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一種山楂中黃酮成分的熒光檢測方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201410126992.2

申請日:

2014.03.31

公開號:

CN103983621A

公開日:

2014.08.13

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):G01N 21/64申請日:20140331|||公開
IPC分類號: G01N21/64; G01N21/76; G01N1/28 主分類號: G01N21/64
申請人: 杭州師范大學
發明人: 曹君; 曹婉; 胡帥帥; 龐瀟卿
地址: 310036 浙江省杭州市下沙高教園區學林街16號
優先權:
專利代理機構: 杭州天正專利事務所有限公司 33201 代理人: 黃美娟;王曉普
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410126992.2

授權公告號:

||||||

法律狀態公告日:

2016.04.20|||2014.09.10|||2014.08.13

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明提供了一種山楂中黃酮成分的熒光檢測方法:先用甲醇提取山楂得到山楂提取液,稀釋后作為樣品液,進行毛細管電泳熒光檢測,毛細管柱中填充微乳緩沖溶液,所述微乳緩沖溶液的成分為:兩性離子表面活性劑3~12mg/mL、助表面活性劑55~70mg/mL、乙酸乙酯4.5~6mg/mL、2.5~10mmol/L的緩沖鹽、pH值為8~10。然后根據對照品的標準曲線計算得到山楂中各黃酮成分的含量。本發明針對現有色譜技術的不足,提供了一種制備簡單、溶解能力好、粘度低、穩定性好的微乳緩沖液,并在緩沖液中創新使用中性兩性離子表面活性劑;同時,本發明優先使用靈敏度高、重復性好的發光二極管誘導熒光檢測器,并在黃酮檢測方面取得了顯著的效果。

權利要求書

權利要求書
1.  一種山楂中黃酮成分的熒光檢測方法,其特征在于所述方法包括以下步驟:
(1)山楂粉末加入甲醇溶劑,甲醇的體積用量以山楂粉末的質量計為10~30mL/g,稱定重量為M,密閉后加熱超聲提取30~60分鐘,冷卻后加入甲醇補足至重量M,混勻后用0.22μm規格的有機膜過濾,離心,取續濾液制得山楂提取液;
(2)取步驟(1)所得山楂提取液,用甲醇稀釋10~15體積倍后作為樣品液進樣,進行毛細管電泳熒光檢測,毛細管柱中填充微乳緩沖溶液,所述微乳緩沖溶液的成分為:兩性離子表面活性劑3~12mg/mL、助表面活性劑55~70mg/mL、乙酸乙酯4.5~6mg/mL、2.5~10mmol/L的緩沖鹽、pH值為8~10,25~30℃下超聲20~30分鐘,過濾、制得微乳緩沖溶液;
以發光二極管光誘導熒光檢測器進行檢測,檢測波長480nm,得到樣品液的毛細管電泳熒光光譜圖;
所述兩性離子表面活性劑為3-磺丙基十二烷基二甲基甜菜堿、3-磺丙基十四烷基二甲基甜菜堿或3-磺丙基十六烷基二甲基甜菜堿;
所述助表面活性劑為異丙醇、正丁醇、戊醇或環己醇;
所述緩沖鹽為tris或硼砂;
(3)以山奈素的對照品配制不同濃度的對照品溶液,按照步驟(2)同樣條件進行毛細管電泳色譜檢測,獲得山奈素對照品的毛細管電泳熒光光譜圖,以山奈素對照品的摩爾濃度為橫坐標,以山奈素對照品溶液的毛細管電泳熒光光譜圖中色譜峰的峰面積為縱坐標制作山奈素標準曲線,按同樣方法制作芹菜素標準曲線、槲皮素標準曲線、異牡荊素標準曲線、牡荊素標準曲線、異槲皮素標準曲線、金絲桃苷標準曲線;根據樣品液的毛細管電泳熒光光譜圖中相應色譜峰的峰面積及各個標準品的標準曲線計算樣品液中山奈素、芹菜素、槲皮素、異牡荊素、牡荊素、異槲皮素、金絲桃苷含量,相應換算得到山楂中山奈素、芹菜素、槲皮素、異牡荊素、牡荊素、異槲皮素、金絲桃苷含量。

2.  如權利要求1所述的方法,其特征在于所述兩性離子表面活性劑為3-磺丙基十二烷基二甲基甜菜堿。

3.  如權利要求1所述的方法,其特征在于所述助表面活性劑為正丁醇。

4.  如權利要求1所述的方法,其特征在于所述緩沖鹽為硼砂。

5.  如權利要求1所述的方法,其特征在于所述毛細管電泳條件為:分離電壓:30KV,柱溫:35℃。

6.  如權利要求1所述的方法,其特征在于所述微乳緩沖溶液的成分為:兩性離子表面活性劑6mg/mL、助表面活性劑60mg/mL、乙酸乙酯5mg/mL、5mmol/L的緩沖鹽、pH值為9。

7.  如權利要求1所述的方法,其特征在于所述微乳緩沖溶液的成分為:3-磺丙基十二烷基二甲基甜菜堿6mg/mL、正丁醇60mg/mL、乙酸乙酯5mg/mL、5mmol/L的硼砂、pH值為9。

8.  如權利要求1所述的方法,其特征在于所述步驟(2)中,所述過濾用0.22μm規格的有機膜過濾。

9.  如權利要求1所述的方法,其特征在于所述步驟(1)中,所述山楂提取液按以下步驟制得:過三號篩的山楂粉末1.0g,精密稱定,置具塞廣口瓶中,精密加入甲醇15mL,稱定重量M,加熱40~50℃超聲40分鐘,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量至重量M,搖勻,用0.22μm規格的有機膜過濾,離心,取續濾液,即得山楂提取液。

10.  如權利要求1所述的方法,其特征在于所述方法按以下步驟進行:
(1)過三號篩的山楂粉末1.0g,精密稱定,置具塞廣口瓶中,精密加入甲醇15mL,稱定重量M,加熱40~50℃超聲40分鐘,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量至重量M,搖勻,用0.22μm規格的有機膜過濾,離心,取續濾液,即得山楂提取液;
(2)取步驟(1)所得山楂提取液,用甲醇稀釋10~15體積倍后作為樣品液進樣,進行毛細管電泳熒光檢測,毛細管電泳條件為:分離電壓:30KV,柱溫:35℃,毛細管柱中填充微乳緩沖溶液,所述微乳緩沖溶液的成分為:3-磺丙基十二烷基二甲基甜菜堿6mg/mL、正丁醇60mg/mL、乙酸乙酯5mg/mL、5mmol/L的硼砂、pH值為9,25~30℃下超聲20~30分鐘,過濾、制得微乳緩沖溶液;
以發光二極管光誘導熒光檢測器進行檢測,檢測波長480nm,得到樣品液的毛細管電泳熒光光譜圖;
(3)以山奈素的對照品配制不同濃度的對照品溶液,按照步驟(2)同樣條件進行毛細管電泳色譜檢測,獲得山奈素對照品的毛細管電泳熒光光譜圖,以山奈素對照品的摩爾濃度為橫坐標,以山奈素對照品溶液的毛細管電泳熒光光譜圖中色譜峰的峰面積為縱坐標制作山奈素標準曲線,按同樣方法制作芹菜素標準曲線、槲皮素標準曲線、異牡荊素標準曲線、牡荊素標準曲線、異槲皮素標準曲線、金絲桃苷標準曲線;根據樣品液的毛細管電泳熒光光譜圖中相應色譜峰的峰面積及各個標準品的標準曲線計算樣品液中山奈素、芹菜素、槲皮素、異牡荊素、牡荊素、異槲皮素、金絲桃苷含量,相應換算得到山楂中山奈素、芹菜素、槲皮素、異牡荊素、牡荊素、異槲皮素、金絲桃苷含量。

說明書

說明書一種山楂中黃酮成分的熒光檢測方法
技術領域
本發明涉及一種利用發光二極管誘導熒光器的中藥檢測方法,可實現對山楂中不同黃酮成分的品質檢測,屬于中藥分析檢測技術領域。
背景技術
山楂,薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果實。山楂果中含糖類、蛋白質、黃酮類化合物、胡蘿卜素、淀粉、蘋果酸、鈣、鐵等物質,但以黃酮類化合物含量最高。山楂入藥已久,據藥典記載,山楂具有消積化滯、活血化淤、擴張血管、增加冠脈血流量、改善心臟活力、興奮中樞神經系統、軟化血管及利尿和鎮靜等作用。最新研究還發現山楂果中的牡荊素化合物對癌細胞體內生長、增殖和浸潤轉移有一定的抑制作用。
當今社會,高血壓、高血脂等心腦血管疾病已嚴重影響人類的身體健康,因此,對具有降壓、降脂功效的藥物的開發變得越來越重要;研究表明,黃酮類化合物在這方面具有較好的療效,而黃酮類物質廣泛存在于自然界的某些植物和漿果中,且具有多種結構;許多年前,科學家在銀杏樹中提取出了黃酮,現主要在銀杏葉和山楂葉中提取,但是含量相對較低,提取工藝還存在限制。而山楂果實中含有豐富的黃酮,具有很高的利用價值。
近年來,以色譜為主的現代分析技術已廣泛應用于山楂體系,并且獲得了一定的效果。但是,熒光分析特別是對發光二極管誘導熒光檢測分析的報道并不多見。熒光是一種自然發光反應,它是利用頻率相同的光照射樣品,使樣品中的電子吸收能量后發生躍遷,從而釋放出光。目前對山楂成分的研究表明,具有多個共軛結構或剛性的平面結構的物質能產生熒光。而黃酮類物質作為這樣的存在能在檢測器下被檢測。同時,發光二極管誘導熒光檢測法是一種高效、快速、微量的檢測方法,而LED作為光源具有結構簡單、性能穩定、造價低廉的優點。
微乳電動色譜應用廣泛,能同時分離水溶性的、脂溶性的、帶電的和不帶電的物質,微乳液是由表面活性劑、助表面活性劑、油相和鹽溶液所形成的穩定透明液體。微乳的種類按表面活性劑可分為陰離子表面活性劑微乳、陽離子表面活性劑微乳、兩性離子表面活性劑微乳和非離子表面活性劑微乳。目前,還未見有關使用中性兩性離子表面活性劑形成的微乳來作為固定相的報導。
基于上述背景,有效檢測山楂中各種黃酮成分將有助于山楂分析工作的開展。目前,已 有較多文獻報導對山楂中黃酮成分的檢測,但檢測的方法以及儀器的選擇和使用較為單一,基本是以高效液相色譜作為主要的檢測體系,但HPLC成本高,需要各種填料柱,流動相消耗大且有毒性的居多。鑒于上述問題,本發明提供了一種方便,安全且檢測準確度穩定的一種熒光檢測方法。
發明內容
本發明的目的在于提供一種快速、方便、準確進行山楂黃酮檢測的方法。該技術針對現有色譜技術的不足,提供了一種制備簡單、溶解能力好、粘度低、穩定性好的微乳緩沖液,并在緩沖液中創新使用兩性離子表面活性劑;同時,本發明優先使用靈敏度高、重復性好的發光二極管誘導熒光檢測器,并在黃酮檢測方面取得了顯著的效果。
本發明采用的技術方案是:
一種山楂中黃酮成分的熒光檢測方法,所述方法包括以下步驟:
(1)山楂粉末加入甲醇溶劑,甲醇的體積用量以山楂粉末的質量計為10~30mL/g(優選15mL/g),稱定重量為M,密閉后加熱超聲提取30~60分鐘,冷卻后加入甲醇補足至重量M,混勻后用0.22μm規格的有機膜過濾,離心,取續濾液制得山楂提取液;
(2)取步驟(1)所得山楂提取液,用甲醇稀釋10~15體積倍后作為樣品液進樣,進行毛細管電泳熒光檢測,毛細管柱中填充微乳緩沖溶液,所述微乳緩沖溶液的成分為:兩性離子表面活性劑3~12mg/mL、助表面活性劑55~70mg/mL、乙酸乙酯4.5~6mg/mL、2.5~10mmol/L的緩沖鹽、pH值為8~10,25~30℃下超聲20~30分鐘,過濾、制得微乳緩沖溶液;
以發光二極管光誘導熒光檢測器進行檢測,檢測波長480nm,得到樣品液的毛細管電泳熒光光譜圖;
(3)以山奈素的對照品配制不同濃度的對照品溶液,按照步驟(2)同樣條件進行毛細管電泳色譜檢測,獲得山奈素對照品的毛細管電泳熒光光譜圖,以山奈素對照品的濃度為橫坐標,以山奈素對照品溶液的毛細管電泳熒光光譜圖中色譜峰的峰面積為縱坐標制作山奈素標準曲線,按同樣方法制作芹菜素標準曲線、槲皮素標準曲線、異牡荊素標準曲線、牡荊素標準曲線、異槲皮素標準曲線、金絲桃苷標準曲線;根據樣品液的毛細管電泳熒光光譜圖中相應色譜峰的峰面積及各個標準品的標準曲線計算樣品液中山奈素、芹菜素、槲皮素、異牡荊素、牡荊素、異槲皮素、金絲桃苷含量,相應換算得到山楂中山奈素、芹菜素、槲皮素、異牡荊素、牡荊素、異槲皮素、金絲桃苷含量。
所述兩性離子表面活性劑為3-磺丙基十二烷基二甲基甜菜堿、3-磺丙基十四烷基二甲基甜菜堿或3-磺丙基十六烷基二甲基甜菜堿,優選為3-磺丙基十二烷基二甲基甜菜堿。
所述助表面活性劑為異丙醇、正丁醇、戊醇或環己醇,優選為正丁醇。
所述緩沖鹽為tris或硼砂,優選為硼砂。
進一步,優選硼砂在緩沖液中的濃度為5mmol/L。
所述微乳緩沖溶液的pH值為8~10,優選為9。
進一步,優選所述微乳緩沖溶液的成分為:兩性離子表面活性劑6mg/mL、助表面活性劑60mg/mL、乙酸乙酯5mg/mL、5mmol/L的緩沖鹽、pH值為9;
更優選的,優選所述微乳緩沖溶液的成分為:3-磺丙基十二烷基二甲基甜菜堿6mg/mL、正丁醇60mg/mL、乙酸乙酯5mg/mL、5mmol/L的硼砂、pH值為9。
所述步驟(1)中,所述毛細管電泳條件為:分離電壓:30KV,柱溫:35℃。
所述步驟(2)中,所述過濾優選用0.22μm規格的有機膜過濾。
所述步驟(1)中,所述加熱超聲提取優選加熱至40~50℃,在100W,40kHz的條件下超聲提取。
所述步驟(2)中,所述超聲優選在100W,40kHz的條件下進行。
所述毛細管電泳可采用常規毛細管電泳設備,使用未涂層熔融石英毛細管柱,進樣可采用壓力進樣或電壓進樣。
所述步驟(1)中,所述山楂提取液優選按以下步驟制得:山楂粉末(過三號篩)約1.0g,精密稱定,置具塞廣口瓶中,精密加入甲醇15mL,稱定重量,加熱40~50℃超聲40分鐘,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,用0.22μm規格的有機膜過濾,離心,取續濾液,即得山楂提取液。
較為具體的,推薦本發明所述方法按以下步驟進行:
(1)過三號篩的山楂粉末1.0g,精密稱定,置具塞廣口瓶中,精密加入甲醇15mL,稱定重量M,加熱40~50℃超聲40分鐘,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量至重量M,搖勻,用0.22μm規格的有機膜過濾,離心,取續濾液,即得山楂提取液;
(2)取步驟(1)所得山楂提取液,用甲醇稀釋10~15體積倍后作為樣品液進樣,進行毛細管電泳熒光檢測,毛細管電泳條件為:分離電壓:30KV,柱溫:35℃,毛細管柱中填充微乳緩沖溶液,所述微乳緩沖溶液的成分為:3-磺丙基十二烷基二甲基甜菜堿6mg/mL、正丁醇60mg/mL、乙酸乙酯5mg/mL、5mmol/L的硼砂、pH值為9,25~30℃下超聲20~30分鐘,過濾、制得微乳緩沖溶液;
以發光二極管光誘導熒光檢測器進行檢測,檢測波長480nm,得到樣品液的毛細管電泳熒光光譜圖;
(3)以山奈素的對照品配制不同濃度的對照品溶液,按照步驟(2)同樣條件進行毛細管電泳色譜檢測,獲得山奈素對照品的毛細管電泳熒光光譜圖,以山奈素對照品的摩爾濃度為橫坐標,以山奈素對照品溶液的毛細管電泳熒光光譜圖中色譜峰的峰面積為縱坐標制作山奈素標準曲線,按同樣方法制作芹菜素標準曲線、槲皮素標準曲線、異牡荊素標準曲線、牡荊素標準曲線、異槲皮素標準曲線、金絲桃苷標準曲線;根據樣品液的毛細管電泳熒光光譜圖中相應色譜峰的峰面積及各個標準品的標準曲線計算樣品液中山奈素、芹菜素、槲皮素、異牡荊素、牡荊素、異槲皮素、金絲桃苷含量,相應換算得到山楂中山奈素、芹菜素、槲皮素、異牡荊素、牡荊素、異槲皮素、金絲桃苷含量。
本發明的優點在于:
1.本發明方法創意新穎,思路巧妙。首次將兩性離子表面活性劑加入到溶液中,形成溶解能力好、粘度低、穩定性好的微乳緩沖液,對黃酮物質能起到很好的分離效果。
2.本發明中首次使用發光二極管光誘導熒光檢測器(LED)。該檢測器是通過創新的共線光路設計,把分散的LED光聚集在檢測器的毛細管窗口,從而獲得和激光誘導熒光檢測器同等的靈敏度。同時,LED光源在使用壽命以及價格方面都有了很大的突破,和激光光源相比,LED的壽命更長,而價格只有激光光源的一半左右,大大降低了生產成本。
3.本方法應用范圍廣泛,無論是山楂的原料藥材還是山楂食品諸如開胃山楂、鐵山楂等,均能用本檢測方法進行檢測分析。且本發明所述的檢測山楂藥材和山楂食品中黃酮成分這方面的應用應屬首例。
4.本發明提供的實驗檢測效果顯著,且操作環境安全,步驟簡單,快速。
附圖說明
圖1為考察不同種類的表面活性劑的熒光光譜圖。圖中,1、2、3、4、5、6、7分別代表山楂黃酮中不同的有效成分,分別為:1為山奈素;2為芹菜素;3為槲皮素;4為異牡荊素;5為牡荊素;6號為異槲皮素;7號為金絲桃苷。a、b、c分別代表表面活性劑的不同種類,分別為:a為3-磺丙基十二烷基二甲基甜菜堿;b為3-磺丙基十四烷基二甲基甜菜堿;c為3-磺丙基十六烷基二甲基甜菜堿。
圖2為考察不同濃度的表面活性劑的熒光光譜圖。圖中,1、2、3、4、5、6、7分別代表山楂黃酮中不同的有效成分,分別為:1為山奈素;2為芹菜素;3為槲皮素;4為異牡荊素;5為牡荊素;6號為異槲皮素;7號為金絲桃苷。a、b、c、d分別代表表面活性劑的不同濃度,分別為:a為3mg/mL;b為6mg/mL;c為9mg/mL;d為12mg/mL。
圖3為考察不同種類的助表面活性劑的熒光光譜圖。圖中,1、2、3、4、5、6、7分別 代表山楂黃酮中不同的有效成分,分別為:1為山奈素;2為芹菜素;3為槲皮素;4為異牡荊素;5為牡荊素;6號為異槲皮素;7號為金絲桃苷。a、b、c分別代表助表面活性劑的不同種類,分別為:a為異丙醇;b為戊醇;c為環己醇。
圖4為考察不同濃度的助表面活性劑的熒光光譜圖。圖中,1、2、3、4、5、6、7分別代表山楂黃酮中不同的有效成分,分別為:1為山奈素;2為芹菜素;3為槲皮素;4為異牡荊素;5為牡荊素;6號為異槲皮素;7號為金絲桃苷。a、b、c、d分別代表助表面活性劑的不同濃度,分別為:a為55mg/mL;b為60mg/mL;c為65mg/mL;d為70mg/mL。
圖5為考察不同種類的緩沖液的熒光光譜圖。圖中,1、2、3、4、5、6、7分別代表山楂黃酮中不同的有效成分,分別為:1為山奈素;2為芹菜素;3為槲皮素;4為異牡荊素;5為牡荊素;6號為異槲皮素;7號為金絲桃苷。a、b、c分別代表緩沖液的不同種類,分別為:a為tris;b為磷酸氫二鈉;c為乙酸鈉。
圖6為考察不同濃度的緩沖液的熒光光譜圖。圖中,1、2、3、4、5、6、7分別代表山楂黃酮中不同的有效成分,分別為:1為山奈素;2為芹菜素;3為槲皮素;4為異牡荊素;5為牡荊素;6號為異槲皮素;7號為金絲桃苷。a、b、c、d分別代表緩沖液的不同濃度,分別為:a為2.5mmol/L;b為5.0mmol/L;c為7.5mmol/L;d為10mmol/L。
圖7為考察不同的pH值的熒光光譜圖。圖中,1、2、3、4、5、6、7分別代表山楂黃酮中不同的有效成分,分別為:1為山奈素;2為芹菜素;3為槲皮素;4為異牡荊素;5為牡荊素;6號為異槲皮素;7號為金絲桃苷。a、b、c、d、e分別代表微乳緩沖溶液不同的pH值,分別為:a為pH8;b為pH8.5;c為pH9;d為pH9.5;e為pH10。
圖8為山楂提取液的樣品液的熒光光譜圖。圖中,1、2、3、5、6、7分別代表山楂黃酮中不同的有效成分,分別為:1為山奈素;2為芹菜素;3為槲皮素;5為牡荊素;6號為異槲皮素;7號為金絲桃苷。
具體實施方式
由于此熒光檢測方法應用范圍廣,故具體實施方案較多,下面結合實施例對本發明山楂黃酮的質量檢測方法作進一步詳細的描述。
本發明涉及的黃酮對照品溶液,其制備方法參照藥典2010版,具體步驟為:分別取山奈素、芹菜素、槲皮素、異牡荊素、牡荊素、異槲皮素、金絲桃苷的對照品適量,精密稱定,混合置容量瓶中,加甲醇制成每lml含山奈素0.1μg、含芹菜素0.3μg、含槲皮素0.5μg、含異牡荊素0.5μg、牡荊素0.5μg、異槲皮素10μg、金絲桃苷10μg的溶液,即得對照品溶液。
實施例1.表面活性劑種類的考察
1.1取3只干凈的30ml廣口瓶,編號1、2、3,其中1號瓶中加入18mg3-磺丙基十二烷基二甲基甜菜堿,2號瓶中加入18mg3-磺丙基十四烷基二甲基甜菜堿、3號瓶中加入18mg3-磺丙基十六烷基二甲基甜菜堿,后分別在三只瓶中加入222μL正丁醇、16.6μL乙酸乙酯、750μL20mM硼砂水溶液、2.037ml水,30℃下超聲(100W,40kHz)20分鐘,配成微乳緩沖溶液。
1.2取3個0.22μm規格的有機膜過濾器,對應1-3號注射器編號為1、2、3、并根據對應的編號,用過濾器將注射器內的緩沖液過濾,一種緩沖液對應兩個進樣瓶,共裝入6個進樣瓶中。進樣瓶中的緩沖液沖入毛細管柱中作為毛細管電泳的緩沖液,取對照品溶液進樣。
毛細管電泳(安捷倫7100)條件為:未涂層熔融石英毛細管柱65cm×75μm i.d.,有效柱長44cm,分離電壓:30KV,柱溫:35℃,進樣壓力:50mbar,進樣時間:5s。
熒光檢測器(ZETALIFTM LED,皮克公司)條件為:檢測波長480nm,Rise time A:0.1s,PM supply A:650V
圖1顯示了在不同種類表面活性劑下檢測的熒光光譜圖。圖中,1、2、3、4、5、6、7分別代表山楂黃酮中不同的有效成分,分別為:1為山奈素;2為芹菜素;3為槲皮素;4為異牡荊素;5為牡荊素;6號為異槲皮素;7號為金絲桃苷。a、b、c分別代表表面活性劑的不同種類,分別為:a為3-磺丙基十二烷基二甲基甜菜堿;b為3-磺丙基十四烷基二甲基甜菜堿;c為3-磺丙基十六烷基二甲基甜菜堿。
從上圖可以發現,當表面活性劑從十二烷基變到十六烷基時,電流不變,μEOF從6.62*10-4變到6.45*10-4(cm2.V-1.s-1),分析物的遷移時間總體趨勢變慢。而且,十六烷基緩沖液在室溫下比較渾濁,需要在加熱情況下才能澄清,可能原因為,隨著兩性離子表面活性劑中碳原子數目的增加,表面活性劑形成微乳的穩定性逐漸減弱,故3-磺丙基十二烷基二甲基甜菜堿為最佳表面活性劑。
實施例2.表面活性劑濃度的考察
2.1取4只干凈的30ml廣口瓶,編號1、2、3、4,其中1號瓶中加入9mg3-磺丙基十二烷基二甲甜菜堿和2.046mL水,2號瓶加入入18mg3-磺丙基十二烷基二甲甜菜堿和2.037mL水,3號瓶中加入27mg3-磺丙基十二烷基二甲基甜菜堿和2.028mL水、4號瓶中加入36mg3-磺丙基十二烷基二甲甜菜堿和2.019mL水,后分別在四只瓶中加入222μL正丁醇、16.6μL乙酸乙酯、750μL20mM硼砂水溶液,30℃下超聲(100W,40kHz)20分鐘,配成微乳緩沖溶液。
2.2取4個0.22μm規格的有機膜過濾器,對應1-4號注射器編號為1、2、3、4,并根據對應的編號,用過濾器將注射器內的緩沖液過濾,一種緩沖液對應兩個進樣瓶,共裝入8個 進樣瓶中。進樣瓶中的緩沖液沖入毛細管柱中作為毛細管電泳的緩沖液,取對照品溶液進樣。
毛細管電泳條件為:未涂層熔融石英毛細管柱65cm×75μm i.d.,有效柱長44cm,分離電壓:30KV,柱溫:35℃,采用壓力進樣,進樣壓力:50mbar,進樣時間:5s。
熒光檢測器條件為:Rise time A:0.1s,PM supply A:650V
實驗結果如下表1,表1中的數據為有效遷移率(單位:cm2.V-1.s-1)。
表1

圖2顯示了在不同濃度表面活性劑下檢測的熒光光譜圖。圖中,1、2、3、4、5、6、7分別代表山楂黃酮中不同的有效成分,分別為:1為山奈素;2為芹菜素;3為槲皮素;4為異牡荊素;5為牡荊素;6號為異槲皮素;7號為金絲桃苷。a、b、c、d分別代表表面活性劑的不同濃度,分別為:a為3mg/mL;b為6mg/mL;c為9mg/mL;d為12mg/mL。
從上述數據可以發現,隨著兩性離子表面活性劑濃度的增加,分析物的遷移時間總體趨勢變慢。可能原因是,隨著表面活性劑用量的增加,表面活性劑中的疏水基、親水基與分析物的相互作用越來越大,表面活性劑形成微乳的穩定性逐漸減弱,故而遷移時間變慢。所以濃度為6mg/mL的兩性離子表面活性劑為最佳條件。
實施例3.助表面活性劑種類考察
3.1取3只干凈的30ml廣口瓶,編號1、2、3,其中1號瓶中加入229μL異丙醇,2號瓶中加入221μL戊醇、3號瓶中加入190μL環己醇,后分別在三只瓶中加入18mg3-磺丙基十二烷基二甲甜菜堿、16.6μL乙酸乙酯、750μL20mM硼砂水溶液、2.037ml水,30℃下超聲(100W,40kHz)20分鐘,配成微乳緩沖溶液。
3.2取3個0.22μm規格的有機膜過濾器,對應1-3號注射器編號為1、2、3、并根據對應的編號,用過濾器將注射器內的緩沖液過濾,一種緩沖液對應兩個進樣瓶,共裝入6個進樣瓶中。進樣瓶中的緩沖液沖入毛細管柱中作為毛細管電泳的緩沖液,取對照品溶液進樣。
毛細管電泳條件為:未涂層熔融石英毛細管柱65cm×75μm i.d.,有效柱長44cm,分離電壓:30KV,柱溫:35℃,進樣壓力:50mbar,進樣時間:5s。
熒光檢測器條件為:Rise time A:0.1s,PM supply A:650V。
圖3顯示了在不同種類助表面活性劑下檢測的熒光光譜圖。圖中,1、2、3、4、5、6、7分別代表山楂黃酮中不同的有效成分,分別為:1為山奈素;2為芹菜素;3為槲皮素;4為異牡荊素;5為牡荊素;6號為異槲皮素;7號為金絲桃苷。a、b、c分別代表助表面活性劑的不同種類,分別為:a為異丙醇;b為戊醇;c為環己醇。
上圖說明,異丙醇作為助表面活性劑時分離效果最差,且峰的對稱性和響應度都不好;戊醇和環己醇作為助表面活性劑時,部分分析物達不到很好的分離,同時戊醇和環己醇在配成緩沖溶液時,微乳液混濁,需要較高溫度才能澄清,這說明它們的乳化力比較弱。其可能原因為,隨著碳原子數目的增加,醇分子的體積逐漸增大,嵌入油水界面膜的阻力依次增大,從而導致界面膜的剛性增強,不易形成微乳。故正丁醇為最佳助表面活性劑。
實施例4.助表面活性劑濃度的考察
4.1取4只干凈的30ml廣口瓶,編號1、2、3、4,其中1號瓶中加入204μL正丁醇和2.052mL水,2號瓶中加入222μL正丁醇和2.037mL水,3號瓶中加入241μL正丁醇和2.022mL水,4號瓶中加入259μL正丁醇和2.007mL水,后分別在四只瓶中加入18mg3-磺丙基十二烷基二甲甜菜堿、16.6μL乙酸乙酯、750μL20mM硼砂水溶液,30℃下超聲(100W,40kHz)20分鐘,配成微乳緩沖溶液。
4.2取4個0.22μm規格的有機膜過濾器,對應1-4號注射器編號為1、2、3、4,并根據對應的編號,用過濾器將注射器內的緩沖液過濾,一種緩沖液對應兩個進樣瓶,共裝入8個進樣瓶中。進樣瓶中的緩沖液沖入毛細管柱中作為毛細管電泳的緩沖液,取對照品溶液進樣。
毛細管電泳條件為:未涂層熔融石英毛細管柱65cm×75μm i.d.,有效柱長44cm,分離電壓:30KV,柱溫:35℃,進樣壓力:50mbar,進樣時間:5s。
熒光檢測器條件為:Rise time A:0.1s,PM supply A:650V
實驗結果如下表2,表2中的數據為有效遷移率(單位:cm2.V-1.s-1)。
表2

圖4顯示了在不同濃度助表面活性劑下檢測的熒光光譜圖。圖中,1、2、3、4、5、6、7分別代表山楂黃酮中不同的有效成分,分別為:1為山奈素;2為芹菜素;3為槲皮素;4為異牡荊素;5為牡荊素;6號為異槲皮素;7號為金絲桃苷。a、b、c、d分別代表助表面活性劑的不同濃度,分別為:a為55mg/mL;b為60mg/mL;c為65mg/mL;d為70mg/mL。
上述數據說明,隨著助表面活性劑(正丁醇)濃度的增加,分析物的遷移時間總體趨勢變慢,但異槲皮素與金絲桃苷的分離度隨濃度的增大而緩慢變大。其可能的原因為,助表面活性劑能改變表面活性劑的表面活性及親水親油平衡性,調整水和油的極性。當正丁醇濃度增加時,醇稀釋了水油界面的表面活性分子,減弱了表面活性劑分子之間的相互作用,從而使遷移時間依次變慢。綜合考慮,故濃度為60mg/mL的正丁醇是最優條件。
實施例5.緩沖液種類考察
5.1取3只干凈的30ml廣口瓶,編號1、2、3,其中1號瓶中加入1.5mL5mM乙酸鈉水溶液,2號瓶中加入1.5mL5mM Na2HPO4水溶液,3號瓶中加入1.5mL5mM tris-HCl水溶液,后分別在三只瓶中加入18mg3-磺丙基十二烷基二甲甜菜堿、16.6μL乙酸乙酯、222μL正丁醇、1.287ml水,30℃下超聲(100W,40kHz)20分鐘,配成微乳緩沖溶液。
5.2取3個0.22μm規格的有機膜過濾器,對應1-3號注射器編號為1、2、3、并根據對應的編號,用過濾器將注射器內的緩沖液過濾,一種緩沖液對應兩個進樣瓶,共裝入6個進樣瓶中。進樣瓶中的緩沖液沖入毛細管柱中作為毛細管電泳的緩沖液,取對照品溶液進樣。
毛細管電泳條件為:未涂層熔融石英毛細管柱65cm×75μm i.d.,有效柱長44cm,分離電壓:30KV,柱溫:35℃,進樣壓力:50mbar,進樣時間:5s。
熒光檢測器條件為:Rise time A:0.1s,PM supply A:650V
圖5顯示了在不同種類緩沖液下檢測的熒光光譜圖。圖中,1、2、3、4、5、6、7分別代表山楂黃酮中不同的有效成分,分別為:1為山奈素;2為芹菜素;3為槲皮素;4為異牡荊素;5為牡荊素;6號為異槲皮素;7號為金絲桃苷。a、b、c分別代表緩沖液的不同種類,分別為:a為tris-HCl;b為磷酸氫二鈉;c為乙酸鈉。
電泳數據表明,當以tris-HCl溶液作為緩沖液時,電流為7μA,它能使分析物達到基本分離,但物質響應很低;而當以磷酸氫二鈉和乙酸鈉溶液作為緩沖液時,分析物無法分離。故以硼砂溶液作為緩沖液是最佳條件。
實施例6.緩沖液濃度考察
61取4只干凈的30ml廣口瓶,編號1、2、3、4,其中1號瓶中加入0375mL20mM硼 砂溶液和2.412mL水,2號瓶中加入0.750mL20mM硼砂溶液和2.037mL水,3號瓶中加入1.125mL20mM硼砂溶液和1.662mL水,4號瓶中加入1.5mL20mM硼砂溶液和1.287mL水,后分別在四只瓶中加入18mg3-磺丙基十二烷基二甲甜菜堿、16.6μL乙酸乙酯、222μL正丁醇,30℃下超聲(100W,40kHz)20分鐘,配成微乳緩沖溶液。
6.2取4個0.22μm規格的有機膜過濾器,對應1-4號注射器編號為1、2、3、4,并根據對應的編號,用過濾器將注射器內的緩沖液過濾,一種緩沖液對應兩個進樣瓶,共裝入8個進樣瓶中。進樣瓶中的緩沖液沖入毛細管柱中作為毛細管電泳的緩沖液,取對照品溶液進樣。
毛細管電泳條件為:未涂層熔融石英毛細管柱65cm×75μm i.d.,有效柱長44cm,分離電壓:30KV,柱溫:35℃,進樣壓力:50mbar,進樣時間:5s。
熒光檢測器條件為:Rise time A:0.1s,PM supply A:650V
實驗結果如下表3,表3中的數據為有效遷移率(單位:cm2.V-1.s-1)。
表3

圖6顯示了在不同濃度緩沖液下檢測的熒光光譜圖。圖中,1、2、3、4、5、6、7分別代表山楂黃酮中不同的有效成分,分別為:1為山奈素;2為芹菜素;3為槲皮素;4為異牡荊素;5為牡荊素;6號為異槲皮素;7號為金絲桃苷。a、b、c、d分別代表緩沖液的不同濃度,分別為:a為2.5mmol/L;b為5.0mmol/L;c為7.5mmol/L;d為10mmol/L。
上述數據可知,當緩沖液中硼砂濃度逐漸增加時,電流量從10μA升至41μA,分析物的熒光響應度依次升高,但遷移時間相應變慢。可能的原因為,電泳緩沖溶液具有一定的導電性,當緩沖液濃度較低時,Na+離子的濃度太低,導電能力弱,熒光響應變低;相應的,當緩沖液濃度升高時,導電能力強,熒光響應高,但濃度太高時會造成電流過大,從而使膠發熱甚至熔化。綜合考慮,故選擇濃度為5.0mmol/L的緩沖液為最佳條件。
實施例7.pH值考察
7.1取4只干凈的30ml廣口瓶,編號1、2、3、4,其中1號瓶中加入200μL的1mol/L硼酸和1.837mL水,2號瓶中加入100μL的1mol/L硼酸和1.937mL水,3號瓶中加入2.037mL 水,4號瓶中加入12.5μL的1mol/L氫氧化鈉和2.0245mL水,5號瓶中加入25μL的1mol/L氫氧化鈉和2.012mL水,后分別在五只瓶中加入18mg3-磺丙基十二烷基二甲甜菜堿、16.6μL乙酸乙酯、222μL正丁醇,0.75mL20mM硼砂水溶液,30℃下超聲(100W,40kHz)20分鐘,配成微乳緩沖溶液,1、2、3、4、5號瓶的pH值分別為8.0,,8.5,9.0,9.5,10.0。
7.2取5個0.22μm規格的有機膜過濾器,對應1-5號注射器編號為1、2、3、4、5,并根據對應的編號,用過濾器將注射器內的緩沖液過濾,一種緩沖液對應兩個進樣瓶,共裝入10個進樣瓶中。進樣瓶中的緩沖液沖入毛細管柱中作為毛細管電泳的緩沖液,取對照品溶液進樣。
毛細管電泳條件為:未涂層熔融石英毛細管柱65cm×75μm i.d.,有效柱長44cm,分離電壓:30KV,柱溫:35℃,進樣壓力:50mbar,進樣時間:5s。
熒光檢測器條件為:Rise time A:0.1s,PM supply A:650V
實驗結果如下表4,表4中的數據為有效遷移率(單位:cm2.V-1.s-1)。
表4

圖7顯示了在不同pH下檢測的熒光光譜圖。圖中,1、2、3、4、5、6、7分別代表山楂黃酮中不同的有效成分,分別為:1為山奈素;2為芹菜素;3為槲皮素;4為異牡荊素;5為牡荊素;6號為異槲皮素;7號為金絲桃苷。a、b、c、d、e分別代表不同的pH,分別為:a為pH8;b為pH8.5;c為pH9;d為pH9.5;e為pH10。
從圖中可知,在pH8和pH8.5時,槲皮素與異牡荊素的峰部分重疊,分離效果較差,在pH9時,分析物達到完全分離,且遷移時間隨著pH的增大而變快;但是當pH>9時,牡荊素與異槲皮素的峰部分重疊,在pH10時,達到完全重疊,且遷移時間隨pH的增大而變慢。可能原因為,pH值是CE分離的重要參數之一,它能通過調解電滲流的速率以及分析物的電荷來影響分析物的遷移速率。故pH9為最佳條件。
實施例8
8.1取1只干凈的30ml廣口瓶,加入18mg3-磺丙基十二烷基二甲基甜菜堿,后在瓶中加入222μL正丁醇、16.6μL乙酸乙酯、750μL20mM硼砂水溶液、2.037ml水,30℃下超聲(100W, 40kHz)20分鐘,配成微乳緩沖溶液。
8.2取1個0.22μm規格的有機膜過濾器,用過濾器將注射器內的緩沖液過濾,一種緩沖液對應兩個進樣瓶。進樣瓶中的緩沖液沖入毛細管柱中作為毛細管電泳的緩沖液,取樣品液進樣。
山楂提取液按以下步驟制得:山楂粉末(過三號篩)約1.0g,精密稱定,置具塞廣口瓶中,精密加入甲醇15mL,稱定重量,加熱50℃下超聲(100W,40kHz)40min,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,0.22μm規格的有機膜過濾,離心,取續濾液,即得山楂提取液。取30μL山楂提取液,加入370μL甲醇,定容后作為樣品液。
毛細管電泳條件為:未涂層熔融石英毛細管柱65cm×75μm i.d.,有效柱長44cm,分離電壓:30KV,柱溫:35℃,進樣壓力:50mbar,進樣時間:5s。
熒光檢測器條件為:Rise time A:0.1s,PM supply A:650V.
圖8為山楂提取液樣品液的熒光光譜圖。
以山奈素的對照品配制不同濃度的對照品溶液,按照步驟(2)同樣條件進行毛細管電泳色譜檢測,獲得山奈素對照品的毛細管電泳熒光光譜圖,以山奈素對照品的摩爾濃度為橫坐標,以山奈素對照品溶液的毛細管電泳熒光光譜圖中色譜峰的峰面積為縱坐標制作山奈素標準曲線,按同樣方法制作芹菜素標準曲線、槲皮素標準曲線、異牡荊素標準曲線、牡荊素標準曲線、異槲皮素標準曲線、金絲桃苷標準曲線;根據樣品液的毛細管電泳熒光光譜圖中相應色譜峰的峰面積及各個標準品的標準曲線計算樣品液中山奈素、芹菜素、槲皮素、異牡荊素、牡荊素、異槲皮素、金絲桃苷含量,相應換算得到山楂中山奈素、芹菜素、槲皮素、異牡荊素、牡荊素、異槲皮素、金絲桃苷含量,實驗結果如下表5,表5中的數據為山楂中各成分的含量(單位:μg g-1)。
表5

從圖8可以看出,大多數目標產物可以在5分鐘內準確測得,基質對物質的分離影響不大。
日內精密度
1.取1只干凈的30ml廣口瓶,加入18mg3-磺丙基十二烷基二甲甜菜堿,后在瓶中加入222μL正丁醇、16.6μL乙酸乙酯、750μL20mM硼砂、2.037ml水,30℃下超聲20分鐘,配成微乳緩沖溶液。
2.取1個0.22μm規格的有機膜過濾器,用注射器吸取一定體積,再用過濾器將注射器內的緩沖液過濾,裝入2個進樣瓶中。
3.取對照品溶液用毛細管電泳(CE)進樣,熒光檢測器分析,在同一天內不同的時間段進樣6次。
日間精密度
1.取1只干凈的30ml廣口瓶,加入18mg3-磺丙基十二烷基二甲甜菜堿,后在瓶中加入222μL正丁醇、16.6μL乙酸乙酯、750μL20mM硼砂、2.037ml水,30℃下超聲20分鐘,配成微乳緩沖溶液。
2.取1個0.22μm規格的有機膜過濾器,用注射器吸取一定體積,再用過濾器將注射器內的緩沖液過濾,裝入2個進樣瓶中。
3.取對照品溶液用毛細管電泳(CE)進樣,熒光檢測器分析,在三天內相同的時間點進樣,每天進兩次。
重復性
1.取5只干凈的30ml廣口瓶,編號1、2、3、4、5,其中1號瓶中加入0.5001mg山楂粉末,2號瓶中加入0.5001mg山楂粉末、3號瓶中加入0.5001mg山楂粉末,4號瓶中加入0.4999mg山楂粉末,5號瓶中加入0.5002mg山楂粉末,后分別在五只瓶中加入15mL甲醇,50℃下超聲40min,過濾,取濾液,離心,取續濾液。
2.取五個進樣瓶,編號1、2、3、4、5,分別取70μL編號相對應的濾液,再加入330μL甲醇,搖勻。
3.取1只干凈的30ml廣口瓶,在瓶中加入18mg3-磺丙基十二烷基二甲甜菜堿、222μL正丁醇、16.6μL乙酸乙酯、750μL20mM硼砂、2.037ml水,30℃下超聲20分鐘,配成微乳緩沖溶液。
4.取1個0.22μm規格的有機膜過濾器,用注射器吸取一定體積,再用過濾器將注射器內的緩沖液過濾,裝入2個進樣瓶中。
5.用毛細管電泳(CE)進樣,熒光檢測器分析。
加樣回收率
1.取編號為3的山楂粉末樣品瓶,棄去100μL溶液,再在樣品瓶中加入100μL對照品,搖勻。
2.用毛細管電泳(CE)進樣,熒光檢測器分析。
上述精密度、重復性、回收率結果見下表6。
表6

結果表明,本發明對山楂黃酮的檢測準確度高,重復性好。

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