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一種消癥丸制劑的指紋圖譜檢測方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201410126546.1

申請日:

2014.03.31

公開號:

CN103983704A

公開日:

2014.08.13

當前法律狀態:

授權

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有權

法律詳情: 專利權人的姓名或者名稱、地址的變更IPC(主分類):G01N 30/02變更事項:專利權人變更前:雷允上藥業有限公司變更后:雷允上藥業集團有限公司變更事項:地址變更前:215009 江蘇省蘇州市高新區橫山路86號變更后:215009 江蘇省蘇州市高新區橫山路86號|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):G01N 30/02申請日:20140331|||公開
IPC分類號: G01N30/02 主分類號: G01N30/02
申請人: 雷允上藥業有限公司
發明人: 狄留慶; 趙曉莉; 嚴燕青; 貢磊; 康安; 單進軍; 李俊松; 李全
地址: 215009 江蘇省蘇州市高新區橫山路86號
優先權: 2013.07.30 CN 201310325229.8
專利代理機構: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200 代理人: 楊海軍
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410126546.1

授權公告號:

|||||||||

法律狀態公告日:

2017.03.08|||2015.06.17|||2014.09.10|||2014.08.13

法律狀態類型:

專利權人的姓名或者名稱、地址的變更|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種消癥丸制劑的HPLC指紋圖譜檢測方法,該方法包括供試品溶液的制備、對照品溶液的制備、各原料藥與成品之間的相關性的測定;用高效液相色譜儀測定,以參照峰保留時間和峰面積為1,計算供試品相對保留時間和相對峰面積,即得消癥丸制劑HPLC指紋圖譜。由此方法得到的消癥丸制劑HPLC指紋圖譜在254nm下歸屬于柴胡、香附、大黃、川芎、莪術、當歸、白芍、浙貝母、王不留行和青皮的特征峰分別有4個、4個、17個、7個、5個、7個、11個、4個、6個、11個。經實驗驗證表明,本發明提供的指紋圖譜檢測方法,靈敏度和精密度高,穩定性和重復性好,相似度高,可以客觀、全面、準確的評價該消癥丸制劑的質量,對保證臨床藥效具有重要意義。

權利要求書

權利要求書
1.  一種消癥丸制劑的HPLC指紋圖譜檢測方法,其特征在于,該方法包括以下步驟: 
(1)供試品溶液的制備:取消癥丸制劑內容物細粉1.0g,精密稱定,置50ml錐形瓶中,精密加入濃度為90%乙醇溶液50ml,超聲處理(功率250W,頻率40kHz)30分鐘,靜置放冷,過濾,濾液減壓回收乙醇,濃縮,上AB-8大孔吸附樹脂柱,分別用400ml水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇,按每小時3~4倍柱體積的流速洗脫,合并40%、60%、80%、95%乙醇洗脫液,減壓濃縮,加甲醇定容至10ml,吸取溶液,過0.45μm濾膜,取續濾液,即得; 
(2)對照品溶液的制備:精密稱取芍藥苷、阿魏酸、橙皮苷、大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、大黃酚適量,加甲醇使溶解,分別制成芍藥苷濃度為36μg/ml、阿魏酸濃度為56.3μg/ml、橙皮苷濃度為42μg/ml、大黃酸濃度為24.6μg/ml、大黃素濃度為29.8μg/ml、蘆薈大黃素濃度為51.6μg/ml、大黃素甲醚濃度為38.6μg/ml、大黃酚濃度為26μg/ml的對照品溶液; 
(3)消癥丸制劑HPLC指紋圖譜的測定:分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各50μl,進樣,用高效液相色譜儀測定,以參照峰保留時間和峰面積為1,計算供試品相對保留時間和相對峰面積,即得消癥丸制劑HPLC指紋圖譜; 
色譜條件為:色譜柱:用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動相:A相為乙腈,B相為0.3%磷酸水,梯度洗脫;檢測波長:245nm~254nm;柱溫35℃~45℃;流速0.8ml/min~1ml/min。 

2.  根據權利要求1所述的消癥丸制劑的HPLC指紋圖譜檢測方法,其特征在于,步驟(3)所述的色譜條件為:色譜柱:填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠;流動相:A相為乙腈,B相為0.3%磷酸水,梯度洗脫,檢測波長:254nm;柱溫40℃;流速0.8ml/min。 

3.  根據權利要求2所述的消癥丸制劑的HPLC指紋圖譜檢測方法,其特征在于,所述的梯度洗脫條件為: 
時間/分鐘 A/% B/% 0-5 10~12 90~88 5-10 12 88 10-30 12~16 88~84 30-33 16~19 84~81 33-45 19 81 45-51 19~24.2 81~75.8 51-58 24.2 75.8~75.8 58-65 24.2~30 75.8~70
65-85 30~38.5 70~61.5 85-90 38.5 61.5 90-96 38.5~65 61.5~35 96-101 65~68 35~32 101-105 68~95 32~5 105-110 95~100 5~0

4.  根據權利要求1所述的消癥丸制劑的HPLC指紋圖譜檢測方法,其特征在于,步驟(3)檢測時間為110分鐘。 

5.  根據權利要求1所述的消癥丸制劑的HPLC指紋圖譜檢測方法,其特征在于,步驟(3)參照峰為蘆薈大黃素峰;所述的供試品指紋圖譜采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版進行評價,各檢測波長下的相似度均大于0.9;在254nm下利用各對照品對主要峰進行比較確定:4號峰為芍藥苷、5號峰為阿魏酸、10號峰為橙皮苷、23號峰為蘆薈大黃素、27號峰為大黃酸、31號峰為大黃素、32號峰為大黃酚、33號峰為大黃素甲醚。 

6.  根據權利要求1至5任一項所述的消癥丸制劑的HPLC指紋圖譜檢測方法,其特征在于,所述的色譜柱的規格為4.6×250mm,5μm的WatersXbridgeC18反相色譜柱。 

7.  消癥丸制劑的原料藥材的指紋圖譜檢測方法,其特征在于,包括以下步驟: 
(1)分別取消癥丸制劑的原料藥材柴胡、香附、大黃、青皮、川芎、莪術、浙貝母、當歸、白芍和王不留行,粉碎至細粉,過60目篩,分別取1.0g,精密稱定,置10ml量瓶中,精密加入90%乙醇50ml,密塞,稱定重量,超聲處理30min,靜置放冷,過濾,濾液減壓回收乙醇,濃縮,濃縮液上AB-8大孔吸附樹脂柱,分別用400ml水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇,按每小時3-4倍柱體積的流速洗脫,合并40%、60%、80%、95%乙醇洗脫液,減壓濃縮,加甲醇定容至10ml,吸取溶液,過0.45μm濾膜,取續濾液,即得各原料藥材的供試品溶液; 
(2)各原藥材HPLC指紋圖譜測定:分別精密吸取步驟(1)各原料藥材的供試品溶液50μl,進樣,用高效液相色譜儀測定各原料藥材的指紋圖譜; 
色譜條件為:色譜柱:填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠;流動相:A相為乙腈,B相為0.3%磷酸水,梯度洗脫,檢測波長:254nm;柱溫40℃;流速0.8ml/min;所述的梯度洗脫條件為: 
時間/分鐘 A/% B/% 0-5 10~12 90~88 5-10 12 88
10-30 12~16 88~84 30-33 16~19 84~81 33-45 19 81 45-51 19~24.2 81~75.8 51-58 24.2 75.8~75.8 58-65 24.2~30 75.8~70 65-85 30~38.5 70~61.5 85-90 38.5 61.5 90-96 38.5~65 61.5~35 96-101 65~68 35~32 101-105 68~95 32~5 105-110 95~100 5~0

說明書

說明書一種消癥丸制劑的指紋圖譜檢測方法
優先權 
對于本申請,申請人要求在中國申請的專利,申請日為2013年7月30日,申請號為201310325229.8的優先權。 
技術領域
本發明涉及一種中藥制劑的質量檢測方法,具體涉及一種消癥丸制劑的指紋圖譜檢測方法。 
背景技術
消癥丸是由河南中醫學院老中醫趙俊學老師在明代張介賓《景岳全書》中柴胡疏肝散的基礎上,根據乳腺增生病的發病機理加減而成,在臨床中應用幾十年,對乳腺增生癥的療效確切。該方由柴胡、香附、大黃、青皮、川芎、當歸、白芍、莪術、土鱉蟲、浙貝母、王不留行十一味藥材組成,具有舒肝行氣、活血化痰、軟堅散結的功效。主治氣滯血瘀痰凝所致的乳腺增生病。癥見乳房腫塊,乳房脹痛或刺痛,可伴胸脅疼痛,善郁易怒,胸悶,脘痞納呆,月經量少色暗,經行腹痛。舌暗紅或有瘀點、瘀斑,苔薄白或白膩。脈弦或澀。 
現有檢測方法(專利ZL201110058699.3)對該產品中柴胡、香附、大黃、青皮、浙貝母、白芍6味藥材進行薄層鑒別以及對大黃藥材中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚進行HPLC含量測定。該方法步驟繁瑣,且消癥丸制劑由十一味藥材組成,僅僅測定其中的一味藥材含量不足以全面對該復方的制劑的質量進行控制。現有方法沒有對其中主要多味藥材中的化學成分進行全面、系統的檢測,因此不能全面監控中間體、成品的質量。 
近年來,中藥指紋圖譜技術已日漸成熟,能夠很好的控制藥品的質量,保證藥品的有效性和質量可控性,已經成為一種業內公認的、可靠的、高效的技術手段,是中藥質量控制的發展趨勢。 
因此,為了更全面、有效的控制該消癥丸制劑的質量,提高其質量控制水平,讓臨床用藥安全及療效更加有所保證,很有必要在現有技術的基礎之上研究設計出一種能客觀、準確,全面檢測消癥丸制劑質量的指紋圖譜測定方法。 
發明內容
發明目的:本發明的目的是提供一種通過HPLC指紋圖譜對消癥丸制劑進行檢測的方法,本發明的目的是解決現有技術的不足,提供一種精密度高,重復性和穩定性好,能客觀、全面、準確的評價消癥丸制劑質量的指紋圖譜檢測方法,能更有效的保證成品的質量,對控制 消癥丸制劑的質量具有重要作用。該方法采用HPLC梯度洗脫在一個流動相系統首次同時檢出復方中十味藥材成分,從色譜峰的特征和相似度結果判斷消癥丸制劑的樣品合格與否,從整體上全面反映消癥丸所用藥材內在質量,不僅能全面反映消癥丸制劑成品的質量,還可根據成品、半成品的指紋圖譜變化追根溯源尋找工藝操作中的問題。本發明還提供了消癥丸制劑的標準指紋圖譜。 
技術的方案:為了實現以上目的,本發明的通過HPLC指紋圖譜對消癥丸制劑進行檢測的方法包括如下步驟: 
(1)供試品溶液的制備:取消癥丸制劑內容物細粉1.0g,精密稱定,置50ml錐形瓶中,精密加入濃度為90%乙醇溶液50ml,超聲處理(功率250W,頻率40kHz)30分鐘,靜置放冷,過濾,濾液減壓回收乙醇,濃縮,上AB-8大孔吸附樹脂柱,分別用400ml水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇,按每小時3~4倍柱體積的流速洗脫,合并40%、60%、80%、95%乙醇洗脫液,減壓濃縮,加甲醇定容至10ml,吸取溶液,過0.45μm濾膜,取續濾液,即得; 
(2)對照品溶液的制備:精密稱取芍藥苷、阿魏酸、橙皮苷、大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、大黃酚適量,加甲醇溶解,分別制成芍藥苷濃度為36μg/ml、阿魏酸濃度為56.3μg/ml、橙皮苷濃度為42μg/ml、大黃酸濃度為24.6μg/ml、大黃素濃度為29.8μg/ml、蘆薈大黃素濃度為51.6μg/ml、大黃素甲醚濃度為38.6μg/ml、大黃酚濃度為26μg/ml的對照品溶液; 
(3)消癥丸制劑HPLC指紋圖譜的測定:分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各50μl,進樣,用高效液相色譜儀測定,以參照峰保留時間和峰面積為1,計算供試品相對保留時間和相對峰面積,即得消癥丸制劑HPLC指紋圖譜; 
色譜條件為:色譜柱:用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動相:A相為乙腈,B相為0.3%磷酸水,梯度洗脫;檢測波長:245nm~254nm;柱溫35℃~45℃;流速0.8ml/min~1ml/min。 
色譜條件的篩選:本發明分別對色譜柱、洗脫系統、洗脫程序、柱溫、檢測波長進行了篩選。 
色譜柱的篩選:分別篩選色譜柱1:XbridgeC18(4.6×250mm,5μm,Waters);色譜柱2:ODS HypersilC18(4.6×250mm,5μm,Thermo);色譜柱3:ODS-2C18(4.6×250mm,5μm,Hedera)。根據色譜峰的分離情況和總峰數,優選色譜柱1:XbridgeC18(4.6×250mm,5μm,Waters)色譜柱。 
洗脫系統的篩選:本發明分別篩選洗脫系統:1:甲醇-水;2:乙腈-水;3:乙腈-0.1% 磷酸;4:乙腈-0.2%磷酸;5:乙腈-0.3%磷酸。根據色譜峰分離效果和峰型等,優選5:乙腈-0.3%磷酸為最終洗脫系統。 
洗脫程序的篩選:本發明以乙腈-0.3%磷酸做流動相,篩選了程序1-6的洗脫程序,以乙腈百分比表示,括號內表示時間(min): 
程序1:10%(0)~18.4%(9)~18.4%(23)~20.5%(26)~20.5%(33)~24.2%(39)~24.2%(46)~39.4%(55)~43%(68)~43%(77)~90%(87) 
程序2:10%(0)~18.4%(23)~20.5%(26)~20.5%(33)~24.2%(39)~24.2%(43)~39.4%(52)~43%(70)~90%(80) 
程序3:10%(0)~18.4%(23)~20.5%(26)~20.5%(33)~24.2%(39)~24.2%(43)~39.4%(52)~43%(90)~90%(95) 
程序4:10%(0)~18.4%(23)~20.5%(26)~20.5%(33)~24.2%(39)~24.2%(43)~30%(49)~39.4%(63)~43%(73)~90%(90) 
程序5:10%(0)~14.4%(10)~14.4%(15)~18.4%(25)~20.5%(27)~20.5%(45)~24.2%(50)~30%(56)~39.4%(76)~43%(90)~90%(110) 
程序6:10%(0)~12%(5)~12%(10)~16%(30)~19%(33)~19%(45)~24.2%(51)~24.2%(58)~30%(65)~38.5%(85)~38.5%(90)~65%(96)~68%(101)~95%(105)~100%(110) 
根據色譜圖的分離效果,優選程序6:10%(0)~12%(5)~12%(10)~16%(30)~19%(33)~19%(45)~24.2%(51)~24.2%(58)~30%(65)~38.5%(85)~38.5%(90)~65%(96)~68%(101)~95%(105)~100%(110)為最終洗脫程序。 
柱溫的篩選:本發明篩選了35℃和40℃柱溫,根據色譜峰分離效果及分離時間,優選40℃為最終柱溫。 
檢測波長的篩選:本發明篩選了230nm、254nm、280nm、316nm和360nm的波長,根據色譜峰分離效果和峰數優選254nm為最終檢測波長。 
消癥丸制劑HPLC指紋圖譜的測定:分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各50μl,進樣,用高效液相色譜儀測定,以參照峰保留時間和峰面積為1,計算供試品相對保留時間和相對峰面積,即得消癥丸制劑HPLC指紋圖譜; 
作為優選的方案,以上所述的消癥丸制劑的指紋圖譜檢測方法,步驟(4)所述的色譜柱為XbridgeC18(4.6×250mm,5μm,Waters)色譜柱; 
作為優選的方案,以上所述的消癥丸制劑的指紋圖譜檢測方法,步驟(4)所述的洗脫系統為乙腈-0.3%磷酸; 
作為優選的方案,以上所述的消癥丸制劑的指紋圖譜檢測方法,步驟(4)所述的梯度洗脫程序如下表: 
T/min A/% B/% 0-5 10~12 90~88 5-10 12 88 10-30 12~16 88~84 30-33 16~19 84~81 33-45 19 81 45-51 19~24.2 81~75.8 51-58 24.2 75.8~75.8 58-65 24.2~30 75.8~70 65-85 30~38.5 70~61.5 85-90 38.5 61.5 90-96 38.5~65 61.5~35 96-101 65~68 35~32 101-105 68~95 32~5 105-110 95~100 5~0
作為優選的方案,以上所述的消癥丸制劑的指紋圖譜檢測方法,檢測波長優選254nm;色譜柱柱溫為40℃;流動相流速為0.8mL/min;檢測時間為110分鐘; 
作為優選的方案,以上所述的消癥丸制劑的指紋圖譜檢測方法,參照峰為蘆薈大黃素; 
作為更優選的方案,供試品指紋圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版》進行評價,各檢測波長下的相似度均大于0.90; 
本發明消癥丸制劑HPLC指紋圖譜的構建方法得到的HPLC指紋圖譜,其特殊之處在于,其成分之一的柴胡、香附、大黃、青皮、川芎、莪術、浙貝母、當歸、白芍、王不留行十味藥材的HPLC指紋圖譜的構建方法,與消癥丸制劑具有相同的檢測條件并分別得到各自藥材的指紋圖譜。 
本發明所述的消癥丸制劑的原料藥材的指紋圖譜檢測方法,其包括以下步驟: 
別取消癥丸制劑的原料藥材柴胡、香附、大黃、青皮、川芎、莪術、浙貝母、當歸、白芍和王不留行,粉碎至細粉,過60目篩,分別取1.0g,精密稱定,置10ml量瓶中,精密加入90%乙醇50ml,密塞,稱定重量,超聲處理30min,靜置放冷,過濾,濾液減壓回收乙醇,濃縮,濃縮液上AB-8大孔吸附樹脂柱,分別用400ml水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇,按每小時3-4倍柱體積的流速洗脫,合并40%、60%、80%、95%乙醇洗脫液,減壓濃縮,加甲醇定容至10ml,吸取溶液,過0.45μm濾膜,取續濾液,即得各原 料藥材的供試品溶液; 
(2)各原藥材HPLC指紋圖譜測定:分別精密吸取步驟(1)各原料藥材的供試品溶液50μl,進樣,用高效液相色譜儀測定各原料藥材的指紋圖譜; 
色譜條件為:色譜柱:填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠;流動相:A相為乙腈,B相為0.3%磷酸水,梯度洗脫,檢測波長:254nm;柱溫40℃;流速0.8ml/min;所述的梯度洗脫條件為: 
時間/分鐘 A/% B/% 0-5 10~12 90~88 5-10 12 88 10-30 12~16 88~84 30-33 16~19 84~81 33-45 19 81 45-51 19~24.2 81~75.8 51-58 24.2 75.8~75.8 58-65 24.2~30 75.8~70 65-85 30~38.5 70~61.5 85-90 38.5 61.5 90-96 38.5~65 61.5~35 96-101 65~68 35~32 101-105 68~95 32~5 105-110 95~100 5~0
本發明消癥丸制劑HPLC指紋圖譜的構建方法得到的HPLC指紋圖譜,所述消癥丸制劑HPLC指紋圖譜在254nm下歸屬于柴胡的指紋圖譜具有4個特征峰;歸屬于香附的指紋圖譜具有4個特征峰;歸屬于大黃的指紋圖譜具有17個特征峰;歸屬于川芎的指紋圖譜具有7個特征峰;歸屬于莪術的指紋圖譜具有5個特征峰;歸屬于當歸的指紋圖譜具有7個特征峰;歸屬于白芍的指紋圖譜具有11個特征峰;歸屬于浙貝母的指紋圖譜具有4個特征峰;歸屬于王不留行的指紋圖譜具有6個特征峰;歸屬于青皮的指紋圖譜具有11個特征峰。所述圖譜的圖形如說明書附圖中圖1、圖2和/或圖6中所示的圖譜。 
本發明的目的還可以通過以下措施來達到:這種利用權利要求1所述消癥丸制劑HPLC指紋圖譜的檢測方法得到的HPLC指紋圖譜,其特殊之處在于: 
所述消癥丸制劑HPLC指紋圖譜254nm的共有峰為(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、 (20)、(21)、(22)、(23)、(24)、(25)、(26)、(27)、(28)、(29)、(30)、(31)、(32)、(33)33個峰;其中,歸屬于柴胡的共有峰為(1)、(2)、(13)、(14)4個峰;歸屬于香附的共有峰(1)、(15)、(16)、(25)4個峰;歸屬于大黃的共有峰為(1)、(2)、(3)、(7)、(8)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(23)、(25)、(27)、(30)、(31)、(32)、(33)17個峰;歸屬于青皮的共有峰為(1)、(2)、(3)、(6)、(8)、(10)、(22)、(24)、(25)、(28)、(30)11個峰;歸屬于川芎的共有峰為(1)、(2)、(3)、(5)、(6)、(12)、(29)7個峰;歸屬于莪術的共有峰為(2)、(12)、(13)、(22)、(29)5個峰;歸屬于浙貝母的共有峰為(2)、(6)、(9)、(20)4個峰;歸屬于當歸的共有峰為(1)、(2)、(3)、(5)、(6)、(12)、(18)共7個峰;歸屬于白芍的共有峰為(1)、(2)、(3)、(4)、(7)、(8)、(9)、(11)、(12)、(15)、(21)共11個峰;歸屬于王不留行的共有峰為(2)、(3)、(6)、(9)、(12)、(14)6個峰;所述圖譜的圖形如說明書附圖中圖1、圖2和/或圖6所示的圖譜。 
利用各對照品對HPLC指紋圖譜主要峰進行比較確定:4號峰為芍藥苷、5號峰為阿魏酸、10號峰為橙皮苷、23號峰為蘆薈大黃素、27號峰為大黃酸、31號峰為大黃素、32號峰為大黃酚、33號峰為大黃素甲醚。 
本發明提供的消癥丸制劑的HPLC指紋圖譜的檢測方法相比現有技術具有以下優點: 
1、本發明選用HPLC作為消癥丸制劑的檢測方法,以超聲法為提取方法,以大孔樹脂富集為純化方法,條件簡便,具有良好的可操作性,易于推廣。 
2、本發明采用的HPLC梯度洗脫條件在一個流動相系統首次同時檢出消癥丸制劑10味藥材,不僅包括了現有技術中消癥丸制劑質量控制的所有指標,而且有所提高,能更準確、全面地表達該產品的特征。 
3、本發明的消癥丸制劑的檢測方法,其測定的精密度試驗、重復性試驗、穩定性試驗的相似度評價都表明,該方法檢測結果準確、穩定性高。 
4、本發明的消癥丸制劑的檢測方法對有效成分既能定性又能定量,可適用于監控消癥丸的原料藥材、中間體半成品的質量以及生產工藝的質量控制,適用范圍廣。 
附圖說明
圖1為消癥丸制劑254nm的HPLC參照指紋圖譜。 
圖2為混標254nm的HPLC指紋圖譜。 
圖3為254nm下消癥丸制劑精密度試驗相似度評價結果示意圖。 
圖4為254nm下消癥丸制劑重復性試驗相似度評價結果示意圖。 
圖5為254nm下消癥丸制劑穩定性試驗相似度評價結果示意圖。 
圖6為消癥丸制劑指紋圖譜各成分峰歸屬圖譜。 
該圖中字母分別代表:a柴胡;b香附;c大黃;d青皮;e川芎;f莪術;g浙貝母;h當歸;i白芍;j王不留行 
圖7為254nm下消癥丸制劑批間相似度評價結果示意圖。 
具體實施方式
下面結合具體實施例進一步闡明本發明,應理解這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍,在閱讀了本發明之后,本領域技術人員對本發明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權利要求所限定的范圍。 
實施例消癥丸HPLC指紋圖譜的構建方法及消癥丸HPLC指紋圖譜 
1、儀器與試藥 
1.1儀器 
美國Waterse2695高效液相色譜系統(包括在線脫氣機,自動進樣器Prominence SIL-20A,二極管陣列檢測器waters2998和柱溫箱CTO-20A,Empower色譜工作站);電子分析天平(FA1204B,上海精密科學有限公司);萬分之一電子天平(FA1204B,上海精密科學儀器有限公司);超聲波清洗機(AS20500A,Auto Science);XbridgeC18分析柱(4.6×250mm,5μm,Waters,USA)。 
1.2試藥 
對照品:芍藥苷、阿魏酸、橙皮苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚 

對照藥材:柴胡、香附、大黃(酒炙)、炒青皮、川芎、莪術、浙貝母、當歸、白芍、炒王不留行十味藥材,由雷允上藥業有限公司提供。 
消癥丸制劑:雷允上藥業有限公司產品,國藥準字Z20100057,為丸劑,每丸重0.3g,相當于原藥材0.1g。 
2、方法與結果 
2.1色譜條件 
色譜柱:Waters XbridgeC18分析柱(4.6×250mm;5μm,Waters公司) 
流動相:乙腈(A)-濃度為0.3%磷酸(B),梯度洗脫,洗脫程序見表1 
檢測波長:254nm;柱溫:40℃;流速:0.8ml/min; 
表1梯度洗脫程序 
T/min A/% B/% 0-5 10~12 90~88 5-10 12 88 10-30 12~16 88~84 30-33 16~19 84~81 33-45 19 81 45-51 19~24.2 81~75.8 51-58 24.2 75.8 58-65 24.2~30 75.8~70 65-85 30~38.5 70~61.5 85-90 38.5 61.5 90-96 38.5~65 61.5~35 96-101 65~68 35~32 101-105 68~95 32~5 105-110 95~100 5~0
2.2指紋圖譜制備 
2.2.1供試品溶液的制備:取消癥丸1.0g,精密稱定,置50ml錐形瓶中,精密加入濃度為90%乙醇溶液50ml,超聲處理(功率250W,頻率40kHz)30分鐘,靜置放冷,過濾,濾液減壓回收乙醇,濃縮,上AB-8大孔吸附樹脂柱,分別用400ml水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇,按每小時3~4倍柱體積的流速洗脫,合并40%、60%、80%、95%乙醇洗脫液,減壓濃縮,加甲醇定容至10ml,吸取溶液,過0.45μm濾膜,取續濾液,即得; 
2.2.2對照品溶液的制備:精密稱取芍藥苷、阿魏酸、橙皮苷、大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、大黃酚適量,加甲醇溶解,分別制成芍藥苷濃度為36μg/ml、阿魏酸濃度為56.3μg/ml、橙皮苷濃度為42μg/ml、大黃酸濃度為24.6μg/ml、大黃素濃度為29.8μg/ml、蘆薈大黃素濃度為51.6μg/ml、大黃素甲醚濃度為38.6μg/ml、大黃酚濃度為26μg/ml的對照品溶液; 
2.2.3消癥丸HPLC指紋圖譜測定:分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各50μl,進樣,用高效液相色譜儀測定,即得消癥丸HPLC指紋圖譜見附圖1,混標的指紋圖譜見附圖2。 
2.2.4主要峰的定性:通過與對照品比較確定,其中4號峰為芍藥苷,5號峰為阿魏酸,10號峰為橙皮苷,23號峰為蘆薈大黃素,27號峰為大黃酸,31號峰為大黃素,32號峰為大黃酚,33號峰為大黃素甲醚。 
2.3指紋圖譜精密度試驗 
2.3.1取同一消癥丸溶液,連續進樣5次,檢測指紋圖譜,采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版》軟件進行數據處理:以5批供試品指紋圖譜作為樣本集,經軟件系統生成對照圖譜(Standard Chromatographie Project,采用中位數法,時間寬度:0.01),以此為基準,計算樣本圖譜與對照圖譜的相似度,結果顯示儀器精密度良好,相似度均大于0.9,見表2,附圖3。 
表2指紋圖譜精密度試驗的相似度結果 
  S1 S2 S3 S4 S5 對照指紋圖譜 S1 1 0.999 0.999 0.999 1 1 S2 0.999 1 1 0.999 0.999 1 S3 0.999 1 1 1 0.999 1 S4 0.999 0.999 1 1 0.999 1 S5 1 0.999 0.999 0.999 1 1 對照指紋圖譜 1 1 1 1 1 1
2.4指紋圖譜重現性試驗 
2.4.1取同一批消癥丸5份,按供試品溶液制備項下方法制備,分別進樣,采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版》軟件進行數據處理:以5批供試品溶液指紋圖譜作為樣本集,經軟件系統生成對照圖譜(Standard Chromatographie Project,采用中位數法,時間寬度:0.01),以此為基準,計算樣本圖譜和對照圖譜的相似度,結果顯示樣品重復性良好,相似度均大于0.90,見表3,附圖4。 
表3指紋圖譜重復性試驗的相似度結果 
  S1 S2 S3 S4 S5 對照指紋圖譜 S1 1 0.98 0.98 0.981 0.97 0.992 S2 0.98 1 0.997 0.978 0.963 0.993 S3 0.98 0.997 1 0.979 0.966 0.994 S4 0.981 0.978 0.979 1 0.97 0.991 S5 0.97 0.963 0.966 0.97 1 0.983 對照指紋圖譜 0.992 0.993 0.994 0.991 0.983 1
2.5指紋圖譜穩定性試驗: 
2.5.1取一個編號的消癥丸樣品溶液,分別在0、2、4、6、8、12、24小時進樣,檢測指 紋圖譜,采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版》軟件進行數據處理:以7批供試品溶液指紋圖譜作為樣本集,經軟件系統生成對照圖譜(Standard Chromatographie Project,采用中位數法,時間寬度:0.01),以此為基準,計算樣本圖譜和對照圖譜的相似度,結果顯示樣品穩定性良好,相似度均大于0.90,見表4,附圖5。 
表4指紋圖譜穩定性試驗的相似度結果 
  S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 對照指紋圖譜 S1 1 0.986 0.995 0.997 0.997 0.998 0.998 0.998 S2 0.986 1 0.995 0.99 0.992 0.99 0.989 0.993 S3 0.995 0.995 1 0.998 0.998 0.998 0.997 0.999 S4 0.997 0.99 0.998 1 0.998 0.999 0.998 0.999 S5 0.997 0.992 0.998 0.998 1 0.999 0.999 1 S6 0.998 0.99 0.998 0.999 0.999 1 0.999 0.999 S7 0.998 0.989 0.997 0.998 0.999 0.999 1 0.999 對照指紋圖譜 0.998 0.993 0.999 0.999 1 0.999 0.999 1
2.6成品與各原料藥材的相關性及特征峰歸屬 
2.6.1供試品溶液的制備:取各藥材粉碎至細粉過60目篩,取約1.0g,精密稱定,置10ml量瓶中,精密加入90%乙醇50ml,密塞,稱定重量,超聲處理(功率250W,頻率40kHz)30min,靜置放冷,過濾,濾液減壓回收乙醇,濃縮,上AB-8大孔吸附樹脂柱,分別用400ml水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇,按每小時3-4倍柱體積的流速洗脫,合并40%、60%、80%、95%乙醇洗脫液,減壓濃縮,加甲醇定容至10ml,吸取溶液,過0.45μm濾膜,取續濾液,即得; 
2.6.2各原藥材HPLC指紋圖譜測定:分別精密吸取各原藥材溶液50μl,進樣,用高效液相色譜儀測定,見表5,附圖6。 
表5各特征峰的歸屬 
共有峰 柴胡 香附 大黃 青皮 川芎 莪術 浙貝母 當歸 白芍 王不留行 1 + + + + +     + +   2 +   + + + + + + + + 3     + + +     + + + 4(芍藥苷)                 +   5(阿魏酸)         +     +     6       + +   + +   + 7     +           +   8     + +         +   9             +   + + 10(橙皮苷)       +             11                 +   12 +       + +   + + + 13 +         +         14                   +
 15   +             +   16   + +               17     +               18     +         +     19     +               20     +       +       21                 +   22       +   +         23(蘆薈大黃素)     +               24       +             25   + + +             26                     27(大黃酸)     +               28       +             29         + +         30     + +             31(大黃素)     +               32(大黃酚)     +               33(大黃素甲醚)     +              
所述消癥丸制劑HPLC指紋圖譜254nm的共有峰為(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(21)、(22)、(23)、(24)、(25)、(26)、(27)、(28)、(29)、(30)、(31)、(32)、(33)33個峰;其中,歸屬于柴胡的共有峰為(1)、(2)、(12)、(13)4個峰;歸屬于香附的共有峰(1)、(15)、(16)、(25)4個峰;歸屬于大黃的共有峰為(1)、(2)、(3)、(7)、(8)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(23)、(25)、(27)、(30)、(31)、(32)、(33)17個峰;歸屬于青皮的共有峰為(1)、(2)、(3)、(6)、(8)、(10)、(22)、(24)、(25)、(28)、(30)11個峰;歸屬于川芎的共有峰為(1)、(2)、(3)、(5)、(6)、(12)、(29)7個峰;歸屬于莪術的共有峰為(2)、(12)、(13)、(22)、(29)5個峰;歸屬于浙貝母的共有峰為(2)、(6)、(9)、(20)4個峰;歸屬于當歸的共有峰為(1)、(2)、(3)、(5)、(6)、(12)、(18)共7個峰;歸屬于白芍的共有峰為(1)、(2)、(3)、(4)、(7)、(8)、(9)、(11)、(12)、(15)、(21)共11個峰;歸屬于王不留行的共有峰為(2)、(3)、(6)、(9)、(12)、(14)6個峰。 
2.7批間相似度評價 
2.7.1供試品溶液的制備:取11批不同批號的消癥丸,各精密稱取1.0g,按藥材樣品溶液制備項下方法制備,分別進樣,采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A》軟件進行數據處理:以11批供試品溶液指紋圖譜作為樣品集,經軟件系統生成對照圖譜,以此為基準,計算樣本圖譜與對照圖譜的相似度,評價批次間穩定性,結果顯示11批樣品的相似度良好,均在0.9以上,見表7,附圖7。 
2.7.2指紋圖譜條件: 
色譜柱:Waters XbridgeC18分析柱(4.6×250mm;5μm,Waters公司) 
流動相:乙腈(A)-濃度為0.3%磷酸(B),梯度洗脫,洗脫程序見表1 
檢測波長:254nm;柱溫:40℃;流速:0.8ml/min; 
時間 A/% B/% 0-5 10~12 90~88 5-10 12 88 10-30 12~16 88~84 30-33 16~19 84~81 33-45 19 81 45-51 19~24.2 81~75.8 51-58 24.2 75.8 58-65 24.2~30 75.8~70 65-85 30~38.5 70~61.5 85-90 38.5 61.5 90-96 38.5~65 61.5~35 96-101 65~68 35~32 101-105 68~95 32~5 105-110 95~100 5~0
表7十一批消癥丸指紋圖譜相似度考察結果 

以上所述僅是本發明的優選實施方式,應當指出,對于本技術領域的普通技術人員來說,在不脫離本發明原理的前提下,還可以做出若干改進和潤飾,這些改進和潤飾也應視為本發明 的保護范圍。 

關 鍵 詞:
一種 消癥丸 制劑 指紋 圖譜 檢測 方法
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