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一種用于廢水中生物降解的二元復合菌群構建方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201510423726.0

申請日:

2015.07.18

公開號:

CN105062911A

公開日:

2015.11.18

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 1/20申請日:20150718|||公開
IPC分類號: C12N1/20; C02F3/34; C12R1/05(2006.01)N; C12R1/01(2006.01)N; C12R1/40(2006.01)N; C02F101/38(2006.01)N; C02F101/34(2006.01)N 主分類號: C12N1/20
申請人: 東北電力大學
發明人: 郭靜波; 姜麗杰; 王偉卓; 劉明偉
地址: 132012吉林省吉林市船營區長春路169號
優先權:
專利代理機構: 吉林市達利專利事務所22102 代理人: 陳傳林
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201510423726.0

授權公告號:

||||||

法律狀態公告日:

2018.09.07|||2015.12.16|||2015.11.18

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

一種用于廢水中生物降解的二元復合菌群構建方法,其特點是,包括苯酚和苯胺兩種構建方法,均含有:選擇菌株、菌株活化、菌株馴化、菌株保存、菌落形態觀察、菌懸液制備、不同菌株初始配比的混合菌懸液的制備和二元復合菌群最佳配比選擇,在兩株具有不同菌落特征,對同一種有機污染物具有降解能力的菌株的基礎上,將菌體以不同比例接種于含有目標有機污染物的廢水中,在指定的反應條件下,經過指定的生化反應時間后,測定不同接種比例下菌株對目標污染物的降解情況,同時對反應終點時刻培養液中兩種菌的菌落形成單位進行計量,最終通過污染物降解效率及兩株菌的相對菌落形成單位的計算結果確定用于目標污染物生物降解的二元復合菌群的配比。

權利要求書

1.一種用于廢水中苯酚生物降解的二元復合菌群的構建方法,其特征在于,它包括以下
內容:
1)選擇菌株:選擇糞產堿菌和乙酸鈣不動桿菌,糞產堿菌和乙酸鈣不動桿菌均來源于中
國普通微生物菌種保藏管理中心,糞產堿菌的菌株編號為CGMCCNo.1.2098,乙酸鈣不動桿
菌的菌株編號為CGMCCNo.1.6186,將糞產堿菌的菌株簡稱為PR1、乙酸鈣不動桿菌的菌株
簡稱為PR2;
2)菌株的活化:從營養肉汁瓊脂斜面上挑取PR1和PR2的菌苔分別接種于100mL牛肉
膏蛋白胨液體培養基中,置于30℃,150rpm搖床中振蕩培養24h進行菌株的活化;
3)菌株的馴化:取活化后的PR1和PR2培養液各10mL,分別接種于含有苯酚的馴化培
養基中,置于30℃,150rpm搖床中振蕩培養,進行菌株的馴化,培養24h后再重復上述過程
進行第二個周期的馴化,共馴化5個周期,120h,前兩個馴化周期加入1.5mL經過濾除菌的
10%(w/v)苯酚溶液,第三個周期加入3.0mL經過濾除菌的10%(w/v)苯酚溶液,最后兩個馴化
周期加入8mL經過濾除菌的10%(w/v)苯酚溶液;
4)菌株的保存:將馴化后的菌株采用倍比稀釋法在平板上得到單菌落后,挑取單菌落接
種到斜面培養基上,待菌苔長出后放入4℃冰箱中低溫保存備用;
5)菌落形態觀察:采用平板劃線的方法將菌株分別接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基中,
置于30℃生化培養箱中培養24h后,觀察其菌落形態,主要通過菌落的顏色、透明度、表面
光滑性和邊緣形態對用于苯酚生物降解的二元復合菌群構建的PR1和PR2菌株進行區分;
6)菌懸液制備:將馴化后的PR1和PR2分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中,置于
30℃,150rpm搖床中振蕩培養24h,將培養液置于臺式高速冷凍離心機中以10000rpm離心
5min后,棄去上清液后用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液重懸,再次離心后棄
去上清液,如此操作兩次清洗菌體,再用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液重懸,
分別制成OD600=1.2的菌懸液置于冰箱中冷藏備用,同時通過平板計數法分別測定菌懸液中
PR1和PR2的活菌數;
7)不同PR1、PR2初始配比的混合菌懸液的制備:根據菌懸液中測定的PR1和PR2活
菌數,吸取PR1和PR2的菌懸液,使混合后的PR1、PR2菌懸液的總活菌量為2×108CFU/mL,
并使PR1和PR2活菌初始比例分別為0/10、1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和
10/0,其中10/0代表體系中僅有PR1,0/10代表體系中僅有PR2;
8)二元復合菌群最佳配比的選擇:將PR1和PR2活菌初始比例為0/10、1/9、2/8、3/7、
4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和10/0的混合菌懸液以10%(v/v)的量分別接種于含有200mg/L
苯酚的無機鹽培養液中,于30℃,150rpm搖床中振蕩培養12h后測定殘留的苯酚和TOC濃
度,同時通過倍比稀釋法依據菌落形態特征對生物降解反應結束后體系中PR1和PR2的數量
進行計量;定義CFUPR1為PR1在10/0體系中的活菌數,即僅接種PR1的體系,CFUPR2為
PR2在0/10體系中的活菌數,即僅接種PR2的體系,CFUPR1·PR2為PR1在PR2存在時的活菌
數,CFUPR2·PR1為PR2在PR1存在時的活菌數,PR1的相對活菌數
PR2的相對活菌數當RCFU<1時,代表一株菌生長和繁殖受到了另
一株菌的抑制,而當RCFU>1時,代表另一株菌的存在對該菌株的生長和繁殖起到了促進作
用;根據兩株菌在不同初始活菌比例下的苯酚降解率、TOC降解率以及RCFU計算結果,選
擇苯酚降解率、TOC降解率最高且RCFUPR1和RCFUPR2計算結果均大于1的初始活菌比例作
為苯酚生物降解二元復合菌群的構建比例,此時二元復合菌群對苯酚的降解效果最佳且形成
了互利共生的關系。
2.根據權利1所述的用于廢水中苯酚生物降解的二元復合菌群的構建方法,其特征在于:
所述的牛肉膏蛋白胨培養基的組分為牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,蒸餾水1000mL,pH
7.0,121℃滅菌20min后備用,制作牛肉膏蛋白胨固體培養基時加入20g瓊脂。
3.根據權利1所述的用于廢水中苯酚生物降解的二元復合菌群的構建方法,其特征在于:
所述的馴化培養基的組分為(NH4)2SO43g,KH2PO40.5g,NaHPO40.5g,MgSO4·7H2O0.3g,
微量元素液1mL,蒸餾水1000mL,pH7.5,121℃滅菌20min,待冷卻后加入經過濾除菌的
10%(w/v)苯酚溶液。
4.根據權利1所述的用于廢水中苯酚生物降解的二元復合菌群的構建方法,其特征在于:
所述的微量元素液的組分為FeSO4·7H2O0.5g,MnSO4·H2O0.15g,ZnSO40.14g,CoCl20.2g,
蒸餾水1000mL。
5.根據權利1所述的用于廢水中苯酚生物降解的二元復合菌群的構建方法,其特征在于:
所述的苯酚降解率及TOC降解率采用以下公式進行計算:


6.一種用于廢水中苯胺生物降解的二元復合菌群的構建方法,其特征在于:它包括以下
內容:
1)選擇菌株:選擇惡臭假單胞菌和乙酸鈣不動桿菌,惡臭假單胞菌和乙酸鈣不動桿菌均
來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心,糞產堿菌的菌株編號為CGMCCNo.1.1003,乙酸
鈣不動桿菌的菌株編號為CGMCCNo.1.3615,將惡臭假單胞菌的菌株簡稱為BA1、乙酸鈣
不動桿菌的菌株簡稱為BA2;
2)菌株的活化:從營養肉汁瓊脂斜面上挑取BA1和BA2的菌苔分別接種于100mL牛
肉膏蛋白胨液體培養基中,置于30℃,150rpm搖床中振蕩培養24h進行菌株的活化;
3)菌株的馴化:取活化后的BA1和BA2培養液各10mL,分別接種于含有苯胺的馴化
培養基中,置于30℃,150rpm搖床中振蕩培養,進行菌株的馴化,培養36h后再重復上述過
程進行第二個周期的馴化,共馴化5個周期,180h,前兩個馴化周期加入1.5mL經過濾除菌
的10%(w/v)苯胺溶液,第三個周期加入3.0mL經過濾除菌的10%(w/v)苯胺溶液,最后兩個馴
化周期加入8mL經過濾除菌的10%(w/v)苯胺溶液;
4)菌株的保存:將馴化后的菌株采用倍比稀釋法在平板上得到單菌落后,挑取單菌落接
種到斜面培養基上,待菌苔長出后放入4℃冰箱中低溫保存備用;
5)菌落形態觀察:采用平板劃線的方法將菌株分別接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基中,
置于30℃生化培養箱中培養24h后,觀察其菌落形態,主要通過菌落的顏色、透明度、表面
光滑性和邊緣形態對用于苯胺生物降解的二元復合菌群構建的BA1和BA2菌株進行區分;
6)菌懸液制備:將馴化后的BA1和BA2分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中,置于
30℃,150rpm搖床中振蕩培養24h,將培養液置于臺式高速冷凍離心機中以10000rpm離心
5min后,棄去上清液后用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液重懸,再次離心后棄
去上清液,如此操作兩次清洗菌體,再用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液重懸,
分別制成OD600=1.2的菌懸液置于冰箱中冷藏備用,同時通過平板計數法分別測定菌懸液中
BA1和BA2的活菌數;
7)不同BA1、BA2初始配比的混合菌懸液的制備:根據菌懸液中測定的BA1和BA2
活菌數,吸取BA1和BA2的菌懸液,使混合后的BA1、BA2菌懸液的總活菌量為
2×108CFU/mL,并使BA1和BA2活菌初始比例分別為0/10、1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、
7/3、8/2、9/1和10/0,其中10/0代表體系中僅有BA1,0/10代表體系中僅有BA2;
8)二元復合菌群最佳配比的選擇:將BA1和BA2活菌初始比例為0/10、1/9、2/8、3/7、
4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和10/0的混合菌懸液分別以10%(v/v)的量分別接種于含苯胺300mg/L
的無機鹽培養液中,于30℃,150rpm搖床中振蕩培養36h后測定殘留的苯胺和TOC濃度,
同時通過倍比稀釋法依據菌落形態特征對生物降解反應結束后體系中BA1和BA2的數量進
行計量;定義CFUBA1為BA1在10/0體系中的活菌數,即僅接種BA1的體系,CFUBA2為BA2
在0/10體系中的活菌數,即僅接種BA2的體系,CFUBA1·BA2為BA1在BA2存在時的活菌數,
CFUBA2·BA1為BA2在BA1存在時的活菌數,BA1的相對活菌數PR2
的相對活菌數當RCFU<1時,代表一株菌生長和繁殖受到了另一株
菌的抑制,而當RCFU>1時,代表另一株菌的存在對該菌株的生長和繁殖起到了促進作用;
根據兩株菌在不同初始活菌比例下的苯胺降解率、TOC降解率以及RCFU計算結果,選擇苯
胺降解率、TOC降解率最高且RCFUBA1和RCFUBA2計算結果均大于1的初始活菌比例作為
苯胺生物降解二元復合菌群的構建比例,此時二元復合菌群對苯胺的降解效果最佳且形成了
互利共生的關系。
7.根據權利要求6所述的用于廢水中苯胺生物降解的二元復合菌群的構建方法,其特征
在于:所述的牛肉膏蛋白胨液體培養基的組分為牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,蒸餾水
1000mL,pH7.0,121℃滅菌20min后備用,制作牛肉膏蛋白胨固體培養基時加入20g瓊脂。
8.根據權利要求6所述的用于廢水中苯胺生物降解的二元復合菌群的構建方法,其特征
在于:所述的馴化液體培養基的組分為(NH4)2SO43g,KH2PO40.5g,NaHPO40.5g,MgSO4·7H2O
0.3g,微量元素液1mL,蒸餾水1000mL,pH7.5,121℃滅菌20min,待冷卻后加入經過濾
除菌的10%(w/v)苯胺溶液。
9.根據權利要求6所述的用于廢水中苯胺生物降解的二元復合菌群的構建方法,其特征
在于:所述的微量元素液的組分為FeSO4·7H2O0.5g,MnSO4·H2O0.15g,ZnSO40.14g,CoCl2
0.2g,蒸餾水1000mL。
10.根據權利要求6所述的用于廢水中苯胺生物降解的二元復合菌群的構建方法,其特征
在于:所述的苯胺降解率及TOC降解率采用以下公式進行計算:


說明書

一種用于廢水中生物降解的二元復合菌群構建方法

技術領域

本發明屬于廢水生物處理領域,是一種用于廢水中生物降解的二元復合菌群構建方法。

背景技術

近年來,隨著化學工業的飛速發展,新技術和新材料的開發與應用使得廢水中含有大量
的有機污染物。由于這些物質本身結構的復雜性和生物陌生性,污染環境中能降解轉化該類
污染物的土著微生物種類和數量較少,甚至沒有能降解某些特殊污染物的土著微生物,因此,
傳統的廢水生化處理工藝很難將其有效的去除,這些難降解有機污染物將隨廢水處理系統外
排水或生物固體廢棄物以第二污染源的形式最終反饋到水體、土壤及大氣中,對人類及其他
生命體的健康和生態環境都將構成嚴重威脅。此外,城市化進程使得城市用地逐年緊張,傳
統污水處理工藝流程長、占地面積大、操作復雜等矛盾也日趨突出,提標和提效改造成為城
市污水處理廠在現有基礎上節能降耗和更好發揮其污染治理效果的必經途徑。

大量研究表明,通過向生化處理系統中投加復合菌群的生物增強技術可以最大限度發揮
微生物的潛力,有效解決傳統生化處理工藝難降解有機污染物去除效率低、運行效果不穩定
等突出問題。復合菌群又稱復合菌劑、復合微生物、混合菌劑等,是基于微生態學理論,利
用微生物菌群的聯合作用,由兩種或兩種上的微生物共同培養、相互作用、相互影響,最終
達到發揮其最大群體優勢的微生態系統。在污染環境中,單一菌株往往不能完成或只能對有
機物的降解起很微弱的作用,而復合菌群可以利用多種微生物的共生互利關系,通過多步轉
化將復雜的有機物協同代謝為對環境無害的終產物。復合菌群的出現是人類對于微生物認識
的自然結果,很多生化反應過程是單一微生物不能完成或只能微弱進行的,而在兩種或多種
微生物共存的條件下,微生物之間的共生、共養和共榮等使得生化反應過程朝著出現有益效
果的方向發展。隨著純培養技術的完善和對微生物間互生和共生現象的研究,人為的微生物
混合培養或混合發酵日益備受重視,由此產生了結構和功能多樣的復合菌群。

復合菌群的構建原理是將不同的微生物菌株針對不同的處理體系進行科學組合,構建出
高效的或具有特定功能的菌群。其構建過程首先是對微生物進行優選、馴化,將具有不同功
能的菌群提取出來,然后針對各類工業廢水、天然水體和市政污水等不同處理對象、環境,
經多次組合搭配,構建出最優組合的復合菌群。處理對象和應用場合的不同使目前復合菌群
的開發呈多樣化的發展趨勢。目前,我國環境科學領域對復合菌群的研究主要集中于兩大類:
一類是對現有以日本比嘉照夫教授研制的有效微生物菌群(HighEffectiveComplex
Microorganisms,簡稱EM)為代表的商品化復合菌劑進行研究和應用,另一類是根據所應用的
環境條件和所達的目的,利用篩選到的微生物配置、優化的微生物制劑。商品化的復合菌群
細菌種類和配比固定,難以適應生產實踐中含有多種污染物的廢水處理的需要;此外,利用
篩選到的菌株進行復合菌群的構建時往往要經過較長周期的馴化和反復的配比實驗以獲得菌
株復合的最佳比例,且實驗室條件下確定的最佳比例投加到實際污染場地后能否長期維持穩
定的群落結構并形成良好的互利共生關系很難預知。因此,開發簡單、快速和有效的復合菌
群構建方法是將其更好地規模化應用到廢水中所含有機污染物的生物分解和轉化過程中亟待
解決的問題。

發明內容

本發明的目的是,為強化微生物對廢水中苯酚和苯胺的分解和轉化,而提供科學合理,
便于實施,配比明確,降解效果好,群落結構穩定,用于廢水中苯酚生物降解的二元復合菌
群的構建方法和用于廢水中苯胺生物降解的二元復合菌群構建方法。

本發明的目的之一是由以下技術方案來實現的:一種用于廢水中苯酚生物降解的二元復
合菌群構建方法,其特征在于,它包括以下內容:

1)選擇菌株:選擇糞產堿菌和乙酸鈣不動桿菌,糞產堿菌和乙酸鈣不動桿菌均來源于中
國普通微生物菌種保藏管理中心,糞產堿菌的菌株編號為CGMCCNo.1.2098,乙酸鈣不動桿
菌的菌株編號為CGMCCNo.1.6186,將糞產堿菌的菌株簡稱為PR1、乙酸鈣不動桿菌的菌株
簡稱為PR2;

2)菌株的活化:從營養肉汁瓊脂斜面上挑取PR1和PR2的菌苔分別接種于100mL牛肉
膏蛋白胨液體培養基中,置于30℃,150rpm搖床中振蕩培養24h進行菌株的活化;

3)菌株的馴化:取活化后的PR1和PR2培養液各10mL,分別接種于含有苯酚的馴化培
養基中,置于30℃,150rpm搖床中振蕩培養,進行菌株的馴化,培養24h后再重復上述過程
進行第二個周期的馴化,共馴化5個周期,120h,前兩個馴化周期加入1.5mL經過濾除菌的
10%(w/v)苯酚溶液,第三個周期加入3.0mL經過濾除菌的10%(w/v)苯酚溶液,最后兩個馴化
周期加入8mL經過濾除菌的10%(w/v)苯酚溶液;

4)菌株的保存:將馴化后的菌株采用倍比稀釋法在平板上得到單菌落后,挑取單菌落接
種到斜面培養基上,待菌苔長出后放入4℃冰箱中低溫保存備用;

5)菌落形態觀察:采用平板劃線的方法將菌株分別接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基中,
置于30℃生化培養箱中培養24h后,觀察其菌落形態,主要通過菌落的顏色、透明度、表面
光滑性和邊緣形態對用于苯酚生物降解的二元復合菌群構建的PR1和PR2菌株進行區分;

6)菌懸液制備:將馴化后的PR1和PR2分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中,置于
30℃,150rpm搖床中振蕩培養24h,將培養液置于臺式高速冷凍離心機中以10000rpm離心
5min后,棄去上清液后用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液重懸,再次離心后棄
去上清液,如此操作兩次清洗菌體,再用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液重懸,
分別制成OD600=1.2的菌懸液置于冰箱中冷藏備用,同時通過平板計數法分別測定菌懸液中
PR1和PR2的活菌數;

7)不同PR1、PR2初始配比的混合菌懸液的制備:根據菌懸液中測定的PR1和PR2活
菌數,吸取PR1和PR2的菌懸液,使混合后的PR1、PR2菌懸液的總活菌量為2×108CFU/mL,
并使PR1和PR2活菌初始比例分別為0/10、1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和
10/0,其中10/0代表體系中僅有PR1,0/10代表體系中僅有PR2;

8)二元復合菌群最佳配比的選擇:將PR1和PR2活菌初始比例為0/10、1/9、2/8、3/7、
4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和10/0的混合菌懸液以10%(v/v)的量分別接種于含有200mg/L
苯酚的無機鹽培養液中,于30℃,150rpm搖床中振蕩培養12h后測定殘留的苯酚和TOC濃
度,同時通過倍比稀釋法依據菌落形態特征對生物降解反應結束后體系中PR1和PR2的數量
進行計量;定義CFUPR1為PR1在10/0體系中的活菌數,即僅接種PR1的體系,CFUPR2為
PR2在0/10體系中的活菌數,即僅接種PR2的體系,CFUPR1·PR2為PR1在PR2存在時的活菌
數,CFUPR2·PR1為PR2在PR1存在時的活菌數,PR1的相對活菌數
PR2的相對活菌數當RCFU<1時,代表一株菌生長和繁殖受到了另
一株菌的抑制,而當RCFU>1時,代表另一株菌的存在對該菌株的生長和繁殖起到了促進作
用;根據兩株菌在不同初始活菌比例下的苯酚降解率、TOC降解率以及RCFU計算結果,選
擇苯酚降解率、TOC降解率最高且RCFUPR1和RCFUPR2計算結果均大于1的初始活菌比例作
為苯酚生物降解二元復合菌群的構建比例,此時二元復合菌群對苯酚的降解效果最佳且形成
了互利共生的關系。

所述的牛肉膏蛋白胨培養基的組分為牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,蒸餾水1000mL,
pH7.0,121℃滅菌20min后備用,制作牛肉膏蛋白胨固體培養基時加入20g瓊脂。

所述的馴化培養基的組分為(NH4)2SO43g,KH2PO40.5g,NaHPO40.5g,MgSO4·7H2O0.3g,
微量元素液1mL,蒸餾水1000mL,pH7.5,121℃滅菌20min,待冷卻后加入經過濾除菌的
10%(w/v)苯酚溶液。

所述的微量元素液的組分為FeSO4·7H2O0.5g,MnSO4·H2O0.15g,ZnSO40.14g,CoCl2
0.2g,蒸餾水1000mL。

所述的苯酚降解率及TOC降解率采用以下公式進行計算:

(1)

(2)

本發明的目的之二是,一種用于廢水中苯胺生物降解的二元復合菌群構建方法,其特征
在于:它包括以下內容:

1)選擇菌株:選擇惡臭假單胞菌和乙酸鈣不動桿菌,惡臭假單胞菌和乙酸鈣不動桿菌均
來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心,糞產堿菌的菌株編號為CGMCCNo.1.1003,乙酸
鈣不動桿菌的菌株編號為CGMCCNo.1.3615,將惡臭假單胞菌的菌株簡稱為BA1、乙酸鈣
不動桿菌的菌株簡稱為BA2;

2)菌株的活化:從營養肉汁瓊脂斜面上挑取BA1和BA2的菌苔分別接種于100mL牛
肉膏蛋白胨液體培養基中,置于30℃,150rpm搖床中振蕩培養24h進行菌株的活化;

3)菌株的馴化:取活化后的BA1和BA2培養液各10mL,分別接種于含有苯胺的馴化
培養基中,置于30℃,150rpm搖床中振蕩培養,進行菌株的馴化,培養36h后再重復上述過
程進行第二個周期的馴化,共馴化5個周期,180h,前兩個馴化周期加入1.5mL經過濾除菌
的10%(w/v)苯胺溶液,第三個周期加入3.0mL經過濾除菌的10%(w/v)苯胺溶液,最后兩個馴
化周期加入8mL經過濾除菌的10%(w/v)苯胺溶液;

4)菌株的保存:將馴化后的菌株采用倍比稀釋法在平板上得到單菌落后,挑取單菌落接
種到斜面培養基上,待菌苔長出后放入4℃冰箱中低溫保存備用;

5)菌落形態觀察:采用平板劃線的方法將菌株分別接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基中,
置于30℃生化培養箱中培養24h后,觀察其菌落形態,主要通過菌落的顏色、透明度、表面
光滑性和邊緣形態對用于苯胺生物降解的二元復合菌群構建的BA1和BA2菌株進行區分;

6)菌懸液制備:將馴化后的BA1和BA2分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中,置于
30℃,150rpm搖床中振蕩培養24h,將培養液置于臺式高速冷凍離心機中以10000rpm離心
5min后,棄去上清液后用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液重懸,再次離心后棄
去上清液,如此操作兩次清洗菌體,再用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液重懸,
分別制成OD600=1.2的菌懸液置于冰箱中冷藏備用,同時通過平板計數法分別測定菌懸液中
BA1和BA2的活菌數;

7)不同BA1、BA2初始配比的混合菌懸液的制備:根據菌懸液中測定的BA1和BA2
活菌數,吸取BA1和BA2的菌懸液,使混合后的BA1、BA2菌懸液的總活菌量為
2×108CFU/mL,并使BA1和BA2活菌初始比例分別為0/10、1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、
7/3、8/2、9/1和10/0,其中10/0代表體系中僅有BA1,0/10代表體系中僅有BA2;

8)二元復合菌群最佳配比的選擇:將BA1和BA2活菌初始比例為0/10、1/9、2/8、3/7、
4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和10/0的混合菌懸液分別以10%(v/v)的量分別接種于含苯胺300mg/L
的無機鹽培養液中,于30℃,150rpm搖床中振蕩培養36h后測定殘留的苯胺和TOC濃度,
同時通過倍比稀釋法依據菌落形態特征對生物降解反應結束后體系中BA1和BA2的數量進
行計量;定義CFUBA1為BA1在10/0體系中的活菌數,即僅接種BA1的體系,CFUBA2為BA2
在0/10體系中的活菌數,即僅接種BA2的體系,CFUBA1·BA2為BA1在BA2存在時的活菌數,
CFUBA2·BA1為BA2在BA1存在時的活菌數,BA1的相對活菌數PR2
的相對活菌數當RCFU<1時,代表一株菌生長和繁殖受到了另一株
菌的抑制,而當RCFU>1時,代表另一株菌的存在對該菌株的生長和繁殖起到了促進作用;
根據兩株菌在不同初始活菌比例下的苯胺降解率、TOC降解率以及RCFU計算結果,選擇苯
胺降解率、TOC降解率最高且RCFUBA1和RCFUBA2計算結果均大于1的初始活菌比例作為
苯胺生物降解二元復合菌群的構建比例,此時二元復合菌群對苯胺的降解效果最佳且形成了
互利共生的關系。

所述的牛肉膏蛋白胨液體培養基的組分為牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,蒸餾水
1000mL,pH7.0,121℃滅菌20min后備用,制作牛肉膏蛋白胨固體培養基時加入20g瓊脂。

所述的馴化液體培養基的組分為(NH4)2SO43g,KH2PO40.5g,NaHPO40.5g,MgSO4·7H2O
0.3g,微量元素液1mL,蒸餾水1000mL,pH7.5,121℃滅菌20min,待冷卻后加入經過濾
除菌的10%(w/v)苯胺溶液。

所述的微量元素液的組分為FeSO4·7H2O0.5g,MnSO4·H2O0.15g,ZnSO40.14g,Cocl2
0.2g,蒸餾水1000mL。

所述的苯胺降解率及TOC降解率采用以下公式進行計算:

(1)

(2)

將本發明與現有技術相比,結果如下:

中國專利申請號201110287122.X,名稱為一種用于降解城市廢水的優勢菌群及其制備方
法,公開了制備構成優勢菌群的陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、戈登氏菌(Gordonia)和惡
臭假單胞菌(Pseudomonasputida)體積百分比分別是20~24%、54~58%和26~18%,然而并未明
確指出獲得該體積百分的具體方法。而本發明通過測定不同比例的兩株菌投加到待處理廢水
中后對目標污染物的濃度及活菌數量,綜合考察污染物處理效果和微生物群落結構的穩定性,
從而獲得二元復合菌群的精確配比;

中國專利申請號200710064363.1,名稱為一種降解酚類有機物的方法及其專用菌群,公
開了一種采用含有發孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9CGMCCNo.1893在溫和條件下高效降
解酚類有機物的方法,然而并未給出混合菌群的具體群落結構組成及所涉及微生物的相對比
例,而本發明是在獲得具體菌株并了解其污染物降解特性的基礎上,通過簡便而快速的構建
方法,綜合二元復合菌群的污染物降解效果和群落結構穩定性,給出菌株的確切配比;

中國專利申請號200810063737.2,名稱為降解“三苯”VOCs廢氣的復合微生物菌劑的制備
方法,公開了的用于“三苯”VOCs廢氣降解的復合微生物菌劑是以含目標污染物的培養基馴化
活性污泥的方法獲得的,馴化周期長,且該發明并未對經干燥后碾磨成粉末狀的復合微生物
菌劑發酵物經長期保存后的污染物效果進行驗證,由于群落結構未知,該復合菌群的規模化
生產及應用效果難以得到保證,而本發明是在分離純化高效降解菌株的基礎上,采用復合菌
群的構建方法,對復合菌群的配比進行優化,其穩定的群落結構組成能夠保證其高效穩定的
污染物降解效果,且在實際生產應用中,其種子液的發酵過程可分別進行,以獲得活性高的
初始菌株,為復合菌群的構建奠定了必要的基礎;

中國專利申請號201110128285.3,名稱為一種降解多環芳烴的混合菌劑,公開了混合菌
劑的具體組成,然而并未涉及混合菌劑中不同微生物在種子液中的相對比例和投加到待處理
廢水中后其相對數量的變化規律,由于不同污染場地中污染物的濃度及環境條件存在著不同
程度的差異,因而該混合菌劑的針對性和實用性有待考證,而本發明直接以含有目標難降解
有機污染物的待處理廢水為環境介質,通過污染物降解效果及群落結構穩定性的考察,能獲
得針對性強、污染物降解效果好和群落結構穩定的二元復合菌群,因而能保證良好的實地應
用效果;

中國專利申請號2013105523877,名稱為一種用于降解造紙廢水的復合菌群及其制備方
法,公開了構成降解造紙廢水復合菌群的土壤桿菌、桿狀菌、陰溝腸桿菌、惡臭假單胞菌和
施氏假單胞菌的體積百分比分別為5-8%、2-5%、10-15%、26-41%和34-56%,但是并未給出
獲得該體積比的依據,同時由于各菌株培養營養條件不同,其對數增長期培養液中各菌株的
相對數量也有所不同,以體積比作為定量化依據降低了該復合菌群在實際生產中的可操作性。
而本發明中涉及了兩種獨立的高效菌株,在實際操作中,可以采用測定殘余目標污染物濃度
和RCFU的方法,對降解效果和菌株在待處理污染中的存在狀態進行系統的把握,從而能構
建出配比明確、降解效果好和群落結構穩定的二元復合菌群;

本發明的用于廢水中苯酚生物降解的二元復合菌群構建方法和用于廢水中苯胺生物降解
的二元復合菌群的構建方法均具有科學合理,便于實施,配比明確,降解效果好,群落結構
穩定等優點。

附圖說明

圖1為實施例1的不同初始比例下二元復合菌群相對菌落形成單位以及苯酚和TOC的降
解率示意圖;

圖2為實施例1的單一菌株及二元復合菌群對不同初始濃度苯酚的降解情況示意圖;

圖3為實施例2的不同初始比例下二元復合菌群相對菌落形成單位以及苯胺和TOC的降
解率示意圖;

圖4為實施例2的單一菌株及二元復合菌群對不同初始濃度苯胺的降解情況示意圖。

具體實施方式

實施例1:本發明的用于廢水中苯酚生物降解的二元復合菌群構建方法

選擇糞產堿菌和乙酸鈣不動桿菌,糞產堿菌和乙酸鈣不動桿菌來源于中國普通微生物菌
種保藏管理中心,菌株編號分別為CGMCCNo.1.2098和CGMCCNo.1.6186,為簡便起見,
將兩株菌分別簡稱為PR1和PR2。將保存在營養肉汁瓊脂斜面上的菌株分別接種于100mL
牛肉膏蛋白胨液體培養基中,置于30℃,150rpm搖床中振蕩培養24h進行菌株的活化。取菌
株活化后的培養液10mL接種于100mL含有苯酚的馴化液體培養基中,置于30℃,150rpm
搖床中振蕩培養,進行菌株的馴化。24h后再取振蕩培養后的培養液10mL接種于100mL新
鮮的馴化液體培養基中,相同條件下振蕩培養,重復上述步驟開始第二個周期的馴化,共馴
化5個周期,120h,前兩個馴化周期加入1.5mL經過濾除菌的10%(w/v)苯酚溶液,第三個周
期加入3.0mL經過濾除菌的10%(w/v)苯酚溶液,最后兩個馴化周期加入8mL經過濾除菌的
10%(w/v)苯酚溶液。將馴化后的菌株采用倍比稀釋法在平板上得到單菌落后,挑取單菌落接
種到斜面培養基上,待菌苔長出后放入4℃冰箱中低溫保存備用。

牛肉膏蛋白胨培養基組分為牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,蒸餾水1000mL,pH7.0,
121℃滅菌20min后備用,制作固體培養基時加入20g瓊脂。馴化液體培養基組分為(NH4)2SO4
3g,KH2PO40.5g,NaHPO40.5g,MgSO4·7H2O0.3g,微量元素液1mL,蒸餾水1000mL,pH
7.5,121℃滅菌20min,待冷卻后加入經過濾除菌的10%(w/v)苯酚溶液。微量元素液組分為
FeSO4·7H2O0.5g,MnSO4·H2O0.15g,ZnSO40.14g,CoCl20.2g,蒸餾水1000mL。

將PR1和PR2采用平板劃線的方法將菌株分別接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基中,置于
30℃生化培養箱中培養24h后,觀察其菌落形態(如表1所示)。在對不同初始配比的二元復
合菌群經生物降解反應后各菌株的CFU進行計數時,主要通過菌落的顏色、透明度、表面光
滑性和邊緣形態進行區分,以此為依據進行RCFU的計算。

表1PR1和PR2的菌落特征


在馴化液體培養基中加入不同體積的苯酚,使其初始苯酚濃度分別為100mg/L、200mg/L、
300mg/L、400mg/L、500mg/L和600mg/L,將PR1和PR2分別接種于上述含有不同濃度苯酚
的馴化液體培養基中,放置于30℃,150rpm搖床中振蕩培養12h后測定液體培養基中的苯酚
殘余濃度,計算PR1和PR2苯酚降解率,計算公式為:
如圖2所示,在苯酚初始濃度低于
300mg/L時,12h后在苯酚殘留量很少或基本被完全降解,其中PR1的降解效果略優于PR2,
當苯酚初始濃度上升到400mg/L時,PR1和PR2對苯酚的降解率分別下降到76%和27%,
而當苯酚初始濃度繼續上升至500mg/L和600mg/L,PR1和PR2對苯酚的降解率不足8%。
因此,高濃度的苯酚對PR1和PR2的生長和繁殖產生了抑制作用,進而影響到了其對苯酚的
利用。

將經馴化的PR1和PR2分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中,放置于30℃,150rpm
搖床中振蕩培養24h后,將培養液置于臺式高速冷凍離心機中以10000rpm離心5min后,棄
去上清液后用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(0.1mol/L,pH8.0)重懸,再次離心后棄去上清液,如
此操作兩次清洗菌體,再用該緩沖溶液重懸,制成OD600=1.2的菌懸液置于冰箱中冷藏備用,
同時通過平板計數的方法測定菌懸液中PR1和PR2的活菌數。

依據單位體積所含活菌數,分別吸取不同體積的菌懸液,并維持整個體系的活菌量為
2×108CFU/mL,配制一系列含有不同比例PR1和PR2的菌懸液,使得兩株菌的活菌比例分
別為0/10、1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和10/0,其中10/0代表體系中僅有
PR1,0/10代表體系中僅有菌PR2。

將上述不同PR1、PR2初始配比的混合菌懸液分別接種于含苯酚200mg/L的無機鹽培養
液中,無機鹽培養液的組分為(NH4)2SO43g,KH2PO40.5g,NaHPO40.5g,MgSO4·7H2O0.3g,
微量元素液1mL,蒸餾水1000mL,pH7.5,121℃滅菌20min。放置于30℃,150rpm搖床中
振蕩培養12h后測定殘留苯酚和TOC的濃度,同時通過倍比稀釋法對生物降解反應結束后體
系中PR1和PR2的數量進行計量。

定義CFUPR1為PR1在10/0體系中的活菌數,即僅接種PR1的體系,CFUPR2為PR2在
0/10體系中的活菌數,即僅接種PR2的體系,CFUPR1·PR2為PR1在PR2存在時的活菌數,
CFUPR2·PR1為PR2在PR1存在時的活菌數,相對活菌數的英文名稱為RelativeColonyForming
Unit,其縮寫為RCFU,RCFUPR1為PR1的相對活菌數,RCFUPR2為PR2的相對活菌數,
RCFU P R 1 = CFU P R 1 · P R 2 CFU P R 1 , RCFU P R 2 = CFU P R 2 · P R 1 CFU P R 2 , ]]>當RCFU<1時,代表一株菌生長和繁殖受
到了另一株菌的抑制,而當RCFU>1時,代表另一株菌的存在對該菌株的生長和繁殖起到了
促進作用。其中,對同時接種了PR1和PR2的培養液根據它們不同的菌落形態對采用平板計
數的方法分別進行計量,根據RCFU的計算方法進行計算。此外,分別測定培養液中的殘留
苯酚濃度及TOC濃度。RCFU及苯酚和TOC的降解效率如圖1所示,其中

從圖1可以看出,在PR1和PR2的初始接種比例分別為2/8,4/6和5/5時,12h后復合菌
群對苯酚和TOC的降解率相似,均維持在95%以上。在初始接種比例分別為2/8時,PR1的
RCFU<1,說明PR2的存在對PR1的生長和繁殖有抑制作用,PR2逐漸在體系中處于優勢地
位,生物降解結束后,PR1和PR2群落相對比例為0.35/9.65。當初始接種比例分別為5/5時,
PR1的RCFU為1.29,說明PR2的存在對PR1的生長和繁殖有促進作用,然而PR2的生長
和繁殖卻受到了抑制。當初始接種比例分別為4/6時,PR1和PR2的RCFU均大于1,說明
兩株菌形成了良好的互利共生關系,同時系統中檢測不到苯酚,且由于TOC的降解率高達
99%,說明苯酚代謝后僅有極少的中間代謝產物殘留。因此,最終二元苯酚降解復合菌群中
PR1和PR2的初始配比確定為4/6。

將PR1和PR2初始配比為4/6、活菌數為2×108CFU/mL的混合菌液以10%(v/v)的比例接
種到初始苯酚濃度分別為100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L和600mg/L的
無機鹽培養液中,放置于30℃,150rpm搖床中振蕩培養12h后測定液體培養基中的苯酚殘余
濃度,結果如圖2所示。和僅接種單菌落的體系相比,復合菌群表現出更高的苯酚降解率,
同時對高濃度苯酚的耐受能力也更強。當初始苯酚濃度為100mg/L、200mg/L和300mg/L時,
經過12h的生物降解后系統中檢測不到殘留的苯酚;當初始苯酚濃度上升為400mg/L時,二
元復合菌群為對苯酚的降解率為86.23%,而相同條件下單菌株PR1和PR2對苯酚降解率僅
為76.23%和26.56%;當初始苯酚濃度繼續上升至500mg/L和600mg/L,復合菌群對苯酚
的降解效果也要明顯優于單一菌株。

對上述經12h生物降解反應后的培養液以10%(v/v)的比例轉接到新鮮的含苯酚濃度為
200mg/L的無機鹽培養液中,放置于30℃,150rpm搖床中振蕩培養12h后測定PR1和PR2
經培養后的RCFU以及殘留苯酚和TOC濃度,如此重復10個周期。結果表明,反應結束后
PR1和PR2的RCFU仍然>1,同時苯酚幾乎被完全礦化。因此,由PR1和PR2組成的二元
復合菌群能長期維持穩定的群落結構,形成了功能穩定的苯酚降解體系,其污染物效果要比
同等條件下單一菌株優良。

實施例2本發明的用于廢水中苯胺生物降解的二元復合菌群構建方法

選擇惡臭假單胞菌和乙酸鈣不動桿菌,惡臭假單胞菌和乙酸鈣不動桿菌來源于中國普通
微生物菌種保藏管理中心,菌株編號分別為CGMCCNo.1.1003和CGMCCNo.1.3615,為簡
便起見,將兩株菌分別簡稱為BA1和BA2。將保存在營養肉汁瓊脂斜面上的菌株分別接種于
100mL牛肉膏蛋白胨液體培養基中,放置于30℃,150rpm搖床中振蕩培養24h進行菌株的
活化。取菌株活化后的培養液10mL接種于100mL含有苯胺的馴化液體培養基中,置于30℃,
150rpm搖床中振蕩培養,進行菌株的馴化。36h后再取振蕩培養后的培養液10mL接種于
100mL新鮮的馴化液體培養基中,相同條件下振蕩培養,開始第二個周期的馴化,共馴化5
個周期,180h,前兩個馴化周期加入1.5mL經過濾除菌的10%(w/v)苯胺溶液,第三個周期加
入3.0mL經過濾除菌的10%(w/v)苯胺溶液,最后兩個馴化周期加入8mL經過濾除菌的
10%(w/v)苯胺溶液。將馴化后的菌株采用倍比稀釋法在平板上得到單菌落后,挑取單菌落接
種到斜面培養基上,待菌苔長出后放入4℃冰箱中低溫保存備用。牛肉膏蛋白胨培養基組分、
馴化液體培養基和微量元素液組分與實施例1相同。

將BA1和BA2采用平板劃線的方法將菌株分別接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基中,置于
30℃生化培養箱中培養24h后,觀察其菌落形態如表2所示。對不同初始配比的二元復合菌
群經生物降解反應后各菌株的CFU進行計數時,主要通過菌落的顏色、透明度和邊緣形態進
行區分,以此為依據進行RCFU的計算。

表2BA1和BA2的菌落特征


在馴化液體培養基中加入不同體積的苯胺,使其初始苯胺濃度分別為100mg/L、200mg/L、
300mg/L、400mg/L、500mg/L和600mg/L,將BA1和BA2分別接種于上述含有不同濃度苯
胺的馴化液體培養基中,放置于30℃,150rpm搖床中振蕩培養36h后測定液體培養基中的苯
胺殘余濃度,計算BA1和BA2苯胺降解率,計算公式為:
如圖4所示,在苯胺初始濃度為
100mg/L時,36h后苯胺完全降解;當初始濃度為200mg/L時,36h后BA1和BA2對苯胺的
降解率分別是89%和96%;當苯胺初始濃度上升到300mg/L時,BA1和BA2對苯胺的降解
率分別下降到41%和50%;當苯胺初始濃度上升到400mg/L時,BA1和BA2對苯胺的降解
率分別下降到16%和21%;而當苯胺初始濃度繼續上升至500mg/L和600mg/L,BA1和BA2
對苯胺的降解率不足10%。因此,高濃度的苯胺對BA1和BA2的生長和繁殖產生了抑制作
用,進而影響到了其對苯胺的分解和轉化。

將經馴化的BA1和BA2分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中,采用和實例1相同的方
法制成OD600=1.2的菌懸液置于冰箱中冷藏備用,同時通過平板計數的方法測定菌懸液中BA1
和BA2的活菌數。

依據單位體積所含活菌數,分別吸取不同體積的菌懸液,并維持整個體系的活菌量為
2×108CFU/mL,配制一系列含有不同比例BA1和BA2的菌懸液,使得兩株菌的活菌比例分
別為0/10、1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和10/0,其中10/0代表體系中僅有
BA1,0/10代表體系中僅有菌BA2。

將上述不同BA1、BA2初始配比的混合菌懸液分別接種于含苯胺300mg/L的無機鹽培養
液中,無機鹽培養液的組分為(NH4)2SO43g,KH2PO40.5g,NaHPO40.5g,MgSO4·7H2O0.3g,
微量元素液1mL,蒸餾水1000mL,pH7.5,121℃滅菌20min。放置于30℃,150rpm搖床中
振蕩培養36h后測定殘留苯胺和TOC的濃度。同時,根據BA1和BA2菌落形態的不同,采
用倍比稀釋法對生物降解反應結束后體系中BA1和BA2的數量進行計量。RCFU的計算方法
同實例1。

從圖3可以看出,在BA1和BA2的初始接種比例分別為6/4,7/3和8/2時,36h后復合
菌群對苯胺的降解率均維持在90%以上,然而,由于菌群組成的不同,TOC的降解率并非與
苯胺降解率呈比例增減。在初始接種比例分別為8/2時,BA2的RCFU<1,說明BA1的存在
對BA2的生長和繁殖有抑制作用,BA1逐漸在體系中處于優勢地位,生物降解結束后,BA1
和BA2群落相對比例為1.5/0.22。當初始接種比例分別為6/4和7/3,BA1和BA2的RCFU
均大于1,說明兩株菌形成了良好的互利共生關系,苯胺降解率分別為90%和93%,而TOC
的降解率則分別為83%和96%。因此,綜合考慮苯胺和TOC降解率以及菌株的生長情況,最
終二元苯胺降解復合菌群中BA1和BA2的初始配比確定為7/3。

將BA1和BA2初始配比為7/3、活菌數為2×108CFU/mL的混合菌液以10%(v/v)的比例
接種到初始苯胺濃度分別為100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L和600mg/L
的無機鹽培養液中,放置于30℃,150rpm搖床中振蕩培養36h后測定液體培養基中的苯胺殘
余濃度,結果如圖4所示。從圖中可以看出相對于單一菌種,二元苯胺降解復合菌群對苯胺
的降解率均明顯增加,且菌落計數結果表明,BA1和BA2的RCFU始終維持在大于1的水平,
說明BA1和BA2形成了良好的互利共生關系,保證了對苯胺的穩定代謝和分解。

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