蘇銀桃; 李生平; 謝佐福; 施方媛; 曾占壯; 趙艷和
地址: 350002 福建省福州市楊橋西路155號
優先權:
專利代理機構: 北京慶峰財智知識產權代理事務所(普通合伙) 11417 代理人: 劉元霞;謝蓉
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410052911.9

授權公告號:

||||||

法律狀態公告日:

2016.03.23|||2014.09.10|||2014.08.13

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種針對DAB2IP蛋白的ELISA檢測方法,該方法采用雙抗體夾心ABC法,同時具有高特異性和高靈敏度。所述檢測方法具有以下特征:包被DAB2IP單克隆抗體(由保藏號為CCTCC?No.C2013148的細胞株分泌,保藏名稱為DAB2IPMab1)于ELISA檢測板上作為固相抗體,以生物素標記的DAB2IP多克隆抗體作為酶標抗體,使HRP通過與其偶聯的Avidin與多克隆抗體上的生物素結合,經TMB顯色,在450nm單波長處測定吸收值,可以實現DAB2IP蛋白的定量檢測。本發明還提供DAB2IP蛋白檢測方法的應用。該方法為DAB2IP蛋白的檢測及檢測產品的開發奠定了基礎。

權利要求書

權利要求書
1.  一種DAB2IP蛋白的檢測方法,所述方法包括以包被于ELISA檢測板上的DAB2IP單克隆抗體作為固相抗體和標記的DAB2IP多克隆抗體作為酶標抗體進行雙抗體夾心法,以定量檢測DAB2IP蛋白。

2.  權利要求1的方法,所述DAB2IP單克隆抗體來自抗人腫瘤抑制因子DAB2IP單克隆抗體雜交瘤細胞株,其保藏號為CCTCC No.C2013148。

3.  權利要求1或2的方法,包括所述檢測方法:以包被于ELISA檢測板上的DAB2IP單克隆抗體作為固相抗體,以生物素標記的DAB2IP多克隆抗體作為酶標抗體,通過顯色劑-Avidin與多克隆抗體上的生物素結合使顯色劑通過與其偶聯的Avidin與多克隆抗體上的生物素結合,經顯色,以定量檢測DAB2IP蛋白。

4.  權利要求3的方法,所述顯色劑是辣根過氧化物酶(HRP),在這種情況下經四甲基聯苯胺(TMB)顯色,在450nm單波長測定吸收值,以定量檢測實現DAB2IP蛋白。

5.  權利要求1或2的方法,所述生物素標記的DAB2IP多克隆抗體是按以下步驟制備的:
將DAB2IP多克隆抗體溶解在PBS緩沖液中(優選濃度2mg/ml),加入生物素(優選生物素為抗體分子數的1-40倍,更優選5-30,還更優選10-20倍),在冰上靜置,經純化得到純的生物素化抗體。

6.  權利要求1或2的方法,所述單克隆抗體是按以下步驟制備的:將DAB2IP基因重組到改造過的pET32a載體上,該載體同時含有6His tag和TRX tag,并在6His tag和多克隆位點之間含有TEV酶切位點;將重組質粒在大腸桿菌BL21菌株中進行表達,所表達的蛋白為TRX-6His-DAB2IP融合蛋白,經TEV酶切及二次鎳柱和分子篩純化,得到純化的DAB2IP蛋白;利用該純化的DAB2IP蛋白免疫小鼠,經細胞融合及亞克隆化得到單克隆抗體雜交瘤細胞株, 由該細胞株分泌產生單克隆抗體。

7.  權利要求1或2的方法,所述多克隆抗體是按以下步驟制備的:利用權利要求6純化的DAB2IP蛋白免疫新西蘭大白兔獲得多克隆抗體。

8.  權利要求1或2的方法,所述DAB2IP的定量檢測是按以下方法完成的:將DAB2IP標準蛋白進行梯度稀釋,然后分別用此方法測定400-700nm,優選450nm單波長時的讀數,制作一個標準曲線,再將要測定的樣品用此法在相同波長所測得的讀數帶入標準曲線,得到其實際濃度。

說明書

說明書一種DAB2IP蛋白的ELISA檢測方法
技術領域
本發明屬于免疫學檢測技術領域,特別是涉及一種DAB2IP蛋白的檢測方法及其應用。 
背景技術
腫瘤是嚴重威脅人類健康的常見病和多發病,其死亡率僅次于心腦血管疾病。全球每年罹患惡性腫瘤人數約有1000萬人,其中因腫瘤死亡的病例達700多萬,而腫瘤的轉移和復發是腫瘤死亡的主要因素。近年來,我國每年新增腫瘤病患160-170萬人,呈明顯上升趨勢。腫瘤治療康復的關鍵在于腫瘤的及時準確診斷和治療。因此,腫瘤診斷對于降低腫瘤病死亡率意義重大。腫瘤的診斷主要依靠檢測腫瘤標志物來實現。同時,腫瘤標志物也是腫瘤的病理診斷、治療和預后判斷的重要指標。這些標志物存在于病人的細胞、組織、血液或體液中,檢測這些腫瘤標志物的表達水平,對相關惡性腫瘤的早期診斷、治療效果和預后轉歸判斷等有重要參考價值。 
DAB2IP是一種新發現的抑癌蛋白,它與抑癌蛋白DAB2蛋白的N末端相結合,是DAB2下游的效應蛋白。DAB2IP最初發現與前列腺癌有關,其表達減少常在前列腺癌細胞中檢測到,而在正常的前列腺細胞中則表達正常。另外,研究表明DAB2IP蛋白的表達與前列腺癌轉移的分級和預后呈負相關,故監測低表達的DAB2IP對于前列腺癌的預測和診治具有重要意義。Dote等發現DAB2IP的基因沉默對胃腸癌和乳腺癌的發生發展和侵襲轉移起重要作用。Yano等認為DAB2IP可作為肺癌發生的一個生物標志物。而越來越多的研究表明DAB2IP作為重要的抑癌基因,在乳腺癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肺癌等多種腫瘤發生發展和預后等方面都發揮了舉足輕重的作用。 
作為一種新發現的抑癌蛋白,關于DAB2IP的失活機制、抑癌機理及其與多種腫瘤的關系正在不斷被深入研究。對DAB2IP的進一步研究,將為腫瘤診斷提供新途徑,并有望成為治療腫瘤的突破口之一。DAB2IP的去甲基化治療,DAB2IP再表達和依據DAB2IP信號通路蛋白設計腫瘤抑制劑類藥物,將為腫瘤治療提供新的思路。 
因此,針對DAB2IP蛋白的檢測方法一方面為臨床腫瘤的輔助診斷、鑒別診斷、觀察療效、監測復發以及預后評價提供一個新的參考指標和檢測工具;另一方面為全面揭示DAB2IP蛋白的作用機制以及與臨床腫瘤的關系的研究提供了一個新手段。蛋白檢測方法相對于核酸檢測法,避免了蛋白表達的時空調控導致的誤差,具有更直接準確的優勢。 
發明內容
本發明的目的在于提供一種人DAB2IP蛋白的檢測方法。 
在一方面,本發明提供了一種DAB2IP蛋白的檢測方法,所述方法包括以包被于ELISA檢測板上的DAB2IP單克隆抗體作為固相抗體和標記的DAB2IP多克隆抗體作為酶標抗體進行雙抗體夾心法,以定量檢測DAB2IP蛋白。優選地,所述DAB2IP單克隆抗體來自抗人腫瘤抑制因子DAB2IP單克隆抗體雜交瘤細胞株,其保藏號為CCTCC No.C2013148。 
在一個具體的實施方案中,所述檢測方法包括:以包被于ELISA檢測板上的DAB2IP單克隆抗體作為固相抗體,以生物素標記的DAB2IP多克隆抗體作為酶標抗體,通過顯色劑-Avidin與多克隆抗體上的生物素結合使顯色劑通過與其偶聯的Avidin與多克隆抗體上的生物素結合,經顯色,以定量檢測實現DAB2IP蛋白。 
在一個實施方案中,所述顯色劑是辣根過氧化物酶(HRP),在這種情況下經四甲基聯苯胺(TMB)顯色,在400-700nm,優選450nm單波長測定吸收值,以定量檢測實現DAB2IP蛋白。 
本發明的方法為DAB2IP蛋白的檢測及相關檢測產品的開發奠定基礎。 
在一個實施方案中,本發明的生物素標記的DAB2IP多克隆抗體是按以下步驟得到的: 
將DAB2IP多克隆抗體溶解在PBS緩沖液中(優選濃度2mg/ml),加入生物素(優選生物素為抗體分子數的1-40倍,更優選5-30倍,還更優選10-20倍),在冰上靜置,經純化得到純的生物素化抗體。 
本發明中的DAB2IP單克隆抗體可以參見本申請人于2014年1月9日提交的,申請號為201410009739.9、發明名稱為“一種抗人DAB2IP的單克隆抗體及其細胞株”的發明專利申請,其全文引入本文作為參考。 
在一個實施方案中,本發明的單克隆抗體是按以下步驟制備的:將DAB2IP基因(SEQ ID NO.1)重組到改造過的pET32a載體上,該載體同時含有6His tag和TRX tag,并在6His tag和多克隆位點之間含有TEV酶切位點;將重組質粒在大腸桿菌BL21菌株中進行表達,所表達的蛋白為TRX-6His-DAB2IP(SEQ ID NO.2)融合蛋白,經TEV(S219V)酶切及二次鎳柱和分子篩純化,得到純化的DAB2IP蛋白;利用該純化的DAB2IP蛋白免疫小鼠,經細胞融合及亞克隆化得到單克隆抗體雜交瘤細胞株,由該細胞株分泌產生單克隆抗體。 
其中,SEQ ID NO.1如下: 
aggtcctccg gggtccagcc ctcacctgcc cgcagctcga gttactcgga agccaacgag    60 
cctgatcttc agatggccaa cggtggcaag agcctctcca tggtggacct ccaggacgcc    120 
cgcacgctgg atggggaggc aggctccccg gcgggccccg acgtcctccc cacagatggg    180 
caggccgctg cagctcagct ggtggccggg tggccggccc gggcaacccc agtgaacctg    240 
gcagggctgg ccacggtgcg gcgggcaggc cagacaccaa ccacaccagg cacctccgag    300 
ggcgcgccag gccggcccca gctgttggca ccgctctcct tccagaaccc tgtgtaccag    360 
atggcggctg gcctgccgct gtcaccccgt ggccttggcg actcaggctc tgagggccac    420 
agctccctga gctcacacag caacagcgag gagttggcgg ctgctgccaa gctgggaagt    480 
ttcagcactg ccgcggagga gctggctcgg cggcccggtg agctggcacg gcgacagatg    540 
tcactgactg aaaaaggcgg gcagcccacg gtgccacggc agaacagtgc tggcccccag    600 
aggaggatcg accagcctcc gcccccaccc ccgccgccac ctcctgcccc ccgcggccgg    660 
acgcccccca acctgctgag caccctgcag tacccaagac cctcaagcgg aaccctggcg    720 
tcggcctcac ctgattgggt gggccccagt acccgcctga ggcagcagtc ctcttcctcc    780 
aagggggaca gcccagaact gaagccacgg gcagtgcaca agcagggccc ttcacctgtg    840 
agccccaatg ccctggaccg cacagccgct tggctcttga ccatgaacgc gcagttgtta    900 
gaagacgagg gcctgggccc agaccccccc cacagggata ggctaaggag taaggacgag    960 
ctcagccaag cagaaaagga cctggcggtg ctgcaggaca agctgcgaat ctccaccaag    1020 
aagctggagg agtatgagac cctgttcaag tgccaggagg agacgacgca gaagctggtg    1080 
ctggagtacc aggcacggct ggaggagggc gaggagcggc tgcggcggca gcaggaggac    1140 
aaggacatcc agatgaaggg catcatcagc aggttgatgt ccgtggagga agaactgaag    1200 
aaggaccacg cagagatgca agcggctgtg gactccaaac agaagatcat tgatgcccag    1260 
SEQ ID NO.2如下: 
Arg Ser Ser Gly Val Gln Pro Ser Pro Ala Arg Ser Ser Ser Tyr Ser 
Glu Ala Asn Glu Pro Asp Leu Gln Met Ala Asn Gly Gly Lys Ser Leu 
Ser Met Val Asp Leu Gln Asp Ala Arg Thr Leu Asp Gly Glu Ala Gly 
Ser Pro Ala Gly Pro Asp Val Leu Pro Thr Asp Gly Gln Ala Ala Ala 
Ala Gln Leu Val Ala Gly Trp Pro Ala Arg Ala Thr Pro Val Asn Leu 
Ala Gly Leu Ala Thr Val Arg Arg Ala Gly Gln Thr Pro Thr Thr Pro 
Gly Thr Ser Glu Gly Ala Pro Gly Arg Pro Gln Leu Leu Ala Pro Leu 
Ser Phe Gln Asn Pro Val Tyr Gln Met Ala Ala Gly Leu Pro Leu Ser 
Pro Arg Gly Leu Gly Asp Ser Gly Ser Glu Gly His Ser Ser Leu Ser 
Ser His Ser Asn Ser Glu Glu Leu Ala Ala Ala Ala Lys Leu Gly Ser 
Phe Ser Thr Ala Ala Glu Glu Leu Ala Arg Arg Pro Gly Glu Leu Ala 
Arg Arg Gln Met Ser Leu Thr Glu Lys Gly Gly Gln Pro Thr Val Pro 
Arg Gln Asn Ser Ala Gly Pro Gln Arg Arg Ile Asp Gln Pro Pro Pro 
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Pro Arg Gly Arg Thr Pro Pro Asn 
Leu Leu Ser Thr Leu Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Ser Gly Thr Leu Ala 
Ser Ala Ser Pro Asp Trp Val Gly Pro Ser Thr Arg Leu Arg Gln Gln 
Ser Ser Ser Ser Lys Gly Asp Ser Pro Glu Leu Lys Pro Arg Ala Val 
His Lys Gln Gly Pro Ser Pro Val Ser Pro Asn Ala Leu Asp Arg Thr 
Ala Ala Trp Leu Leu Thr Met Asn Ala Gln Leu Leu Glu Asp Glu Gly 
Leu Gly Pro Asp Pro Pro His Arg Asp Arg Leu Arg Ser Lys Asp Glu 
Leu Ser Gln Ala Glu Lys Asp Leu Ala Val Leu Gln Asp Lys Leu Arg 
Ile Ser Thr Lys Lys Leu Glu Glu Tyr Glu Thr Leu Phe Lys Cys Gln 
Glu Glu Thr Thr Gln Lys Leu Val Leu Glu Tyr Gln Ala Arg Leu Glu 
Glu Gly Glu Glu Arg Leu Arg Arg Gln Gln Glu Asp Lys Asp Ile Gln 
Met Lys Gly Ile Ile Ser Arg Leu Met Ser Val Glu Glu Glu Leu Lys 
Lys Asp His Ala Glu Met Gln Ala Ala Val Asp Ser Lys Gln Lys Ile 
Ile Asp Ala Gln 
在一個具體的實施方案中,利用純化的DAB2IP蛋白免疫新西蘭大白兔獲得DAB2IP的多克隆抗體。 
在一個實施方案中,本發明的DAB2IP的定量檢測是按以下方法完成的:將DAB2IP標準蛋白進行梯度稀釋,然后分別用此方法測定400-700nm,優選450nm單波長時的讀數,制作一個標準曲線,再將要測定的樣品用此法在相同波長所測得的讀數帶入標準曲線,即得其實際濃度。雙抗體夾心法與傳統的ELISA檢測方法相比,固相抗體可以捕獲并富集抗原,產生放大作用,同時通過兩個單克隆抗體的特異性選擇,提高了特異性,所以該方法具有更高的特異性和靈敏性。因此建立的一種利用雙抗體夾心法檢測DAB2IP蛋白的方法具有重大意義。 
本發明包含以下有益效果: 
(1)檢測重復性好,特異性強,靈敏度高。 
(2)可以實現DAB2IP蛋白的定量檢測。 
(3)為DAB2IP蛋白的檢測及相關檢測產品的開發奠定了基礎。 
附圖說明
圖1:本發明的DAB2IP蛋白的檢測方法的工作原理圖。plate,檢測板;Ab1,DAB2IP單克隆抗體;Ab2,DAB2IP多克隆抗體;Ag,待檢測樣品;Biotin,生物素;Avidin,抗生物素蛋白;HRP,辣根過氧化物酶。 
圖2:雙抗體夾心ABC法檢測不同濃度DAB2IP蛋白的XY散點圖。 
具體實施方式
下面將結合附圖和實施例,對本發明的具體實施方式做進一步詳細描述。以下實施例將有助于說明本發明,但不以任何形式限制本發明。 
實施例1.所述檢測方法(附圖1)是按以下步驟進行的: 
1.1包被:將DAB2IP單克隆抗體用包被液(pH9.6的碳酸鈉緩沖液)稀釋至10μg/ml,每孔加入100μl,37℃孵育4h。 
1.2洗滌:棄去孔中液體,用PBST洗4次,每次2分鐘,甩去孔內液體后在吸水紙上拍干。 
1.3封閉:每孔加200μl含5%BSA的PBS封閉液封閉,37度孵育4h。 
1.4洗滌:PBST洗2次,每次2分鐘,甩去孔內液體后在吸水紙上拍干。 
1.5捕獲抗原:抗原稀釋至合適濃度,每孔100μl加入到對應孔中,陰性對照加100μl PBS,37度孵育1h,洗滌(同步驟1.2)。 
1.6加入二抗:將生物素化的DAB2IP多克隆抗體稀釋至2μg/ml,每孔各加100μl,37度孵育1h,洗滌(同步驟1.4)。 
1.7酶標二抗:將購買的商業化HRP-Avidin稀釋1.5萬倍,每孔各加100μl,37度孵育50min,洗滌(同步驟1.2)。 
1.8顯色:每孔加100μl TMB,室溫或37度反應5-30min,時間依據孔內變藍程度而定。 
1.9終止反應:顯色完畢后,每孔立即加入100μl2M H2SO4終止反應,于20min內檢測實驗結果。 
1.10檢測:在450nm單波長處測定吸收值。用此方法可以檢測DAB2IP蛋白,為DAB2IP蛋白的定量檢測及相關檢測產品的開發奠定基礎。 
1.11實例驗證:將DAB2IP蛋白按表1所示濃度梯度進行稀釋,并設置陰性對照。按照上述方法進行檢測,在450nm單波長處測定吸收值(表1),結果表明該方法靈敏度可以達到0.1μg/ml,檢測結果的XY散點圖(附圖2)表明在450nm單波長處測定吸收值與蛋白濃度有很好的線性關系,結果準確,可重復性好。 
表1雙抗體夾心ABC法檢測不同濃度DAB2IP蛋白的A450讀數 

實施例2.所述DAB2IP抗體生物素化是按以下步驟進行的: 
將抗體溶解在PBS緩沖液中,濃縮至2mg/ml,按1ml抗體加入0.15mg生物素(約為抗體分子數的20倍)的比例加入生物素,冰上靜置2h,經Protein A純化后得到純的生物素化抗體。 
實施例3.生物素化效果檢測是按以下步驟進行的: 
3.1用標準曲線法測定生物素化抗體中生物素的濃度: 
將生物素用PBS稀釋為0μg/ml、1μg/ml,10μg/ml及100μg/ml四個濃度梯度,各取10ul與90μl HABA/親和素溶液混合于孔中,在500nm處測定吸收值,即為標準曲線。同時將10μl生物素標記的抗體與90μl HABA/親和素溶液混合,亦于500nm處測定吸收值,代入標準曲線,得到生物素的濃度。 
所述試劑配制如下: 
PBS(3.58g Na2HPO4.12H2O;0.27g KH2PO4;8g NaCl;定容至1L;pH7.4);HABA/親和素溶液:10mg親和素、600μl10mM HABA于19.4ml的PBS中,溶液于4℃保存可穩定2周。 
3.2用BCA法測定生物素化抗體中抗體的濃度 
3.2.1配制工作液:根據標準品和樣品數量,按50體積BCA試劑加1體積Cu試劑(50:1)配制成BCA工作液,充分混勻。BCA工作液室溫24小時內穩定。 
3.2.2稀釋標準品:①取15μl1mg/ml BSA標準品+15μl PBS;②取15μl①+15μl PBS;③取15μl②+15μl PBS;④取15μl③+15μl PBS。 
3.2.3取90μl BCA工作液加于干凈96孔板酶標中,然后第一孔取10μl1mg/ml BSA標準品于孔中,使其終濃度為1mg/ml。第二孔取10μl步驟2中的①于相應孔中,以此類推,在A562nm處測定吸收值,得到標準曲線。 
3.2.4取5μl蛋白樣品加10μl PBS,從中取10μl加于相應孔中。所有樣加完后,將酶標板放于37℃孵育15-30分鐘,用酶標儀測定A562nm吸收值,代入標準曲線計算出蛋白濃度。 
3.3計算Biotin/Protein摩爾質量比,摩爾質量比小于20時說明生物素標記成功。本實驗測得的Biotin/Protein摩爾質量比為10.21,說明抗體生物素化成功。 
所述摩爾質量比的計算方法如下 
A=生物素化的蛋白毫摩爾濃度=蛋白濃度(mg/ml)/蛋白的分子量 
B=生物素的毫摩爾濃度=Biotin濃度/生物素分子量 
Biotin/Protein摩爾比=B/A(B/A應小于20才能使用) 
實施例4.本發明使用的單克隆抗體的制備 
4.1DAB2IP表達載體的構建 
4.1.1DAB2IP基因片段(SEQ ID NO.1)的獲得 
為了獲得SEQ ID NO.1表示DAB2IP基因片段序列,根據已公布DAB2IP cDNA序列設計一對特異性引物:正義鏈:5’-CGGGATCCAGGTCCTCCGGGGTCCAGC-3’(SEQ ID NO.3);反義鏈:5’-ATTTGCGGCCGCTTACTGGGCATCAATGATCTTCTGTTT-3’(SEQ ID NO.4);其中正義鏈含有BamHI酶切位點(GGATCC),反義鏈含有NotI酶切位點(GCGGCCGC)和終止密碼子(TAA)。以DAB2IP全長cDNA為模板,用高保真酶(Primer HS STAR)DNA聚合酶(大連寶生物工程(TaKaRa)有限公司產品)進行PCR擴增, 
反應體系是: 
2×PrimeSTAR GC緩沖液:25μl 
dNTP(每種均2.5mM):4μl 
正義引物(10μm):2μl 
反義引物(10μm):2μl 
模板(DAB2IP cDNA50ng/μl):2μl 
ddH2O:14.5μl 
Prime HS STAR:0.5μl 
擴增條件是: 
98℃變性10s, 
55℃退火15s, 
72℃延伸1m30s, 
上述條件共循環33次。 
取PCR產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳(附圖1),將該PCR產物測序確認正確擴增了DAB2IP基因序列。 
4.1.2pET32a-TRX-His-DAB2IP(SEQ ID NO.1)載體的構建及大腸桿菌轉化 
將步驟4.1.1得到的PCR產物和pET32a載體(購自Novagen)同時進行BamHI(購自TAKARA)和NotI(購自TAKARA)雙酶切,酶切產物回收后用T4DNA連接酶(購自TAKARA)進行連接,連接產物轉化大腸桿菌DH5α(本實驗室保存)。隨后用步驟4.1.1中的特異性引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4對用質粒提取試劑盒(OMEGA,Plasmid Mini Kit I)從轉化子中提取的質粒DNA(分光光度計測量濃度為500ng/μl,使用時稀釋至50ng/μl)進行PCR(反應體系和擴增條件同上)以鑒定陽性轉化子。提取陽性轉化子的質粒進行BamHI和NotI雙酶切,經1%瓊脂糖凝膠檢測可以得到與目標條帶大小一致的序列,經測序確認序列正確。 
將重組質粒按如下條件轉化表達菌株大腸桿菌BL21(本實驗室保存),得到含有pET32a-TRX-6His-DAB2IP質粒的大腸桿菌BL21菌株:從-80℃冰箱中取100μl感受態細胞,置于冰上解凍。待完全解凍后,加入連接產物,輕輕吹打均勻,冰浴30min,隨后42℃溫浴90秒,迅速置于冰浴中冷卻3-5分鐘。加入800μl LB液體培養基,混勻后37℃,150rpm振蕩培養1h,之后涂布于含AMP抗性的平板上,37℃培養12-16h。 
4.1.3Pet32a-TRX-His-DAB2IP(SEQ ID NO.1)融合蛋白的誘導表達及純化 
將含有pET32a-TRX-6His-DAB2IP(SEQ ID NO.1)質粒的大腸桿菌BL21菌株在含0.1mM氨芐青霉素(100mg/ml)的LB培養基(1%W/V NaCl,1%W/V Tryptone和0.5%W/V yeast extact)中培養至OD值0.5-0.6之間,加入誘導劑IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至終濃度0.3mmol/L,未加IPTG的菌液作為陰性對照。將上述菌液在16℃下培養12-14h,7000rpm離心5min收集菌體。將誘導的菌體和陰性對照菌體煮沸10分鐘裂解,然后進行SDS-PAGE電泳分析。隨后,選擇陽性菌株按上述條件進行大量誘導,收集菌體后在裂解液(pH8.0Tris-Hcl,500mM NaCl,5%甘油)中進行超聲破碎(功率380W,破碎30min),通過鎳離子親和層析(GE Healthcare)純化,再用 TEV蛋白酶(由本實驗室自行制備)切除標簽后再通過鎳離子親和層析(同前)及分子篩(superdex S200,GE Healthcare)進行進一步純化,用SDS-PAGE電泳檢測蛋白純度達到90%左右(圖2),用于后續單克隆抗體制備。 
4.1.4抗人DAB2IP單克隆抗體的制備 
4.1.4.1免疫小鼠 
將步驟4.1.3中純化的DAB2IP蛋白與完全弗氏佐劑(sigma)或不完全弗氏佐劑(sigma)按1∶1比例混合乳化。取5只4-6周齡的健康小鼠(BAlB/c小鼠),用上述DAB2IP蛋白與完全弗氏佐劑的乳化物進行腹腔免疫,每只小鼠每次50μg蛋白。8天后,用DAB2IP蛋白與不完全弗氏佐劑的乳化物對小鼠再次進行腹腔免疫。隨后每隔7-10天用不加佐劑的DAB2IP蛋白進行一次免疫。細胞融合前4天,用DAB2IP蛋白進行加強免疫,分離小鼠脾細胞。 
4.1.4.2細胞融合 
取SP2/O骨髓瘤細胞(本實驗室保存)與步驟4.1.4.1中得到的小鼠脾細胞按常規方法進行細胞融合后(吳建祥等,1999),加入HAT培養基(不完全培養基中含有15-20%V/V的FBS及2%V/V的HAT),輕輕吹打使細胞懸浮,最后加入到已有飼養細胞層(小白鼠腹水巨噬細胞)的96孔培養板中,每孔100μl,然后置5%CO2、37℃孵箱培養進行融合。融合10天后,檢測培養基上清中的特異性抗體(步驟見下文)。 
4.1.4.3陽性雜交瘤細胞的篩選及克隆 
篩選過程是以DAB2IP蛋白作為抗原,取有雜交瘤細胞生長的培養孔的細胞培養上清液用間接ELISA方法檢測。選擇其中ELISA反應為陽性的雜交瘤細胞在HAT培養基中進行連續3次亞克隆培養,直至得到單克隆。所述DAB2IP單克隆抗體雜交瘤細胞株,保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC),保藏號為CCTCC No.C2013148,保藏時間為2013年10月23日,保藏名稱為DAB2IPMab1。經鑒定此抗體為IgG1亞類(中國典型培養物保藏中心地址:中 國湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心,郵編:430072)。 
5.所述DAB2IP多克隆抗體是按以下步驟制備的: 
利用上述單克隆抗體制備中所純化的DAB2IP蛋白(SEQ ID NO.2)免疫新西蘭大白兔,獲得多克隆抗體。具體步驟如下:直接耳緣靜脈注射純化好的DAB2IP蛋白,注射量為0.5mg,此后每隔10-14天,耳緣靜脈注射0.5mg純化好的DAB2IP蛋白,第三次免疫之后,免疫前都先抽血檢測效價,至第5次效價達到10-6,可以用于制備多克隆抗體。放血前3天再注射一次,加強免疫。采用心臟采血法進行取血,取血后放于4℃冰箱,待凝固后離心分離血清,血清即多克隆抗體凍存于-80℃冰箱。 

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一種 DAB2IP 蛋白 ELISA 檢測 方法
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