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一種表面糖修飾聚合物膠束及其制備方法和應用.pdf

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一種 表面 修飾 聚合物 膠束 及其 制備 方法 應用
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摘要
申請專利號:

CN201510295535.0

申請日:

2015.06.02

公開號:

CN104892807A

公開日:

2015.09.09

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C08F 120/28申請日:20150602|||公開
IPC分類號: C08F120/28; C08F8/30; C08F8/00; A61K31/4745; A61K31/704; A61K9/51; A61P35/00 主分類號: C08F120/28
申請人: 江南大學
發明人: 尹健; 汪舒婷; 張權; 葉舟
地址: 214122江蘇省無錫市濱湖區蠡湖大道1800號
優先權:
專利代理機構: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙)11419 代理人: 張勇
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201510295535.0

授權公告號:

104892807B||||||

法律狀態公告日:

2017.05.24|||2015.10.07|||2015.09.09

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種表面糖修飾聚合物膠束及其制備方法和應用,屬于藥物和藥劑學領域。本發明所述聚合物為雙親性大分子,即以表面修飾糖類為親水部分,以聚合物碳鏈為疏水性部分,在水中能夠自組裝形成膠束同時完成對疏水性藥物的包載,同時表面修飾的糖類分子具有選擇性識別腫瘤細胞表面受體,達到靶向輸送所載藥物的特點。本發明的表面糖修飾聚合物膠束不僅低毒性,而且能通過識別癌細胞表面過度表達的糖受體實現靶向藥物輸送的目的,降低其對正常組織毒副作用,可作為各類抗癌藥物的輸送載體。

權利要求書

權利要求書
1.  一種糖修飾聚合物,其特征在于,所述糖修飾聚合物具有式1所示的結構:

其中,n為10-300;
Z為以下任意一個或者多個相同或不同的分子組合得到的化學功能團或功能片段:甘露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖或含以上分子的糖類;
b為以下任意糖類與聚合物的連接鍵中的一種:酯鍵、酰胺鍵、二硫鍵、醚鍵、碳氮鍵或1,3-三氮唑環

2.  根據權利要求1所述的聚合物,其特征在于,所述式1中的Z為以下任意一種:甘露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、1,2,3,4,6-五-O-乙酰基-D-甘露糖、2,3,4,6-四-O-乙酰基-1-炔丙基-α-D-甘露糖、炔丙基-α-D-吡喃甘露糖、2,3,4,6-四-O-乙酰基-1-炔丙基-α-D-半乳糖、1,2,3,4,6-五-O-乙酰基-D-半乳糖、炔丙基-α-D-吡喃半乳糖、1,2,3,4,6-五-O-乙酰基-D-葡萄糖、2,3,4,6-四-O-乙酰基-1-炔丙基-α-D-葡萄糖、炔丙基-α-D-吡喃葡萄糖。

3.  根據權利要求1所述的聚合物,其特征在于,所述式1中的b為酯鍵、酰胺鍵、二硫鍵或1,3-三氮唑環。

4.  一種權利要求1-3任一所述聚合物的制備方法,其特征在于,所述方法包括如下步驟:
(1)制備聚合度一定的聚甲基丙烯酸縮水甘油酯;
(2)將(1)中所得聚合物進行疊氮基或氨基或巰基修飾;
(3)將(2)中所得聚合物進行表面糖類分子修飾。

5.  一種利用權利要求1-3任一所述聚合物制備得到的表面糖修飾聚合物膠束。

6.  根據權利要求5所述的表面糖修飾聚合物膠束,其特征在于,所述膠束的粒徑在10-500nm之間。

7.  根據權利要求5所述的表面糖修飾聚合物膠束,其特征在于,所述聚合物膠束是按以下方法制備得到的:通過透析和凝膠色譜純化,通過控制聚合物分子在水溶液中的濃度高于臨界膠束濃度后,超聲處理促進膠束形成,即得聚合物膠束溶液。

8.  權利要求5所述表面糖修飾聚合物膠束在作為藥物載體方面的應用。

9.  根據權利要求8所述的應用,其特征在于,所述藥物為抗癌藥物、抗病毒藥物、治療糖尿病的藥物或治療心腦血管疾病的藥物。

10.  根據權利要求8所述的應用,其特征在于,所述藥物為阿霉素或喜樹堿。

說明書

說明書一種表面糖修飾聚合物膠束及其制備方法和應用
技術領域
本發明涉及一種表面糖修飾聚合物膠束及其制備方法和應用,屬于藥物和藥劑學領域。
背景技術
化療作為現階段應用于癌癥治療最有效的方法之一。其效果往往不夠理想,主要原因在于化療的靶向給藥性能差,同時易造成對正常組織的毒副作用,并且在長期使用過程中,化療容易產生耐藥性。藥物載體的應用則可以通過實現抗癌藥物靶向輸送進而達到治療癌癥的目的。近年來,許多載體材料如聚合物膠束、納米脂質體、樹枝狀大分子以及有機無機雜化納米粒子等已經被廣泛開發并開展了將其用作靶向輸送藥物載體,以達到治療癌癥的目的的研究。
雙親性聚合物可以在水中自組裝形成聚合物膠束,其內核為疏水性空腔可用于疏水性藥物的包載,具有增加所載藥物穩定性,延長其體內循環時間的功能。同時,所形成聚合物膠束具有適宜的粒徑,可通過增強滲透滯留(EPR)效應富集于腫瘤部位(被動靶向作用),從而減少抗癌藥物對正常組織的不良反應。但僅依靠被動靶向作用來實現載體對癌細胞生長的選擇性抑制則有所欠缺,故為了進一步增強納米載體的靶向性,通常對其表面進行靶向分子修飾,如利用鍵連抗體、多肽、葉酸等能夠特異性識別癌細胞表面過度表達受體的性質,載體可以通過受體識別方式被癌細胞攝取,從而實現載體選擇性輸送所載藥物至癌細胞的目的,進而降低抗癌藥物的毒副作用。
發明內容
甘露糖受體為多凝集素受體,可通過受體識別的方式結合以甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖和巖藻糖為末端的糖類分子。近年來,已經有報道證明將甘露糖分子修飾于藥物載體表面,可以利用其識別癌細胞表面過度表達的受體從而實現靶向輸送藥物至癌細胞。但以糖類分子修飾聚合物膠束實現癌細胞的靶向藥物輸送同時降低抗癌藥物對正常細胞毒副作用的研究尚未見報道。
本發明的第一個目的是提供一種糖修飾聚合物,該聚合物以修飾的糖類分子為親水性部分,聚合物碳鏈為疏水性部分,在水中自組裝形成膠束,同時完成疏水性藥物的包載,其組成如式1所示:

上面的式1中:
Z為選自如下的一個或多個相同或不同的化學功能團或功能片段:甘露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖,以及末端為上述分子的其他糖類分子;
b為選自如下的糖類與聚合物的連接鍵:酯鍵(—COO—)、酰胺鍵(—CONR1—,R1=H,CH3,或-CH2-)、二硫鍵(—S—S—)、醚鍵(—O—)、碳氮鍵(—C—N(R2)—,R2=H,CH3,或CH3CH2等)以及1,3-三氮唑環();
n為10-300。
式1中包含聚合物的結構,在本發明的一種實施方式中,為聚甲基丙烯酸縮水甘油酯。
所述Z,在本發明的一種實施方式中,為甘露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、1,2,3,4,6-五-O-乙酰基-D-甘露糖、2,3,4,6-四-O-乙酰基-1-炔丙基-α-D-甘露糖、炔丙基-α-D-吡喃甘露糖、2,3,4,6-四-O-乙酰基-1-炔丙基-α-D-半乳糖、1,2,3,4,6-五-O-乙酰基-D-半乳糖、炔丙基-α-D-吡喃半乳糖、1,2,3,4,6-五-O-乙酰基-D-葡萄糖、2,3,4,6-四-O-乙酰基-1-炔丙基-α-D-葡萄糖、炔丙基-α-D-吡喃葡萄糖等。
所述的聚合物,在本發明的一種實施方式中,為D-甘露糖修飾聚甲基丙烯酸縮水甘油酯。
本發明的第二個目的是提供一種所述聚合物的制備方法,其特征在于,所述方法包括如下步驟:
(1)制備聚合度一定的聚甲基丙烯酸縮水甘油酯;
(2)將(1)中所得聚合物進行疊氮基或氨基或巰基修飾;
(3)將(2)中所得聚合物進行表面糖類分子修飾。
所述步驟(1)中的聚合度為10-300。
在本發明的一種實施方式中,所述糖類為甘露糖、半乳糖、葡萄糖以及乳糖中的一種或多種,以及末端為這些分子的糖類。
所述方法,在本發明的一種實施方式中,具體是:
(1)將一定量的甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA),用二甲基亞砜(DMSO)溶解。在氬 氣保護條件下,先后加入溴化亞銅(CuBr)和聯吡啶(Bpy)。最后用微量進樣器加入α-溴丙酸甲酯(MBrP)引發劑,密封氬氣保護,反應后用一定量四氫呋喃(THF)終止反應。通過中性氧化鋁柱除去銅配體,將濾液濃縮后,在甲醇中沉淀,干燥所得沉淀物為聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(PGMA)。
(2)將(1)中制得PGMA,一定量疊氮鈉,催化量的氯化銨溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)中,密封,50℃油浴反應,過濾除去固體雜質,將濾液濃縮后,在水中沉淀,干燥沉淀物得到疊氮基取代的PGMA(PGMA-N3)。
(3)將(2)中所得PGMA-N3溶于DMF中,通氬氣去除體系內氧氣。另將糖類分子和硫酸銅溶于蒸餾水中,在氬氣保護條件下,加入抗壞血酸鈉。將上面DMF和水溶液混合,密封,在油浴60℃反應,過濾除去不溶物后透析(Mw 2000),冷凍干燥透析袋內溶液得到糖修飾的聚合物。
本發明所用聚合物的合成可用現有任何合成聚合物的方法,如活性自由基聚合(包括原子轉移自由基聚合(ATRP)、可逆加成-裂解鏈轉移自由基聚合(RAFT)等)、陰離子聚合等。
本發明的第三個目的是提供一種利用所述聚合物制備得到的表面糖修飾聚合物膠束。
所述表面糖修飾聚合物膠束的粒徑,在本發明的一種實施方式中,在10-500nm之間。
所述表面糖修飾聚合物膠束的平均粒徑,在本發明的一種實施方式中,在10-200nm。
在本發明的一種實施方式中,Z形成表面糖修飾聚合物膠束的親水部分,同時充當主動靶向基團。
所述表面糖修飾聚合物膠束,在本發明的一種實施方式中,是按如下方法制備得到的:通過透析和凝膠色譜純化,通過控制聚合物分子在水溶液中的濃度高于臨界膠束濃度后,超聲處理促進膠束形成,即得聚合物膠束溶液。測得所得聚合物膠束為球形、均勻分布,粒徑范圍10-500nm之間。
本發明的第四個目的是提供所述表面糖修飾聚合物膠束在作為藥物載體方面的應用。
所述應用,在本發明的一種實施方式中,是將藥物包裹在表面糖修飾聚合物膠束內部,進而提高藥物的水溶性、同時利用膠束表面糖的識別細胞表面糖受體作用,完成對所載藥物的靶向運輸。包裹藥物方法是:將藥物與聚合物分子溶解于DMSO中,添加水促進藥物包載,透析除去DMSO,凍干即得載藥聚合物膠束。
所述藥物,在本發明的一種實施方式中,為抗癌藥物、抗病毒藥物、治療糖尿病的藥物、或治療心腦血管疾病的藥物。
所述藥物,在本發明的一種實施方式中,具體地,為阿霉素或喜樹堿。
本發明的有益效果:
(1)本發明的聚合物制備得到的表面糖類修飾聚合物膠束為球形,均勻分布;
(2)傳統膠束載藥體系,因其生物相容性較差,且容易造成全身性分布,對正常組織造成較大毒副作用。而本發明制備的聚合物膠束具有較低的細胞毒性,在實驗條件下,聚合物膠束和人乳腺癌MDA-MB-231細胞共同孵育72小時,細胞存活率高于90%;
(3)本發明的表面鍵連糖類的聚合物膠束,能夠特異性識別癌細胞表面受體,通過受體識別作用選擇性進入癌細胞,將所載抗癌藥物釋放,藥物進入細胞核后抑制癌細胞生長;表面無糖類分子修飾的聚合物膠束進入乳腺癌細胞內較少,而表面有糖類分子修飾的聚合物膠束能夠快速進入乳腺癌細胞。
附圖說明
圖1:PGMA-Mannose的核磁共振氫譜;
圖2:PGMA-Mannose的凝膠滲透色譜圖;
圖3:PGMA-Mannose空白膠束透射電鏡照片(A)和粒徑分布圖(B);
圖4:人乳腺癌MDA-MB-231細胞和人腎上皮HEK293細胞在不同濃度聚合物膠束PGMA-Mannose存在條件下培養72小時后的相對存活率;
圖5:熒光共聚焦顯微鏡照片證明1小時培養后少量載藥聚合物膠束被人腎上皮細胞HEK293攝取;A:DAPI染色的細胞核;B:DOX熒光成像;C:前兩種成像的合并圖;
圖6:熒光共聚焦顯微鏡照片證明1小時培養后大量載藥聚合物膠束被人乳腺癌細胞MDA-MB-231攝取;A:DAPI染色的細胞核;B:DOX熒光成像;C:前兩種成像的合并圖。
具體實施方式
縮寫:
PGMA,聚甲基丙烯酸縮水甘油酯;GMA,甲基丙烯酸縮水甘油酯;MBrP,α-溴丙酸甲酯;CuBr,溴化亞銅;Bpy,聯吡啶;THF,四氫呋喃;PGMA-N3,疊氮基取代的聚甲基丙烯酸縮水甘油酯;PGMA-Mannose,D-甘露糖修飾聚甲基丙烯酸縮水甘油酯;TMSOTf,三氟甲磺酸三甲基硅脂;PGMA-Galactose,半乳糖修飾聚甲基丙烯酸縮水甘油酯;PGMA-Glucose,葡萄糖修飾聚甲基丙烯酸縮水甘油酯。
實施例1:1,2,3,4,6-五-O-乙酰基-D-甘露糖的合成
在250mL燒瓶中加入80mL的吡啶溶液,5.4g的D-甘露糖,以及70mL醋酸酐后,室溫攪拌反應,期間以薄層色譜法(TLC)檢測反應,結果顯示反應完全后。將燒瓶內溶液轉移至1000mL分液漏斗,加入100mL二氯甲烷溶液進行萃取,以水(3×100mL),飽和碳酸氫鈉(3×100mL),以及1M鹽酸洗滌后,取二氯甲烷層。以飽和食鹽水(2×100mL),無水 硫酸鈉進行干燥,過濾除去無水硫酸鈉,并旋轉蒸發除去溶劑,真空干燥后得到1,2,3,4,6-六-O-乙酰基-D-甘露糖。
實施例2:2,3,4,6-四-O-乙酰基-1-炔丙基-α-D-甘露糖的合成
將4.8g化合物2與一定量的預活化分子篩加入250mL燒瓶中,于真空泵上抽真空3h后,將燒瓶密封,向燒瓶內加入無水二氯甲烷60mL,在整個體系置于冰浴上,攪拌15min后。在氬氣保護條件下,向燒瓶內加入2.8mL三氟甲磺酸三甲基硅脂(TMSOTf)。加完試劑后,撤去冰浴,密封氬氣保護反應2d。TLC檢測反應完畢后,向體系中加入,50mL飽和K2CO3終止反應。將燒瓶內混合物轉移至500mL分液漏斗中,以飽和K2CO3(50mL×3)洗滌,飽和NaCl(50mL×3),無水硫酸鈉干燥后,過濾除去固體無水硫酸鈉后,旋轉蒸發濃縮所得液體,經硅膠柱分離純化,得白色粉末為2,3,4,6-六-O-乙酰基-1-炔丙基-α-D-甘露糖。
實施例3:炔丙基-α-D-吡喃甘露糖的合成
向100mL的燒瓶中,加入1g化合物3,20mL的甲醇,以及催化量甲醇鈉。反應30min后,經TLC檢測反應完全。加入氫型陽離子交換樹脂中和溶液酸性,過濾除去固體樹脂,旋轉蒸發除去剩余溶劑,真空干燥12h后,得到白色粉末即為最終產物炔丙基-α-D-吡喃甘露糖。
實施例4:1,2,3,4,6-五-O-乙酰基-D-半乳糖的合成
在250mL燒瓶中加入80mL的吡啶溶液,5.4g的D-半乳糖,以及70mL醋酸酐后,室溫攪拌反應,期間以薄層色譜法(TLC)檢測反應,結果顯示反應完全后。將燒瓶內溶液轉移至1000mL分液漏斗,加入100mL二氯甲烷溶液進行萃取,以水(3×100mL),飽和碳酸氫鈉(3×100mL),以及1M鹽酸洗滌后,取二氯甲烷層。以飽和食鹽水(2×100mL),無水硫酸鈉進行干燥,過濾除去無水硫酸鈉,并旋轉蒸發除去溶劑,真空干燥后得到1,2,3,4,6-六-O-乙酰基-D-半乳糖。
實施例5:2,3,4,6-四-O-乙酰基-1-炔丙基-α-D-半乳糖的合成
將4.8g化合物2與一定量的預活化分子篩加入250mL燒瓶中,于真空泵上抽真空3h后,將燒瓶密封,向燒瓶內加入無水二氯甲烷60mL,在整個體系置于冰浴上,攪拌15min后。在氬氣保護條件下,向燒瓶內加入2.8mL三氟甲磺酸三甲基硅脂(TMSOTf)。加完試劑后,撤去冰浴,密封氬氣保護反應2d。TLC檢測反應完畢后,向體系中加入,50mL飽和K2CO3終止反應。將燒瓶內混合物轉移至500mL分液漏斗中,以飽和K2CO3(50mL×3)洗滌,飽和NaCl(50mL×3),無水硫酸鈉干燥后,過濾除去固體無水硫酸鈉后,旋轉蒸發濃縮所得液體,經硅膠柱分離純化,得白色粉末為2,3,4,6-六-O-乙酰基-1-炔丙基-α-D-半乳糖。
實施例6:炔丙基-α-D-吡喃半乳糖的合成
向100mL的燒瓶中,加入1g化合物3,20mL的甲醇,以及催化量甲醇鈉。反應30min 后,經TLC檢測反應完全。加入氫型陽離子交換樹脂中和溶液酸性,過濾除去固體樹脂,旋轉蒸發除去剩余溶劑,真空干燥12h后,得到白色粉末即為最終產物炔丙基-α-D-吡喃半乳糖。
實施例7:1,2,3,4,6-五-O-乙酰基-D-葡萄糖的合成
在250mL燒瓶中加入80mL的吡啶溶液,5.4g的D-葡萄糖,以及70mL醋酸酐后,室溫攪拌反應,期間以薄層色譜法(TLC)檢測反應,結果顯示反應完全后。將燒瓶內溶液轉移至1000mL分液漏斗,加入100mL二氯甲烷溶液進行萃取,以水(3×100mL),飽和碳酸氫鈉(3×100mL),以及1M鹽酸洗滌后,取二氯甲烷層。以飽和食鹽水(2×100mL),無水硫酸鈉進行干燥,過濾除去無水硫酸鈉,并旋轉蒸發除去溶劑,真空干燥后得到1,2,3,4,6-六-O-乙酰基-D-葡萄糖。
實施例8:2,3,4,6-四-O-乙酰基-1-炔丙基-α-D-葡萄糖的合成
將4.8g化合物2與一定量的預活化分子篩加入250mL燒瓶中,于真空泵上抽真空3h后,將燒瓶密封,向燒瓶內加入無水二氯甲烷60mL,在整個體系置于冰浴上,攪拌15min后。在氬氣保護條件下,向燒瓶內加入2.8mL三氟甲磺酸三甲基硅脂(TMSOTf)。加完試劑后,撤去冰浴,密封氬氣保護反應2d。TLC檢測反應完畢后,向體系中加入,50mL飽和K2CO3終止反應。將燒瓶內混合物轉移至500mL分液漏斗中,以飽和K2CO3(50mL×3)洗滌,飽和NaCl(50mL×3),無水硫酸鈉干燥后,過濾除去固體無水硫酸鈉后,旋轉蒸發濃縮所得液體,經硅膠柱分離純化,得白色粉末為2,3,4,6-六-O-乙酰基-1-炔丙基-α-D-葡萄糖。
實施例9:炔丙基-α-D-吡喃葡萄糖的合成
向100mL的燒瓶中,加入1g化合物3,20mL的甲醇,以及催化量甲醇鈉。反應30min后,經TLC檢測反應完全。加入氫型陽離子交換樹脂中和溶液酸性,過濾除去固體樹脂,旋轉蒸發除去剩余溶劑,真空干燥12h后,得到白色粉末即為最終產物炔丙基-α-D-吡喃葡萄糖。
實施例10:PGMA的合成
向50mL燒瓶中加入準確稱取的1.5g的GMA單體(預先通過快速硅膠柱除去阻聚劑),接著用2.5mL二甲基亞砜(DMSO)溶解。向燒瓶內通氬氣15min,去除體系中氧氣。然后在氬氣保護條件下,先后加入64.4mg的CuBr催化劑和189.7mg的Bpy配體。最后用微量進樣器向無氧體系中加入81μL引發劑MBrP,密封氬氣保護條件下,40℃反應2h。反應完成后,打開密封體系,向燒瓶中加入10mL THF終止反應。當溶液從棕色變成墨綠色時,將混合物溶液通過中性氧化鋁柱子以除去銅配體,得無色液體,將所得濾液濃縮后,于大體積甲醇中沉淀,35℃條件下干燥所得沉淀物即可得到白色固體聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(PGMA)。通過控制GMA單體和引發劑MBrP的比例,分別制得不同聚合度的PGMA。
實施例11:PGMA-N3的合成
將100.0mg的PGMA固體,56.0mg的氯化銨粉末,以及68.5mg的疊氮化鈉,加至50mL燒瓶中,接著繼續向燒瓶內加入7mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)液體,將燒瓶密封處理,50℃油浴反應,12h后,過濾除去反應體系的固體雜質,濃縮所得濾液后,于大體積水中沉淀,真空干燥所得沉淀物即可得到疊氮基取代的PGMA(PGMA-N3)。
實施例12:PGMA-NH2的合成
將PGMA固體,鈀碳粉末,以及甲醇溶液,加至燒瓶中,置換燒瓶內氣體為氫氣,添加氫氣球,反應12h后,過濾除去反應體系的固體雜質,濃縮所得濾液后,于大體積水中沉淀,真空干燥所得沉淀物即可得到氨基取代的PGMA(PGMA-NH2)。
按類似方法,可制備得到連接鍵b為巰基(-SH)以及羧基(-COOH)的化合物。
實施例13:PGMA-Mannose的合成
將60.0mg的PGMA-N3固體置于50mL的燒瓶中,向燒瓶內加入15mL DMF溶液,攪拌至固體溶解,向燒瓶內通氬氣15min以去除體系內氧氣。另將125.2mg的炔丙基-α-D-吡喃甘露糖粉末和90.5mg的五水硫酸銅晶體加入5mL蒸餾水中,震蕩攪拌使其徹底溶解,向體系內通氬氣15min,以除去燒瓶內氧氣,接著在氬氣保護條件下,向體系內加入248.1mg的抗壞血酸鈉粉末。將上述除盡氧氣的DMF溶液體系與水溶液體系混合,密封,氬氣保護的條件下,60℃反應24h。反應完成后,將體系內混合物通過過濾除去不溶物后,濃縮所得濾液,以雙蒸水為透析液透析(MW 2000)2d后,過濾除去透析產生的固體,冷凍干燥所得濾液即可得到目標雙親性化合物PGMA-Mannose。核磁共振氫譜和凝膠滲透色譜證明了所制得PGMA-Mannose的化學結構和相對分子量(如圖1和圖2)。
用PGMA-Mannose制成的聚合物膠束為球形,均勻分布(如圖3,A、B),而且具有較低的細胞毒性,在實驗條件下,聚合物膠束和人乳腺癌MDA-MB-231細胞共同孵育72小時,細胞存活率高于92%(如圖4所示)。采用實施例6或9合成的糖分子,也具有類似效果。
實施例14:PGMA-CONH-Mannose的合成
將60.0mg的PGMA-NH2固體置于50mL的燒瓶中,向燒瓶內加入15mL DMF溶液,攪拌至固體溶解,向溶液中加入羧基修飾甘露糖,密封,氬氣保護的條件下,60℃反應24h。反應完成后,將體系內混合物通過過濾除去不溶物后,濃縮所得濾液,以雙蒸水為透析液透析(MW 2000)2d后,過濾除去透析產生的固體,冷凍干燥所得濾液即可得到目標雙親性化合物PGMA-CONH-Mannose。
用PGMA-CONH-Mannose制備的糖修飾聚合物膠束:粒徑均一;細胞毒性低,與人乳腺癌MDA-MB-231細胞共同孵育72小時,細胞存活率高于92%;與其他表面無糖類分子修飾的聚合物膠束相比,能夠快速進入乳腺癌細胞。采用實施例6或9合成的糖分子,也具有類 似效果。
實施例15:PGMA-Mannose膠束包載阿霉素
首先稱取10mg PGMA-Mannose樣品,加入1mL DMSO,攪拌2h至完全溶解,向其中加入100μL預先配置的阿霉素溶液。攪拌5min后,在劇烈攪拌的條件下,向其中緩慢滴加1mL雙蒸水,透析袋透析除去DMSO溶劑(Mw=1000,24h)。過濾透析袋內液體,將所得液體冷凍干燥,即為包載阿霉素的PGMA-Mannose膠束樣品。
同時,包載阿霉素的PGMA-Mannose膠束,能夠特異性選擇癌細胞表面受體,通過受體識別作用選擇性進入癌細胞,經過細胞內溶酶體等作用,將所載抗癌藥物釋放進入細胞核,達到抑制癌細胞生長的目的。通過激光共聚焦顯微鏡測試證明了在1小時的培養時間內,表面無糖類分子修飾的聚合物膠束進入乳腺癌細胞內較少(如圖5所示),而表面有糖類分子修飾的聚合物膠束能夠快速進入乳腺癌細胞(如圖6所示)。
實施例16:PGMA-Galactose膠束包載阿霉素
首先稱取10mg PGMA-Galactose樣品,加入1mL DMSO,攪拌2h至完全溶解,向其中加入100μL預先配置的阿霉素溶液。攪拌5min后,在劇烈攪拌的條件下,向其中緩慢滴加1mL雙蒸水,透析袋透析除去DMSO溶劑(Mw=1000,24h)。過濾透析袋內液體,將所得液體冷凍干燥,即為包載阿霉素的PGMA-Galactose膠束樣品。
實施例17:PGMA-Glucose膠束包載阿霉素
首先稱取10mg PGMA-Glucose樣品,加入1mL DMSO,攪拌2h至完全溶解,向其中加入100μL預先配置的阿霉素溶液。攪拌5min后,在劇烈攪拌的條件下,向其中緩慢滴加1mL雙蒸水,透析袋透析除去DMSO溶劑(Mw=1000,24h)。過濾透析袋內液體,將所得液體冷凍干燥,即為包載阿霉素的PGMA-Glucose膠束樣品。
實施例18:PGMA-Mannose膠束包載喜樹堿
用喜樹堿代替實施案例15中的阿霉素,其它操作同實施例15。制備得到包載喜樹堿的PGMA-Mannose膠束樣品。
實施例19:載藥膠束的細胞內吞
選取對數期生長的兩種細胞分別接種于細胞培養皿內,置培養箱孵育24h使其貼壁。加入含有載藥膠束(40μg/mL)的培養液繼續培養一定的時間。棄去培養液,用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次。將細胞用4.0%甲醛在室溫下固定15min。PBS清洗2次后,用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,1μg/mL)染細胞核15min。用激光共聚焦顯微鏡觀察載藥膠束在細胞內部的分布狀態,激發波長為405/561nm,發射波長為417-477/570-1000nm。
實施例20:空白膠束毒性評價
采用MTT法考察載藥膠束的細胞毒性。將MDA-MB-231或HEK293的細胞懸液種植于96孔板中,每孔10000個細胞。在培養箱中培養24h后,用pH 7.4的PBS清洗2次,加入含載藥膠束或原藥阿霉素的培養基,使體系中所含的阿霉素的質量濃度為2μg/mL。培養一定的時間后,用pH 7.4的PBS清洗2次,每孔加入100μL MTT溶液(1mg/mL)繼續培養4h。棄去孔內培養液,每孔加入100μL DMSO,振蕩10min,應用酶標儀在490nm處測量各孔的吸光值(OD),計算細胞存活率。
雖然本發明已以較佳實施例公開如上,但其并非用以限定本發明,任何熟悉此技術的人,在不脫離本發明的精神和范圍內,都可做各種的改動與修飾,因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。

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本文標題:一種表面糖修飾聚合物膠束及其制備方法和應用.pdf
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