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一種納米金免疫層析毛細管的制備方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201410112602.6

申請日:

2014.03.25

公開號:

CN103983769A

公開日:

2014.08.13

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):G01N 33/543申請日:20140325|||公開
IPC分類號: G01N33/543 主分類號: G01N33/543
申請人: 中國海洋大學
發明人: 曹立民; 杜淑媛; 隋建新; 林洪; 王靜雪
地址: 266100 山東省青島市嶗山區松嶺路238號
優先權:
專利代理機構: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109 代理人: 尉偉敏
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410112602.6

授權公告號:

||||||

法律狀態公告日:

2015.11.18|||2014.09.10|||2014.08.13

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種納米金免疫層析毛細管的制備方法,利用化學鍵交聯的方法對毛細玻璃管內壁進行修飾,將質控區和檢測區固定在毛細管內壁的特定區域,組裝了一種新型的免疫層析毛細管。本發明以玻璃材質的毛細管為基底,較硝酸纖維素膜、紙質材料和線性材料更穩定,基底材料更穩固不易脫落,更不易受環境因素的影響,可以顯著地減少批間和批內差異,組裝過程相對簡單,且組裝過程中不需要使用大型儀器,修飾、組裝技術簡單易掌握。

權利要求書

權利要求書
1.  一種納米金免疫層析毛細管的制備方法,其特征在于,包括如下步驟:
(1)毛細管的處理:將毛細管浸入piranha溶液中超聲清洗15-20min,超純水清洗至中性,干燥,冷卻,然后將毛細管依次浸入KOH溶液、超純水、HCl溶液、超純水及有機溶劑中分別超聲清洗10-15min,然后烘干;
(2)毛細管的修飾:將GPTMS和三乙胺溶于無水甲苯中得修飾液,使得GPTMS的終濃度為8vol%-15vol%,三乙胺的終濃度為1vol%-2vol%,將步驟(1)處理所得毛細管浸沒于修飾液中室溫下干燥環境中反應18h-25h,排出毛細管內的修飾液,室溫下干燥環境中保持2-3h,然后將毛細管浸入無水甲苯中上下抽動清洗5-7min,接著將毛細管浸入丙酮中上下抽動清洗5-7min,氮氣氣氛下干燥;
(3)免疫層析毛細管的組裝:將作為檢測區的抗原和作為質控區的二抗分別注入步驟(2)處理得到的毛細管的兩端,25-30℃下固定1.5-2.5 h,將毛細管浸入于PBST緩沖液中抽動清洗3-5min,重復清洗三次,1-2wt%的BSA溶液注滿毛細管,在30-37℃下反應1.5-2h,將毛細管浸入于PBST緩沖液中抽動清洗3-5min,重復清洗三次,干燥后獲得免疫層析毛細管。

2.  根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于:步驟(1)中的有機溶劑為丙酮或乙醇。

3.  根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于:步驟(1)中所述piranha溶液的制備方法為:95 wt %-98wt%濃硫酸與30wt%雙氧水按照3-4:1的體積比混合,混合時將雙氧水溶液緩慢加入濃硫酸中,不斷攪拌以保持混合液的溫度在80℃以下。

4.  根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于:步驟(1)中KOH溶液濃度為0.8-1.2mol/L,HCl溶液濃度為0.8-1.2mol/L。

5.  根據權利要求1或2或3或4所述的制備方法,其特征在于:步驟(2)無水甲苯的制備方法為:甲苯中加入無水硫酸鈉靜置10-24h,抽濾除去無水硫酸鈉,然后加入金屬鈉絲,同時加入二苯甲酮作為指示劑,加熱回流2-3h,然后常壓蒸餾,收集111±1℃的餾分得無水甲苯。

6.  根據權利要求5所述的制備方法,其特征在于:無水硫酸鈉用量為5-10g/100mL甲苯,金屬鈉絲用量為0.5-1g/100mL甲苯,二苯甲酮用量為0.1-0.5g/100mL甲苯。

7.  根據權利要求1或2或3或4所述的制備方法,其特征在于:所述抗原為小清蛋白,二抗為羊抗兔二抗。

8.  根據權利要求7所述的制備方法,其特征在于:小清蛋白與PBS緩沖液配制成濃度0.1-0.25 mg/mL的小清蛋白溶液后注入毛細管,羊抗兔二抗與PBS緩沖液配制成濃度0.2-0.3 mg/mL的羊抗兔二抗溶液后注入毛細管。

9.  根據權利要求8所述的組裝方法,其特征在于:小清蛋白溶液注入毛細管的用量為3-6μL,羊抗兔二抗溶液注入毛細管的用量為3-6μL。

說明書

說明書一種納米金免疫層析毛細管的制備方法
技術領域
本發明涉及免疫檢測技術領域,特別涉及一種納米金免疫層析毛細管的制備方法。
背景技術
免疫印跡、酶聯免疫(ELISA)、電化學傳感器和SPR傳感器是近些年新發展起來的快速檢測方法,因其較好的靈敏度、精確度、穩定性和選擇性被用于環境、食品和醫學中危害因子的檢測。但是這些方法操作時間較長,且需要昂貴的儀器和專業的操作技能限制其用于現場的快速檢測,尤其限制其在資源相對缺乏地區的應用。20世紀80年代初期,免疫膠體金層析技術以其靈敏度高、特異性強、操作簡捷、不需要儀器等特點在醫學、環境、食品檢測及農牧業等領域廣泛應用。膠體金免疫層析方法的核心技術是以條狀纖維層析材料為基底通過毛細管作用使金標材料混合物泳動,移動至固定抗原或抗體的區域時,待檢物與金標的結合物被截留,聚集在檢測帶上,可通過肉眼觀察到顯色結果。基于硝酸纖維素膜的高蛋白結合能力和易處理的性質被廣泛用作免疫層析的基底材料。然而,硝酸纖維素膜較薄、韌性小且結構復雜,因而在處理過程中易破碎,且易受環境溫度和濕度的影響進而影響檢測的靈敏度、重復性和貯存壽命(Fu, E.; Liang, T.; Houghtaling, J.; Ramachandran, S.; Ramsey, S. A.; Lutz, B.; Yager, P. Enhanced sensitivity of lateral flow tests using a two-dimensional paper network format. Anal. Chem.2011, 83, 7941-7946)。
近期大家越來越關注新型基底材料的開發,以期提高免疫檢測的靈敏度和穩定性,同時降低實際應用的成本。紙質材料被引入做為ELISA、免疫印跡、斑點金免疫滲濾和電化學發光免疫檢測的基底材料。紙質材料作為基底的檢測方法制備較容易,可裸眼或通過儀器表征其結果。但紙質材料基底結構仍較為復雜且紙質基底較脆組裝過程中易弄碎。另外棉線和尼龍線被引入作為免疫層析的基底,但是線本身質地松散、不均勻、易脫落,因此固定量和邊界很難控制。以SPE柱為反應器的凝膠柱免疫反應將檢測過程引入管中進行,但此種方法組裝和檢測過程復雜。因此,尋找一種穩定的基底,通過簡單的組裝方法設計出一種快速、穩定性、靈敏度好的檢測方法成為目前研究的方向。
發明內容
本發明的目的在于提供一種納米金免疫層析毛細管的制備方法,以玻璃材質的毛細管為基底,較硝酸纖維素膜、紙質材料和線性材料更穩定,基底材料更穩固不易脫落,更不易受環境因素的影響,可以顯著地減少批間和批內差異,組裝過程相對簡單,且組裝過程中不需要使用大型儀器,修飾、組裝技術簡單易掌握。
本發明解決其技術問題所采用的技術方案是: 
一種納米金免疫層析毛細管的制備方法,包括如下步驟:
(1)毛細管的處理:將毛細管浸入piranha溶液中超聲清洗15-20min,超純水清洗至中性,干燥,冷卻,然后將毛細管依次浸入KOH溶液、超純水、HCl溶液、超純水及有機溶劑中分別超聲清洗10-15min,然后烘干。
利用piranha溶液的強氧化性去除毛細管上的有機殘留物,同時對毛細管的玻璃表面進行羥基化,使得毛細管的玻璃表面上具有親水性。
將毛細管依次浸入KOH溶液、超純水、HCl溶液、超純水及有機溶劑中分別超聲清洗,以進一步用堿、酸清洗玻璃表面去除離子和表面的活性基團,同時穩定玻璃表面上的羥基。
(2)毛細管的修飾:將GPTMS和三乙胺溶于無水甲苯中得修飾液,使得GPTMS的終濃度為8vol%-15vol%,三乙胺的終濃度為1vol%-2vol%,將步驟(1)處理所得毛細管浸沒于修飾液中室溫下干燥環境中反應18h-25h,排出毛細管內的修飾液,室溫下干燥環境中保持2-3h,然后將毛細管浸入無水甲苯中上下抽動清洗5-7min,接著將毛細管浸入丙酮中上下抽動清洗5-7min,氮氣氣氛下干燥。
    GPTMS(3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷)含有豐富的環氧基團,通過修飾液處理,將GPTMS的環氧基團固定在毛細管的內壁。排出毛細管內的修飾液,室溫下干燥環境中保持2-3h,是為了毛細管內壁上固定的基團更穩定,以保證檢測時的穩定性。
(3)免疫層析毛細管的組裝:將作為檢測區的抗原和作為質控區的二抗分別注入步驟(2)處理得到的毛細管的兩端,25-30℃下固定1.5-2.5 h,將毛細管浸入于PBST緩沖液中抽動清洗3-5min,重復清洗三次,1-2wt%的BSA溶液注滿毛細管,在30-37℃下反應1.5-2h,將毛細管浸入于PBST緩沖液中抽動清洗3-5min,重復清洗三次,干燥后獲得免疫層析毛細管。
作為檢測區的抗原是能與膠體金標記的一抗特異性結合的抗原,作為質控區的二抗是能與膠體金標記的一抗特異性結合的抗體。本方法可以用于多種抗原-一抗-二抗對應物的檢測。
1-2wt%的BSA溶液注滿毛細管,在30-37℃下反應1.5-2h,以封閉毛細管內壁上沒有連接蛋白的非特異性位點。
玻璃材質具有很多適合作為基底的優點,如廉價、表面均一光滑、無滲透、耐高溫、能承受高離子強度漂洗、熒光背景低和樣品使用量少等優點。
本發明針對傳統免疫層析材料的不足和玻璃材質自身的優點,利用玻璃毛細管為層析反應器,將膠體金免疫層析檢測方法成功轉移至毛細管中,建立了一種新型毛細管免疫層析方法。將二抗和抗原固定在特定區域為質控區和檢測區,應用直接競爭的方法組裝了免疫層析毛細管。
作為優選,步驟(1)中的有機溶劑為丙酮或乙醇。
作為優選,步驟(1)中所述piranha溶液的制備方法為:95 wt %-98wt%濃硫酸與30wt%雙氧水按照3-4:1的體積比混合,混合時將雙氧水溶液緩慢加入濃硫酸中,不斷攪拌以保持混合液的溫度在80℃以下。
作為優選,步驟(1)中KOH溶液濃度為0.8-1.2mol/L,HCl溶液濃度為0.8-1.2mol/L。
作為優選,步驟(2)無水甲苯的制備方法為:甲苯中加入無水硫酸鈉靜置10-24h,抽濾除去無水硫酸鈉,然后加入金屬鈉絲,同時加入二苯甲酮作為指示劑,加熱回流2-3h,然后常壓蒸餾,收集111±1℃的餾分得無水甲苯。
作為優選,無水硫酸鈉用量為5-10g/100mL甲苯,金屬鈉絲用量為0.5-1g/100mL甲苯,二苯甲酮用量為0.1-0.5g/100mL甲苯。
作為優選,所述抗原為小清蛋白,二抗為羊抗兔二抗。針對不同的檢測物,可以選擇其它不同的抗原、二抗。抗原為小清蛋白,二抗為羊抗兔二抗是針對小清蛋白的檢測而設計的,用于與被檢測物(小清蛋白)混合的一抗:為保證檢測結果的精確和穩定性選用單克隆抗體,可以選擇兔抗小清蛋白,鼠抗小清蛋白等,對應的二抗可以選擇羊抗兔或者羊抗鼠、兔抗鼠等二抗。
作為優選,小清蛋白與PBS緩沖液配制成濃度0.1-0.25 mg/mL的小清蛋白溶液后注入毛細管,羊抗兔二抗與PBS緩沖液配制成濃度0.2-0.3 mg/mL的羊抗兔二抗溶液后注入毛細管。
作為優選,小清蛋白溶液注入毛細管的用量為3-6μL,羊抗兔二抗溶液注入毛細管的用量為3-6μL。
本發明的有益效果是: 
1、首次采用毛細管為免疫層析的反應器,將質控區和檢測區固定在剛性的玻璃基底上,避免了傳統基地材料如硝酸纖維素膜因材質復雜而引起的拖帶、穩定性和重復性差的缺點。
2、以玻璃材質為基底較硝酸纖維素膜、紙質材料和線性材料更穩定,基底材料更穩固不易脫落,更不易受環境因素的影響,可以顯著地減少批間和批內差異。
3、以毛細管為免疫層析反應的容器,由于其微小的管徑可以減少樣品的使用量,十幾微升甚至幾微升的樣品即可完成檢測。
4、以毛細管為免疫層析反應的容器,由于其可控的長度可以方便設計多殘留的檢測。
5、組裝過程相對簡單,且組裝過程中不需要使用大型儀器,修飾、組裝技術簡單易掌握。
6、使用GPTMS作為將二抗和抗原固定在毛細管內壁上的交聯劑,由于其末端的環氧基團提高了蛋白質的結合能力,并同時盡可能地保持了抗原抗體的活性。
7、以固定在質控區和檢測區上的二抗和抗原為固定相,結合檢測混合液中的目標待測物-金標一抗結合物,使其聚集在特定的區域,以肉眼辨別其結果。
8、使用毛細管作為免疫層析的反應容器成本較低,且材質較均一,利于較長時間儲藏。
9、采用本發明制成的免疫層析毛細管可根據實際檢測需要進行質控區和檢測區的組裝,從而實現對危害因子的快速、可視化檢測。
 
附圖說明
圖1是本發明免疫層析毛細管的組裝流程圖,圖中a、毛細管的清洗;b、環氧基團的修飾;c、抗原和二抗的固定;d、非特異位點的封閉。
圖2是本發明免疫層析毛細管的組裝效果。
圖3是免疫層析毛細管對小清蛋白檢測結果的掃描圖片,兩端分別為控制區和檢測區,小清蛋白的濃度為從0到106 ng/mL。
具體實施方式
下面通過具體實施例,并結合附圖,對本發明的技術方案作進一步的具體說明。
本發明中,若非特指,所采用的原料和設備等均可從市場購得或是本領域常用的。下述實施例中的方法,如無特別說明,均為本領域的常規方法。
1、儀器和試劑
HP Scanjet G4050掃描儀     中國惠普有限公司  
超聲清洗儀KQ 5200B      昆山市超聲儀器有限公司
分析天平  北京賽多利斯儀器系統有限公司
MS1 Minshaker渦旋振蕩器           IKA公司
電熱恒溫鼓風干燥箱     上海精宏實驗設備有限公司
自動超純水儀(Ro DI digital)     北京康銘泰克科技發展有限公司
pHs-3C 型pH計     上海偉業儀器廠
蛋白A柱        GE Healthare
毛細管(d=0.9mm)華西醫科大學儀器廠
氯金酸(HAuCl4) 中國國藥集團
兔抗小清蛋白     華大蛋白提供
羊抗兔二抗       北京中杉金橋生物技術有限公司
3-glycidyloxypropyltrimethoxysilane (GPTMS)   Sigma試劑公司
BSA (牛血清白蛋白)索萊寶生物科技有限公司
三乙胺         中國國藥集團
Tris-HCL        Solarbio公司。
 
2、免疫層析毛細管的組裝
實施例1:
(1)毛細管的處理:
piranha溶液的配制:95 wt %濃硫酸與30wt%雙氧水按照4:1的體積比混合,混合時將雙氧水溶液緩慢加入濃硫酸中,不斷攪拌以保持混合液的溫度在80℃以下。
將毛細管迅速浸入上述熱的piranha溶液中超聲清洗15min,超純水清洗至中性,105℃的烘箱中干燥2h,冷卻,然后將毛細管依次浸入濃度為0.8mol/L的KOH溶液(200mL)、超純水(200mL,中間更換兩次)、濃度為0.8mol/L的HCl溶液(200mL)、超純水(200mL,中間更換兩次)及丙酮(200mL)中分別超聲清洗15min,然后在105℃的烘箱中干燥1h以上,以完全出去水分。
(2)毛細管的修飾:
無水甲苯的制備:300mL甲苯(分析純)中加入15 g無水硫酸鈉靜置10h,抽濾除去無水硫酸鈉,然后加入2g金屬鈉絲,同時加入0.5g二苯甲酮作為指示劑,將回流裝置中的空氣用氮氣置換,加熱回流2h,使溶液變藍;停止加熱,改為蒸餾裝置,然后常壓蒸餾,收集111±1℃的餾分得無水甲苯。
將GPTMS和三乙胺溶于無水甲苯中得修飾液,使得GPTMS的終濃度為8vol%,三乙胺的終濃度為1vol%,將步驟(1)處理所得毛細管浸沒于修飾液中室溫下干燥環境中反應25h,排出毛細管內的修飾液,室溫下干燥環境中保持2h,然后將毛細管浸入無水甲苯中上下抽動清洗5min,接著將毛細管浸入丙酮中上下抽動清洗5min,氮氣氣氛下干燥。
(3)免疫層析毛細管的組裝:
將作為檢測區的抗原(濃度0.1mg/mL的小清蛋白溶液,小清蛋白與PBS緩沖液(PH7.4,0.01mol/L)配制而成)和作為質控區的二抗(濃度0.2mg/mL的羊抗兔二抗溶液,羊抗兔二抗與PBS緩沖液(PH7.4,0.01mol/L)配制而成)分別注入步驟(2)處理得到的毛細管的兩端,小清蛋白溶液注入毛細管的用量為6μL,羊抗兔二抗溶液注入毛細管的用量為6μL,25℃下固定2.5 h,將毛細管浸入于PBST緩沖液(PH7.4)中抽動清洗3min,重復清洗三次,1wt%的BSA溶液(BSA與PBS緩沖液(PH7.4,0.01mol/L)配制而成)注滿毛細管,在30℃下反應2h,將毛細管浸入于PBST緩沖液中抽動清洗3min,重復清洗三次,干燥后獲得免疫層析毛細管。
 
實施例2:
(1)毛細管的處理:
piranha溶液的配制:98wt%濃硫酸與30wt%雙氧水按照3:1的體積比混合,混合時將雙氧水溶液緩慢加入濃硫酸中,不斷攪拌以保持混合液的溫度在80℃以下。
將毛細管迅速浸入上述熱的piranha溶液中超聲清洗20min,超純水清洗至中性,105℃的烘箱中干燥1h,冷卻,然后將毛細管依次浸入濃度為1.2mol/L的KOH溶液(200mL)、超純水(200mL,中間更換兩次)、濃度為1.2mol/L的HCl溶液(200mL)、超純水(200mL,中間更換兩次)及乙醇(200mL)中分別超聲清洗15min,然后在105℃的烘箱中干燥1h以上,以完全除去水分。
(2)毛細管的修飾:
無水甲苯的制備:300mL甲苯(分析純)中加入30 g無水硫酸鈉靜置24h,抽濾除去無水硫酸鈉,然后加入1.5g金屬鈉絲,同時加入1.5g二苯甲酮作為指示劑,將回流裝置中的空氣用氮氣置換,加熱回流3h,使溶液變藍;停止加熱,改為蒸餾裝置,然后常壓蒸餾,收集111±1℃的餾分得無水甲苯。
將GPTMS和三乙胺溶于無水甲苯中得修飾液,使得GPTMS的終濃度為15vol%,三乙胺的終濃度為2vol%,將步驟(1)處理所得毛細管浸沒于修飾液中室溫下干燥環境中反應18h,排出毛細管內的修飾液,室溫下干燥環境中保持3h,然后將毛細管浸入無水甲苯中上下抽動清洗7min,接著將毛細管浸入丙酮中上下抽動清洗7min,氮氣氣氛下干燥。
(3)免疫層析毛細管的組裝:
將作為檢測區的抗原(濃度0.25 mg/mL的小清蛋白溶液,小清蛋白與PBS緩沖液(PH7.4,0.01mol/L)配制而成)和作為質控區的二抗(濃度0.3 mg/mL的羊抗兔二抗溶液,羊抗兔二抗與PBS緩沖液(PH7.4,0.01mol/L)配制而成)分別注入步驟(2)處理得到的毛細管的兩端,小清蛋白溶液注入毛細管的用量為3μL,羊抗兔二抗溶液注入毛細管的用量為3μL,30℃下固定1.5h,將毛細管浸入于PBST緩沖液(PH7.4)中抽動清洗5min,重復清洗三次, 2wt%的BSA溶液注滿毛細管,在37℃下反應1.5h,將毛細管浸入于PBST緩沖液中抽動清洗5min,重復清洗三次,干燥后獲得免疫層析毛細管。
 
實施例3:
(1)毛細管的處理:
piranha溶液的配制: 98wt%濃硫酸與30wt%雙氧水按照3:1的體積比混合,混合時將雙氧水溶液緩慢加入濃硫酸中,不斷攪拌以保持混合液的溫度在80℃以下。
將毛細管迅速浸入上述熱的piranha溶液中超聲清洗18min,超純水清洗至中性,105℃的烘箱中干燥3h,冷卻,然后將毛細管依次浸入濃度為1mol/L的KOH溶液(200mL)、超純水(200mL,中間更換兩次)、濃度為1mol/L的HCl溶液(200mL)、超純水(200mL,中間更換兩次)及丙酮(200mL)中分別超聲清洗12min,然后在105℃的烘箱中干燥1h以上,以完全除去水分。
(2)毛細管的修飾:
無水甲苯的制備:300mL甲苯(分析純)中加入20 g無水硫酸鈉靜置18h,抽濾除去無水硫酸鈉,然后加入1.5g金屬鈉絲,同時加入1g二苯甲酮作為指示劑,將回流裝置中的空氣用氮氣置換,加熱回流2.5h,使溶液變藍;停止加熱,改為蒸餾裝置,然后常壓蒸餾,收集111±1℃的餾分得無水甲苯。
將GPTMS和三乙胺溶于無水甲苯中得修飾液,使得GPTMS的終濃度為10vol%,三乙胺的終濃度為1.5vol%,將步驟(1)處理所得毛細管浸沒于修飾液中室溫下干燥環境中反應20h,排出毛細管內的修飾液,室溫下干燥環境中保持2.5h,然后將毛細管浸入無水甲苯中上下抽動清洗6min,接著將毛細管浸入丙酮中上下抽動清洗6min,氮氣氣氛下干燥。
(3)免疫層析毛細管的組裝:
將作為檢測區的抗原(濃度0.2 mg/mL的小清蛋白溶液,小清蛋白與PBS緩沖液(PH7.4,0.01mol/L)配制而成)和作為質控區的二抗(濃度0.3 mg/mL的羊抗兔二抗溶液,羊抗兔二抗與PBS緩沖液(PH7.4,0.01mol/L)配制而成)分別注入步驟(2)處理得到的毛細管的兩端,小清蛋白溶液注入毛細管的用量為4μL,羊抗兔二抗溶液注入毛細管的用量為4μL,28℃下固定2 h,將毛細管浸入于PBST緩沖液(PH7.4)中抽動清洗4min,重復清洗三次,1.5wt%的BSA溶液注滿毛細管,在32℃下反應1.8h,將毛細管浸入于PBST緩沖液中抽動清洗4min,重復清洗三次,干燥后獲得免疫層析毛細管。
毛細管的清洗、管內壁的修飾及質控區和檢測區的組裝過程如圖1所示。通過piranha溶液、KOH及HCl溶液的清洗使毛細管內壁上固定上穩定的羥基基團。GPTMS為毛細管內壁連結上豐富的環氧基基團,環氧基相比較于氨基和羧基提供更優異的蛋白質固定基團,并能盡可能的保證蛋白質的活性。GPTMS將二抗和抗原固定在特定區域作為質控區和檢測區,BSA將沒有連結二抗、抗原的非特異性位點環氧基團進行封閉。至此,免疫層析毛細管的組裝過程結束,4℃下儲存備用。
免疫層析毛細管的具體組裝效果如圖2,當金標一抗和待檢測物同時進入免疫層析毛細管進行免疫反應后,通過顏色現象分析其測試結果。a為固定好質控區和檢測區的免疫層析毛細管;b為對陰性樣品的檢測,當進入免疫層析毛細管的混合液中沒有待測物時,金標一抗和檢測區上固定的抗原結合,當到達質控區時同樣和管壁上的二抗結合,因此可以同時在檢測區和質控區看到由于金標一抗聚集呈現兩條紅色;c為對陽性樣品的檢測,由于待測樣品中的抗原與免疫層析毛細管檢測區上固定的抗原與金標一抗發生競爭性結合,因此金標一抗就無法或者只有少量能結合到檢測區上固定的抗原,因此,檢測區的顏色相對質控區明顯減弱或者完全沒有顏色,只出現金標一抗聚集在質控區的一條紅色區域。
 
3、毛細管檢測條件的優化
設置了一系列的環氧基硅烷(GPTMS)修飾時間實驗,結果表明隨著固定時間的延長,免疫反應后顯色逐漸加深,當固定時間超過18h后顯色深度逐漸不發生變化,且隨著時間的增長管內壁上開始出現固定不均勻的情況,因此修飾時間確定為18h-25h。
對修飾液的比例進行選擇,將GPTMS配置成一系列濃度的混合液(5 vol %-25 vol %),把前處理過的毛細管浸入此混合液中固定18h。免疫反應后可以觀察到當GPTMS的濃度達到8vol%-15vol%后,隨著GPTMS濃度的增大,顏色深度將不再增加。因此,在本發明中GPTMS的濃度選為8vol%-15vol%。
封閉液和封閉時間的選擇,配置成一系列濃度的BSA溶液(0.5%,1%,1.5%,2%,2.5%,3%,4%,5%),對固定有質控區、檢測區的毛細管進行不同時間的封閉:1h, 1.5h, 2h, 2.5h, 3h。以質控區和陰性樣品的檢測區邊界清晰,對陽性檢測完全沒有顏色為標準,最終選擇的封閉液的濃度為1%-2%,封閉時間為1.5-2h。
質控區和檢測區固定二抗和抗原濃度的選擇:將二抗和抗原的濃度分別稀釋為0.1-0.5 mg/mL,檢測陰性樣品時質控區和檢測區的顏色基本相同,陽性樣品時檢測區完全沒有顏色,同時保證兩者的用量最小及盡量低的檢測限。經過優化后固定二抗的濃度約為0.2-0.3 mg/mL,抗原的濃度約為0.1-0.25 mg/mL。
4、對小清蛋白的檢測
4.1膠體金標記的一抗(金標一抗)的制備
膠體金的制備:將實驗中用到的玻璃儀器和轉子等在新配置的王水(HCl:HNO3=3:1)中至少浸泡15min,然后依次用大量的去離子水沖洗干凈,100℃以上干燥。向雙頸瓶中加入100mL 1mM HAuCl4,在冷凝條件下使用磁力攪拌器攪拌下均勻加熱。充分沸騰后,快速加入10mL 38.8mM 檸檬酸鈉溶液,溶液的顏色會發生快速的變化,其順序應為:淡黃色→無色→黑色→紫色→深紅色。繼續加熱回流15-20min后停止加熱,持續攪拌使反應系統自然冷卻至室溫。將冷卻好的溶液過孔徑為0.45μm的醋酸濾膜。制備好的納米金溶液4℃條件下避光保存。
膠體金標記的一抗的制備:使用蛋白A柱對兔抗小清蛋白(一抗)進行純化,3000g離心15min除去沉淀。0.1M的K2CO3將上述納米金溶液調至pH 8.2,緩慢加入兔抗小清蛋白至終濃度為20μg/mL,緩慢均勻攪拌2h,接下來加入10wt% BSA至終濃度為1 wt %,以及 1 wt % 的聚乙二醇(PEG20000)至最終體積的1/10,繼續攪拌30min封閉納米金粒子上的非特異性位點。然后2500 g 離心15 min除去聚集的沉淀, 10000 g 離心1h 收集沉淀,將沉淀復溶于pH8.2的含有1wt% BSA和0.02 wt % NaN3的Tris-HCl緩沖液,復溶至原體積(納米金溶液的體積)的1/10得金標兔抗小清蛋白(膠體金標記的一抗),4℃保存。
4.2小清蛋白提取
稱取從佳世客超市(青島)中購買的大菱鲆魚糜制品,與Tris-HCl(pH 7.5)以1:2(w/v)混合勻漿,將勻漿后的樣品過濾后,98℃下水浴加熱5min,最后3800g離心5min,收集上清(小清蛋白溶液)進行測試。
4.3樣品檢測
將4.1節制備好的金標兔抗小清蛋白與4.2節方法提取純化后的小清蛋白溶液按1:1的體積比混合混勻。取5μL的前述混合液從檢測區端注入免疫層析毛細管,靜置4min后用移液器推動混合液向下移動流經至毛細免疫層析管的質控區,同樣在此區停留4min,將多余的混合液排出毛細管,然后用PBST(pH7.4)注滿全管后甩出清洗,重復此清洗步驟三次。通過裸眼定性獲得檢測結果。     
用本發明組裝的免疫層析毛細管對待測樣品進行檢測,免疫反應后通過觀察質控區和檢測區的顏色判定結果。當兩部分均呈現紅色且顏色幾乎相同時為陰性結果;只有質控區呈現紅色,檢測區為無色或者是檢測區的顏色比質控區淺時為陽性結果;質控區未呈現紅色的免疫層析毛細管為失效。
將制備好的免疫層析毛細管用于陰性樣品的檢測,在反應之初質控區和檢測區的顏色隨著顯色時間的增加而加深,4min后顏色的深淺基本上不發生變化,說明金標一抗已穩定結合在管壁上,因此顯色時間為4min。
4.4不同濃度小清蛋白的檢測
按照4.2節的方法獲得小清蛋白溶液,用考馬斯亮藍法(現有常規方法)測定小清蛋白的濃度,然后用PBS( PH7.4,0.01mol/L)將小清蛋白配置成一系列濃度梯度的溶液,金標兔抗小清蛋白一抗與不同濃度的小清蛋白溶液按1:1的體積比混合混勻,取5μL的前述混合液從檢測區端注入免疫層析毛細管,靜置4min后用移液器推動混合液向下移動流經至毛細免疫層析管的質控區,同樣在此區停留4min,將多余的混合液排出毛細管,然后用PBST(pH7.4)注滿全管后甩出清洗,重復此清洗步驟三次,觀察顯色情況。其結果如圖3所示,當小清蛋白的濃度升高至70ng/mL時檢測區的顏色明顯弱于質控區的顏色,當濃度繼續升高時顏色越來越淺,因此本發明的免疫層析毛細管的視覺檢測限為70ng/mL,即當小清蛋白的濃度高于70ng/mL檢測區的顏色明顯弱于質控區或檢測區無顏色為陽性,反之為陰性。此檢測限顯著低于對魚過敏的消費者的最低預期值5 mg/kg。
4.5毛細層析管的穩定性和重復性
將同一批次制備的毛細層析管4 ℃條件下分別儲存2, 4, 8 天,和2, 4 周,進行陰性樣本檢測,其檢測區和控制區的顏色均沒有顯著變化,說明儲存穩定性良好。原因可能是由于玻璃毛細管可以有效的保護檢測區不被環境的溫度、濕度、氧氣和光線所破壞。小清蛋白通過環氧基團共價固定在檢測區,此共價結合力明顯牢固于傳統的電子吸引力和疏水作用力,因此增強了檢測的穩定性。
 
以上所述的實施例只是本發明的一種較佳的方案,并非對本發明作任何形式上的限制,在不超出權利要求所記載的技術方案的前提下還有其它的變體及改型。

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一種 納米 免疫 層析 毛細管 制備 方法
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