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一種抗菌細菌纖維素及其制備方法與應用.pdf

關 鍵 詞:
一種 抗菌 細菌 纖維素 及其 制備 方法 應用
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摘要
申請專利號:

CN201510247433.1

申請日:

2015.05.15

公開號:

CN104892842A

公開日:

2015.09.09

當前法律狀態:

駁回

有效性:

無權

法律詳情: 發明專利申請公布后的駁回IPC(主分類):C08F 251/02申請公布日:20150909|||實質審查的生效IPC(主分類):C08F 251/02申請日:20150515|||公開
IPC分類號: C08F251/02; C08F220/34; A61L15/44 主分類號: C08F251/02
申請人: 深圳先進技術研究院
發明人: 朱勇軍; 胡陽; 周新; 潘浩波
地址: 518055廣東省深圳市南山區西麗大學城學苑大道1068號
優先權:
專利代理機構: 北京三友知識產權代理有限公司11127 代理人: 韓蕾
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201510247433.1

授權公告號:

||||||

法律狀態公告日:

2018.10.09|||2015.10.07|||2015.09.09

法律狀態類型:

發明專利申請公布后的駁回|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明提供一種抗菌細菌纖維素及其制備方法與應用,所述方法包括如下步驟:將1~10重量份的細菌纖維素以及0.5~10重量份的四價鈰鹽加入100~500重量份的酸性水溶液中,在惰性環境下,加入10~100重量份的不飽和季銨鹽單體,在30~80℃反應4~24h,加入阻聚劑終止反應,即得到所述抗菌細菌纖維素。所述方法十分簡單,成本低,有利于工業生產;并且無需使用有機溶劑,在水相體系中即可完成接枝反應;本發明的方法接枝率高,并且通過控制反應溫度可直接控制接枝率。所得到的抗菌細菌纖維素穩定高、抗菌效果好、生物安全性高。

權利要求書

權利要求書
1.  一種抗菌細菌纖維素的制備方法,所述方法包括如下步驟:將1~10重量份的細菌纖維素以及0.5~10重量份的四價鈰鹽加入100~500重量份的酸性水溶液中,在惰性環境下,加入10~100重量份的不飽和季銨鹽單體,在30~80℃反應4~24h,加入阻聚劑終止反應,即得到所述抗菌細菌纖維素。

2.  根據權利要求1所述的方法,其中,所述的方法還包括得到所述抗菌細菌纖維素后,將該抗菌細菌纖維素在沸水中煮10~120min,優選30~90min。

3.  根據權利要求1所述的方法,其中,所述的不飽和季銨鹽單體包括甲基丙烯酰氧乙基三甲基鹵化銨、丙烯酰氧乙基三甲基鹵化銨、丙烯酰氧基乙基二甲基芐基鹵化銨中的一種或幾種;優選地,所述不飽和季銨鹽單體加入反應體系后的最終濃度為0.1~2.0mol/L。

4.  根據權利要求1所述的方法,其中,所述的四價鈰鹽為硝酸鈰銨。

5.  根據權利要求1所述的方法,其中,所述的酸性水溶液包括硝酸水溶液、硫酸水溶液、鹽酸水溶液、高氯酸水溶液中的一種或幾種;優選地,所述酸性水溶液的濃度為1.0×10-2~1.0mol/L。

6.  根據權利要求1所述的方法,其中,所述的阻聚劑包括對苯二酚、2-叔丁基對苯二酚、2,5-二叔丁基對苯二酚中的一種或幾種,其用量為所述細菌纖維質量的50%~100%;優選地,可將所述的阻聚劑配制成質量濃度為0.5%~5%的阻聚劑水溶液添加至反應體系中。

7.  根據權利要求1所述的方法,其中,所述的細菌纖維素為純化的細菌纖維素。

8.  一種抗菌細菌纖維素,其是以細菌纖維素為主鏈,通過接枝不飽和季銨鹽得到的,并且所述抗菌細菌纖維素的接枝率為5%~40%,優選地,接枝率為9%~30%,更優選地,接枝率為15%~30%。

9.  根據權利要求8所述的抗菌細菌纖維素,其是根據權利要求1~7中任一項所述的方法制備得到的。

10.  權利要求1~7中制備得到的抗菌細菌纖維素或權利要求8~9中所述的抗菌細菌纖維素在制備抗菌敷料中的應用,優選地,所述的抗菌敷料為抗大腸桿菌和/或金黃色葡萄糖球菌的敷料。

說明書

說明書一種抗菌細菌纖維素及其制備方法與應用
技術領域
本發明涉及一種抗菌細菌纖維素及其制備方法與應用,屬于生物醫用材料技術領域。
背景技術
細菌纖維素(bacterial cellulose,簡稱BC)作為一種新型的“濕性”敷料,其具有獨特的物理、化學和機械性質,例如:超細網狀結構、高抗張強度和彈性模量、高親水性、良好的透氣吸水及透水性能、優異的持水性和高濕強度、良好的體內體外生物相容性,并且使用后產生的醫用廢料經生物酶處理后可完全降解。大量研究表明細菌纖維素水凝膠敷料能夠起到保溫保濕的作用,同時能夠有效促進傷口愈合;并且敷料可以任意裁剪,與皮膚有極好的伏貼性,具有一定的鎮痛效果;其超細網狀結構、優異的機械性能和抗張強度使得輔料有一定的可縫性,便于固定。但是,細菌纖維素本身不具備抗菌性能,而且在使用過程中很容易受到空氣或水中有害微生物的污染,從而引發一系列的感染問題,因此有效提高和改善其抗菌能力尤為重要。采用細菌纖維素作為抗菌材料的基材具有以往其它生物材料、織物等無可比擬的優點,有望成為一種較理想的醫用敷料。國外采用單純的細菌纖維素作為敷料已有報道,并且已經產業化用于臨床,如Xylos公司推出細菌纖維素創傷敷料和抗菌創傷敷料也已在臨床上得到了廣泛的應用。而國內關于細菌纖維素的研究仍處于起步階段,有關細菌纖維素敷料的研究鮮有報道。綜上所述,賦予細菌纖維素的較強抗菌性能對其在生物醫用材料領域的應用至關重要。
為了使細菌纖維素具備抗菌的功能,現有技術多采用物理復合的方式,其是在細菌纖維素的培養過程中加入抗菌材料,這種方式使細菌纖維素合成微生物的活性被部分抑制,導致了細菌纖維素合成緩慢,產率大大降低。另一種方式是將細菌纖維素置于殺菌劑溶液中通過浸泡吸附的方式得到抗菌細菌纖維素,但這種方式中殺菌劑的吸附效率及穩定性都不高,并且在治療中另外添加抗菌劑的方式也增加了操作的繁復性。CN101708341 B采用細菌纖維素水凝膠與含銀離子溶液共浸泡的方法制備了載納 米銀抗菌細菌纖維素水凝膠,雖然該材料具有良好的抗菌性能,但是納米銀主要是通過物理吸附的方式沉積在細菌纖維素網絡中,其使用過程中或多或少會存在納米銀的釋放,而納米銀的體內生物安全性在學術界一直存在著爭議,目前SFDA對此類醫用材料的批復較為謹慎。CN101905031 B同樣也是采用物理吸附抗菌劑磺酸嘧啶銀的方法,其工藝穩定性難以保證,因而其抗菌性會受到一定的影響。因此,無論是通過物理復合的方式還是浸泡吸附的方式均不能高效、簡單得得到抗菌細菌纖維素,并且難以保障所得抗菌細菌纖維素的穩定性、防止抗菌劑進入人體。
CN103724569 A公開了一種抗菌細菌纖維素及其制備方法,該制備方法主要包括:先在細菌纖維素主鏈上通過酯化反應引入含雙鍵的不飽和有機酸或酸酐,然后再通過酯化反應引入的不飽和雙鍵與不飽和季銨鹽單體發生聚合反應從而得到抗菌細菌纖維素。盡管通過上述方法可以得到了一種接枝的抗菌細菌纖維素,但該方法的比較繁瑣,工藝相對復雜,不利于工業生產。尤其是得到含有雙鍵的酯化細菌纖維素的工藝,該步反應是在油溶反應體系下進行,反應需要大量的有機溶劑,例如甲苯,不可避免的會產生有機溶劑的污染,生物安全性低,且提高了整個工藝的生產成本;該方案中接枝抗菌細菌纖維素的總體收率及接枝率受制于酯化反應,從該案圖1中可以看出,盡管酯化前后紅外圖譜存在一定的差別,但差別不是很大,說明細菌纖維素上酯化效率不太高,因此后續的聚合反應接枝率較低并且不可控。
因此,如何通過簡單、接枝成功率高并且接枝率可控、后處理簡單的合成方法來制備穩定性高、抗菌效果好、生物安全性高的抗菌細菌纖維素是本領域的迫切需求。
發明內容
本發明的目的在于提供一種抗菌細菌纖維素的制備方法,該方法在工藝的簡便性、接枝成功率、接枝率的可控性以及后處理的方便性至少一方面優于現有技術。
本發明的另一目的在于提供一種抗菌細菌纖維素,該抗菌細菌纖維素在穩定性、抗菌效果、生物安全性至少一方面優于現有技術。
本發明的再一目的在于提供一種抗菌細菌纖維素的應用。
為此,一方面本發明提供一種抗菌細菌纖維素的制備方法,所述方法包括如下步驟:將1~10重量份的細菌纖維素以及0.5~10重量份的四價鈰鹽加入100~500重量份的酸性水溶液中,在惰性環境下,加入10~100重量份的不飽和季銨鹽單體,在30~80℃ 反應4~24h,加入阻聚劑終止反應,即得所述抗菌細菌纖維素。
本發明抗菌細菌纖維素的制備方法中,優選地,所述四價鈰鹽為1~5重量份。
本發明抗菌細菌纖維素的制備方法中,優選地,所述酸性水溶液為200~400重量份。
本發明抗菌細菌纖維素的制備方法中,優選地,所述不飽和季銨鹽單體為30~80重量份。
本發明抗菌細菌纖維素的制備方法中,優選地,所述反應溫度為40~75℃;更優選地,所述反應溫度為50~75℃;再優選地,所述反應溫度為60~75℃。
本發明以四價鈰離子為引發劑,在細菌纖維素主鏈上直接接枝不飽和季銨鹽類單體,相較于CN103724569 A提供的先酯化后聚合的方法,本發明的方法十分簡單,成本低,有利于工業生產;并且無需使用有機溶劑,在酸性水相體系中即可完成接枝反應;本發明的方法接枝率高,并且通過控制反應溫度可直接控制接枝率。
根據本發明的具體實施方案,在本發明所述的抗菌細菌纖維素的制備方法中,還包括將得到的所述抗菌細菌纖維素在沸水中煮10~120min,優選30~90min。之后選擇性地進行純化處理,例如洗滌、干燥或不干燥、滅菌。其中,干燥方法可采用現有技術中的常規方法,例如自然干燥、離心干燥、真空干燥、機械壓除干燥、冷凍干燥等方法中的一種或幾種,干燥的程度可依據所需抗菌細菌纖維素的狀態而定,所需抗菌細菌纖維素的狀態可根據不同的傷口類型選擇;例如,對于干性創傷,需采用濕性敷料,則可選擇使用抗菌細菌纖維素水凝膠,此時,無需干燥或可采用上述干燥方法脫除部分水分;而對于有大量滲出液的傷口,則選擇干態的抗菌性細菌纖維素,此時,可通過上述干燥方法進行基本完全脫水。滅菌方法可采用現有技術中的常規方法,例如,可將得到的抗菌細菌纖維素包裝后采用γ輻射、壓力蒸氣或高能電子輻照等方法進行滅菌。
根據本發明的具體實施方案,在本發明所述的抗菌細菌纖維素的制備方法中,其中,所述的不飽和季銨鹽單體為含有不飽和鍵的季銨鹽。優選地,所述不飽和季銨鹽單體包括但不限于甲基丙烯酰氧乙基三甲基鹵化銨、丙烯酰氧乙基三甲基鹵化銨、丙烯酰氧基乙基二甲基芐基鹵化銨中的一種或幾種,例如甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨、丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨、丙烯酰氧乙基二甲基芐基氯化銨、甲基丙烯酰氧乙基三甲基溴化銨、丙烯酰氧乙基三甲基溴化銨、丙烯酰氧乙基二甲基芐基溴化銨等。 優選地,所述不飽和季銨鹽單體加入反應體系后的最終濃度為0.1~2.0mol/L,更優選地,其最終濃度為0.5~1.5mol/L。
根據本發明的具體實施方案,在本發明所述的抗菌細菌纖維素的制備方法,其中,所述的四價鈰鹽為鈰的價態為四價的鈰鹽,包括但不限于硝酸鈰銨。
根據本發明的具體實施方案,在本發明所述的抗菌細菌纖維素的制備方法中,其中,所述的酸性水溶液包括但不限于硝酸水溶液、硫酸水溶液、鹽酸水溶液、高氯酸水溶液中的一種或幾種。優選地,所述酸性水溶液的濃度為1.0×10-2~1.0mol/L,更優選地,其濃度為0.05~0.5mol/L。
根據本發明的具體實施方案,在本發明所述的抗菌細菌纖維素的制備方法中,其中,所述的阻聚劑包括但不限于對苯二酚、2-叔丁基對苯二酚或2,5-二叔丁基對苯二酚中的一種或幾種,其用量為所述細菌纖維素質量的50%~100%。優選地,可將所述的阻聚劑配制成質量濃度為0.5%~5%的阻聚劑水溶液添加至反應體系中。
本發明中所述的細菌纖維素為微生物合成的纖維素,通常所述的細菌纖維素的聚合度為1000~5000,其可以購買(例如,于海南億德食品有限公司)或按現有技術中記載的方法制備得到,例如可按如下方法制備得到:
將細菌纖維素生產菌株按培養基體積比1:100的比例接種到所述培養液中,然后在28℃~32℃潔凈條件下靜態培養3~7天獲得細菌纖維素膜。其中的培養液為:0.1~0.4g/ml葡萄糖、0.03~0.06g/ml蛋白胨、0.02~0.03g/ml酵母粉、0.01~0.02g/ml磷酸氫二鈉、0.005~0.015g/ml硫酸鎂、0.005~0.01g/ml硫酸銨、0.005~0.015ml/ml玉米糖漿提取液。
其中所述的細菌纖維素生產菌株包括但不限于木醋桿菌、產醋桿菌、醋化桿菌、巴氏醋桿菌、葡萄糖桿菌、農桿菌、根瘤菌、八疊球菌、洋蔥假單胞菌、椰毒假單胞菌或空腸彎曲菌。
根據本發明的具體實施方案,在本發明所述的抗菌細菌纖維素的制備方法中,其中所述的細菌纖維素為純化的細菌纖維素,純化的細菌纖維素可以購買或按現有技術制備得到,例如CN103724569A中的方法,或按如下方法制備得到:
將培養后獲得的細菌纖維素膜粗品用大量清水多次沖洗除去表面的培養基及細菌殘體;再用質量濃度為1%~3%的十二烷基硫酸鈉(SDS),60℃條件下攪拌浸泡12~24h,以除去細菌纖維素里面的殘留的雜蛋白;用大量去離子水沖洗凈后,用0.1~1.0 mol/L NaOH溶液,60℃條件下處理1~3h,已除去細菌纖維素中致熱源;再用0.1mol/L的乙酸溶液中和處理并用多次蒸餾水浸泡至中性,在-20~80℃冰箱中預冷凍4~24h,在冷凍干燥機中進行冷凍干燥24~48h,得到干燥好的BC干膜,并室溫干燥保存備用。
另一方面,本發明提供一種抗菌細菌纖維素,其是以細菌纖維素為主鏈,通過接枝不飽和季銨鹽得到的,并且所述抗菌細菌纖維素的接枝率為5%~40%,優選地,接枝率為9%~30%,更優選地,接枝率為15%~30%。所述的抗菌細菌纖維素可根據本發明所述的方法制備得到的。由于本發明是采用接枝反應將季銨鹽單元通過共價鍵接枝到細菌纖維素鏈上,因此本發明所述的抗菌細菌纖維素穩定高,能有效防止抗菌劑進入人體。本發明通過實驗證實所述的抗菌細菌纖維素對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等具有良好的抗菌效果,并且隨著接枝率的提高,抗菌效果越好。由于本發明制備方法中未使用任何有機溶劑,因此,本發明所得的抗菌細菌纖維素生物安全性高。
再一方面,本發明提供所述的抗菌細菌纖維素在制備抗菌敷料中的應用,優選地,所述的抗菌敷料為抗大腸桿菌和/或金黃色葡萄糖球菌敷料。由于本發明的所述的抗菌細菌纖維素具有良好的穩定性、抗菌效果以及生物安全性,因此,將本發明所述的抗菌細菌纖維素用作促進傷口愈合的敷料時,可有效預防傷口感染。
綜上所述,本發明提供了一種抗菌細菌纖維素及其制備方法,所述方法十分簡單,成本低,有利于工業生產;并且無需使用有機溶劑,在水相體系中即可完成接枝反應;本發明的方法接枝率高,并且通過控制反應溫度可直接控制接枝率。所得到的抗菌細菌纖維素穩定高、抗菌效果好、生物安全性高。
附圖說明
圖1為原料BC以及接枝BC I的紅外圖譜。
圖2為原料BC、接枝BC I、接枝BC II及接枝BC III抗大腸桿菌效果圖。
圖3為原料BC、接枝BC I、接枝BC II及接枝BC III抗金黃色葡萄球菌效果圖。
具體實施方式
為了對本發明的技術特征、目的和有益效果有更加清楚的理解,現結合具體實例對本發明的技術方案進行以下詳細說明,應理解這些實例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
實施例1
本實施例按如下方法制備得到所使用的細菌纖維素:
將細菌纖維素生產菌株(ATCC700178)按培養基體積比1:100的比例接種到培養液中,然后在30℃潔凈條件下靜態培養7天獲得細菌纖維素膜。其中的培養液為:20.0g/L葡萄糖、5.0g/L蛋白胨、5.0g/L酵母粉、2.7g/L磷酸氫二鈉、1.0g/ml硫酸鎂、1.0g/ml硫酸銨、1.0ml/ml玉米糖漿提取液。
將上述獲得的細菌纖維素膜粗品用大量清水多次沖洗除去表面的培養基及細菌殘體;再用質量濃度為2.0%的十二烷基硫酸鈉(SDS),60℃條件下攪拌浸泡24h,以除去細菌纖維素里面的殘留的雜蛋白;用大量去離子水沖洗凈后,用1.0mol/LNaOH溶液,60℃條件下處理2h,以除去細菌纖維素中致熱源;再用0.1mol/L的乙酸溶液中和處理并用多次蒸餾水浸泡至中性,在-80℃冰箱中預冷凍24h,在冷凍干燥機中進行冷凍干燥24h,得到干燥好的BC干膜,其紅外圖譜如圖1所示,并室溫干燥保存備用。
稱取0.5g 3cm×3cm的干燥好的BC干膜和0.55g硝酸鈰銨,先后加入到含有100ml 8×10-2mol/L的硝酸水溶液的圓底三口瓶中,置于70℃的水浴中,磁力攪拌,并緩慢通入氮氣30min后,加入10.4g的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨(METAC)水溶液,繼續通入氮氣,在反應溫度為70℃反應12h。待反應結束后加入30ml質量濃度為1.0%的對苯二酚水溶液終止反應,取出接枝后的BC置于100℃沸水中煮沸60min進行純化處理后,得到抗菌細菌纖維素水凝膠,記為接枝BC I,其紅外圖譜如圖1所示,對比所使用的原料BC及接枝BC I的圖譜可以看出接枝BC I在約1728cm-1處出現新的吸收峰,其為接枝的METAC中酯基的伸縮振動峰,在約1480cm-1處出現季銨基上甲基C-H鍵的特征吸收峰,這說明METAC成功接枝聚合到BC表面。
實施例2~7
為了探討反應溫度對接枝率的影響,實施例2~7僅改變實施例1中的水浴溫度,使該反應分別在反應溫度為30℃、40℃、50℃、60℃、65℃、80℃進行。實驗過程中觀察到,當反應溫度為80℃時,BC裂解成小的碎片,破壞了材料的整體性,因此在此條件下進行接枝聚合沒有多大的實際應用意義,在其余反應溫度條件下可得到接枝BC,其中,將反應溫度為60℃、65℃所得接枝BC分別記為BC II,BC III。
對原料BC以及實施例1~6中得到的各接枝BC利用德國Vario EL元分析儀測試 樣品中氮元素的含量,記為N%,由于BC本身是不含有氮元素的,因此按照公式(1)(2):
G1%=N%×M(METAC)/M(N)   (1)
G%=G1/(100-G1)×100%        (2)
測得接枝率,其結果如表1所示:
表1
反應溫度/℃304050606570N含量/%0.140.210.340.5950.9101.525接枝率G/%2.13.25.319.6815.6129.24
從表1可以看出,當接枝反應溫度較低時,BC的接枝率很低,但是隨著接枝反應溫度的升高,細菌纖維素的接枝率也隨之提高,在反應溫度為70℃,細菌纖維素的接枝率可達29.2%,即本發明可以方便的控制反應溫度來控制細菌纖維素的接枝率。
實施例8
參照GB/T 20944.2-2007測試原料BC、接枝BC I、接枝BC II及接枝BC III分別對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌效果,其結果分別如圖2、圖3所示,從圖2可以看出本發明的接枝BC I、接枝BC II及接枝BC III的抗菌效果均優于原料BC,并且隨著接枝率的提高,抗大腸桿菌的效果越好;從圖3可以看出本發明的接枝BC I、接枝BC II及接枝BC III的抗菌效果均優于原料BC,并且隨著接枝率的提高,抗金黃色葡萄球菌的效果越好。
實施例9
將購買于海南億德食品有限公司的細菌纖維素用去離子水沖洗后,再用質量濃度為1.0%的十二烷基硫酸鈉(SDS),60℃條件下攪拌浸泡24h,以除去細菌纖維素里面的殘留的雜蛋白;用大量去離子水沖洗凈后,用0.1mol/L NaOH溶液,60℃條件下處理3h,除去細菌纖維素中致熱源;再用0.1mol/L的乙酸溶液中和處理并用多次蒸餾水浸泡至中性,在-80℃冰箱中預冷凍12h,在冷凍干燥機中進行冷凍干燥24h,得到干燥好的BC干膜,并室溫干燥保存備用。
稱取1.0g 3cm×3cm的干燥好的BC干膜和1.65g硝酸鈰銨,先后加入到含有300ml 10×10-2mol/L的硝酸水溶液的圓底三口瓶中,置于60℃的水浴中,磁力攪拌, 并緩慢通入氮氣30min后,加入10.0g的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨(METAC)水溶液,繼續通入氮氣,在反應溫度為60℃反應12h。待反應結束后加入70ml質量濃度為1.0%的對苯二酚水溶液終止反應,取出接枝后的BC置于100℃沸水中煮沸60min進行純化處理后,得到抗菌細菌纖維素水凝膠。通過德國Vario EL元素分析儀測試樣品氮元素的含量計算得到該樣品的接枝率為10.57%。
實施例10
將購買于海南億德食品有限公司的細菌纖維素用去離子水沖洗后,再用質量濃度為3.0%的十二烷基硫酸鈉(SDS),60℃條件下攪拌浸泡12h,以除去細菌纖維素里面的殘留的雜蛋白;用大量去離子水沖洗凈后,用1.0mol/L NaOH溶液,60℃條件下處理2h,除去細菌纖維素中致熱源;再用0.1mol/L的乙酸溶液中和處理并用多次蒸餾水浸泡至中性,在-80℃冰箱中預冷凍12h,在冷凍干燥機中進行冷凍干燥24h,得到干燥好的BC干膜,并室溫干燥保存備用。
稱取2.0g 3cm×3cm的干燥好的BC干膜和1.65g硝酸鈰銨,先后加入到含有400ml 10×10-2mol/L的硝酸水溶液的圓底三口瓶中,置于75℃的水浴中,磁力攪拌,并緩慢通入氮氣30min后,加入50.0g的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨(METAC)水溶液,繼續通入氮氣,在反應溫度為75℃反應12h。待反應結束后加入100ml質量濃度為1.0%的對苯二酚水溶液終止反應,取出接枝后的BC置于100℃沸水中煮沸60min進行純化處理后,得到抗菌細菌纖維素水凝膠。通過德國Vario EL元素分析儀測試樣品氮元素的含量計算得到該樣品的接枝率為32.79%。

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