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表面帶正電荷具有聚集誘導熒光增強性質的熒光納米微球及其生物應用.pdf

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表面 正電荷 具有 聚集 誘導 熒光 增強 性質 納米 及其 生物 應用
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摘要
申請專利號:

CN201510226607.6

申請日:

2015.05.06

公開號:

CN104892815A

公開日:

2015.09.09

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C08F 212/08申請日:20150506|||公開
IPC分類號: C08F212/08; C08F212/14; C08F8/34; G01N21/64; B82Y40/00(2011.01)I 主分類號: C08F212/08
申請人: 吉林大學
發明人: 林權; 陳潔; 楊旭東; 楊雪; 孫源卿; 楊柏
地址: 130012吉林省長春市前進大街2699號
優先權:
專利代理機構: 長春吉大專利代理有限責任公司22201 代理人: 王淑秋; 王恩遠
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201510226607.6

授權公告號:

||||||

法律狀態公告日:

2018.04.13|||2015.10.07|||2015.09.09

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

一種表面帶正電荷具有聚集誘導熒光增強性質的熒光納米微球及其在細胞成像方面的應用,屬于高分子材料技術領域。本發明首先合成出一種表面帶正電荷的納米微球乳液,將帶有負電荷的具有AIE效應的熒光分子通過靜電作用力修飾到納米微球表面。熒光分子由于受到庫侖力的作用分子內轉動受到限制,吸收的能量基本通過熒光輻射釋放出來,因此熒光分子修飾到納米微球上熒光百倍增強,表現出優異的AIE性質。我們所制得的熒光納米微球熒光性質穩定,生物相容性好,毒性低,表面帶正電荷易于進入細胞和生物檢測。因此,我們制得的表面帶正電荷的熒光納米微球在細胞成像等生物領域具有廣闊的應用前景。

權利要求書

權利要求書
1.  一種表面帶正電荷具有聚集誘導熒光增強性質的熒光納米微球,其由如下步驟制備得到:
1)量取5~10mL聚合單體1分散于150~200mL的去離子水中,再加入0.04g~0.5g的聚合單體2;室溫、氮氣保護下,機械攪拌除去反應體系中的氧氣;升溫至70~90℃后加入10mL、含0.3~0.5mmol引發劑的水溶液于反應體系中,氮氣保護、攪拌下聚合反應5~20小時,得到表面帶正電荷的納米微球溶液;高速離心洗滌后將得到的納米微球重新超聲分散于100mL去離子水中;
2)量取10~20mL步驟1)所得到的納米微球溶液,加入10~20mL去離子水,然后再加入3~5mL、80~150μg/mL的AIE型熒光分子,在50~80℃、氮氣保護條件下,磁力攪拌反應4~10h;高速離心除去未復合的AIE型熒光分子,獲得AIE分子復合的表面帶正電荷的熒光納米微球;將得到的熒光納米微球分散于去離子水中,從而得到表面帶正電荷的具有聚集誘導熒光增強性質的熒光納米微球;
聚合單體1是苯乙烯、氟代苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸縮水甘油酯;聚合單體2是N,N,N-三甲基乙烯基苯甲氯化銨、2-(二異丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯或2-氨乙基甲基丙烯酸酯鹽酸鹽。

2.  如權利要求1所述的一種表面帶正電荷具有聚集誘導熒光增強性質的熒光納米微球,其特征在于:引發劑是偶氮二異丁脒鹽酸鹽、偶氮二異丁咪唑啉鹽酸鹽或偶氮異丁氰基甲酰胺。

3.  如權利要求1所述的一種表面帶正電荷具有聚集誘導熒光增強性質的熒光納米微球,其特征在于:AIE型的熒光分子是9,10-二(苯乙烯基)蒽磺酸鹽、1,2-二[4-(3-磺酸丙氧基)苯基]-1,2-二苯基乙烯二鈉鹽或1,1,2,2-四[4-(3-磺酸丙氧基)苯基]乙烯四鈉鹽。

4.  權利要求1~3任何一項所述的一種表面帶正電荷具有聚集誘導熒光增強性質的熒光納米微球在生物成像方面的應用。

說明書

說明書表面帶正電荷具有聚集誘導熒光增強性質的熒光納米微球及其生物應用
技術領域
本發明屬于高分子材料技術領域,具體涉及一種表面帶正電荷具有聚集誘導熒光增強性質的熒光納米微球及其在細胞成像和生物檢測等方面的應用。
背景技術
生物成像是一個集合多種技術、交融多種學科、應用廣泛、發展迅速的新興領域。近些年來隨著生物化學和生命科學的發展,人們對生物體的研究逐漸從宏觀轉向了微觀。因此其分支領域之一的生物熒光成像成為人們研究和關注的焦點。熒光技術具有快捷、靈敏、實時、無放射性、重復性好,多個光物理參量(如發射波長、激發波長、熒光強度、熒光壽命)可用于檢測等優點。熒光探針是實現生物熒光成像的核心技術。傳統的熒光探針以有機熒光染料為主,但由于有機熒光染料耐光性差、水溶性差、生物相容性差以及聚集熒光誘導淬滅等缺點,而難以在實際中應用。隨著生物熒光成像應用的日益廣泛,研發出新型的熒光探針以克服傳統探針的缺點變得刻不容緩。因此,熒光納米粒子探針作為解決這一問題的有效手段被提出。
目前熒光納米粒子探針主要包括:量子點(quantum dot,QD),上轉換稀土納米粒子(Upconversion Rare Earth Nanoparticles,UCRE-NPs)和高分子熒光納米微球。無機量子點由于熒光效率高被人們廣泛用于生物標記等領域,但是研究發現當無機量子點用于生物成像進入生物體內時,表面易被體內的氧化劑氧化成重金屬離子,因此生物毒性大不宜于生物成像。高分子熒光納米微球開始是以聚苯乙烯、聚丙烯酰胺類、聚甲基丙烯酸酯類為微粒主體,表面鍵合或吸附熒光物質的熒光納米微球。因為單個納米粒子可以鍵合多個熒光分子,所以熒光強度有所增強。與小分子的有機染料相比,高分子熒光納米微球通常在水相中分散性良好、熒光發射強度較強、發光效率較高的同時,光漂白的現象發生幾率很低;并且在多種生物環境之下粒子穩定性和生物相容性都很高。所以很多高分子熒光納米微粒無需經過繁瑣的改性及改良就可以直接用于生物成像熒光探針、熒光生物傳感器等生物應用領域。但目前用于高分子熒光納米微球的大部分熒光分子具 有聚集誘導淬滅性質。在制備高效率高分子熒光納米微球時熒光染料加入量少時熒光信號不能顯著地提高,但加入量大時由于聚集誘導淬滅效應熒光信號也會衰減或沒有熒光發射,使其應用受到限制。
近年來,具有聚集誘導發光(AIE)的熒光分子受到人們的關注。它與傳統的熒光分子不同,AIE分子在聚集態或不良溶劑中熒光會顯著增強,當處于自由狀態時由于分子內轉動加劇消耗吸收的能量使熒光衰減。但AIE分子多為有機染料小分子,生物相容性差,在血液中循環時間短不能有效的進入細胞因此不能用于生物成像。因此設計一個有效載體能實現熒光分子的AIE效應并且生物相容性好,生物毒性低,尺寸合適,細胞穿透性好以及體內環境對其熒光沒有淬滅作用,在生物成像領域是至關重要的。
發明內容
本發明的目的是提供一種可用于細胞成像和生物檢測的表面帶正電荷的具有聚集誘導熒光增強性質的熒光納米微球。
本發明首先合成出一種表面帶正電荷的納米微球乳液,將帶有負電荷的具有AIE效應的熒光分子通過靜電作用力修飾到納米微球表面。熒光分子由于受到庫侖力的作用分子內轉動受到限制,吸收的能量基本通過熒光輻射釋放出來,因此熒光分子修飾到納米微球上其熒光強度增強百倍,表現出優異的AIE性質。我們所制得的熒光納米微球熒光性質穩定,生物相容性好,毒性低,表面帶正電荷易于進入細胞內部,進行細胞熒光成像和生物檢測。因此,我們制得的表面帶正電荷的熒光納米微球在細胞成像等生物領域具有廣闊的應用前景。
本發明所述的表面帶正電荷的具有聚集誘導熒光增強性質的熒光納米微球,其由如下步驟制備得到:
(1)量取5~10mL聚合單體1分散于150~200mL的去離子水中,再加入0.04g~0.5g的聚合單體2;室溫、氮氣保護下,機械攪拌(300~600rpm),除去反應體系中的氧氣;升溫至70~90℃后加入10mL含0.3~0.5mmol引發劑的水溶液于反應體系中,氮氣保護、攪拌下聚合反應5~20小時,得到表面帶正電荷的納米微球溶液;高速離心 (15000~20000rpm)洗滌除去未反應的單體、低聚物、引發劑等雜質,納米微球重新超聲分散于100mL去離子水中;
(2)量取10~20mL步驟(1)所得到的納米微球溶液,加入10~20mL去離子水,然后再加入3~5mL、80~150μg/mL的AIE型熒光分子,在50~80℃、氮氣保護條件下,磁力攪拌反應4~10h;高速離心(15000~20000rpm)除去未復合的AIE型熒光分子,獲得AIE分子復合的表面帶正電荷的熒光納米微球;將得到的熒光納米微球分散于去離子水中,從而得到本發明所述的表面帶正電荷的具有聚集誘導熒光增強性質的熒光納米微球。
上述方法中,聚合單體1是苯乙烯(St)、氟代苯乙烯(F-St)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸乙酯、氯乙烯、丙烯酸叔丁酯、二乙烯基苯或α-甲基苯乙烯或甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA);
上述方法中,聚合單體2是N,N,N-三甲基乙烯基苯甲氯化銨(VBTAC),2-(二異丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯(DPA)或2-氨乙基甲基丙烯酸酯鹽酸鹽(AMA);
上述方法中,引發劑是偶氮二異丁脒鹽酸鹽(V50),偶氮二異丁咪唑啉鹽酸鹽(AIBI),偶氮異丁氰基甲酰胺(V30);
上述方法中,AIE型的熒光分子是9,10-二(苯乙烯基)蒽磺酸鹽(DSA)、1,2-二[4-(3-磺酸丙氧基)苯基]-1,2-二苯基乙烯二鈉鹽(BSTPE)或1,1,2,2-四[4-(3-磺酸丙氧基)苯基]乙烯四鈉鹽(TSTPE)。
本發明具有如下優點:
1、該熒光納米微球的粒徑在納米級別且尺寸可控(50~140nm);
2、該熒光納米微球生物相容性好,在磷酸緩沖溶液和生物大分子溶液中能穩定存在3個月以上(圖5);
3、該熒光分子在pH=3~7范圍內熒光基本穩定,在pH=7~10范圍內熒光呈線性降低,但降低程度對熒光成像沒有影響;
4、該熒光納米微球表面帶正電荷,易于進入細胞,進行細胞熒光成像和生物檢測。
5、該熒光納米微球在生物大分子如BSA存在時熒光信號增強,生物大分子可以起到放大熒光信號的作用。并且BSA濃度和熒光強度呈線性變化,因此此材料可用于檢測BSA濃度(圖7)。
6、該熒光納米微球的細胞毒性低(圖8),利于其進行生物應用。
附圖說明
圖1:為實施例1制備的納米微球掃描電子顯微鏡照片(SEM);
圖2:為實施例1制備的納米微球和熒光納米微球動態光散射粒徑圖;
圖3:為實施例1制備的納米微球和熒光納米微球動態光散射Zeta圖;
圖4:為實施例1制備的熒光納米微球和熒光分子水溶液熒光譜圖(熒光分子濃度相同,λex=420nm);
圖5:為實施例1制備的熒光納米微球水溶液、熒光納米微球胎牛血清(FBS)磷酸緩沖溶液(pH=7.4)、3個月后的熒光納米微球胎牛血清(FBS)磷酸緩沖溶液(pH=7.4)的動態光散射粒徑圖;
圖6:(1)為實施例1制備的熒光納米微球在不同pH磷酸緩沖溶液下,熒光納米微球的熒光譜圖;(2)為實施例1制備的熒光納米微球熒光強度與pH關系圖;
圖7:(1)為實施例1制備的納米微球在不同BSA濃度下熒光譜圖;(2)為BSA濃度與熒光強度曲線圖;
圖8:(1)為實施例1熒光納米微球對人胃粘膜上皮細胞(GES-1)的細胞毒性測試圖;(2)為實施例1熒光納米微球對人胃癌細胞(SGC-7901)的細胞毒性測試圖;
圖9:(a)為實施例1制備的納米微球在正常細胞人胃粘膜上皮細胞(GES-1)熒光共聚焦明場照片;(b)為實施例1制備的納米微球在正常細胞人胃粘膜上皮細胞(GES-1)熒光共聚焦明場和暗場疊加照片;(c)為實施例1制備的納米微球在正常細胞人胃粘膜上皮細胞(GES-1)熒光共聚焦暗場照片;(d)為實施例1制備的納米微球在正常細胞人胃癌細胞(SGC-7901)熒光共聚焦明場照片;(e)為實施例1制備的納米微球在人胃癌細胞(SGC-7901)熒光共聚焦明場和暗場疊加照片;(f)為實施例1制備的納米微球在人胃癌細胞(SGC-7901)熒光共聚焦暗場照片;
圖10:為實施例2制備的納米微球掃描電子顯微鏡照片(SEM);
圖11:為實施例3制備的納米微球掃描電子顯微鏡照片(SEM);
圖12:為實施例4制備的納米微球掃描電子顯微鏡照片(SEM)。
具體實施方式
實施例1:
(1)取5mL苯乙烯(分析純,經減壓蒸餾除阻聚劑)和0.06g N,N,N-三甲基乙烯基苯甲氯化銨(VBTAC)加入到含有185mL去離子水的500mL的三頸瓶中,室溫、氮氣保護下機械攪拌(400rpm)30分鐘,除去反應體系中的氧氣,然后升溫到70℃,加入10mL、含有0.37mmol偶氮二異丁脒鹽酸鹽(V50)引發劑的水溶液引發聚合,聚合在氮氣保護、400rpm的攪拌速度下進行10h。聚合得到的納米微球在18500rpm的轉速下離心3次,并用去離子水洗滌3次,除掉未反應的單體、低聚物、引發劑等,重新分散到100mL去離子水中,便制得質量濃度為2.92%表面帶正電荷的納米微球溶液。
(2)取10mL納米微球溶液加入10mL去離子水再加入3mL、100μg/mL DSA于三頸瓶中,放入攪拌子,在磁攪拌下加熱到50℃反應4h,反應完成后熒光納米微球在18500rpm的轉速下離心3次,并用去離子水洗滌3次,除去未復合的熒光分子,并重新分散到23mL去離子水中,得到質量濃度為1.27%的表面帶正電荷的具有聚集誘導熒光增強性質的熒光納米微球溶液。
從納米微球掃描電子顯微鏡照片(SEM)(圖1)可以看出納米微球尺寸為100nm,尺寸均一,單分散性好。通過動態光散射(DLS)測得納米微球在水溶液中的尺寸為120.7nm,單分散指數PDI=0.002(圖2),由于存在水合粒徑,所以測得的尺寸要比SEM的數值大。通過動態光散射(DLS)測得納米微球表面呈正電性(42.4mv)(圖3)。帶負電荷的AIE型熒光分子DSA通過庫侖力的作用復合到熒光納米微球表面,得到的熒光納米微球的水合粒徑為131.7nm(圖2),并且具有很好的單分散性,單分散指數PDI=0.013,表面電荷也降低到40.6mv(圖3)。雖然熒光分子DSA本身具有良好的生物相容性,并且克服了傳統的聚集熒光誘導淬滅現象,但是由于具有水溶性,吸收的大部分能量都通過 分子內轉動釋放,熒光效率很低,因此不適用于生物成像。熒光分子DSA復合到我們合成的納米微球上后,由于分子內轉動受到限制,大部分吸收的能量通過輻射的方式釋放出,從熒光譜圖上可以看出熒光效率得到的顯著地增強(圖4)。我們所合成的熒光納米微球具有很好的生物相容性和生物穩定性。我們配制了含有500μg/mL熒光納米微球的10%胎牛血清(FBS)磷酸緩沖溶液(pH=7.4),低溫存放3個月后,通過動態光散射測得尺寸沒有發生明顯變化(圖5)。并且我們測試了熒光納米微球在不同生物環境下的熒光穩定性,當熒光納米微球在不同的pH磷酸緩沖溶液中時,熒光強度并沒有明顯的變化(圖6)。當在生物大分子BSA溶液中時,由于這些生物大分子帶負電,吸附到熒光納米微球的表面進一步束縛DSA分子內轉動,因此使其熒光增強并且呈線性變化(圖7),因此細胞內的一些生物分子會放大我們合成的熒光納米微球的熒光信號。我們進行了熒光納米微球的細胞毒性測試,可以看出在納米微球濃度100mg/L培養72h細胞的存活率仍達到85%以上,細胞毒性低,可以用于生物成像(圖8)。我們對其進行了細胞成像實驗,通過共聚焦細胞成像看到我們合成的熒光納米微球可以很好地進入正常細胞和癌細胞的細胞質,對細胞進行很好的成像(圖9)。
實施例2:
(1)取5mL苯乙烯(分析純,經減壓蒸餾除阻聚劑)和0.5g N,N,N-三甲基乙烯基苯甲氯化銨(VBTAC)加入到含有185mL去離子水的500mL的三頸瓶中,室溫、氮氣保護下機械攪拌(400rpm)30分鐘,除去反應體系中的氧氣,然后升溫到70℃,加入10mL、含有0.37mmol偶氮二異丁脒鹽酸鹽(V50)引發劑的水溶液引發聚合,聚合在氮氣保護、400rpm的攪拌速度下進行10h。聚合得到的納米微球在18500rpm的轉速下離心3次,并用去離子水洗滌3次,除掉未反應的、低聚物、引發劑等,重新分散到100mL去離子水中,便制得質量濃度為2.92%表面帶正電荷的納米微球溶液。
(2)取10mL納米微球溶液加入10mL去離子水再加入3mL、100μg/mL DSA于三頸瓶中,放入攪拌子,在磁攪拌下加熱到50℃反應4h,反應完成后熒光納米微球在18500rpm的轉速下離心3次,并用去離子水洗滌3次,除去未復合的熒光分子,并重新分散到23mL去離子水中,得到質量濃度為1.27%的表 面帶正電荷的具有聚集誘導熒光增強性質的熒光納米微球溶液。
我們發現,其性質和實施例1中制備的樣品性質相似,但是尺寸變小,約為50nm(見圖10)。這是因為聚合單體N,N,N-三甲基乙烯基苯甲氯化銨(VBTAC)是兩親性單體,充當表面活性劑的作用。當它的量增加時,相當于表面活性劑的量增加,所以納米微球的尺寸會變小。
實施例3:
(1)取5mL苯乙烯(分析純,經減壓蒸餾除阻聚劑)和0.05g N,N,N-三甲基乙烯基苯甲氯化銨(VBTAC)加入到含有185mL去離子水的500mL的三頸瓶中,室溫、氮氣保護下機械攪拌(400rpm)30分鐘,除去反應體系中的氧氣,然后升溫到70℃,加入10mL、含有0.37mmol偶氮二異丁脒鹽酸鹽(V50)引發劑的水溶液引發聚合,聚合在氮氣保護、400rpm的攪拌速度下進行10h。聚合得到的納米微球在18500rpm的轉速下離心3次,并用去離子水洗滌3次,除掉未反應的、低聚物、引發劑等,重新分散到100mL去離子水中,便制得質量濃度為2.92%表面帶正電荷的納米微球溶液。
(2)取10mL納米微球溶液加入10mL去離子水再加入3mL、100μg/mL DSA于三頸瓶中,放入攪拌子,在磁攪拌下加熱到50℃反應4h,反應完成后熒光納米微球在18500rpm的轉速下離心3次,并用去離子水洗滌3次,除去未復合的熒光分子,并重新分散到23mL去離子水中,得到質量濃度為1.27%的表面帶正電荷的具有聚集誘導熒光增強性質的熒光納米微球溶液。
我們發現,其性質和實施例1中制備的樣品性質相似,但是尺寸變大,約為110nm(見圖11)。這是因為聚合單體N,N,N-三甲基乙烯基苯甲氯化銨(VBTAC)是兩親性單體,充當表面活性劑的作用。當它的量減少時,相當于表面活性劑的量減少,所以納米微球的尺寸會變大。
實施例4:
(1)取5mL苯乙烯(分析純,經減壓蒸餾除阻聚劑)和0.04g N,N,N-三甲基乙烯基苯甲氯化銨(VBTAC)加入到含有185mL去離子水的500mL的三頸瓶中,室溫、氮氣保護下機械攪拌(400rpm)30分鐘,除去反應體系中的氧氣, 然后升溫到70℃,加入10mL、含有0.37mmol偶氮二異丁脒鹽酸鹽(V50)引發劑的水溶液引發聚合,聚合在氮氣保護、400rpm的攪拌速度下進行10h。聚合得到的納米微球在18500rpm的轉速下離心3次,并用去離子水洗滌3次,除掉未反應的、低聚物、引發劑等,重新分散到100mL去離子水中,便制得質量濃度為2.92%表面帶正電荷的納米微球溶液。
(2)取10mL納米微球溶液加入10mL去離子水再加入3mL、100μg/mL DSA于三頸瓶中,放入攪拌子,在磁攪拌下加熱到50℃反應4h,反應完成后熒光納米微球在18500rpm的轉速下離心3次,并用去離子水洗滌3次,除去未復合的熒光分子,并重新分散到23mL去離子水中,得到質量濃度為1.27%的表面帶正電荷的具有聚集誘導熒光增強性質的熒光納米微球溶液。
我們發現,其性質和實施例1中制備的樣品性質相似,但是尺寸變大,約為140nm(見圖12)。這是因為聚合單體N,N,N-三甲基乙烯基苯甲氯化銨(VBTAC)是兩親性單體,充當表面活性劑的作用。當它的量減少時,相當于表面活性劑的量減少,所以納米微球的尺寸會變大。

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