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抗人B7H4單克隆抗體及其制備和應用.pdf

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抗人 B7H4 單克隆抗體 及其 制備 應用
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摘要
申請專利號:

CN201410121768.4

申請日:

2014.03.28

公開號:

CN103981150A

公開日:

2014.08.13

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 5/20申請日:20140328|||公開
IPC分類號: C12N5/20; C07K16/18; G01N33/577; G01N33/574; A61K39/395; A61P35/00; C12R1/91(2006.01)N 主分類號: C12N5/20
申請人: 蘇州大學
發明人: 張學光; 虞培娟; 傅豐慶; 張光波
地址: 215123 江蘇省蘇州市蘇州工業園區仁愛路199號
優先權:
專利代理機構: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103 代理人: 陶海鋒
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410121768.4

授權公告號:

||||||

法律狀態公告日:

2016.06.01|||2014.09.10|||2014.08.13

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了抗人B7-H4單克隆抗體及其制備和應用,具體涉及一種單克隆抗體,所述單克隆抗體由雜交瘤細胞株為保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)的保藏編號為CGMCCNo.8788的雜交瘤細胞株產生;本發明所述抗人B7-H4單克隆抗體2B7識別不同腫瘤細胞株表面B7-H4分子的表達,可作為生物學檢測指標應用在腫瘤細胞檢測中;并且,通過體外實驗發現,本發明所述抗人B7-H4單克隆抗體2B7能阻斷B7-H4分子對T細胞增殖的抑制效應。

權利要求書

權利要求書
1.  一種雜交瘤細胞株,所述雜交瘤細胞株為分泌小鼠抗人B7-H4分子單克隆抗體雜交瘤細胞株2B7,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,其簡稱為CGMCC,保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號,保藏日期是2014年2月19日,保藏編號為CGMCC No.8788。

2.  一種抗人B7-H4 單克隆抗體,其特征在于,所述抗人B7-H4 單克隆抗體為保藏編號CGMCC No.8788的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體。

3.  權利要求2所述抗人B7-H4單克隆抗體在制備用于腫瘤細胞檢測的藥物中應用。

4.  權利要求2所述抗人B7-H4單克隆抗體在制備阻斷B7-H4分子對T細胞增殖抑制的藥物中的應用。

說明書

說明書抗人B7-H4單克隆抗體及其制備和應用
技術領域
本發明涉及一種單克隆抗體,具體涉及抗人B7-H4單克隆抗體及其制備方法,以及所述單克隆抗體在阻斷B7-H4分子抑制T細胞增殖中的應用。 
背景技術
T細胞活化需要雙信號。第一信號是由T細胞特異性受體TCR識別APC細胞表面MHC復合物,第二信號是由共刺激分子與相應的配體或受體結合而產生。缺乏共刺激信號會導致T細胞無能。B7家族是經典的共刺激信號提供者,成員包括CD80、CD86與他們的配體CD28、CTL-4,在T細胞的活化過程中提供正向或負向的信號。最近,一些B7家族的同源物被鑒定,包括B7-H1、B7-DC、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6。B7-H4也稱為B7X或B7S1,是最新發現的新成員之一,廣泛表達在人類正常組織和細胞上,通過抑制T細胞增殖、活化、減少細胞因子分泌和阻滯細胞周期來調節適應性免疫應答,同時也通過抑制中性粒細胞前體細胞的生長調節固有免疫。B7-H4高表達于各種腫瘤組織,被視為預后不良指標。因此,B7-H4成為研究分子免疫調節的新熱點,有助于打破腫瘤微環境中的負性免疫網絡。 
B7-H4為I型跨膜蛋白,胞外段與B7家族其他成員有20-30%氨基酸同源性。人鼠B7-H4分子87%的氨基酸序列相同。B7-H4的mRNA廣泛表達在人類的外周組織,如肺、睪丸、胰腺、前列腺、胎盤、尿道、皮膚、肌肉、腸道、胃、腎臟、肝臟、心臟、大腦和卵巢;然而,B7-H4蛋白卻很少表達。B7-H4在結腸癌、前列腺癌、肺癌、纖維肉瘤的惡性腫瘤細胞和卵巢癌、肺癌等組織中被發現。 
在適應性免疫中,B7-H4抑制了CD4 、CD8陽性T細胞活化、增殖,減少了細胞因子IL-2,IFN-γ的分泌,并通過阻滯細胞周期減少CTL的產生。B7-H4在APC上表達也抑制了T細胞的增殖。在體內,利用特異性單克隆抗體阻斷內源性的B7-H4能增強T細胞反應,暗示了B7-H4在T細胞活化中扮演了重要的角色。在急性淋巴細胞減少誘發的自穩性T細胞增殖能促進抗腫瘤免疫,這些細胞B7-H4表達很微弱,與特異性抗B7-H4抗體結合后無抑制作用,并且不能產生IL-10。與野生型小鼠相比,B7-H4敲基因小鼠能輕度增強Th1細胞反應,減少杜氏原蟲的感染,這說明B7-H4能抑制Th1細胞的抗感染作用。然而,缺失B7-H4不影響由Th1或Th2細胞介導的氣道或皮膚的炎癥反應高敏感性。同樣的,B7-H4敲基因小鼠不影響CTL抗病毒作用。這些結果提示了B7-H4可能為負性共刺激分子家族中的一員,共同參與了T細胞免疫的微觀調節。沒有直接的證據證明B7-H4有屏障功能,盡管它在腫瘤細胞表面有不同水平的糖基化,這表明糖基化可能是CTL和腫瘤細胞之間相互作用的潛在機制。B細胞表面的B7-H4的作用并未被研究,然而增強EB病毒感染的B細胞表面B7-H4的表達能增加細胞內ROS的水平,從而誘導Fas配體表達,繼而引發Fas介導的細胞凋亡。研究發現,B7-H4的表達顯著抑制了EB病毒陽性淋巴細胞的生長,主要通過下調CDK4/6,CDK2,細胞周期蛋白E/D的表達、使蛋白激酶和細胞周期蛋白E發生磷酸化和上調P21的表達使細胞周期阻滯在G0-G1期。這些結果說明B7-H4是治療EB病毒陽性淋巴細胞的潛在靶點。這些研究結果表明了B7-H4能抑制B細胞的增殖和活化,誘導其凋亡,使免疫球蛋白的產生減少從而抑制了適應性免疫應答。 
另有研究顯示腫瘤相關性B7-H4+巨噬細胞和CD4+CD25+FOXP3+的調節性T細胞抑制了腫瘤相關抗原特異性T細胞免疫,腫瘤相關巨噬細胞自分泌趨化因子CCL22介導調節性T細胞向腫瘤組織移動,這些調節性T細胞又介導了APC和巨噬細胞表面B7-H4的表達。已有報道稱調節性T細胞能介導巨噬細胞自分泌IL-10、IL-6,這些細胞因子又刺激了巨噬細胞表達B7-H4,這兩個研究表明調節性T細胞可通過B7-H4途徑來抑制APC細胞的活化。 
B7-H4在固有免疫中作用主要通過抑制中性粒細胞的增殖來抑制固有免疫。B7-H4敲基因小鼠比野生型更耐受產單核李斯特菌的感染,暗示了B7-H4在固有免疫中發揮負性效應。進一步研究發現敲基因小鼠外周器官中的中性粒細胞數量多于野生型小鼠,但是殺菌功能沒有變化。體外實驗發現B7-H4抑制骨髓來源中性粒細胞前體細胞的增殖,這暗示了B7-H4負性調節中性粒細胞的增殖。由于固有免疫主要依賴于中性粒細胞,B7-H4又能負向調節中性粒細胞的抗感染免疫,所以B7-H4可以通過抑制中性粒細胞的增殖來抑制固有免疫。 
人類很多腫瘤中,B7-H4在mRNA和蛋白水平上有表達并且與病人的預后呈負相關。正常組織不表達B7-H4蛋白或僅在mRNA水平有表達,腫瘤組織卻過表達B7-H4,這說明與蛋白轉錄過程中的異常調節有關。B7-H4優先表達于人類腦膠質瘤和髓母細胞瘤的未分化細胞和一群CD133+腫瘤干細胞上。在免疫缺陷小鼠中,CD133+的腦膠質瘤細胞比CD133-的具有更強的增殖能力。 
在一些動物模型中發現B7-H4在腫瘤細胞上高表達,能抑制細胞凋亡和刺激腫瘤生長。B7-H4有廣泛而多樣的糖基化,這是腫瘤細胞逃避免疫監視的屏障。在腫瘤的進展中,B7-H4扮演了轉化癌癥前期細胞并使之逃避免疫監視的角色,比如在卵巢癌的免疫缺陷小鼠模型中,高表達B7-H4能刺激腫瘤的形成,主要通過刺激細胞增殖,增加細胞粘附,轉移和侵襲來實現,這說明了B7-H4也許是獨立于免疫之外的直接刺激腫瘤形成的因素。正常上皮細胞過表達B7-H4會導致其惡性轉變,主要是抑制了細胞的凋亡。在體外實驗中,用siRNA干擾B7-H4基因的腫瘤細胞株會加速凋亡。 
在腫瘤微環境中,除了腫瘤細胞,腫瘤浸潤巨噬細胞,小血管的內皮細胞等被發現組成性表達B7-H4。卵巢癌患者腹水中的腫瘤相關巨噬細胞上高表達B7-H4促進了腫瘤的生長。用寡義核苷酸阻滯B7-H4后能使巨噬細胞恢復對T細胞的刺激功能從而使腫瘤衰退。 
最近研究數據發現B7-H4在外周組織中發揮作用負向調節靶器官的免疫應答。B7-H4在mRNA水平廣泛表達但在蛋白水平表達受限,說明B7-H4是在轉錄后受到調控。尋找受體是研究B7-H4功能的熱點和要點,但目前仍存在困難,主要由于受體/配體的低親和力。因此,需要更多的研究致力于B7-H4受體的尋找。鑒于B7-H4高表達于腫瘤組織或腫瘤患者的外周血中,因此通過調控B7-H4或其受體的表達來調節免疫應答將成為免疫治療的新路徑。研究B7-H4的表達類型,也為診斷腫瘤和判斷預后提供有利指標。現有結果都提示B7-H4是個重要的負性協同刺激分子,值得大家的關注和研究;但遺憾的是,自從2003年被發現以來已經過去十余年的時間,人們對B7-H4的了解還只是冰山一角,盡管許多實驗室數據提示B7-H4通過抑制T細胞活化,改變細胞因子分泌和阻滯細胞周期來實現負性調控免疫應答反應,但其中具體的信號機制還尚未清楚,并且B7-H4的受體至今尚未明確。現有技術中抗人B7-H4的單克隆抗體主要有MIH43(美國,BioLegend)和H74(美國,eBioscience)兩種,但他們識別的腫瘤位點較少,無法檢測到B7-H4在腫瘤細胞株上的表達。因此,研制新的B7-H4的單克隆抗體,創造靶向研究工具迫在眉睫。 
發明內容
本發明目的是提供一種抗人B7-H4單克隆抗體以及能產生抗人B7-H4單克隆抗體的雜交瘤細胞株;所述抗人B7-H4單克隆抗體具有新型識別位點,可以用于流式細胞術、免疫印跡技術及免疫組化檢測。 
為達到上述發明目的,本發明采用的技術方案是:一種雜交瘤細胞株,所述雜交瘤細胞株的制備方法包括以下步驟 : 
1)構建高表達人B7-H4分子的轉基因細胞:將 B7-H4基因克隆入真核表達載體,轉染小鼠成纖維細胞293T細胞,構建高表達分子的轉基因細胞293T/B7-H4;用轉基因細胞293T/B7-H4免疫Balb/c小鼠;
2)獲取融合細胞生長克隆:從免疫合格小鼠無菌取其脾細胞作為抗原致敏的B細胞,按常規方法,將B細胞與骨髓瘤細胞SP2/0株融合,然后利用常規的融合細胞HAT篩選方法進行篩選,進而獲取融合細胞生長克隆;
3)應用流式細胞學技術篩選和鑒定后,挑選出具有高抗體分泌水平的雜交瘤細胞株,所述雜交瘤細胞株為保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)的保藏編號為CGMCC No.8788的雜交瘤細胞株2B7。
上述雜交瘤細胞株的保藏信息為:保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC),保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號,保藏日期是2014年2月19日,保藏編號為CGMCC No.8788,分類命名為雜交瘤細胞株2B7。 
上述技術方案中,步驟1)中高表達人B7-H4分子的轉基因細胞293T/B7-H4具有較強的免疫原性,并且所表達的抗原分子的空間構型能以自然狀態暴露于細胞膜表面,從而可更有效地激發機體的免疫反應。 
上述技術方案中,步驟1)中,制備293T/B7-H4細胞的方法可以按照本領域技術人員熟知的DNA操作技術(例如參見Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour,1989)進行基因的分離、核苷酸片段的切割與連接、克隆和表達載體的構建及擴增、核苷酸序列的分析與鑒定、細胞的轉化和培養;具體構建步驟參照毛一香等人發表的文獻(參見:毛一香,王勤,陳潔  陳永井 施勤 楊明峰 李文香 張學光 . 人B7-H4基因轉染細胞的構建及其對T細胞的共刺激效應的初步研究. 中華微生物學和免疫學雜志2006年8月第25卷第8期609-613頁)。 
上述技術方案中,制備抗人B7-H4單克隆抗體的方法可以按照本領域已知的常規方法(參見:Kohler and Milstein,Nature 265:495 -497,1975)。也可以按照美國專利5,585,089中所述的方法制備相應的人源化形式的抗單克隆抗體。 
采用上述雜交瘤細胞株制備單克隆抗體的方法有以下兩種: 
1)在雜交瘤培養液中接種上述雜交瘤細胞,培養后培養液中分離純化所需單克隆抗體;
2)在動物腹腔內接種上述雜交瘤細胞,動物腹水液中分離和純化所需單克隆抗體。
本發明中,保藏編號為CGMCC No.8788雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體為抗人B7-H4的單克隆抗體2B7。 
流式細胞儀分析結果顯示,所述抗人B7-H4的單克隆抗體2B7能識別多種腫瘤細胞上表達的B7-H4分子;競爭抑制試驗結果進一步顯示,所述抗人B7-H4單克隆抗體2B7與現有商品化抗體識別完全不同的抗原表位;因此,2B7可制備用于識別人B7-H4的檢測抗體,亦可能成為檢測腫瘤細胞的重要標志。 
因此,本發明同時要求保護上述抗人B7-H4單克隆抗體2B7作為生物學檢測指標,在制備用于腫瘤細胞檢測藥物中的應用。 
本發明同時要求保護上述抗人B7-H4單克隆抗體2B7在制備阻斷B7-H4信號對T細胞增殖的抑制的藥物中的應用。 
由于上述技術方案運用,本發明與現有技術相比具有下列優點: 
本發明公開的新的抗人B7-H4單克隆抗體2B7能特異性地識別B7-H4分子,與現有的單抗的識別位點存在差異,能檢測到隱蔽位點,具有更廣的識別譜,可以檢測到多種腫瘤細胞株上B7-H4的表達,為臨床檢測能提供更好的幫助。除此之外,2B7生產成本低,性價比高,為臨床、科研減低成本。
附圖說明
圖1為實施例一中以流式細胞術分析抗人B7-H4單克隆抗體2B7對轉基因細胞上B7-H4分子的識別; 
圖2為實施例一中2B7雜交瘤細胞株染色體的核型分析(X1000倍)圖;
圖3為實施例一中單克隆抗體2B7的Ig亞型和效價測定結果圖;
圖4為實施例一中用western blot驗證單克隆抗體2B7的識別結果圖;
圖5為實施例一中用細胞免疫組化的方法驗證單克隆抗體2B7的識別結果圖;
圖6為實施例一中以流式細胞術分析單克隆抗體2B7和商品化抗體MIH43識別的抗原位點的競爭性抑制的結果圖;
圖7為施例一中以流式細胞術分析克隆抗體2B7對腫瘤細胞株上B7-H4識別的結果圖;
圖8為實施例一中以免疫組化方法分析克隆抗體2B7對新鮮組織上B7-H4分子的識別結果圖;
圖9為實施例二中以檢測CCK8的方法鑒定克隆抗體2B7對B7-H4分子的信號作用。
具體實施方式
下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述: 
實施例一:抗人B7-H4單克隆抗體的制備
本實施例描述本發明的抗人B7-H4單克隆抗體2B7的制備。
(1) 抗人B7-H4單克隆抗體的制備 
構建高表達B7-H4分子的轉基因細胞(293T/B7-H4),具體構建步驟參照毛一香等人發表的文獻:人B7-H4基因轉染細胞的構建及其對T細胞的共刺激效應的初步研究(毛一香,王勤,陳潔等,中華微生物學和免疫學雜志2006年8月第25卷第8期609-613頁)。
將高表達B7-H4分子的轉基因細胞(293T/B7-H4)作為免疫原,三次免疫接種Balb/c小鼠(107/500 1/只)(間隔3周)。末次免疫后第四天,取小鼠脾臟細胞與Ag8骨髓瘤細胞株進行細胞融合(共20塊96孔板)。以高表達B7-H4分子的293T/B7-H4為陽性對照及不表達B7-H4分子的293T/mock為陰性對照,用間接免疫熒光法對雜交瘤培養物上清進行初步篩選、蛋白鑒定及Ig亞類鑒定(參見圖1,圖1顯示以流式細胞術分析抗人B7-H4單克隆抗體2B7對轉基因細胞上B7-H4分子的識別。其中灰色峰為陰性對照,一抗為小鼠IgG,二抗為熒光素PE標記的羊抗鼠IgG。透明峰顯示轉基因細胞與抗人B7-H4單抗反應的結果,其中第一抗體是本發明的抗人B7-H4單抗2B7,第二抗體是熒光素PE標記的羊抗鼠IgG)。陽性克隆經3次有限稀釋后,克隆的陽性率達到約95%。經復篩及亞克隆后獲得穩定地分泌特異性鼠抗人B7-H4的雜交瘤細胞株,并被命名為2B7(保藏號為CGMCC No.8788)。這些雜交瘤細胞經體外持續傳代(40代)后,仍能穩定地分泌特異性抗體。對雜交瘤細胞株2B7的染色體分析顯示,這株雜交瘤細胞的染色體數目大于100條(參見附圖2),超過小鼠B細胞和雜交瘤細胞Ag8的染色體數,表明此雜交瘤為融合體。 
(2)抗人B7-H4單克隆抗體的生產與特性性鑒定 
(a)采用本室建立的腹水體內誘生方法生產單克隆抗體。取6-8周齡的雌性Balb/c小鼠,腹腔內注入Pristane (0.5ml/只)。一周后腹腔內接種雜交瘤細胞(1×107/只),同時再次腹腔內注射Pristane與福氏不完全佐劑的等體積混合物(0.2ml/只)。5-10天后收獲腹水,并離心取上清于-80℃保存。
(b)腹水型單抗的純化和定量。腹水液經去除纖維蛋白和鹽析處理后,以蛋白 G親和柱層析法純化。收集蛋白峰流出液,對磷酸鹽緩沖液(PBS)透析后用751紫外分光光度計測定抗體蛋白濃度為0.8~10mg/ml。間接免疫熒光法分析結果表明,純化的單克隆抗體的效價在1∶2000以上。 
(c)Ig亞類鑒定。采用試紙快速測定(Argen公司)法鑒定Ig亞類,結果顯示2B7為小鼠IgG1型,輕鏈為κ。 
附圖3為上述單克隆抗體2B7的Ig亞型和效價測定結果圖,顯示2B7的重鏈為IgG1,輕鏈為Kappa,效價大于1∶2000。 
(d)用化學發光的免疫印跡Western blot 分析的方法鑒定單克隆抗體2B7識別特異性。簡述步驟如下:293T/B7-H4細胞,293T/mock細胞各取1×107個,PBS洗兩遍,重懸于0.3ml的預冷RIPA(1×PBS,1%NP-40,0.5%去氧膽酸鈉,0.1%SDS)細胞裂解液中,加蛋白酶抑制劑(10 mg/ml PMSF,30 μg/ml aprotinin,100mmol/L Na3VO4),搖勻2~3min,置冰盒中用1ml針筒吸放3~4次,15min后再重復3~4次,再放置15~20min,移入Eppendoff管,離心(12000rpm,10min),取上清30μl,加入6×SDS-Loading Buffer煮沸10min。取出樣品和商品化B7-H4人FC融合蛋白經12% SDS-PAGE電泳,并電轉移(0.65mA/cm2)至硝酸纖維素膜上,用5%脫脂奶粉4℃封閉過夜;次日加入純化的鼠抗人B7-H4 mAb室溫孵育1 h,用PBST洗去未結合的抗體,加入辣根過氧化物酶標記的二抗,孵育1h,洗滌后加入ECL顯色試劑,在暗室用X光片曝光數分鐘,進行顯影后再定影。以商品化的B7-H4融合蛋白為陽性對照組,293T/mock細胞裂解液為陰性對照組,293T/B7-H4細胞裂解液為實驗組,2B7能特異性結合B7-H4人Fc融合蛋白(40-60KD)和293T/B7-H4轉基因細胞裂解物,并在40-55KD之間形成特異性條帶,而不能和293T/Mock細胞裂解物結合(參見附圖4)。 
(e)用細胞免疫組織化學的方法鑒定單克隆抗體2B7識別特異性:收集生長良好的293T/mock、293T/B7-H4細胞進行離心甩片,1×104細胞/片,丙酮固定后按常規免疫組化步驟進行,陰性對照組的一抗為鼠IgG,實驗組一抗為1:100稀釋后純化的mAb,二抗為HRP羊抗鼠IgG,DAB顯示,蘇木素染核,樹膠封片觀察。細胞免疫組化的結果也顯示2B7僅能特異性識別轉基因細胞表面B7-H4分子的表達。(參見附圖5, A為2B7與293T/B7-H4細胞結合,B為同型IgG與293T/B7-H4細胞結合,C為2B7與293T細胞結合,B為同型IgG與293T細胞結合)。 
(f)抗體識別抗原位點的競爭性抑制試驗: PBS洗滌293T/B7-H4細胞兩次,調整到5×105/管,分別加入純化后單克隆抗體2B7  0ug 、0.25ug、0.5ug、1ug、2ug 、3ug ,4℃孵育30min,PBS洗滌后加入1 test PE標記商品化單抗MIH43,再4℃孵育30min,PBS洗滌后用流式細胞儀檢測,附圖6為識別結果,灰色峰表示陰性對照,虛線峰代表陽性對照,實線峰表示競爭峰。結果顯示不同濃度的2B7均不能抑制轉基因細胞與商品化抗體MIH43的結合,表明2B7與MIH43的識別的抗原表位不同。 
(g)按照常規技術,以流式細胞術分析單抗2B7對多種腫瘤細胞株上B7-H4分子的識別情況,參見附圖7,其中灰色峰為陰性對照,一抗為鼠抗人B7-H4單抗2B7,二抗為熒光素PE標記的羊抗鼠IgG。透明峰顯示腫瘤細胞與鼠抗人B7-H4單抗(2B7)反應的結果;可以看出本發明公開的新的抗人B7-H4單克隆抗體2B7能特異性地識別B7-H4分子。 
(h)以免疫組化方法分析單抗2B7對新鮮組織上B7-H4分子的識別情況:取樣本組織,10%中性福爾馬林固定,95%酒精脫水,正丁醇透明過夜,滲蠟、包埋、制備厚5μm的石蠟切片,貼附于多聚賴氨酸載玻片上,70℃烤片1h。切片脫蠟(二甲苯I 10min, 二甲苯II 10min, 無水乙醇10min, 95%乙醇 5min, 85%乙醇5min, 蒸餾水洗滌5min), 于高壓鍋中放入適量檸檬酸鈉緩沖液, 放入切片,加熱至放氣1min以修復抗原。冷卻后取出切片。PBS洗滌后加入0.3%過氧化氫以阻斷內源過氧化物酶,室溫10min,PBS洗滌后,每張切片分別加入3%BSA封閉,于37℃孵育30min后分別加入濃度為10μg/ml特異性鼠抗人B7-H4抗體2B7作為一抗,37℃孵育1h。PBS(PH7.2)洗滌3次后加入HRP標記的二抗,于37℃孵育40min。PBS洗滌后,加DAB顯色,顯微鏡下觀察3-10min,自來水沖洗,蘇木素復染,60℃水浴返藍,梯度乙醇脫水干燥,中性樹膠封片,觀片,顯影并攝影。以同型IgG來代替一抗作為陰性對照。最后B7-H4的顯色結果判斷根據在細胞漿和細胞膜上是否有顯著棕色而分別判定為陽性或陰性。若樣本組織的陽性細胞數大于10% 則該樣本為陽性,不然則為陰性。結果見圖8(A為放大200倍的陽性表達,B為放大400倍的陽性表達,C為放大200倍的陰性對照,D為放大400倍的陰性對照),免疫組化方法分析2B7對人乳腺癌組織中B7-H4分子的識別結果顯示,單抗 2B7 檢測到乳腺癌組織中癌細胞的薄膜和胞漿彌漫性表達B7-H4抗原。 
實施例二:單克隆抗體2B7對T 細胞增殖抑制的阻斷作用 
1)分離正常人外周血PBMC,磁珠分選T細胞,接種到預先包被激發型單抗CD3(100ng/ml)和CD28(500ng/ml)的96孔板中(10×105/孔),分別加入B7-H4鼠Fc融合蛋白(10ug/ml)、B7-H4單克隆單體(10ug/ml)或兩者混合物,每組設3個復孔,培養72h后加CCK8檢測增殖情況。激發型單抗CD3和CD28刺激T細胞增殖,B7H4鼠Fc融合蛋白抑制T細胞的增殖,加入單克隆抗體2B7觀察阻斷抑制效應。CCK8結果顯顯示2B7能在一定程度上阻斷負性分子的抑制效應;參見附圖9,其中1為未刺激的T細胞、2為刺激活化后T細胞、3為活化的T細胞中加入B7-H4鼠Fc融合蛋白、4為活化的T細胞中加入B7-H4鼠Fc融合蛋白和2B7,可以看出第2組和第3組比較** P <0.05,第3組和第4組比較*P <0.05。單克隆抗體2B7有效地阻斷B7-H4對T細胞增殖的抑制效應。   內容來自專利網www.wwszu.club轉載請標明出處

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