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工程化免疫球蛋白重鏈輕鏈對及其用途.pdf

摘要
申請專利號:

CN201380062006.5

申請日:

2013.11.28

公開號:

CN105026430A

公開日:

2015.11.04

當前法律狀態:

實審

有效性:

審中

法律詳情: 著錄事項變更IPC(主分類):C07K 16/46變更事項:發明人變更前:A·L·科珀 D·厄洛塞夫 S·A·L·湯姆-耶 D·W·B·布萊勒 T·斯普雷特馮克羅登斯泰恩 S·迪希特 P·I·拉里奧變更后:A·L·科珀 D·厄洛塞夫 S·A·L·湯姆-耶 D·W·B·布萊勒 T·斯普雷特馮克羅登斯泰恩 S·迪希特 P·I·拉里奧 M·桑切斯|||實質審查的生效IPC(主分類):C07K 16/46申請日:20131128|||公開
IPC分類號: C07K16/46; C07K16/00; C12N15/13; C12N5/10; C12Q1/68; G06F19/10 主分類號: C07K16/46
申請人: 酵活有限公司
發明人: A·L·科珀; D·厄洛塞夫; S·A·L·湯姆-耶; D·W·B·布萊勒; T·斯普雷特馮克羅登斯泰恩; S·迪希特; P·I·拉里奧
地址: 加拿大不列顛哥倫比亞省
優先權: 61/730,906 2012.11.28 US; 61/761,641 2013.02.06 US; 61/818,874 2013.05.02 US; 61/869,200 2013.08.23 US
專利代理機構: 北京市金杜律師事務所11256 代理人: 陳文平
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201380062006.5

授權公告號:

||||||

法律狀態公告日:

2016.11.23|||2015.12.23|||2015.11.04

法律狀態類型:

著錄事項變更|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明提供了可包含第一異二聚體和第二異二聚體的異二聚體對,其中每個異二聚體包含免疫球蛋白重鏈或其片段和免疫球蛋白輕鏈或其片段。所述異二聚體的至少一個可在CH和/或CL結構域中包含一個或多個氨基酸修飾,在VH和/或VL結構域中包含一個或多個氨基酸修飾或包含其組合。經修飾的氨基酸可以是輕鏈與重鏈之間的界面的部分,并且通常被修飾來產生每一條重鏈與所需輕鏈之間的優先配對,以便當所述異二聚體的兩條重鏈和兩條輕鏈在細胞中共表達時,所述第一異二聚體的重鏈優先與所述輕鏈的一條鏈而非另一條鏈配對。同樣地,所述第二異二聚體的重鏈可優先與第二輕鏈而非第一輕鏈配對。

權利要求書

權利要求書
1.  一種分離的抗原結合多肽構建體,其包含至少第一異二聚體和第二異二聚體,
所述第一異二聚體包含第一免疫球蛋白重鏈多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白輕鏈多肽序列(L1);并且所述第二異二聚體包含第二免疫球蛋白重鏈多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白輕鏈多肽序列(L2),其中所述第一異二聚體的所述H1或L1序列的至少一個與所述第二異二聚體的對應H2或L2序列不同,并且其中
H1和H2各自包含至少重鏈可變結構域(VH結構域)和重鏈恒定結構域(CH1結構域);
L1和L2各自包含至少輕鏈可變結構域(VL結構域)和輕鏈恒定結構域(CL結構域);以及
H1、H2、L1和L2的至少一個包含至少一個恒定結構域和/或至少一個可變結構域的至少一個氨基酸修飾,其中H1相較于L2優先與L1配對,并且H2相較于L1與優先與L2配對。

2.  根據權利要求1所述的構建體,其中所述構建體還包含異二聚體Fc,所述Fc包含至少2個CH3序列,其中所述Fc通過或不通過一個或多個接頭偶聯于所述第一異二聚體和所述第二異二聚體,其中所述二聚化的CH3序列具有約68℃或更高的解鏈溫度(Tm),如通過差示掃描量熱法(DSC)測量的,并且其中所述構建體是雙特異性的。

3.  根據權利要求1-2中任一項所述的構建體,其中當H1、H2、L1和L2在細胞或哺乳動物細胞中共表達時,或當H1、H2、L1和L2在無細胞表達系統中共表達時,或當H1、H2、L1和L2共產生時,或當H1、H2、L1和L2通過氧化還原產生體系共產生時,H1相較于 L2優先與L1配對,并且H2相較于L1優先與L2配對。

4.  根據權利要求1-3中任一項所述的構建體,其中H1、H2、L1和L2的至少一個包含VH和/或VL結構域的至少一個氨基酸修飾和CH1和/或CL結構域的至少一個氨基酸修飾,以便H1相較于L2優先與L1配對,和/或H2相較于L1優選與L2配對。

5.  根據權利要求1-4中任一項所述的構建體,其中如果H1在所述CH1結構域中包含至少一個氨基酸修飾,則L1和L2的至少一個在所述CL結構域中包含至少一個氨基酸修飾;和/或如果H1在所述VH結構域中包含至少一個氨基酸修飾,則L1和L2的至少一個在所述VL結構域中包含至少一個氨基酸修飾。

6.  根據權利要求1-5中任一項所述的構建體,其中H1、L1、H2,和/或L2包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸突變。

7.  根據權利要求1-6中任一項所述的構建體,其中H1、H2、L1和L2的至少一個包含至少一個恒定結構域和/或至少一個可變結構域的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸修飾。

8.  根據權利要求1-7中任一項所述的構建體,其中當L1和L2與H1和H2的至少一個共表達時,H1-L1和H2-L2異二聚體對的至少一個對各自對應的H1-L2或H2-L1異二聚體對的至少一個的相對配對大于50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%,并且其中所述經修飾的H1-L1或H2-L2異二聚體對的相對配對大于在無所述至少一個氨基酸修飾的對應的H1-L1或H2-L2異二聚體對中觀察到的各自相對配對。

9.  根據權利要求1-8中任一項所述的構建體,其中
通過如經由所述第一和第二異二聚體的至少一個的DSC測量的解鏈溫度(Tm)所測量的熱穩定性在無所述至少一個氨基酸修飾的對應的異二聚體的Tm的約0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃內;或
其中通過如經由每個包含至少一個氨基酸修飾的異二聚體的DSC測量的解鏈溫度(Tm)所測量的熱穩定性在無所述至少一個氨基酸修飾的對應的異二聚體的Tm的約0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃內。

10.  根據權利要求1-9中任一項所述的構建體,其中每個異二聚體對于其所結合的抗原的親和力,在通過表面等離子體共振(SPR)或FACS測量的各自未修飾的異二聚體對于相同抗原的親和力的約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、25、30、35、40、45或50倍內。

11.  根據權利要求1-10中任一項所述的構建體,其中
H1和L1的至少一個包含含有至少一個氨基酸修飾的至少一個結構域,當H1相較于L2與L1配對時,導致更大的氨基酸的空間互補性;或
其中H2和L2的至少一個包含含有至少一個氨基酸修飾的至少一個結構域,當H2相較于L1與L2配對時,導致更大的氨基酸的空間互補性;或
其中H1和L1的至少一個包含含有至少一個氨基酸修飾的至少一個結構域,當H1相較于L2與L1配對時,導致更大的帶電荷的氨基酸之間的靜電互補性;或
其中H2和L2的至少一個包含含有至少一個氨基酸修飾的至少一個結構域,當H2相較于L1與L2配對時,導致更大的帶電荷的氨 基酸之間的靜電互補性。

12.  根據權利要求1-11中任一項所述的構建體,其中所述至少一個氨基酸修飾選自表29、表30或表31中顯示的那些氨基酸修飾的一個或多個修飾。

13.  根據權利要求1-12中任一項所述的構建體,其中所述構建體還包含含有至少兩個CH3序列的Fc,其中所述Fc通過或不通過一個或多個接頭偶聯于所述第一異二聚體和所述第二異二聚體。

14.  根據權利要求13所述的構建體,其中所述Fc是人Fc、人IgG1Fc、人IgA Fc、人IgG Fc、人IgD Fc、人IgE Fc、人IgM Fc、人IgG2Fc、人IgG3 Fc或人IgG4 Fc。

15.  根據權利要求13-14中任一項所述的構建體,其中所述Fc是異二聚體Fc。

16.  根據權利要求13-15中任一項所述的構建體,其中所述Fc在CH3序列的至少一個中包含一個或多個修飾。

17.  根據權利要求13-16中任一項所述的構建體,其中所述二聚化CH3序列具有如通過DSC測量的約68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、77.5℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃或85℃或更高的解鏈溫度(Tm)。

18.  根據權利要求13-17中任一項所述的構建體,其中所述Fc是當產生時以大于約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的純度形成的異二聚體;或其中所述Fc是當表達時或當通過單細胞表達時以大于約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的純度形成的異二聚體。

19.  根據權利要求13-18中任一項所述的構建體,其中所述Fc在CH3序列的至少一個中包含一個或多個修飾,所述修飾促進穩定性與野生型同二聚體Fc相當的異二聚體Fc的形成。

20.  根據權利要求13-19中任一項所述的構建體,其中所述Fc還包含至少一個CH2序列。

21.  根據權利要求20所述的構建體,其中所述Fc的CH2序列包含一個或多個修飾。

22.  根據權利要求13-21中任一項所述的構建體,其中所述Fc包含一個或多個修飾以促進Fc-γ受體的選擇性結合。

23.  根據權利要求13-22中任一項所述的構建體,其中所述Fc通過一個或多個接頭偶聯于所述異二聚體,或其中所述Fc通過一個或多個接頭偶聯于H1和H2。

24.  根據權利要求23所述的構建體,其中所述一個或多個接頭是一個或多個多肽接頭。

25.  根據權利要求23所述的構建體,其中所述一個或多個接頭包含一個或多個抗體鉸鏈區。

26.  根據權利要求23所述的構建體,其中所述一個或多個接頭包含一個或多個IgG1鉸鏈區。

27.  根據權利要求23-26中任一項所述的構建體,其中所述一個或多個接頭包含一個或多個修飾。

28.  根據權利要求27所述的構建體,其中所述一個或多個修飾促進Fc-γ受體的選擇性結合。

29.  根據權利要求1-28中任一項所述的構建體,其中所述至少一個氨基酸修飾是至少一個氨基酸突變或其中所述至少一個氨基酸修 飾是至少一個氨基酸置換。

30.  根據權利要求1-29中任一項所述的構建體,其中H1、H2、L1和L2的每一個的序列來源于人序列。

31.  根據權利要求1-30中任一項所述的構建體,其中所述構建體是多特異性的或雙特異性的。

32.  根據權利要求1-31中任一項所述的構建體,其中所述構建體是多價的或二價的。

33.  一種分離的多核苷酸或分離的多核苷酸的組,所述分離的多核苷酸包含編碼根據權利要求1至32中任一項所述的構建體的至少一個序列。

34.  根據權利要求33所述的分離的多核苷酸,其中所述多核苷酸或多核苷酸的組是cDNA。

35.  一種載體或載體的組,所述載體包含根據權利要求33或34所述的多核苷酸的一個或多個或所述多核苷酸的組。

36.  根據權利要求35所述的載體或載體的組,其選自質粒、多順反子載體、病毒載體、非附加型哺乳動物載體、表達載體和重組表達載體。

37.  一種分離的細胞,其包含根據權利要求33-34所述的多核苷酸或多核苷酸的組,或根據權利要求35或36所述的載體或載體的組。

38.  根據權利要求37所述的分離的細胞,其中所述細胞是雜交瘤、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或HEK293細胞。

39.  一種藥物組合物,其包含根據權利要求1至32中任一項所述的構建體和藥學上可接受的載體。

40.  根據權利要求39中所述的藥物組合物,其還包含一種或多種選自緩沖劑、抗氧化劑、低分子量分子、藥物、蛋白質、氨基酸、碳水化合物、脂質、螯合劑、穩定劑和賦形劑的物質。

41.  根據權利要求1-32中任一項所述的構建體或根據權利要求39-40中任一項所述的藥物組合物用于治療受試者的疾病或病癥或癌癥或血管疾病或用于制造藥劑的用途。

42.  一種治療患有疾病或病癥或癌癥或血管疾病的受試者的方法,其包括向受試者施用根據權利要求1-32中任一項所述的構建體或根據權利要求39-40中任一項所述的組合物。

43.  一種抑制、減弱或阻斷細胞內或至細胞的信號的方法,其包括將所述細胞與根據權利要求1-32中任一項所述的構建體或根據權利要求39-40中任一項所述的組合物接觸。

44.  一種從宿主細胞培養物獲得根據權利要求1-32中任一項所述的構建體的方法,所述方法包括步驟:
(a)獲得包含含有一個或多個編碼所述構建體的核酸序列的至少一個宿主細胞的宿主細胞培養物;和
(b)從所述宿主細胞培養物回收所述構建體。

45.  一種獲得根據權利要求1-32中任一項所述的構建體的方法,其包括步驟:
(a)獲得H1、L1、H2和L2;
(b)使H1相較于L2優先與L1配對,并且使H2相較于L1優先與L2配對;和
(c)獲得所述構建體。

46.  一種制備根據權利要求1至32中任一項所述的構建體的方法,其包括:
a.獲得編碼至少一個構建體的多核苷酸或所述多核苷酸的組;
b.確定用于引入至少一個宿主細胞的每個多核苷酸或多核苷酸的組的最佳比率,其中通過估計在H1、L1、H2和L2表達時形成的H1-L1和H2-L2異二聚體對相較于在H1、L1、H2和L2表達時形成的錯配的H1-L2和H2-L1異二聚體對的量來確定最佳比率;
c.選擇優選的最佳比率,其中用優選的最佳比率的所述多核苷酸或多核苷酸的組轉染所述至少一個宿主細胞導致所述構建體的表達;
d.用最佳比率的所述多核苷酸或多核苷酸的組轉染所述至少一個宿主細胞;和
e.培養所述至少一個宿主細胞以表達所述構建體。

47.  根據權利要求46所述的方法,其中選擇最佳比率通過在瞬時轉染系統中進行轉染來估計。

48.  根據權利要求46-47中任一項所述的方法,其中用優選的最佳比率的所述多核苷酸或多核苷酸的組轉染所述至少一個宿主細胞導致所述構建體的最佳表達。

49.  根據權利要求46-48中任一項所述的方法,其中所述構建體包含含有至少兩個CH3序列的Fc,其中所述Fc通過或不通過一個或多個接頭偶聯于所述第一異二聚體和所述第二異二聚體。

50.  根據權利要求49所述的方法,其中所述Fc是異二聚體,任選地包含一個或多個氨基酸修飾。

51.  一種計算機可讀存儲介質,其存儲
包含數據的數據集,所述數據代表包含第一免疫球蛋白重鏈多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白輕鏈多肽序列(L1)的第一異二聚體中的互補突變;以及包含第二免疫球蛋白重鏈多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白輕鏈多肽序列(L2)的第二異二聚體中的互補突變,其中H1和H2各自包含至少重鏈可變結構域(VH結構域)和重鏈恒定結構域(CH1結構域);其中L1和L2各自包含至少輕鏈可變結構域(VL結構域)和輕鏈恒定結構域(CL結構域),并且其中互補突變的數據集包含代表表29、30或31中所列的那些突變或那些突變的亞組的數據;和
用于測定H1將相較于L2優選與L1配對和/或H2將相較于L1優選與L2配對的可能性的計算機可執行代碼。

52.  一種用于測定優先配對的計算機實現的方法,其包括:
獲得包含數據的數據集,所述數據代表包含第一免疫球蛋白重鏈多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白輕鏈多肽序列(L1)的第一異二聚體中的互補突變;以及包含第二免疫球蛋白重鏈多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白輕鏈多肽序列(L2)的第二異二聚體中的互補突變,其中H1和H2各自包含至少重鏈可變結構域(VH結構域)和重鏈恒定結構域(CH1結構域);其中L1和L2各自包含至少輕鏈可變結構域(VL結構域)和輕鏈恒定結構域(CL結構域),并且其中互補突變的數據集包含代表表29、30或31中所列的那些突變或那些突變的亞組的數據;和
通過計算機處理器測定H1將相較于L2優先與L1配對和/或H2將相較于L1優先與L2配對的可能性。

53.  根據權利要求52所述的方法,所述方法還包括產生根據權利要求1-32中任一項所述的構建體。

54.  一種產生雙特異性抗原結合多肽構建體的方法,所述雙特異性構建體包含含有來自第一單特異性抗原結合多肽的第一免疫球蛋白重鏈多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白輕鏈多肽序列(L1)的第一異 二聚體;和包含來自第二單特異性抗原結合多肽的第二免疫球蛋白重鏈多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白輕鏈多肽序列(L2)的第二異二聚體,其中H1和H2各自包含至少重鏈可變結構域(VH結構域)和重鏈恒定結構域(CH1結構域);其中L1和L2各自包含至少輕鏈可變結構域(VL結構域)和輕鏈恒定結構域(CL結構域),所述方法包括:
a.獲得包含數據的數據集,所述數據代表一組H1、H2、L1和L2內的氨基酸修飾,以便在將一個亞組的所述修飾引入H1、H2、L1和/或L2時,在測試系統中H1對相較于L2優先與L1配對并且H2對相較于L1優先與L2配對;
b.將一個亞組的來自所述數據集的一個或多個修飾引入所述第一異二聚體和/或所述第二異二聚體;和
c.在至少一個宿主細胞中共表達所述第一異二聚體和所述第二異二聚體,以產生包含所述雙特異性構建體的表達產物。

55.  根據權利要求54所述的方法,其還包括測定表達產物中所述雙特異性構建體相對于其它多肽產物的量。

56.  根據權利要求54-55中任一項所述的方法,其中以相較于其它多肽產物大于70%的純度產生所述雙特異性構建體。

57.  根據權利要求54-56中任一項所述的方法,其中所述數據集是根據權利要求51所述的數據集。

58.  根據權利要求54-57中任一項所述的方法,其還包括將另外的氨基酸修飾添加至H1、H2、L1或L2的至少一個以相較于其它多肽產物增加所述雙特異性構建體的純度的步驟。

59.  根據權利要求54-58中任一項所述的方法,其中所述構建體包含含有至少2個CH3序列的Fc,其中所述Fc通過或不通過一個或多個接頭偶聯于所述第一異二聚體和所述第二異二聚體。

60.  根據權利要求59所述的方法,其中所述Fc是異二聚體,任選地包含一個或多個氨基酸修飾。

61.  根據權利要求54-60中任一項所述的方法,其中所述抗原結合多肽是抗體、Fab或scFv。

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