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一種用于磷酸肽富集的聚胍基離子液體材料的制備方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201510591262.4

申請日:

2015.09.16

公開號:

CN105175588A

公開日:

2015.12.23

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C08F 12/26申請日:20150916|||公開
IPC分類號: C08F12/26; C08F26/02 主分類號: C08F12/26
申請人: 天津科技大學
發明人: 鄧啟良; 顧雨辰; 李燕麗
地址: 300222 天津市河西區大沽南路1038號天津科技大學
優先權:
專利代理機構: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209 代理人: 韓曉梅
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201510591262.4

授權公告號:

||||||

法律狀態公告日:

2018.09.18|||2016.01.20|||2015.12.23

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及一種用于磷酸肽富集的聚胍基離子液體材料的制備方法,步驟如下:在乙腈溶液中加入1,1,3,3-四甲基胍和含乙烯基的鹵單體,常溫反應,干燥,即得胍基離子液體功能單體;將功能單體與交聯劑和引發劑溶于乙腈中,得到混合液,向混合液中通入氮氣除氧;在水浴下引發聚合,將固體材料用蒸餾水洗滌、抽濾、干燥,即得用于磷酸肽富集的聚胍基離子液體材料。本方法制得的胍基聚離子液體材料生物相容性好、分散性好,材料粒徑均一,對磷酸肽具有較強的吸附性能,對磷酸肽的富集效率高,性能穩定,可以實現重復利用,可以重復利用至少五次,在室溫干燥的環境中放置1年后,仍能用于對磷酸肽的富集,極大地節約了使用的生產成本,具有廣闊的應用前景。

權利要求書

權利要求書
1.  一種用于磷酸肽富集的聚胍基離子液體材料的制備方法,其特征在于:步驟如下:
⑴在乙腈溶液中加入1,1,3,3-四甲基胍和含乙烯基的鹵單體,常溫反應2~8小時,得到白色固體,于真空干燥箱中干燥,即得到制備胍基離子液體材料的胍基離子液體功能單體;
其中,所述乙腈溶液與1,1,3,3-四甲基胍的體積比為6:1~1:1,1,1,3,3-四甲基胍和含乙烯基的鹵單體的物質的量比為1:1~1:2.2;
⑵將步驟⑴胍基離子液體功能單體與交聯劑和引發劑溶于乙腈中,得到混合液,所述胍基離子液體功能單體在混合液中的質量百分數為1.0%~20%,交聯劑在混合液中的質量百分數為2.5%~35%,引發劑在混合液中的質量百分數為0.15%~2.5%,向混合液中通入氮氣除氧;
⑶混合液在水浴55℃~80℃下引發聚合12~24小時后,得到固體材料,將固體材料用蒸餾水洗滌、抽濾,放于真空干燥箱中干燥,即得用于磷酸肽富集的聚胍基離子液體材料。

2.  根據權利要求1所述的用于磷酸肽富集的聚胍基離子液體材料的制備方法,其特征在于:所述步驟⑴中含乙烯基的鹵單體為4-氯甲基苯乙烯、4-溴甲基苯乙烯、3-氯甲基苯乙烯、3-溴甲基苯乙烯、3-氯-1-丙烯或3-溴-1-丙烯。

3.  根據權利要求1所述的用于磷酸肽富集的聚胍基離子液體材料的制備方法,其特征在于:所述步驟⑴中胍基離子液體功能單體為1,1,3,3-四甲基有機胍氯鹽或1,1,3,3-四甲基有機胍溴鹽。

4.  根據權利要求1所述的用于磷酸肽富集的聚胍基離子液體材料的制備方法,其特征在于:所述步驟⑴中干燥的具體條件為80℃~120℃,4~12小時。

5.  根據權利要求1所述的用于磷酸肽富集的聚胍基離子液體材料的制備方法,其特征在于:所述步驟⑵中交聯劑為N,N-亞甲基雙丙烯酰胺,引發劑為偶氮二異丁腈。

6.  根據權利要求1所述的用于磷酸肽富集的聚胍基離子液體材料的制備方法,其特征在于:所述步驟⑶中用蒸餾水洗滌的次數為5次。

7.  根據權利要求1所述的用于磷酸肽富集的聚胍基離子液體材料的制備方法,其特征在于:所述步驟⑶中干燥的具體條件為90℃~150℃,6~24小時。

說明書

說明書一種用于磷酸肽富集的聚胍基離子液體材料的制備方法
技術領域
本發明屬于功能化材料制備技術領域,尤其是一種用于磷酸肽富集的聚胍基離子液體材料的制備方法。
背景技術
蛋白質的磷酸化修飾在生命活動中扮演著非常重要的角色,蛋白質的磷酸化修飾與一些癌癥疾病的發生、神經系統的調節、細胞活動等息息相關。因此,制備具有磷酸肽識別性能的材料對于磷酸化蛋白組學的發展具有重要意義。近年來用于富集磷酸肽的材料受到廣大科研工作者的關注。
目前,用于富集磷酸肽的材料多種多樣,包括經過修飾的納米硅球、納米線、磁性顆粒、二氧化鈦、光學晶體以及離子液體高分子聚合物等。近年來,固相金屬離子親和色譜法和金屬氧化物親和色譜法被廣泛應用于磷酸肽富集,其中Zr4+、TiO2和ZrO2被廣泛應用。
近年來胍基離子液體成為離子液體家族中新的一員,胍基與磷酸根之間存在相互作用,離子液體陽離子所帶的正電荷與磷酸根帶的負電荷存在靜電作用,胍基功能材料用于磷酸肽的富集已成為一個新的領域,但是目前市場上還沒有相關的聚胍基離子液體材料,因此制作一種新的聚胍基離子液體材料來用于磷酸肽富集是非常必要的。
通過檢索,尚未發現與本發明專利申請相關的專利公開文獻。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足之處,提供一種生物相容性好、方法簡單的用于磷酸肽富集的聚胍基離子液體材料制備方法,該方法制備的聚胍基離子液體材料具有較快的傳質速率和對磷酸肽較強的選擇性和特異性。
本發明解決其技術問題所采用的技術方案是:
一種用于磷酸肽富集的聚胍基離子液體材料的制備方法,步驟如下:
⑴在乙腈溶液中加入1,1,3,3-四甲基胍和含乙烯基的鹵單體,常溫反應2~8小時,得到白色固體,于真空干燥箱中干燥,即得到制備胍基離子液體材料的胍基離子液體功能單體;
其中,所述乙腈溶液與1,1,3,3-四甲基胍的體積比為6:1~1:1,1,1,3,3-四甲基胍和含乙烯基的鹵單體的物質的量比為1:1~1:2.2;
⑵將步驟⑴胍基離子液體功能單體與交聯劑和引發劑溶于乙腈中,得到混合液,所述胍 基離子液體功能單體在混合液中的質量百分數為1.0%~20%,交聯劑在混合液中的質量百分數為2.5%~35%,引發劑在混合液中的質量百分數為0.15%~2.5%,向混合液中通入氮氣除氧;
⑶混合液在水浴55℃~80℃下引發聚合12~24小時后,得到固體材料,將固體材料用蒸餾水洗滌、抽濾,放于真空干燥箱中干燥,即得用于磷酸肽富集的聚胍基離子液體材料。
而且,所述步驟⑴中含乙烯基的鹵單體為4-氯甲基苯乙烯、4-溴甲基苯乙烯、3-氯甲基苯乙烯、3-溴甲基苯乙烯、3-氯-1-丙烯或3-溴-1-丙烯。
而且,所述步驟⑴中胍基離子液體功能單體為1,1,3,3-四甲基有機胍氯鹽或1,1,3,3-四甲基有機胍溴鹽。
而且,所述步驟⑴中干燥的具體條件為80℃~120℃,4~12小時。
而且,所述步驟⑵中交聯劑為N,N-亞甲基雙丙烯酰胺,引發劑為偶氮二異丁腈。
而且,所述步驟⑶中用蒸餾水洗滌的次數為5次。
而且,所述步驟⑶中干燥的具體條件為90℃~150℃,6~24小時。
本發明的優點和積極效果是:
1、本方法制得的胍基聚離子液體材料生物相容性好、分散性好,材料粒徑均一,對磷酸肽具有較強的吸附性能,具有較高的選擇性識別與富集磷酸肽的能力,對磷酸肽的富集效率高,性能穩定,可以實現重復利用,可以重復利用至少五次,在室溫干燥的環境中放置1年后,仍能用于對磷酸肽的富集,極大地節約了使用的生產成本,具有廣闊的應用前景。
2、本發明方法合成過程簡單,條件易于控制,所制得的材料粒徑較均一,具有較好的熱穩定性,較強的生物相容性,可以用于磷酸肽的富集,該胍基離子液體材料提高了磷酸肽效率,實現了對磷酸肽更加高效簡便的富集。
3、本發明方法制得的聚合物單體的合成過程簡單,減少了后續質譜鑒定過程中的雜質干擾,而且采用聚胍基離子液體材料來富集磷酸肽,將離子液體的強分散性等優點和聚合物的熱穩定性結合起來,可以更好的將材料進行優化后投入應用,具有很廣的應用前景。
4、本發明方法的聚胍基離子液體材料的制備僅需一步反應即可得到,反應過程簡單,提高了工作效率。
附圖說明
圖1為本發明聚胍基離子液體材料的掃描電鏡圖,從圖1中可看出本發明顆粒大小較均一,顆粒直徑約為300nm;
圖2為本發明聚胍基離子液體材料的熱重圖,從圖2中可看出本發明材料熱穩定相良好;
圖3為本發明聚胍基離子液體材料的富集β-casein酶解物(4×10-8M)后MALDI-TOF-MS 圖;其中,圖a為磷酸肽未使用本發明材料富集的MALDI-TOF-MS圖,從圖a中可以看出,材料富集前檢測不到磷酸肽峰,由于非磷酸肽豐度大且對磷酸肽有抑制作用;圖b為磷酸肽使用本發明材料富集后的MALDI-TOF-MS圖,從圖b中可以看出,材料富集后有7個磷酸肽峰可以被明顯檢測到,說明本發明材料的富集靈敏度高。
圖4為本發明聚胍基離子液體材料對脫脂牛奶酶解后富集的MALDI-TOF-MS圖,其中,圖a為脫脂牛奶酶解后的酶解物未使用本發明材料富集的MALDI-TOF-MS圖,從圖a中可以看出,材料富集前檢測不到磷酸肽峰;圖b為脫脂牛奶酶解后的酶解物使用本發明材料富集后的MALDI-TOF-MS圖,從圖b中可以看出,材料富集后有7個磷酸肽峰可以被明顯檢測到,說明材料適用于實際樣品,使用范圍極廣。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明進一步詳述,下述實施例只是說明性的,不是限定性的,不能以該實施例來限定本發明的保護范圍。
本發明中所使用的原料,如無特殊規定,均為本領域內常用的原料;本發明中所使用的方法,如無特殊規定,均為本領域內常用的方法。
實施例1
一種用于磷酸肽富集的聚胍基離子液體材料的制備方法,步驟如下:
⑴胍基離子液體功能單體的合成:
量取1,1,3,3-四甲基胍12.547mL(0.1mol)于100mL圓底燒瓶中,加入20mL乙腈,量取0.1mol3-氯-1-丙烯于滴液漏斗中,逐滴加入到燒瓶中,常溫反應4小時后得白色固體,放于真空干燥箱中干燥;
⑵聚胍離子液體材料的合成:
上述反應完后加入4mmol的N,N-亞甲基雙丙烯酰胺,超聲脫氧5分鐘后,加入0.45mmolAIBN充氮氣除氧后封口,放于60℃的水浴鍋中反應24小時,反應完成后用蒸餾水洗滌、抽濾,放于真空干燥箱中干燥,即得用于磷酸肽富集的聚胍基離子液體材料。
實施例2
一種用于磷酸肽富集的聚胍基離子液體材料的制備方法,步驟如下:
⑴在乙腈溶液中加入1,1,3,3-四甲基胍和含乙烯基的鹵單體,常溫反應2~5小時,得到白色固體,于真空干燥箱中干燥,干燥的具體條件為80℃~100℃,4~8小時,即得到制備胍基離子液體材料的胍基離子液體功能單體;
其中,所述乙腈溶液與1,1,3,3-四甲基胍的體積比為6:1,1,1,3,3-四甲基胍和含乙烯基的鹵單體的物質的量比為1:1.6;
⑵將步驟⑴胍基離子液體功能單體與交聯劑和引發劑溶于乙腈中,得到混合液,所述胍基離子液體功能單體在混合液中的質量百分數為10%,交聯劑在混合液中的質量百分數為15%,引發劑在混合液中的質量百分數為1.5%,向混合液中通入氮氣除氧;
⑶混合液在水浴55℃~70℃下引發聚合12小時后,得到固體材料,將固體材料用蒸餾水洗滌5次、抽濾,放于真空干燥箱中干燥,干燥的具體條件為120℃~150℃,12~24小時,即得用于磷酸肽富集的聚胍基離子液體材料。
所述步驟⑴中含乙烯基的鹵單體為4-氯甲基苯乙烯、4-溴甲基苯乙烯、3-氯甲基苯乙烯、3-溴甲基苯乙烯、3-氯-1-丙烯(氯丙烯)或3-溴-1-丙烯。
實施例3
一種用于磷酸肽富集的聚胍基離子液體材料的制備方法,步驟如下:
⑴在乙腈溶液中加入1,1,3,3-四甲基胍和含乙烯基的鹵單體,常溫反應5~8小時,得到白色固體,于真空干燥箱中干燥,干燥的具體條件為100℃~120℃,8~12小時,即得到制備胍基離子液體材料的胍基離子液體功能單體;
其中,所述乙腈溶液與1,1,3,3-四甲基胍的體積比為4:1,1,1,3,3-四甲基胍和含乙烯基的鹵單體的物質的量比為1:2.2;
⑵將步驟⑴胍基離子液體功能單體與交聯劑和引發劑溶于乙腈中,得到混合液,所述胍基離子液體功能單體在混合液中的質量百分數為20%,交聯劑在混合液中的質量百分數為35%,引發劑在混合液中的質量百分數為2.5%,向混合液中通入氮氣除氧;
⑶混合液在水浴55℃~80℃下引發聚合20小時后,得到固體材料,將固體材料用蒸餾水洗滌、抽濾,放于真空干燥箱中干燥,干燥的具體條件為90℃~120℃,6~12小時,即得用于磷酸肽富集的聚胍基離子液體材料。
實施例4
一種用于磷酸肽富集的聚胍基離子液體材料的制備方法,步驟如下:
⑴在乙腈溶液中加入1,1,3,3-四甲基胍和含乙烯基的鹵單體,常溫反應2~8小時,得到白色固體,于真空干燥箱中干燥,即得到制備胍基離子液體材料的胍基離子液體功能單體;
其中,所述乙腈溶液與1,1,3,3-四甲基胍的體積比為6:1~1:1,1,1,3,3-四甲基胍和含乙烯 基的鹵單體的物質的量比為1:1~1:2.2;
⑵將步驟⑴胍基離子液體功能單體與交聯劑和引發劑溶于乙腈中,得到混合液,所述胍基離子液體功能單體在混合液中的質量百分數為1.0%,交聯劑在混合液中的質量百分數為2.5%,引發劑在混合液中的質量百分數為0.15%,向混合液中通入氮氣除氧;
⑶混合液在水浴55℃~80℃下引發聚合12~24小時后,得到固體材料,將固體材料用蒸餾水洗滌、抽濾,放于真空干燥箱中干燥,即得用于磷酸肽富集的聚胍基離子液體材料。
本發明聚胍基離子液體材料的相關檢測結果:
1、本發明聚胍基離子液體材料的掃描電鏡檢測,結果如圖1所示,從圖1中可看出本發明顆粒大小較均一,顆粒直徑約為300nm;
2、本發明聚胍基離子液體材料的熱重檢測,結果如圖2所示,從圖2中可看出本發明材料熱穩定相良好;
3、本發明聚胍基離子液體材料的富集β-casein酶解物(4×10-8M)后MALDI-TOF-MS檢測:
檢測步驟如下:
⑴聚胍離子液體材料吸附磷酸肽:
取15mg本發明聚胍基離子液體材料于2mL離心管中,用HEPES-NaOH(25mM,pH=6.8)緩沖液潤洗材料3次,加入4×10-8Mβ-casein酶解物或脫脂牛奶酶解后酶解物富集3小時后離心(5000轉/分離心10分鐘)棄上清液,用1mL50%乙腈,0.1mol/L醋酸洗滌材料3次后,加入200μlpH=4.0500mM鹽酸-鹽酸胍,乙腈,TFA(w:w:w=50:47.5:2.5)洗脫,得洗脫產物;
其中,β-casein酶解物的制備步驟如下:標準蛋白酶切肽段的制備:準確稱取1mgβ-casein于1.5mL進口離心管中,向其中加入1mL50mmol/L的NH4HCO3緩沖液,使其溶解,此時β-casein的濃度為1mg/mL,繼續向該蛋白溶液中以1:40(酶/蛋白,質量比)的比例向上述溶液中加入配置好的1mg/mL的胰蛋白酶(Trypsin)溶液25μL,之后將其置于37℃的搖床(200rpm),酶解16h,即得β-casein酶解物;
實際樣品脫脂牛奶酶解后酶解物的制備方法為:
①準確稱取0.25mL脫脂牛奶(根據商品說明,每100mg牛奶里含有3mg蛋白質),并將其與0.25mL8M尿素的50mmol/LNH4HCO3的緩沖溶液混勻,將其置于室溫下,變性2.5h;
②向其中加入20μL10mmol/L的1,4-二硫蘇糖醇溶液(DTT,用50mM的碳酸氫氨溶液配置),同上置于37℃搖床中,200rpm振蕩2小時;
③向上述溶液中繼續加入20μL20mmol/L的碘乙酰胺溶液(IAA,同樣是用50mM的碳酸氫氨溶液配置的)進行烷基化,在避光條件下(或用錫箔紙包住),常溫震蕩30min;
④將上述變性后的溶液用50mM的NH4HCO3緩沖溶液稀釋10倍,從而使得尿素的濃度降至1M以下,防止胰蛋白酶的活性被尿素破壞,之后,向上述溶液中加入0.18mg胰蛋白酶(胰蛋白酶:蛋白=1:40w/w),之后將其置于37℃的搖床(200rpm),酶解16h,得實際樣品脫脂牛奶酶解后酶解物。
⑵MALDI-TOF-MS檢測:
取2μl步驟⑴后的洗脫產物加入2μL20mg/mL的DHB基質,搖勻后取1μL滴到基板上,晾干后進行檢測。
相關的檢測結果如圖3和圖4所示,圖3為本發明聚胍基離子液體材料的富集β-casein酶解物(4×10-8M)后MALDI-TOF-MS圖;其中,圖a為磷酸肽未使用本發明材料富集的MALDI-TOF-MS圖,從圖a中可以看出,材料富集前檢測不到磷酸肽峰,由于非磷酸肽豐度大且對磷酸肽有抑制作用;圖b為磷酸肽使用本發明材料富集后的MALDI-TOF-MS圖,從圖b中可以看出,材料富集后有7個磷酸肽峰可以被明顯檢測到,說明本發明材料的富集靈敏度高。
圖4為本發明聚胍基離子液體材料對脫脂牛奶酶解后富集的MALDI-TOF-MS圖,其中,圖a為脫脂牛奶酶解后的酶解物未使用本發明材料富集的MALDI-TOF-MS圖,從圖a中可以看出,材料富集前檢測不到磷酸肽峰;圖b為脫脂牛奶酶解后的酶解物使用本發明材料富集后的MALDI-TOF-MS圖,從圖b中可以看出,材料富集后有7個磷酸肽峰可以被明顯檢測到,說明材料適用于實際樣品,使用范圍極廣。

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一種 用于 磷酸 富集 聚胍基 離子 液體 材料 制備 方法
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