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一種溫敏性聚合物載體、制備方法及其應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201510611508.X

申請日:

2015.09.23

公開號:

CN105175625A

公開日:

2015.12.23

當前法律狀態:

駁回

有效性:

無權

法律詳情: 發明專利申請公布后的駁回IPC(主分類):C08F 220/38申請公布日:20151223|||實質審查的生效IPC(主分類):C08F 220/38申請日:20150923|||公開
IPC分類號: C08F220/38; C08F220/34; A61K47/32 主分類號: C08F220/38
申請人: 蘇州大學
發明人: 華道本; 董萍; 周媛; 何偉偉
地址: 215137 江蘇省蘇州市相城區濟學路8號
優先權:
專利代理機構: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103 代理人: 仇波
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201510611508.X

授權公告號:

||||||

法律狀態公告日:

2018.03.27|||2016.01.20|||2015.12.23

法律狀態類型:

發明專利申請公布后的駁回|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及一種溫敏性聚合物載體、制備方法及其應用,它由單體A和單體B在引發劑的作用下共聚而成,所述單體A的化學結構式為???????????????????????????????????????????????,所述單體B的化學結構式為。通過在其分子結構中引入兩親性離子官能團,不但創造了納米顆粒表面的無污染性質,具有較強的抗蛋白吸附性能,而且具有溫敏響應的性質,實現了低溫包裹,高溫快速釋放藥物的功能;本發明用無歸共聚的方法合成了溫度響應的磺酸甜菜堿-腺嘌呤納米顆粒(即溫敏性聚合物載體),不但過程簡單,原料便宜,而且不會產生有害的中間產物,該溫敏性聚合物載體能夠和兩親性藥物進行組裝,形成穩定的藥物納米離子,不但可以降低藥物的細胞毒性和提高酶

權利要求書

權利要求書
1.  一種溫敏性聚合物載體,它由單體A和單體B在引發劑的作用下共聚而成,其特征在于:所述單體A的化學結構式為,所述單體B的化學結構式為。

2.  根據權利要求1所述的溫敏性聚合物載體,其特征在于:所述單體A和所述單體B的摩爾比為3:1~1:1。

3.  根據權利要求1所述的溫敏性聚合物載體,其特征在于:它的重均分子量為20600~24900g/mol,PDI為1.58~1.78。

4.  權利要求1至3中任一所述溫敏性聚合物載體的制備方法,其特征在于,它包括以下步驟:
(a)將單體A、單體B和引發劑溶于第一溶劑中,在65~75℃、無氧條件下,攪拌反應70~74小時,得磺酸甜菜堿-腺嘌呤溶液;
(b)將所述磺酸甜菜堿-腺嘌呤溶液傾入沉淀劑中,過濾后干燥即可。

5.  根據權利要求4所述溫敏性聚合物載體的制備方法,其特征在于:所述第一溶劑為二甲亞砜,所述沉淀劑為丙酮。

6.  根據權利要求4所述溫敏性聚合物載體的制備方法,其特征在于,所述單體B的制備方法包括以下步驟:
(S1)將2-溴乙醇、甲基丙烯酰氯和三乙胺溶于二氯甲烷中,攪拌反應17.5~18.5小時得混合溶液;
(S2)過濾所述混合溶液,向濾液中加入冰水混合后靜置封層;取下層清液,再向其中加入冰水重復洗滌多次后,蒸發除去二氯甲烷得2-溴乙醇丙烯酸甲酯;
(S3)將腺嘌呤、氫化鈉和所述2-溴乙醇丙烯酸甲酯溶于N,N-二甲基甲酰胺中,攪拌反應11.5~12.5小時,過濾后用丙酮沉淀,干燥即可。

7.  根據權利要求6所述溫敏性聚合物載體的制備方法,其特征在于:所述2-溴乙醇、所述甲基丙烯酰氯和所述三乙胺的摩爾比為1:1~1.2:1~1.2,所述腺嘌呤、所述2-溴乙醇丙烯酸甲酯和所述氫化鈉的摩爾比為1:1~1.2:1~1.2。

8.  權利要求1至3中任一所述溫敏性聚合物載體用于包裹組裝兩親性藥物。

9.  根據權利要求8所述溫敏性聚合物載體的應用,其特征在于,它包括以下步驟:
(Q1)將所述溫敏性聚合物載體溶于去離子水中得納米顆粒預混液,將兩親性藥物溶于第二溶劑中得藥物預混液;
(Q2)將所述納米顆粒預混液和所述藥物預混液混合后傾入透析袋中,置于去離子水組裝23~25小時,再傾入另一透析袋中除去未組裝的兩親性藥物即可。

10.  根據權利要求9所述溫敏性聚合物載體的應用,其特征在于:所述納米顆粒預混液和所述藥物預混液的體積比為1:0.2~1;所述納米顆粒預混液的濃度為0.1~2g/L,所述兩親性藥物的濃度為1~5g/L。

說明書

說明書一種溫敏性聚合物載體、制備方法及其應用
技術領域
本發明屬于高分子材料領域,涉及一種聚合物載體,具體涉及一種溫敏性聚合物載體、制備方法及其應用。
背景技術
1928年英國細菌學家弗萊明首先發現了世界上第一種抗生素-青霉素,它的出現開創了用抗生素治療疾病的新紀元,人類抵抗細菌性感染的能力大大增強。抗生素是由微生物或高等動植物在生活過程中所產生的具有抗病原體或其它活性的一類次級代謝產物,能干擾其他生活細胞發育功能的化學物質。然而隨著抗生素的應用過多,細菌對抗生素的耐藥性增加,大大降低了它在細菌感染方面的治療效果,而“超級細菌”的出現給人們敲起了警鐘,因此尋找新的有效的治療藥物尤為重要。
抗菌肽被認為是很好的替代藥,它對于廣泛的病原微生物都有著顯著的抑制作用,且不易產生耐藥性問題。抗菌肽原指昆蟲體內經誘導而產生的一類具有抗菌活性的堿性多肽物質,分子量在2000~7000左右,由20~60個氨基酸殘基組成。抗菌肽是通過作用于細菌細胞膜,破壞膜的完整性,使細胞內外屏障喪失,造成細胞內容物泄漏,從而殺死細胞。因此這類活性多肽多數具有強堿性、熱穩定性以及廣譜抗菌等特點。抗菌肽的廣泛的生物學活性顯示了其在醫學上良好的應用前景。然而,通常多肽類藥物的半衰期短,需多次給藥,且在體內的穩定性差,易被酶分解。研究人員調查發現,用脂質體包裹抗菌肽可以很好的解決多肽藥物的酶切穩定性和細胞毒性問題。但是由于脂質體本身較低的膜穩定性和生物可利用性,從而限制了這項應用。
近年來,由于突出的穩定、化學功能性和生物相容性,聚合物納米載體在藥物傳輸中具有巨大的潛力。近年來,利用納米載體負載抗菌肽的方法,不僅可以提高抗菌肽的分散性以及實現藥物緩釋,還能夠降低抗菌肽的細胞毒性和增加它的酶穩定性。因此,研究新型的聚合物載體用于抗菌肽的負載是十分重要的研究。
發明內容
本發明目的是為了克服現有技術的不足而提供一種溫敏性聚合物載體。
為達到上述目的,本發明采用的技術方案是:一種溫敏性聚合物載體,它由單體A和單體B在引發劑的作用下共聚而成,所述單體A的化學結構式為所述單體B的化學結構式為
優化地,所述單體A和所述單體B的摩爾比為3:1~1:1。
優化地,它的重均分子量為20600~24900g/mol,PDI為1.58~1.78。
本發明的又一目的在于提供一種上述溫敏性聚合物載體的制備方法,它包括以下步驟:
(a)將單體A、單體B和引發劑溶于第一溶劑中,在65~75℃、無氧條件下,攪拌反應70~74小時,得磺酸甜菜堿-腺嘌呤溶液;
(b)將所述磺酸甜菜堿-腺嘌呤溶液傾入沉淀劑中,過濾后干燥即可。
優化地,所述第一溶劑為二甲亞砜,所述沉淀劑為丙酮。
優化地,所述單體B的制備方法包括以下步驟:
(S1)將2-溴乙醇、甲基丙烯酰氯和三乙胺溶于二氯甲烷中,攪拌反應17.5~18.5小時得混合溶液;
(S2)過濾所述混合溶液,向濾液中加入冰水混合后靜置封層;取下層清液,再向其中加入冰水重復洗滌多次后,蒸發除去二氯甲烷得2-溴乙醇丙烯酸甲酯;
(S3)將腺嘌呤、氫化鈉和所述2-溴乙醇丙烯酸甲酯溶于N,N-二甲基甲酰胺中,攪拌反應11.5~12.5小時,過濾后用丙酮沉淀,干燥即可。
進一步地,所述2-溴乙醇、所述甲基丙烯酰氯和所述三乙胺的摩爾比為1:1~1.2:1~1.2,所述腺嘌呤、所述2-溴乙醇丙烯酸甲酯和所述氫化鈉的摩爾比為1:1~1.2:1~1.2。
本發明的再一目的在于提供一種上述溫敏性聚合物載體用于包裹組裝兩親性藥物。
優化地,它包括以下步驟:
(Q1)將所述溫敏性聚合物載體溶于去離子水中得納米顆粒預混液,將兩親性藥物溶于第二溶劑中得藥物預混液;
(Q2)將所述納米顆粒預混液和所述藥物預混液混合后傾入透析袋中,置于去離子水組裝23~25小時,再傾入另一透析袋中除去未組裝的兩親性藥物即可。
進一步地,所述納米顆粒預混液和所述藥物預混液的體積比為1:0.2~1;所述納米顆粒預混液的濃度為0.1~2g/L,所述兩親性藥物的濃度為1~5g/L。
由于上述技術方案運用,本發明與現有技術相比具有下列優點:本發明溫敏性聚合物載體,通過在其分子結構中引入兩親性離子官能團,不但創造了納米顆粒表面的無污染性質,具有較強的抗蛋白吸附性能,而且具有溫敏響應的性質,實現了低溫包裹,高溫快速釋放藥物的功能;本發明用無歸共聚的方法合成了溫度響應的磺酸甜菜堿-腺嘌呤納米顆粒(即溫敏性聚合物載體),不但過程簡單,原料便宜,而且不會產生有害的中間產物,所得產品生物相容性好,可用于藥物載體,該溫敏性聚合物載體能夠和兩親性藥物進行組裝,形成穩定的藥物納米離子,不但可以降低藥物的細胞毒性和提高酶的穩定性,還大大增強了藥物的抗菌效果。
附圖說明
附圖1為本發明溫敏性聚合物載體的反應流程圖;
附圖2為本發明溫敏性聚合物載體中單體B的反應流程圖;
附圖3為實施例1中制得的溫敏性聚合物載體的性能參數:(A)1H-NMR圖,(B)GPC圖和(C)溫度響應圖;
附圖4為實施例1中制得的溫敏性聚合物載體與抗菌肽丙甲菌素組裝得到的藥物納米顆粒在不同溫度環境下的體外釋放圖;
附圖5為實施例1中制得的溫敏性聚合物載體與抗菌肽丙甲菌素組裝得到的藥物納米顆粒對人成纖維細胞活力的影響圖;
附圖6為實施例1中制得的溫敏性聚合物載體在不同濃度下與抗菌肽丙甲菌素組裝得到的藥物納米顆粒對細菌生長曲線的抑制圖。
具體實施方式
本發明溫敏性聚合物載體,它由單體A和單體B在引發劑的作用下共聚而成,所述單體A的化學結構式為所述單體B的化學結構式為共聚方法可以采用常規共聚方法即可,例如無規共聚、嵌段共聚等,由于無規共聚的成本較低、工藝簡單、易于操作,一般選用無規共聚即可。所述單體A和所述單體B的摩爾比為3:1~1:1,從而提高了溫敏性聚合物載體的性能;并且單體A和單體B的摩爾比為1:1時,溫敏性聚合物載體和兩親性藥物組裝效果最好。溫敏性聚合物載體的重均分子量為20600~24900g/mol,PDI為1.58~1.78,此時其聚合物分子鏈的分布比較均勻,質量穩定。
上述溫敏性聚合物載體的制備方法,它包括以下步驟:(a)將單體A、單體B和引發劑溶于第一溶劑中,在65~75℃、無氧條件下,攪拌反應70~74小時,得磺酸甜菜堿-腺嘌呤溶液;(b)將所述磺酸甜菜堿-腺嘌呤溶液傾入沉淀劑中,過濾后干燥即可。所述第一溶劑優選為二甲亞砜,所述沉淀劑優選為丙酮,所述引發劑選用現有的即可,其量根據單體A和單體B的總量予以確定。
所述單體B的制備方法包括以下步驟:(S1)將2-溴乙醇、甲基丙烯酰氯和三乙胺溶于二氯甲烷中,攪拌反應17.5~18.5h得混合溶液;(S2)過濾所述混合溶液,向濾液中加入冰水混合后靜置封層;取下層清液,再向其中加入冰水重復洗滌多次后,蒸發除去二氯甲烷得2-溴乙醇丙烯酸甲酯;(S3)將腺嘌呤、氫化鈉和所述2-溴乙醇丙烯酸甲酯溶于N,N-二甲基甲酰胺中,攪拌反應11.5~12.5h,過濾后用丙酮沉淀,真空干燥即可。所述2-溴乙醇、所述甲基丙烯酰氯和所述三乙胺的摩爾比為1:1~1.2:1~1.2,所述腺嘌呤、所述2-溴乙醇丙烯酸甲酯和所述氫化鈉的摩爾比為1:1~1.2:1~1.2。
上述溫敏性聚合物載體能夠用于包裹組裝兩親性藥物,具體包括以下步驟:(Q1)將所述溫敏性聚合物載體溶于去離子水中得納米顆粒預混液,將兩親性藥物溶于第二溶劑中得藥物預混液;(Q2)將所述納米顆粒預混液和所述藥物預混液混合后傾入透析袋中,置于去離子水組裝23~25小時,再傾入另一透析袋中除去未組裝的兩親性藥物即可。所述納米顆粒預混液和所述藥物預混液的體積比為1:0.2~1;所述納米顆粒預混液的濃度為0.1~2g/L,所述兩親性藥物的濃度為1~5g/L。
下面將結合附圖實施例對本發明進行進一步說明。
實施例1
本實施例提供一種溫敏性聚合物載體,其制備如圖1所示,具體為:按照1:1摩爾比,將0.35mmolSBMA(結構式如圖1所示,美國Sigma公司,97%)、0.35mmolAEM(結構式如圖1所示,上海百靈威公司,98%)、0.0055gAIBN(國藥集團化學試劑有限公司,化學純)加入到4.0mL無水DMSO(國藥集團化學試劑有限公司,純度≥99.0%)中,在室溫條件下攪拌,直至溶質完全溶解,得到混合溶液;將上述混合溶液置于安倍瓶中,通氬氣以除去溶解的氧氣,然后封口放入70℃的油浴鍋中,反應72h;反應結束后的產物用丙酮沉淀三次,真空干燥,得到聚合物,簡寫為P(SBMA-co-AEM),其表征如圖3和圖4所示,圖3(A)為1H-NMR(400M,D2O)譜圖,圖3(B)為GPC譜圖,圖3(C)為溫度響應的粒徑圖。P(SBMA-co-AEM)的SEM和粒徑圖譜如圖2所示。
1、藥物組裝和含藥納米顆粒的表征。
以抗菌肽丙甲菌素(J&K百靈威)作為模型,進行P(SBMA-co-AEM)材料和藥物的組裝,具體步驟如下所述:準確稱取1mgP(SBMA-co-AEM),高溫溶解在2mL去離子水中,得到P(SBMA-co-AEM)預混液;準確稱取1mg丙甲菌素,溶解于1mL乙醇中,得到丙甲菌素預混液;將兩種預混液混合并振蕩,以便使其充分混合;振蕩完畢后,將混合液置于透析袋(MWCO=1000Da)中,室溫的條件下讓其在去離子水中組裝24h;組裝結束后將透析袋中的混合液放入另外一種透析袋(MWCO=3500Da)中,在去離子水中攪拌除去未組裝的抗菌肽,即可得到P(SBMA-co-AEM)納米顆粒包裹的丙甲菌素,其表征如圖5所示,(A)為掃描電子顯微鏡(SEM)拍攝到的共組裝藥物納米顆粒的圖片;(B)為納米粒度分析儀測到的共組裝藥物納米顆粒的直徑,其中平均209nm。
2、藥物的載藥率的考察。
由于丙甲菌素沒有特征譜圖,所以很難測出其在溶液中的濃度,為了考察P(SBMA-co-AEM)對它的包封率,我們用FITC(異硫氰酸熒光素)標記的丙甲菌素進行了一個模型實驗,具體步驟如下所述:首先,稱取5mg的丙甲菌素溶在1mL的乙醇中,調整溶液的pH值到9,隨后加入稱取的5mgFITC,在室溫下充分攪拌反應4h。反應結束后將溶液置于透析袋(MWCO=1000Da)中,乙醇透析除去未標記的FITC。用紫外-可見光分光光度計測出其在下490nm的吸光度,通過繪制FITC標記的丙甲菌素的標準曲線,即可計算出載體包裹的丙甲菌素的濃度。接著,將FITC標記的丙甲菌素緩慢的加入P(AEM-co-SBMA)水溶液(2mg/mL,5mL)中,置于分子量為1000的透析袋攪拌組裝24h,然后置于分子量為3500的透析袋除去未包裹的丙甲菌素。依照下式計算含藥納米顆粒的包封率。

紫外測定結果如下:包封率為28.81%。
3、藥物的體外釋放實驗
由于聚合物載體是溫敏性的,當溫度高于某個閾值時,聚合物溶解可以釋放包裹的藥物,所以藥物體外釋放實驗過程如下:將上述過程得到的藥物納米顆粒溶液采用透析法進行藥物體外釋放實驗,釋放介質是PBS(磷酸緩沖溶液),在固定的時間點測出透析袋里溶液的紫外吸收值,并計算藥物的剩余率(%),其結果如圖6所示,為藥物納米顆粒在不同溫度環境下的體外釋放實驗。實驗結果表明,在溫度高于閾值(37℃)的環境下,藥物體現了快速釋放的特點,且在6小時以內全部釋放出來;在溫度低于閾值(25℃)的環境下,藥物大多保留在載體內部沒有釋放出來。
4、藥物共聚物的細胞學實驗。
4.1、藥物共聚物對人成纖維細胞HDF生長的影響(MTT法)。
將處于對數生長期的HDF細胞用0.25%胰酶消化后,用完全培養基懸浮制成單細胞懸液,計數調整細胞濃度為5×103個/ml,按照200μL/孔的劑量接種于96孔板中,待細胞貼壁后,吸出培養基,并換成含有不同藥物(單純的P(SBMA-co-AEM)、包裹丙甲菌素的P(SBMA-co-AEM)、單純的丙甲菌素)的培養基,每組均設置5個平行孔。在37℃,5%CO2培養箱中培養48h后,每孔加入30μLMTT(質量濃度為5mg/mL),于37℃繼續培養4h后,每孔再加入150μLDMSO,于37℃充分溶解后,在酶標儀中于590nm下測定吸光值,并計算相對細胞活力(%),P(SBMA-co-AEM)與丙甲菌素共聚物對HDF細胞活力的影響。
實驗結果表明,包裹在納米顆粒中的丙甲菌素明顯降低了對HDF細胞產生的毒性作用,而單純的丙甲菌素對于HDF細胞生長抑制效果明顯。此外,單純的P(SBMA-co-AEM)載體可以促進細胞的生長,這印證了該載體材料的生物相容性。
4.2、藥物共聚物的酶穩定性測試。
為了測定藥物共聚物的酶穩定性,藥物共聚物和丙甲菌素用酶(胰蛋白酶和胃蛋白酶)預先處理30分鐘,然后加入到稀釋至105CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌液中,同時設立對照組。于37℃,150r/min培養24h后測定菌液的濃度(OD600nm)。
4.3、藥物共聚物對金黃色葡萄球菌的殺傷能力測試。
4.3.1藥物共聚物的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的考察。
用肉湯培養基將實驗組(藥物載體、藥物共聚物、單純的丙甲菌素、以及丙甲菌素和載體的混合物)倍比稀釋共稀釋10次;同時設空白對照和陰性對照。取對數生長期的金黃色葡萄球菌培養液稀釋使其菌體濃度為105CFU/mL,分別加入100μL菌液至上述稀釋后的實驗組中,于37℃,150r/min培養18-20h后觀察金黃色葡萄球菌的生長情況,以金黃色葡萄球菌不生長的最小稀釋度的實驗組濃度即位最小抑菌濃度(MIC)。將上述透明的菌藥液吸取0.1mL加入瓊脂培養基滅菌平板涂布,置于37℃電熱恒溫培養箱培養24h。若沒有菌生長則該實驗組濃度為最小殺菌濃度(MBC)。實驗結果表明,藥物共聚物的MIC和MBC明顯低于單純的丙甲菌素以及兩者的混合物(8μMvs.32μM;32μMvs.128μM)。還有單純的藥物載體對金黃色葡萄球菌的生長沒有影響。
4.3.2藥物共聚物對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響。
取對數生長期的金黃色葡萄球菌培養液稀釋使其菌體濃度為106CFU/mL,加入藥物納米顆粒使得最后藥物濃度分別為1,2,3倍的MIC,同時設立對照組。于37℃,150r/min培養24h,每隔2h用紫外分光光度計測定各組的吸收值(OD600nm)。實驗結果表明,藥物共聚物對金黃色葡萄球菌的生長有明顯抑制作用,且隨著藥物濃度增加,抑制效果更加明顯。
實施例2
本實施例提供一種溫敏性聚合物載體,其制備方法與實施例1中的基本相同,不同的是單體A和單體B的摩爾比為3:1。
實施例3
本實施例提供一種溫敏性聚合物載體,其制備方法與實施例1中的基本相同,不同的是單體A和單體B的摩爾比為2:1。
上述實施例只為說明本發明的技術構思及特點,其目的在于讓熟悉此項技術的人士能夠了解本發明的內容并據以實施,并不能以此限制本發明的保護范圍,凡根據本發明精神實質所作的等效變化或修飾,都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。

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一種 溫敏性 聚合物 載體 制備 方法 及其 應用
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