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脂質體組合物.pdf

摘要
申請專利號:

CN201080014698.2

申請日:

2010.03.30

公開號:

CN102369008B

公開日:

2014.10.29

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 31/357申請日:20100330|||公開
IPC分類號: A61K31/357; A61K9/127; A61K47/02; A61K47/18; A61K47/24; A61K47/28; A61K47/34; A61K47/36 主分類號: A61K31/357
申請人: 衛材R&D管理有限公司
發明人: 菊池寬; 兵頭健治; 石原比呂之
地址: 日本東京都
優先權: 2009.03.30 JP 2009-082521; 2009.03.30 US 61/164,653
專利代理機構: 北京市金杜律師事務所 11256 代理人: 楊宏軍
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201080014698.2

授權公告號:

102369008B||||||

法律狀態公告日:

2014.10.29|||2012.04.18|||2012.03.07

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明提供一種含有艾日布林或其藥理學上允許的鹽的新脂質體組合物及其制備方法。

權利要求書

1: 一種脂質體組合物, 所述脂質體組合物含有脂質體、 且在脂質體內相中含有活性化 合物, 所述活性化合物為艾日布林或其藥理學上允許的鹽。
2: 如權利要求 1 所述的脂質體組合物, 其中, 所述脂質體組合物為固態或液態。
3: 如權利要求 1 或 2 所述的脂質體組合物, 其中, 在所述脂質體內相中還含有銨鹽。
4: 如權利要求 3 所述的脂質體組合物, 其中, 所述銨鹽的濃度為 10mM 以上。
5: 如權利要求 1 ~ 4 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 在脂質體內相中還含有鹽、 酸、 堿及 / 或氨基酸。
6: 如權利要求 5 所述的脂質體組合物, 其中, 所述鹽的濃度為 1 ~ 300mM。
7: 如權利要求 5 或 6 所述的脂質體組合物, 其中, 所述酸的濃度為 1 ~ 300mM。
8: 如權利要求 5 ~ 7 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 所述氨基酸的濃度為 1 ~ 300mM。
9: 如權利要求 5 ~ 8 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 所述堿的濃度為 1 ~ 300mM。
10: 如權利要求 1 ~ 9 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 所述活性化合物的濃度為 0.01 ~ 300mg/mL。
11: 如權利要求 1 ~ 10 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 所述活性化合物為甲磺酸 艾日布林。
12: 如權利要求 1 ~ 11 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 在脂質體內相中還含有硫 酸銨、 檸檬酸及活性化合物。
13: 如權利要求 1 ~ 12 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 在脂質體外相中含有糖、 電解質、 及 / 或氨基酸。
14: 如權利要求 1 ~ 13 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 在脂質體外相中含有糖或 電解質、 及氨基酸。
15: 如權利要求 13 或 14 所述的脂質體組合物, 其中, 所述糖的濃度為 2 ~ 20%。
16: 如權利要求 13 ~ 15 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 所述氨基酸的濃度為 1 ~ 300mM。
17: 如權利要求 1 ~ 16 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 在脂質體外相中含有蔗糖 或氯化鈉、 及組氨酸。
18: 如權利要求 1 ~ 17 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 在所述脂質體內相中實質 上不含有環糊精。
19: 如權利要求 1 ~ 18 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 所述脂質體含有氫化卵磷 脂。
20: 如權利要求 1 ~ 19 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 所述脂質體含有膽固醇。
21: 如權利要求 1 ~ 20 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 所述脂質體含有甲氧基聚 乙二醇縮合物。
22: 如權利要求 21 所述的脂質體組合物, 其中, 所述甲氧基聚乙二醇縮合物為二硬脂 酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇縮合物。
23: 如權利要求 1 ~ 22 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 所述脂質體含有氫化卵磷 脂、 膽固醇及二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇縮合物。
24: 如權利要求 23 所述的脂質體組合物, 含有 10 ~ 80%所述氫化卵磷脂、 1 ~ 60%所 2 述膽固醇、 0 ~ 50%所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇縮合物。
25: 如權利要求 1 ~ 24 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 所述脂質體含有氫化大豆 卵磷脂、 膽固醇及聚乙二醇 2000- 磷脂酰乙醇胺。
26: 一種制備權利要求 1 ~ 25 中任一項所述的脂質體組合物的方法, 包括下述步驟 : 供給含有脂質體的脂質體分散液的步驟 ; 將所述脂質體分散液和所述活性化合物混合的步驟 ; 及 將所述活性化合物導入所述脂質體分散液的脂質體內相的步驟。
27: 如權利要求 26 所述的方法, 其中, 所述脂質體分散液在脂質體外相中實質上不含 有銨鹽。
28: 如權利要求 26 或 27 所述的方法, 其中, 所述脂質體分散液的脂質體外相的 pH 為 3 ~ 10。
29: 如權利要求 26 ~ 28 中任一項所述的方法, 其中, 所述脂質體分散液的脂質體外相 的 pH 為 7 ~ 10。
30: 如權利要求 28 或 29 所述的方法, 其中, 所述 pH 為將所述脂質體分散液和所述活性 化合物混合的步驟中的所述脂質體分散液的脂質體外相的 pH。
31: 如權利要求 26 ~ 30 中任一項所述的方法, 其中, 所述供給脂質體分散液的步驟包 括: 供給脂質體準備液的步驟, 所述脂質體準備液含有脂質體、 且在脂質體內相及脂質體 外相中含有銨鹽 ; 置換或稀釋所述脂質體準備液的脂質體外相的步驟。
32: 如權利要求 31 所述的方法, 其中, 置換或稀釋所述脂質體外相的步驟是使脂質體 外相的 pH 高于脂質體內相的 pH 的步驟。
33: 如權利要求 31 或 32 所述的方法, 其中, 置換或稀釋所述脂質體外相的步驟是使脂 質體內相的 pH 與脂質體外相的 pH 的差為 1 ~ 5 的步驟。
34: 如權利要求 26 ~ 33 中任一項所述的方法, 其中, 所述脂質體內相的 pH 為 3 ~ 9。
35: 如權利要求 26 ~ 34 中任一項所述的方法, 其中, 所述脂質體內相的 pH 為 4 ~ 9。
36: 如權利要求 26 ~ 35 中任一項所述的方法, 其中, 所述脂質體內相的 pH 為 5 ~ 8。
37: 如權利要求 26 ~ 36 中任一項所述的方法, 其中, 在導入所述活性化合物的步驟中, 脂質體外相為含有電解質的溶液。
38: 如權利要求 26 ~ 37 中任一項所述的方法, 其中, 所述脂質體分散液在脂質體內相 中實質上不含有環糊精。
39: 如權利要求 26 ~ 38 中任一項所述的方法, 其中, 還包括使脂質體外相的 pH 為中性 的步驟。

說明書


脂質體組合物

    【技術領域】
     本發明涉及一種含有艾日布林或其藥理學上允許的鹽的新脂質體組合物。另外, 本發明涉及該脂質體組合物的制造方法。背景技術
     脂質體為微小封閉囊泡, 所述微小封閉囊泡具有被 1 個以上脂質雙層 (lipid bilayer) 包圍的內相, 能夠將水溶性物質保持在內相、 將脂溶性物質保持在脂質雙層中。 將 活性化合物包封在脂質體中、 送達至目標組織時, 如何以高效率將活性化合物包封在脂質 體中、 以及如何確保利用脂質體的活性化合物的保持穩定性成為重要的課題。
     將脂溶性化合物包封在脂質體中時, 能夠比較容易地實現高包封率, 但除兩性霉 素 B( 脂質體藥品 AmBisome 的主藥 ) 之類的膜親和性非常高的化合物的情況之外, 通常在 血漿中的保持穩定性低, 難以充分改善藥物動力學。將水溶性化合物包封到脂質體中的包 封方法中, 包括類脂膜法 (Vortex 法 )、 反相蒸發法、 表面活性劑除去法、 凍融法或遙控裝載 法 (pH 梯度法、 離子梯度法 ) 等各種方法。但是, 能夠得到接近 100%的高包封率的方法僅 為遙控裝載法, 其他方法中只能得到 5 ~ 30%左右的包封率。
     作為遙控裝載法, 已知利用 pH 梯度或硫酸銨離子梯度的方法。所謂利用 pH 梯度 的遙控裝載法即 pH 梯度法, 是指利用由目標化合物的 pH 引起的分子型 / 離子型的離解平 衡的移動, 將化合物攝入脂質體內的技術。
     作為利用 pH 梯度法被包封在脂質體內的化合物的一個例子, 例如可以舉出阿霉 素 (DOX, pKa : 8.2)。使用 pH4 的緩沖液配制脂質體溶液后, 將脂質體外相置換為 pH7 的緩 沖液。在上述脂質體溶液中加入了 DOX 時, 由于加入的 pH7 的溶液中分子型的 DOX 變成脂 溶性, 所以向脂質體膜轉移、 而不向水相轉移。進而, 向脂質體膜轉移后的 DOX 與 pH4 的脂 質體內相接觸時, 變為離子型溶于脂質體內相。如上所述, 通過離解平衡的移動, DOX 由脂 質體外相被輸送至內相 ( 參見非專利文獻 1、 非專利文獻 2 及專利文獻 1)。
     另外, 將上述遙控裝載法改良后的各種技術已有報道。
     非專利文獻 3 中公開了一種技術 : 在稱作不含膽固醇的脂質體的特別組成的脂質 體中進行 pH 梯度法時, 通過向脂質體外相中添加活性化合物及乙醇, 提高活性化合物的包 封率。
     專利文獻 2 中公開了一種技術 : 除 pH 梯度之外, 通過使脂質體內相中存在銅離子, 提高活性化合物的包封率。
     所謂利用了硫酸銨離子梯度的遙控裝載法即硫酸銨法, 是指利用 2 價硫酸銨等的 離子梯度代替 pH 梯度法中的 pH 梯度, 將活性化合物攝入脂質體內相的技術 ( 參見非專利 文獻 1 及專利文獻 3)。
     專利文獻 4 中公開了一種技術 : 除由硫酸銨產生離子梯度之外, 通過向脂質體外 相中添加活性化合物和硼酸, 將活性化合物攝入脂質體內。另外, 專利文獻 5 中公開了一種 技術 : 通過利用由葡萄糖醛酸陰離子產生的離子梯度代替由硫酸銨產生的離子梯度, 將活性化合物攝入脂質體內, 與利用了硫酸銨的情況相比, 提高了活性化合物的釋放速度。
     如上所述, 從包封率的方面考慮, 遙控裝載法為優異的包封方法。但是, 采用遙控 裝載法時, 除了被包封在脂質體內相的活性化合物結晶化的 Doxil(Dox 的脂質體制劑 ) 等 特殊的例子之外, 存在活性化合物在血漿中容易從脂質體漏出、 活性化合物的保持穩定性 較低的問題。
     如上所述, 在現有技術的方法中, 現狀是難以同時實現脂質體中的活性化合物的 高包封率、 及脂質體中的活性化合物的保持穩定性。
     專利文獻 1 : 美國專利第 5192549 號說明書
     專利文獻 2 : 國際公開第 2006/037230 號說明書
     專利文獻 3 : 美國專利第 5316771 號說明書
     專利文獻 4 : 美國專利第 6051251 號說明書
     專利文獻 5 : 國際公開第 2005/046643 號說明書
     非專利文獻 1 : 佐塚泰之, “脂質體的制備法” , “脂質體應用的新進展 : 面向人工細 胞的開發 ( 秋吉一成, 辻井薰主編 )” , NTS, (2005), pp.33-37。
     非專利文獻 2 : Mayer LD et al., Biochimica et Biophysica Acta, (1986), 857 : pp.123-126.
     非專利文獻 3 : N.Dos Santos et al., Biochimica et Biophysica Acta, (2004), 1661(1) : pp.47-60. 發明內容
     本發明要解決的課題在于提供一種活性化合物的保持穩定性及包封率高的脂質 體組合物。
     本發明人等為了解決上述課題進行了深入研究, 結果發現以艾日布林或其藥理學 上允許的鹽作為活性化合物的脂質體組合物中, 脂質體組合物中的活性化合物的保持穩定 性及包封率極高, 從而完成了本發明。
     即, 本發明如下。
     [1] 一種脂質體組合物, 所述脂質體組合物含有脂質體、 且在脂質體內相中含有活 性化合物, 所述活性化合物為艾日布林或其藥理學上允許的鹽。
     [2] 如 1 所述的脂質體組合物, 其中, 所述脂質體組合物為固態或液態。
     [3] 如 1 或 2 所述的脂質體組合物, 其中, 在脂質體內相中還含有銨鹽。
     [4] 如 3 所述的脂質體組合物, 其中, 上述銨鹽的濃度為 10mM 以上。
     [5] 如 1 ~ 4 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 在脂質體內相中還含有鹽、 酸、 堿及 / 或氨基酸。
     [6] 如 5 所述的脂質體組合物, 其中, 上述鹽的濃度為 1 ~ 300mM。
     [7] 如 5 或 6 所述的脂質體組合物, 其中, 上述酸的濃度為 1 ~ 300mM。
     [8] 如 5 ~ 7 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 上述氨基酸的濃度為 1 ~ 300mM。
     [9] 如 5 ~ 8 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 上述堿的濃度為 1 ~ 300mM。
     [10] 如 1 ~ 9 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 上述活性化合物的濃度為0.01 ~ 300mg/mL。
     [11] 如 1 ~ 10 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 上述活性化合物為甲磺酸艾 日布林。
     [12] 如 1 ~ 11 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 在脂質體內相中還含有硫酸 銨、 檸檬酸及活性化合物。
     [13] 如 1 ~ 12 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 在脂質體外相中含有糖、 電解 質、 及 / 或氨基酸。
     [14] 如 1 ~ 13 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 在脂質體外相中含有糖或電 解質、 及氨基酸。
     [15] 如 13 或 14 所述的脂質體組合物, 其中, 上述糖的濃度為 2 ~ 20%。
     [16] 如 13 ~ 15 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 上述氨基酸的濃度為 1 ~ 300mM。
     [17] 如 1 ~ 16 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 在脂質體外相中含有蔗糖或 氯化鈉、 及組氨酸。
     [18] 如 1 ~ 17 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 在上述脂質體內相中實質上 不含有環糊精。 [19] 如 1 ~ 18 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 脂質體含有氫化卵磷脂。
     [20] 如 1 ~ 19 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 脂質體含有膽固醇。
     [21] 如 1 ~ 20 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 脂質體含有甲氧基聚乙二醇 縮合物。
     [22] 如 21 所述的脂質體組合物, 其中, 上述甲氧基聚乙二醇縮合物為二硬脂酰磷 脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇縮合物。
     [23] 如 1 ~ 22 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 脂質體含有氫化卵磷脂、 膽固 醇及二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇縮合物。
     [24] 如 23 所述的脂質體組合物, 含有 10 ~ 80%上述氫化卵磷脂、 1 ~ 60%上述 膽固醇、 0 ~ 50%上述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇縮合物。
     [25] 如 1 ~ 24 中任一項所述的脂質體組合物, 其中, 脂質體含有氫化大豆卵磷脂、 膽固醇及聚乙二醇 2000- 磷脂酰乙醇胺。
     [26] 一種制備 1 ~ 25 中任一項所述的脂質體組合物的方法, 包括下述步驟 :
     供給含有脂質體的脂質體分散液的步驟 ;
     將上述脂質體分散液和上述活性化合物混合的步驟 ;
     將上述活性化合物導入上述脂質體分散液的脂質體內相中的步驟。
     [27] 如 26 所述的方法, 其中, 上述脂質體分散液在脂質體外相中實質上不含有銨 鹽。
     [28] 如 26 或 27 所述的方法, 其中, 上述脂質體分散液的脂質體外相中的 pH 為 3 ~ 10。
     [29] 如 26 ~ 28 中任一項所述的方法, 其中, 上述脂質體分散液的脂質體外相的 pH 為 7 ~ 10。
     [30] 如 28 或 29 所述的方法, 其中, 上述 pH 為將上述脂質體分散液和上述活性化
     合物混合的步驟中的上述脂質體分散液的脂質體外相的 pH。
     [31] 如 26 ~ 30 中任一項所述的方法, 其中, 供給上述脂質體分散液的步驟包括 :
     供給脂質體準備液的步驟, 所述脂質體準備液含有脂質體、 且在脂質體內相及脂 質體外相中含有銨鹽 ;
     置換或稀釋上述脂質體準備液的脂質體外相的步驟。
     [32] 如 31 所述的方法, 其中, 置換或稀釋上述脂質體外相的步驟是使脂質體外相 的 pH 高于脂質體內相的 pH 的步驟。
     [33] 如 31 或 32 所述的方法, 其中, 置換或稀釋上述脂質體外相的步驟是使脂質體 內相的 pH 與脂質體外相的 pH 的差為 1 ~ 5 的步驟。
     [34] 如 26 ~ 33 中任一項所述的方法, 其中, 上述脂質體內相的 pH 為 3 ~ 9。
     [35] 如 26 ~ 34 中任一項所述的方法, 其中, 上述脂質體內相的 pH 為 4 ~ 9。
     [36] 如 26 ~ 35 中任一項所述的方法, 其中, 上述脂質體內相的 pH 為 5 ~ 8。
     [37] 如 26 ~ 36 中任一項所述的方法, 其中, 在導入上述活性化合物的步驟中, 脂 質體外相為含有電解質的溶液。
     [38] 如 26 ~ 37 中任一項所述的方法, 其中, 上述脂質體分散液在脂質體內相中實 質上不含有環糊精。
     [39] 如 26 ~ 38 中任一項所述的方法, 其中, 還包括使脂質體外相的 pH 為中性的步驟。
     根據本發明, 能夠提供一種新的脂質體組合物。本發明的脂質體組合物以高效率 將活性化合物包封到脂質體內相中, 并且具有活性化合物的高保持穩定性。附圖說明
     [ 圖 1] 表示體外大鼠血漿中 (37℃ ) 的甲磺酸艾日布林的脂質體組合物的濃度進 展。
     [ 圖 2] 表示體內 FaDu 罹癌裸鼠 (nude mice) 中由脂質體產生的甲磺酸艾日布林 的抗腫瘤活性。
     [ 圖 3] 表示體內 ACHN 罹癌裸鼠中由脂質體產生的甲磺酸艾日布林的抗腫瘤活性。 具體實施方式
     通過用于實施發明的方案具體說明本發明, 但本發明并不限定于以下用于實施發 明的方案, 可以進行各種變形而實施。
     本發明中所參照的文獻中公開的內容, 作為參照被引入本發明中。
     [ 定義 ]
     所謂 “脂質體” , 是指具有被脂質雙層包圍的內相的微小封閉囊泡。在本發明中, 脂質體包括小單層脂質體 (SUV : small unilamellarvesicle)、 大單層脂質體 (LUV : large unilamellar vesicle)、 更大單層脂質體 (GUV : giant unilamellar vesicle)、 具有同心圓 狀的多層膜的多層脂質體 (MLV : multilamellar vesicle)、 具有不是同心圓狀、 而為不規則 的多層膜的脂質體 (MVV : Multivesicular vesicle) 等。
     “脂質體內相” 是指被脂質體的脂質雙層包圍的水性區域, 以 “內水相” 及 “脂質體內水相” 的相同含義進行使用。在脂質體分散在液體中時, “脂質體外相” 是指沒有被脂質 體的脂質雙層包圍的區域 ( 即除內相及脂質雙層之外的區域 )。
     所謂 “脂質體組合物” 是指含有脂質體、 并且在脂質體內相中還含有甲磺酸艾日布 林的組合物。在本發明中, 脂質體組合物包括固態及液態。
     所謂 “脂質體分散液 “, 為含有脂質體的組合物, 是指活性化合物被導入到脂質體 內相前的組合物。
     所謂 “脂質體準備液” , 為含有脂質體的組合物, 是指為了將甲磺酸艾日布林包封 在脂質體內相中, 調節脂質體外相前的組合物。
     所謂 “脂質體試劑” , 在液態時是指脂質體分散液, 在固態時, 是指通過溶解或混懸 在規定的溶劑中能夠得到脂質體分散液的試劑。溶劑如下所述。如下所述, 固態的脂質體 試劑例如可以通過干燥脂質體分散液得到。
     需要說明的是, 本說明書中, 所謂將固體和液體混合, 包含將固體溶解及混懸在液 體中, 可以彼此交替使用混合、 溶解、 混懸。同樣地, 溶劑和分散介質也可以交替使用。
     另外, 本發明的脂質體組合物、 脂質體分散液、 脂質體準備液、 脂質體試劑實質上 不含有環糊精。所謂實質上不含有環糊精, 是指不添加環糊精。需要說明的是, 只要不含有 可以明顯地確認到由環糊精引起的活性化合物的溶解度 ( 表觀溶解度 ) 提高的量的環糊精 即可, 加入不能顯著地確認到活性化合物的溶解度提高的量時, 作為本發明的實施方式也 不能被排除。 進而, 作為本發明的優選方案, 所謂脂質體分散液中的脂質體分散液在脂質體外 相中實質上不含有銨鹽, 是指不向脂質體分散液的脂質體外相中添加銨鹽。 需要說明的是, 加入能夠達成本發明目的范圍的量的銨鹽, 作為本發明的實施方式不能被排除。 另外, 脂質 體準備液的脂質體外相中含有銨鹽時, 通過使用實質上不含有銨鹽的溶液, 置換或稀釋脂 質體準備液的脂質體外相, 能夠制備實質上不含有銨鹽的脂質體分散液。
     [ 活性化合物 ]
     本發明的活性化合物為艾日布林或其藥理學上允許的鹽 ( 以下有時也記作 “艾日 布林等” )。所謂藥理學上允許的鹽, 可以為無機酸鹽、 有機酸鹽中的任一種, 只要與艾日布 林形成鹽即可, 沒有特別限定, 例如可以舉出鹽酸鹽、 硫酸鹽、 檸檬酸鹽、 氫溴酸鹽、 氫碘酸 鹽、 硝酸鹽、 硫酸氫鹽、 磷酸鹽、 過磷酸鹽、 異煙酸鹽、 乙酸鹽、 乳酸鹽、 水楊酸鹽、 酒石酸鹽、 泛酸鹽、 抗壞血酸鹽、 琥珀酸鹽、 馬來酸鹽、 富馬酸鹽、 葡糖酸鹽、 糖精酸鹽、 甲酸鹽、 苯甲酸 鹽、 谷氨酸鹽、 甲磺酸鹽、 乙磺酸鹽、 苯磺酸鹽、 對甲苯磺酸鹽、 亞甲基雙羥萘酸鹽 (pamoate) 等, 優選鹽酸鹽、 硫酸鹽、 乙酸鹽、 磷酸鹽、 檸檬酸鹽、 甲磺酸鹽等, 較優選甲磺酸鹽。即, 本 發明中的活性化合物優選甲磺酸艾日布林。另外, 作為艾日布林的藥理學上允許的鹽, 可 以為艾日布林與鋁、 鈣、 鋰、 鎂、 鈣、 鈉、 鋅、 二乙醇胺形成的鹽。艾日布林或其藥理學上允許 的鹽, 為國際公開第 99/65894 號說明書或美國專利第 6214865 號公報 ( 所述專利文獻所 記載的內容作為參照被引入 ) 中記載的化合物或其鹽, 含有抗腫瘤及抗有絲分裂活性, 具 有藥理學活性。艾日布林或其藥理學上允許的鹽作為抗腫瘤劑, 對于黑色素瘤、 纖維肉瘤、 單核細胞性白血病、 結腸癌、 卵巢癌、 乳癌、 骨癌、 前列腺癌、 肺癌及 ras- 轉化成纖維細胞 (transformed fibroblasts) 等具有抗腫瘤活性。
     但是, 作為能夠與艾日布林等一同組合的活性化合物, 可以選自藥品 ( 包含診斷
     藥 )、 化妝品、 食品等領域中使用的化合物。活性化合物可以為艾日布林等以外的 1 種化合 物或 2 種以上的化合物的組合。
     作為活性化合物, 可以舉出低分子化合物等, 其中, 優選用作抗腫瘤劑、 抗菌劑、 抗 炎劑、 抗心肌梗死劑、 造影劑的化合物。
     活性化合物的分子量優選為 100 ~ 2000、 較優選為 200 ~ 1500、 更優選為 300 ~ 1000。通常, 在上述范圍內, 活性化合物的脂質體膜透過性良好, 可以適當地應用本發明。
     活性化合物含有水溶性化合物及脂溶性化合物, 只要多少溶于水或水性溶劑, 就 可以應用本發明。
     本發明中, 作為抗腫瘤劑沒有特別限定, 例如可以舉出鹽酸伊立替康、 鹽酸拓撲 替康、 依沙替康、 RFS-2000、 Lurtotecan、 BNP-1350、 Bay-383441、 PNU-166148、 IDEC-132、 BN-80915、 DB-38、 DB-81、 DB-90、 DB-91、 CKD-620、 T-0128、 ST-1480、 ST-1481、 DRF-1042、 DE-310 等喜樹堿衍生物 ; 多西他賽水合物、 多西他賽、 紫杉醇、 IND-5109、 BMS-184476、 BMS-188797、 T-3782、 TAX-1011、 SB-RA-31012、 SBT-1514、 DJ-927 等 紫 杉 烷 衍 生 物 ; 異 環磷酰胺、 鹽酸尼莫司汀、 卡巴醌 (carvocon)、 環磷酰胺、 達卡巴嗪、 噻替派、 白消安、 馬 法蘭、 雷莫司汀、 雌莫司汀磷酸酯鈉、 6- 巰基嘌呤核苷、 依諾他濱、 鹽酸吉西他濱、 卡莫氟 (carmfur)、 阿糖胞苷、 阿糖胞苷十八烷基磷酸鹽、 替加氟、 去氧氟尿苷、 羥基脲、 氟尿嘧啶、 氨甲喋呤、 巰嘌呤 (mercaptopurine)、 磷酸氟達拉濱、 放線菌素 D、 鹽酸阿柔比星、 鹽酸伊 達比星、 鹽酸吡柔比星、 鹽酸表柔比星、 鹽酸柔紅霉素、 鹽酸阿霉素、 表柔比星、 吡柔比星、 柔紅霉素、 阿霉素、 鹽酸吡柔比星、 鹽酸博來霉素、 凈司他丁斯酯、 新制癌菌素、 絲裂霉素 C、 硫酸博來霉素、 硫酸培洛霉素、 依托泊苷、 酒石酸長春瑞濱、 硫酸長春新堿、 硫酸長春地辛、 硫酸長春堿、 鹽酸氨柔比星、 吉非替尼、 依西美坦、 卡培他濱、 TNP-470、 TAK-165、 KW-2401、 KW-2170、 KW-2871、 KT-5555、 KT-8391、 TZT-1027、 S-3304、 CS-682、 YM-511、 YM-598、 TAT-59、 TAS-101、 TAS-102、 TA-106、 FK-228、 FK-317、 E7070、 (8E、 12E、 14E)-7-〔(4- 環 庚 基 哌 嗪 -1- 基 ) 羰基 } 氧基 -3, 6, 16, 21- 四羥基 -6, 10, 12, 16, 20- 五甲基 -18, 19- 環氧基二十三 碳 -8, 12, 14- 三烯 -11- 交酯 (E7107)、 KRN-700、 KRN-5500、 J-107088、 HMN-214、 SM-11355、 ZD-0473 等。 上述抗腫瘤劑中, 作為鹽記載的化合物可以為任何鹽, 也可以為游離體。 另外, 作為游離體記載的化合物可以為任何鹽。
     作為抗菌劑, 沒有特別限定, 例如可以舉出兩性霉素 B、 頭孢替安酯、 頭孢菌素、 氯 霉素、 雙氯芬酸等。在上述抗菌劑中, 化合物可以為任何鹽。
     作為抗炎劑, 沒有特別限定, 例如可以舉出前列腺素類 (PGE1、 PGE2)、 地塞米松、 氫 化可的松、 吡羅昔康 (pyroxicam)、 吲哚美辛、 潑尼松龍等。上述抗炎劑中, 化合物可以為任 何鹽。
     作為抗心肌梗塞劑, 沒有特別限定, 例如可以舉出腺苷、 阿替洛爾、 吡西卡尼等, 作 為造影劑, 可以舉出碘帕醇、 碘克沙酸、 碘海醇、 碘美普爾等。 上述抗心肌梗塞劑及上述造影 劑中, 化合物可以為任何鹽。
     [ 脂質 ]
     本發明的脂質體中, 作為膜構成成分, 優選含有磷脂及 / 或磷脂衍生物。作為磷脂 及磷脂衍生物, 例如可以舉出磷脂酰乙醇胺、 卵磷脂、 磷脂酰絲氨酸、 磷脂酰肌醇、 磷脂酰甘 油、 心磷脂、 鞘磷脂、 神經酰胺磷酸乙醇胺、 神經酰胺磷酸甘油、 神經酰胺磷酸甘油磷酸酯、1, 2- 二肉豆蔻酰 -1, 2- 脫氧卵磷脂、 縮醛磷脂、 磷脂酸等。 磷脂及磷脂衍生物可以為上述物 質中的 1 種或 2 種以上的組合。
     磷脂及磷脂衍生物中的脂肪酸殘基沒有特別限定, 例如可以舉出碳原子數 12 ~ 20 的飽和或不飽和的脂肪酸殘基, 具體而言, 可以舉出月桂酸、 肉豆蔻酸、 棕櫚酸、 硬脂酸、 油酸、 亞油酸等來自脂肪酸的酰基。另外, 還可以使用蛋黃卵磷脂、 大豆卵磷脂等來自天然 物質的磷脂、 及不飽和脂肪酸殘基中部分或完全氫化的部分氫化蛋黃卵磷脂、 ( 完全 ) 氫化 蛋黃卵磷脂、 部分氫化大豆卵磷脂、 ( 完全 ) 氫化大豆卵磷脂等。
     制備脂質體時使用的磷脂及 / 或磷脂衍生物的配合量 ( 摩爾分數 ) 沒有特別限 定, 相對于全部脂質體膜成分, 優選為 10 ~ 80%, 較優選為 30 ~ 60%。
     本發明的脂質體中, 作為膜構成成分, 除磷脂及 / 或磷脂衍生物之外, 還可以含有 膽固醇、 膽甾烯醇等固醇類作為膜穩定劑、 具有碳原子數 8 ~ 22 的飽和或不飽和的酰基的 脂肪酸類、 α- 生育酚等抗氧化劑。
     制備脂質體時使用的上述固醇類的配合量 ( 摩爾分數 ) 沒有特別限定, 相對于全 部脂質體膜成分, 優選為 1 ~ 60%, 較優選為 10 ~ 50%, 更優選為 30 ~ 50%。
     另外, 脂肪酸類的配合量 ( 摩爾分數 ) 沒有特別限定, 相對于全部脂質體膜成分, 優選為 0 ~ 30%, 較優選為 0 ~ 20%, 更優選為 0 ~ 10%。抗氧化劑的配合量 ( 摩爾分數 ) 只要添加能夠獲得抗氧化效果的量就足夠, 優選為全部脂質體膜成分的 0 ~ 15%, 較優選 為 0 ~ 10%, 更優選為 0 ~ 5%。 本發明的脂質體中, 作為膜構成成分, 可以含有功能性脂質或修飾脂質。
     作為功能性脂質, 可以舉出血中滯留性脂質衍生物、 溫度變化敏感性脂質衍生物、 pH 敏感性脂質衍生物等。 作為修飾脂質, 可以舉出 PEG 化脂質、 糖脂質、 抗體修飾脂質、 肽修 飾脂質等。
     作為血中滯留性脂質衍生物, 例如可以舉出血型糖蛋白、 神經節苷酯 GM1、 神經節 苷酯 GM3、 葡糖醛酸衍生物、 谷氨酸衍生物、 聚甘油磷脂衍生物、 磷酸乙醇胺和甲氧基聚乙二 醇的縮合物如 N-{ 羰基 - 甲氧基聚乙二醇 -2000}-1, 2- 二棕櫚酰 -sn- 甘油 -3- 磷酸乙醇 胺、 N-〔羰基 - 甲氧基聚乙二醇 -5000}-1, 2- 二棕櫚酰 -sn- 甘油 -3- 磷酸乙醇胺、 N-{ 羰 基 - 甲氧基聚乙二醇 -750}-1, 2- 二硬脂酰 -sn- 甘油 -3- 磷酸乙醇胺、 N-{ 羰基 - 甲氧基 聚乙二醇 -2000}-1, 2- 二硬脂酰 -sn- 甘油 -3- 磷酸乙醇胺 (MPEG2000- 二硬脂酰磷脂酰乙 醇胺 )、 N-{ 羰基 - 甲氧基聚乙二醇 -5000}-1, 2- 二硬脂酰 -sn- 甘油 -3- 磷酸乙醇胺等聚 乙二醇衍生物 ( 甲氧基聚乙二醇縮合物等 ) 等。脂質體通過含有血中滯留性脂質衍生物, 脂質體不易作為外來異物在肝臟等中被捕捉, 由此, 能夠提高脂質體的血中滯留性等。
     作為溫度變化敏感性脂質衍生物, 例如可以舉出二棕櫚酰卵磷脂等。脂質體通過 含有溫度變化敏感性脂質衍生物, 能夠在特定的溫度下破壞脂質體、 使脂質體的表面特性 發生變化等。 進而通過與腫瘤等靶部位的加熱組合, 能夠在靶部位破壞脂質體、 在靶部位釋 放活性化合物等。
     作為 pH 敏感性脂質衍生物, 例如可以舉出二油酰磷脂酰乙醇胺等。脂質體通過含 有 pH 敏感性脂質衍生物, 能夠在通過內吞作用將脂質體攝入細胞時促進脂質體與核內體 的膜融合、 改良活性化合物向細胞質的送達等。
     作為糖脂質、 抗體修飾脂質及肽修飾脂質, 可以舉出與靶細胞或靶組織具有親和
     性的糖、 連接有抗體或肽的脂質。 通過使用修飾脂質, 能夠主動地將脂質體運送至靶細胞或 靶組織中。
     制備脂質體時使用的血中滯留性脂質衍生物的配合量 ( 摩爾分數 ) 沒有特別限 定, 優選為全部脂質體膜構成成分脂質的 0 ~ 50%, 較優選為 0 ~ 30%, 更優選為 0 ~ 20%。
     [ 脂質體 ]
     如上所述, 脂質體為具有被脂質雙層包圍的內相的微小封閉囊泡。
     理想情況下, 優選脂質體具有屏蔽能, 即, a) 一旦將艾日布林等包封在內相后, 艾 日布林等不會漏出至脂質體外相中。 另外, 用作藥品時, 優選脂質體在生物體內穩定, 另外, 優選脂質體具有屏蔽能, 即, 給與生物體時, 在血中艾日布林等不會漏出至脂質體外相中。
     用于以能夠實用的水平具有上述膜透過性的脂質體的膜構成成分的組合, 如果是 本領域技術人員, 可以根據需要通過參照下述實施例, 根據活性化合物及靶組織等適當設 定 ( 參見菊池寬他, “脂質體 I- 制備法及檢驗法 -” , 細胞工學, (1983), 2(9) : pp.1136-1149 及該文獻中引用的文獻等 )。
     需要說明的是, 用作藥品時, 優選脂質體到達靶組織、 細胞或細胞內小器官后, 艾 日布林等從脂質體中被釋放。 通常, 脂質體膜構成成分本身具有生物降解能力, 最終在靶組 織等被分解。可以認為包封的艾日布林等由此被釋放。另外, 脂質體本身可以被細胞攝取。 另外, 脂質體組合物不僅可以用于靶向固形癌等靶組織, 也可以用于將活性化合 物送達至血液癌等, 也可以用作血中的緩釋性制劑 (slow release formulation) 和控釋制 劑 (controlled releaseformulation) 等。
     脂質體的粒徑可以根據目的進行設定。例如, 打算將脂質體作為注射劑等通過 EPR(Enhanced Permeability and Retention) 效果送達至癌組織或炎癥組織時, 脂質體的 粒徑優選為 30 ~ 400nm, 較優選為 50 ~ 200nm。另外, 打算將脂質體送達至巨噬細胞時, 脂 質體的粒徑優選為 30 ~ 1000nm, 較優選為 100 ~ 400nm。另外, 將脂質體組合物用作口服 制劑或透皮制劑時等, 脂質體的粒徑可以為幾微米。需要說明的是, (1) 正常組織中 ( 由于 血管內皮細胞緊密地構成血管壁 ) 血管壁成為屏障, 高分子和特定大小的脂質體之類的微 細粒子不能分布在組織內, 但病變組織中 ( 血管內皮細胞間出現間隙 ) 血管壁變得松弛, 血 管透過性增加, 高分子和微細粒子能夠分布在血管外的組織中 (enhanced permeability), 另外, (2) 在正常組織中淋巴系統發達, 但是已知由于在病變組織中淋巴系統不發達, 所以 高分子或微細粒子一旦被攝入則不會被全身系統回收, 而是留在其病變組織中 (enhanced retention), 稱作 EPR 效果 ( 松村、 前田, Cancer Research, (1986), 46 : pp.6387-6392)。由 此, 通過調節脂質體的粒徑, 能夠控制藥物動力學。
     需要說明的是, 本發明中, 脂質體的粒徑是指根據動態光散射法 ( 準彈性光散射 法 ) 測定的重量平均粒徑。此處表示使用動態光散射 (Dynamic Light Scattering) 測量 儀器 ( 例如 Malvern InstrumentsLtd 公司制 Zetasizer Nano ZS 型號或大冢電子公司制 ELS-8000) 測定的粒徑。 測量儀器測定粒子的布朗運動, 基于確立的動態光散射法理論確定 粒徑。
     脂質體內相的溶劑沒有特別限定, 例如可以舉出磷酸鹽緩沖液、 檸檬酸鹽緩沖液、 磷酸鹽緩沖生理鹽水等緩沖液、 生理鹽水、 細胞培養用的培養基等。作為溶劑, 使用緩沖液 時, 緩沖劑的濃度優選為 5 ~ 300mM, 較優選為 10 ~ 100mM。脂質體內相的 pH 沒有特別限
     定, 優選為 3 ~ 11, 較優選為 4 ~ 9。
     [ 脂質體組合物 ]
     根據本發明提供了脂質體組合物。脂質體組合物含有脂質體, 在脂質體內相還含 有艾日布林等。如上所述, 脂質體組合物包括固態及液態。脂質體組合物為固態時, 如下所 述通過溶解或混懸在規定溶劑中, 能夠變成液態。另外, 脂質體組合物為冷凍的固體時, 通 過室溫放置等使其溶化, 由此可以變成液態。
     脂質體組合物中的脂質體的濃度及活性化合物的濃度, 可以根據脂質體組合物的 目的、 劑型等適當設定。 脂質體組合物為溶液劑時, 脂質體的濃度以作為脂質體的構成成分 的全部脂質的濃度計, 可以為 0.2 ~ 100mM, 優選為 1 ~ 30mM。使用脂質體組合物作為藥物 時活性化合物的濃度 ( 用量 ) 如下所述。脂質體組合物中的環糊精的量, 相對于艾日布林 等優選小于 0.1 摩爾當量, 較優選為檢出限以下。
     本發明的脂質體中, 艾日布林等可以分配在脂質雙層中。
     脂質體組合物為溶液劑時脂質體組合物的溶劑 ( 分散介質 ) 沒有特別限定, 例如 可以舉出磷酸鹽緩沖液、 檸檬酸鹽緩沖液、 磷酸鹽緩沖生理鹽水等緩沖液、 生理鹽水、 細胞 培養用的培養基等。脂質體組合物中的脂質體外相的 pH 沒有特別限定, 優選為 3 ~ 11, 較 優選為 4 ~ 9。 還可以向脂質體組合物中加入葡萄糖、 半乳糖、 甘露糖醇、 果糖、 肌醇、 核糖、 木糖 等單糖類 ; 乳糖、 蔗糖、 纖維素二糖、 海藻糖、 麥芽糖等二糖類 ; 棉籽糖、 松三糖等三糖類 ; 環 糊精等多糖類 ; 赤蘚醇、 木糖醇、 山梨醇、 甘露糖醇、 麥芽糖醇等糖醇等的糖 ; 甘油、 雙甘油、 聚甘油、 丙二醇、 聚丙二醇、 乙二醇、 二乙二醇、 三乙二醇、 聚乙二醇、 乙二醇單烷基醚、 二乙 二醇單烷基醚、 1, 3- 丁二醇等多元醇等。可以將糖和醇組合使用。
     為了穩定地長期保存分散在上述溶劑 ( 分散介質 ) 中的脂質體, 從凝集等物理穩 定性的方面考慮, 優選盡可能消除溶劑 ( 分散介質 ) 中的電解質。另外, 從脂質的化學穩定 性方面考慮, 優選將溶劑 ( 分散介質 ) 的 pH 由酸性設定為中性附近 (pH3.0 ~ 8.0)、 及通過 吹入氮氣除去溶解氧。
     脂質體組合物含有的糖或多元醇的濃度沒有特別限定, 但在脂質體分散在溶劑中 的狀態下, 例如優選糖的濃度為 2 ~ 20% (W/V), 較優選為 5 ~ 10% (W/V)。多元醇的濃度 優選為 1 ~ 5% (W/V), 較優選為 2 ~ 2.5% (W/V)。上述溶劑也可以用作脂質體分散液的 脂質體外相, 通過用上述溶劑置換或稀釋脂質體準備液的脂質體外相, 可以使脂質體外相 的溶液為上述溶液。
     脂質體組合物的固體制劑例如優選含有葡萄糖、 半乳糖、 甘露糖醇、 果糖、 肌醇、 核 糖、 木糖的單糖類、 乳糖、 蔗糖、 纖維素二糖、 海藻糖、 麥芽糖等二糖類 ; 棉籽糖、 松三糖等三 糖類 ; 環糊精等多糖類 ; 赤蘚醇、 木糖醇、 山梨醇、 甘露糖醇、 麥芽糖醇等糖醇等糖。較優選 為葡萄糖、 乳糖、 蔗糖、 海藻糖、 山梨醇的配合, 更優選為乳糖、 蔗糖、 海藻糖的配合。由此, 能夠穩定地長期保存固體制劑。另外, 冷凍時, 固體制劑優選含有甘油、 雙甘油、 聚甘油、 丙 二醇、 聚丙二醇、 乙二醇、 二乙二醇、 三乙二醇、 聚乙二醇、 乙二醇單烷基醚、 二乙二醇單烷基 醚、 1, 3- 丁二醇等多元醇 ( 水溶液 )。多元醇 ( 水溶液 ) 較優選為甘油、 丙二醇、 聚乙二醇, 更優選為甘油、 丙二醇。由此, 能夠穩定地長期保存固體制劑。可以組合糖和多元醇使用。
     [ 脂質體組合物的制造方法 ]
     根據本發明, 提供了一種制造含有艾日布林或其藥理學上允許的鹽的脂質體組合 物的方法。制造脂質體組合物的方法包括下述步驟 : 供給含有脂質體的脂質體分散液的步 驟; 將上述脂質體分散液和上述活性化合物 ( 艾日布林或其藥理學上允許的鹽 ) 混合的步 驟; 將上述活性化合物導入上述脂質體分散液的脂質體內相的步驟。
     供給含有脂質體的脂質體分散液的步驟, 優選包括供給脂質體準備液的步驟、 及 置換或稀釋上述脂質體準備液的脂質體外相的步驟。
     脂質體準備液例如可以通過在含有銨鹽的溶液中制備脂質體而供給。 通過在含有 銨鹽的溶液中制備脂質體準備液, 可以制成在脂質體內相還含有銨鹽的脂質體分散液。
     制備脂質體準備液時的含有銨鹽的溶液, 可以是任何含有銨鹽的溶液, 沒有特別 限定。
     作為銨鹽, 例如可以舉出氯化銨、 硼酸銨、 硫酸銨、 甲酸銨、 乙酸銨、 檸檬酸銨、 酒石 酸銨、 琥珀酸銨、 磷酸銨, 優選為硫酸銨、 乙酸銨、 檸檬酸銨、 酒石酸銨、 磷酸銨, 較優選為硫 酸銨、 檸檬酸銨、 酒石酸銨, 特別優選為硫酸銨。
     上述銨鹽中, 可以組合任意 2 種以上的銨鹽進行使用。
     含有銨鹽的溶液中銨鹽的濃度, 可以根據包封的艾日布林等的量適當設定, 濃度 越高越好, 優選為 10mM 以上, 較優選為 20mM 以上, 更優選為 50mM 以上。優選含有銨鹽的溶 液的 pH 為 3 ~ 9, 從包封率與穩定性的均衡性考慮, 較優選為 4 ~ 9, 更優選為 5 ~ 8。
     為了調節含有銨鹽的溶液的 pH, 可以使用 pH 調節劑。含有銨鹽的溶液中的各個 pH 調節劑的濃度沒有特別限定, 優選為 1 ~ 300mM, 較優選為 5 ~ 100mM。
     pH 調節劑例如可以舉出精氨酸、 組氨酸、 甘氨酸等氨基酸 ; 抗壞血酸、 苯甲酸、 檸 檬酸、 谷氨酸、 磷酸、 乙酸、 丙酸、 酒石酸、 碳酸、 乳酸、 硼酸、 馬來酸、 富馬酸、 蘋果酸、 己二酸、 鹽酸、 硫酸等酸 ; 上述酸的鈉鹽、 鉀鹽、 銨鹽等鹽 ; 三羥甲基氨基甲烷、 氨水 ( 氨 )、 氫氧化鈉、 氫氧化鉀等堿性化合物 ( 堿 ) 等。作為 pH 調節劑, 優選為氫氧化鈉、 鹽酸、 氨水、 乙酸、 乳 酸、 酒石酸、 琥珀酸、 檸檬酸及磷酸, 較優選為氫氧化鈉、 氨水、 鹽酸、 乙酸、 檸檬酸及磷酸, 更 優選為氫氧化鈉、 氨水、 鹽酸、 檸檬酸及磷酸。pH 調節劑可以組合任何 2 種以上的銨鹽進行 使用。另外, 作為 pH 調節劑, 可以使用磷酸鹽緩沖液、 檸檬酸鹽緩沖液、 磷酸鹽緩沖生理鹽 水等緩沖液。
     作為脂質體準備液, 優選使用通過實質上不含有環糊精地制備脂質體得到的溶 液。另外, 作為脂質體準備液, 脂質體內相中還可以含有鹽、 酸、 堿及 / 或氨基酸, 這種情況 下, 優選脂質體內相中含有活性化合物、 銨鹽及酸。作為銨鹽, 可以舉出硫酸銨作為優選例 子, 作為酸, 可以舉出檸檬酸作為優選例子。
     脂 質 體 的 制 備, 可 以 舉 出 類 脂 膜 法 (Vortex 法 )、 反 相 蒸 發 法、 超 聲 波 法、 Pre-vesicle 法、 乙醇注入法、 French Press 法、 膽酸除去法、 Triton X-100 分批法、 Ca2+ 融 合法、 醚注入法、 退火法、 凍融融合法等。
     脂質體的制備中的各種條件 ( 膜構成成分的量、 溫度等 ) 可以根據脂質體的制備 方法或作為目標的脂質體的組成、 粒徑等適當確定 ( 參見上述菊池 (1983) 等 )。
     根據需要, 可以任意調節脂質體的粒徑。 例如可以通過使用孔徑均勻的膜過濾器, 在高壓力下進行擠出 ( 擠出過濾 ) 來調節粒徑。粒徑的調節可以在本發明的脂質體組合物 的制造中的任意時刻進行, 例如可以在調節脂質體準備液中的脂質體外相之前、 調節脂質體準備液中的脂質體外相之后、 或將活性化合物導入脂質體內相之后進行。粒徑的調節優 選在將活性化合物導入脂質體內相之前進行, 較優選在調節脂質體準備液中的脂質體外相 之前進行。
     通過置換或稀釋得到的脂質體準備液的脂質體外相, 可以得到脂質體分散液。脂 質體外相的置換或稀釋可以進行 1 次, 也可以組合各種置換或稀釋的方法進行多次。
     作為置換脂質體準備液的脂質體外相的方法, 可以舉出透析、 離心分離、 凝膠過濾 等方法。通過置換脂質體外相, 可以實施本發明, 使脂質體外相實質上不含有環糊精或銨 鹽。 另外, 通過置換或稀釋脂質體外相, 也可以有效地將艾日布林或其藥理學上允許的鹽包 封在脂質體內相中。
     透析例如可以使用透析膜進行。作為透析膜, 可以舉出纖維素管或 Spectra/Por 等以分子量餾化的膜。
     離心分離例如優選以 100,000g 以上、 較優選以 300,000g 以上的離心加速度實施。 通過離心來置換脂質體外相, 可以與脂質體外相的置換一同進行脂質體的濃縮。
     凝膠過濾例如可以通過使用 Sephadex 或 Sepharose 等柱, 基于分子量進行餾化而 實施。
     作為置換及 / 或稀釋脂質體外相時使用的溶劑 ( 分散介質 ), 例如可以舉出蔗糖溶 液、 食鹽水、 細胞培養用培養基等。通過使用上述溶劑, 可以制備穩定的脂質體組合物。
     所述溶劑的 pH 沒有特別限定, 可以在 2 ~ 11 的范圍內設定, 優選為 3 ~ 10, 較優 選為 6 ~ 10, 更優選為 7 ~ 10。如下所述, 艾日布林等向脂質體內相的導入時也可以利用 pH 梯度。此時, 可以設定溶劑的 pH, 使脂質體外相變成目標 pH。
     為了調節所述溶劑的 pH, 可以使用 pH 調節劑。使用的濃度沒有特別限定, 優選為 1 ~ 300mM, 較優選為 5 ~ 100mM。
     作為 pH 調節劑, 例如可以舉出精氨酸、 組氨酸、 甘氨酸等氨基酸、 抗壞血酸、 苯甲 酸、 檸檬酸、 谷氨酸、 磷酸、 乙酸、 丙酸、 酒石酸、 碳酸、 乳酸、 硼酸、 馬來酸、 富馬酸、 蘋果酸、 己二酸、 鹽酸、 硫酸等酸 ; 上述酸的鈉鹽、 鉀鹽、 銨鹽等鹽 ; 三羥甲基氨基甲烷、 氨水、 氫氧化 鈉、 氫氧化鉀等堿性化合物。優選為氫氧化鈉、 鹽酸、 組氨酸、 酒石酸、 琥珀酸、 檸檬酸及磷 酸, 較優選為氫氧化鈉、 鹽酸、 組氨酸、 酒石酸、 檸檬酸及磷酸, 更優選為氫氧化鈉、 鹽酸、 組 氨酸、 磷酸。
     為了改善艾日布林或其藥理學上允許的鹽在脂質體中的包封率, 可以向脂質體外 相中添加含有電解質的溶液 ( 鹽類溶液 ) 使離子強度增大, 由此增加包封率。脂質體外相 中含有的電解質 ( 鹽類 ) 沒有特別限定, 優選為氯化鈉、 氯化鉀, 較優選為氯化鈉。另外, 也 可以使用生理鹽水。另外, 作為脂質體分散液等的脂質體外相, 可以含有糖、 電解質、 及/或 氨基酸, 也可以含有糖或電解質、 及氨基酸。 作為糖, 可以舉出蔗糖作為優選例子, 作為電解 質, 可以舉出生理鹽水、 氯化鈉等作為優選例子, 作為氨基酸可以舉出組氨酸。
     優選得到的脂質體分散液在脂質體外相及脂質體內相中實質上不含有環糊精或 銨鹽, 但本發明中, 由于某些原因向脂質體分散液的脂質體外相中添加環糊精或銨鹽時等, 即使脂質體分散液在脂質體外相中含有環糊精或銨鹽, 也可以將艾日布林或其藥理學上允 許的鹽導入脂質體內相中。
     脂質體分散液中的脂質體的脂質濃度優選為 1 ~ 100mM, 較優選為 1 ~ 50mM。在上述范圍內, 可以不破壞脂質體分散液的物性、 適當地形成更多的脂質體粒子。
     將得到的脂質體分散液和艾日布林等活性化合物混合, 向脂質體分散液的脂質體 內相導入活性化合物, 由此可以得到脂質體組合物。優選導入的步驟包括提高脂質體分散 液與活性化合物的混合液中的脂質體的膜透過性的步驟。由此, 能夠以更短時間將艾日布 林等包封到脂質體中。 但是, 將脂質體分散液和艾日布林等混合后, 即使不特別進行用于提 高脂質體的膜透過性的操作, 經過一定時間也能夠將艾日布林等包封到脂質體中。
     在將艾日布林或其藥理學上允許的鹽混合的步驟中, 作為艾日布林等, 可以使用 溶解在溶劑中的上述物質、 或固態的上述物質。 溶劑沒有特別限定, 例如可以使用與脂質體 分散液中的脂質體外相相同的溶劑。
     根據需要, 任意地也可以在將艾日布林等導入脂質體內相時利用 pH 梯度。此時, 脂質體分散液中的脂質體內相的 pH 優選為 3 ~ 9, 較優選為 4 ~ 9, 更優選為 5 ~ 8。
     另外, 可以將脂質體外相的 pH 設定為高于脂質體內相的 pH, 賦予 pH 梯度。 優選的 pH 梯度為 1 ~ 5, 較優選為 2 ~ 3。
     進而, 通過使脂質體外相的 pH 在艾日布林等的 pKa 附近, 可以提高包封到脂質體 中的包封率。優選為 7.5 ~ 12.5, 較優選為 8.5 ~ 11.5, 更優選為 9 ~ 10.5( 甲磺酸艾日 布林的 pKa = 9.6)。
     作為脂質體準備液, 優選使用通過實質上不含有環糊精地制備脂質體而得到的溶液。 作為提高得到的混合液中脂質體的膜透過性的方法, 可以舉出加熱混合液的方 法、 向混合液中加入膜流化劑的方法等。
     加熱混合液時, 通常, 能夠通過升溫至更高的溫度, 更有效地將活性化合物導入在 脂質體內相中。 具體而言, 優選考慮活性化合物及使用的脂質體膜構成成分的熱穩定性, 設 定升溫溫度。特別優選升溫的溫度在脂質體的脂質雙層膜的相變溫度以上。
     所謂脂質體的脂質雙層膜的 “相變溫度” , 是指升溫狀態下的差熱分析中的吸熱開 始溫度 ( 吸熱反應開始時的溫度 )。 所謂差熱分析, 是如下所述的技術, 即, 能夠通過一邊改 變樣品及基準物質的溫度, 一邊測定該樣品與基準物質的溫度差作為時間或溫度的函數, 來分析樣品的熱特性。 針對脂質體的膜構成成分進行差熱分析時, 隨著溫度的上升, 發生脂 質體膜成分的流化, 觀察到吸熱反應。如本技術領域中眾所周知那樣, 根據脂質體的膜成 分, 觀察到吸熱反應的溫度域變化很大。例如, 脂質體膜成分由純粹的脂質構成時, 觀察到 吸熱反應的溫度域非常窄, 多在相對于吸熱峰溫度為 ±1℃的范圍內觀察到吸熱反應。 另一 方面, 脂質體膜成分由多種脂質構成時, 特別在由來自天然物質的脂質構成等時, 觀察到吸 熱反應的溫度域有變寬的傾向, 有時在相對于吸熱峰溫度例如為 ±5℃的范圍內觀察到吸 熱反應 ( 即能夠觀察到寬峰 )。 本發明中, 認為通過升溫至脂質體的脂質雙層膜的相變溫度 以上, 脂質體的膜流動性提高, 活性化合物的膜透過性提高。
     例如, 雖然也取決于活性化合物和使用的脂質體膜構成成分的熱穩定性等, 但優 選在脂質體的脂質雙層膜的相變溫度~相變溫度 +20 ℃的溫度范圍內, 較優選在相變溫 度~相變溫度 +10℃的溫度范圍內, 更優選在相變溫度 +5℃~相變溫度 +10℃的溫度范圍 內。
     升溫的溫度通常為 20 ~ 100℃, 優選為 40 ~ 80℃, 更優選為 45 ~ 65℃。
     具體而言, 在為以二棕櫚酰卵磷脂 ( 單體的相變溫度 : 41℃ ) 和膽固醇作為主體 的脂質體膜的情況下, 雖然也取決于其組成, 但通常升溫溫度優選為 40 ~ 60℃, 較優選為 45 ~ 50℃。另外, 在為以氫化大豆卵磷脂 (HSPC, 單體的相變溫度 : 50 ~ 60℃ ) 和膽固醇 作為主體的脂質體膜的情況下, 雖然也取決于其組成, 但通常升溫溫度優選為 50 ~ 70℃, 較優選為 55 ~ 65℃。但是, 上述升溫的溫度并不限定本發明。
     升溫的步驟中, 維持在相變溫度以上的溫度的時間沒有特別限定, 例如可以在幾 秒~ 30 分鐘的范圍內適當設定, 但考慮活性化合物和脂質的熱穩定性、 及有效的大量生產 時, 優選在短時間內處理。即, 升溫維持時間優選在 1 分鐘~ 30 分鐘, 較優選為 2 分鐘~ 5 分鐘。但是, 上述溫度維持的時間并不限定本發明。
     另外, 如上所述, 通過向得到的混合液中添加膜流化劑 ( 即向脂質體的外相側添 加 ), 也能夠提高脂質體的膜透過性。作為膜流化劑, 可以舉出可溶于水系溶劑中的有機溶 劑、 表面活性劑、 酶等。 更具體而言, 作為有機溶劑, 例如可以舉出乙醇、 苯甲醇等一元醇類 ; 甘油、 丙二醇等多元醇類 ; 二甲基亞砜 (DMSO) 等非質子性極性溶劑。 作為表面活性劑, 可以 舉出脂肪酸鈉、 單烷基硫酸鹽、 單烷基磷酸鹽等陰離子類表面活性劑 ; 烷基三甲基銨鹽等陽 離子類表面活性劑 ; 烷基二甲基氧化胺等兩性表面活性劑 ; 聚氧乙烯烷基醚、 烷基單甘油 醚、 脂肪酸山梨醇酯等非離子性表面活性劑。 作為酶, 可以舉出膽堿酯酶、 膽固醇氧化酶等。 如果是本領域技術人員, 可以根據脂質體膜構成成分的組成、 膜流化劑等, 考慮由膜流化劑 的添加引起的活性化合物包封效率化的程度、 及脂質體的穩定性等, 設定膜流化劑的量。 本發明的脂質體組合物的制造方法可以繼上述導入的步驟后, 包括調節所得脂質 體組合物的脂質體外相的 pH 的步驟。
     調節的外相的 pH 沒有特別限定, 但從構成脂質體的磷脂的化學穩定性的觀點考 慮, 優選為 4 ~ 10, 較優選為 5 ~ 9, 更優選為 6 ~ 8 的中性 pH。
     另外, 可以還包括干燥所得脂質體組合物的步驟。
     即, 脂質體組合物為溶液劑時, 可以將由上述導入的步驟得到的液態的脂質體組 合物可以直接作為最終的脂質體組合物, 或可以通過調節 ( 置換等 ) 得到的液態脂質體組 合物的脂質體外相, 作為最終的脂質體組合物。此時的脂質體外相的調節可以與脂質體準 備液的脂質體外相的調節同樣地進行。脂質體組合物為溶液劑時, 可以直接使用。
     另外, 脂質體組合物為固體制劑時, 可以通過對由上述導入步驟得到的液態脂質 體組合物進行干燥, 作為最終的固態脂質體組合物。 作為對脂質體組合物進行干燥的方法, 可以舉出凍干及噴霧干燥等。脂質體組合物為固體制劑時, 脂質體組合物可以通過溶解或 混懸在適當的溶劑中, 作為溶液劑使用。溶劑可以根據脂質體組合物的使用目的等適當設 定, 例如使用脂質體組合物作為注射劑時, 溶劑優選為滅菌蒸餾水。 使用脂質體組合物作為 藥物時, 例如可以由醫生或患者將溶劑注入包封有固體制劑的安瓿中, 由此進行上述用時 制備。另外, 為將液態的脂質體組合物冷凍所得的固體制劑時, 可以在冷凍狀態下保存, 使 用時通過在室溫下放置溶化或利用加熱迅速溶化來使其恢復液態, 由此作為溶液劑使用。
     [ 藥物組合物等 ]
     本發明的脂質體組合物在藥物領域中, 可以用作治療藥。 具體而言, 本發明的脂質 體組合物可以用作抗腫瘤劑的藥物組合物。
     使用本發明的脂質體組合物作為藥物組合物時, 脂質體組合物可以通過注射 ( 靜
     注、 動脈注射、 局部注射 )、 口服、 經鼻、 透皮、 經肺或滴眼給與, 特別是除靜脈注射、 皮下注 射、 皮內注射、 動脈內注射之外, 優選對于作為目標的細胞或臟器的局部注射等注射。作為 口服給與時的脂質體組合物的劑型, 例如可以舉出片劑、 散劑、 顆粒劑、 糖漿劑、 膠囊劑、 內 服溶液劑等。作為非口服給與時的脂質體組合物的劑型, 例如可以舉出注射劑、 滴劑、 滴眼 劑、 軟膏劑、 栓劑、 混懸劑、 巴布劑、 洗劑、 氣霧劑、 硬膏劑 (plaster) 等, 特別優選注射劑、 滴 劑。
     藥物組合物的給藥量, 根據作為對象的疾病的種類、 活性化合物的種類、 患者的年 齡、 性別、 體重、 癥狀的程度等明顯不同, 但通常成人每 1 日的艾日布林或其藥理學上允許 的鹽的給藥量沒有特別限定, 作為優選鹽的甲磺酸艾日布林通常為 0.1 ~ 10mg。另外, 可 以 1 日 1 次給予, 或分數次給與。可以給與在脂質體內相含有例如 0.01 ~ 300mg/mL 的艾 日布林或其藥理學上允許的鹽的脂質體組合物作為本發明的脂質體組合物。
     [ 試劑盒 ]
     根據本發明, 提供了一種用于制備脂質體組合物的試劑盒。
     試劑盒可以用于制備作為藥物的脂質體組合物, 醫者和患者本人可以在臨床現場 使用。
     試劑盒含有脂質體試劑。脂質體試劑可以為固態或液態的任一種。脂質體試劑為 液態時, 可以使用上述脂質體分散液作為脂質體試劑。另外, 脂質體試劑為固態時, 脂質體 試劑可以通過溶解或混懸在適當的溶劑中而得到脂質體分散液, 可以通過干燥上述脂質體 分散液而得到脂質體試劑。干燥可以與上述脂質體組合物的干燥同樣地進行。使用試劑盒 時, 脂質體試劑為固態時, 通過將脂質體試劑溶解或混懸在適當的溶劑中, 作為脂質體分散 液。此時的溶劑與上述脂質體分散液中的脂質體外相相同。
     本發明的試劑盒還含有艾日布林或其藥理學上允許的鹽 ( 作為優選的鹽為甲磺 酸艾日布林 )。艾日布林或其藥理學上允許的鹽可以為固態或液態 ( 溶解或混懸在溶劑中 的狀態 ) 中的任一種。使用試劑盒時, 在艾日布林等為固態時, 優選使艾日布林等溶解或混 懸在適當的溶劑中, 制成液態。 溶劑可以根據艾日布林等的物性等適當設定, 例如可以與上 述脂質體分散液中的脂質體外相相同。 本發明的試劑盒中可以含有除艾日布林或其藥理學 上允許的鹽之外的活性化合物。
     在試劑盒中, 脂質體試劑和活性化合物可以單獨包裝, 或者, 脂質體試劑和活性化 合物分別為固態, 可以被混合。
     脂質體試劑為固態時, 除了如上所述通過溶解或混懸制備脂質體分散液之外, 試 劑盒也可以通過進行下述步驟而使用, 所述步驟與上述脂質體組合物的制造方法中脂質體 分散液與活性化合物的混合、 及將活性化合物導入脂質體分散液的脂質體內相相同。 由此, 可以制備將活性化合物導入脂質體試劑的脂質體內相的脂質體組合物。
     脂質體試劑和活性化合物分別為固態, 被一起包裝時, 使所述脂質體試劑和活性 化合物的混合物溶解或混懸在適當的溶劑中。 此時的溶劑與上述脂質體分散液中的脂質體 外相相同。由此, 可以形成將脂質體分散液和活性化合物混合的狀態, 之后, 可以通過進行 上述脂質體組合物的制造方法中的、 將活性化合物導入脂質體分散液的脂質體內相中的其 他步驟進行使用。
     實施例給出實施例及比較例, 具體說明本發明, 但本發明并不限于以下的實施例。
     [ 實施例 1]
     < 脂質體內相用水溶液的制備 >
     將 396.4mg 硫酸銨及 189.1mg 檸檬酸一水合物溶解在純水中, 稀釋為 15mL, 由此制 備 200mM 硫酸銨 /60mM 檸檬酸水溶液。脂質體內相用水溶液如下制備, 即用氨水將 2.5mL 200mM 硫酸銨 /60mM 檸檬酸水溶液的 pH 調節為 5.5 之后, 使用純水稀釋為 5mL。
     < 脂質體準備液的制備 >
     將 317.9mg 氫化大豆卵磷脂 (Lipoid 公司制 )、 116.0mg 膽固醇 (Sigma 公司制 ) 及 130.4mg 聚乙二醇 2000- 磷脂酰乙醇胺 (Genzyme 公司制, MPEG2000- 二硬脂酰磷脂酰乙 醇胺 ) 溶解在 10mL 氯仿中, 之后精確地分成 3 份, 其中的 1 份使用旋轉蒸發器減壓蒸餾除 去氯仿, 制成脂質膜。 向得到的脂質膜中添加加熱至 60℃的 5mL 脂質體內相用水溶液, 攪拌 制備脂質體準備液。超聲波處理上述脂質體準備液 20 分鐘后, 使用加熱至約 65℃的擠壓 機 (Lipex Biomembranes 公司制 ) 整粒, 得到脂質體準備液。使用動態光散射法測定所得 脂質體準備液中的脂質體的粒徑, 結果均為 90 ~ 100nm。
     < 脂質體分散液的制備 >
     通過使用 Sephadex G-50 柱, 用 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液 (pH = 7.6) 洗 脫得到的脂質體準備液, 將脂質體外相置換為 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液。 置換脂質 體外相后, 以 400,000×g 離心 30 分鐘。離心后再分散, 使用 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水 溶液調節液量為 5mL, 得到脂質體分散液。
     < 活性化合物溶液的制備 >
     用 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液溶解甲磺酸艾日布林, 得到 1mg/mL 的甲磺酸 艾日布林溶液。
     < 脂質體組合物的制備 >
     在 10mL 的玻璃容器中, 將 0.5mL 的脂質體分散液和 0.5mL 的甲磺酸艾日布林溶液 混合, 在 55℃的水浴中孵化 (incubation)3 分鐘, 由此得到甲磺酸艾日布林被導入到脂質 體內的脂質體組合物。
     < 包封率的測定 >
     包封率如下所述求出。
     將包封有活性化合物的脂質體組合物以 400,000×g 超速離心 30 分鐘。用 HPLC 測定上清液中的活性化合物濃度, 由此對未包封在脂質體中的活性化合物量進行定量。通 過下式計算包封率。
     [ 式 1]
     甲磺酸艾日布林的包封率為 90.9%。 [ 實施例 2] < 脂質體內相用水溶液的制備 > 與實施例 1 同樣地, 將 264.3mg 硫酸銨及 126.1mg 檸檬酸一水合物溶解在純水中,使用容量瓶稀釋為 10mL, 由此制成 200mM 硫酸銨 /60mM 檸檬酸水溶液。從中量取 1mL, 用氨 水將 pH 調節為 5.5 之后, 用純水稀釋為 2mL, 由此制備脂質體內相用水溶液。
     < 脂質體準備液的制備 >
     分別稱量 80mg 脂質混合物 ( 氫化大豆卵磷脂∶膽固醇∶聚乙二醇 2000- 磷脂酰 乙醇胺= 58.6 ∶ 19.2 ∶ 22.2( 重量比 )), 添加加熱至約 80℃的脂質體內相用水溶液 2mL, 攪拌制備脂質體準備液。 使用加熱至約 80℃的擠壓機 (Lipex Biomembranes 公司制 ) 將上 述脂質體準備液整粒, 得到脂質體準備液。
     < 脂質體分散液的制備 >
     用 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液 (pH = 7.6) 將得到的脂質體準備液稀釋為 10mL, 以 400,000×g 離心 30 分鐘。離心后, 棄去全部上清液。使用 0.9%氯化鈉 /10mM 組 氨酸水溶液將沉淀再分散, 使用容量瓶將液量調節為 1mL, 得到脂質體分散液。
     < 藥物溶液的制備 >
     使用 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液溶解甲磺酸艾日布林 ( 甲磺酸艾日布林 ), 得到 5mg/mL 的甲磺酸艾日布林溶液。
     < 脂質體組合物的制備 >
     在 10mL 的玻璃容器中, 將 0.96mL 脂質體分散液和 0.24mL 甲磺酸艾日布林溶液混 合, 在 60℃的水浴中孵化 3 分鐘, 由此得到甲磺酸艾日布林被導入到脂質體內的脂質體組 合物。
     < 大鼠血漿中的穩定性 >
     將 0.2mL 制備的甲磺酸艾日布林包封脂質體和 1.8mL 大鼠血漿混合, 使用液相孵 化箱在 37℃下振蕩。制備后, 立即在振蕩開始 6 小時后、 12 小時后、 24 小時后、 48 小時后、 72 小時后進行取樣, 用 HPLC 測定甲磺酸艾日布林的脂質體內殘留量。
     測定結果如圖 1 所示。由圖 1 可知, 表明即使經過 120 小時的長時間, 甲磺酸艾日 布林也穩定地保持在血漿中, 可以緩釋。
     [ 實施例 3]
     < 脂質體內相用水溶液的制備 >
     將 264.3mg 硫酸銨及 126.1mg 檸檬酸一水合物溶解在純水中, 制成約 15mL。 用氫氧 化鈉水溶液將 pH 調節為 7.0 后, 用純水稀釋為 20mL, 由此制備脂質體內相用水溶液 (100mM 硫酸銨 /30mM 檸檬酸 )。
     < 脂質體準備液的制備 >
     稱量 378mg 脂質混合物 ( 氫化大豆卵磷脂∶膽固醇∶聚乙二醇 2000- 磷脂酰乙醇 胺= 58.6 ∶ 19.2 ∶ 22.2( 重量比 )), 添加加熱至約 80℃的上述脂質體內相用水溶液 10mL, 攪拌制備脂質體準備液。使用安裝有 50nm 的聚碳酸酯膜過濾器、 加熱至約 80℃的擠壓機 (Lipex Biomembranes 公司制 ) 將脂質體準備液整粒, 得到粒徑約 80nm 的脂質體準備液。
     < 脂質體分散液的制備 >
     使用 Sephadex G-50 柱, 用 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液 (pH = 7.6) 洗脫所 得脂質體準備液, 由此將脂質體外相置換為 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液。 置換脂質體 外相后, 以約 400,000×g 離心 30 分鐘。離心后, 用 96mg/mL 蔗糖 /10mM 組氨酸水溶液 (pH = 7.6) 再分散, 將液量稀釋為 10mL, 由此得到脂質體分散液。< 藥物溶液的制備 >
     用 96mg/mL 蔗糖 /10mM 組氨酸水溶液 (pH = 7.6) 溶解甲磺酸艾日布林, 得到 5mg/ mL 的甲磺酸艾日布林溶液。
     < 脂質體組合物的制備 >
     在 10mL 的玻璃容器中, 將 9.6mL 脂質體分散液和 1.2mL 甲磺酸艾日布林溶液混 合, 使用氫氧化鈉將 pH 調節為 9.5。在 60℃的水浴中孵化 3 分鐘, 由此得到甲磺酸艾日布 林被導入到脂質體內的脂質體組合物。冷卻后, 使用鹽酸將 pH 調節為 7.5。與實施例 1 同 樣地測定包封率, 結果包封率為 99%。
     [ 實施例 4]
     < 脂質體內相用水溶液的制備 >
     與實施例 1 同樣地制備 100mM 硫酸銨 /30mM 檸檬酸水溶液 (pH = 5.5)。
     < 脂質體準備液的制備 >
     分別僅稱量下述表 1 記載的量的氫化大豆卵磷脂、 膽固醇及聚乙二醇 2000- 磷脂 酰乙醇胺。分別溶解在 3mL 氯仿中, 之后使用旋轉蒸發器減壓蒸餾除去氯仿, 制成脂質膜。 向得到的脂質膜中添加 10mL 加熱至約 80℃的脂質體內相用水溶液, 攪拌制備脂質體準備 液。使用加熱至約 80℃的擠壓機 (Lipex Biomembranes 公司制 ) 整粒, 得到整粒后的脂質 體準備液。使用動態光散射法測定得到的脂質體準備液中的脂質體的粒徑, 結果 Rp.1 為 77nm, Rp.2 為 95nm, Rp.3 為 79nm, Rp.4 為 128nm。
     [ 表 1]
     Rp. 1 2 3 4
     氫化大豆卵磷脂 234mg 234mg 222mg 222mg 膽固醇 76mg 76mg 73mg 73mg 聚乙二醇 2000- 磷脂酰乙醇胺 15mg 15mg 87mg 87mg< 脂質體組合物的制備 >與實施例 1 同樣地得到脂質體分散液。 另外, 用 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液 溶解甲磺酸艾日布林, 得到 5mg/mL 的甲磺酸艾日布林溶液。
     在 10mL 的玻璃容器中, 將 4.8mL 各脂質體分散液與 0.6mL 甲磺酸艾日布林溶液分 別混合, 在 60℃的水浴中孵化 3 分鐘, 由此得到甲磺酸艾日布林被導入到脂質體內的脂質 體組合物。向各個脂質體組合物中添加 24.6mL 的 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液, 使用 0.22μm 的聚偏 1, 1- 二氟乙烯 (PVDF) 過濾器過濾、 滅菌, 由此得到給藥樣品 ( 甲磺酸艾日 布林濃度 : 0.1mg/mL)。
     與實施例 1 同樣地測定包封率, 確認了任一處方中包封率均為 90%以上。
     對雌性裸鼠 (NU/NU, 日本 Charles River 株式會社 ) 皮下接種人黑色素瘤 LOX 細胞, 11 日后或 12 日后尾靜脈內給與樣品, 使其為 10mL/kg( 換算成甲磺酸艾日布林為1.0mg/kg)。給藥后經過一定時間 (15 分鐘、 30 分鐘、 1、 2、 4、 8、 12、 24、 36、 48 小時 ) 后利用 心臟穿刺采集血液并摘除腫瘤組織 (n = 3)。將血液收集到含有肝素的試管中, 采集后 30 分鐘以內, 在 4℃下、 以 1,500×g 離心分離 10 分鐘, 得到血漿。摘除全部腫瘤組織, 用 PBS 清洗, 用吸水紙擦拭后, 立即測定并記錄組織重量。將組織裝入試管中, 在冰水中冷卻后, 在 -80℃下保存至分析操作。
     血漿中及腫瘤組織中的甲磺酸艾日布林使用 LC/MS/MS 進行測定。
     PK 參 數 使 用 非 房 室 模 型 (non-compartment model) 分 析 軟 件 (WinNonlin v.5.0.1) 算出。甲磺酸艾日布林的血漿 PK 參數及腫瘤組織 PK 參數的結果分別示于表 2 及 表 3。
     [ 表 2]
     LOX 罹癌鼠中的 Rp.1 ~ 4 及甲磺酸艾日布林的血漿 PK 參數
     Ratio1 = AUC 血漿脂質體 /AUC 血漿甲磺酸艾日布林 [ 表 3] LOX 罹癌鼠中的 Rp.1 ~ 4 及甲磺酸艾日布林的血漿 PK 參數
     Ratio2 = AUC 腫瘤脂質體 /AUC 腫瘤甲磺酸艾日布林由表 2 及表 3 可知, 在 Rp.1 ~ 4 的所有脂質體組合物中, 與游離的甲磺酸艾日布 林相比, 血漿及腫瘤組織的 AUC 增大, 因此, 甲磺酸艾日布林的腫瘤遷移量及滯留性提高。
     [ 實施例 5]
     < 脂質體內相用水溶液的制備 >
     與實施例 1 同樣地制備 100mM 硫酸銨 /30mM 檸檬酸水溶液 (pH = 5.5)。
     < 脂質體準備液的制備 >
     稱量 221.8mg 氫化大豆卵磷脂、 72.5mg 膽固醇及 86.9mg 聚乙二醇 2000- 磷脂酰乙 醇胺。溶解在 3mL 氯仿中, 之后使用旋轉蒸發器減壓蒸餾除去氯仿, 制成脂質膜。向得到的 脂質膜中添加 10mL 加熱至約 80℃的制成的脂質體內相用水溶液, 攪拌制備脂質體準備液。 使用加熱至約 80℃的擠壓機 (Lipex Biomembranes 公司制 ) 整粒, 得到整粒的脂質體準備液。使用動態光散射法測定所得脂質體準備液中的脂質體的粒徑, 結果為約 90nm。
     < 脂質體分散液的制備 >
     使用 Sephadex G-50 柱, 用 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液 (pH = 7.6) 洗脫得 到的脂質體準備液, 由此將脂質體外相置換為 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液。 置換脂質 體外相后, 以 400,000×g 離心分離 30 分鐘。離心后再分散, 使用 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨 酸水溶液將液量調節為 10mL, 得到脂質體分散液。
     < 藥物溶液的制備 >
     用 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液溶解甲磺酸艾日布林, 得到 1mg/mL 的甲磺酸 艾日布林溶液。另外, 作為游離體的給藥樣品, 用 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液稀釋甲 磺酸艾日布林溶液, 使用 0.22μm 的 PVDF 過濾器過濾滅菌, 由此得到給藥樣品 ( 甲磺酸艾 日布林濃度 : 0.3mg/mL 及 0.4mg/mL)。
     < 脂質體組合物的制備 >
     在 10mL 的玻璃容器中, 將 1.8mL 脂質體分散液和 1.2mL 甲磺酸艾日布林溶液分別 混合, 在 60℃的水浴中孵化 3 分鐘, 由此得到甲磺酸艾日布林被導入在脂質體內的脂質體 組合物。用 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液稀釋得到的脂質體組合物, 使用 0.22μm 的 PVDF 過濾器過濾滅菌, 由此得到給藥樣品 ( 甲磺酸艾日布林濃度 : 0.2mg/mL)。與實施例 1 同樣地測定包封率, 確認包封率為 90%以上。 在含有 10%胎牛血清的 MEM 培養基中培養人咽部鱗狀細胞癌細胞株即 FaDu( 購自 American Type Culture Collection), 使其增殖。使用 0.05% Trypsin-EDTA 溶液使細胞 從燒瓶分離, 回收。用 PBS 洗滌后, 將細胞懸浮在 PBS 中使其為 5×107 個 /mL, 在冰上保持。 向 6 周齡的裸鼠 ( 日本 Charles·River 株式會社 ) 的右腹側部皮下注射細胞懸浮液, 每1 只注射 0.1mL。 每天觀察各個小鼠, 發現狀態異常時進行適當記錄。 使用游標卡尺經時測定 腫瘤的大小, 基于計算式 : 長徑 ×( 短徑的平方 )÷2 算出腫瘤的大小。在腫瘤的大小變為 100 ~ 200mm3 的時刻進行分組, 使各試驗組間的腫瘤的大小及小鼠體重的平均值均勻 ( 各 試驗組的小鼠數為 5 只 ), 進行藥物的尾靜脈給藥 (0.2mL/20g ; 每 7 天給藥 1 次, 共 3 次 )。
     給與樣品后的平均腫瘤體積的發展結果示于圖 2。
     如圖 2 所示, 由于 FaDu 為對甲磺酸艾日布林敏感性低的細胞株, 所以給與游離體 時, 即使給與作為最大耐受劑量的 4mg/kg, 也不能得到腫瘤縮小效果。另一方面, 給予脂質 體組合物時, 即使給與作為最大耐受劑量以下的 2mg/kg, 也明確地確認到腫瘤縮小效果, 表 明即使對于目前為止甲磺酸艾日布林不起效的癌癥種類, 也能得到非常高的藥理效果。
     [ 實施例 6]
     < 脂質體內相用水溶液的制備 >
     與實施例 1 同樣地制備 100mM 硫酸銨 /30mM 檸檬酸水溶液 (pH = 5.5)。
     < 藥物溶液的制備 >
     與實施例 5 同樣地實施, 得到游離體的給予樣品 ( 甲磺酸艾日布林濃度 : 0.2mg/ mL、 0.3mg/mL 及 0.4mg/mL)。
     < 脂質體組合物的制備 >
     除使用如上所述制備的脂質體內相用水溶液之外, 與實施例 5 同樣地得到脂質體 組合物 ( 甲磺酸艾日布林濃度 : 0.3mg/mL)。與實施例 1 同樣地測定包封率, 確認到包封率
     為 90%以上。
     在 含 有 10 % 胎 牛 血 清 的 MEM 培 養 基 中 培 養 作 為 人 腎 癌 細 胞 株 的 ACHN( 購 自 American Type Culture Collection), 使其增殖。使用 0.05% Trypsin-EDTA 溶液使細胞 從燒瓶分離, 回收。用 PBS 洗滌后, 將細胞懸浮在 PBS 中使其為 5×107 個 /mL, 在冰上保持。 向 6 周齡的裸鼠 ( 日本 Charles River 株式會社 ) 的右腹側部皮下注射細胞懸浮液, 每1 只注射 0.1mL。每天觀察各個小鼠, 發現狀態異常時進行適當記錄。使用游標卡尺經時測 定腫瘤的大小, 基于計算式 : 長徑 ×( 短徑的平方 )÷2 算出腫瘤的大小。在腫瘤的大小變 成 150 ~ 200mm3 的時刻進行分組, 使各試驗組間的腫瘤大小及小鼠的體重的平均值均勻 ( 各試驗組的小鼠數為 5 只 ), 進行藥物的尾靜脈內給藥 (0.2mL/20g ; 每 7 天給藥 1 次, 共3 次 )。
     給與樣品后的平均腫瘤體積的發展結果示于圖 3。
     如圖 3 所示, 由于 ACHN 為對甲磺酸艾日布林具有耐受性的細胞株, 所以給與游離 體時, 在 2mg/kg 給藥組、 3mg/kg 給藥組及 4mg/kg( 最大耐受劑量 ) 給藥組的任一組中, 給與 樣品開始 45 天后沒有確認到與無處置組間的顯著差異。另一方面, 在脂質體組合物 3mg/ kg 給藥組中確認到腫瘤增殖抑制效果, 開始給與樣品 45 天后, 對于無處置組及游離體給藥 組, 顯示出明顯小的腫瘤體積值。 如上所述, 表明即使對于目前為止甲磺酸艾日布林完全得 不到治療效果的癌癥種類, 通過制成脂質體制劑, 也可以延遲腫瘤的增殖。
     [ 實施例 7]
     < 脂質體內相用水溶液的制備 >
     制備以下表 4 所示的 12 種內相用水溶液。
     < 脂質體準備液的制備 >
     分別稱量 120mg 脂質混合物 ( 氫化大豆卵磷脂∶膽固醇∶聚乙二醇 2000- 磷脂酰 乙醇胺= 58.6 ∶ 19.2 ∶ 22.2( 重量比 )) 裝入試管中, 用 3mL 加熱至 80℃的各內相用水溶 液進行水合。
     使用加熱至約 80℃的擠壓機對上述脂質體準備液進行整粒, 得到脂質體準備液。
     < 脂質體分散液的制備 >
     使用 Sephadex G-50 柱, 用 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液洗脫得到的脂質體準 備液, 由此將脂質體外相置換為 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液。
     置換脂質體外相后, 以 400,000×g 離心 1 小時, 完全除去上清液。用 96mg/mL 蔗 糖 /10mM 組氨酸水溶液 (pH = 7.5) 將沉淀物進行再懸浮, 使其變為約 2mL。
     使用動態光散射法測定所得脂質體分散液的粒徑, 結果均為約 80nm。
     < 藥物溶液的制備 >
     用 96mg/mL 蔗糖 /10mM 組氨酸水溶液溶解甲磺酸艾日布林, 得到 5mg/mL 的甲磺酸 艾日布林溶液。
     < 脂質體組合物的制備 >
     在 10mL 玻璃容器中, 混合脂質體分散液和甲磺酸艾日布林溶液, 使甲磺酸艾日布 林為 0.2mg/mL、 總脂質濃度為 16μmol/mL。在 60℃下升溫 5 分鐘, 得到甲磺酸艾日布林被 導入在脂質體內的脂質體組合物。
     < 包封率的測定 >與實施例 1 同樣地測定包封率。結果示于表 4。由表 4 可知, 內相中使用任一種 銨鹽時, 甲磺酸艾日布林的包封率均提高。 特別是使用硫酸銨、 檸檬酸銨、 磷酸銨、 酒石酸銨 時, 包封率顯著提高。
     [ 表 4]
     [ 實施例 8]
     < 脂質體內相用水溶液的制備 >
     與實施例 7 同樣地制備 100mM 硫酸銨 /30mM 檸檬酸水溶液 (pH = 7.5) 的脂質體 內相用水溶液。
     < 脂質體準備液的制備 >
     使用上述脂質體內相用水溶液, 與實施例 7 同樣地制備脂質體準備液。
     < 脂質體分散液的制備 >
     使用 Sephadex G-50 柱, 用 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液洗脫得到的脂質體準 備液, 由此將脂質體外相置換為 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液。
     置換脂質體外相后, 以 400,000×g 離心 1 小時, 完全除去上清液。 用 96mg/mL/10mM 組氨酸水溶液 (pH = 7.5) 將沉淀物進行再懸浮, 將脂質體外相置換為 96mg/mL 蔗糖 /10mM 組氨酸水溶液 (pH = 7.5), 得到脂質體分散液。使用動態光散射法測定所得脂質體分散液 的粒徑, 結果約為 80nm。
     將脂質體分散液分注到 7 個小瓶中, 向脂質體外相中分別添加已知量的硫酸銨 ( 已使用氫氧化鈉水溶液將 pH 調節為 7.5), 使其為表 5 的各濃度, 得到脂質體外相中存在 已知濃度的硫酸銨的脂質體分散液。
     < 藥物溶液的制備 >
     用 96mg/mL 蔗糖 /10mM 組氨酸水溶液溶解甲磺酸艾日布林, 得到 5mg/mL 甲磺酸艾 日布林溶液。
     < 脂質體組合物的制備 >
     在 10mL 玻璃容器中, 混合脂質體分散液和甲磺酸艾日布林溶液, 使甲磺酸艾日布 林為 0.2mg/mL、 總脂質濃度為 16mM。在 60℃下升溫 5 分鐘, 得到甲磺酸艾日布林被導入在
     脂質體內的脂質體組合物。
     < 包封率的測定 >
     與實施例 1 同樣地測定包封率。結果如表 5 所示。表明在脂質體外相中僅存在 0.4mM 硫酸銨, 包封率顯著下降, 而存在 10mM 時, 幾乎沒有被包封。
     [ 表 5]
     [ 實施例 9]
     < 脂質體內相用水溶液的制備 >
     與實施例 7 同樣地制備 100mM 硫酸銨 /30mM 檸檬酸水溶液 (pH = 7.5) 的脂質體 內相用水溶液。
     < 脂質體準備液的制備 >
     使用上述脂質體內相用水溶液, 與實施例 7 同樣地制備脂質體準備液。
     < 脂質體分散液的制備 >
     使用 Sephadex G-50 柱, 用 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液洗脫所得的脂質體準 備液, 由此將脂質體外相置換為 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液。
     置換脂質體外相后, 以 400,000×g 離心 1 小時, 完全除去上清液。用 96mg/mL 蔗 糖 /10mM 組氨酸水溶液 (pH = 7.5) 將沉淀物進行再懸浮, 將脂質體外相置換為 96mg/mL 蔗 糖 /10mM 組氨酸水溶液 (pH = 7.5), 得到脂質體分散液。用動態光散射法測定所得脂質體 分散液的粒徑, 結果約為 80nm。
     之后, 將脂質體分散液分注至 7 個小瓶中。
     < 藥物溶液的制備 >
     將甲磺酸艾日布林溶解在 96mg/mL 蔗糖 /10mM 組氨酸水溶液中, 得到 5mg/mL 的甲 磺酸艾日布林溶液。
     < 脂質體組合物的制備 >
     在 10mL 玻璃容器中, 分別混合脂質體分散液和甲磺酸艾日布林溶液, 使甲磺酸艾 日布林為 0.2mg/mL、 總脂質濃度為 16mM。如表 6 所示, 使用 1M 氫氧化鈉水溶液分別調節脂 質體外相的 pH。在 60℃下升溫 5 分鐘, 得到甲磺酸艾日布林被導入在脂質體內的脂質體組 合物。接下來, 使用鹽酸將外相的 pH 調節為 7.5。
     < 包封率的測定 >
     與實施例 1 同樣地測定包封率。結果示于表 6。隨著脂質體外相的 pH 的升高, 艾 日布林的包封率顯著提高, 實現了幾乎 100%的包封率。
     [ 表 6][ 實施例 10]
     < 脂質體內相用水溶液的制備 >
     與實施例 7 同樣地制備 100mM 硫酸銨 /30mM 檸檬酸水溶液 (pH = 7.5) 的脂質體 內相用水溶液。
     < 脂質體準備液的制備 >
     使用上述脂質體內相用水溶液, 與實施例 7 同樣地制備脂質體準備液。
     < 脂質體分散液的制備 >
     使用 Sephadex G-50 柱, 用 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液洗脫所得脂質體準備 液, 由此將脂質體外相置換為 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液。
     將脂質體分散液分注至 4 個小瓶中, 以 400,000×g 離心 1 小時, 完全除去上清液。 用 96mg/mL 蔗糖 /10mM 組氨酸水溶液 (pH = 7.5) 將其中 2 個小瓶的沉淀物進行再懸浮, 將 脂質體外相置換為 96mg/mL 蔗糖 /10mM 組氨酸水溶液 (pH = 7.5)。 用 0.9%氯化鈉 /10mM 組 氨酸水溶液 (pH = 7.5) 將剩余 2 個小瓶的沉淀物進行再懸浮, 將脂質體外相置換為 0.9% 氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液 (pH = 7.5)。使用動態光散射法測定所得脂質體分散液的粒 徑, 結果均為約 80nm。
     < 藥物溶液的制備 >
     用 96mg/mL 蔗糖 /10mM 組氨酸水溶液溶解甲磺酸艾日布林, 得到 5mg/mL 的甲磺酸 艾日布林溶液。另外, 同樣地用 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液溶解甲磺酸艾日布林, 得 到 5mg/mL 甲磺酸艾日布林溶液。
     < 脂質體組合物的制備 >
     在 10mL 的玻璃容器中分別混合脂質體分散液和甲磺酸艾日布林溶液, 使甲磺酸 艾日布林為 0.2mg/mL、 總脂質濃度為 16mM。通過添加氫氧化鈉, 將脂質體外相為 96mg/mL 蔗糖 /10mM 組氨酸水溶液 (pH = 7.5) 的 2 個小瓶中的 1 瓶的脂質體外相的 pH 調節為 9.5。 同樣地通過添加氫氧化鈉, 將脂質體外相為 0.9%氯化鈉 /10mM 組氨酸水溶液 (pH = 75) 的 2 個小瓶中的 1 瓶的脂質體外相的 pH 調節為 9.5。在 60℃下升溫 5 分鐘, 得到甲磺酸艾日 布林被導入在脂質體內的脂質體組合物。
     < 包封率的測定 >
     與實施例 1 同樣地測定包封率。結果示于表 7。可知與脂質體外相為作為非電解 質的蔗糖時相比, 作為電解質的氯化鈉的情況能夠得到非常高的包封率。 另外, 除電解質的 效果之外, 通過應用使脂質體外相為堿性的 pH 梯度, 實現了 100%的包封率。
     [ 表 7]本申請基于 2009 年 3 月 30 日申請的日本專利申請 ( 日本特愿 2009-082521 號 ) 及美國專利臨時申請 (61/164653), 將其內容作為參照引入本說明書中。
     產業上的可利用性
     本發明可以提供一種以較高包封率制備活性化合物的保持穩定性高的脂質體的 方法。
     本發明的脂質體組合物優選通過艾日布林或其藥理學上允許的鹽的藥理作用, 用 于治療用途。
    

關 鍵 詞:
脂質體 組合
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