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龍葵金屬硫蛋白表面展示工程菌的構建方法及用途.pdf

摘要
申請專利號:

CN201510579521.1

申請日:

2015.09.11

公開號:

CN105177035A

公開日:

2015.12.23

當前法律狀態:

實審

有效性:

審中

法律詳情: 實質審查的生效IPC(主分類):C12N 15/81申請日:20150911|||公開
IPC分類號: C12N15/81; C12N1/19; C02F3/34; C12R1/865(2006.01)N; C02F101/20(2006.01)N 主分類號: C12N15/81
申請人: 曲阜師范大學
發明人: 張洪海; 韋欽國; 郭東革; 馬士勝; 田李
地址: 273165 山東省濟寧市曲阜市靜軒西路57號
優先權:
專利代理機構: 濟南泉城專利商標事務所 37218 代理人: 劉麗
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201510579521.1

授權公告號:

|||

法律狀態公告日:

2016.01.20|||2015.12.23

法律狀態類型:

實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及工程菌株構建技術領域,特別涉及一種龍葵金屬硫蛋白表面展示工程菌的構建方法,提取龍葵金屬硫蛋白基因,以pYES2為出發載體,將載體上的誘導型啟動子替換為組成型表達啟動子,分別連接釀酒酵母的分泌信號肽基因和釀酒酵母錨定蛋白凝集素基因,將龍葵金屬硫蛋白基因連在分泌信號肽基因和凝集素基因之間,表達載體轉入大腸桿菌,提取載體質粒,轉入釀酒酵母。本發明構建的龍葵金屬硫蛋白表面展示工程菌,對Cd2+具有更強的吸附能力;對鎘耐受能力也得到了顯著的提升;吸附超痕量重金屬的能力顯著高于野生型酵母株和對照菌株;受pH影響小;能在Cd2+和Cu2+或Cd2+者Hg2+共存的情況下吸附重金屬鎘。

權利要求書

權利要求書
1.  一種龍葵金屬硫蛋白表面展示工程菌的構建方法,其特征在于提取龍葵金屬硫蛋白基因,以pYES2為出發載體,將載體上的誘導型啟動子替換為組成型表達啟動子,將釀酒酵母的分泌信號肽基因連在組成型啟動子之后,將釀酒酵母錨定蛋白凝集素基因的3’端序列連在啟動子之后,將獲得的龍葵金屬硫蛋白基因連在分泌信號肽基因和凝集素基因之間,將構建好的表達載體轉入大腸桿菌擴增得組成型表達表面展示載體,提取載體質粒,轉入釀酒酵母。

2.  根據權利要求1所述的構建方法,其特征在于提取龍葵金屬硫蛋白基因包括以下步驟:
(1)提取龍葵的RNA,
(2)通過反轉錄得到龍葵的cDNA,
(3)以cDNA為模板,通過PCR的方法擴增出龍葵的金屬硫蛋白基因,
(4)瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收,連接T載體,轉化大腸桿菌,
(5)挑選陽性克隆,培養,菌液PCR,測序確定,
(6)質粒提取,
(7)酶切獲得帶酶切位點的龍葵金屬硫蛋白基因片段。

3.  根據權利要求1所述的構建方法,其特征在于構建表達載體操作如下:
(1)以釀酒酵母穿梭表達載體pYES2為出發載體,將pYES2上的誘導型啟動子GAL1替換為釀酒酵母組成型強啟動子,丙糖磷酸異構酶啟動子TPI,得到組成型表達載體pYES2-Tpi
(2)以質粒pPIC9K為模板,以帶有MfeⅠ和SpeⅠ酶切位點的酵母分泌信號肽基因alphafactor擴增引物Alphafactor-Forward和Alphafactor-Reverse,PCR擴增出酵母分泌信號肽基因alphafactor,用MfeⅠ和SpeⅠ酶切消化獲取的分泌信號肽段alphafactor,連接到經過EcoRⅠ和XbaⅠ酶切消化的釀酒酵母組成型表達載體pYES2-Tpi上,得到重組質粒pYES2-Tpi-alpha;
(3)以釀酒酵母基因組DNA為模板,以帶有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點的釀酒酵母錨定序列凝集素3’端序列AG擴增引物AGα1-Forward和AGα1-Reverse,進行PCR擴增,用EcoRⅠ和NotⅠ酶切消化獲取的錨定序列凝集素3’端序列AG,連接到同樣經過EcoRⅠ和NotⅠ酶切消化的pYES2-Tpi-alpha上,經菌落PCR篩選和測序分析得重組質粒pYES2-Tpi-alpha-AG;
(4)將龍葵金屬硫蛋白基因,連接到經EcoRI和MluI消化的重組質粒pYES2-Tpi-alpha-AG上;
上述操作中用到的引物序列如下:
Primer IDSequenceRestriction SiteTPI-ForwardGCACTAGTATATGACAGAGTCGC SpeTPI-ReverseCGAATTCCTGTATGTGTTTTTTG EcoRⅠAlphafactor-ForwardTCCAATTGATGAGATTTCCTTC MfeAlphafactor-ReverseGAACTAGTTCGCGGCCGCCCTA SpeⅠ、NotAGα1-ForwardGGAATTCCTCTAGACGCGTCGCCAAAAGC EcoRⅠ、MluAGα1-ReverseGCGTGCGGCCGCTTTGATTATGTTCTTTCTAT Not


4.  根據權利要求3所述的構建方法,其特征在于步驟(1)中是以釀酒酵母DNA為模板,以帶有SpeI和EcoRI的引物TPI-Forward和TPI-ReversePCR擴增出丙糖磷酸異構酶啟動子基因,然后用SpeI和EcoRI酶切消化基因片段,連接到經過SpeI和EcoRI消化的pYES2上。

5.  根據權利要求1-4中任一項所述的構建方法,其特征在于提取表達載體,轉入釀酒酵母的操作包括:
(1)制備釀酒酵母感受態細胞;
(2)載體質粒電擊轉化入釀酒酵母感受態細胞;
(3)對步驟(2)得到的細胞進行培養。

6.  一種權利要求1-5中任一項所述的構建方法所得到的龍葵金屬硫蛋白表面展示工程菌在吸附重金屬鎘中的用途。

7.  根據權利要求6所述的用途,其特征在于將龍葵金屬硫蛋白表面展示工程菌接種到含有Cd2+的環境中,對Cd2+進行吸附。

8.  根據權利要求7所述的用途,其特征在于龍葵金屬硫蛋白表面展示工程菌在Cd2+濃度小于等于0.5mM的環境中接種。

說明書

說明書龍葵金屬硫蛋白表面展示工程菌的構建方法及用途
技術領域
本發明涉及工程菌株構建技術領域,特別涉及一種龍葵金屬硫蛋白表面展示工程菌的構建方法,還涉及龍葵金屬硫蛋白表面展示工程菌的用途。
背景技術
隨著工業的飛速發展,各種重金屬離子通過各種工業途徑釋放到環境中。由于重金屬具有強毒性,不可降解性和食物鏈富集性,因此重金屬的環境污染問題得到越來越多的重視(NriaguandPacyna1988;DhankharandHooda2011)。而且,攝入過量的重金屬會對人的健康造成各種各樣的危害(Wuetal.2004;Batayneh2012)。許多處理重金屬的方法,例如離子轉換,物理滲透,化學沉淀,活性炭吸附,電凝固,電滲析,超過率和溶劑萃取等多種方法被很多的人研究(Holanetal.1993;Ariefetal.2008)。但是,通常的物理和化學方法有成本高,去除不徹底,二次污染和專一性不強等缺點(Davisetal.2003;Dabrowskietal.2004;AkbalandCamci2012)。更多的科學家轉向生物吸附劑的研究。(Hammainietal.2002;KurodaandUeda2003,2006;Ariefetal.2008;KotrbaandRuml2010;Kurodaetal.2012;Parisuthametal.2014;TanakaandKondo2015)。
鎘是一種被工業廣泛應用,但對人健康又有危害的一種重金屬(Pirzadeh,etal.2012)。由于它有通過生物鏈富集的特性,因此,人們經常通過食物間接的攝入過量的鎘而造成對身體健康的危害(Alexanderetal.2009)。為了去除環境中的鎘污染,科學家做了很多的研究。(GaddandWhite1993;TanakaandKondo2015)。利用微生物,特別是表面展示工程菌作為吸附劑,來去除鎘污染,也許會成為一種有效可行的方法。
發明內容
為了解決以上現有技術中去除環境中重金屬常用的物理和化學方法成本高、去除不徹底、二次污染和專一性不強等缺點,本發明提供了一種利用微生物,可以吸附鎘的龍葵金屬硫蛋白表面展示工程菌的構建方法。
本發明還提供了龍葵金屬硫蛋白表面展示工程菌的用途。
龍葵是一種鎘超富集植物,這一特征與它的金屬硫蛋白有著密切的關系(Ferrazetal.2012)。但是,至今還沒有人將龍葵的金屬硫蛋白展示在釀酒酵母表面,來構建鎘吸附工程菌。為了提高釀酒酵母對鎘的吸附能力和耐受能力,我們首次將龍葵的一種金屬硫蛋白,通過表面展示技術成功的展示在了釀酒酵母的表面。成功的構建出了一種高效吸附重金屬鎘的工程 菌,對其吸附性能研究表明,在鎘污染處理領域有廣闊的應用前景。
本發明是通過以下步驟得到的:
一種龍葵金屬硫蛋白表面展示工程菌(以下簡稱表面展示菌株)的構建方法,其特征在于提取龍葵金屬硫蛋白基因,以pYES2為出發載體,將載體上的誘導型啟動子替換為組成型表達啟動子,將釀酒酵母的分泌信號肽基因連在組成型啟動子之后,將釀酒酵母錨定蛋白凝集素基因的3’端序列連在啟動子之后,將獲得的龍葵金屬硫蛋白基因連在分泌信號肽基因和凝集素基因之間,將構建好的表達載體轉入大腸桿菌擴增得組成型表達表面展示載體,提取載體質粒,轉入釀酒酵母。
所述的構建方法,優選提取龍葵金屬硫蛋白基因包括以下步驟:
(1)提取龍葵的RNA,
(2)通過反轉錄得到龍葵的cDNA,
(3)以cDNA為模板,通過PCR的方法擴增出龍葵的金屬硫蛋白基因,
(4)瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收,連接T載體,轉化大腸桿菌,
(5)挑選陽性克隆,培養,菌液PCR,測序確定,
(6)質粒提取,
(7)酶切獲得帶酶切位點的龍葵金屬硫蛋白基因片段。
所述的構建方法,優選構建表達載體操作如下:
(1)以釀酒酵母穿梭表達載體pYES2為出發載體,將pYES2上的誘導型啟動子GAL1替換為釀酒酵母組成型強啟動子,丙糖磷酸異構酶啟動子TPI,得到組成型表達載體pYES2-Tpi;
(2)以質粒pPIC9K為模板,以帶有MfeⅠ和SpeⅠ酶切位點的酵母分泌信號肽基因alphafactor擴增引物Alphafactor-Forward和Alphafactor-Reverse,PCR擴增出酵母分泌信號肽基因alphafactor,用MfeⅠ和SpeⅠ酶切消化獲取的分泌信號肽段alphafactor,連接到經過EcoRⅠ和XbaⅠ酶切消化的釀酒酵母組成型表達載體pYES2-Tpi上,得到重組質粒pYES2-Tpi-alpha;
(3)以釀酒酵母基因組DNA為模板,以帶有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點的釀酒酵母錨定序列凝集素3’端序列AG擴增引物AGα1-Forward和AGα1-Reverse,進行PCR擴增,用EcoRⅠ和NotⅠ酶切消化獲取的錨定序列凝集素3’端序列AG,連接到同樣經過EcoRⅠ和NotⅠ酶切消化的pYES2-TPI-alpha上,經菌落PCR篩選和測序分析得重組質粒pYES2-Tpi-alpha-AG。
(4)將龍葵金屬硫蛋白基因,連接到經EcoRI和MluI消化的重組質粒pYES2-Tpi-alpha-AG上;
上述操作中用到的引物序列如下:

所述的構建方法,優選步驟(1)中是以釀酒酵母DNA為模板,以帶有SpeI和EcoRI的引物TPI-Forward和TPI-ReversePCR擴增出丙糖磷酸異構酶啟動子基因,然后用SpeI和EcoRI酶切消化基因片段,連接到經過SpeI和EcoRI消化的pYES2上。
所述的構建方法,優選提取表達載體,轉入釀酒酵母的操作包括:
(1)制備釀酒酵母感受態細胞;
(2)載體質粒電擊轉化入釀酒酵母感受態細胞;
(3)對步驟(2)得到的細胞進行培養。
所述的構建方法所得到的龍葵金屬硫蛋白表面展示工程菌在吸附重金屬鎘中的用途。
將龍葵金屬硫蛋白表面展示工程菌接種到含有Cd2+的環境中,對Cd2+進行吸附。
龍葵金屬硫蛋白表面展示工程菌在Cd2+濃度小于等于0.5mM的環境中接種。
首次通過a凝集素表面展示系統將龍葵(Solanumnigrum)金屬硫蛋白(metallothionein)展示在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的細胞表面。通過RT-PCR的方法獲得鎘超富集植物龍葵的一種金屬硫蛋白基因,命名為SMT2agene,用pYES2作為構建表面展示的載體。通過電轉化的方法將表達載體轉入釀酒酵母,實現了龍葵金屬硫蛋白在釀酒酵母中的組成型表達,并將其成功的展示在了釀酒酵母的表面。獲得了一種高效吸附重金屬鎘的工程酵母菌。
本發明的有益效果:
1、本發明構建的龍葵金屬硫蛋白表面展示工程菌,鎘吸附能力顯著高于野生型酵母株和對照菌株,對Cd2+具有更強的吸附能力;
2、本發明構建的龍葵金屬硫蛋白表面展示工程菌,對鎘耐受能力也得到了顯著的提升;
3、本發明構建的龍葵金屬硫蛋白表面展示工程菌,吸附超痕量重金屬的能力顯著高于野 生型酵母株和對照菌株;
4、本發明構建的龍葵金屬硫蛋白表面展示工程菌能在較大的pH范圍內有效吸附重金屬鎘;
5、本發明構建的龍葵金屬硫蛋白表面展示工程菌能在Cd2+和Cu2+或Cd2+者Hg2+共存的情況下吸附重金屬鎘。
附圖說明
圖1為表面展示載體的結構;
圖2為酵母菌液PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果圖;
圖3為不同酵母菌在含有0.5mMCdSO4的培養基中的生長情況,▲本發明獲得的表面展示酵母菌;■對照酵母菌;◆野生型出發菌株;
圖4pH對Cd2+吸附性能的影響,柱狀圖中3個柱自左至右依次為出發菌株、對照菌株和表面展示菌株;
圖5.共存Cu2+離子對Cd2+吸附性能的影響,柱狀圖中3個柱自左至右依次為出發菌株、對照菌株和表面展示菌株;
圖6.共存Hg2+離子對Cd2+吸附性能的影響,柱狀圖中3個柱自左至右依次為出發菌株、對照菌株和表面展示菌株。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步說明:
實施例1
一、龍葵金屬硫蛋白基因的獲得
1、龍葵RNA的提取
取50-100mg植物組織,在液氮中磨成粉末后,按照購自Takara的RNA提取試劑盒RNAisoPlus操作說明提取龍葵的總RNA。
2、cDNA的合成
以龍葵的總RNA為模板,按照下述反應體系合成cDNA
5×ReverseTranscriptaseBuffer:4μL
dNTPmix(10mM):2μL
RNaseinhibitor(40U/μL):0.5μL
Oligo(dT)primer:0.5μL
AMVReverseTranscriptase:2μL
RNAtemplet:2μL
RNase-freeddH2O:定容至20μL
反應混合物37℃水浴60min,在70℃加熱10min結束反應,置冰上進行后續實驗或冷凍保存。
3、金屬硫蛋白基因的獲取
以cDNA為模板,通過PCR的方法擴增出龍葵的金屬硫蛋白基因,所用到的引物為(帶有EcoRI和MluI兩個酶切位點):
5’-GAATTCATGTCTTGCTGTGGAGGA-3’(EcoRIGAATTC)
5’-ACGCGTTTAGAGCAAGTGCAAGGG-3’(MluIACGCGT)。
4、帶有粘性末端基因的獲取
(1)對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收片段,然后將回收片段按照試劑盒方法連接T載體,熱擊轉化大腸桿菌,
(2)將轉化菌液涂LB平板,37℃恒溫培養至克隆產生,
(3)根據藍白斑,挑選陽性克隆,LB培養過夜,
(4)菌液PCR,對陽性克隆測序確定是金屬硫蛋白基因,
(5)按照購自Takara的質粒提取試劑盒,提取質粒,
(6)用EcoRI和MluI對提取的質粒進行酶切,獲得帶酶切位點的目的基因片段,命名為SMT2a。
二、組成型表達表面展示載體的構建
1、以釀酒酵母穿梭表達載體pYES2為出發載體,將pYES2上的誘導型啟動子GAL1替換為釀酒酵母組成型強啟動子,丙糖磷酸異構酶啟動子TPI。該段基因是以釀酒酵母DNA為模板,以帶有SpeI和EcoRI的引物(TPI-Forward和TPI-Reverse)PCR擴增出丙糖磷酸異構酶啟動子基因。然后用SpeI和EcoRI酶切消化基因片段,連接到經過SpeI和EcoRI消化的pYES2上。測序確定得到組成型表達載體pYES2-Tpi。
2、以質粒pPIC9K為模板,以帶有MfeⅠ和SpeⅠ酶切位點的酵母分泌信號肽基因alphafactor擴增引物(Alphafactor-Forward和Alphafactor-Reverse),PCR擴增出酵母分泌信號肽基因alphafactor,用MfeⅠ和SpeⅠ酶切消化獲取的分泌信號肽段alphafactor,連接到經過EcoRⅠ和XbaⅠ酶切消化的釀酒酵母組成型表達載體pYES2-Tpi上,得到重組質粒pYES2-Tpi-alpha。
3、以釀酒酵母基因組DNA為模板,以帶有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點的釀酒酵母錨定序列 凝集素3’端序列AG擴增引物(AGα1-Forward和AGα1-Reverse),以,進行PCR擴增將約1.5kb的PCR產物回收,并進行測序確定。用EcoRⅠ和NotⅠ酶切消化獲取的錨定序列凝集素3’端序列AG,連接到同樣經過EcoRⅠ和NotⅠ酶切消化的pYES2-Tpi-alpha上,經菌落PCR篩選和測序分析得重組質粒pYES2-Tpi-alpha-AG,命名為pYES2-display。
4、將上述獲得的龍葵金屬硫蛋白基因SMT2agene,連接到經EcoRI和MluI消化的重組質粒pYES2-TPI-alpha-AG上。經過測序確定,SMT正確的插入到了alohafactor和AG之間,符合預期的設計要求,得到組成型表達表面展示載體pYES2-Tpi-alpha-SMT-AG,命名為pYES2-display/SMT。結構如圖1所示。
5、將構建好的表達載體轉入大腸桿菌擴增,按照試劑盒的方法提取質粒,即得到組成型表達表面展示載體。
表1構建組成型表達載體用到的引物序列

三、酵母菌的轉化,篩選和驗證
1、釀酒酵母感受態細胞的制備
(1)、在含5mLYPD的50mL搖瓶中,培養釀酒酵母,30℃過夜
(2)、取0.1mL過夜培養物,接種在含50mL新鮮培養基的500mL搖瓶,過夜生長至OD600=1.5
(3)、在4℃,1500rcf離心5min收集細胞,用50mL預冷的滅菌水懸浮細胞
(4)、如上離心,用50mL預冷的滅菌水懸浮細胞
(5)、如上離心,用20mL預冷的1M山梨醇懸浮細胞
(6)、如上離心,用200μL預冷的1M山梨醇懸浮細胞,至終體積約300μL
2、電擊轉化感受態釀酒酵母
(1)、取80μL上述細胞與10ul質粒混合,轉入預冷的0.2cm電轉杯中
(2)、在冰上放置5min
(3)、電擊(條件為:2.0kV,20μF,250Ω,5.0ms)
(4)、立即加入1mL預冷的1M山梨醇至電轉杯中,將內容物轉移至滅菌離心管中
(5)、分成200-600μL等份,涂于SC平板上
(6)、在30℃孵育平板至克隆產生
3、釀酒酵母的培養
挑取單菌落接種在100ml的SC培養液中,30℃160rpm培養至穩定期,離心收集菌體。
4、表面展示酵母陽性的確定
對培養的釀酒酵母菌液做PCR鑒定和測序確定,鑒定是否轉化成功,PCR產物瓊脂糖凝膠電泳(見圖2),能擴增出條帶和測序正確的為陽性菌,可以進一步做性能鑒定。
四、工程菌性能的測定
1、吸附性能的測定
(1)、釀酒酵母在SC培養液中培養生長至穩定期
(2)、600g離心收集菌體,并用50mMHEPES(pH6.5)洗滌三次
(3)、將菌體按5g/L的量,接種到含有150μMCdSO4的50mMHEPES(pH6.5)
(4)、30℃,180rpm孵育兩小時
(5)、離心收集菌體,并用50mMHEPES(pH6.5)的緩沖液洗滌
(6)、將菌體冷凍干燥24小時后稱量干重
(7)、原子吸收方法測定溶液中剩余Cd2+的濃度
參照上面的實驗方法,對野生型(出發菌株,即未轉化表面展示載體的菌株)、對照菌株(轉化的表達載體同表面展示載體相比,無SMT2a基因的釀酒酵母菌株)和表面展示菌分別進行了吸附性能檢測實驗,實驗結果表明,表面展示工程菌的吸附能力比對照菌株和野生型菌株有顯著的提高。結果見表2
表2.酵母吸附Cd2+的能力

2、對Cd2+的耐受能力實驗
(1)、離心收集培養至穩定期的酵母,
(2)、將收集的菌體接種在新的含有0.5mM培養基中,至OD600=0.2,
(3)、在30℃和180rpm條件下培養,定時測定菌液的OD600。
耐受性研究結果表明,表面展示工程菌對Cd2+的耐受能力顯著高于對照菌株和野生型菌株。表明表面結合能力的提升,能有效的提高菌株對Cd2+的耐受能力。表面展示菌株能夠耐受0.5mM的Cd2+,而對照菌株和野生型菌株的耐受能力低于80μM(KurodaandUeda2003)。結果如圖3。
3、超痕量吸附實驗
實驗步驟同吸附性能的測定實驗,Cd2+的濃度改為100μg/L。超痕量吸附性能試驗結果表3顯示,表面展示工程菌對超痕量Cd2+去除率顯著高于對照菌株和野生型菌株。
表3不同酵母對超痕量Cd2+吸附

4、pH因素對吸附性能影響的實驗
實驗步驟同吸附性能的測定實驗,緩沖液的pH分別為3,4,5,6,7。如圖4,在不同pH值下的吸附實驗表明,表面展示酵母菌的吸附能力受pH的影響較小,隨著pH的變化,吸附能力的變化較小。
5、共存離子對吸附性能影響的實驗
緩沖液中共存離子Cu2+或Hg2+的濃度梯度分別為5mg/L,10mg/L,15mg/L,20mg/L,25mg/L,其余實驗步驟同吸附性能測定實驗。在考查Cu2+和Hg2+的影響時發現,這兩種的任何一種離子存在時,表面展示酵母都表現出對Cd2+吸附的偏好性,見圖5、6,說明,構建的表面展示酵母有吸附Cd2+的偏好性和特異性。而其他兩個菌株,緩沖液中共存離子Cu2+或Hg2+的濃度增加,明顯影響其吸附Cd2+的效率,而且影響程度比較大。
上述實施例為本發明較佳的實施方式,但本發明的實施方式并不受實施例的限制,其它任何未背離本發明的精神實質與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應為等效替換方式,都包含在本發明的保護范圍之內。

關 鍵 詞:
金屬 蛋白 表面 展示 工程 構建 方法 用途
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