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抗氯霉素SCFV的抗體基因及應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201510593196.4

申請日:

2015.09.17

公開號:

CN105177016A

公開日:

2015.12.23

當前法律狀態:

實審

有效性:

審中

法律詳情: 實質審查的生效IPC(主分類):C12N 15/13申請日:20150917|||公開
IPC分類號: C12N15/13; C07K16/44; C12N15/70; C12N1/21; G06F19/22(2011.01)I 主分類號: C12N15/13
申請人: 天津科技大學
發明人: 王碩; 杜欣軍; 李萍; 周曉楠
地址: 300222 天津市河西區大沽南路1038號天津科技大學
優先權:
專利代理機構: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209 代理人: 趙瑤瑤
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201510593196.4

授權公告號:

|||

法律狀態公告日:

2016.01.20|||2015.12.23

法律狀態類型:

實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及一種抗氯霉素scFv的抗體基因及應用,涉及特異性單鏈抗體基因的篩選、特異性單鏈抗體基因的序列測定、單鏈抗體的制備、抗體的活性測定,該抗體基因包含編碼重鏈可變區(117個氨基酸)、柔性鏈接區(15個氨基酸)和輕鏈可變區(108個氨基酸)的核苷酸序列,如序列表SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示,將該抗體基因與堿性磷酸酶進行融合表達后,獲得了具有活性的單鏈抗體,活性檢測結果顯示該抗體對氯霉素的檢測靈敏度為2.97(g/kg。該抗體在氯霉素的檢測中具有重要的應用價值。

權利要求書

權利要求書
1.  一種抗氯霉素scFv的抗體基因,其特征在于:其包括重鏈基因和輕鏈基因,該基因由714個核苷酸組成,所述重鏈基因的序列見序列1,輕鏈基因的基因序列見序列2。

2.  由權利要求1所述基因編碼的抗氯霉素scFv的抗體。

3.  根據權利要求2所述的抗氯霉素scFv的抗體,其特征在于:重鏈可變區由117個氨基酸組成,柔性鏈接區由15個氨基酸,輕鏈可變區由108個氨基酸組成。

4.  含有權利要求1所述的抗體基因的載體。

5.  含有權利要求1所述的抗體基因的基因工程菌。

6.  權利要求4所述的載體或權利要求5所述的基因工程菌在制備抗氯霉素scFv抗體中的應用。

7.  一種氯霉素抗體基因重鏈可變區和輕鏈可變區的篩選方法,其特征在于:步驟如下
⑴將抗體基因的重鏈可變區、輕鏈可變區進行PCR擴增,與T載體連接并轉化大腸桿菌感受態細胞,篩選陽性克隆后進行大規模測序,利用序列比對軟件對測序后的結構進行序列比對分析;
⑵將氯霉素單克隆抗體進行酶解,獲得Fab水解片段,并將水解后的重鏈和輕鏈分別進行質譜鑒定;
⑶將大規模測序結果轉換為氨基酸序列,與質譜鑒定結果所獲得的氨基酸片段進行序列比對分析,從測序結果中篩選與質樸鑒定結果一致的序列,從而獲得目標抗體基因的重鏈可變區和輕鏈可變區。

說明書

說明書抗氯霉素scFv的抗體基因及應用
技術領域
本發明涉及基因工程技術領域和免疫學檢測領域,具體涉及一種抗氯霉素scFv的抗體基因及應用。
技術背景
氯霉素是一種廣譜抗生素,最早是從土壤中的委內瑞拉放線菌中發現的,但現在主要靠化學合成的手段生產。氯霉素不僅能夠有效的作用于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌,對立克次氏體、支原體和衣原體也具有抑制作用。該藥的抑菌機理,是通過與細菌的核糖體50s亞基的可逆結合,阻止氨基酰-tRNA與核糖體結合,抑制肽酰基轉移酶的作用,從而達到抑菌、殺菌的效果。由于氯霉素價格便宜且藥效顯著,因此在畜牧業生產中被廣泛用于治療敗血癥、肺、消化系統及泌尿系統感染。在水產養殖領域,由于氯霉素的廣譜、高效的殺菌能力,也曾廣泛地用于治療氣一單胞菌等引起的魚類疾病。自1949年氯霉素應用于臨床后,在一些感染性疾病,尤其是傷寒流行中取得良好療效,但也于1950年發現本品可造成嚴重致死性血液系統毒性。
目前,越來越多的國家都開始高度重視氯霉素獸藥的殘留問題。歐盟、美國等均在相關法規中限定氯霉素殘留限量標準為“零容許量”,日本于2006年實施的《肯定列表制度》中關于氯霉素的殘留量也規定為不得檢出,為此,我國農業部己將氯霉素從2000年的《中國獸藥典》中刪除,而《動物性食品獸藥殘留規定》中則明確規定氯霉素在食品當中不得檢出,一旦發現其殘留量超標,一律禁止出口。農業部公告第193號(2002-4-27)發布的《食品動物禁用獸藥及其化合物清單》中,將氯霉素列為禁用藥。
因為這類抗生素的含量極微,因此要求高度靈敏的檢測技術。已報道的氯霉素殘留量測定方法有氣相色譜(GC)法、酶聯免疫吸附(ELISA)等。GC法使用高靈敏度的電子捕獲檢測器,因而對樣品的凈化要求嚴格,并增加了分析流程時間。這就迫切需一種新的快速檢測的方法;普通的酶聯免疫法雖靈敏度高、樣 品容量大,卻存在實驗動物需量大、飼養周期長,不同動物個體對農獸藥敏感程度不同,造成抗體差異大等問題;單克隆抗體作為第二代抗體,由于制備和篩選過程繁瑣,且對操作技術要求很高,克隆后的細胞遺傳容易不穩定等原因,不利于廣泛應用。
基因工程抗體的優勢表現在節省實驗動物及飼養時間、技術簡便、易于投入生產、遺傳信息具有可操作性。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足之處,提供一種針對性強、穩定性高、制備方便的抗氯霉素的scFv抗體及編碼該抗體的基因序列。
本發明的目的是通過以下技術方案實現的:
一種抗氯霉素scFv的抗體基因,其包括重鏈基因和輕鏈基因,該基因由714個核苷酸組成,所述重鏈基因的序列見序列1,輕鏈基因的基因序列見序列2。
由抗氯霉素scFv的抗體基因編碼的抗氯霉素scFv的抗體。
而且,重鏈可變區由117個氨基酸組成,柔性鏈接區由15個氨基酸,輕鏈可變區由108個氨基酸組成。
含有抗氯霉素scFv的抗體基因的載體。
含有抗氯霉素scFv的抗體基因的基因工程菌。
含有抗氯霉素scFv的抗體基因的基因工程菌或含有抗氯霉素scFv的抗體基因的載體在制備抗氯霉素scFv抗體中的應用。
一種氯霉素抗體基因重鏈可變區和輕鏈可變區的篩選方法,步驟如下
⑴將抗體基因的重鏈可變區、輕鏈可變區進行PCR擴增,與T載體連接并轉化大腸桿菌感受態細胞,篩選陽性克隆后進行大規模測序,利用序列比對軟件對測序后的結構進行序列比對分析;
⑵將氯霉素單克隆抗體進行酶解,獲得Fab水解片段,并將水解后的重鏈和輕鏈分別進行質譜鑒定;
⑶將大規模測序結果轉換為氨基酸序列,與質譜鑒定結果所獲得的氨基酸片段進行序列比對分析,從測序結果中篩選與質樸鑒定結果一致的序列,從而獲得目標抗體基因的重鏈可變區和輕鏈可變區。
本發明的優點和積極效果:
(1)本申請通過查閱大量NCBI數據設計了兼并引物,該引物能全面地覆蓋鼠源抗體重鏈和輕鏈的多樣性,尤其是輕鏈引物除了包括一般的kappa輕鏈引物,還包括了lambda輕鏈引物,以防止部分目的基因的丟失。
(2)本發明選用雜交瘤細胞作為制備抗氯霉素scFv抗體的基因來源,省去了免疫、飼養動物帶來的繁瑣,針對性更強;
(3)本發明建立了一種新的、可靠性強的獲得特異性抗體基因的方法,將抗體的質譜鑒定和大規模測序相比對,從而獲得目標抗體基因;
(4)本發明的制備方法節省時間、技術簡便、易于發展下游生產、遺傳信息可操作且穩定。
附圖說明
圖1為氯霉素抗體可變區的擴增。圖中1:VL片段;2:VL片段;M:DNAMarkerDL2000。
圖2為氯霉素Fab的檢測。圖中M:ProteinMolecularWeightMarker;1、2、3:純化后的氯霉素Fab。
圖3為輕鏈可變區測序結果與質譜的比對。圖中Sequence為VL的氨基酸序列,1、2、3、4為質譜測序結果。
圖4為重鏈可變區測序結果與質譜的比對。圖中Sequence為VH的氨基酸序列,1、2、3、4、5、6為質譜測序結果。
圖5為單鏈抗體基因(scFv)的擴增。1、2:scFv;M:DNAMarkerDL2000。
圖6為PCR篩選scFv-pMD18-T陽性克隆。1-18:PCR篩選結果;M:DNAMarkerDL2000。
圖7為PCR篩選重組表達質粒。M:DNAMarkerDL2000;1-10:PCR篩選結果。
圖8為重組表達質粒的酶切驗證。M1:DNAMarkerDL2000;M2:DNAMarker1kb;1-4:重組表達質粒的酶切。
圖9為氯霉素單鏈抗體的誘導表達。M:標準蛋白分子量;1:CAPscfv-pLIP6/GN-BL21誘導前;2、3、4、5、6:CAPscfv-pLIP6/GN-BL21不同克隆菌株誘導后
圖10為單鏈抗體表達形式的檢測。M:ProteinMolecularWeightMarker;1:CAPscfv-pLIP6/GN-BL211號誘導前;2:CAPscfv-pLIP6/GN-BL211號誘導后;
3:CAPscfv-pLIP6/GN-BL211號破碎后上清;4:CAPscfv-pLIP6/GN-BL211號破碎后沉淀;
5:CAPscfv-pLIP6/GN-BL215號誘導后;6:CAPscfv-pLIP6/GN-BL215號破碎后上清;
7:CAPscfv-pLIP6/GN-BL215號破碎后沉淀。
圖11為單鏈抗體純化后的檢測。M:ProteinMolecularWeightMarker;1: CAPscfv-pLIP6/GN-BL211號誘導前;2:CAPscfv-pLIP6/GN-BL211號誘導后;2:CAPscfv-pLIP6/GN-BL211號純化后。
圖12為單鏈抗體的活性檢測。
具體的實施方式
為了理解本發明,下面結合實施例對本發明作進一步說明:下述實施例是說明性的,不是限定性的,不能以下述實施例來限定本發明的保護范圍。
為了實現本發明目的,申請人利用重組DNA技術,將針對氯霉素具有廣譜特異性的鼠源雜交瘤細胞株10A3B6E的抗體重鏈、輕鏈可變區基因進行體外擴增,經過大量測序后,將測序結果與Fab形式抗體的質譜結果進行序列比對,篩選出目標基因。
本發明利用融合表達技術,獲得了具有氯霉素特異識別活性的單鏈抗體(scFv)。經過重疊延伸PCR,用15個氨基酸(氨基酸序列(GGGGS)3,基因序列GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG))組成的柔性連接肽將篩選到的重鏈、輕鏈連接成scFv抗體基因片段,并將所得的scFv基因片段插入到pLIP6/GN表達載體上,構建重組質粒并化學轉化至表達型宿主菌中,獲得了融合表達的抗氯霉素scFv抗體。
本發明還提供了氯霉素抗體基因重鏈可變區和輕鏈可變區序列,分別如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2;以及scFv重鏈、輕鏈的氨基酸序列,如序列18和序列19。
本發明還提供了借助NCBI設計的兼并引物,用于擴增上述基因。其中輕鏈擴增引物除了常用的kappa鏈引物還引入了lambda鏈引物,以覆蓋抗體可變區的多樣性。
本發明還提供了含有上述基因的載體和載體的宿主細胞。本發明還提供了上述scFv抗體、編碼該抗體的基因、含有該基因的載體、含有該載體的宿主細胞在制備抗氯霉素scFv抗體中的應用。
以下實施例中的實驗方法,如無特殊說明,均為常規方法。
以下實施例中使用的試劑材料,如無特殊說明,均為常規生化試劑供應商購買得到。
以下實施例中由于氯霉素通用半抗原在合成時簡稱為CAP,所以以下相應細胞、基因、菌種等提到有關了氯霉素時均簡稱為CAP。
實施例1:CAP單克隆細胞總RNA的提取及cDNA的合成
1、CAP單克隆細胞株10A3B6E總RNA的提取
取通過本實驗室篩選得到的新鮮單克隆細胞株10A3B6E,利用QigenRneasyMiniKit提總RNA,細胞株10A3B6E可產生抗CAP的單克隆抗體。
⑴培養細胞至3-4×106個,300×g離心5min,移去上清;
⑵配制裂解液:BufferRLT:β-巰基乙醇=1ml:10μl;
⑶向離心后的細胞中加入350μlBufferRLT裂解緩沖液,輕彈管壁,用移液槍吹打,使緩沖液與細胞充分接觸;
⑷加入同等體積的70%的乙醇溶液,移液槍輕輕吸打混勻,注意不要離心;
⑸取QigenRneasyMiniKit中的硅膠柱,裝入2ml收集管上,轉移所有的樣品到柱子中,室溫下12000rpm離心15s,棄去廢液;
⑹加入700μlBufferRW1到柱中,室溫下12000rpm離心15s,棄去流出液;
⑺加入500μl用乙醇稀釋的RPE緩沖液,洗滌柱子,10000rpm,離心15s,棄上清;
⑻加入500μlRPE緩沖液移入柱子,輕蓋蓋子,室溫下10000rpm,離心2min,沖洗柱子;
⑼把柱子放入一個試劑盒提供的新2ml收集管中,全速離心1min;
⑽把柱子轉移到QigenRneasyMiniKit提供的1.5ml離心管中,取50μl的無RNA酶水(試劑盒提供)小心懸空滴加到柱子的膜上,靜置3-5min,輕輕蓋上蓋子,室溫下10000rpm離心1min,洗脫RNA;
⑾洗脫的RNA分裝、標記后,凍存于-80℃。
2、CAP-cDNA的合成
⑴添加以下組分到1.5ml離心管:

⑵合好蓋,將離心管放入70℃水浴5min,然后立即放到冰上,至少5min,離心10s收集濃縮物保持原始體積,一直放冰上;
⑶準備反轉錄體系,各組分一直放冰上;


⑷上一步準備的反應體系與第一步的反應體系混合,終體積20μl;
⑸退火:25℃,5min;
⑹延伸:42℃,1h;
⑺分裝,-80℃凍存。
實施例2:CAP-scFv表達質粒的構建
1、PCR擴增VH、VL
所用引物:(VL后引物和scFv后引物為引物在使用時均為等量使用)


其中K為kappa引物,L為lambda引物,用kappa前引物也能擴增lambda鏈,所以沒有單獨的lambda前引物。


PCR體系(50μl):
PCR程序:

經PCR擴增,產物利用瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果如圖1所示。
2、利用Qiagen凝膠純化試劑盒膠回收目的片段
⑴準備干凈的離心管,稱重;
⑵用干凈的刀片切下瓊脂糖凝膠上的目的片段,放入離心管中;
⑶稱重,計算切下的膠重量,加入3倍體積的BufferQG到1倍體積凝膠中;
⑷50℃孵育,10min,直至膠完全溶解,每隔2-3min顛倒一次;
⑸膠完全溶解后,檢查溶液顏色是否為黃色,如溶液顏色成橘黃色或紫色,加10ul3M醋酸鈉混勻;
⑹加一倍凝膠體積異丙醇到溶液中,混勻(100mg-100ul異丙醇);
⑺將試劑盒中的硅膠柱子放到2ml收集管;
⑻結合DNA:將溶液加到柱子上,離心1min,13000rpm(溶液體積超過800ul再離心一次);
⑼倒盡流出液,將柱子再放回到離心管中;
⑽加0.5mlBufferQG到柱子上,離心1min,13000rpm;
⑾洗脫:倒盡流出液,加入750ulBufferPE到柱子上,離心1min;
⑾倒盡流出液,離心1min,13000rpm;
⑿將柱子放到一個干凈的1.5ml離心管;
⒀洗提DNA,加50ulBufferEB或pH為7.0-8.5水到膜中間,離心1min;
3、利用eppendorfBio-PhotoMeterplus測定VH和VL濃度
4、序列的測定與分析
(1)抗體的質譜鑒定
將氯霉素單克隆抗體進行純化,利用木瓜蛋白酶進行水解后,利用ProteinA吸附抗體恒定區,獲得純化的Fab,利用SDS-PAGE進行檢測(圖2),分別將重鏈和輕鏈切割下來進行質譜鑒定。
(2)抗體基因可變區的序列測定
將重鏈可變區和輕鏈可變區連接到T載體中,進行規模化測序,每種片段測序20-30個克隆,將測序獲得的核酸序列翻譯成氨基酸序列,與質譜測序結果,進行比對(圖3、4)。根據比對結果,選擇與質譜測序結果最相近的VH15號和VL1號繼續后續實驗。
5、CAP-scFv合成
(1)預拼接體系:

PCR程序:

所得PCR產物用于scFv的正式拼接。
(2)scFv正式拼接體系


PCR程序:

經PCR擴增,產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果見圖5。切取約750bp左右的目的條帶,用Qiagen凝膠純化試劑盒膠回收,eppendorfBio-PhotoMeterplus測定濃度,-20℃保存。
6、亞克隆實驗
A.scFv連接pMD18-Tvector
連接體系:

16℃連接16h。
B.連接產物轉化JM109感受態細胞
(1)將100μLJM109感受態細胞放置冰上解凍。
(2)將連接產物10μL加入到50μL感受態細胞中,輕輕混勻后放置冰上30min。
(3)將混合物42℃水浴60s,然后迅速放置冰上冷卻2min,注意不可晃動。
(4)加入800μLLB液體培養基,37℃,200rpm振蕩培養1h。
(5)5000rpm,離心5min,倒掉培養基,大約留100μL涂布含有抗生素Amp的LB固體培養基平板上,37℃生長過夜。
C.驗證陽性克隆
挑取Amp平板上的單克隆菌落于10μL無菌水中重懸,用M13通用 引物做菌落PCR實驗。結果見圖6。
(1)PCR體系:

(2)PCR擴增程序:

(3)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。
D.獲得重組質粒scFv-pMD18-T
(1)挑取Amp平板上的單克隆,轉接到LB液體培養基中,37℃,200rpm,過夜培養。
(2)天根質粒小提試劑盒提取重組質粒scFv-T,步驟如下:
①柱平衡步驟:將吸附柱放入收集管,向吸附柱中加入500μL平衡液BL,13000rpm離心1min,吸棄收集管中廢液,將吸附柱放回收集管中。
②取1-5mL過夜培養的菌液,加入到離心管中,13000rpm離心1min,盡量吸棄上清,菌液較多,可分多次離心后將菌體收集到同一離心管中。
③向含有菌體沉淀的離心管中加入250μLBufferP1(BufferP1在使用之前要確保已加入RNaseA),使用移液器吹打或渦旋徹底懸浮細菌沉淀,如果菌體為徹底混勻,會影響裂解,導致提取量和純度偏低。
④繼續向離心管中加入250μLBufferP2,上下翻轉混勻6-8次,操作要溫和,確保菌體充分裂解,此時菌液會變得清亮粘稠,所用時間不 要超過5min,以免質粒受到損傷。
⑤向離心管中加入350μLBufferP3,立即溫和地上下翻轉6-8次,此時會出現白色絮狀沉淀,13000rpm離心10min。
⑥小心吸取上清,注意不要吸到沉淀,將上清加入到吸附柱中
⑦13000rpm離心1min,吸棄收集管中廢液,吸附柱放回收集管。
⑧向吸附柱中加700μLBufferPW(BufferPW使用之前要加入無水乙醇),13000rpm離心1min,吸棄收集管中廢液,將吸附柱重新放回收集管中。
⑨向吸附柱中加入500μLBufferPW(請檢查是否已加入無水乙醇),13000rpm離心1min,吸棄收集管中廢液,將吸附柱重新放回收集管。
⑩13000rpm離心2min,吸棄收集管中廢液。將吸附柱開蓋置于室溫10min,以徹底晾干吸附膜上殘余的BufferPW。
⑾取吸附柱放置于干凈的離心管中,向吸附膜中間部位懸空滴加50μL無菌水,室溫放置1-2min,13000rpm離心1min,將質粒溶液收集到離心管中,-20℃保存質粒。
7、CAP-scFv-pLIP6/GN表達質粒的構建
A.scFv-pMD18-T重組質粒與pLIP6/GN空質粒的雙酶切。
(1)用限制性內切酶SfiI酶切scFv-T,酶切體系如下:

50℃水浴溫育過夜。
(2)用限制性內切酶NotI繼續酶切scFv-T,將上一步酶切體系取
出水浴鍋,冷卻至室溫,向體系中加入1μLNotI,37℃水浴溫育1.5h。
(3)scFv連接pLIP6/GN
連接體系:

16℃連接16h。
B.連接產物轉化JM109感受態細胞
(1)將100μLJM109感受態細胞放置冰上解凍。
(2)將連接產物10μL加入到50μL感受態細胞中,輕輕混勻后放置冰上30min。
(3)將混合物42℃水浴60s,然后迅速放置冰上冷卻2min,注意不可晃動。
(4)加入800μLLB液體培養基,37℃,200rpm振蕩培養1h。
(5)5000rpm,離心5min,倒掉培養基,大約留100μL涂布含有抗生素Amp的LB固體培養基平板上,37℃生長過夜。
C.驗證陽性克隆
(1)菌落PCR驗證
①挑取Amp平板上的單克隆菌落于10μL無菌水中重懸,用phoA通用引物做菌落PCR實驗。
②PCR體系:

③PCR擴增程序:

④瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。結果見圖7。
(2)酶切驗證
提取菌落PCR驗證為陽性的單克隆的質粒,用SfiI和NotI雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物。結果見圖8。
(3)測序
驗證正確的菌種接種于LB-Amp中過夜培養。菌液送至北京金維智生物公司測序,所用引物為phoA。最后利用MEGA5軟件將測序結果同已知的VH15號、VL1號和Linker序列進行對比,scFv基因序列一致的菌株即為CAPscFv-pLIP6/GN-BL21菌株。
實施例3:CAP-scFv-pLIP6/GN表達載體的重組表達
1、BL21(DE3)感受態細胞的制備
(1)將-80℃保存的BL21(DE3)菌種在LB固體平板上劃線,37℃倒置培養過夜。
(2)挑取單克隆,接種于5mLLB液體培養基中,37℃,180rpm,培養過夜。
(4)取100μL過夜培養的菌液,轉接至100mLPsi培養基中,37℃振蕩培養3h左右,至OD600為0.4-0.5左右。
(5)將菌液轉至100mL無菌離心管中,冰上放置30min。4℃,4000rpm離心3min。
(6)棄上清,加入80mLtfbⅠ,用移液器輕輕吹打,充分重懸細胞,置于冰上20min。4000rpm4℃離心3min。
(7)棄上清,加入10mLtfbⅡ,用移液器輕輕吹打,充分重懸細胞,置于冰上20min。在冰盒上100μL分裝,液氮速凍,存于-80℃冰箱備用。
2、表達菌株的制備
將6個重組質粒CAPscFv1、2、3、4、5、6-pLIP6/GN分別轉入表達菌大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中。挑取轉化平板上生長的單克隆,接種于LB-Amp培養基中進行37℃過夜培養。
3、誘導表達及SDS-PAGE檢測
A.CAPscFv-pLIP6/GN-BL21的誘導表達
取50μL過夜培養的菌液,按1:100比例轉接到新的5mLLB培養液(含100μg/mLAmp)中,培養3h左右,至OD600達到0.8-1.0時加入IPTG至終濃度為0.1mM,25℃180rpm培養過夜,進行scFv誘導表達。
B.進行超聲破碎和SDS-PAGE檢測。
為了檢測CAPscFv在大腸桿菌BL21(DE3)中是否能進行正常表達,利用SDS-PAGE進行檢測,并探究了目的蛋白的表達位置及是否形成包涵體。SDS-PAGE步驟如下:
(1)樣品前處理
取誘導前的500μL菌液,5000rpm離心5min,取200μL用PBS重懸,作為誘導前對照;剩余4.5mL誘導后培養物,5000rpm離心5min,去上清,菌體用2.5mLPBS進行重懸。取其中500μL菌液保存于4℃,即誘導后全蛋白。剩余2mL在冰水混合物中進行超聲破碎。條件:超聲1s、間歇3s,全程99次,功率250W。
將超聲破碎的菌液在4℃,13000rpm離心8min,收集上清和沉淀,沉淀用2mLPBS重懸。分別取15μL誘導前后菌液、破碎上清和沉淀于PCR管中,加入12μL2×SDS-PAGE上樣緩沖液和3μLβ-巰基乙醇,混勻,用沸水煮5min,備用。
(2)聚丙烯酸胺凝膠的制備:
12%分離膠:水1.6mL,30%丙烯酰胺2mL,1.5MTris-HCl(pH=8.3)1.3mL,10%SDS50μL,10%過硫酸銨50μL,TEMED4μL。各組分添加后迅速混勻,加入組裝好的制膠板中,待加到膠板約2/3高度時,在其上層用異丙醇封住,封至整個膠板頂端。室溫放置1h左右(視室溫而定),將膠板整體傾斜,觀察是否凝固,若凝固去除異丙醇,用濾紙吸干,取干凈的梳子插入制膠板縫隙。
6%濃縮膠:水1.4mL,30%丙烯酰胺0.33mL,1.5MTris-HCl(pH=6.8)0.25mL,10%SDS20μL,10%過硫酸銨20μL,TEMED4μL。各組分添加后立即混勻,沿著梳子縫隙灌膠,到膠快裝滿時輕輕壓下梳子,趕走氣泡,室溫放置40min。輕輕晃動梳子,觀察濃縮膠是否凝固,待凝固后拔去梳子,即完成制膠過程。
(3)SDS-PAGE:
按照電泳儀說明書將凝膠板固定在支架上,放入電泳槽中,加入1×電泳緩沖液。負極處加電泳液至沒過上樣孔,正極處至沒過正極,用上樣針將3個菌體的誘導前、后,破碎上清、沉淀樣品依次加入上樣孔中,各15μL。在樣品左側上10μL蛋白Marker。將電泳裝置與電源連接,先用80V電壓將溴酚藍條帶跑過濃縮膠和分離膠的交界處,然后用100V電壓跑膠至溴酚藍條帶離膠板底部0.5cm處,停止電泳。
(4)染色和脫色
電泳完畢后將裝置小心拆卸,凝膠置于200mL考馬斯亮藍R-250染色液中染色,室溫輕搖過夜。轉天,將凝膠用無菌水沖洗干凈,脫色兩次。每次用100mL脫色液(甲醇7mL,乙醇30mL,水63mL)脫色10min,至條帶清晰后利用成像儀成像。結果見圖9、10。
C.純化CAPscFv抗體
用Ni-NTA柱純化超聲破碎后的上清。步驟如下:
(1)所用試劑在使用之前均需超聲15分鐘,以去除溶液中的氣泡。
(2)10mL1*BindBuffer緩慢加入柱子中,4℃下靜置30分鐘。
(3)打開兩端的塞子,讓液體緩慢流出,加入超聲破碎后的上清液5mL,4℃下靜置60分鐘。
(4)打開兩端的塞子,讓液體緩慢流出,加入10mL1*washingbuffer,收集流出液。
(5)加入4mL1*elutionbuffer,收集流出液。
D.SDS-PAGE檢測純化后的蛋白。結果見圖11。條帶單一的泳道對應的蛋白樣品在4℃下,用PBS透析3天。
實施例4:間接競爭ELISA檢測CAPscFv
利用間接競爭ELISA對純化后的CAPscFv活性進行初步鑒定。包被原為CAP-OVA,封閉液為0.5%的乳粉,氯霉素作為標準品。計算IC50值。間接競爭ELISA步驟如下:
(1)包被:取CAP-OVA,0.1μg/孔包被96孔酶標板12-16h。
(2)洗板:傾去包被液,PBST洗3次,拍干。
(3)封閉:每孔加入200μL,0.5%的乳粉,37℃封閉1h。
(4)洗板:傾去封閉液,PBST洗3次,拍干。
(5)向酶標板中分別加入標準品50μL。
(6)加抗體:將純化后的CAPscFv稀釋6倍,取50μL加入到各濃度標準品的酶標板中,37℃孵育1h。
(7)洗板:傾去scFv抗體上清液,PBST洗4次,拍干。
(8)顯色:加AP顯色底物pNPP,100μL/孔,37℃顯色20min。
(9)終止:加3MNaOH終止液,50μL/孔,在405nm波長下用酶標儀讀取OD405數值。
經過間接競爭ELISA,CAPscFv用PBS稀釋6倍,顯色20min。ELISA結果如下:

氯霉素標準溶液從500ng/mL向下四倍稀釋六個濃度,用間接競爭ELISA法進行測定。根據吸光度值計算抑制率,建立了如圖12所示的ELISA方法的標準抑制曲線,由四個點可得到一個線性回歸方程y=15.733ln(x)+32.868(R2=0.9988),通過計算得到檢測靈敏度(IC50值)為2.97±0.52ng/mL、檢測限(IC15值)為0.33±0.11ng/mL,這一檢測靈敏度可用于食品樣品中氯霉素殘留的初步篩查。










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