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用于預防或治療胃腸病癥的支鏈脂肪酸.pdf

摘要
申請專利號:

CN200880107380.1

申請日:

2008.09.16

公開號:

CN101801200B

公開日:

2014.10.29

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效號牌文件類型代碼:1604號牌文件序號:101014883059IPC(主分類):A01N 63/00專利申請號:2008801073801申請日:20080916|||公開
IPC分類號: A61K31/185 主分類號: A61K31/185
申請人: 康奈爾大學
發明人: J·T·布倫納; R·蘭-雷斯勒
地址: 美國紐約州
優先權: 2007.09.17 US 60/972,992
專利代理機構: 中國專利代理(香港)有限公司 72001 代理人: 張軼東;李炳愛
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200880107380.1

授權公告號:

101801200B||||||

法律狀態公告日:

2014.10.29|||2010.11.17|||2010.08.11

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及一種預防或治療受治療者的胃腸病癥的方法,該方法包括在有效預防或治療受治療者的胃腸病癥的條件下,將一種或多種支鏈脂肪酸施用于受治療者。本發明還涉及促進受治療者的胃腸健康和益生生物繁殖的方法。還公開了一種制劑,其包括一種或多種支鏈脂肪酸和被所述一種或多種支鏈脂肪酸乳化的水相,其中該制劑含有25wt%以上的所述一種或多種支鏈脂肪酸。

權利要求書

1: 一種預防或治療受治療者的胃腸病癥的方法,所述方法包括: 在有效預防或治療所述受治療者的胃腸病癥的條件下,將一種或多種支鏈脂肪酸施用于所述的受治療者。
2: 根據權利要求1所述的方法,該方法還包括: 在所述施用之前選擇需要治療胃腸病癥的受治療者。
3: 根據權利要求1所述的方法,該方法還包括: 在所述施用之前選擇需要預防胃腸病癥的受治療者。
4: 根據權利要求1所述的方法,其中所述胃腸病癥受病原菌對受治療者的胃腸道感染的介導。
5: 根據權利要求4所述的方法,其中所述胃腸病癥是壞死性小腸結腸炎。
6: 根據權利要求1所述的方法,其中所述胃腸病癥需要所述受治療者胃腸道的微生物建群。
7: 根據權利要求6所述的方法,其中所述受治療者胃腸道的建群與抗生素治療結合進行。
8: 根據權利要求1所述的方法,其中所述胃腸病癥是涉及炎癥的腸疾病。
9: 根據權利要求8所述的方法,其中所述胃腸病癥是炎性腸病。
10: 根據權利要求1所述的方法,其中所述一種或多種支鏈脂肪酸是C11-C26的支鏈脂肪酸或其混合物。
11: 根據權利要求1所述的方法,其中所述一種或多種支鏈脂肪酸選自由以下組成的組:4,7-二甲基-壬酸、4,8-二甲基-癸酸、8-甲基-十一烷酸、異-十二烷酸、4,8-二甲基-十一烷酸、4,9-二甲基-十一烷酸、異-十三烷酸、反異-十三烷酸、4,10-二甲基-十二烷酸、異-十四烷酸、4,11-二甲基-十三烷酸、異-十五烷酸、反異-十五烷酸、8,10-二甲基-十四烷酸、4,12-二甲基-十四烷酸、異-十六烷酸、2-甲基十六烷酸、4,11-二甲基-十五烷酸、4,13-二甲基-十五烷酸、異-十七烷酸、反異-十七烷酸、異-十八烷酸、異-二十烷酸、反異-二十一烷酸、異-十二烷酸、異-二十四烷酸、異-二十五烷酸、反異-二十五烷酸、異-二十六烷酸、植烷酸、降植烷酸及其混合物。
12: 根據權利要求11所述的方法,其中所述一種或多種支鏈脂肪酸選自由以下組成的組:異-十六烷酸、反異-十六烷酸、4,13-二甲基十五烷酸、植烷酸、降植烷酸及其混合物。
13: 根據權利要求1所述的方法,其中所述一種或多種支鏈脂肪酸選自由飽和的和單不飽和的脂肪酸及其混合物組成的組。
14: 根據權利要求13所述的方法,其中所述一種或多種支鏈脂肪酸是脂肪酸的支鏈形式,所述脂肪酸選自由以下組成的組:辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、二十烷酸、棕櫚油酸、油酸及其混合物。
15: 根據權利要求1所述的方法,其中所述受治療者是人。
16: 根據權利要求15所述的方法,其中所述受治療者是胎兒。
17: 根據權利要求15所述的方法,其中所述受治療者是嬰兒。
18: 根據權利要求17所述的方法,其中所述受治療者是新生嬰兒。
19: 根據權利要求15所述的方法,其中所述受治療者是兒童。
20: 根據權利要求15所述的方法,其中所述受治療者是成人。
21: 一種促進受治療者的胃腸健康的方法,所述方法包括: 在有效促進所述受治療者的胃腸健康的條件下,將一種或多種支鏈脂肪酸施用于所述受治療者。
22: 根據權利要求21所述的方法,該方法還包括: 在所述施用之前選擇需要促進胃腸健康的受治療者。
23: 根據權利要求21所述的方法,其中所述一種或多種支鏈脂肪酸是C11-C26的支鏈脂肪酸或其混合物。
24: 根據權利要求21所述的方法,其中所述一種或多種支鏈脂肪酸選自由以下組成的組:4,7-二甲基-壬酸、4,8-二甲基-癸酸、8-甲基-十一烷酸、異-十二烷酸、4,8-二甲基-十一烷酸、4,9-二甲基-十一烷酸、異-十三烷酸、反異-十三烷酸、4,10-二甲基-十二烷酸、異-十四烷酸、4,11-二甲基-十三烷酸、異-十五烷酸、反異-十五烷酸、8,10-二甲基-十四烷酸、4,12-二甲基-十四烷酸、異-十六烷酸、2-甲基十六烷酸、4,11-二甲基-十五烷酸、4,13-二甲基-十五烷酸、異-十七烷酸、反異-十七烷酸、異-十八烷酸、異-二十烷酸、反異-二十一烷酸、異-十二烷酸、異-二十四烷酸、異-二十五烷酸、反異-二十五烷酸、異-二十六烷酸、植烷酸、降植烷酸及其混合物。
25: 根據權利要求24所述的方法,其中所述一種或多種支鏈脂肪酸選自由以下組成的組:異-十六烷酸、反異-十六烷酸、4,13-二甲基十五烷酸、植烷酸、降植烷酸及其混合物。
26: 根據權利要求21所述的方法,其中所述一種或多種支鏈脂肪酸選自由飽和的和單不飽和的脂肪酸及其混合物組成的組。
27: 根據權利要求26所述的方法,其中所述一種或多種支鏈脂肪酸是脂肪酸的支鏈形式,所述脂肪酸選自由以下組成的組:辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、二十烷酸、棕櫚油酸、油酸及其混合物。
28: 根據權利要求21所述的方法,其中所述受治療者是人。
29: 一種促進益生生物繁殖的方法,所述方法包括: 提供含有益生生物的細胞群,和 在有效促進所述細胞群中益生生物的繁殖的條件下,將一種或多種支鏈脂肪酸施用于所述細胞群。
30: 根據權利要求29所述的方法,其中所述一種或多種支鏈脂肪酸是C11-C26的支鏈脂肪酸或其混合物。
31: 根據權利要求29所述的方法,其中所述一種或多種支鏈脂肪酸選自由以下組成的組:4,7-二甲基-壬酸、4,8-二甲基-癸酸、8-甲基-十一烷酸、異-十二烷酸、4,8-二甲基-十一烷酸、4,9-二甲基-十一烷酸、異-十三烷酸、反異-十三烷酸、4,10-二甲基-十二烷酸、異-十四烷酸、4,11-二甲基-十三烷酸、異-十五烷酸、反異-十五烷酸、8,10-二甲基-十四烷酸、4,12-二甲基-十四烷酸、異-十六烷酸、2-甲基十六烷酸、4,11-二甲基-十五烷酸、4,13-二甲基-十五烷酸、異-十七烷酸、反異-十七烷酸、異-十八烷酸、異-二十烷酸、反異-二十一烷酸、異-十二烷酸、異-二十四烷酸、異-二十五烷酸、反異-二十五烷酸、異-二十六烷酸、植烷酸、降植烷酸及其混合物。
32: 根據權利要求31所述的方法,其中所述一種或多種支鏈脂肪酸選自由以下組成的組:異-十六烷酸、反異-十六烷酸、4,13-二甲基十五烷酸、植烷酸、降植烷酸及其混合物。
33: 根據權利要求29所述的方法,其中所述一種或多種支鏈脂肪酸選自由飽和的和單不飽和的脂肪酸及其混合物組成的組。
34: 根據權利要求33所述的方法,其中所述一種或多種支鏈脂肪酸是脂肪酸的支鏈形式,所述脂肪酸選自由以下組成的組:辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、二十烷酸、棕櫚油酸、油酸及其混合物。
35: 根據權利要求29所述的方法,其中所述方法在體外進行。
36: 根據權利要求29所述的方法,其中所述方法在體內進行。
37: 根據權利要求36所述的方法,該方法還包括: 在所述施用之前選擇需要益生生物繁殖的受治療者。
38: 根據權利要求29所述的方法,其中所述益生生物包括選自由以下組成的組的生物:乳桿菌屬物種、雙歧桿菌屬物種、其他乳酸菌、非乳酸菌及其混合物。
39: 根據權利要求38所述的方法,其中所述益生生物包括選自由以下組成的組的乳桿菌屬物種:嗜酸乳桿菌、食淀粉乳桿菌、短乳桿菌、干酪乳桿菌、干酪乳桿菌鼠李糖亞種(乳桿菌GG)、高加索乳桿菌、卷曲乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種(保加利亞乳桿菌)、發酵乳桿菌(L.fermenti)、加氏乳桿菌、瑞士乳桿菌、約氏乳桿菌、乳乳桿菌、賴氏乳桿菌、類干酪乳桿菌、植物乳桿菌、路氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌及其混合物。
40: 根據權利要求38所述的方法,其中所述益生生物包括選自由以下組成的組的雙歧桿菌屬物種:青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、乳雙歧桿菌(動物雙歧桿菌)、地衣雙歧桿菌、長雙歧桿菌及其混合物。
41: 根據權利要求38所述的方法,其中所述益生生物包括選自由以下組成的組的乳酸菌:屎腸球菌、乳乳球菌、腸膜明串珠菌、乳酸片球菌、嗜熱鏈球菌及其混合物。
42: 根據權利要求38所述的方法,其中所述益生生物包括選自由以下組成的組的非乳酸菌:枯草芽孢桿菌、大腸桿菌尼氏菌株、鮑氏酵母菌、釀酒酵母菌及其混合物。
43: 一種制劑,該制劑包括: 一種或多種支鏈脂肪酸,和 被所述一種或多種支鏈脂肪酸乳化的水相,其中所述制劑包括25wt%以上的所述一種或多種支鏈脂肪酸。
44: 根據權利要求43所述的制劑,其中所述一種或多種支鏈脂肪酸是C11-C26的支鏈脂肪酸或其混合物。
45: 根據權利要求43所述的制劑,其中所述一種或多種支鏈脂肪酸選自由以下組成的紐:4,7-二甲基-壬酸、4,8-二甲基-癸酸、8-甲基-十一烷酸、異-十二烷酸、4,8-二甲基-十一烷酸、4,9-二甲基-十一烷酸、異-十三烷酸、反異-十三烷酸、4,10-二甲基-十二烷酸、異-十四烷酸、4,11-二甲基-十三烷酸、異-十五烷酸、反異-十五烷酸、8,10-二甲基-十四烷酸、4,12-二甲基-十四烷酸、異-十六烷酸、2-甲基十六烷酸、4,11-二甲基-十五烷酸、4,13-二甲基-十五烷酸、異-十七烷酸、反異-十七烷酸、異-十八烷酸、異-二十烷酸、反異-二十一烷酸、異-十二烷酸、異-二十四烷酸、異-二十五烷酸、反異-二十五烷酸、異-二十六烷酸、植烷酸、降植烷酸及其混合物。
46: 根據權利要求45所述的制劑,其中所述一種或多種支鏈脂肪酸選自由以下組成的組:異-十六烷酸、反異-十六烷酸、4,13-二甲基十五烷酸、植烷酸、降植烷酸及其混合物。
47: 根據權利要求43所述的制劑,其中所述一種或多種支鏈脂肪酸選自由飽和的和單不飽和的脂肪酸及其混合物組成的組。
48: 根據權利要求47所述的制劑,其中所述一種或多種支鏈脂肪酸是脂肪酸的支鏈形式,所述脂肪酸選自由以下組成的組:辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、二十烷酸、棕櫚油酸、油酸及其混合物。
49: 根據權利要求45所述的制劑,其中所述制劑包括多達70wt%的所述一種或多種支鏈脂肪酸。
50: 根據權利要求45所述的制劑,該制劑還包括: 乳化劑。
51: 根據權利要求45所述的制劑,其中所述一種或多種支鏈脂肪酸包括多達20wt%的異肉豆蔻酸、異十五烷酸、反異十五烷酸、異棕櫚酸、異二十烷酸、反異二十烷酸、異二十二烷酸、異二十四烷酸、異二十六烷酸或其組合。

說明書


用于預防或治療胃腸病癥的支鏈脂肪酸

    本申請要求2007年9月17日提交的序列號為60/972,992的美國臨時專利申請的權益,在此通過引用以其全部內容并入本文。

    本申請的主題借助國立衛生研究院(NIH)編號為GM071534的撥款在美國政府的支持下進行。美國政府具有特定權利。

    【發明領域】

    本發明涉及一種用于預防或治療胃腸病癥的方法。

    【發明背景】

    支鏈脂肪酸(BCFA)大多數是在碳鏈上帶有一個或多個甲基支鏈的飽和脂肪酸(SFA)。BCFA主要是由皮膚合成的而且長期以來已知是胎脂的主要組分(10%-20%的干重)(Nicolaides等,“皮膚脂質.3.皮膚脂質中的脂肪鏈。胎脂用于區分人類皮膚表面脂質中的內源和外源組分的用途,”JAm?Oil?Chem?Soc?42:702-707(1965))。在地球上的動物中,胎脂是人類獨有的,并且在其他陸地哺乳動物包括其他靈長類動物中還沒有被發現(Pickens等,“胎脂的表征:含水量、形態學和元素分析”J?Invest?Dermatol115:875-881(2000))。胎脂是由皮脂和胎兒的角化細胞組成的(Nicolaides等,“皮膚脂質.3.皮膚脂質中的脂肪鏈.胎脂用于區分人類皮膚表面脂質中的內源和外源組分的用途,”J?Am?Oil?Chem?Soc?42:702-707(1965)以及Narendran等,“肺表面活性物質與胎脂之間的相互作用:誘導羊水混濁的潛在機制,”Pediatr?Res?48:120-124(2000)),并且它是由24周孕齡的胎兒皮膚開始產生的,并持續至足月產(Moore等,“胎兒接觸可卡因:皮質的分析,”J?Anal?Toxicol?20:509-511(1996))。在妊娠末三個月中,胎脂脫落為顆粒物,并懸浮在羊水中(Narendran等,“肺表面活性物質與胎脂之間的相互作用:誘導羊水混濁的潛在機制,”PediatrRes?48:120-124(2000)以及Yoshio等,“人類胎脂和羊水中的抗微生物多肽:新生兒先天防御的本質,”Pediatr?Res?53:211-216(2003)),這可能是由同樣進入羊水的肺表面活性物質磷脂輔助的。胎兒在懷孕末期通常會吞咽包括胎脂在內的大約500毫升量的羊水(Miettinen等,“對胎脂、羊水和胎糞中甾醇的氣-液色譜和質譜研究,”Acta?Chem?Scand22:2603-2612(1968)以及Sherman等,“胎兒吞咽:肌電描記術與食道液流的關聯,”Am?J?Physiol258:R1386-1394(1990))。這樣,在末期,胎兒的腸道通常是暴露在胎脂及其BCFA中的,他們的持續增加是促進分娩的方式。

    胎脂的干物質包含大致相等數量的蛋白和脂質(Pickens等,“胎脂的表征:含水量、形態學和元素分析,”J?Invest?Dermatol?115:875-881(2000)以及Hoeger等,“人類胎脂中的表皮屏障脂質:胎脂和胎兒皮膚中的神經酰胺模式,”Br?J?Dermato?l?146:194-201(2002))。胎脂中的脂質部分已經得到了全面的表征(Nicolaides等,“來自胎脂和來自人類皮膚表面脂質的蠟酯和甾醇酯中的脂肪酸,”Lipids?7:506-517(1972);Rissmann等,對胎脂的超微結構、脂質組成和組織的新洞察,”J?Invest?Dermatol126:1823-1833(2006)以及Kaerkkaeinen等,“胎脂中的脂質,”J?InvestDermatol?44:333-338(1965)),且顯示為25%-30%的甾醇酯(SE)、18-36%甘油三酯(TAG)、12-16%蠟酯(WE)、9%的鯊烯、5%的神經酰胺,而且一些人還檢測到了少量的非酯化脂肪酸(NEFA)級分(Rissmann等,“對胎脂的超微結構、脂質組成和組織的新洞察,”J?Invest?Dermatol?126:1823-1833(2006)以及Tollin等,“基于多肽、脂質及其相互作用而作為多組分防御系統的胎脂,”Cell?Mol?Life?Sci?62:2390-2399(2005))但另一些人卻未檢測到(Nazzaro-Porro等,“老化對皮膚表面脂質中的脂肪酸的作用,”J?Invest?Dermatol?73:112-117(1979))。BCFA在所有的帶有酰基的脂質中都能找到,WE(16%-53%)和SE(27%-62%)(Nicolaides等,“來自胎脂和來自人類皮膚表面脂質的蠟酯和甾醇酯中的脂肪酸,”Lipids7:506-517(1972);Rissmann等,“對胎脂的超微結構、脂質組成和組織的新洞察,”J?Invest?Dermatol?126:1823-1833(2006)以及Kaerkkaeinen等,“胎脂中的脂質,”J?Invest?Dermatol?44:333-338(1965)以及Nazzaro-Porro等,“老化對皮膚表面脂質中的脂肪酸的作用,”J?InvestDermatol?73:112-117(1979));以及在TAG(18%-21%)和NEFA(21%)級分中找到(Rissmann等,“對胎脂的超微結構、脂質組成和組織的新洞察,”J?Invest?Dermatol126:1823-1833(2006))。

    除了皮膚外(Nicolaides等,“皮膚脂質.3.皮膚脂質中的脂肪鏈.胎脂用于區分人類皮膚表面脂質中的內源和外源組分的用途,”J?Am?OilChem?Soc?42:702-707(1965);Nicolaides等,“來自胎脂和來自人類皮膚表面脂質的蠟酯和甾醇酯中的脂肪酸,”Lipids?7:506-517(1972)以及Nicolaides等,“皮膚脂質:其生物化學獨特性,”Science?186:19-26(1974)),BCFA在內部組織中的水平很低(Nicolaides等,“皮膚脂質:其生物化學獨特性,”Science?186:19-26(1974)),但還發現存在于人類乳汁中(Jensen等,“乳汁組成手冊,”Academic?Press?Inc.,San?Diego.(1995);Egge等,“人類乳汁的次要成分.IV.支鏈脂肪酸的分析,”ChemPhys?Lipids?8:42-55(1972)以及Gibson等,“人類初乳和成熟母乳的脂肪酸組成,”Am?J?Clin?Nutr?34:252-257(1981)),濃度占到所有脂肪酸(FA)的1.5%w/w。這個水平和同樣乳汁中的二十二碳六烯酸(DHA,22:6n-3)以及花生四烯酸(ARA,20:4n-6)的水平相當或者在某些情況下更高。例如,在一篇1981年發表的報告中指出,在澳大利亞婦女的初乳中,反異17∶0的濃度占總FA的0.45%w/w,比DHA(0.32%w/w)和ARA(0.4%w/w)的濃度高(Gibson等,“人類初乳和成熟母乳的脂肪酸組成,”Am?J?Clin?Nutr?34:252-257(1981))。

    胎糞,新生兒的第一次排泄物,第一次出現在胎兒的胃腸道是在約12周孕齡時,一般會在出生后排出(Ahanya等,“子宮中的胎糞解出:機制、結果和操控,”Obstet?Gynecol?Surv?60:45-56(2005);Gareri等,“在胎糞中檢測藥物濫用,”Clin?Chim?Acta?366:101-111(2006);以及Ostrea等,“胎糞中的脂肪酸乙酯:它們是胎兒接觸醇和作用的生物標志物嗎?”Alcohol?Clin?Exp?Res?30:1152-1159(2006))。它由羊水殘留物、皮膚和胃腸(GI)的上皮細胞、胃腸分泌物和酶、脂質、糖類、蛋白質、膽固醇、甾醇、膽汁酸和鹽組成(Ahanya等,“子宮中的胎糞解出:機制、結果和操控,”Obstet?Gynecol?Surv?60:45-56(2005);Gareri等,“在胎糞中檢測藥物濫用,”Clin?Chim?Acta?366:101-111(2006);Buchanan等,“正常胎糞和來自患有胎糞性腸梗阻患者的胎糞的化學比較,”Pediatrics?9:304-310(1952);以及Righetti等,“新生兒中胎糞組成的質子核磁共振分析,”J?Pediatr?Gastroenterol?Nutr?36:498-501(2003))。胎糞包含12%干重的脂質(Buchanan等,“正常胎糞和來自患有胎糞性腸梗阻患者的胎糞的化學比較,”Pediatrics?9:304-310(1952))并且只有一項未經確認的研究報道了胎糞中的BCFA(Terasaka等,“人類胎糞的游離脂肪酸,”Biol?Neonate?50:16-20(1986))。目前還沒有關于在同一個嬰兒體內胎脂和胎糞中BCFA的組成的研究。

    假設足月新生兒的胎脂BCFA可以保持活性地通過消化道并在胎糞中被找到。想要驗證這個假設就要表征在胎脂及胎糞中的相關BCFA的特性并以此來確定子宮內無菌的胎兒腸道對該特性的改變程度。

    本發明指向克服這個領域的空缺。

    發明概述

    本發明的第一個方面涉及預防或治療受治療者的胃腸病癥的方法,該方法包括在有效預防或治療受治療者的胃腸病癥的條件下,將所述一種或多種支鏈脂肪酸施用于受治療者。

    本發明的第二個方面涉及促進受治療者的胃腸健康的方法,該方法包括在有效促進受治療者的胃腸健康的條件下,將一種或多種支鏈脂肪酸施用于受治療者。

    本發明的第三個方面涉及促進益生生物的繁殖的方法,該方法包括提供包含益生生物的細胞群,并在有效促進細胞群中益生生物繁殖的條件下,將一種或多種支鏈脂肪酸施用于細胞群。

    本發明的第四個方面涉及一種制劑,該制劑包括一種或多種支鏈脂肪酸和被所述一種或多種支鏈脂肪酸乳化的水相,其中所述制劑包括25wt%以上的一種或多種支鏈脂肪酸。

    懸浮在羊水中的胎脂一般是被后期的胎兒吞咽下去。假設長期以來已知是胎脂主要組分的支鏈脂肪酸(BCFA)可以在胎糞中被找到,并且其特性會存在系統性差異。胎脂和胎糞從足月新生兒處被收集和分析。包含BCFA的脂質占到胎脂干重的約12%,而且以飽和的為主,并且每個BCFA具有11到26個碳。相比之下,胎糞BCFA具有16到26個碳,并且為干重的約1%。胎糞BCFA大多數是異(iso)構型,但是胎脂BCFA包括二甲基和中鏈分支以及五個反異(anteiso)BCFA。在孕期最后一個月,作為吞咽的胎脂顆粒進入胎兒腸道的BCFA的質量據估計是180mg,然而在胎糞中發現的BCFA的總質量據估計是16mg,所以大部分的BCFA從胎兒的腸道中消失了。胎脂及胎糞中BCFA的特性顯示BCFA是正常健康的足月新生兒腸胃道的主要組分。BCFA是在腸道建群中起作用的藥劑的候選物,并且應被認為是胎兒/新生兒的營養組分。

    附圖簡述

    圖1顯示的是胎脂和胎糞的BCFA甲酯的特性(平均值±SEM,n≤18個新生兒),從左到右以分子量順序列出。平均值是針對來自至少三個新生兒的樣品中出現的那些FA。異-BCFA具有二甲基末端結構:異-16:0和14-甲基-15:0(14-甲基-十五烷酸)同義。反異-BCFA在n-2位有一個甲基分支:反異-17:0和14-甲基-16:0(14-甲基-十六烷酸)同義,i=異;ai=反異;Me=甲基;diMe=兩個甲基分支。圖標:□胎脂;■胎糞。*p<0.05

    圖2顯示的是在胎脂及胎糞中的異BCFA甲酯(平均值±SEM,n≤18個新生兒),從左到右以分子量順序列出。i=異。圖標:□胎脂;■胎糞。*p<0.05

    圖3顯示的是在胎脂及胎糞中的反異BCFA甲酯(平均值±SEM,n≤18個新生兒),從左到右以分子量順序列出。ai=反異。圖標:□胎脂;■胎糞。*p<0.05

    圖4顯示的是胎脂中的正(直鏈)FAME(平均值±SEM,n≤18個新生兒),從左到右以分子量順序列出。圖標:□胎脂;■胎糞。*p<0.05

    圖5A-C顯示的是來自Caco-2BCFA的攝取實驗的GC/MS重建離子色譜(RIC)。RIC部分顯示的是飽和的和單不飽和的C14-18脂肪酸。圖5A和5C被調整至n-16:0與18:1異構體相匹配的比例,這是為了方便直觀地比較相對豐度。圖5A顯示對照Caco-2細胞,其顯示無顯著的BCFA。圖5B顯示的是純BCFA的混合物(異-14:0、反異-17:0、異-18:0、異-20:0)。圖5C顯示的是來自圖5B中的BCFA-處理的BCFA的總FA。檢測到了作為細胞生物合成新產物的異-16:0,它最有可能是從異-14:0通過鏈的延長得到的。RIC是從每一秒收集的完整質譜重建的,可以肯定地鑒定結構分配。

    圖6A-E顯示的是從用BCFA處理的Caco-2細胞中純化得到的磷脂脂肪酸。圖6A顯示的是天然(未處理的)細胞的RIC。圖6B顯示的是BCFA處理的細胞的RIC。圖6C顯示的是選擇的離子的色譜圖,其示出16:的0洗脫。圖6D顯示的是圖6B中第一個峰的質譜圖,具有新合成的異-16:0的特征。圖6E顯示的是通常存在于細胞中的n-16:0的質譜圖,有可忽略不計的m/z?255峰(損失甲基)。

    圖7顯示的是來自BCFA處理的Caco-2細胞的單酰基甘油(MAG)FA。BCFA混合物在MAG?FA中占主導地位,而且他們以與圖5B中顯示的母游離脂肪酸混合物接近的比例被表示出來。將異-20:0對異-14:0的峰高和圖6B中的峰高進行比較。還注意到異-16:0對異-14:0的比與圖6B中的相比時小,指示在這一脂質類別中出現相對低的異-16:0的生物合成。

    圖8顯示的是在母游離脂肪酸混合物中以及在BCFA處理的Caco-2細胞的脂質中的BCFA的分布型。異-16:0存在于所有的細胞提取物中。尤其注意,該選擇不利于PL中的異-20:0,但有利于MAG中的異-20:0。

    圖9顯示有胎脂時短雙歧桿菌(B.breve)(TSB)或者菊糖芽孢乳桿菌(S.inulinus)(TSB或NB)的生長相對于對照來說增強了。病原體的生長不受胎脂的影響。較高的胎脂曲線偏移是由于胎脂中的不溶顆粒物而致。

    發明詳述

    本發明的一個方面涉及預防或治療受治療者的胃腸病癥的方法,該方法包括在有效預防或治療受治療者的胃腸病癥的條件下,將所述一種或多種支鏈脂肪酸施用于受治療者。

    本發明的第二個方面涉及促進受治療者的胃腸健康的方法,該方法包括在有效促進受治療者胃腸健康的條件下,將一種或多種支鏈脂肪酸施用于受治療者。

    對于每一個方法,可以選擇需要的受治療者。預防或治療受治療者胃腸病癥的方法可以在人類中進行,特別是在胎兒、嬰兒、新生嬰兒、兒童或成人中進行。

    胃腸病癥可以受病原菌對受治療者的胃腸道感染的介導(如壞死性小腸結腸炎),或者可能需要對受治療者的胃腸道的微生物建群(如連同抗生素治療)。胃腸病癥還可以是涉及炎癥的腸疾病,如炎性腸病。

    總的來說,依據本發明的支鏈脂肪酸可以是非酯化的脂肪酸或可以被共價連接到脂質,包括蠟酯、甾醇酯、三酰基甘油或任何其他天然或人工的與脂質相關的分子物種。

    支鏈脂肪酸可以是C11到C26的支鏈脂肪酸及其混合物。支鏈脂肪酸可以是4,7-二甲基-壬酸、4,8-二甲基-癸酸、8-甲基-十一烷酸、異-十二烷酸、4,8-二甲基-十一烷酸、4,9-二甲基-十一烷酸、異-十三烷酸、反異-十三烷酸、4,10-二甲基-十二烷酸、異-十四烷酸、4,11-二甲基-十三烷酸、異-十五烷酸、反異-十五烷酸、8,10-二甲基-十四烷酸、4,12-二甲基-十四烷酸、異-十六烷酸、2-甲基十六烷酸、4,11-二甲基-十五烷酸、4,13-二甲基-十五烷酸、異-十七烷酸、反異-十七烷酸、異-十八烷酸、異-二十烷酸、反異-二十一烷酸、異-十二烷酸、異-二十四烷酸、異-二十五烷酸、反異-二十五烷酸、異-二十六烷酸、植烷酸、降植烷酸或其混合物。

    支鏈脂肪酸還可以是飽和的和單不飽和的脂肪酸或其混合物。

    此外,支鏈脂肪酸可以是脂肪酸的支鏈形式,所述脂肪酸例如為辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、二十烷酸、棕櫚油酸(palmitoliec?acid)、油酸或其混合物。

    不考慮其作用的方式,治療劑可以以藥物組合物的形式被施用于患者,該藥物組合物還包括藥學上可接受的載體。該藥物組合物可以呈液體或固體劑型的形式,包括但不限于片劑、膠囊、粉末、溶液、懸浮液或乳液。

    本發明的治療劑,由此本發明的藥物組合物可以以口服、腸胃外、皮下、靜脈內、肌肉內、腹膜內、通過鼻內滴注、通過植入、通過腔內或膀胱內滴注、眼內、動脈內、病灶內、經皮、通過施加于粘膜(如,鼻、咽喉和支氣管的粘膜),或通過引入到一個或多個淋巴結而被施用。

    除了被用于藥物組合物中之外,根據本發明的支鏈脂肪酸還可以被添加到多種食品中的任一種中,所述食品包括牛奶、嬰兒配方、嬰兒食品、膳食補充劑、植物油、蛋黃醬和調味品、酸奶、人造黃油和涂味品、起酥油,和任何包括脂肪的或可以用脂肪配制的食品。

    本發明的第三個方面涉及促進益生生物的繁殖的方法,該方法包括提供包含益生生物的細胞群,并在有效促進細胞群中益生生物繁殖的條件下,將一種或多種支鏈脂肪酸施用于細胞群。

    促進益生生物繁殖的方法可以在體外或體內進行。

    益生生物可選自由以下組成的組:乳桿菌屬(Lactobacillus)物種、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)物種、其他乳酸菌和非乳酸菌及其混合物。

    益生生物可以是乳桿菌屬物種,如嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、食淀粉乳桿菌(L.amylovorus)、短乳桿菌(L.brevis)、干酪乳桿菌(L.casei)、干酪乳桿菌鼠李糖亞種(L.casei?subsp.rhamnosus,乳桿菌GG(Lactobacillus?GG))、高加索乳桿菌(L.caucasicus)、卷曲乳桿菌(L.crispatus)、德氏乳桿菌保加利亞亞種(L.delbrueckii?subsp.bulgaricus,保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus))、發酵乳桿菌(L.fermentum,L.fermenti)、加氏乳桿菌(L.gasseri)、瑞士乳桿菌(L.helveticus)、約氏乳桿菌(L.johnsonii)、乳乳桿菌(L.lactis)、賴氏乳桿菌(L.leichmannii)、類干酪乳桿菌(L.paracasei)、植物乳桿菌(L.plantarum)、路氏乳桿菌(L.reuteri)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)或其混合物。

    益生生物可以是雙歧桿菌屬物種,如青春雙歧桿菌(B.adolescentis)、兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)、短雙歧桿菌(B.breve)、嬰兒雙歧桿菌(B.infantis)、乳雙歧桿菌(B.lactis,動物雙歧桿菌(B.animalis))、地衣雙歧桿菌(B.licheniformis)、長雙歧桿菌(B.longum)或其混合物。

    益生生物可以是乳酸菌,如屎腸球菌(Enterococcus?faecium)、乳乳球菌(Lactococcus?lactis)、腸膜明串珠菌(Leuconstoc?mesenteroides)、乳酸片球菌(Pediococcus?acidilactici)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)或其混合物。

    益生生物可以是非乳酸菌,如枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)、大腸桿菌尼氏菌株(Escherichia?coli?strain?nissle)、鮑氏酵母菌(Saccharomyces?boulardii)、釀酒酵母菌(Saccharomyces?cerevisiae)或其混合物。

    在一定程度上,繁殖益生生物的方法是在受治療者中進行的,其以與上述大致相同的方式被配制并施用。

    益生菌已證明在NEC(壞死性小腸結腸炎)試驗中有效,尤其是嗜酸乳桿菌和嬰兒雙歧桿菌的組合(Hoyos?AB,“與對重癥監護室中新生兒腸施用嗜酸乳桿菌和嬰兒雙歧桿菌有關的壞死性小腸結腸炎的減少的發病率,”Int?J?Infect?Dis?3:197-202(1999)以及Lin等,“口服益生菌減少極低出生體重嬰兒中壞死性小腸結腸炎的發病率和嚴重度,”Pediatrics?115:1-4(2005),在此通過引用將其全部內容并入本文)或嬰兒雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌和兩歧雙歧桿菌的組合(Bin-Nun等,“口服益生菌預防極低出生體重嬰兒中的壞死性小腸結腸炎,”J?Pediatr?147:192-6(2005),在此通過引用將其全部內容并入本文)。

    益生菌主要在發酵食品和奶制品中被銷售,特別是在酸奶類產品中,其構成了益生菌產品市場的最大部分(Heller等,“發酵食品中的益生菌:產品特征和起子生物,”Am?J?Clin?Nutr?73(suppl):374S-9S(2001),在此通過引用將其全部內容并入本文)。如本文所用的,“益生菌”被定義為有生存能力的微生物,足夠數量的益生菌到達活動狀態的腸,并由此產生積極的健康影響。(de?Vrese等,“益生菌、益生元和合生元,”AdvBiochem?Eng?Biotechnol?111:1-66(2008),在此通過引用將其全部內容并入本文)。

    本發明的第四個方面涉及一種制劑,該制劑包括一種或多種支鏈脂肪酸和被所述一種或多種支鏈脂肪酸乳化的水相,其中所述制劑包括25wt%以上的一種或多種支鏈脂肪酸。

    該制劑可包括至多98wt%,優選至多70wt%的支鏈脂肪酸或其混合物。此外,該制劑的支鏈脂肪酸或其混合物可包含至多20wt%的異肉豆蔻酸、異十五烷酸、反異十五烷酸、異棕櫚酸、異二十烷酸、反異二十烷酸、異二十二烷酸、異二十四烷酸、異二十六烷酸或其組合。該制劑還可包括乳化劑。

    胎脂具有29%的BCFA,胎糞為約12%,而母乳為約1%。胎脂和胎糞存在于胎兒和剛出生的新生兒中,而母乳則在胎兒出生后施用。設計本發明的制劑以達到相比于胎脂更好的結果。對于BCFA而言,在水(水性)相中被乳化是有利的。這種乳液并不對應于存在于胎脂、或胎糞或母乳中的任何物質。用于預防或治療胃腸(GI)道的異常細菌群落以及用于優化腸健康的合適的BCFA制劑,將是脂肪和至多50%脂肪的水溶液的混合物。水相包括與胃腸道相容的任何溶液。應該用任何適用于兒童使用的食品級乳化劑如大豆卵磷脂將該混合物乳化。

    實施例

    下面的實施例用來說明本發明的實施方案,然而決不是為了限制其范圍。

    實施例1-5的材料和方法

    樣品采集

    從Cayuga?Medical?Center?in?Ithaca,NY的18個正常足月新生兒收集18個胎脂和胎糞樣品。在分娩室中,從肩區取下胎脂,置于干凈的管中,并在-80℃存儲直到分析。從尿布上收集胎糞并相似地移放到干凈的管中,且在-80℃存儲直到分析。

    FA分析

    根據修改的Bligh和Dyer方法(Bligh等,“總脂質提取和純化的快速方法,”Can?J?Biochem?Physiol?37:911-917(1959),在此通過引用將其全部內容并入本文)從胎脂和胎糞樣品中提取總脂質。脂肪酸絕大多數存在于哺乳動物的污物(如胎脂和胎糞)中,以作為更高分子量的脂質分子(如TAG、SE和WE)成分的酰基部分的形式。為了詳細的分子分析,水解脂肪酰基基團并合成脂肪酸甲酯(FAME)用以分析。使用在甲醇(Sigma?Chemical,St,Louis,MO.)中的14%BF3來制備FAME。丁基化的羥基甲苯(BHT)被加入到甲醇中用作抗氧化劑。氯仿中的十七烷酸(Sigma?Chemical,St?Louis,MO)作為內部標準。這一常規步驟掩蓋了十七烷酸,其在哺乳動物組織中通常是罕見的,但存在于胎脂和胎糞中。由于在這些樣品中FA的非凡的多樣性,任何內部標準都干擾了一些樣品中的一種或多種FA的分析。進行校正以便估計干擾的程度,并且相對于外部標準對該信號進行仔細的校準。

    FAME的分析是運用Hewlett?Packard?5890系列II氣相色譜儀(GC)完成的。BPX-70柱(60m×0.32mm×0.25μm,SGE,Austin,TX)被用于分析,以H2為載氣。FAME的身份通過化學電離(CI)和電子轟擊(EI)質譜(MS)而被確定,使用了耦合到Varian?Saturn?2000離子阱MS的Varian?Star?3400GC。BCFA的FAME的身份是基于每種物質的GC保留時間及其電子轟擊質譜。FAME的質譜的歸屬是按照Yang等人所描述的方法通過將FAME轉化為甲基吡啶基酯衍生物(Yang等,“甲基吡啶基酯碎裂機理研究與酯交換之后鑒定酰基肉毒堿酰基的應用,”J?AmSoc?Mass?Spectrom?17:1620-1628(2006),在此通過引用將其全部內容并入本文),之后又通過GC/MS分析并與文獻的圖譜比較而確定的(Carballeira等,來自嗜鹽芽孢桿菌屬物種的新型甲基-支鏈脂肪酸的表征,”J?Nat?Prod?64:256-259(2001);Suutari等,“在δ5和δ9不飽和異和反異支鏈脂肪酸鑒定中的特征GLC-MS離子,”J?Microbiol?Methods17:39-48(1993);Karlsson等,“對鳥類羽蠟的研究,”Arkiv?for?Kemi?31:143-158(1969);Yu等,“在脂肪酸中甲基分支的位置:通過4,4-二甲基惡唑啉衍生物的GC-MS確定上海鴨的尾羽分泌中的脂肪酸,”Lipids23:804-810(1988);Apon等,“通過毛細管GC/MS確定甲基支鏈脂肪酸甲酯的位置異構體,”J?Chromatogr?Sci?13:467-473(1975);以及Harvey等,“通過使用甲基吡啶基和煙酸酯鑒定來自人類耳垢的長鏈脂肪酸和醇,”Biomed?Environ?Mass?Spectrom?18:719-723(1989),在此通過引用將其全部內容并入本文)。

    相同重量的FAME混合物(68A;Nuchek?Prep,Elysian,MN)被用于計算響應因子。下列也被做為標準:n-11:0到n-24:0(Nuchek?Prep,Elysian,MN);異13:0、反異13:0、異15:0、反異15:0、異17:0、反異17:0(LarodanFine?Chemicals?AB,Malmo,Sweden)和10-甲基十六烷酸(Matreya?LLC,Pleasant?Gap,PA)。對于所有11到32個碳的FA,將FA水平表示為占總脂肪酸的重量%。

    統計學

    為了研究群體的特征,將數據表示為平均值±SD,而為了繼續FA分析,將數據表示為平均值±SEM。統計學分析是用JMP6(SAS?Institute,Cary,NC)進行的。對于非零差異,使用了一個樣本的T檢驗計算了每種FA的平均的差異,p<0.05表示顯著性的。

    受治療者

    將研究群體的特點列于表1中。除了所注意的以外,沒有一個新生兒出現并發癥。除了兩個新生兒以外,所有的新生兒都是經陰道分娩的。六位母親在懷孕期間接受了抗生素治療,其中5位生下女嬰。

    表1.研究群體的特征(平均值±SD(范圍))

    

    *剖腹產

    實施例1-總FA的分布

    在表2中顯示了FA類別的分布型。所有類別的比較在p<0.05水平上都是顯著性的。BCFA幾乎占胎脂中所有FA的三分之一(29.1±1.5%w/w),并且顯著地高于在胎糞中的平均水平(17.5±1.3%w/w;p<0.05)。這種BCFA的下降伴隨著正(n-)飽和FA(n-SFA)的相反的增加,具體地,在胎脂中34+1.9%w/w以及在胎糞中51.3+3.0%w/w(P<0.05)。比較起來,n-單不飽和脂肪酸(MUFA)與多不飽和脂肪酸(PUFA)的差異是適度的。

    表2.胎脂及胎糞中FA類別的分布型(%w/w)(平均值±SEM)

    

    總的來說,從它們天然的脂質化合物中水解的BCFA占胎脂干重的5.8%,對應于大約占天然的含BCFA的脂質中的胎脂干重的12%。胎糞含有0.55%干重的水解的BCFA和估計1%的含BCFA的脂質。

    實施例2-BCFA在胎脂和胎糞中的分布

    圖1是針對在來自至少三個新生兒的樣品中檢測的BCFA,關于胎脂和胎糞中的BCFA特性的圖形匯總,從左至右以碳原子數的順序呈現。總體上,在胎脂中鑒別了30種BCFA,而在胎糞中也檢測到了9種。胎脂BCFA碳原子范圍從11到26,并且除2種異單不飽和脂肪酸外,主要是飽和的。異BCFA、反異BCFA、中鏈單甲基BCFA和二甲基BCFA全部在胎脂BCFA中被檢測到。相比之下,胎糞BCFA含有非常更加有限范圍的碳原子數,從16到26個碳原子。在9種胎糞BCFA中有8種為異BCFA,其中有兩種為MUFA,一種為反異。

    實施例3-胎脂和胎糞中的異BCFA的分布型

    如圖2中所示,胎脂異BCFA的分布型具有從異-12:0至異-16:0的奇數碳和偶數碳原子數的FA,僅在更長碳鏈情況下為偶數碳原子數。相比之下,在其分布型中,在胎糞異BCFA中主要是最短鏈BCFA占優勢,異-16:0是任何其他BCFA的相對濃度的兩倍以上。8種出現在胎脂和胎糞中的異-BCFA中的5種在各自的分布型中BCFA的比例有很大的差異;在胎糞中長鏈支鏈脂肪酸的優勢導致在鏈數為20至26個碳原子的四種異-BCFA中的3種中有顯著性差異。

    實施例4-反異BCFA的分布型

    如圖3中所示,在胎脂中檢測到的全部5種反異BCFA為奇數碳原子的。它們的范圍是從13到25個碳原子,在胎糞中僅僅發現一種,反異17:0。

    實施例5-胎脂和胎糞的直鏈分布型,n-FA的分布型

    如圖4中所示,胎脂的正FA具有11至26個碳原子,胎糞FA具有14至26個碳,并且二者都含有較少的奇數鏈數的FA。此外,胎糞BCFA趨向于具有更高的分子量。

    在健康足月嬰兒的胎脂和胎糞中都存在BCFA表明了BCFA是一種正常足月新生兒腸道內容物的主要組成部分,它們在胎糞中的存在意味著它們在整個腸道長度中都存在。因此,BCFA是一種在分娩或剖腹產期間或其之后立即,在腸建群的初始階段首先出現的很少幾種環境微生物時存在的胃腸道環境的一個組成部分。在胎糞中,在BCFA分布型中向高分子量的系統性位移以及除異-BCFA外大多數BCFA的不存在表明,胎兒消化道容易吸收和消化大多數BCFA。

    關于母乳中的BCFA有很多報道,最早和最廣泛地表明,54種BCFA的累積濃度為1.5%(Egge等,“人類乳汁的次要成分.IV.支鏈脂肪酸的分析,”Chem?Phys?Lipids?8:42-55(1972),在此通過引用將其全部內容并入本文)。1981年的一篇文章測定了成熟澳大利亞人母乳中BCFA的濃度總共為0.84%w/w,并且初乳中一種BCFA反異-17:0為脂肪酸的0.45%w/w,超過了同一母親的成熟母乳中的DHA的濃度(0.32%w/w)及ARA的濃度(0.40%w/w)(Gibson等人,“人類初乳和成熟母乳的脂肪酸組成,”Am?J?Clin?Nutr?34:252-257(1981),在此通過引用將其全部內容并入本文)。Chen報道了在加拿大母乳中四種BCFA的累積濃度為0.58%w/w(Chen等,“加拿大人乳汁中的反式脂肪酸異構體,”Lipids?30:15-21(1995),在此通過引用將其全部內容并入本文。對加利福尼亞州婦女的研究表明,四種報道的BCFA(15:0,16:0,17:0,18:0,支鏈位置沒有報道)的平均濃度為0.60%(Aitchison等,“飲食對人類乳汁中反式脂肪酸的影響,”Am?J?Clin?Nutr?30:2006-2015(1977),在此通過引用將其全部內容并入本文)。Corso在意大利南部40名婦女的乳汁中發現了6種BCFA(Corso等,“來自生活于意大利南部的四十位產婦的人類乳汁中脂肪酸的氣相色譜-質譜分析,”Riv?Eur?Sci?Med?Farmacol?17:215-219(1995),在此通過引用將其全部內容并入本文),反異-17:0范圍占總脂肪酸的0.12-0.93%。這個變化幅度與DHA的變化幅度不同;母乳DHA的變化范圍在0.06%w/w到1.40%w/w之間(Brenna等,“世界范圍的人類母乳中二十二碳六烯酸和花生四烯酸的濃度,”Am?J?Clin?Nutr?85:1457-1464(2007),在此通過引用將其全部內容并入本文)。許多但不是所有的母乳脂肪酸濃度與飲食攝取的脂肪酸或其前體(包括DHA,報道的寬范圍歸因于DHA)密切相關(Brenna等,“世界范圍的人類母乳中二十二碳六烯酸和花生四烯酸的濃度,”Am?J?Clin?Nutr?85:1457-1464(2007),在此通過引用將其全部內容并入本文)。在大多數母乳FA論文中BCFA鑒別的缺乏很可能是由于它們的低濃度、它們在色譜圖中在主要的飽和的和單不飽和的脂肪酸中以GC痕量出現以及對于它們來說強制代謝作用的歷史性缺乏。

    在子宮內腸道暴露于可能來自母乳的BCFA比其他生命時期要多,因為BCFA在日常食物中處于微量水平。由人腸道中的BCFA和其他組成部分所代表的獨特小環境在建群期間也許對共生菌的建立來說非常重要。BCFA是很多種細菌的突出的膜元件。(Kaneda等.,“細菌中的異和反異脂肪酸:生物合成、功能和分類學意義,”Microbiol?Rev55:288-302(1991)以及Huang等,“菊糖芽孢乳桿菌BCRC?14647的潛在益生性質的基礎表征,”Curr?Microbiol?54:396-404(2007),在此通過引用將其全部內容并入本文)。例如,在包括菊糖芽孢乳桿菌(最近被證明是一種益生菌)在內的幾種桿菌和乳酸桿菌中,BCFA約占FA的95%(Huang等人,“菊糖芽孢乳桿菌BCRC?14647的潛在益生性質的基礎表征,”Curr?Microbiol?54:396-404(2007),在此通過引用將其全部內容并入本文)。9種雙歧桿菌屬菌株的FA包括各種水平的BCFA,如異-14:0、反異-15:0、異-16:0和異-18:0(0.6-24.6%w/w)。在短雙歧桿菌中,異-14:0是第二位最豐富的FA,高達24.6%w/w(Veerkamp等,“雙歧桿菌屬和乳桿菌屬菌株的脂肪酸組成,”J?Bacteriol?108:861-867(1971),在此通過引用將其全部內容并入本文)。可以合理地假設,BCFA在新生兒腸道中的存在將改變優勢種的混合,有助于在它們膜中使用BCFA的那些生物,據推測,BCFA是人類胎兒腸道的一種獨特特征,有助于建群期間共生菌的生長。

    這種假設暗示極早產兒胃腸道的建群,并可能是壞死性小腸結腸炎(NEC)發展的因素,其病因和發病機制還沒有被很好地了解(Caplan等,“雙歧桿菌補充減少了新生大鼠模型中壞死性小腸結腸炎的發病率,”Gastroenterology?117:577-583(1999)以及Claud等,“假設:早產兒腸道不適當的建群可導致新生兒壞死性小腸結腸炎,”Faseb?J?15:1398-1403(2001),在此通過引用將其全部內容并入本文)。NEC是早產兒發病的主要原因之一(Caplan等,“雙歧桿菌補充減少了新生大鼠模型中壞死性小腸結腸炎的發病率,”Gastroenterology?117:577-583(1999),在此通過引用將其全部內容并入本文),盡管其肯定與病原體的過度生長有關(Hallstrom等,“遞送模式和壞死性小腸結腸炎對早產兒腸道微生物菌落的影響.”Eur?J?Clin?Microbiol?Infect?Dis?23:463-470(2004),在此通過引用將其全部內容并入本文)。以經驗為支撐的主導假說是NEC與早產、腸道喂養和細菌建群有關(Claud等,“假設:早產兒腸道不適當的建群可導致新生兒壞死性小腸結腸炎,”Faseb?J?15:1398-1403(2001),在此通過引用將其全部內容并入本文)。重要的是,這在出生前不曾被觀察到。NEC的危險在較低孕齡嬰兒中較高,在足月嬰兒中較罕見(Beeby等,“壞死性小腸結腸炎的風險因子:孕齡的影響,”Arch?DisChild?67:432-435(1992),在此通過引用將其全部內容并入本文)。母乳喂養與NEC的低發病率有關(Claud等,“假設:早產兒腸道不適當的建群可導致新生兒壞死性小腸結腸炎,”Faseb?J?15:1398-1403(2001)以及Lucas等,“母乳和新生兒壞死性小腸結腸炎,”Lancet?336:1519-1523(1990),在此通過引用將其全部內容并入本文)。盡管沒有一種特定的病原菌與NEC有關(Lucas等,“母乳和新生兒壞死性小腸結腸炎,”Lancet336:1519-1523(1990),在此通過引用將其全部內容并入本文),但給早產動物和嬰兒補充益生菌似乎可以降低其發病率(Caplan等,“雙歧桿菌補充減少了新生大鼠模型中壞死性小腸結腸炎的發病率,”Gastroenterology?117:577-583(1999)以及Hoyos等,“與對重癥監護室中新生兒腸施用嗜酸乳桿菌和嬰兒雙歧桿菌有關的壞死性小腸結腸炎的減少的發病率,”Int?J?Infect?Dis?3:197-202(1999),在此通過引用將其全部內容并入本文)。綜合這些原因,我們假設BCFA在增加適當的消化道建群方面起作用:胎脂在妊娠期24周左右開始出現,并且在羊水中積聚成顆粒直到足月(Narendran等,“肺表面活性物質與胎脂之間的相互作用:誘導羊水混濁的潛在機制,”Pediatr?Res?48:120-124(2000),在此通過引用將其全部內容并入本文),因此,極早產兒胃腸道是不會在出生前暴露于胎脂BCFA的。出生后,它們如若母乳喂養則將會暴露于BCFA,但配方奶喂養的早產兒將不會暴露于BCFA,因為它們不是早產配方奶的組成部分。最后,值得注意的是NEC的發病率隨著孕齡接近正常足齡而降低。因此后期早產兒可能會暴露于一些BCFA并可能獲益,如果假設是正確的話。

    BCFA進入和退出消化道的質量是可以估計的。在足月時,羊水脂質約有154毫克/升(Biezenski等,“對羊水脂質起源的研究I.正常組成,”Am?J?Obstet?Gynecol102:853-861(1968),在此通過引用將其全部內容并入本文),其中52mg/L是磷脂,它可能是來自于不含BCFA的肺表面活性物質(Narendran等,“肺表面活性物質與胎脂之間的相互作用:誘導羊水混濁的潛在機制,”Pediatr?Res?48:120-124(2000)以及Rissmann等,“對胎脂的超微結構、脂質組成和組織的新洞察,”J?InvestDermatol?126:1823-1833(2006),在此通過引用將其全部內容并入本文)。因此,羊水胎脂的FA的濃度大約是102毫克/升。其中,測量顯示,57%是FA,達到58毫克/升。數據(見表2)進一步表明,29%是BCFA,達到17毫克/升BCFA。據估計,胎兒在接近足月時每天吞下200至500毫升的羊水(Pritchard等,“正常胎兒和無腦畸形胎兒的吞咽,”ObstetGynecol?25:289-297(1965)以及Pritchard等,“胎兒吞咽和羊水體積,”Obstet?Gynecol?28:606-610(1966),在此通過引用將其全部內容并入本文),取此范圍的中間點350毫升/天,每天有6毫克的BCFA進入胎兒的胃腸道,在孕期最后一個月中總共有30×6=180毫克的BCFA進入胎兒的胃腸道。胎糞是從妊娠12個星期左右的整體胃腸道輸出的。據報道(Friel等,“來自早產嬰兒和足月嬰兒的胎糞中的痕量元素,”BiolNeonate?55:214-217(1989),在此通過引用將其全部內容并入本文)27個足月胎兒的總胎糞為8.9克濕重,平均32%的干重,或2.8g。數據表明,約0.55%是BCFA,或在胎糞中有大約16毫克的平均總BCFA。這個值是一個數量級,比在妊娠期最后一個月吞下的BCFA的估計值低,并且這提示在轉運過程中大部分的BCFA消失了。在胎糞中確實出現的BCFA的分布和結構特征反映了腸道細胞對胎脂的加工。本發明顯示,C11-15BCFA以及幾乎所有除異BCFA之外的BCFA從胎糞中缺失了并且因此必定是被代謝了。這一代謝的性質還有待于被確定,部分原因是BCFA及其與人類腸細胞的相互作用還沒有被研究。

    鏈的延伸是一種可能的代謝轉化,這將會解釋胎糞中C11-15的BCFA的缺乏和較長鏈的BCFA占優勢。支持這個假說的提示性證據可以在圖1的數據中找到。胎糞異-16:0的水平明顯地比胎脂異-16:0更高,其大致是胎脂異-14:0和異-16:0的總和,與胎脂異-14:0的延伸增加了存在的異-16:0的假設一致。類似的觀察適用于胎糞異-20:0和胎脂異-18:0和異-20:0。

    中鏈脂肪酸(C8-C14)通常被喂給早產兒,因為它們通過胃粘膜被有效地吸收,并直接通過門靜脈被輸送到肝,并且被不成熟的胃腸道氧化。雖然在胎糞中會缺失具有15個或者更少的碳原子的BCFA,但圖4顯示FA?n-14:0和n-15:0被部分地排泄掉。這一觀察意味著胎兒胃腸道會選擇性吸收和保留BCFA,這可能對于n-FA不能有效地運轉。

    現在的BCFA的測量與以前的數據一致。BCFA幾乎占胎脂中所有FA的三分之一(Kaerkkaeinen等,“胎脂中的脂質,”J?Invest?Dermatol44:333-338(1965)以及Nicolaides等,“在胎脂脂質的蠟酯中支鏈脂肪酸的結構,”Lipids?11:781-790(1976),在此通過引用將其全部內容并入本文),而且胎脂SFA、MUFA和PUFA的水平在以前的報告所包括的范圍之內(Rissmann等,“對胎脂的超微結構、脂質組成和組織的新洞察,”J?Invest?Dermatol?126:1823-1833(2006);Nicolaides等,“對胎脂脂質的飽和甲基支鏈脂肪酸的進一步研究,”Lipids?11:781-790(1976);以及Nicolaides等,“在胎脂脂質的蠟酯中支鏈脂肪酸的結構,”Lipids?11:901-905(1971),在此通過引用將其全部內容并入本文)。只有奇數碳原子的反異BCFA被找到了,與之前的一些報道一致(Nicolaides等,“對胎脂脂質的飽和甲基支鏈脂肪酸的進一步研究,”Lipids?11:781-90(1976);Nicolaides等,“在胎脂的蠟酯中支鏈脂肪酸的結構,”Lipids6:901-905(1971)以及Haahti等,“胎脂中的脂肪酸,”Scand?J?Clin?LabInvest?13:70-73(1961),在此通過引用將其全部內容并入本文),但是對于其他的并不相符(Rissmann等,“對胎脂的超微結構、脂質組成和組織的新洞察,”J?Invest?Dermatol?126:1823-1833(2006)以及Kaerkkaeinen等,“胎脂的脂質),”J?Invest?Dermatol?44:333-338(1965),在此通過引用將其全部內容并入本文)。在樣品的胎糞中BCFA平均為所有脂肪酸的17%w/w。顯示胎糞中的BCFA的單個的以前的研究只報道了游離脂肪酸級分,并且使用了GC,其保留時間與鑒定匹配。具有22和24個碳原子的異FA被鑒定分別占4%w/w和6%w/w,而九種其他的異-BCFA(C?14-21,25)暫時找到了歸屬,沒有提供百分數。

    雖然在胎脂中檢測到了5種反異BCFA,但反異-17:0是唯一在胎糞中檢測到的反異BCFA,并沒有明顯的解釋說明這是為什么。以無脂飲食的形式以100mg/周給剛斷奶的大鼠喂食反異-17:0,在其糞便中排泄了8-10%,并在脂肪組織中儲存相似的數量(LiVingston等,“大鼠中天然存在的(+)-14-甲基十六烷酸的代謝,”Biochem?J?65:438-440(1957),在此通過引用將其全部內容并入本文),顯然也轉化了少量的反異-15:0。其余的80%被代謝成反異FA以外的其他物質。在至少一項母乳的研究中已經報道,反異-17:0的水平在所有BCFA當中是最高的(Gibson等,“人類初乳和成熟母乳的脂肪酸組成,”Am?J?Clin?Nutr?34:252-257(1981),在此通過引用將其全部內容并入本文),而且值得注意的是,反異-17:0是多種細菌膜的主要脂質組分(Kaneda等,“細菌中的異和反異脂肪酸:生物合成、功能和分類學意義,”Microbiol?Rev?55:288-302(1991),在此通過引用將其全部內容并入本文)。

    胎脂樣品的中鏈單甲基和二甲基BCFA的組合水平與Nicolaides&Apon報道的在單胎脂樣品中的水平相似(Nicolaides等,“胎脂脂質的蠟酯中支鏈脂肪酸的結構,”Lipids?11:781-790(1976),在此通過引用將其全部內容并入本文)。在18個新生兒的樣品中,二甲基單甲基BCFA的平均比例高于中鏈單甲基BCFA。與之前的發現相一致,二甲基BCFA中的第一甲基支鏈主要位于鏈的第四個碳上(Nicolaides等,“胎脂脂質的蠟酯中支鏈脂肪酸的結構,”Lipids?11:781-790(1976)以及Nicolaides等,“在胎脂的蠟酯中支鏈脂肪酸的結構,”Lipids?6:901-905(1971),在此通過引用將其全部內容并入本文)。但是在本發明中,二甲基BCFA的半數第二甲基支鏈位于奇數碳原子上,在幾乎所有的二甲基BCFA中,這種甲基支鏈位于FA鏈的反異碳原子上。

    總之,在胎脂和胎糞之間在BCFA組成方面存在著引人注目的和系統性的差異,這表明在胎兒的胃腸道中BCFA被活躍地代謝。這一觀察意味著胎脂應該被認為是營養劑,并且在正常足月新生兒胃腸道中,BCFA是一種正常的并且在數量上是主要的成分。進一步研究也保證通過對BCFA被腸細胞攝取和代謝以及在細菌建群過程中BCFA的作用的理解。在早產兒面臨的最糟糕情況下,胎脂和BCFA在極早產兒和配方奶喂養的嬰兒的胃腸道中的缺失可能在NEC的病原學當中相當重要。

    實施例6-7的材料和方法

    Caco-2細胞

    Caco-2細胞是20世紀80年代引入的作為腸代謝模型的人結腸癌細胞系,并迅速成為研究腸細胞吸收和代謝的體外模型的標準。這些細胞通常被培養在被其視為極化的構型的微孔膜上,其具有在頂面上發展出的絨毛,并有乳糜微粒分泌,在基底側面有極低密度脂蛋白(Traber等,“Caco-2人類腸細胞系對新合成的脂蛋白的極化分泌”J?Lipid?Res?28:1350-63(1987)和Luchoomun等.,“分化的Caco-2細胞對乳糜微粒的組裝和分泌。新生成的甘油三酯和預形成的磷脂被優先地用于脂蛋白組裝,”J?Biol?Chem?274:19565-72(1999),在此通過引用將其全部內容并入本文)。體外系統的限制是它們的代謝與體內環境的相似性。Caco-2細胞分化,并且使微絨毛與腸上部的那些類似,然而它們并不具有與體內環境的相同密度,并被認為與胎兒細胞的相似(Blais等.“Caco-2細胞和人類胎兒結腸中Na+-依賴性糖轉運的一般特征,”J?Membr?Biol99:113-25(1987)和Zweibaum等.,“蔗糖酶-異麥芽糖酶:胎兒和人類結腸惡性上皮細胞的標志物,”Int?J?Cancer?32:407-12(1983),在此通過引用將其全部內容并入本文)。此外,胎兒和新生兒胃腸道的正常內容物比成人胃腸道的內容物變化少得多。胎兒的腸道處理羊水,而新生兒的胃腸道處理母乳或它的替代品。成人必須處理任何可以想象的食物,并較為復雜,這就需要在進行Caco-2食物吸收的研究之前,細心地設計模擬的消化模型系統(Fairweather-Tait等.,“體外模型用來預測鐵和鋅的生物利用度的用途:來自HarvestPlus?Expert?Consultation的一致聲明),”IntJ?Vitam?Nutr?Res?75:371-4(2005),在此通過引用將其全部內容并入本文)。

    這些考慮因素表明,Caco-2細胞是最適用于將本發明模型化。除了在將Caco-2數據的結果外推至體內環境時的限制外,認為BCFA作為營養劑或治療劑的專家們將希望有關于在Caco-2細胞中的攝取和代謝數據作為參考數據,因此認可該模型的使用。

    在含有10%v∶v胎牛血清的DMEM(達爾伯克改良的伊格爾培養基)中,讓Caco-2細胞在固體底面、多孔板上生長至融合。在用BCFA處理前24小時,用MEM(最低基礎培養基)替代DMEM。將兩個孔用從Larodan?Lipids(Malmo,Sweden)獲得的作為游離脂肪酸(FFA)的四種的混合物、純BCFA(異-14:0、反異-17:0、異-18:0、異-20:0)各1.2mmol孵育。兩個其他的作為對照。在培養基被移除和細胞被充分小心地清洗3遍之后,孵育細胞18小時。提取細胞脂質,并制備FAME用于GC/MS。實施例6-BCFA與Caco-2細胞的相互作用:Caco-2細胞容易從培養基攝取BCFA和從外源BCFA生物合成新的BCFA

    圖5描繪了GC/MS數據,以對應于BCFA洗脫時間的色譜圖的區域的重建離子色譜圖(RIC)顯示。在圖5A中,頂圖顯示了對照細胞的C14-C18飽和的和單不飽和的FA。在這些數據中沒有BCFA超過0.1%脂肪酸的證據。在圖5B中,中部圖是用來處理細胞的BCFA混合物的RIC。在圖5C中,底部圖是用BCFA孵育18小時的Caco-2細胞的RIC。對三個圖的仔細檢查顯示,圖的RIC(圖5C)似乎與(圖5A)和(圖5B)中的色譜圖的復合很接近。細胞已經攝取大量的BCFA,以至于它們現在為主要的飽和FA。然而,在處理的細胞中顯示的但是既不在對照組細胞(圖5A)也不在BCFA混合物(圖5B)中顯示的是異16:0。與異-14:0的延伸相似,該BCFA只能通過生物合成來產生。計算得出,新生物合成的異-16:0大約占異-14:0峰的10%,指示如果所有的異-16:0來源于異-14:0鏈的增長,那么物質轉化活性超過18h。在這些細胞中,BCFA占總FA的33%,并且占飽和FA的53%。這與1.7%20∶4(花生四烯酸)和0.86%二十二碳六烯酸(DHA)形成對照,它們是這些細胞中兩個具有相當代謝重要性的LCPUFA。

    圖6和7顯示了在圖5中顯示的相同BCFA-處理的細胞的磷脂(PL)和單酰基甘油(MAG)中的BCFA的分布型。圖6顯示,BCFA以大約內源性FA的一半水平被引入PL(比較例如圖6B中的異-14:0對異-16:0的高度)。還要注意,異-20:0峰相比其他BCFA要小得多(比較圖5A、5C、6B和7)。還顯示了所選擇的離子色譜和質譜來進一步舉例說明作為實例的異-16:0異構體的肯定鑒定。

    圖7顯示,BCFA是MAG中非常占優勢的FA(比較異-14:0對n-16:0)。在該級分中,與異-14:0相比,新合成的異-16:0非常低。有可能進入細胞的游離BCFA最初被引入MAG,因此濃度是最高的,而新合成的異-16:0的相對出現量是低的。

    實施例7-基于鏈長和脂質類別,Caco-2細胞選擇性地將BCFA引入到脂質類別中

    圖8為在每個樣品中BCFA分布型的匯總,顯示了起始的FFA混合物被轉化為PL和MAG,鏈長選擇性能夠幫助解釋胎脂/胎糞BCFA分布型。

    BCFA混合物被用來產生初始數據,以提供對無蛋白或其他混雜的化合物的胎脂BCFA的基礎模擬。用單獨的BCFA、異-17:0、反異-17:0、異-18:0和其他處理細胞,以確定例如,是否異-14:0鏈被延長或異-18:0鏈被縮短來產生異-16:0。

    本發明中的數據與在胎脂和胎糞之間的BCFA分布的差異至少部分地是由于BCFA的攝取和差異代謝造成的假設的預測相符。除了在皮膚和表面腺體中的研究外,這些屬于有關在哺乳動物中BCFA代謝的稀有的數據。

    BCFA是正常足月嬰兒消化道的主要成分。本發明將發展有關在腸細胞中BCFA代謝的知識,聚焦于NEC的實際問題,其在具有可忽略的或低的腸道BCFA(由對照細胞模擬的)的早產兒中發展。

    實施例8-厭氧培養和胎脂

    進行了厭氧微生物生長的研究,并且檢查了胎脂是否影響共生細菌或病原細菌的繁殖。使兩種共生細菌(短雙歧桿菌和菊糖芽孢乳桿菌)和三種病原體(產氣莢膜梭菌(C?perfringens)、艱難梭菌(C?difficile),均為專性厭氧菌,和大腸桿菌(E?coli),嫌氣性細菌)在純培養基中厭氧生長。使用了兩種營養培養基(Trypticase?Soy?Broth和Nutrient?Broth(″NB″,Difco))。將用于產生上述數據的胎脂的剩余部分溶解在乙醇中,高壓滅菌,以及加入到培養基中(胎脂)。將單獨的乙醇用作對照(C)。

    圖9顯示短雙歧桿菌胎脂顯現光密度比對照快80%。在兩種培養基中,菊糖芽孢乳桿菌的生長增加是引人注目的。相比之下,右圖的病原體在胎脂和對照之間沒有不同。

    本發明提供了胎脂其自身影響腸道菌群的初始證據。經過考慮,令人感覺到友好細菌的生長因胎脂,足月人類新生兒腸道的正常內容物而增強,以及胎脂使得機會致病菌沒有特定優勢。

    從本發明不能證實的是正是胎脂的BCFA成分促進了生長。但是,有可能的是在溶解于乙醇中并且高壓蒸汽滅菌后胎脂肽的生物活性實質上受損或失活,同時飽和脂質的活性沒受影響。其次,每種細菌生長的幅度不是其競爭適度的標志;不能得出產氣莢膜梭菌是最合適的微生物的結論,這是由于其在培養基中快速生長的特點。這些數據只適用于滅菌的胎脂自身對生長的影響。為此目的,需要適當地控制的競爭生長實驗。重要的是要注意,這些都是來自采用這些培養物的第一次嘗試的數據。條件還沒有被最優化。例如,一篇新的論文顯示,膽汁通過雙歧桿菌加強了對BCFA的攝取(Ruiz等,“作為對膽汁響應的動物雙歧桿菌屬乳亞種的細胞被膜變化,”FEMS?Microbiol?Lett?274:316-22(2007),在此通過引用將其全部內容并入本文),將對這做進一步的研究。

    BCFA的劑量為每20ml培養基23μg,或者大約1μg/ml,基于380μg胎脂的添加(干重)。這可與嬰兒的估計暴露相比。當吸收水和電解質時,在吞入的羊水中相對稀的胎脂顆粒將在新生兒的腸道中被迅速地濃縮。在34-40周妊娠之間,羊水含有138μg脂質/ml,在大于39周時,它含有386μg脂質/ml(Lentner?C5GeigyScientific?Tables,第8版.NewJersey:Ciba-Geigy,(1981)在此通過引用將其全部內容并入本文),其大多數是胎脂,其中存在表面活性物質或其他少量的脂質。當在嬰兒腸道的上部吸收水并且液態羊水轉化為糊時,該濃度迅速地提高。基于胎脂(6%干重)和胎糞(0.5%干重)中BCFA濃度的測量值,能估計出1mgBCFA/ml胎糞的總濃度。基于這種分析,在出生后到達腸道的微生物將因此遇到更高濃度的BCFA,雖然不能說它們是否將與溶于乙醇中的BCFA的表現相似。然而,本發明顯示,相比于腸道環境,胎脂成分的低水平可能發揮主要的作用。

    值得注意的是,最新的(初始)數據與胎脂增強了共生微生物的生長,且不對機會致病菌的生長產生影響的假設一致。然而存在這樣的證據:胎脂脂質自身具有抗微生物性質,并與抗微生物的胎脂肽相互協同作用來抑制至少一種模型微生物的生長。與無脂質的對照相比,胎脂脂質抑制巨大芽孢桿菌的生長。此外,當以3∶1的比例與胎脂脂質混合時,胎脂肽LL-37的添加導致進一步的生長抑制(Tollin等.,“基于多肽、脂質及其相互作用而作為多組分防御系統的胎脂,”Cell?Mol?Life?Sci62:2390-9(2005),在此通過引用將其全部內容并入本文)。重要的是,該研究在其胎脂脂肪酸中,檢測到了23%“未鑒定的脂肪酸”,其能被有把握地假設為占壓倒性優勢的BCFA。

    重要的是,當聚焦于該假設時,所建議的研究,包括競爭實驗,自然地評估了胎脂和其脂質的相對促共生的、抗病原體的(“抗微生物的”)特性,如上所述。

    雖然本文已經詳細的刻畫和描述了優選的實施方式,但對于相關領域技術人員來說顯然可以進行各種修改、增加、替代等等,而不違背本發明的精神,因此這些被認為是在本發明的范圍內,正如隨后的權利要求中所定義的那樣。

    

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