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新型的特異性細胞免疫應答體外檢測方法及其臨床應用.pdf

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新型 特異性 細胞 免疫 應答 體外 檢測 方法 及其 臨床 應用
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摘要
申請專利號:

CN201410122051.1

申請日:

2014.03.29

公開號:

CN103983785A

公開日:

2014.08.13

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):G01N 33/68申請日:20140329|||公開
IPC分類號: G01N33/68 主分類號: G01N33/68
申請人: 陳仁奮
發明人: 陳仁奮; 魏秀妹
地址: 350001 福建省福州市鼓樓區華林路屏東城11棟-302
優先權:
專利代理機構: 福州元創專利商標代理有限公司 35100 代理人: 蔡學俊
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410122051.1

授權公告號:

||||||

法律狀態公告日:

2015.12.30|||2014.09.10|||2014.08.13

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種新型的特異性細胞免疫應答體外檢測方法及其臨床應用,該方法包括Sm合成肽抗原的合成及篩選,待檢血液與Sm混合肽抗原的混合培養,檢測培養血上清液中特定細胞因子的水平。該檢測方法可以應用于系統性紅斑狼瘡臨床的輔助診斷和治療監控。本發明具備多種臨床應用功能,而且簡便快速,容易操作,可靈活運用等特點,具有很好的應用前景。

權利要求書

權利要求書
1.  一種新型的細胞免疫應答體外檢測方法,其特征在于包括以下步驟:
(1)篩選并混合能被T細胞特異識別的Smith(Sm)合成肽,作為刺激待檢外周血白細胞的抗原,同時設立絲裂原PHA作陽性對照;
(2)將待檢血液與抗原混合,37℃培養20-24小時;
(3)檢測培養血上清液中特定細胞因子的水平,以判斷機體對特異性抗原Sm混合肽和非特異性免疫原絲裂原PHA的細胞免疫應答水平。

2.  如權利要求1所述的細胞免疫應答體外檢測方法,其特征在于:所述的Sm混合肽抗原包含五條合成肽, 分別為Sm1、Sm2、Sm3、Sm4、Sm5 ,具體氨基酸序列如下:
Sm1: RGNNIRYFILPDSLPLDTLL;         
Sm2 :SHETVTIELKNGTQVHGTIT;   
Sm3:GVDVSMNTHLKAVKMT;           
Sm4:TVGKSSKMLQHIDYRMRCI;   
Sm5: PMGIPPGRGTPMGMPPPGM。

3.   如權利要求1、2所述的細胞免疫應答體外檢測方法,其特征在于:所述的Sm合成肽抗原由FMOC固相合成方法自動或人工合成,經HPLC分析和純化,抗原純度90%以上。

4.  一種如權利要求1、2、3所述的細胞免疫應答體外檢測方法的臨床應用,其特征在于包括:
(1)通過測定待檢血經Sm 混合肽刺激產生IL-6的含量,判斷患者對Sm混合肽抗原的刺激是否存在高水平的細胞免疫應答,以實驗診斷SLE;
(2)通過分析SLE患者經Sm混合肽抗原特異刺激后產生的細胞因子譜,為病人選擇細胞因子拮抗劑進行個體化治療提供實驗參考;
(3)通過觀察SLE患者外周血對絲裂原刺激所釋放的細胞因子的能力,既可以評估病人的整體細胞免疫功能狀態, 也可用來判定該實驗結果的可靠性,以排除假陰性結果。

說明書

說明書新型的特異性細胞免疫應答體外檢測方法及其臨床應用
技術領域
本發明屬于臨床免疫及醫學實驗診斷領域,具體涉及一種新型的細胞免疫應答體外檢測技術。這種實驗方法基于檢測由Smith (Sm) 合成肽抗原體外刺激外周血T細胞產生的細胞因子水平,為系統性紅斑狼瘡(SLE)的實驗診斷和治療監控提供參考。
背景技術
系統性紅斑狼瘡(SLE)是影響人群最廣泛、最嚴重的自身免疫病之一,通常好發于育齡女性,能引發全身多種組織及器官的炎癥病變。由于該疾病發作潛伏,病程遷延反復并不斷加重,臨床表現復雜多樣,診斷和治療難度大,世界衛生組織把它列為新世紀醫學領域急待攻克的堡壘。
該疾病的病因目前尚不清楚。傳統的觀點是SLE患者的多器官炎癥損害主要歸因于體液免疫紊亂引起的B 細胞異常活化產生的多種自身抗體,并通過抗原抗體免疫復合物沉積并激活補體等途徑造成。因此,臨床診斷,病情監控及治療的參考實驗指標幾乎都依賴血清中自身抗體。而近年來的大量研究表明,細胞介導的免疫應答及其產生的細胞因子,特別是炎癥性的細胞因子等異常可能是造成紅斑狼瘡病理炎癥的另一關鍵原因(YAP, D. Y. & LAI, K. N. Cytokines and their roles in the pathogenesis of systemic lupus erythematosus: from basics to recent advances. J Biomed Biotechnol, 2010, 365083.),并與體液免疫相互作用,在整個疾病的發生和發展過程中起重要作用(DAVIS, L. S., HUTCHESON, J. & MOHAN, C. The role of cytokines in the pathogenesis and treatment of systemic lupus erythematosus. J Interferon Cytokine Res, 2011, 31, 781-9.)。最近Iwata 報道了一些SLE病人甚至出現以T細胞免疫紊亂為主導的發病機制(IWATA, S., SAITO, K., TOKUNAGA, M. & TANAKA, Y. B cell or T cell-dominant recurrence after rituximab therapy in patients with SLE. Ann Rheum Dis. 2012. )。這樣,檢測細胞免疫應答的產物(如細胞因子)與自身抗體一樣,對SLE的診斷,監控與治療至關重要。
衡量細胞免疫應答的水平可通過檢測由免疫原體外刺激全血白細胞產生的細胞因子來衡量。雖然細胞因子能敏感地反映機體的細胞免疫反應,但由于多種生理或病理因素均可影響細胞因子的釋放,所以細胞因子本身不具疾病特異性(PICCOLI, L., MERONI, V., GENCO, F., TAMAROZZI, F., TINELLI, C., FILICE, C. & BRUNETTI, E. Serum cytokine profile by ELISA in patients withechinococcal cysts of the liver: a stage-specific approach to assess their biological activity. Clin Dev Immunol, 2012, 483935.)。至今為止,國際上尚未實現以檢測細胞因子來診斷自身免疫性疾病(包括SLE)的實驗技術。 
診斷及監控SLE 是基于綜合臨床表現及實驗檢查的美國風濕病學會(ACR)的分類標準,臨床醫生在判斷該標準規定的11項指標時受主觀因素影響較大,診斷準確性差,加上缺乏既敏感及特異的實驗指標,經常出現誤診或漏診。而對SLE的治療基本上依賴各類免疫抑制劑,藥物副作用大,常引發繼發性感染。雖然近年來不斷涌現出新型的治療藥物(細胞因子拮抗劑),臨床醫生對它們的選擇多依賴個人經驗作主觀判斷,存在盲目性。而目前國際上仍缺乏能指導細胞因子個體化治療的實驗方法(KALUNIAN, K. & JOAN, T. M. New directions in the treatment of systemic lupus erythematosus. Curr Med Res Opin. 2009.;RONNBLOM, L. & ELKON, K. B. Cytokines as therapeutic targets in SLE. Nat Rev Rheumatol, 2010,6, 339-347.)。
Smith(Sm) 抗原已被證明是系統性紅斑狼瘡(SLE)最特異的抗原。SLE病人體內除了出現高特異的抗Sm抗體,還存在針對Sm抗原的特異性T細胞免疫反應(FRITSCH-STORK, R., MULLEGGER, D., SKRINER, K., JAHN-SCHMID, B., SMOLEN, J. S. & STEINER, G. The spliceosomal autoantigen heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 (hnRNP-A2) is a major T cell autoantigen in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Res Ther, 2006, 8, R118.)。與雙鏈DNA相比,Sm屬于蛋白抗原,具有能直接刺激T細胞活化增殖并釋放細胞因子的優點。
基于以上背景,本發明結合Sm抗原對SLE的高特異性及其能在體外直接刺激T細胞活化產生大量細胞因子的高敏感性,發展了一種新型的細胞免疫應答體外檢測的實驗方法,用以輔助診斷SLE并為其治療和監控提供參考。
發明內容
本發明的目的在于建立一種新型的細胞免疫應答體外檢測方法,并用于SLE的輔助診斷和治療監控。
本發明的技術方案如下:
本發明利用Sm抗原能特異地刺激SLE患者T細胞活化并產生多種細胞因子的現象,首先篩選出這些能被T細胞特異識別的Sm合成肽,并將其混合作為體外刺激全血細胞的抗原。基于SLE患者全血中的記憶性T細胞能快速而特異地識別Sm抗原并活化產生細胞因子,本發明將待檢血液與Sm混合肽抗原混合培養時間控制在18-24小時(37℃)。然后檢測培養血上清液中特定細胞因子的水平,以判斷機體對特異性抗原的細胞免疫應答能力以及患者的整體細胞免疫功能狀況。實驗同時設定本底對照(只加生理鹽水)及陽性對照(絲裂原:植物血凝素(PHA))。
其中,用于刺激外周血的Sm混合肽抗原包含五條合成肽,由FMOC固相合成方法自動或人工合成,經HPLC分析和純化,抗原純度90%以上。具體氨基酸序列如下:
Sm1: RGNNIRYFILPDSLPLDTLL              Sm2 :SHETVTIELKNGTQVHGTIT   
Sm3:GVDVSMNTHLKAVKMT              Sm4:TVGKSSKMLQHIDYRMRCI   
Sm5: PMGIPPGRGTPMGMPPPGM             
本實驗檢測的結果可有多種臨床用途:1. 通過測定待檢血經Sm混合肽刺激產生IL-6的含量,判斷患者對Sm抗原的刺激是否存在高水平的特異性細胞免疫應答,可實驗診斷SLE;2.通過分析SLE患者經Sm混合肽刺激后產生的細胞因子譜,為患者選擇細胞因子拮抗劑進行個體化治療時提供實驗參考;3. 通過觀察SLE患者外周血對絲裂原刺激所釋放的細胞因子的能力,既可評估病人的整體細胞免疫功能狀況, 也可用來判定該實驗結果的可靠性(如患者是否存在較強的免疫功能抑制),以排除假陰性結果。
本發明的優點:
本發明原創性地應用一組對SLE 高度特異的Sm合成肽抗原刺激外周全血中的T細胞,然后通過測定T細胞活化后產生的細胞因子水平,首次在國際上建立了一種針對疾病特異性抗原的細胞免疫應答的體外測定方法,并應用于SLE的實驗診斷,免疫功能監控及指導個體化治療,填補了該領域的空白。這種新型的細胞免疫功能檢測手段具備多種臨床應用功能,而且簡便快速,容易操作,可靈活運用等特點。將與目前廣泛應用的抗Sm和 抗dsDNA 抗體等體液免疫檢測方法互為補充,并可更全面地評估SLE患者的免疫狀況,大大地提高了SLE 的實驗診斷水平。綜合分析由Sm合成肽抗原和絲裂原刺激產生的多種細胞因子,可為SLE的治療提供科學的實驗依據,為降低治療的副作用,減少目前狼瘡治療中的主觀性和盲目性起到重要的作用,具有很好的應用前景。
附圖說明
圖1.體外檢測Sm混合肽抗原刺激外周血白細胞產生細胞因子的實驗方法。
圖2.  系統性紅斑狼瘡 (SLE)患者與對照的外周血在Sm 抗原刺激后產生的IL-6 水平。虛線為陽性界值。檢測對象包括SLE 患者41例,疾病對照(Disease control )61例(其中包括類風濕性關節炎10例,干燥綜合征7例,硬皮病6例,混合結締組織病6例,其它疾病32例),健康對照(Healthy control)42例。
圖3. 受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析本發明的臨床診斷價值。 A: SLE區分疾病對照(disease control)的ROC 曲線; B: SLE區分健康對照(healthy control)的ROC 曲線;C: SLE區分所有對照(controls)的ROC 曲線。AUC: ROC 曲線區域下的面積.
圖4.不同SLE患者(A,B,C)外周血白細胞受Sm合成肽混合抗原(Sm peptide cocktail)刺激產生的細胞因子譜比較。Nil及PHA(植物血凝素)為自身本底及陽性對照。
圖5. 隨訪SLE患者在使用免疫抑制劑(潑尼松:prednisone)治療過程中外周血白細胞對PHA刺激應答水平的變化。圖示為同一病人的外周血白細胞在用藥前(day 0),使用20mg/d的潑尼松一周(day 7)后,繼續使用10mg/d潑尼松的第30 天,以及使用低劑量5mg/潑尼松的第60 天對PHA刺激產生的各種細胞因子水平。
具體實施方式
    以下結合具體實施例對本發明進行進一步說明,但本發明不僅限于此。
實施例1:體外檢測Sm混合肽抗原刺激患者白細胞產生細胞因子
1. 實驗材料
(1)無菌血培養管:含有30μl生理鹽水(本底對照),30μg Sm 混合肽抗原 (每種Sm合成肽各5μg)及10μg PHA 陽性對照;
(2)細胞因子檢測:可自由選擇商業化的試劑盒。如需同時檢測多種細胞因子,可用本實驗采用的液態芯片技術(Luminex xMAP multiplex beads assay)。如只需檢測單一的細胞因子(如 IL-6)含量,可用ELISA 方法。
2. 實驗步驟
(1)Sm合成肽序列及合成
用于刺激外周血的Sm混合肽抗原包含五條合成肽,由FMOC固相合成方法自動或人工合成,經HPLC分析和純化,抗原純度90%以上。具體氨基酸序列如下:
Sm1: RGNNIRYFILPDSLPLDTLL              Sm2 :SHETVTIELKNGTQVHGTIT   
Sm3:GVDVSMNTHLKAVKMT        Sm4:TVGKSSKMLQHIDYRMRCI   
Sm5: PMGIPPGRGTPMGMPPPGM             
(2)血培養:如圖1所示,外周肝素抗凝血各1 ml加入三種分別含有30μl生理鹽水(空白對照管),6×5μg Sm 混合合成肽及10μg 絲裂原植物血凝素(PHA)的無菌管,經充分混勻后放入37℃溫箱孵育20-24小時(過夜)。
(3)細胞因子檢測:第二天取出離心(3000轉 10分鐘)分離血漿,然后采用液態芯片技術同時檢測血漿中的多種細胞因子 或用ELISA 檢測單一的細胞因子(e.g. IL-6)含量。
3. 結果計算及判定
細胞因子釋放水平 = 細胞因子含量(抗原或陽性對照)- 細胞因子含量(自身本底對照)
(1)分析待檢血對Sm混合肽刺激產生的IL-6的水平,用以實驗診斷SLE:若待檢者受Sm混合肽刺激產生的IL-6 ≥ 2000pg/ml, 結果為SLE陽性,反之為陰性。
(2)如果陽性對照管產生的IL-6低于1000 pg/ml, 表明病人處于中度或高度免疫抑制狀態(如使用高劑量的免疫抑制劑),試驗結果為不可判定,須待患者細胞免疫功能恢復到一定水平(陽性對照管產生的IL-6≥ 1000 pg/ml)后再重新進行檢測。
實施例2:細胞免疫應答檢測方法對SLE的實驗診斷
對應用Sm混合肽刺激T細胞產生IL-6水平用于診斷SLE的方法進行臨床驗證,分別檢測了41例SLE 患者,61例疾病對照者(其中包括類風濕性關節炎10例,干燥綜合征7例,硬皮病6例,混合結締組織病6例,其它疾病32例)及健康對照41例。結果見圖2。以產生IL-6 2000pg/ml作為診斷陽性的界值(圖2中虛線),顯示該法對SLE的診斷敏感性為73%,特異性為92%。
采用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,簡稱ROC曲線)評估該法的診斷價值,以ROC 曲線下方區域面積(AUC)為參考指標,圖3顯示SLE對疾病對照(disease control),健康對照(healthy control), 及綜合兩對照的AUC分別為0.86,0.94 及0.90, 表明該法對SLE具有較高的臨床診斷價值。
實施例3: SLE患者經Sm混合肽刺激產生的細胞因子譜存在明顯個體差異
借助液態芯片技術同時檢測培養血上清液中的七種細胞因子,結果表明不同SLE患者的免疫細胞經Sm混合肽抗原(Sm peptide cocktail)刺激后產生的細胞因子譜存在明顯個體差異。以圖4所示的3位SLE病人為例:SLE病人A產生的炎癥性細胞因子以IL-6及IL-1β為主,病人B主要以IL-6及TNF-α為主,而病人C僅以 IL-6為主導。該結果同時也反映了同一細胞因子在不同狼瘡患者的病理炎癥發展中所起的作用可能不同。因此,分析SLE患者的免疫細胞在該疾病特異的Sm抗原刺激實驗中產生的細胞因子譜,臨床醫生可對其中占主導地位的細胞因子進行針對性地抑制,這樣在選擇細胞因子拮抗劑治療病理炎癥時就有了科學實驗依據,從而避免盲目用藥,優化治療效果。另外,檢測的細胞因子類型可根據臨床需要進行變換,以便為SLE 的個體化治療提供指引。 
本實驗表明通過分析SLE患者外周全血受Sm混合肽刺激產生的細胞因子譜,可為病人進行細胞因子拮抗劑的個體化治療時提供實驗參考。
實施例4:外周血白細胞對PHA刺激的應答能力反映臨床免疫抑制水平
SLE患者在使用免疫抑制劑(如潑尼松:prednisone)治療過程中,其外周血白細胞對PHA刺激產生的細胞因子水平出現顯著波動。以圖5中隨訪的一位SLE患者為例,用藥前(day 0),該病人的外周血白細胞在對PHA刺激應答水平很高,伴隨大劑量潑尼松(20mg/天)的使用,一周(day 7)后,其對PHA刺激應答水平明顯下降,再隨著相對高劑量(10mg/天)潑尼松的繼續使用,在第30 天,出現了顯著的細胞免疫功能抑制,表現為對PHA刺激應答的無反應。隨后及時減低潑尼松劑量至5mg/天,在隨訪的第60 天,對PHA刺激應答開始有所反應(IL-6首先開始回升),表明細胞免疫功能開始恢復。以上結果表明隨著治療狼瘡炎癥的免疫抑制劑使用的增加和持續,機體正常淋巴細胞功能(對PHA的刺激應該有強烈的免疫反應)出現明顯的抑制,說明發生繼發感染等副作用的機會在增加。而在使用低劑量免疫抑制劑一段時間后,正常淋巴細胞功能逐漸回升。因此臨床醫生應根據病人體征,以及對絲裂原刺激的免疫應答能力,對后續免疫抑制治療的安全性進行評估,及時作出調整劑量的決定,以減少藥物副作用,提高療效。
本實驗說明分析SLE 患者外周全血對絲裂原刺激產生的細胞因子水平可以監控病人的免疫功能狀態。 
SEQUENCE LISTING
 
<110>  陳仁奮
 
<120>  新型的特異性細胞免疫應答體外檢測方法及其臨床應用
 
<130>  2014
 
<160>  5    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  20
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<400>  1
 
Arg Gly Asn Asn Ile Arg Tyr Phe Ile Leu Pro Asp Ser Leu Pro Leu
1               5                   10                  15     
 
 
Asp Thr Leu Leu
            20 
 
 
<210>  2
<211>  20
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<400>  2
 
Ser His Glu Thr Val Thr Ile Glu Leu Lys Asn Gly Thr Gln Val His
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            20 
 
 
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<211>  16
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<213>  人工序列
 
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<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<400>  4
 
Thr Val Gly Lys Ser Ser Lys Met Leu Gln His Ile Asp Tyr Arg Met
1               5                   10                  15     
 
 
Arg Cys Ile
           
 
 
<210>  5
<211>  19
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<400>  5
 
Pro Met Gly Ile Pro Pro Gly Arg Gly Thr Pro Met Gly Met Pro Pro
1               5                   10                  15     
 
 
Pro Gly Met
           
 
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