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一株假單胞菌及其在降解石油類污染物中的應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201510690558.1

申請日:

2015.10.22

公開號:

CN105176888A

公開日:

2015.12.23

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 1/20申請日:20151022|||公開
IPC分類號: C12N1/20; C02F3/34; B09C1/10; C12R1/38(2006.01)N; C02F101/30(2006.01)N 主分類號: C12N1/20
申請人: 中國石油大學(華東)
發明人: 趙朝成; 李琳; 劉芳; 劉其友; 張云波; 劉春爽; 陳水泉
地址: 266000 山東省青島市黃島區長江西路66號
優先權:
專利代理機構: 青島聯信知識產權代理事務所 37227 代理人: 高洋
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201510690558.1

授權公告號:

||||||

法律狀態公告日:

2019.04.02|||2016.01.20|||2015.12.23

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及微生物在環境污染物降解中的應用領域,特別涉及一株假單胞菌及其在降解石油類污染物中的應用,本發明從中國勝利油田石油污染土壤中篩選出一株假單胞菌(Pseudomonas?sp.?LKY-5),它的保藏號是CCTCC?NO:M?2015448。本發明篩選得到的Pseudomonas?sp.?LKY-5能有效降解含硫雜環芳烴如二苯并噻吩、苯并噻吩、烷基二苯并噻吩、4,6-二甲基二苯并噻吩、2,4,6-三甲基二苯并噻吩等;同時,還可以降解原油中其他的污染物如正十六烷、菲、芘、咔唑等多種污染物。

權利要求書

權利要求書
1.  一株假單胞菌(Pseudomonassp.LKY-5),它的保藏號是CCTCCNO:M2015448。

2.  如權利要求1所述的假單胞菌,其特征在于,它的16SrDNA序列如SEQIDNO.3所示。

3.  一種如權利要求1所述的假單胞菌在降解石油類污染物中的應用。

4.  根據權利要求3所述的應用,其特征在于所述的石油類污染物為含硫雜環芳烴。

5.  根據權利要求4所述的應用,其特征在于所述含硫雜環芳烴為二苯并噻吩。

6.  如權利要求3-5任一項所述的應用,其特征在于,將所述的假單胞菌Pseudomonassp.LKY-5菌株接種到石油類污染物中進行降解。

說明書

說明書一株假單胞菌及其在降解石油類污染物中的應用
技術領域
本發明涉及微生物在環境污染物降解中的應用領域,特別涉及一株假單胞菌及其在降解石油類污染物中的應用。
背景技術
石油類污染物是油田開發和石油加工過程中產生的最重要的污染物。石油類污染物的危害主要表現在對人類、動物、土壤和天然水體的危害和影響。石油類污染物已列入我國危險廢物名錄,在列入的48種危險廢物中,石油類排第8位。
井噴、油罐泄漏、油輪泄漏、油田設備檢修、石化生產、運輸事故等,都會溢出和排放石油烴類。其中,含硫雜環芳烴是高硫原油的重要組成,70%以上的含硫化合物是二苯并噻吩(DBT)和其衍生物,它屬于污染面廣、毒性更大的一類難降解有機物,具有強致癌、致畸和致突變效應。石油、石化產品以及煉焦生產在生產、運輸以及使用過程中會造成土壤和地下水的污染,并產生大量的廢水,含硫雜環芳烴作為主要的污染物之一的降解對于土壤生物修復以及石化污水、煉焦廢水的處理具有重要意義,此外這些污染中還含有烷烴和多環芳烴等污染物。
生物治理是指微生物利用污染物作為碳源或其他營養源如氮源、硫源等,將其分解利用轉化為二氧化碳、水以及無機礦物質等。生物治理/處理因為成本低、操作簡單、條件溫和以及無二次污染等優勢,在土壤生物修復以及石化污水、煉焦廢水的處理過程中具有絕對的優勢,篩選、獲得對含硫雜環芳烴具有快速降解能力,以及對烷烴、多環芳烴等污染物具有降解作用的高效微生物菌株,可以將其投加于待修復的土壤以及污水處理中,來大幅提高生物降解的效果,這對保護生態具有重要意義。
一般來說生物降解菌要求具有對生長環境要求低、生長速度快、降解速度快、可耐受或可降解多種污染物的優勢。
二苯并噻吩作為含硫雜環芳烴的模式物,微生物對二苯并噻吩的代謝途徑主要分為“4S”途徑(產物為2-羥基聯苯)和“Kodama”途徑(產物為3-羥基-2-甲酰基苯并噻吩),不能完全礦化生成二氧化碳和水,生物修復價值較低。此外,實際污染情況下往往有多種底物同時存在,因而能夠利用和降解多種底物的降解菌將在生物修復過程中占有重要地位。
發明內容
本發明提供一株假單胞菌及其在降解石油類污染物中的應用。
本發明的技術方案是:
本發明從中國勝利油田石油污染土壤中篩選出一株假單胞菌(Pseudomonassp.LKY-5),于2015年7月13日保藏在中國典型培養物保藏中心(地址:中國武漢武漢大學),保藏號是CCTCCNO:M2015448。它能夠將二苯并噻吩降解生成鄰苯二酚,進入三羧酸循環,生成CO2和H2O,該代謝途徑相較已有的“4S”途徑和“Kodama”途徑有進一步的延伸,可以7天完全降解100mg/L的二苯并噻吩。
本發明的另一個目的在于公開該假單胞菌在降解石油類污染物中的應用。
石油類污染物主要包括烷烴(正十六烷)、多環芳烴(菲、芘)、含硫雜環芳烴(二苯并噻吩)、含氮雜環芳烴(咔唑)等,其中,含硫雜環芳烴是污染物中最為頑固,且極難降解的一類物質。
1)菌株的篩選及分離純化
取1g新鮮土樣加入到篩選培養基中,在溫度為30℃、轉速為160rpm的搖床中振蕩培養一周后,接種5%的培養液轉接至新鮮的培養基中繼續培養,相同條件下連續轉接5~7次。然后取培養液進行梯度稀釋,涂布于二苯并噻吩-無機鹽固體培養基上,培養3天后,挑取產生降解圈的菌落,在LB平板上劃線分離純化,直至得到純的單菌落。將菌株經培養后,再單獨接種到DBT-無機鹽液體培養基中搖瓶培養,選擇降解效果最好的菌株作為研究對象。
其中:
無機鹽培養基:Na2HPO40.6g,KH2PO40.2g,NaNO34.0g,CaCl20.01g,FeSO40.01g,MgSO40.3g,酵母粉0.5g,蒸餾水1000mL,調節pH至7.2~7.5。(CaCl2和MgSO4單獨高溫滅菌,FeSO4過濾除菌)
篩選培養基:在無機鹽培養基的基礎上加40mg/L的二苯并噻吩的丙酮溶液。
LB培養基:蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl5g,蒸餾水1000mL,pH7.2~7.5。
DBT-無機鹽固體培養基:在無機鹽培養基中加入20g/L的瓊脂,將DBT的丙酮溶液涂布于固體培養基上。
2)菌株的分子生物學鑒定:
將分離的菌株提取總DNA后進行PCR擴增,
正向引物27F:5'-agagtttgatcctggctcag-3',SEQIDNO.1
反向引物1492R:5'-ggttaccttgttacgactt-3',SEQIDNO.2
PCR條件:94℃預變性5min;94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,30個循環,最后72℃延伸10min。擴增之后的產物送至上海生工生物公司進行測序。該菌株的16SrDNA序列如SEQIDNO.3所示。
將LKY-5的測序結果提交到GenBank進行比對,發現LKY-5和Pseudomonassp.BC041(HQ105010)同源性為99%,命名為Pseudomonassp.LKY-5。
Pseudomonassp.LKY-5的掃描電鏡分析見圖1。從圖1中可以看出,LKY-5菌株以桿菌形態存在,長度約為1.5μm,寬度約為0.42μm。
二苯并噻吩作為含硫雜環芳烴的模式物,經過分析可知,本發明篩選的LKY-5對二苯并噻吩(DBT)的降解主要有以下兩條代謝途徑。
一條代謝途徑為:DBT首先在加氧酶的作用下生成DBT砜,然后打開噻吩環上的C-S鍵生成2’-羥基聯苯基-2-亞磺酸鹽,然后脫掉磺酸基生成2-羥基聯苯,然后再脫掉羥基生成聯苯,聯苯發生開環反應,生成2-羥基-6-酮基-6-苯基-2,4己二烯,隨后水解生成苯甲醛,然后氧化生成苯甲酸,苯甲酸在雙加氧酶的作用下生成鄰苯二酚(兒茶酚),或者苯甲醛在單加氧酶作用下生成2-羥基苯甲醛,隨后氧化生成2-羥基苯甲酸(水楊酸),然后再生成鄰苯二酚,最后生成2-羥基己二烯半醛酸進入三羧酸循環,生成CO2和H2O。
另一條代謝途徑為:DBT斷裂一個苯環生成3-羥基-2-甲酰基苯并噻吩,然后脫掉羧基生成3-羥基苯并噻吩,或脫掉羥基生成苯并噻吩-2-羧酸,然后生成2,3-苯并噻吩二酮,斷裂噻吩環生成硫代水楊酸,隨后生成苯甲酸,最后生成鄰苯二酚進入三羧酸循環,生成CO2和H2O。或者兩個2,3-苯并噻吩二酮生成硫靛,然后生成2-巰苯基乙醛酸,再生成苯乙酸。

本發明的有益效果是:
1)本發明篩選得到的Pseudomonassp.LKY-5能夠將二苯并噻吩降解生成鄰苯二酚,進入三羧酸循環,生成CO2和H2O,該代謝途徑相較已有的“4S”途徑和“Kodama”途徑有進一步的延伸,具有較高的生物修復價值。
2)本發明篩選得到的Pseudomonassp.LKY-5能有效降解含硫雜環芳烴如二苯并噻吩、苯并噻吩、烷基二苯并噻吩、4,6-二甲基二苯并噻吩、2,4,6-三甲基二苯并噻吩等;同時,還可以降解原油中其他的污染物如正十六烷、菲、芘、咔唑等多種污染物。
附圖說明
附圖1為本發明的假單胞菌菌株Pseudomonassp.LKY-5的掃描電鏡圖;
附圖2為本發明具體實施例3中Pseudomonassp.LKY-5對石油類污染物的降解情況。
具體實施方式
本發明的具體實施方式如下:
實施例1:二苯并噻吩降解
將Pseudomonassp.LKY-5菌株接種至100mL含有100mg/L二苯并噻吩的無機鹽培養基中。30℃,pH7.5,接種量10wt%,160rpm搖床培養7天,用6M的HCl酸化至pH≤2后,加入等體積的乙酸乙酯萃取,于4℃,5000rpm離心10min,取上清液用Bruker450氣相色譜儀(FID,HP5毛細管柱)測定,二苯并噻吩降解率達100%。
實施例2:
將Pseudomonassp.LKY-5菌株分別接種至含有100mg/L的菲、芘、咔唑、正十六烷的無機鹽培養基中,30℃,pH7.5,接種量10wt%,160rpm搖床培養7天,正十六烷采用Bruker450氣相色譜儀測定。菲、芘和咔唑采用高效液相色譜Waters2695測定,使用紫外檢測器,WaterssunfireC18反相色譜柱(柱長150mm,內徑4.6mm,填料5μm),柱子恒溫25℃,于254nm檢測物質的吸收峰,流動相A為含0.5%三氟乙酸的水,流動相B為含0.5%三氟乙酸的乙腈。采用梯度洗脫,見表1。
表1梯度洗脫程序

結果如圖2所示,Pseudomonassp.LKY-5對正十六烷、菲、芘和咔唑均有降解效果,降解能力順序為正十六烷>菲>咔唑>芘。
實施例3:
分別添加2mL市售0號柴油(密度為0.841g/mL)、2mL青島煉化催化裂化柴油(密度為0.9468g/mL)于無機鹽培養基中(培養基終體積為30mL),Pseudomonassp.LKY-5菌株的接種量為10wt%,不接種的作為空白對照。30℃,160rpm,培養時間7天后,將空白對照和降解后的含油培養基用石油醚(30~60℃)進行振蕩萃取,合并萃取液,于5000rpm、4℃下離心10min,經無水硫酸鈉脫水后,在30℃下減壓旋轉蒸發至石油醚完全揮發后,移至色譜瓶中,采用美國Varian3800氣相色譜儀進行分析。檢測器為脈沖式火焰光度檢測器(PFPD),HP-5NS石英毛細管柱(30m×0.32mm×0.25μm),進樣量1μL,分流比30:1,進樣口溫度300℃,柱溫80℃保持2min,然后6℃/min升至280℃,載氣He,流速1mL/min。柴油中總含硫量測定采用MultiEA3100S/N微量分析儀。結果如表2所示。
表2柴油中不同類型硫化物的降解


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一株假單胞菌 及其 降解 石油 污染物 中的 應用
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