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用于組織移植物去細胞化的方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201480026804.7

申請日:

2014.03.17

公開號:

CN105188787A

公開日:

2015.12.23

當前法律狀態:

實審

有效性:

審中

法律詳情: 實質審查的生效IPC(主分類):A61L 27/38申請日:20140317|||公開
IPC分類號: A61L27/38; A61F2/02; A01N1/00 主分類號: A61L27/38
申請人: 佛羅里達大學研究基金會股份有限公司
發明人: D·F·繆爾
地址: 美國佛羅里達州
優先權: 2013.03.15 US 61/794,012
專利代理機構: 北京德崇智捷知識產權代理有限公司 11467 代理人: 趙晨宇
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201480026804.7

授權公告號:

|||

法律狀態公告日:

2016.04.06|||2015.12.23

法律狀態類型:

實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及用于處理組織以產生與受體免疫相容的天然、無細胞的替代組織的材料和方法。根據本發明,用其中只使用兩性洗滌劑(例如不包括陰離子洗滌劑)的洗滌液清洗收獲的組織。在經兩性洗滌劑提取之后,用緩沖系統洗滌組織以幫助清除細胞組分和洗滌劑。在一個實施例中,本發明涉及一種支持軸突再生、引導軸突朝向遠端神經末端和/或免疫耐受的神經移植物的替代組織。優選地,所述神經移植物保留主要的細胞外基質支架以及促進貫穿神經移植物的神經再生的生物組分。

權利要求書

權利要求書
1.  一種用于使組織移植物去細胞的方法,其中所述方法包括使組織移植物與包含一定濃度的兩性洗滌劑的提取組合物接觸一段時間,所述接觸時間足以使所述組織中的細胞破裂,且其中所述方法是在無陰離子洗滌劑的情況下進行的。

2.  根據權利要求1所述的方法,其中在去細胞化之后,所述細胞外基質結構保持完整且測得的完整程度等于或優于通過包括陰離子洗滌劑的方法去細胞化。

3.  根據權利要求1所述的方法,其中沒有將陰離子洗滌劑施用于所述組織。

4.  根據權利要求1所述的方法,其中沒有將曲拉通X-200TM施用于所述組織。

5.  根據權利要求1所述的方法,其中所述組織移植物與硫代甜菜堿-10和/或硫代甜菜堿-16接觸。

6.  根據權利要求5所述的方法,其中所述組織移植物與一具有由硫代甜菜堿-10組成的洗滌劑組分的提取組合物接觸,且所述組織移植物還與具有由硫代甜菜堿-16組成的洗滌劑組分的第二提取組合物接觸。

7.  根據權利要求1所述的方法,其中所述兩性洗滌劑的濃度為至少臨界膠束濃度。

8.  根據權利要求1所述的方法,其中所述提取組合物具有生理鹽度或更大鹽度。

9.  根據權利要求1所述的方法,還包括至少一種漂洗步驟,包括將所述組織與具有小于生理鹽度的溶液接觸。

10.  根據權利要求9所述的方法,其中所述漂洗溶液沒有鹽度。

11.  根據權利要求1所述的方法,還包括從所述組織物理上去除非結構性碎片。

12.  根據權利要求1所述的方法,還包括在所述去細胞化處理之前或之后冷凍所述組織移植物。

13.  根據權利要求1所述的方法,用于制造選自神經、骨、腸、血管、韌帶、腱和心臟移植物的組織移植物。

14.  根據權利要求13所述的方法,用于制造神經移植物。

15.  根據權利要求14所述的方法,其中用于制造所述神經移植物的所述組織是選自神經、肌肉、胎盤和血管組織。

16.  根據權利要求1所述的方法,還包括將一或多種生物活性分子或細胞引入所述組織移植物中。

17.  根據權利要求1所述的方法,其中與用單獨緩沖洗滌液處理的神經相比,所述組織移植物的促進軸突的活性在去細胞化之后得以保持。

18.  根據權利要求1所述的方法,其中在去細胞化之后,所述組織移植物的促進神經突活性被保持且測得的保留程度等于或優于通過包括陰離子洗滌劑的方法去細胞化。

19.  一種組織移植物,其經由權利要求1所述的方法制備。

20.  一種試劑盒,其包括權利要求19所述的組織移植物。

說明書

說明書用于組織移植物去細胞化的方法
相關申請的交叉引用
本申請要求2013年3月15日提交的美國臨時申請US61/794,012的權利,所述申請案全文以引證的方式并入本文中。
背景技術
生物醫學工程在開發可用于幫助愈合的組織的過程中面臨許多挑戰。例如,“替代”組織應促進組織再生。在這種情況下,所述新組織必須與受體組織相容以便相鄰細胞接受替代物。重要地是,替代組織應克服(或避免)通常由于向生物系統添加“外來物”而引起的免疫反應。
而且,替代組織應展示它所替代的組織的特性和功能。例如,替代組織應展示與原始組織類似的機械特性和結構特性,或至少不干擾原生環境。替代組織可作為支架和/或保持生物學特性以促進細胞再生。最后,替代組織不應刺激疤痕形成,疤痕形成會限制組織再生或抑制深層組織的天然功能。
組織工程學的一個特別具有挑戰性的實施例是制造可用于幫助切斷的神經再生的神經移植物。在直接神經修復過程中,當切斷的神經末端再接合(沒有間置移植物)時,軸突會試圖從近端神經向遠端神經重新生長。由于這個原因,在神經損傷之后,遠端神經經受被稱為華勒氏變性(Walleriandegeneration)的過程,其涉及神經單元(nerveelement)(包括非功能性遠端軸突及其髓鞘)的崩解和清除。部分地因為此過程,軸突碎片和髓磷脂碎片長期被認為具有減少神經再生的生長抑制作用并且可能是軸突生長的機械屏障。
大量證據表明當華勒氏變性過程被推遲時神經再生變慢了。因此, 人們已普遍接受神經單元的清除改善了遠端神經的軸突生長。這個假定已被外推到神經移植并且使人相信為了促進軸突生長,也必須將細胞碎片從神經移植物移除。移除剩余的細胞物質也被認為是使組織中的病原體減到最少以及除去可能導致移植物免疫排斥的免疫原性物質所必需。因此,用于神經移植物的處理方法通常包括嚴格的去細胞化技術,甚至代價為破壞支持再生過程的細胞外基質(ECM)結構和神經移植物的完整性。
神經損傷常常導致用于直接修復的干凈末端(cleanends)的損失或由神經組織損傷而造成缺口。在該情況下,神經修復要求間置移植物來橋接缺失處并恢復神經連續性。
例如,美國專利號為7,402,319的專利(該專利全文并入本文中)描述了一種無細胞的神經同種異體移植物,其可以恢復神經連續性并且在合適環境下可以促使神經再生。這類神經移植物經將神經組織浸泡于含有硫代甜菜堿和陰離子表面活性洗滌劑(例如曲拉通(Triton)X-200)的若干系列溶液中而獲得,所述系列溶液用于使神經組織脫去細胞。
Hudson等人申請了一種含有曲拉通X-200TM、硫代甜菜堿-16和硫代甜菜堿-10的用于大鼠神經的去細胞化技術,并報告了極高的提取水平。(HudsonTW,LiuSY,SchmidtCE.TissueEng.10:1346-58,2004)。然而,嚙齒動物神經含有單個神經束(簇)且嚙齒動物神經的外神經鞘與較大動物的神經的相似性較小。較大動物(例如兔、人)的大部分神經具有嵌入于膠原性內在神經外膜(圍繞神經束的結締組織)的多個神經束。人神經的鞘和束內結構是可擴張的,且對神經完整性和滲透性(包括影響組織提取的特性)具有明顯影響。因此,當應用于來自較大動物的神經時,關于嚙齒動物神經的去細胞化和提取的知識是所期望的提取的最佳提示。
總而言之,對改善組織替代物(特別是在神經組織環境中)仍有需 要。經改善的組織替代物應維持它所替代的組織的原生結構和生物活性特征,包括例如層粘連蛋白活性,并且能夠在必要時結合生物活性化合物或分子以促進快速再生,并刺激組織修復和無疤痕的再生,疤痕可減低組織可動性和完整性。
發明簡述
本發明提供了用于制備組織移植物的新穎方法和組合物,所述組織移植物保持原生結構和完整性以及改善再生所需的生物學特性。
本發明的組織移植物提供了一種天然替代組織或可通過簡單制備步驟獲得的移植物。本發明的方法特定地破壞免疫原性細胞組分而不會顯著改變天然細胞外結構。有利地,組織保持促進移植物中細胞再生的生物學特性。原生細胞外基質(ECM)的結構被保持,具體地說,在神經移植的情況下,基膜和神經內膜/內皮細胞層保持天然和通常的原始結構。
因此,在一個實施例中,本發明提供了一種神經移植物,其支持軸突再生、引導軸突朝向遠端神經末端并且免疫耐受。無細胞神經移植物可以是例如,同系移植物、自體移植物、同種異體移植物或異種移植物。
在一個實施例中,本發明提供了一種制備組織替代物的方法,所述方法包括以下步驟:在沒有任何離子型洗滌劑的情況下(包括任何陰離子洗滌劑),在包含至少一種兩性洗滌劑的溶液中洗滌替代組織,然后在緩沖鹽的系列溶液中洗滌替代組織以除去多余的兩性洗滌劑。這個方法比當前技術的方法更簡單更便宜,且得到具有更好的處理特性和更好的促進再生特性的替代組織。
在一個特定實施例中,根據本發明使用的兩性洗滌劑是硫代甜菜堿-10(SB-10)和/或硫代甜菜堿-16(SB-16)。
本發明還提供一種去細胞化替代組織。在一個實施例中,替代組織可以形成為縫合處、管、片、膜或支架的一部分,以遞送到受體。優選 地,替代組織保留了在移植到受體之后促進再生和/或不引起免疫反應的生物組分。
在另一個實施例中,本發明提供了用于組織替代的試劑盒,其包含去細胞化替代組織。該試劑盒還可包括一或多種用于使本發明的替代組織再懸浮的溶液,例如藥理學可接受的緩沖無菌生理鹽水溶液。此外,所述試劑盒還可包括一小瓶具有細胞或其他活性劑的溶液,其可被加入以促進組織再生(例如,施萬細胞(Schwanncell)和/或細胞因子)。所述試劑盒可進一步包括說明書或小冊子,給用戶提供所述無細胞替代組織的詳細說明。
在一個特定實施例中,本發明提供了一種移植物,其支持軸突再生、引導軸突朝向遠端神經末端并且免疫耐受。在一個實施例中,所述移植物是神經移植物。移植物可在去細胞化之前被冷凍,然后儲存并擱置以冷凍使用。另一個實施例是用于不要求冷凍保藏的特別應用而制備神經移植物;在那種情況下,可使溫度降低或升高,這取決于使用前儲存移植物的溶液,例如包括一或多種防腐劑和/或抗微生物劑。
在一個實施例中,支持再生的移植物還可包括幫助抑制受體對移植物植入的免疫反應的一或多種物質。例如,本發明的移植物可包括佛波酯佛波醇豆蔻乙酸酯(phorbolesterphorbolmyristateacetate,PMA)以在CD4+T細胞介導的免疫反應減少的情況下促進移植物植入。
附圖說明
圖1蘇木紫和曙紅染色的兔神經組織(對照物;圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的兔神經組織(DC2;圖B)以及按照本發明的方法處理的兔神經組織(DC3;圖C)。
圖2Hoescht染色的兔神經組織(對照物;圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的兔神經組織(DC2;圖B)以及按照本發明的方法處理的兔神經組織(DC3;圖C)。
圖3S-100免疫染色的兔神經組織(對照物;圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的兔神經組織(DC2;圖B)以及按照本發明的方法處理的兔神經組織(DC3;圖C)。
圖4蘇丹黑染色的兔神經組織(對照物;圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的兔神經組織(DC2;圖B)以及按照本發明的方法處理的兔神經組織(DC3;圖C)。
圖5NAP-4神經絲染色的兔神經組織(對照物;圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的兔神經組織(DC2;圖B)以及按照本發明的方法處理的兔神經組織(DC3;圖C)。
圖6層粘連蛋白免疫染色的兔神經組織(對照物;圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的兔神經組織(DC2;圖B)以及按照本發明的方法處理的兔神經組織(DC3;圖C)。
圖7蘇木紫和曙紅染色的人神經組織(對照物;圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的人神經組織(DC2;圖B)以及按照本發明的方法處理的人神經組織(DC3;圖C)。
圖8Hoescht染色的人神經組織(對照物;圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的人神經組織(DC2;圖B)以及按照本發明的方法處理的人神經組織(DC3;圖C)。
圖9S-100免疫染色的人神經組織(對照物;圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的人神經組織(DC2;圖B)以及按照本發明的方法處理的人神經組織(DC3;圖C)。
圖10蘇丹黑染色的人神經組織(對照物;圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的人神經組織(DC2;圖B)以及按照本發明的方法處理的人神經組織(DC3;圖C)。
圖11NAP-4神經絲免疫染色的人神經組織(對照物;圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的人神經組織(DC2;圖B)以及按照本發 明的方法處理的人神經組織(DC3;圖C)。
圖12層粘連蛋白免疫染色的人神經組織(對照物;圖A)、按照Hudson等人教示導的方法處理的人神經組織(DC2;圖B)以及按照本發明的方法處理的人神經組織(DC3;圖C)。
圖13A經(A)單獨的緩沖液和(B)由Hudson等人描述的去細胞化洗滌劑(硫代甜菜堿-10、硫代甜菜堿-16和曲拉通X-200TM)去細胞的大鼠神經移植物的冷凍培養分析。將神經沿縱軸冷凍切片并安放在蓋玻片上。將分離神經元接種在組織切片上并培養24小時。隨后將冷凍培養物固定并且將測試神經元免疫染色。當神經移植物的促進生長的活性幾乎全被嚴格的洗滌劑去細胞化消除時,觀察到在單獨緩沖液條件下有大量軸突生長。
圖13B曲拉通X-200TM對神經移植物神經突促進活性的影響。在有和沒有曲拉通X-200TM的情況下經由Hudson等人的方法將神經移植物樣品去細胞化。將神經沿縱軸冷凍切片并安放在蓋玻片上。將分離神經元接種在組織切片上并培養24小時。經由數字圖象分析給神經突長度評分。數據表示在2個獨立的實驗中來自4個組織切片的超過500個軸突的平均(±SE)得分。
圖14單個洗滌劑對純化的層粘連蛋白的神經突促進活性的影響。純化的層粘連蛋白-1與如下的單個洗滌劑混合:對照物(單獨緩沖液)、硫代甜菜堿-10(125mM)、硫代甜菜堿-16(0.6mM)和曲拉通X-200(0.14%)。將混合物大量透析且隨后添加至組織培養孔中以形成基質,在其上接種分離的神經元。在培養基中24小時之后,測量神經突的長度。數據表示從來自4個獨立實驗中重復進行的稀釋系列中的平均得分計算的特異活性(ED50)。
圖15在兔神經同種異體移植物模型中的成功的神經再生。兔腓骨神經中的0.5cm缺口用經由本發明方法處理的1.2cm神經移植物來修 復。4周之后檢查移植物。A)蘇木紫和曙紅染色表明極佳的移植物完整性且并入受體神經中。在移植物內明顯有血管再生和細胞浸潤。在24個受體中的任一個中均沒有發現發炎或移植排斥的跡象。B)β-微管蛋白III免疫標記(對軸突為特異的)顯示在整個移植物中有大量的軸突再生。C)S100免疫標記顯示大量的受體組織施萬細胞浸潤了與再生軸突密切相關的移植物,指示有功能的神經再生。
圖16很長的神經同種異體移植物成功再生。兔腓骨神經中的5cm缺口用經由本發明方法處理的7cm神經移植物來修復。26周之后檢查移植物。A)蘇木紫和曙紅染色表明極佳的移植物完整性且并入受體神經中。在移植物內明顯有血管再生和細胞浸潤。在10個受體中的任一個中均沒有發現發炎或移植排斥的跡象。B)NAP-4神經絲免疫標記(對軸突為特異的)顯示在整個移植物中有大量的軸突再生。C)S100免疫標記顯示大量的受體組織施萬細胞浸潤與再生軸突密切相關的移植物,指示有功能的神經再生。D)在移植物的受體神經遠端發現大量的神經絲免疫陽性軸突,表明神經再生成功地橫越7厘米移植物并向遠端前進到靶組織。
發明詳述
本文中使用的術語具有與本發明相關的領域的一般技術人員所普遍理解的含義。諸如“a”、“an”和“the”等術語不是指僅僅單一的實體,而是包括特定的例子可用來說明的一般類別。本文中的術語用來描述本發明的特定實施例,但它們的用法不限制本發明,除非是權利要求書中概述的。本文中使用的所有技術術語和科學術語具有本發明所屬技術領域的一般技術人員所普遍理解的含義,除非另有規定。
在一個實施例中,本發明提供一種保留細胞外結構以及周圍神經組織的生物學特性的神經同種異體移植物。同種異體移植物是通過一種改進的專有的去細胞處理來制備。去細胞化方法從神經組織中溶解細胞膜,從而消除導致同種異體移植排斥的抗原。
本發明進一步提供了制備基于天然組織的移植物的方法,所述移植物具有免疫耐受性并且保留原生組織的內在結構和架構。本文中使用的術語“替代組織”用來描述已從供體動物(活的或尸體)移除并且已根據本發明處理的一種組織。
本發明中的移植物的用途包括但不限于:1)作為生物相容的生物材料,一般是非免疫原性的;2)作為促進組織特異性和受體特異性的組織再生的因素的結構基礎;以及3)作為一種研究工具來研究受體對替代組織結構的反應。本發明還提供一種替代組織,其一般為具有可處理、生物學、生物活性和/或生物可降解特性的無細胞組織。
根據本發明,現已發現,與傳統的擔心相反,在組織移植物中絕大多數殘余細胞組分是沒有問題的;在植入之后宿主細胞最終將他們除去。即使殘余的MHC分子可能引起排斥反應也不成問題。為引起顯著免疫反應,MHC組分必須作為細胞膜中緊密結合的復合物而保留。根據本發明,由于細胞膜和MHC復合物容易被溫和(非離子和兩性離子)洗滌劑溶解,因此這些擔心得以緩解。
傳統的去細胞化技術要求苛刻的試劑和強效的陰離子洗滌劑。根據本發明已出人意料地且有利地確定大量的細胞提取對植入過程并非有利,事實上是不利的。相反,溫和的提取足以使組織同種異體移植物免疫相容且有利于促進組織修復所需的移植物ECM的保留。
遺憾的是,用離子型洗滌劑(諸如曲拉通X-200TM)洗滌神經組織已顯示會減少層粘連蛋白活性。層粘連蛋白是基底層中的主要蛋白質,其對于經由影響細胞分化、遷移和粘附的組織再生很重要。例如,層粘連蛋白是沿神經軸突生長的主要底物。
因此,根據本發明,溫和的兩性洗滌劑足以使細胞成分充分分散并簡單地使組織移植物免疫相容,而不會使基本的內在生物活性變性。
定義
本文中使用的術語“無細胞的”是指沒有活細胞的組織。
術語“去細胞的”是指其中細胞被解離且細胞物質被提取的組織。細胞的移除程度取決于組織的確切來源、用于提取細胞的方法以及細胞移除的需要。經由細胞移除,本發明可使用大量提取方法。細胞移除量可以從非常小到接近100%。當使用非自體組織來源或在組織相容性方面不匹配的組織來源時,所實現的細胞解離和/或提取使得移植物免疫耐受。為減少對受體免疫排斥的擔心,同種異體移植要求的組織提取比異種移植少。因此,表明與兩性洗滌劑的接觸時間較長。
本文中使用的術語“移植物”是指來源于供體用于植入受體的生物材料。移植物可來自任何動物來源,包括人類,無論是來自尸體或活供體。供體優選為哺乳動物。
術語“哺乳動物”是指分類為哺乳動物的任何動物受體,包括人類、家養動物和農場動物,以及動物園動物、運動動物或玩賞動物,諸如狗、馬、貓、豬和牛。
用于組織移植物去細胞化的方法
根據本發明使用的組織可使用本領域技術人員熟知的標準技術來收集。在一個優選實施例中,組織(可以是例如神經組織)在其被收集后被冷凍。
在優選實施例中,在本發明的方法中使用鹽和緩沖溶液中的至少一種洗滌劑。洗滌劑組分優選包含至少一種兩性洗滌劑且不包括使用任何大量的離子型洗滌劑(如陰離子洗滌劑)。在一個優選實施例中,所述方法不使用曲拉通X-200TM。
本發明中所用的洗滌劑是指使組織內的細胞特異性破裂,但不解離細胞外結構或結構蛋白(包括例如細胞外基質和/或層粘連蛋白)的洗滌劑。細胞碎片可能會如本文中所述那樣被移除,例如,經由用緩沖溶液洗滌和/或物理上移除其他非結構性碎片,諸如脂肪。與未經處理的組織 移植物相比,本發明的替代組織引起顯著減少的免疫反應,因為表面細胞抗原已經解離或移除。
在一個特定實施例中,獲得神經組織并且其被包含至少一種兩性洗滌劑的洗滌液洗滌。本申請中使用的術語“洗滌劑”與術語“表面活性劑”可互換。
兩性洗滌劑可以大致描述為包括可作為酸以及堿起作用的分子(或離子)。兩性表面活性劑可包括可提供或接受質子(H+)的兩性分子。這些都受pH值變化的影響很大。他們在pH值大于或等于8時作用類似于陰離子洗滌劑。他們在pH值介于8與6之間時作用類似于非離子型洗滌劑。他們在pH值低于4時作用類似于陽離子洗滌劑。在高pH值時,洗滌能力增加;在低pH值時,洗滌能力降低。在一個優選實施例中,組織與pH值6至8時為兩性的洗滌劑接觸。在一個特定實施例中,組織與兩性洗滌劑的接觸在pH值介于與8之間進行。
兩性離子類別的清單和這些表面活性劑的種類在1975年12月30日頒發給Laughlin和Heuring的美國專利第3,929,678號中提供。進一步例子在"SurfaceActiveAgentsandDetergents"(卷I和卷II,Schwartz、Perry和Berch)中提供。
兩性離子表面活性劑是兩性表面活性劑的子集,所述兩性表面活性劑包括兩性電解質。通常,兩性離子表面活性劑包括在分子內不同位置具有正電荷和負電荷(注意非偶極子)的中性分子。兩性離子一般含有陽離子和陰離子基團,其離子化至分子的等電位區中幾乎相等的程度,且可在正負電荷中心之間產生強的“內鹽”吸引力。甜菜堿和磺基甜菜堿(sultaine)表面活性劑是供本文中使用的示例性的兩性離子表面活性劑。在一個實施例中,所用的表面活性劑不是兩性離子表面活性劑。
組織去細胞化方案中使用的洗滌劑的濃度(包括兩性硫代甜菜堿和陰離子曲拉通X-200TM)是基于他們的“臨界膠束濃度”。此濃度報告 于文獻或制造商的說明書中,且是洗滌劑效力的最低需要量。本發明的獨特緩沖基本原理是較大的膠束提取較好。較高的鹽濃度增加膠束大小。
因此,例如,在本發明的提取緩沖液中形成大膠束,其優選具有生理鹽度或更大鹽度。這些大膠束對于溶解細胞組分有利。在優選實施例中,洗滌劑的濃度為臨界膠束濃度,或更高。
在漂洗緩沖液中形成較小膠束,其具有低的(低于生理學鹽度)滲透壓/鹽度/滲透性或無滲透壓/鹽度/滲透性。根據本發明,已發現小膠束對于擴散出組織較好并且低滲透壓/鹽度/滲透性漂洗(在高鹽度洗滌之后)造成向外流動以及有助于提取。
在本發明的優選實施例中,用具有高濃度NaCl的溶液進行的一或多次初始組織洗滌經由提供大膠束而維持可溶性并幫助提取。用具有較低NaCl濃度的溶液進行的后續漂洗減少膠束大小并改善向組織外的擴散。
在優選實施例中,神經與提取組合物(優選含水組合物)接觸,所述提取組合物包括包含一或多種兩性洗滌劑或由一或多種兩性洗滌劑組成的洗滌劑組分。優選地,在提取組合物的洗滌劑組分中不存在陰離子洗滌劑。“不存在”陰離子洗滌劑,如本文中闡明的概念,意思指沒有足夠的離子型洗滌劑來分解組織的ECM。因此,沒必要要求完全不存在(即0%)。優選地,陰離子洗滌劑的量小于0.14、0.10、0.05、0.01或0.005%。
兩性洗滌劑可以是例如SB-10和/或SB-16。洗滌劑濃度應為至少臨界膠束濃度。SB-10的濃度可以是例如100、125、150、175、200或200mM以上。SB-16的濃度可以是例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0或1.0mM以上。
除洗滌劑組分之外,提取組合物還可包含一或多種鹽類和/或緩沖系統。鹽濃度應為生理學鹽度或高于生理學鹽度。鹽濃度的下限可為例如100、125、150、175、200或200mM以上的NaCl,且上限可為例如500、 450、400、350、250或250mM以下的NaCl。pH值可為例如6.5到8.5。優選pH值是生理學pH值。在一個實施例中,使用磷酸鈉緩沖液來維持pH值在大約7.2。
可使組織與此組合物在溫和攪動下接觸優選5、10、15或15小時以上的一段時間。
可選地,在新鮮(fresh)提取組合物情況下可使用一或多個額外提取步驟,所述新鮮提取組合物中的成分可以與第一提取組合物相同或不同。隨后,可將此后續提取組合物與其所包含的組織攪拌1、2、3、4、5、6小時或6小時以上。
提取步驟之后優選用提取緩沖液和/或生理鹽水洗滌,優選地,隨后是用漂洗緩沖液洗滌。漂洗緩沖液可與提取緩沖液具有相同或不同的緩沖系統且通常還具有相同或相似pH值。然而漂洗組合物的鹽濃度優選小于提取組合物的鹽度。在一個實施例中,漂洗組合物沒有鹽度。
處理步驟通常會在20℃到30℃下進行,且優選在室溫或接近室溫(例如25℃)。
在一個優選實施例中,所述方法包含用大量漂洗緩沖液進行最終洗滌且可將組織再懸浮于漂洗緩沖液中,隨后放入生理緩沖鹽水中并優選冷凍直到使用。
本發明中使用的緩沖系統和兩性洗滌劑與Hudson等人相比達成相同或較好的去細胞化效果,Hudson等人使用苛刻的陰離子洗滌劑提取。經由Hudson等人的方法處理的人神經顯示比大鼠神經所報道的細胞殘余物實質上更多的細胞殘余物。此外,當應用于兔和人神經時,Hudson等人使用的方法和本發明的方法實現幾乎相同的細胞提取水平。因此,如Hudson等人描述的添加陰離子洗滌劑曲拉通X-200TM在去細胞化方面沒有明顯優勢,且如上所述,不利于神經鞘結構的促進生長特性。此外,Hudson等人使用"新鮮的"神經,相比較而言,本發明優選使用獲得后立 即冷凍的神經,這還允許更有效利用來自人尸體供體的神經。
有利地,本發明的去細胞化方法獲得具有極佳生理學特性及結構特性以幫助和促進組織再生的組織移植物。例如,保留高比例的細胞外基質。在優選實施例中,此百分比大于50、60、70、75、80、85、90、95或99%。
在神經移植物的特定情況下,在去細胞化處理之后,保留大于50、60、70、75、80、85、90、95或99%的層粘連蛋白。這可以經由例如觀察(雙盲)計分或數字圖象分析與未處理的對照物供體神經對比來測量。
根據本發明制造的神經移植物的有利特性還可測量它們的促進神經突的活性,如通過生物測定所測量。一種此類生物測定是冷凍培養測定。在優選實施例中,根據本發明的去細胞化技術制造的神經移植物保持它們的神經突促進活性的50、60、70、75、80、85、90、95或99%,與例如只用緩沖洗滌液處理的對照神經相比。
在一個實施例中,根據本發明將包括神經、肌肉、胎盤和血管的組織去細胞化并用作移植物來修復神經。在一個優選實施例中,根據本發明的去細胞化神經被用作原位移植物來修復神經。
在一個實施例中,根據本發明的去細胞化神經被用于獸醫同種異體的應用,包括但不限于,馬神經移植于馬體內、貓神經移植于貓體內,以及狗神經移植于狗體內。
在另一個實施例中,根據本發明的去細胞化神經被用于異種移植應用中,包括動物供體神經移植于人受體體內和動物供體神經移植于不同物種的動物受體體內。
本發明去細胞化的方法除用于神經修復之外,還可用于組織移植物,包括但不限于骨移植物、腸移植物、血管移植物、韌帶移植物、腱移植物和心臟瓣膜移植物。
在本發明的一個優選實施例中,將移植物在去細胞化以后冷凍。此 便于γ輻照的良好狀態(最常見的殺菌方法)。此外,冷凍的最終移植物產品的運輸和儲存更實際。
移植物的細胞再增殖
雖然細胞被從本發明的組織解離和提取,不過向替代組織再引入一或多種不同類型的細胞還可以是可接受的且常常是必需的。這些細胞可以直接從供體、從來自供體的細胞的培養物或從細胞培養物獲得。供體細胞一般通過活組織檢查和使用標準條件在培養物中生長至細胞覆蓋來獲得。受體可根據需要而受免疫抑制,例如,若需要,使用類固醇和/或其他免疫抑制藥物的方案。在一個新的組織或組織等價物生長時,受體的免疫抑制可提供替代組織移植物的免疫保護。
此外,出于移植植入、免疫療法、認知功能、組織再生、修復或重建的目的,本發明的替代組織可用來在替代組織的立體架構/結構內提供多種細胞類型,包括基因改變的細胞、克隆體或移植物。此類細胞的例子包括(但不限于)軟骨細胞、成骨細胞、肌細胞、甲狀腺細胞、甲狀旁腺細胞、免疫細胞、胰腺細胞、纖維母細胞、肝細胞、上皮細胞、胰島細胞、神經細胞,和其他主要用作合成和分泌或代謝物質的細胞,以及腸、腎、心臟、腦、脊髓、肌肉、骨骼、肝、胃、皮膚、肺、生殖系統、神經系統、免疫系統、脾、骨髓、淋巴結、腺的活檢或克隆細胞體。
作為生物活性分子的載體的移植物
本發明的替代組織還可包括配制成具有一或多種活性物種的生物活性分子,以便使替代組織變成為一或多種活性物種的載體。本發明的試劑盒或替代組織可包括摻入所添加的聚合物或聚合物溶液(例如,聚合物支架)中的活性劑,或使用本領域技術人員顯而易見的技術可直接連接至替代組織表面或內部的活性劑。例如,活性劑可通過離子鍵結、共價鍵結和/或使用交聯劑(例如可裂解的交聯劑)鍵結而固化在無細胞替代組織上和進入無細胞替代組織中。
活性劑可以是藥物或其他生物活性化合物;因此,當用于身體內時,本發明的替代組織可以是用于遞送藥物或其他生物活性化合物的微載體。生物活性化合物的例子是蛋白、肽、多糖、核酸、寡核苷酸、天然的和合成的有機或無機分子,以及那些用于治療、預防或診斷目的的生物分子。藥物可包括抗生素、抗病毒劑、化學治療劑、免疫抑制劑、生長因子、抗血管生成劑、激素、消炎劑,對血管流量、細胞新陳代謝有影響的藥物,或針對一或多種疾病有效的藥物,和/或它們的組合。
其他活性劑也可以包括在本發明的替代組織或試劑盒中,例如,非甾體類抗炎藥(NSAID),諸如丙酸衍生物;乙酸衍生物;滅酸(fenamicacid)衍生物;聯苯甲酸衍生物;和昔康類(oxicams)。供本發明的試劑盒或替代組織使用的止痛劑包括對乙酰氨基酚(acetominophen)和非那西汀(phenacetin)。
本文中涉及或引用的所有專利、專利申請、臨時申請和公開案均以引證的方式在它們與本說明書的明確指示不相抵觸的程度上全文(包括所有圖和表)并入本文中。
以下是說明實踐本發明的方法的實例。這些實例不應被解釋為限制性的。除非另有說明,否則所有百分比是以重量計的且所有溶劑混合物比例是以體積計的。
實施例1——去細胞化過程
所有步驟應采用防腐技術和無菌溶液。以下是本發明的去細胞化過程的一個實施例的步驟。
1.從供體切除神經并冷凍儲存。
2.在室溫下解凍所述神經。用冰冷的水漂洗。浸沒在大量冰冷的水中。在4℃下輕輕攪拌6小時(或更長時間)。
3.將所述神經浸沒在提取緩沖液(10mM磷酸鈉緩沖液,pH7.2和150mMNaCl)或任何生理鹽水中的大量125mM(或濃度更大)的硫代 甜菜堿-10中。在25℃(接近室溫)下緩慢攪拌15小時(或更長時間)。
4.替換為提取緩沖液或任何生理鹽水中的大量新鮮的125mM(或濃度更大)的硫代甜菜堿-10。在25℃下攪拌6小時(或更長時間)。
5.用大量的提取緩沖液或任何生理鹽水洗滌。在25℃下攪拌60分鐘(或更長時間)。
6.用大量漂洗緩沖液(10mM磷酸鈉緩沖液,pH7.2)或具有極低滲透壓(沒有鹽度)的任何緩沖液洗滌。在25℃下攪拌60分鐘(或更長時間)。
7.將所述神經浸沒在大量提取緩沖液或任何生理鹽水中的0.6mM(或濃度更大)的硫代甜菜堿-16中。在25℃下攪拌15小時(或更長時間)。
8.替換為提取緩沖液或任何生理鹽水中的大量新鮮的0.6mM(或濃度更大)的硫代甜菜堿-16。在25℃下攪拌6小時(或更長時間)。
9.用大量的提取緩沖液或任何生理鹽水洗滌。緩慢攪拌所述神經30分鐘(或更長時間),然后替換為新鮮的提取緩沖液或任何生理鹽水。在4℃攪拌下洗滌15小時。
10.用大量漂洗緩沖液洗滌。緩慢攪拌以使所述神經再懸浮,然后替換為具有極低滲透壓(沒有鹽度)的新鮮漂洗緩沖液或任何緩沖液。在4℃攪拌下洗滌3小時。
11.放置在生理緩沖鹽水中并冷凍儲存。
實施例2——與兔神經去細胞化方法的比較
按照如上所述的本發明制備的移植物被稱為DC3移植物。將DC3移植物與正常的(未處理的)兔神經和經由Hudson等人(TissueEngineering10:1346-1358,2004)和美國專利第7,402,319號所描述的方案處理的兔移植物(本文中稱為DC2移植物)相比較。
通過幾種組織學技術評價來自兩種處理方法的DC2和DC3移植物。 對每個評價的結果進行半定量計分(0=未提取、1=部分提取、2=大部分提取、3=完全提取以及R=重新分配)。在圖1-6中顯示兩種洗滌劑處理方案的結果(DC2、DC3)和正常的神經對照物。
圖1說明了蘇木紫和曙紅(H和E)染色的兔神經組織(對照物;圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的兔神經組織(DC2;圖B)以及按照本發明教導的方法處理的兔神經組織(DC3;圖C)。圖A得分為0。圖B(DC2)和C(DC3)各自得分為2。H和E染色是一種用于普通組織學的染色法。這些圖和得分表明DC2和DC3的處理方法獲得大量的細胞提取并保持整個神經鞘完整。
圖2說明了Hoescht染色的兔神經組織(對照物;圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的兔神經組織(DC2;圖B)以及按照本發明教導的方法處理的兔神經組織(DC3;圖C)。圖A得分為0。圖B(DC2)和C(DC3)各自得分為1R。Hoescht染色是一種用于DNA的染色法。這些圖和得分顯示DC2和DC3的處理方法并未清除DNA而是分散和重新分配DNA。
圖3說明S-100免疫染色的兔神經組織(對照物;圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的兔神經組織(DC2;圖B)以及按照本發明教導的方法處理的兔神經組織(DC3;圖C)。圖A得分為0。圖B(DC2)和C(DC3)各自得分為3。S-100免疫標記(施萬細胞中的胞漿蛋白)顯示DC2和DC3處理方法在提取施萬細胞的細胞質時同樣有效。
圖4說明蘇丹黑染色的兔神經組織(對照物;圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的兔神經組織(DC2;圖B)以及按照本發明教導的方法處理的兔神經組織(DC3;圖C)。圖A得分為0。圖B(DC2)和C(DC3)各自得分為3。蘇丹黑染色是一種用于髓磷脂的染色法。這些圖和得分表明DC2和DC3的處理方法在提取髓磷脂時相同且非常有效。
圖5說明NAP-4神經絲免疫染色的兔神經組織(對照物;圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的兔神經組織(DC2;圖B)以及按照本發明教導的方法處理的兔神經組織(DC3;圖C)。圖A得分為0。圖B(DC2)和C(DC3)各自得分為1R。神經絲免疫標記(神經元/軸突細胞骨架的標記)顯示DC2和DC3的處理方法只部分地提取和重新分配所述軸突細胞骨架。
圖6說明層粘連蛋白免疫染色的兔神經組織(對照物;圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的兔神經組織(DC2;圖B)以及按照本發明教導的方法處理的兔神經組織(DC3;圖C)。圖A得分為0。圖B(DC2)和C(DC3)各自得分為1R。層粘連蛋白是包括軸突周圍重要基底層的神經鞘的主要組分。層粘連蛋白免疫標記顯示DC3的處理方法基本上沒有提取基底層結構。
實施例3——神經移植物的免疫相容性
已用Hudson等人的方法和本發明處理的神經移植物對新西蘭白兔(NewZealandWhite,NZW)進行了大量體內試驗。結果顯示,兩種類型的去細胞神經移植物是免疫相容的,沒有觀察到移植排斥。
新西蘭白兔是一種遠親雜交品系。文獻中已知從新西蘭白兔供體至新西蘭白兔受體的活的或細胞組織的同種異體移植導致移植免疫排斥。
因此,所觀察到的在新西蘭白兔同種異體移植物中沒有移植排斥表明由本發明制備的神經同種異體移植物是免疫相容的。
實例4——與人神經去細胞化方法的比較
人神經組織是按照如上所述的本發明制備的且被稱為DC3移植物。將DC3移植物與正常的(未處理的)人神經和經由Hudson等人(TissueEngineering10:1346-1358,2004)和美國專利第7,402,319號所描述的方案處理的人移植物(本文中稱為DC2移植物)相比較。通過幾種組織學技術評價來自兩種處理方法的DC2和DC3移植物。
圖7說明蘇木紫和曙紅染色的人神經組織(對照物;圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的人神經組織(DC2;圖B)以及按照本發明教導的方法處理的人神經組織(DC3;圖C)。
圖8說明Hoechst染色的人神經組織(對照物;圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的人神經組織(DC2;圖B)以及按照本發明教導的方法處理的人神經組織(DC3;圖C)。
圖9說明S-100免疫染色的人神經組織(對照物;圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的人神經組織(DC2;圖B)以及按照本發明教導的方法處理的人神經組織(DC3;圖C)。
圖10說明蘇丹黑染色的人神經組織(對照物;圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的人神經組織(DC2;圖B)以及按照本發明教導的方法處理的人神經組織(DC3;圖C)。
圖11說明NAP-4神經絲免疫染色的人神經組織(對照物;圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的人神經組織(DC2;圖B)以及按照本發明教導的方法處理的人神經組織(DC3;圖C)。
圖12說明層粘連蛋白免疫染色的人神經組織(對照物;圖A)、按照Hudson等人教導的方法處理的人神經組織(DC2;圖B)以及按照本發明教導的方法處理的人神經組織(DC3;圖C)。
實例5——大鼠神經移植物的神經元再增殖
將神經沿縱軸冷凍切片并安放在蓋玻片上。將分離神經元接種在組織切片上并培養24小時。隨后將冷凍培養物固定并且將測試神經元免疫染色。
圖13A說明經(A)單獨的緩沖液和(B)由Hudson等人描述的去細胞化洗滌劑(硫代甜菜堿-10、硫代甜菜堿-16和曲拉通X-200TM)去細胞的大鼠神經移植物的冷凍培養鑒定。當神經移植物的促進生長的活性幾乎全被嚴格的洗滌劑去細胞化消除時,觀察到在單獨緩沖液條件下有 大量軸突生長。
在有和沒有曲拉通X-200TM的情況下對經由Hudson等人的方法去細胞化的神經進行冷凍培養鑒定(圖13B)。對照神經(僅僅用緩沖洗滌液處理)具有高神經突促進活性。用硫代甜菜堿-10和硫代甜菜堿-16(無曲拉通X-200TM)去細胞化的神經具有類似高的神經突促進活性。相比之下,經添加曲拉通X-200TM去細胞顯著地降低了促進神經突的活性。這些結果顯示曲拉通X-200TM對去細胞化神經移植物的生物特性具有持久有害影響。
實例6——洗滌劑對層粘連蛋白促進神經突的活性的影響
已知神經的細胞外基質促進軸突的生長。具體地講,包住軸突的基底層管對神經再生中的軸突生長提供了強有力的刺激。在上述實驗中使用的冷凍培養鑒定依賴于基底層的結構和生長促進活性。文獻已記載層粘連蛋白是神經基底層的主要促進神經突的組分。這在冷凍培養鑒定中很容易表明,其中神經突生長有效地被具有阻斷抗層粘連蛋白抗體功能的神經組織部分的預處理所抑制。因此,進行測試以檢驗各個洗滌劑對純化的層粘連蛋白的影響。SB-10未改變層粘連蛋白活性。暴露于SB-16使層粘連蛋白活性降低大約50%。TrX200(一種陰離子洗滌劑)基本上消除了層粘連蛋白的神經突促進活性(圖14)。
本文中描述的本發明的任何方面或實施例中關于一個或多個要素所使用的術語,諸如“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”或“含有(containing)”是用來提供“由特定要素組成(consistsof)”、“基本上由特定要素組成(consistsessentiallyof)”或“基本上包含特定要素(substantiallycomprises)”的本發明的相似方面或實施例的支持,除非上下文另有說明或明顯矛盾(例如,本文中描述的組合物包含一個特定要素應該被理解為還描述由那個要素組成的組合物,除非上下文另有說明或明顯矛盾)。
如本文中所用,術語“基本上由...組成(consistsessentiallyof)”限制了成分范圍和至指定物質的步驟,或沒有在實質上影響本發明的基本特征和新穎特征的步驟,即用于組織移植物去細胞化的組合物和方法。例如,通過使用“基本上由...組成(consistsessentiallyof)”,所述組合物不含任何未指明的成分,包括但不限于對組織的去細胞化具有直接有利或不利影響的表面活性劑。
本文中所述的實例和實施例僅用于說明性目的且本領域技術人員可獲得根據其的各種修改或改變的啟示,并且包括在本申請的精神和權限內。此外,本文公開的任何發明或其實施例的任何要素或限制可與本文公開的任何和/或所有其他要素或限制(單獨地或以任何組合)或任何其它發明或其實施例組合,并且設想所有此類組合均在本發明的范圍之內,但不限于此。

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用于 組織 移植 細胞 方法
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