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用于抑制蛋白酶體酶的化合物.pdf

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用于 抑制 蛋白酶 化合物
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摘要
申請專利號:

CN200580019845.4

申請日:

2005.04.14

公開號:

CN101006098B

公開日:

2014.10.29

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||專利申請權的轉移IPC(主分類):C07K 5/087變更事項:申請人變更前權利人:普羅特奧里克斯公司變更后權利人:歐尼斯治療公司變更事項:地址變更前權利人:美國加利福尼亞州變更后權利人:美國加利福尼亞州登記生效日:20131011|||實質審查的生效|||公開
IPC分類號: C07K5/087; A61K38/06; C07K5/08 主分類號: C07K5/087
申請人: 歐尼斯治療公司
發明人: M·S·史密斯; G·J·萊迪; R·T·波爾查德特; B·A·布寧; C·M·克魯斯; J·H·穆塞爾; J·C·查巴拉
地址: 美國加利福尼亞州
優先權: 2004.04.15 US 60/562,340; 2004.05.07 US 60/569,096; 2004.08.06 US 60/599,401; 2004.09.14 US 60/610,001; 2004.09.14 US 60/610,002; 2004.09.14 US 60/610,159; 2004.10.20 US 60/620,573
專利代理機構: 中國專利代理(香港)有限公司 72001 代理人: 劉健;劉玥
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200580019845.4

授權公告號:

101006098B|||||||||

法律狀態公告日:

2014.10.29|||2013.11.06|||2007.09.19|||2007.07.25

法律狀態類型:

授權|||專利申請權、專利權的轉移|||實質審查的生效|||公開

摘要

基于肽的化合物,包括含雜原子的三元環,有效而選擇性地抑制N端親核(Ntn)水解酶的特定活性。所述化合物對那些具有多活性的Ntn的各個活性進行不同的抑制。例如,本發明化合物可選擇性抑制20S蛋白酶體的胰凝乳蛋白酶樣活性。基于肽的化合物包括至少三個肽單位、一個環氧化物或氮雜環丙烷,以及在N端具有官能作用。基于肽的化合物混入其它治療用劑,預期具有抗炎特性和抑制細胞增殖作用。

權利要求書

權利要求書
1.  一種具有式(I)結構的化合物或其藥學上可接受的鹽,

其中每個A獨立選自C=O、C=S和SO2;或
當與存在的Z相鄰時,A任選為共價鍵;
L不存在或選自C=O、C=S和SO2,優選L不存在或為C=O;
M不存在或為C1-12烷基;
Q不存在或選自O、NH和N-C1-6烷基;
X選自O、NH和N-C1-6烷基;
Y不存在或選自O、NH和N-C1-6烷基、S、SO、SO2、CHOR10和CHCO2R10;
每個Z獨立選自O、S、NH和N-C1-6烷基;或
當與存在的A相鄰時,Z任選為共價鍵;
R1、R2、R3和R4各自獨立選自C1-6烷基、C1-6羥烷基、C1-6烷氧基烷基、芳基和C1-6芳烷基,其中的任何基團任選地被一個或更多個酰胺、胺、羧酸(或其鹽)、酯、硫醇或硫醚取代基取代;
R5為N(R6)LQR7;
R6選自氫、OH和C1-6烷基;
R7選自氫、C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、芳基、C1-6芳烷基、雜芳基、C1-6雜芳烷基、R8ZAZ-C1-8烷基-、R11Z-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-ZAZ-C1-8烷基-、R8ZAZ-C1-8烷基-ZAZ-C1-8烷基-(優選R8ZA-C1-8烷基-ZAZ-C1-8烷基-)、雜環基  MZAZ-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-、(R10)2N-C1-12烷基-、(R10)3N+-C1-12烷基-、雜環基M-、碳環基M-、R11SO2C1-8烷基-和R11SO2NH;或
R6和R7共同為C1-6烷基-Y-C1-6烷基、C1-6烷基-ZAZ-C1-6烷基、ZAZ-C1-6烷基-ZAZ-C1-6烷基、ZAZ-C1-6烷基-ZAZ或C1-6烷基-A,由此形成環;
R8和R9獨立選自氫、金屬陽離子、C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、芳基、雜芳基、C1-6芳烷基和C1-6雜芳烷基,優選選自氫、金屬陽離子和C1-6烷基,或R8和R9共同為C1-6烷基,由此形成環;
每個R10獨立選自氫和C1-6烷基,優選為C1-6烷基;以及
R11獨立選自氫、C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、碳環基、雜環基、芳基、雜芳基、C1-6芳烷基和C1-6雜芳烷基,條件是當R6為H或CH3,且Q不存在時,LR7不是氫、未取代的C1-6烷基C=O、氨基酸的另一個鏈、叔丁氧羰基(Boc)、苯甲酰基(Bz)、芴-9-基甲氧羰基(Fmoc)、三苯基甲基(三苯甲基)、芐氧羰基(Cbz)、三氯乙氧羰基(Troc)或取代的或未取代的芳基或雜芳基;以及
在任何存在序列ZAZ的情況下,該序列中至少有一個成員必須不是共價鍵。

2.  權利要求1所述的化合物,其中R1、R2、R3和R4獨立選自C1-6烷基和C1-6芳烷基。

3.  權利要求2所述的化合物,其中R1和R3均為C1-6芳烷基,且R2和R4均為C1-6烷基。

4.  權利要求3所述的化合物,其中X為O,R1為2-苯乙基,R2為異丁基,R3為苯甲基,R4為異丁基。

5.  權利要求4所述的化合物,其中L和Q不存在,且R6為C1-6烷基。

6.  權利要求5所述的化合物,其中R7選自C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、C1-6芳烷基和C1-6雜芳烷基。

7.  權利要求6所述的化合物,其中R7是C1-6烷基。

8.  權利要求7所述的化合物,其中R7是丁基。

9.  權利要求6所述的化合物,其中R7是C1-6烯基。

10.  權利要求9所述的化合物,其中R7是烯丙基。

11.  權利要求6所述的化合物,其中R7是C1-6炔基。

12.  權利要求11所述的化合物,其中R7是炔丙基。

13.  權利要求6所述的化合物,其中R7是C1-6芳烷基。

14.  權利要求13所述的化合物,其中R7是苯甲基。

15.  權利要求6所述的化合物,其中R7是C1-6雜芳烷基。

16.  權利要求15所述的化合物,其中R7選自2-吡啶基、3-吡啶基和4-吡啶基。

17.  權利要求4所述的化合物,其中Q不存在,L為SO2。

18.  權利要求17所述的化合物,其中R7選自C1-6烷基和C1-6芳烷基。

19.  權利要求18所述的化合物,其中R7為C1-6烷基。

20.  權利要求19所述的化合物,其中R7為甲基。

21.  權利要求18所述的化合物,其中R7為C1-6芳烷基。

22.  權利要求21所述的化合物,其中R7為苯基。

23.  權利要求4所述的化合物,其中L為C=O。

24.  權利要求23所述的化合物,其中R7選自氫、C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、芳基、C1-6芳烷基、雜芳基、C1-6雜芳烷基、R8ZA-C1-8烷基-、R11Z-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-ZAZ-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-Z-C1-8烷基-、R8ZA-C1-8烷基-ZAZ-C1-8烷基-、雜環基MZAZ-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-、(R10)2N-C1-8烷基-、(R10)3N+-C1-8烷基-、雜環基M-、碳環基M-、R11SO2C1-8烷基-和R11SO2NH;或
R6和R7共同為C1-6烷基-Y-C1-6烷基、C1-6烷基-ZA-C1-6烷基、A-C1-6烷基-ZA-C1-6烷基、A-C1-6烷基-A或C1-6烷基-A,由此形成環;
且Z和A的每個存在是獨立的,不為共價鍵。

25.  權利要求24所述的化合物,其中Q不存在。

26.  權利要求25所述的化合物,其中R6和R7為C1-6烷基。

27.  權利要求26所述的化合物,其中R7選自乙基、異丙基、2,2,2-三氟乙基和2-(甲磺酰基)乙基。

28.  權利要求25所述的化合物,其中R7為C1-6芳烷基。

29.  權利要求28所述的化合物,其中R7選自2-苯乙基、苯甲基、(4-甲氧苯基)甲基、(4-氯苯基)甲基和(4-氟苯基)甲基。

30.  權利要求25所述的化合物,其中R6為C1-6烷基,R7為芳基。

31.  權利要求30所述的化合物,其中R7為取代的或未取代的苯基。

32.  權利要求24所述的化合物,其中Q不存在或O,R7為碳環M-。

33.  權利要求32所述的化合物,其中碳環為環丙基或環己基。

34.  權利要求25所述的化合物,其中R7選自R8ZA-C1-8烷基-、R11Z-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-ZAZ-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-Z-C1-8烷基-、R8ZA-C1-8烷基-ZAZ-C1-8烷基-、雜環基MZAZ-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-、A為C=O,Z為O或NH。

35.  權利要求34所述的化合物,其中Z為O。

36.  權利要求35所述的化合物,其中R7為雜環基MZAZ-C1-8烷基-,且雜環基為氧代二氧雜環戊烯基或N(R12)(R13),其中R12和R13共同為C1-6烷基-Y-C1-6烷基,由此形成環。

37.  權利要求36所述的化合物,其中R7選自(R10)2N-C1-8烷基-和(R10)3N+(CH2)n-,R10為C1-6烷基。

38.  權利要求25所述的化合物,其中R7選自雜環基M-,雜環基選自嗎啉代、哌啶子基、哌嗪子基、吡咯烷子基。

39.  權利要求24所述的化合物,其中Q為O或NH。

40.  權利要求39所述的化合物,其中R6為C1-6烷基,R7選自C1-6烷基、C1-6芳烷基和C1-6雜芳烷基。

41.  權利要求40所述的化合物,其中R7選自甲基、乙基、異丙基、苯甲基和(4-吡啶基)甲基。

42.  權利要求24所述的化合物,其中R6和R7共同為C1-6烷基-Y-C1-6烷基、C1-6烷基-ZA-C1-6烷基或C1-6烷基-A,由此形成環。

43.  權利要求42所述的化合物,其中L為C=O,Q和Y不存在,R6和R7共同為C1-3烷基-Y-C1-3烷基。

44.  權利要求42所述的化合物,其中L和Q不存在,R6和R7共同為C1-3烷基-Y-C1-3烷基。

45.  權利要求42所述的化合物,其中L為C=O,Q不存在,Y選自NH和N-C1-6烷基,R6和R7共同為C1-3烷基-Y-C1-3烷基。

46.  權利要求42所述的化合物,其中L為C=O,Y不存在,R6和R7共同為C1-3烷基-Y-C1-3烷基。

47.  權利要求42所述的化合物,其中L和A為C=O,R6和R7共同為C1-2烷基-ZA-C1-2烷基。

48.  權利要求42所述的化合物,其中L和A為C=O,R6和R7共同為C2-3烷基-A。

49.  具有式II結構的化合物或其藥學上可接受的鹽,

其中每個A獨立選自C=O、C=S和SO2;或
當與存在的Z相鄰時,A任選為共價鍵;
L不存在或選自C=O、C=S和SO2;
M不存在或為C1-12烷基;
Q不存在或選自O、NH和N-C1-6烷基;
X選自O、NH和N-C1-6烷基;
Y不存在或選自O、NH和N-C1-6烷基、S、SO、SO2、CHOR10和CHCO2R10;
每個Z獨立選自O、S、NH和N-C1-6烷基;或
當與存在的A相鄰時,Z任選為共價鍵;
R2和R4各自獨立選自C1-6烷基、C1-6羥烷基、C1-6烷氧基烷基、芳基和C1-6芳烷基,其中的任何基團任選地被一個或更多個酰胺、胺、羧酸(或其鹽)、酯、硫醇或硫醚取代基取代;
R5為N(R6)LQR7;
R6選自氫、OH和C1-6烷基;
R7選自氫、C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、芳基、C1-6芳烷基、雜芳基、C1-6雜芳烷基、R8ZAZ-C1-8烷基-、R11Z-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-ZAZ-C1-8烷基-、R8ZAZ-C1-8烷基-ZAZ-C1-8烷基-、雜環基MZAZ-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-、(R10)2N-C1-12烷基-、(R10)3N+-C1-12烷基-、雜環基M-、碳環基M-、R11SO2C1-8烷基-和R11SO2NH;或
R6和R7共同為C1-6烷基-Y-C1-6烷基、C1-6烷基-ZAZ-C1-6烷基、ZAZ-C1-6烷基-ZAZ-C1-6烷基、ZAZ-C1-6烷基-ZAZ或C1-6烷基-A;
R8和R9獨立選自氫、金屬陽離子、C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、芳基、雜芳基、C1-6芳烷基和C1-6雜芳烷基,優選選自氫、金屬陽離子和C1-6烷基,或R8和R9共同為C1-6烷基,由此形成環;
每個R10獨立選自氫和C1-6烷基,優選為C1-6烷基;以及
R11獨立選自氫、C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、碳環基、雜環基、芳基、雜芳基、C1-6芳烷基和C1-6雜芳烷基,條件是當R6為H或CH3,且Q不存在時,LR7不為氫、未取代的C1-6烷基C=O、氨基酸的另一個鏈、叔丁氧羰基(Boc)、苯甲酰基(Bz)、芴-9-基甲氧羰基(Fmoc)、三苯基甲基(三苯甲基)、芐氧羰基(Cbz)、三氯乙氧羰基(Troc);或取代的或未取代的芳基或雜芳基;以及
在任何存在序列ZAZ的情況下,該序列中至少有一個成員必須不是共價鍵。

50.  具有式(III)結構的化合物或其藥學上可接受的鹽,

其中X為O、NH或N-烷基,優選為O;
R1、R2、R3和R4獨立選自氫和式IV的基團,限制條件為R1、R2、R3和R4中至少一個為式IV的基團;

R5、R6、R7和R8獨立選自C1-6烷基、C1-6羥烷基、C1-6烷氧基烷基、芳基和C1-6芳烷基,其中每個基團任選地被選自酰胺、胺、羧酸或其藥學上可接受的鹽、羧酸酯、硫醇或硫醚的基團取代;
R9為氨基酸的另一個鏈、氫、C1-6酰基、保護基、取代的或未取代的芳基、或取代的或未取代的雜芳基,其中取代基包括鹵素、羰基、硝基、羥基、芳基和C1-5烷基;
R10和R11獨立選自氫和C1-6烷基,或R10和R11一起形成3-6元的碳環或雜環;
R12和R13獨立選自氫、金屬陽離子、C1-6烷基和C1-6芳烷基,或R12和R13共同表示C1-6烷基,由此形成環;以及
L不存在或選自-CO2或-C(=S)O。

51.  一種藥物組合物,包括權利要求1或50所述的化合物和藥學上可接受的載體。

52.  一種抑制N-端親核水解酶的方法,包括給予治療有效量的權利要求1所述的化合物。

53.  一種治療炎癥的方法,包括給予治療有效量的權利要求1所述的化合物。

54.  一種抑制或減輕HIV感染的方法,包括給予治療有效量的權利要求1所述的化合物。

55.  一種治療神經變性疾病的方法,包括給予治療有效量的權利要求1所述的化合物。

56.  一種治療肌肉萎縮病的方法,包括給予治療有效量的權利要求1所述的化合物。

57.  一種治療癌癥的方法,包括給予治療有效量的權利要求1所述的化合物。

58.  一種治療慢性傳染病的方法,包括給予治療有效量的權利要求1所述的化合物。

59.  一種治療發熱的方法,包括給予治療有效量的權利要求1所述的化合物。

60.  一種治療免疫相關性病癥的方法,包括給予治療有效量的權利要求1所述的化合物。

61.  一種治療去神經或神經損傷的方法,包括給予治療有效量的權利要求1所述的化合物。

62.  一種影響個體中病毒基因表達水平的方法,包括給予治療有效量的權利要求1所述的化合物。

63.  一種改變生物體中蛋白酶體產生的抗原肽品種的方法,包括給予治療有效量的權利要求1所述的化合物。

說明書

說明書用于抑制蛋白酶體酶的化合物
技術領域
本發明涉及用于抑制酶的化合物和方法。具體地,本發明涉及基于酶抑制的治療方法。
發明背景
在真核生物中,主要通過泛素(ubiquitin)途徑介導蛋白質降解,其中降解的目標蛋白質與76氨基酸的多肽泛素連接。一旦成為目標,泛素化蛋白就成為26S蛋白酶體的底物,26S蛋白酶體是多催化功能蛋白酶(Multicatalytic protease),通過其三種主要的蛋白酶解活性將蛋白質切割成短肽。蛋白酶體介導的降解雖然在胞內蛋白質轉換中具有一般性功能,但在諸如I類主要組織相容性復合體(MHC)的呈遞、調亡、細胞分化以及NF-κB活化等多個過程中也發揮重要作用。
20S蛋白酶體是700kDa的圓筒狀多催化功能蛋白酶復合體,含有構成4個環的28個亞基,在細胞生長調節、I類主要組織相容性復合體的呈遞、調亡、抗原加工、NF-κB活化和促炎信號的轉導中起重要作用。在酵母和其它真核細胞中,7個不同的α亞基構成外環,7個不同的β亞基構成內環。α亞基用作19S(PA700)和11S(28PA)調節復合體的結合位點,以及兩個β亞基環構成的內蛋白酶解腔的物理屏障。因此認為,該蛋白酶體在體內以26S顆粒(“26S蛋白酶體”)形式存在。體內試驗表明,對20S形式的蛋白酶體的抑制容易與對26S蛋白酶體的抑制相關。顆粒形成期間對氨基端β亞基原序列(prosequence)的切割,使得用作催化親核體的氨基端蘇氨酸殘基暴露出來。于是,蛋白酶體中負責催化活性的亞基對氨基端親核殘基進行加工,這些亞基屬于N端親核(Ntn)水解酶家族(其中親核的N端殘基是諸如半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸等親核成分)。該族包括,例如,青霉素G酰基轉移酶(PGA)、青霉素V酰基轉移酶(PVA)、谷氨酰胺PRPP酰氨基轉化酶和細菌糖基天冬酰胺酶。除了遍在表達的β亞基,更高等的脊椎動物還擁有3個γ-干擾素誘導型β亞基(LMP7、LMP2和MECL1),分別替代其正常的對應亞基X、Y和Z,這樣改變了蛋白酶體的催化活性。通過使用不同的肽底物,將真核生物20S蛋白酶體的三種主要的蛋白酶解活性定義為:胰凝乳蛋白酶樣活性(CT-L),在大的疏水殘基之后進行切割;胰蛋白酶樣活性(T-L),在堿性殘基之后進行切割;以及肽基谷氨酰基肽水解活性(PGPH),在酸性殘基之后進行切割。蛋白酶體還有另外兩個較次要的特征活性:BrAAP活性,在支鏈氨基酸之后進行切割;SNAAP活性,在小的中性氨基酸之后進行切割。蛋白酶體的主要蛋白酶解活性似乎由不同的催化位點引起,因為抑制劑、β亞基中的點突變以及γ-干擾素誘導型β亞基的交換使得這些活性發生各種程度的變化。
已有一些實例小分子用于抑制蛋白酶體的活性;但是,這些化合物一般缺乏在細胞和分子水平上探究和開發蛋白酶體功用所必需的專一性、穩定性或潛力。因此,需要合成位點專一性得到提高、穩定性和溶解性得到改善,潛力得到增強的小分子抑制劑,從而能夠在細胞和分子水平上對蛋白酶體的功用進行探究。
發明概述
本發明涉及被稱為肽α’,β’-環氧化物和肽α’,β’-氮雜環丙烷的分子種類的類似物和前藥。母體分子被確信為有效地、不可逆地且選擇性地與N端親核(Ntn)水解酶結合,能專一性抑制具有多催化活性的酶的特定活性。
曾經認為蛋白酶體僅僅處理變性的及錯折疊的蛋白質,現在認識到它構成了通過依賴信號的降解方式,調節多種胞內蛋白質的水平的蛋白酶解機制。因此,人們對于鑒別能專一性干擾蛋白酶體和其它Ntn水解酶活性的試劑,從而將其用作研究這些酶在生物加工中的作用的探針懷有極大的興趣。這里對用于靶向Ntn水解酶的化合物的類似物和前藥進行了描述、合成和研究。公開了能有效地、選擇性地和不可逆地抑制特定的蛋白酶體活性的肽環氧化物和肽氮雜環丙烷,并對其要求保護。
不同于一些其它的基于肽的抑制劑,不能預期這所述的肽環氧化物和肽氮雜環丙烷在濃度高達50μM時充分抑制非蛋白酶體的蛋白酶,如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、組織蛋白酶B、木瓜蛋白酶、需鈣蛋白酶。在較高的濃度下,可以觀察到抑制作用,但如果抑制劑僅僅與底物競爭,預期該抑制作用是競爭性的和可逆的。還預期該新穎的肽環氧化物和肽氮雜環丙烷能抑制NF-κB的活化,穩定細胞培養物中的p53水平。另外,預期這些化合物具有抗炎活性。因此,這些化合物可作為獨特的多功能性分子探針,以探究Ntn酶在正常生物學過程和病理學過程中的功能。
一方面,本發明提供包括含雜原子的三元環的抑制劑類似物和前藥。當所述抑制劑的存在濃度低于約50μM時,這些抑制劑可抑制N端親核水解酶(例如20S蛋白酶體或26S蛋白酶體)的催化活性。對于20S蛋白酶體,特定的水解酶抑制劑在其存在濃度為低于約5μM時,抑制20S蛋白酶體的胰凝乳蛋白酶樣活性,而當其存在濃度為低于約5μM時,不抑制20S蛋白酶體的胰蛋白酶樣活性或PGPH活性。水解酶抑制劑可以為,例如,肽α’,β’-環氧酮或α’,β’-氮雜環丙烷酮,該肽可以是四肽。該四肽可包括分支或不分支的側鏈,如氫、C1-6烷基、C1-6羥烷基、C1-6烷氧基烷基、芳基、C1-6芳烷基、C1-6烷基酰胺、C1-6烷基胺、C1-6羧酸、C1-6羧酸酯、C1-6烷基硫醇或C1-6烷基硫醚,例如異丁基、1-萘基、苯甲基和2-苯乙基。這里定義的α’,β’-環氧酮或α’,β’-氮雜環丙烷酮中的α’-碳可以是手性碳原子,例如(R)或β構型的碳。
另一方面,本發明提供藥物組合物,包括一種藥學上可接受的載體和一種改善神經變性疾病(如阿爾茨海默爾氏病)、肌肉萎縮病(muscle-wasting diseases)、癌癥、慢性傳染病、發熱、肌肉廢用(muscle disuse)、去神經、神經損傷、禁食和免疫相關的病癥的藥學有效量的水解酶抑制劑類似物或前藥以及其它物質。
另一方面,本發明提供抗炎組合物。
另一方面,本發明提供用于以下方面的方法:抑制或減輕個體的HIV感染;影響個體中的病毒基因表達水平;改變生物體中蛋白酶體所產生的抗原肽的品種;確定生物體中的細胞的、發育的或生理的過程或產量是否受特定Ntn水解酶的蛋白酶解活性的調節;對個體的阿爾茨海默爾氏病進行治療;降低細胞中肌肉蛋白的降解速度;降低細胞內胞內蛋白的降解速度;降低細胞內p53蛋白的降解速度;抑制個體中p53相關癌的生長;抑制細胞內的抗原呈遞;對個體的免疫系統進行阻抑;抑制生物體中的IκB-α降解;減少細胞、肌肉、器官或個體體內的NF-κB含量;影響依賴于細胞周期蛋白的真核細胞周期;對個體的增生性疾病進行治療;影響細胞內蛋白酶體依賴性的腫瘤蛋白調節;治療個體的癌癥生長;治療個體中的p53相關性調亡;篩選細胞內N端親核水解酶加工的蛋白質。這些方法中的每一種包括對個體、細胞、組織、器官或生物體施用有效量的包含這里所揭示的水解酶抑制劑的組合物,或使個體、細胞、組織、器官或生物體與有效量的組合物接觸。
本發明的其它特征和優點將在以下的詳細描述和權利要求中得到體現。
發明詳述
本發明涉及用作酶抑制劑的化合物。這些化合物通用于對N端具有親核基團的酶進行抑制。例如,這里所述的酶抑制劑可成功抑制含有側鏈帶親核體的N端氨基酸(如蘇氨酸、絲氨酸或半胱氨酸等)的酶或酶亞基的活性。這里所述的酶抑制劑也能成功抑制在其N端具有非氨基酸親核基團(例如保護基或碳水化合物)的酶或酶亞基的活性。
雖然沒有任何具體的作用原理加以限定,人們認為這種Ntm的N端親核體與這里所述的酶抑制劑的環氧化物官能團形成共價加合物。例如認為在20S蛋白酶體的β5/Pre2亞基中,N端蘇氨酸與肽環氧化物或肽氮雜環丙烷(例如下文所描述的化合物)反應,不可逆地形成嗎啉代加合物或哌嗪子基加合物。這種加合物的形成涉及環氧化物或氮雜環丙烷的開環裂解。
包括與α’碳結合的此種基團的實施方式中,α’-碳(形成環氧化物或氮雜環丙烷環的一部分的碳)的立體化學可以是(R)或(S)。本發明部分基于這里所揭示的結構-功能信息,該信息提示了下列優選的立體化學關系。注意,優選的化合物可含有若干立構中心,立構中心具有上-下(或β-α,其中這里繪制的β在頁面的上方)或(R)-(S)的顯示關系(不需要化合物中的每一個立構中心都符合所述的優選方式)。在一些優選的實施方式中,α’碳的立體化學為(R),即,X原子為β,或位于分子平面的上方。
對于立體化學,遵循用于確定絕對立體化學的Cahn-Ingold-Prelog規則。諸如有機化學(Fox和Whitesell;瓊斯和巴特利特出版社,波士頓,MA(1994);5-6節,177-178頁,這里整體參考該節內容)等對這些規則進行了描述。肽可具有重復主鏈結構,從主鏈單位中伸展出側鏈。一般地,每個主鏈單位具有一條與之締合的側鏈,盡管有時候,該側鏈是一個氫原子。其它實施方式中,并非每個主鏈單位均具有一條締合的側鏈。用于肽環氧化物或肽氮雜環丙烷的肽具有兩個或更多個主鏈單位。一些用于抑制蛋白酶體的胰凝乳蛋白酶樣(CT-L)活性的實施方式中,存在4-8個主鏈單位,一些用于抑制CT-L的優選實施方式中,存在4-6個主鏈單位。
從主鏈單位伸展出來的側鏈可包括天然的脂族或芳族氨基酸側鏈,如氫(甘氨酸)、甲基(丙氨酸)、異丙基(纈氨酸)、仲丁基(異亮氨酸)、異丁基(亮氨酸)、苯甲基(苯丙氨酸)以及構成脯氨酸的側鏈。側鏈也可以是其它分支或不分支的脂族基或芳香基,例如乙基、正丙基、正丁基、叔丁基和芳基取代的衍生物,如1-苯乙基、2-苯乙基、(1-萘基)甲基、(2-萘基)甲基、(1-萘基)乙基、1-(2-萘基)乙基、2-(1-萘基)乙基、2-(2-萘基)乙基及類似的化合物。芳基可進一步被分支或不分支的C1-6烷基或取代烷基、乙酰基等取代,或被其它的芳基或諸如苯甲酰基等取代芳基等取代。雜芳基也可用作側鏈取代基。雜芳基包括含氮、氧和硫的芳基,如噻吩基、苯并噻吩基、萘并噻吩基、噻蒽基、呋喃基、吡喃基、異苯并呋喃基、苯并吡喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、吲哚基、嘌呤基、喹啉基等。
一些實施方式中,可在肽環氧化物或肽氮雜環丙烷中引入極性殘基或帶電殘基。例如可以引入天然存在的氨基酸(如含羥基(Thr、Tyr、Ser)或含硫(Met、Cys)氨基酸)以及諸如牛磺酸、肉堿、瓜氨酸、胱氨酸、鳥氨酸、正亮氨酸及其它氨基酸等非必需氨基酸。還可以包括含有帶電部分或極性部分的非天然存在的側鏈取代基,例如,含有一個或更多個羥基、短鏈烷氧基、硫醚(sulfide)、硫代、羧基、酯、二氧磷基、酰氨基或氨基或被一個或更多個鹵原子取代的這類取代基的C1-6烷基鏈或C6-12芳基。一些優選的實施方式中,肽部分的一條側鏈中具有至少一個芳基。
一些實施方式中,主鏈單位為酰胺單位[-NH-CHR-C(=O)-],其中R為側鏈。這種指定不排除天然存在的脯氨酸或本領域熟練人員認可的其它非天然存在的環狀二級氨基酸。
另外的實施方式中,主鏈單位是N烷基化的酰胺單位(例如,N-甲基等)、烯烴類似物(其中一個或更多個酰胺鍵被烯鍵取代)、四唑類似物(其中四唑環在主鏈上呈順式構型)或這些主鏈鍵的組合。在其它實施方式中,氨基酸α-碳經α-烷基取代修飾,例如,氨基異丁酸。又一些實施方式中,對側鏈進行局部修飾,例如進行ΔE或ΔZ脫氫修飾,其中在側鏈的α原子與β原子之間存在雙鍵,或例如進行ΔE或ΔZ環丙基修飾,其中在側鏈的α原子與β原子之間存在環丙基。另外的采用氨基酸基團的實施方式中,可使用D-氨基酸。進一步的實施方式可包括側鏈向主鏈環化、二硫鍵形成、內酰胺形成、偶氮鍵以及在“肽以及構象限制模擬、設計”(Hruby和Boteju)、“分子生物學和生物技術:綜合性的案頭參考書”(Robert A.Meyers編,VCH出版社(1995),658-664頁,在這里綜合參考)中討論的其它修飾。
某些實施方式中,主題化合物是序列號為09/569748的美國申請所公開的化合物的類似物或前藥,這里對該申請的整體內容進行綜合參考。合適的酶抑制劑類似物或前藥可具有式(I)的結構或其藥學上可接受的鹽,

其中每個A獨立選自C=O、C=S和SO2,優選C=O;或
當與存在的Z相鄰時,A任選為共價鍵;
L不存在或選自C=O、C=S和SO2,優選L不存在或為C=O;
M不存在或為C1-12烷基,優選為C1-8烷基;
Q不存在或選自O、NH和N-C1-6烷基,優選Q不存在或為O或NH,最優選Q不存在或為O;
X選自O、NH和N-C1-6烷基,優選為O;
Y不存在或選自O、NH和N-C1-6烷基、S、SO、SO2、CHOR10和CHCO2R10;每個Z獨立選自O、S、NH和N-C1-6烷基,優選為O;或
當與存在的A相鄰時,Z任選為共價鍵;
R1、R2、R3和R4各自獨立選自C1-6烷基、C1-6羥烷基、C1-6烷氧基烷基、芳基和C1-6芳烷基,其中的任何基團任選地被一個或更多個酰胺、胺、羧酸(或其鹽)、酯(包括C1-5烷基酯和芳基酯)、硫醇或硫醚取代基取代;
R5為N(R6)LQR7;
R6、R12、R13和R14獨立選自氫、OH、C1-6烷基和式IV的基團;優選地,
R6選自氫、OH和C1-6烷基,且R12、R13和R14獨立選自氫和C1-6烷基(優選氫);

R7選自氫、C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、芳基、C1-6芳烷基、雜芳基、C1-6雜芳烷基、R8ZAZ-C1-8烷基-、R11Z-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-ZAZ-C1-8烷基-、R8ZAZ-C1-8烷基-ZAZ-C1-8烷基-、雜環基MZAZ-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-、(R10)2N-C1-12烷基-、(R10)3N+-C1-12烷基-、雜環基M-、碳環基M-、R11SO2C1-8烷基-和R11SO2NH;優選C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、芳基、C1-6芳烷基、雜芳基、C1-6雜芳烷基、R8ZA-C1-8烷基-、R11Z-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-ZAZ-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-、Z-C1-8烷基-、R8ZA-C1-8烷基-ZAZ-C1-8烷基-、雜環基MZAZ-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-、(R10)2N-C1-8烷基-、(R10)3N+-C1-8烷基-、雜環基M-、碳環基M-、R11SO2C1-8烷基-和R11SO2NH,其中Z和A的每個存在是獨立的,不為共價鍵;或R6和R7共同為C1-6烷基-Y-C1-6烷基、C1-6烷基-ZAZ-C1-6烷基、ZAZ-C1-6烷基-ZAZ-C1-6烷基、ZAZ-C1-6烷基-ZAZ或C1-6烷基-A,由此形成環;優選C1-2烷基-Y-C1-2烷基、C1-2烷基-ZA-C1-2烷基、A-C1-2烷基-ZA-C1-2烷基、A-C1-3烷基-A或C1-4烷基-A,其中Z和A的每個存在是獨立的,不為共價鍵;
R8和R9獨立選自氫、金屬陽離子、C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、芳基、雜芳基、C1-6芳烷基和C1-6雜芳烷基,優選選自氫、金屬陽離子、C1-6烷基,或R8和R9共同為C1-6烷基,由此形成環;
每個R10獨立選自氫和C1-6烷基,優選為C1-6烷基;以及
R11獨立選自氫、C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、碳環基、雜環基、芳基、雜芳基、C1-6芳烷基和C1-6雜芳烷基;
R15和R16獨立選自氫、C1-6烷基,或R15和R16共同形成3-6元的碳環或雜環;以及R17和R18獨立選自氫、金屬陽離子、C1-6烷基和C1-6芳烷基,或R17和R18共同表示C1-6烷基,由此形成環;
條件是當R6、R12、R13和R14為H或CH3,且Q不存在時,LR7不是氫、未取代的C1-6烷基C=O、氨基酸的另一條鏈、叔丁氧羰基(Boc)、苯甲酰基(Bz)、芴-9-基甲氧羰基(Fmoc)、三苯基甲基(三苯甲基)、芐氧羰基(Cbz)、三氯乙氧羰基(Troc)或取代的或未取代的芳基或雜芳基;
以及
在任何存在序列ZAZ的情況下,該序列中至少有一個成員必須不是共價鍵。
某些實施方式中,當R6為H,L為C=O,Q不存在時,R7不是氫、C1-6烷基或取代的或未取代的芳基或雜芳基。某些實施方式中,當R6為H,Q不存在時,R7不是在“有機合成中的保護基”(Greene,T.W.和Wuts,P.G.M,JohnWiley&Sons,1999)或“保護基”(Kocienski,P.J.,Georg ThiemeVerlag,1994)中所描述的保護基。
一些實施方式中,R1、R2、R3和R4選自C1-6烷基或C1-6芳烷基。優選實施方式中,R2和R4為C1-6烷基,R1和R3為C1-6烷基。最優選的實施方式中,R2和R4為異丁基,R1為2-苯乙基,R3為苯甲基。
某些實施方式中,L和Q不存在,R7選自C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、C1-6芳烷基和C1-6雜芳烷基。某些此類實施方式中,R6為C1-6烷基,R7選自丁基、烯丙基、炔丙基、苯甲基、2-吡啶基、3-吡啶基和4-吡啶基。
另外的實施方式中,L為SO2,Q不存在,R7選自C1-6烷基和芳基。某些此類實施方式中,R7選自甲基和苯基。
某些實施方式中,L為C=O,R7選自C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、芳基、C1-6芳烷基、雜芳基、C1-6雜芳烷基、R8ZA-C1-8烷基-、R11Z-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-ZAZ-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-Z-C1-8烷基-、R8ZA-C1-8烷基-ZAZ-C1-8烷基-、雜環基MZAZ-C1-8烷基-、(R10)2N-C1-8烷基-、(R10)3N+-C1-8烷基-、雜環基M-、碳環基M-、R11SO2C1-8烷基-和R11SO2NH-,其中Z和A的每個存在是獨立的,不為共價鍵。某些實施方式中,L為C=O,Q不存在,R7為H。
某些實施方式中,R6為C1-6烷基,R7為C1-6烷基,Q不存在,L為C=O。某些此類實施方式中,R7為乙基、異丙基、2,2,2-三氟乙基或2-(甲磺酰基)乙基。
另外的實施方式中,L為C=O,Q不存在,R7為C1-6烷基。某些此類實施方式中,R7選自2-苯乙基、苯甲基、(4-甲氧苯基)甲基、(4-氯苯基)甲基和(4-氟苯基)甲基。
另外的實施方式中,L為C=O,Q不存在,R6為C1-6烷基,R7為芳基。某些此類實施方式中,R7為取代的或未取代的苯基。
某些實施方式中,L為C=O,Q不存在或為O,n為0或1,R7為-(CH2)n碳環基。某些此類實施方式中,R7為環丙基或環己基。
某些實施方式中,L和A為C=O,Q不存在,Z為O,n為1-8的整數(優選為1),R7選自R8ZA-C1-8烷基-、R11Z-C1-8烷基-、R8ZA-C1-8烷基-ZAZ-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-ZAZ-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-Z-C1-8烷基-和雜環基MZAZ-C1-8烷基-,其中A的每個存在是獨立的,不為共價鍵。某些此類實施方式中,R7為雜環基MZAZ-C1-8烷基-,其中雜環基為取代的或未取代的氧代二氧雜環戊烯基或N(R12)(R13),其中R12和R13共同為C1-6烷基-Y-C1-6烷基(優選為C1-3烷基-Y-C1-3烷基),由此形成環。
某些優選的實施方式中,L為C=O,Q不存在,n為1-8的整數,R7選自(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-、(R10)2NC1-8烷基、(R10)3N+(CH2)n-和雜環基-M-。某些此類實施方式中,R7為-C1-8烷基N(R10)2或-C1-8烷基N+(R10)3,其中R10為C1-6烷基。某些其它的此類實施方式中,R7為雜環基M-,其中雜環基選自嗎啉代、哌啶子基、哌嗪子基、吡咯烷子基。
某些實施方式中,L為C=O,R6為C1-6烷基,Q選自O和NH,R7選自C1-6烷基、雜環基-M、C1-6芳烷基和C1-6雜芳烷基。其它的實施方式中,L為C=O,R6為C1-6烷基,Q選自O和NH,R7為C1-6烷基,其中C1-6烷基選自甲基、乙基和異丙基。另外的實施方式中,L為C=O,R6為C1-6烷基,Q選自O和NH,R7為C1-6芳烷基,其中芳烷基為苯甲基。在其它實施方式中,L為C=O,R6為C1-6烷基,Q選自O和NH,R7為C1-6雜芳烷基,其中雜芳烷基為(4-吡啶基)甲基。
某些實施方式中,L不存在或為C=O,R6和R7共同為C1-6烷基-Y-C1-6烷基、C1-6烷基-ZA-C1-6烷基或C1-6烷基-A,其中Z和A的每個存是獨立的,不為共價鍵,由此形成環。某些優選實施方式中,L為C=O,Q和Y不存在,R6和R7共同為C1-3烷基-Y-C1-3烷基。另一個優選實施方式中,L和Q不存在,R6和R7共同為C1-3烷基-Y-C1-3烷基。另一個優選實施方式中,L為C=O,Q不存在,Y選自NH和C1-6烷基,R6和R7共同為C1-3烷基-Y-C1-3烷基。另一個優選實施方式中,L為C=O,Y不存在,R6和R7共同為C1-3烷基-Y-C1-3烷基。另一個優選實施方式中,L和A為C=O,R6和R7共同為C1-2烷基-ZA-C1-2烷基。另一個優選實施方式中,L和A為C=O,R6和R7共同為C2-3烷基-A。
某些實施方式中,式I的化合物具有以下立體化學:

優選實施方式中,抑制劑具有式II的結構或其藥學上可接受的鹽,

其中每個A獨立選自C=O、C=S和SO2;優選C=O或
當與存在的Z相鄰時,A任選為共價鍵;
L不存在或選自C=O、C=S和SO2,優選L不存在或為C=O;
M不存在或為C1-2烷基,優選為C1-8烷基;
Q不存在或選自O、NH和N-C1-6烷基,優選Q不存在或為O或NH,最優選Q不存在或為O;
X選自O、NH和N-C1-6烷基,優選為O;
Y不存在或選自O、NH和N-C1-6烷基、S、SO、SO2、CHOR10和CHCO2R10;每個Z獨立選自O、S、NH和N-C1-6烷基,優選為O;或
當與存在的A相鄰時,Z任選為共價鍵;
R7和R4各自獨立選自C1-6烷基、C1-6羥烷基、C1-6烷氧基烷基、芳基和C1-6芳烷基,其中的任何基團任選地被一個或更多個酰胺、胺、羧酸(或其鹽)、酯(包括C1-5烷基酯和芳基酯)、硫醇或硫醚取代基取代;
R5為N(R6)LQR7;
R6選自氫、OH和C1-6烷基,優選為C1-6烷基;
R7選自氫、C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、芳基、C1-6芳烷基、雜芳基、C1-6雜芳烷基、R8ZAZ-C1-8烷基-、R11Z-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-ZAZ-C1-8烷基-、R8ZAZ-C1-8烷基-ZAZ-C1-8烷基-、雜環基MZAZ-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-、(R10)2N-C1-12烷基-、(R10)3N+-C1-12烷基-、雜環基M-、碳環基M-、R11SO2C1-8烷基-和R11SO2NH,優選選自C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、芳基、C1-6芳烷基、雜芳基、C1-6雜芳烷基、R8ZA-C1-8烷基-、R11Z-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-ZAZ-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-Z-C1-8烷基-、R8ZA-C1-8烷基-ZAZ-C1-8烷基-、雜環基MZAZ-C1-8烷基-、(R8O)(R9O)P(=O)O-C1-8烷基-、(R10)2N-C1-8烷基-、(R10)3N+-C1-8烷基-、雜環基M-、碳環基M-、R11SO2C1-8烷基-和R11SO2NH,其中Z和A的每個存在是獨立的,不為共價鍵;或
R6和R7共同為C1-6烷基-Y-C1-6烷基、C1-6烷基-ZAZ-C1-6烷基、ZAZ-C1-6烷基-ZAZ-C1-6烷基、ZAZ-C1-6烷基-ZAZ或C1-6烷基-A,由此形成環;優選為C1-2烷基-Y-C1-2烷基、C1-2烷基-ZA-C1-2烷基、A-C1-2烷基-ZA-C1-2烷基、A-C1-3烷基-A或C1-4烷基-A,其中Z和A的每個存在是獨立的,不為共價鍵;
R8和R9獨立選自氫、金屬陽離子、C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、芳基、雜芳基、C1-6芳烷基和C1-6雜芳烷基,優選選自氫、金屬陽離子、C1-6烷基,或R8和R9共同為C1-6烷基,由此形成環;
每個R10獨立選自氫和C1-6烷基,優選為C1-6烷基;以及R11獨立選自氫、C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、碳環基、雜環基、芳基、雜芳基、C1-6芳烷基和C1-6雜芳烷基,條件是當R6為H或CH3,且Q不存在時,LR7不是氫、未取代的C1-6烷基C=O、氨基酸的另一條鏈、叔丁氧羰基(Boc)、苯甲酰基(Bz)、芴-9-基甲氧羰基(Fmoc)、三苯基甲基(三苯甲基)、芐氧羰基(Cbz)、三氯乙氧羰基(Troc)或取代的或未取代的芳基或雜芳基;以及
在任何存在序列ZAZ的情況下,該序列中至少有一個成員必須不是共價鍵。
某些實施方式中,L為C=O,Q不存在,X為O,R6為H,R2和R4選自C1-6烷基和C1-6芳烷基。優選的此類實施方式中,R2和R4為C1-6烷基。最優選的此類實施方式中,R2和R4為異丁基。
某些實施方式中,L為C=O,Q不存在,X為O,R6為H,R2和R4為異丁基,R7為雜環基M-,其中雜環基為含氮的雜基,如哌嗪子基(包括N-(低級烷基)哌嗪子基)、嗎啉代和哌啶子基。優選的此類實施方式中,M為CH2。
某些實施方式中,式II的化合物選自









某些實施方式中,主題化合物是序列號為09/569748的美國申請(這里對其整體內容進行綜合參考)所公開的化合物的含磷酸鹽的前藥。用于抑制Ntn的胰凝乳蛋白酶樣(CT-L)活性的酶抑制劑前藥具有式(HI)的結構或其藥學上可接受的鹽

其中X選自O、NH和N-烷基,優選為O;
R1、R2、R3和R4獨立選自氫和式IV的基團,限制條件是R1、R2、R3和R4中至少一個是式IV的基團;

R5、R6、R7和R9獨立選自C1-6烷基、C1-6羥烷基、C1-6烷氧基烷基、芳基和C1-6芳烷基,其中的任何基團任選地被選自酰胺、胺、羧酸或其藥學上可接受的鹽、羧酸酯、硫醇或硫醚的中一個基團取代;
R9是氨基酸的另一條鏈、氫、C1-6酰基、保護基、芳基或雜芳基,其中取代基可包括鹵素、羰基、硝基、羥基、芳基和C1-5烷基;R10和R11獨立選自氫和C1-6烷基,或R10和R11共同形成3-6元的碳環或雜環;
R12和R13獨立選自氫、金屬陽離子、C1-6烷基和C1-6芳烷基,或R12和R13共同表示C1-6烷基,由此形成環;以及
L不存在或選自-CO2或-C(=S)O。
肽合成領域已知的合適的N端保護基包括叔丁氧羰基(Boc)、苯甲酰基(Bz)、芴-9-基甲氧羰基(Fmoc)、三苯基甲基(三苯甲基)和三氯乙氧羰基(Troc)等。肽合成領域熟知的芐氧羰基或叔丁氧羰基(Boc)等各種N保護基;二環己基碳二亞胺(DCC)、1,3-二異丙基碳二亞胺(DIC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、N-羥基氮雜苯并三唑(HATU),羰基二咪唑或1-羥基苯并三唑一水物(HOBT)等各種耦合試劑的使用,以及各種切割條件:例如,三氟乙酸(TFA)、含HCl的二_烷,在有機溶劑(如甲醇或乙酸乙酯)中,Pd-C催化下進行氫化,三(三氟乙酸)硼和溴化氰,以及在溶液中反應,離析和純化中問體,同樣適用于主題化合物的制備。
一些實施方式中,R1、R2、R3和R4中的任何兩個為氫,R1、R2、R3和R4中的任何兩個具有式IV的結構。優選實施方式中,R1、R2、R3和R4中的任何三個為氫,R1、R2、R3和R4中的任何一個具有式IV的結構。最優選的實施方式中,R1具有式IV的結構,R2、R3和R4為氫。
某些實施方式中,R5、R6、R7和R8為C1-6烷基或C1-6芳烷基。優選的實施方式中,R6和R8為C1-6烷基,R5和R7為C1-6芳烷基。最優選的實施方式中,R6和R8為異丁基,R5為2-苯乙基,R7為苯甲基。某些實施方式中,R9選自氫、C1-6酰基或保護基。優選的實施方式中,R9為氫或乙酰基。最優選的實施方式中,R9為乙酰基。
某些實施方式中,R10和R11選自氫和C1-6烷基。一個優選的實施方式中,R10為氫,R11為C1-6烷基。另一優選的實施方式中,R10為氫,R11為甲基。又一優選的實施方式中,R10和R11為氫。某些實施方式中,R12和R13為C1-6烷基、金屬陽離子或C1-6芳烷基。某些優選的實施方式中,R12和R13選自芐基、叔丁基和鈉陽離子。更優選的實施方式中,R12和R13均為芐基或叔丁基。最優選的實施方式中,R12和R13中至少一個是鈉陽離子。
某些實施方式,式III的化合物具有以下立體化學:

優選的實施方式中,抑制劑具有式V的結構或其藥學上可接受的鹽,

其中,X選自O、NH或N-烷基,優選為O;
R1、R2、R3和R4獨立選自氫和式IV的基團,限制條件是R1、R2、R3和R4中至少一個是式IV的基團;
R6和R8獨立選自C1-6烷基、C1-6羥烷基、C1-6烷氧基烷基、芳基和C1-6芳烷基,其中的任何基團任選地被選自酰胺、胺、羧酸或其藥學上可接受的鹽、羧酸酯、硫醇和硫醚的一個基團取代;
R9是氨基酸的另一條鏈、氫、酰基、保護基、芳基或雜芳基,其中取代基可包括鹵素、羰基、硝基、羥基、芳基和C1-5烷基。肽合成領域已知的合適的N端保護基包括叔丁氧羰基(Boc)、苯甲酰基(Bz)、芴-9-基甲氧羰基(Fmoc)、三苯基甲基(三苯甲基)和三氯乙氧羰基(Troc)等;以及
一些實施方式中,R1、R2、R3和R4中的任何兩個為氫,R1、R2、R3和R4中的任何兩個具有式IV的結構。優選的實施方式中,R1、R2、R3和R4中的任何三個為氫,R1、R2、R3和R4中的任何一個具有式IV的結構。最優選的實施方式中,R1具有式IV的結構,R2、R3和R4為氫。
某些實施方式中,R6和R8為C1-6烷基或C1-6芳烷基。優選的實施方式中,R6和R8為C1-6烷基。最優選的實施方式中,R6和R8為異丁基。某些實施方式中,R9選自氫、C1-6酰基或保護基。優選的實施方式中,R9為氫或乙酰基。最優選的實施方式中,R9為乙酰基。
某些實施方式中,R10和R11選自氫和C1-6烷基。一個優選的實施方式中,R10為氫,R11為C1-6烷基。另一優選的實施方式中,R10為氫,R11為甲基。又一優選的實施方式中,R10和R11為氫。某些實施方式中,R12和R13為C1-6烷基、金屬陽離子或C1-6芳烷基。某些優選的實施方式中,R12和R13選自芐基、叔丁基和鈉陽離子。更優選的實施方式中,R12和R13均為芐基和叔丁基。最優選的實施方式中,R12和R13中至少一個是鈉陽離子。
某些實施方式中,R6和R8為C1-6烷基。優選的實施方式中,R6和R8為異丁基。優選的實施方式中,R9為氫或乙酰基。最優選的實施方式中,R9為乙酰基。一個優選的實施方式中,R10為氫,R11為甲基。又一優選的實施方式中,R10和R11均為氫。某些實施方式中,R12和R13為C1-6烷基、金屬陽離子或C1-6芳烷基。某些優選的實施方式中,R12和R13選自芐基、叔丁基和鈉陽離子。更優選的實施方式中,R12和R13均為芐基和叔丁基。最優選的實施方式中,R12和R13中至少一個是鈉陽離子。
某些實施方式中,特別排除US6,831,099中公開的化合物,這里綜合參考該專利公開的整體內容。
本發明的一個方面涉及一種包含這里所公開的組合物的醫療器械,該組合物包括具有式I、II、III或V中任何一種的結構的抑制劑。一種實施方式中,在醫療器械內部結合有該組合物。某些實施方式中,該醫療器械為含有聚合物基質或陶瓷基質以及抑制劑的凝膠。所述聚合物可以是天然存在的或是合成的。另一種實施方式中,所述凝膠用作藥物貯庫、粘合劑、縫線、屏障或密封劑。
本發明的另一個方面涉及一種包含基質的醫療器械,在該基質的一個表面上置有式I、II、III或V中任何一種的結構的抑制劑。一種實施方式中,該抑制劑直接置于醫療器械上。另一種實施方式中,醫療器械上被覆涂層,該涂層中含有聚合物基質或陶瓷基質,其中分散或溶解了這里所公開的式I、II、III或V中任何一種的結構的抑制劑。
一種實施方式中,該醫療器械是冠狀(管腔)支架、血管支架、外周(管腔)支架的或膽管支架。更具體地,本發明支架是一種可擴張支架。用包含具有式I、II、III或V中任一種結構的抑制劑的基質進行涂覆時,該基質是柔韌的,以順應這種可擴張支架的壓縮及擴張狀態。本發明的另一個實施方式種,該支架至少有一部分可插入或植入病人的體內,其中該部分有一表面適合與體組織接觸,其中該表面至少有一部分涂覆了具有式I、II、III或V中任一種結構的抑制劑,或含有基質的涂層,其中溶解或分散了具有式I、II、III或V中任一種結構的抑制劑。美國專利4,733,665公開了一種合適支架的例子,該專利在這里作為整體加以參考。
另一種實施方式中,本發明醫療器械是一種外科器械,如血管植入物、管腔內器械、外科封閉劑或血管支持器(vascular support)。更具體地,本發明醫療器械是導管、植入式血管輸液港(implantable vasularaccess port)、中心靜脈導管、動脈導管、人工血管、主動脈內氣囊泵、縫線、心室輔助泵、藥物洗脫屏障(drug-eluting barrier)、粘結劑、血管包覆物、血管外/血管周圍支持器(extra/perivascular support)、血液過濾器或適于在血管內使用的過濾器,這些器械直接用具有式I、II、III或V中任一種結構的抑制劑涂覆,或用包含具有式I、II、III或V中任一種結構的抑制劑的基質涂覆。
某些實施方式中,管腔內醫療器械經具有式I、II、III或V中任一種結構的抑制劑涂覆或經含有生物耐受基質和分散于聚合物中的具有式I、II、III或V中任一種結構的抑制劑的涂層涂覆,所述器械具有一個內表面和一個外表面,在內表面或外表面或兩者中,至少有一部分被涂覆。
某些實施方式中,醫療器械可用于防止血管成形術后再狹窄。該醫藥器械也可通過局部給予具有式I、II、III或V中任一個結構的抑制劑,用于治療各種疾病和病癥。這樣的疾病和病癥包括再狹窄、炎癥、類風濕性關節炎、炎癥引起的組織損傷、過度增生性疾病、重度銀屑病或關節病性銀屑病、肌肉萎縮病、慢性傳染病、免疫反應異常、涉及易損斑決的病癥、缺血性病癥相關的損傷以及病毒感染和增殖。用包括本發明藥物包被的醫藥器件治療的疾病和病癥的例子包括動脈粥樣硬化、急性冠脈綜合癥、阿爾茨海默爾氏癥、癌癥、發熱、肌肉廢用(萎縮)、去神經、血管阻塞、中風、HIV感染、神經損傷、伴隨酸中毒的腎衰竭以及肝衰竭(例如見Goldberg,美國專利5,340,736。)
術語“Cx-y烷基”指取代的或未取代的飽和烴基,包括鏈中含有x-y個碳的直鏈烷基和支鏈烷基;包括三氟甲基和2,2,2-三氟乙基等鹵代烷基;若C0烷基位于末端位置時表示氫,若該基團位于鏈內部時,表示一個鍵。術語“C2-y烯基”和“C2-y炔基”指取代的或未取代的不飽和脂族基,在長度及可能發生的取代方面,與上述烷基類似,但分別含有至少一個雙鍵或三鍵。
術語“烷氧基”指具有一個與之結合的氧的烷基。代表性的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。“醚”是通過一個氧共價連接的兩個烴基。因此,使烷基成醚的該烷基的取代基為烷氧基或類似于烷氧基。
術語“C1-6烷氧基烷基”指被烷氧基取代的C1-6烷基,由此形成醚。
這里使用的術語“C1-6芳烷基”指被芳基取代的C1-6烷基。
術語“胺”和“氨基”被本領域認可,指未取代的和取代的胺及其鹽,例如能用以下通式表示的部分:

其中R9、R10和R10’各自獨立表示氫、烷基、烯基、-(CH2)m-R8或R9和R10同與之結合的氮原子一起形成環結構中具有4-8個原子的雜環;R8表示芳基、環烷基、環烯基、雜環基或多環基;m為0或1-8的整數。優選的實施方式中,R9或R10中只有一個為羰基,例如,R9、R10和氮不能共同形成酰亞胺。更優選的實施方式中,R9和R10(任選R10’)各自獨立表示氫、烷基、烯基或-(CH2)m-R8。某些實施方式中,氨基為堿性,意味著它的pKa≥7.00。這些官能團的質子化形式的pKa為7.00以上。
術語“酰胺”和“酰氨基”被本領域認可為氨基取代的羰基,包括能用通式表示的部分:

其中R9和R10同前述定義。酰胺的優選方式將不包括可能不穩定的酰亞胺。
這里使用的術語“芳基”包括取代的或未取代的5元、6元和7元單環芳族基,其中環中的每個原子均為碳。術語“芳基”也包括具有兩個或更多個環的多環體系,其中,兩個鄰接環(其中至少一個環為芳香環)共用兩個或更多個碳,其它的環可以是例如環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基和/或雜環基。芳基包括苯、萘、菲、苯酚、苯胺。
這里使用的術語“碳環”和“碳環基”指取代或未取代的非芳香環,其中環中的每個原子均為碳。術語“碳環”和“碳環基”也包括具有兩個或更多個環的多環體系,其中,兩個鄰接環(其中至少一個環為碳環)共用兩個或更多個碳,其它的環可以是例如環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基和/或雜環基。
術語“羰基”被本領域認可,包括能用以下通式表示的部分:

其中X是一個鍵或表示氧或硫,R11表示氫、烷基、烯基、-(CH2)m-R8或藥學上可接受的鹽,R11’表示氫、烷基、烯基或-(CH2)m-R8,其中m和R8同前述定義。當X是氧,且R11或R11’不是氫時,該結構式表示“酯”。當X為氧且R11為氫時,該結構式表示“羧酸”。
這里使用的“酶”可以是以催化方式完成化學反應的任何不完整蛋白質分子或完整蛋白質分子。這樣的酶可以是天然酶、融合酶、酶原、脫輔酶、變性酶、法尼基化酶、泛素化酶、脂酰化酶、牻牛兒牻牛兒基化酶(gerangeranylated enzyme)、GPI連接酶、脂連接酶、異戊二烯基化酶、天然存在的或人工制備的突變酶、帶有側鏈或主鏈修飾的酶、具有前導序列的酶、與非蛋白物質復合的酶(如蛋白聚糖、蛋白脂質體)。可用任何方法制備酶,包括自然表達、促進表達、克隆、各種基于溶液和基于固體的肽合成,以及本領域人員已知的類似方法。
這里使用的術語“C1-6雜芳烷基”指被雜芳基取代的C1-6烷基。
術語“雜芳基”包括取代的或未取代的5-7元芳香環結構,更優選5-6元環,其環結構包括1-4個雜原子。術語“雜芳基”還包括具有兩個或更多個環的多環體系,其中,兩個鄰接環(其中至少一個環為雜芳環)共用兩個或更多個碳,其它的環可以是例如環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基和/或雜環基。雜芳基包括,例如,吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、_唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、噠嗪和嘧啶等。
這里使用的術語“雜原子”指碳或氫以外的任何元素的原子。優選的雜原子為氮、氧、磷和硫。
術語“雜環基“指取代的或未取代的3-10元非芳香環結構,更優選3-7元環,其環結構包括1-4個雜原子。術語“雜環基”還包括具有兩個或更多個環的多環體系,其中,兩個鄰接環(其中至少一個環為雜環)共用兩個或更多個碳,其它的環可以是例如環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基和/或雜環基。雜環基包括,例如,哌啶、哌嗪、吡咯烷、嗎啉、內酯、內酰胺等。
術語“C1-6羥烷基“指被羥基取代的C1-6烷基。
這里使用的術語“抑制劑“指阻滯或降低酶活性的化合物(例如,抑制對諸如suc-LLVY-AMC、Box-LLR-AMC和Z-LLE-AMC等標準的熒光肽底物的蛋白酶切,抑制20S蛋白酶體的各種催化活性)。抑制劑可進行競爭性抑制、反競爭性抑制或非競爭性抑制。抑制劑可進行可逆或不可逆結合,因此該術語包括作為酶的自殺底物的化合物。抑制劑可以對酶的活性部位上的或其附近的一個或更多個部位進行修飾,或者它在酶的別處引起構象變化。
這里使用的術語“肽“不僅包括具有標準α-取代基的標準酰胺連接,通常還使用下文所詳述的肽模擬物、其它的修飾連接、非天然存在的側鏈和側鏈修飾。
術語“多環基“或”多環的“指兩個或更多個環(例如,環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基和/或雜環基),其中兩個鄰接環共用兩個或更多個碳,例如,這些環是”稠環“。多環中的每個環可以是取代的或未取代的。
術語“預防”被本領域認可,在用于局部再發(如疼痛)等病癥、癌癥等疾病、心力衰竭等綜合癥或任何其它的醫學病癥時,為本領域所熟知,包括對個體施用組合物,使得相比于未接受組合物的個體,降低了其出現醫學病癥的癥狀頻率或延遲病癥發作。因此,癌癥的預防包括,例如,受到預防治療的病人群體中,例如在統計水平和/或臨床顯著水平上,相對于未進行治療的對照群體,減少了可檢測到癌生長的人數和/或相對于未進行治療的對照群體,延遲出現可檢測的癌生長。傳染病的預防包括,例如,受到預防治療的群體中,相對于未進行治療的對照群體,減少了傳染的診斷數,和/或相對于未進行治療的對照群體,延遲了傳染癥狀的發作。疼痛的預防包括,例如,受到預防治療的群體中,相對于未進行治療的對照群體,個體的痛覺減輕或延遲出現。
術語“前藥”包括在生理條件下轉化成治療活性劑的化合物。制備前藥的常用方法包括選擇在生理條件下發生水解的組分,以顯露所需要的分子。其它實施方式中,通過宿主動物的酶活性轉化前藥。
術語“預防性或治療性治療”被本領域認可,包括給予宿主一種或更多種測試組合物。如果在臨床表現出有害病癥(例如疾病或宿主動物的其它有害狀況)之前給予,那么該治療是預防性的(即,它防止宿主的有害狀況得到發展),而如果在臨床表現出有害病癥之后給予,那么該治療是治療性的(即,它旨在使所出現的有害狀況或其副作用得到減輕、改善或穩定)。
這里使用的術語“蛋白酶體”包括免疫蛋白酶體和結構蛋白酶體。
術語“取代的”指具有取代主鏈中一個或更多個碳上的氫的取代基的部分。應理解,取代“或”被......取代“包括的隱含限制條件是這種取代應以被取代的原子以及取代基所允許的化合價為根據,且該取代生成穩定的化合物(如不會自發經歷重排轉換、環化轉換、消除轉換等)。這里使用的術語”取代的“期望包括所有允許的有機化合物取代基。廣義上,允許的取代基包括無環的和環狀的,分支的和不分支的,碳環的和雜環的、芳香的和非芳香的有機化合物取代基。允許的取代基可以是一個或多個,與所需要的有機化合物相同或不同。對于本發明,氮等雜原子可具有氫取代基和/或這里所述的符合雜原子化合價的任何允許的有機化合物取代基。取代基可包括,例如,鹵素、羥基、羰基(例如羧基、烷氧羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸根合或硫代甲酸根)、烷氧基、磷酰基、磷酸根、膦酸根、亞膦酸根、氨基、酰胺基、脒、亞胺、氰基、硝基、疊氮基、巰基、烷硫基、硫酸根、磺酸根、氨磺酰、磺胺基、磺酰基、雜環基、芳烷基或芳香的或芳香雜基部分。本領域熟練人員應理解,如果需要,烴鏈上的取代基本身可被取代。
對于被試治療方法,化合物的“治療有效量”指制劑中的化合物用量,其在作為要求的給藥方案的一部分,對哺乳類(優選人)進行施用時,根據用于進行治療的失調或病癥或化妝品用途的臨床上可接受標準,以例如可適用于任何醫學治療的合理的利益/風險比,實現減輕癥狀、改善病癥或延緩疾病發作。
術語“硫醚“指具有與之相連的硫部分的如上所定義的烷基。優選的實施方式中,硫醚”用-S-烷基表示。代表性的硫醚基團包括甲硫基、乙硫基等。
這里使用的術語“治療“包括以改善或穩定個體病癥的方式,逆轉、減輕或阻止病癥的癥狀、臨床表現以及基本病理(underlying pathology)。
對20S蛋白酶體的選擇性
這里所公開的酶抑制劑類似物和前藥之所以有用,部分因為它們抑制20S蛋白酶體的作用。另外,與其它的20S蛋白酶體抑制劑不同,相對于其它的蛋白酶,這里所公開的化合物對20S蛋白酶體具有高度的選擇性。也就是說,相對于組織蛋白酶、需鈣蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、三肽基pepsidase II等其它蛋白酶,本化合物對20S蛋白酶體顯示選擇性。酶抑制劑對20S蛋白酶體的選擇性為:濃度低于約50μM的酶抑制劑對20S蛋白酶體的催化活性表現抑制用作,而對組織蛋白酶、需鈣蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、三肽基pepsidase II等其它蛋白酶的催化活性不顯示抑制作用。優選的實施方式中,濃度低于約10μM的酶抑制劑對20S蛋白酶體的催化活性顯示抑制作用,但該濃度下,對其它蛋白酶的催化活性不顯示抑制。更優選的實施方式中,濃度低于約1μM的酶抑制劑對20S蛋白酶體的催化活性顯示抑制,但該濃度下,對其它蛋白酶的催化活性不顯示抑制。序列號為09/569748的美國申請(實施例2)以及Stein等人(Biochem.(1996),35,3899-3908)公開了酶的動力學分析。
對胰凝乳蛋白酶樣活性的選擇性
這里所描述的酶抑制劑類似物和前藥化合物的具體實施方式之所以有用,還因為它們能有效而選擇性地抑制20S蛋白酶體的胰凝乳蛋白酶樣活性(與胰蛋白酶樣活性和PGPH活性相比)。20S蛋白酶體的胰凝乳蛋白酶樣活性表征為在緊鄰大的疏水性殘基的部位,對肽進行切割。具體地,Ntn水解酶的胰凝乳蛋白酶樣活性可通過對標準底物的切割來確定。這種底物的例子為本領域所知。例如,可使用亮氨酰亮氨酰纈氨酰酪氨酸衍生物。序列號為09/569748的美國申請(實施例2)以及Stein等人(Biochem.(1996),35,3899-3908)公開了酶的動力學分析。
酶抑制劑的用途
蛋白酶體抑制生物學結果有多種。在細胞水平上,用各種蛋白酶體抑制劑處理細胞,已報道出現多泛素化蛋白的積聚、細胞的形態學變化及調亡。蛋白酶體抑制還被建議作為可能的抗腫瘤治療策略。Epoxomicin最初在篩選抗腫瘤化合物時被鑒定的事實證實了蛋白酶體可用作抗腫瘤化療的靶標。因此,這些化合物可用于治療癌癥。蛋白酶體的抑制也伴隨著抑制NF-κB的活化以及穩定p53的水平。因此,本發明化合物也可用于抑制NF-κB的活化,穩定細胞培養物中的p53水平。由于NF-κB是炎癥的主要調節劑,它是用于抗炎治療干預的有吸引力的靶標。因此,本發明化合物可用于治療伴隨慢性發炎的病癥,包括但不限于COPD、銀屑病、支氣管炎、肺氣腫和囊腫性纖維化。
本公開化合物可用于治療由蛋白酶體的蛋白酶解功能直接介導的病癥,如肌肉萎縮,或由NF-κB等蛋白酶體加工的蛋白質間接介導的病癥。蛋白酶體參與涉及細胞調節(如細胞周期、基因轉錄和代謝途徑)、細胞間通訊和免疫反應(如抗原呈遞)的蛋白質(如酶)的快速消去和翻譯后加工。以下討論的具體例子包括β-淀粉樣蛋白和細胞周期蛋白及轉錄因子NF-κB等調節蛋白。
本發明的另一個實施方式是這里所公開的化合物在治療神經變性疾病及病癥中的用途,該類疾病和病癥包括但不限于中風、神經系統的缺血性損傷、神經外傷(如沖擊性腦損傷(percussive brain damage)、脊髓損傷以及神經系統外傷)、多發性硬化癥和其它免疫介導的神經病(如格林-巴利綜合癥及其變型、急性運動軸索神經病、急性發炎性脫髓鞘性多發性神經病和費希爾綜合癥)、HIV/AIDs癡呆綜合癥、axonomy、糖尿病性神經病、帕金森氏癥、亨廷頓氏癥、多發性硬化癥、細菌性腦膜炎、寄生蟲性腦膜炎、真菌性腦膜炎和病毒性腦膜炎、腦炎、血管性癡呆、多梗死性癡呆、路易體癡呆(Lewy body dementia)、皮克氏癥等額葉型癡呆、皮質下型癡呆(如亨廷頓病或進行性核上性麻痹)、局灶性皮質萎縮綜合癥(如原發性失語癥)、代謝性/中毒性癡呆(如慢性甲狀腺功能低下或B12缺乏),以及感染引起的癡呆(如梅毒或慢性腦膜炎)。
阿爾茨海默爾氏癥表征為在老年斑和腦血管中沉積β-淀粉樣蛋白(β-AP)。β-AP是衍生自淀粉樣蛋白前體(APP)的39-42位氨基酸的肽片段。至少三種APP異型(695、751和770氨基酸)是已知的。mRNA的另路剪接產生異型;正常加工對一部分β-AP序列產生影響,從而防止β-AP的生成。人們認為,蛋白酶體對蛋白質進行的異常加工導致阿爾茨海默爾氏腦中含有豐富的β-AP。大鼠中的APP加工酶含有約十種不同的亞基(22kDa-32kDa)。25kDa亞基具有N端序列X-Gln-Asn-Pro-Met-X-Thr-Gly-Thr-Ser,它與人巨蛋白體(macropain)的β-亞基相同(Kojima,S.等,Fed.Eur.Biochem.Soc.,(1992)304:57-60)。APP加工酶對Gln15-Lys16鍵進行切割;在鈣離子的存在下,該酶還對Met1-Asp1鍵和Asp1-Ala2鍵進行切割以釋放β-AP的胞外域。
因此,一種實施方式是一種治療阿爾茨海默爾氏癥的方法,包括給予個體有效量的這里所公開的化合物(如,藥物組合物)。這種治療包括降低β-AP的加工速度,降低β-AP斑決的生成速度,降低β-AP的生成速度,以及減輕阿爾茨海默爾氏癥的臨床征兆。
本發明的其它實施方式涉及惡病質和肌肉萎縮病。蛋白酶體對成熟期網織紅細胞和生長期成纖維細胞中的大量蛋白質進行降解。在喪失的胰島素和血清細胞中,蛋白酶解的速度幾乎加倍。對蛋白酶體的抑制降低了蛋白酶解,從而減少了肌肉蛋白的損失和腎或肝中的含氮負荷。本發明抑制劑用于治療諸如癌癥、慢性傳染病、發熱、肌肉廢用(萎縮)和去神經、神經損傷、禁食、伴隨酸中毒的腎衰竭、糖尿病和肝衰竭等病癥。例如參見,Goldberg,美國專利5,340,736。因此本發明的實施方式包括下述用途的方法:降低細胞中肌蛋白的降解速度;降低胞內蛋白質的降解速度;降低細胞內p53蛋白的降解速度;抑制p53相關的癌生長。這些方法中的每一種都包括使細胞(體內或體外,如個體的肌肉)與有效量的這里所公開的化合物(如藥物組合物)接觸。
蛋白酶體加工的另一種蛋白質為NF-κB(Rel蛋白家族的一員)。轉錄激活蛋白Rel家族可分成兩類,第一類需要進行蛋白酶解加工,包括p50(NF-κB1,105kDa)和p52(NF-κB2,100kDa)。第二類不需要進行蛋白酶解加工,包括p65(RelA,Rel(c-Rel)和RelB)。Rel家族成員可形成同源二聚體和異源二聚體;例如NF-κB是p50-p65異源二聚體。在IκB和p105發生磷酸化和泛素化后,這兩個蛋白質分別得到降解和加工,產生活性NF-κB,從細胞質移位至細胞核。還可以用純化的蛋白酶體對泛素化的p105進行加工(Palombella等,Cell(1994)78:773-785)。活性NF-κB與其它轉錄激活因子(如HMGI(Y))構成立體特異性增強子復合體(stereospecific enhancer complex),誘導特定基因的選擇性表達。
NF-κB調節基因涉及免疫和炎癥反應,以及有絲分裂活動。例如,免疫球蛋白輕鏈κ基因、IL-2受體α鏈基因、I類主要組織相容性復合體基因的表達以及大量的細胞因子(例如IL-2、IL-6、粒細胞集落刺激因子和IFN-β)的基因編碼需要NF-κB(Palombella等,Cell(1994)78:773-785)。本發明的一些實施方式包括影響IL-2、MCH-I、IL-6、TNFα、TNF-β或任何其它前述蛋白質的表達水平的方法,每一種方法包括給予個體有效量的這里所公開的化合物。包括p50的復合體是急性炎癥和免疫反應的快速中介體(Thanos,D.和Maniatis,T.,Cell(1995)80:529-532)。
NF-κB還參與編碼E-選擇蛋白、P-選擇蛋白、ICAM和VCAM-1的細胞粘著基因的表達(Collins,T.,Lab Invest.(1993)68:499-508)。本發明的一種實施方式是抑制細胞粘著(例如,由E-選擇蛋白、P-選擇蛋白、ICAM或VCAM-1介導的細胞粘著)的方法,包括使細胞接觸(或對個體施用)有效量的這里所公開的化合物(或藥物組合物)。
NF-κB還與HIV-增強子/啟動子專一性結合。相比于mac239的Nef,在控制蛋白激酶結合的區域中,pbj14的HIV調節蛋白Nef的氨基酸有兩處不同。人們認為,蛋白激酶對IκB的磷酸化進行信號指示,通過泛素-蛋白酶體途徑觸發IκB降解。IκB在降解后被釋放至細胞核中,從而增強HIV的轉錄(Cohen,J.,Science,(1995)267:960)。本發明的兩種實施方式是一種抑制或降低個體感染HIV的方法,以及一種降低病毒基因表達水平的方法,每一種方法包括給予個體有效量的這里所公開的化合物。
TNFα等脂多糖(LPS)誘導的細胞因子的過度生成被認為是膿毒性休克相關過程的重要因素。此外,人們一般認為LPS激活細胞的第一步是LPS與特定的膜受體結合。20S蛋白酶體復合體的α和β亞基已被鑒定為LPS結合蛋白,說明LPS誘導的信號轉導可能是一種治療或預防膿毒病的重要治療靶標(Qureshi,N.等,J.Immun.(2003)171:1515-1525)。因此,某些實施方式中,本發明化合物可用于抑制TNFα,以預防和/或治療膿毒性休克。
細胞內蛋白酶解產生了用于呈遞至T-淋巴細胞的小肽以誘導I類MHC介導的免疫反應。免疫系統對感染病毒或已發生致癌性轉化的自體細胞進行篩選。一種實施方式為一種抑制細胞內抗原呈遞的方法,包括使細胞與這里所述的化合物接觸。本發明化合物可用于治療免疫相關的病癥,如過敏、哮喘、器官/組織排斥(移植物抗宿主病)和自身免疫病,包括但不限于狼瘡、類風濕關節炎、銀屑病、多發性硬化癥和炎癥性腸病(如潰瘍性結腸炎和克羅恩氏病)。這樣,另一個實施方式是一種用于抑制個體的免疫系統(如抑制移植排斥、過敏和哮喘)的方法,包括對個體施用有效量的這里所公開的化合物。
另一種實施方式是一種改變由蛋白酶體或其它具有多催化活性的Ntn產生的抗原肽的所有組成部分的方法。例如,如果20S蛋白酶體的PGPH活性被選擇性抑制,該蛋白酶體將生成一套不同的抗原肽,并在細胞表面的MHC分子中呈遞,而不像在沒有任何酶抑制或諸如選擇性抑制蛋白酶體的胰凝乳蛋白酶樣活性時的抗原肽生成和呈遞。
某些蛋白酶體抑制劑阻滯了泛素化NF-κB在體外和體內的降解和加工。蛋白酶體抑制劑還阻滯了IκB-α的降解和NF-κB的激活(Palombella,et al.Cell(1994)78:773-785;and Traenckner,et al.,EMBO J.(1994)13:5433-5441)。本發明的一種實施方式是一種抑制IκB-α降解的方法,包括使細胞與這里所述的化合物接觸。另一種實施方式是一種減少細胞、肌肉、器官和個體中的NF-κB胞內含量,包括使細胞、肌肉、器官和個體與這里所述的化合物接觸。
需要蛋白酶解加工的其它真核轉錄因子包括通用轉錄因子TFIIA,單純皰疹病毒VP16輔助蛋白(宿主細胞因子)、病毒誘導型IFN調節因子-2蛋白和膜結合型固醇調節元件結合蛋白-1。
本發明的其它實施方式是影響依賴于細胞周期蛋白的真核細胞周期的方法,包括使細胞與這里所公開的化合物接觸(體外或體內)。細胞周期蛋白是涉及細胞周期控制的蛋白質。蛋白酶體參與細胞周期蛋白的降解。細胞周期蛋白的例子包括有絲分裂細胞周期蛋白、G1細胞周期蛋白和細胞周期蛋白B。細胞周期蛋白的降解使細胞能夠脫離一個細胞周期階段(如有絲分裂)進入另一個階段(如分化)。認為所有的細胞周期蛋白與p34.sup.cdc2蛋白激酶或相關激酶締合。蛋白酶解靶信號定位于氨基酸42-RAALGNISEN-50(降解框)。有證據表明,在有絲分裂期間,細胞周期蛋白轉化為易受泛素連接酶損害的形式或激活細胞周期蛋白專一性連接酶(Ciechanover,A.,Cell,(1994)79:13-21)。對蛋白酶體的抑制抑制了細胞周期蛋白的降解,從而抑制細胞(例如,在細胞周期蛋白相關的癌癥中)的增殖(Kumatori等,Proc,Natl,.Acad.Sci.USA(1990)87:7071-7075)。本發明的一種實施方式是一種對個體進行增生性疾病(如癌癥、銀屑病或再狹窄)治療的方法,包括對個體施用有效量的這里所公開的化合物。本發明還包括一種對個體進行細胞周期蛋白相關的炎癥治療的方法,包括對個體施用治療有效量的這里所述的化合物。
另外的實施方式是影響依賴于蛋白酶體的癌蛋白調節的方法抑制治療或抑制癌生長的方法,每種方法包括使細胞接觸(體內,如在個體體內,或體外)這里所公開的化合物。HPV-16和HPV-18衍生的E6蛋白質刺激了依賴ATP的和依賴泛素的p53在粗品網織紅細胞裂解液中的共軛和降解。突變型不耐熱E1已顯示在非準許溫度下,隱性癌基因p53在細胞系中積累。提高p53的水平可引起調亡。泛素體系降解的原癌蛋白的例子包括c-Mos、c-Fos和c-Jun。一種實施方式是一種治療p53相關調亡的方法,包括給個體施用有效量的這里所公開的化合物。
另一種實施方式中,本公開化合物用于治療寄生蟲感染,如原生寄生蟲引起的感染。這些寄生蟲的蛋白酶體被認為主要涉及細胞分化和復制活性(Paugam等,Trends Parasitol.2003,19(2):55-59)。此外,內阿米巴屬與蛋白酶體抑制劑接觸時,顯示喪失包囊形成能力。某些這樣的實施方式中,本公開化合物用于治療原生寄生蟲引起的人體寄生蟲感染,該原生寄生蟲選自瘧原蟲屬(Plasmodinm sps.)(包括引起瘧疾的惡性瘧原蟲(P.falciparum)、間日瘧原蟲(P.vivax)、三日瘧原蟲(P.malariae)和卵形瘧原蟲(P.ovale))、錐蟲屬(Trypanosoma sps.)(包括引起恰加斯病的克氏錐蟲(T.cruzi)和引起非洲嗜睡癥的布氏錐蟲(T.brucei))、利什曼原蟲屬(Leishmania sps.)(包括亞馬遜利什曼原蟲(L.amazonensis)、杜氏利什曼原蟲(L.donovani)、嬰兒利什曼原蟲(L.infantum)、墨西哥利什曼原蟲(L.mexicana)等)、卡氏肺囊蟲Pneumocystis carinii)(一種已知引起艾滋病人和其它免疫抑制病人發生肺炎的原蟲)、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)、溶組織內阿米巴蟲(Entamoeba histolytica)、侵入內阿米巴蟲(Entamoeba invadens)和蘭氏賈第鞭毛蟲(Giardia lamblia)。某些實施方式中,本公開化合物用于治療由選自蟬爾曼氏瘧原蟲(Plasmodium hermani)、隱孢子蟲(Cryptosporidium sps.)、細粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus)、柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)、神經肉孢子蟲(Sarcocystis neurona)和粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)的原蟲寄生蟲引起的動物和家畜寄生蟲感染。WO98/10779描述了其它用作治療寄生蟲病的蛋白酶體抑制劑的化合物,這里對其整體內容進行綜合參考。
某些實施方式中,本公開化合物對寄生蟲中的蛋白酶體活性進行不可逆抑制。已顯示,這種不可逆抑制誘使紅細胞和白細胞中的酶活性不可恢復地終止。某些此類實施方式中,就抗再暴露于寄生蟲的治療而言,血細胞的漫長半衰期可提供延長保護。某些實施方式中,有關對未來感染進行化學預防方面,血細胞的漫長半衰期可提供延長保護。
也有報道稱,在骨器官培養物中,與20S蛋白酶體結合的抑制劑刺激了骨的形成。另外,給小鼠全身施用這樣的抑制劑時,某些蛋白酶體抑制劑提高骨體積和骨形成速度70%以上(Garrett J.R.等,J.Clin.Invest.(2003)111:1771-1782),從而表明,泛素-蛋白酶體機(ubiquitin-proteasome machinery)對成骨細胞的分化和骨形成進行調節。因此,本公開化合物可用于治療和/或預防骨質疏松癥等骨流失相關疾病。
骨組織是具有刺激骨細胞能力的因子的良好來源。因此,牛骨組織提取物不僅含有負責維持骨的結構完整性的結構蛋白,還含有能刺激骨細胞增殖的生物活性骨生長因子。在這些因子中包括最近報道的被稱為骨形態發生蛋白(BMPs)的蛋白質家族。所有這些生長因子對其它類型的細胞(包括骨細胞)產生影響,包括Hardy,M.H.等描述的有關在發育期間,骨形態發生蛋白(BMPs)在毛囊中差別表達的證據(Trans Genet(1992)8:55-61)。Harris,S.E.等描述了TGFβ對BMP-2和其它骨細胞內物質的表達的影響(BoneMiner Res(1994)9:855-863)。在細胞成熟期間及增殖期以后,在成熟濾泡中也出現了BMP-2的表達(Hardy等,(1992),見上)。因此,本發明化合物也可用于刺激毛囊生長。
最后,本公開化合物還用作診斷劑(例如,診斷試劑盒或臨床實驗室用的診斷劑),對蛋白酶體等Ntn水解酶所加工的蛋白質(例如酶、轉錄因子)進行篩選。本公開化合物還用作專一性結合X/MB1亞基或α鏈以及抑制與之相關的蛋白酶解活性的研究試劑。例如,能確定蛋白酶體的其它亞基的活性(及專一性抑制劑)。
在成熟或活化過程中,大多數細胞蛋白遭受蛋白酶解加工。這里所公開的酶抑制劑可用于確定細胞的、發育的或生理的過程或產量是否受到特定的Ntn水解酶的蛋白水解活性的調節。一種這樣的方法包括:獲取生物體、完整的細胞制備物或細胞提取物;使該生物體、細胞制備物或細胞提取物與這里所公開的化合物接觸;使接觸化合物的生物體、細胞制備物或細胞提取物與信號儀接觸,監控過程或產量。這里所公開的化合物的高選擇性能夠迅速而準確地在給定的細胞的、發育的或生理的過程中消除或暗示Ntn(例如,20S蛋白酶體)。
給藥
這里所描述制備的化合物可以各種形式施用,其形式取決于的進行治療的病癥以及病人的年齡、狀況和體重(如本領域所熟知)。例如,進行口服化合物時,可將其配制成片劑、膠囊劑、顆粒劑、粉劑或糖漿劑;或者進行胃腸道外給藥時,可將其配制成注射劑(靜脈內的、肌肉內的或皮下的),滴注制劑或栓劑。通過眼粘膜路徑給藥時,可將其配制成滴眼劑或眼膏劑。可通過常規方法制備這些劑型,如果需要,可將活性成分與任何常規的添加劑或賦形劑混合,如粘合劑、崩解劑、潤滑劑、矯味劑、穩定劑、助懸劑、乳化劑、包衣材料、環糊精和/或緩沖劑。雖然劑量隨著癥狀、病人的年齡和體重、需要治療或預防的病癥的性質及嚴重性、給藥路徑和藥物劑型而變化,一般地,成年病人的每日推薦劑量為0.01-2000mg化合物,該劑量可以一次劑量使用或分次劑量使用。能與載體物質混合制成一次劑量藥劑的活性成分的用量一般為產生療效的化合物的量。
在對給定病人的治療效果方面,產生最有效結果的精確的給藥時間和/或組合物用量取決于特定化合物的活性、藥代動力學和生物利用率;病人的生理狀況(包括年齡、性別、疾病類型和階段、一般身體狀況、對給定劑量的反應性以及藥療類型)、給藥路徑等。但是,以上方針可用作對治療方法進行精調的基礎,例如確定最佳的時間和/或給藥量,只需要進行日常試驗,包括對個體進行監控以及調整劑量和/或時間安排。
這里使用的短語“藥學上可接受的”指那些在合理的醫學判斷范圍內,適于用來接觸人及動物組織,而不過度產生毒性、刺激、過敏反應或其它問題或并發癥,具有合理的利益/風險比的配體、材料、成份和/或劑型。
這里使用的術語“藥學上可接受的載體”指藥學上可接受的材料、成分或載體,例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或膠囊材料。每個載體必須是“可接受的”,即與劑型中的其它成分相容,對病人無損害。可用作藥學上可接受的載體的材料的一些例子包括:(1)糖,如乳糖、葡萄糖和蔗糖;(2)淀粉,如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉以及取代的或未取代的β-環糊精;(3)纖維素及其衍生物,如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素;(4)黃蓍膠粉;(5)麥芽;(6)明膠;(7)滑石;(8)賦形劑,如可可脂和栓劑蠟(suppository waxes);(9)油,如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油;(10)二元醇,如丙二醇;(11)多元醇,如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇;(12)酯,如油酸乙酯和月桂酸乙酯;(13)瓊脂;(14)緩沖劑,如氫氧化鎂和氫氧化鋁;(15)海藻酸;(16)無熱原水;(17)等滲鹽水;(18)林格氏溶液;(19)乙醇;(20)磷酸鹽緩沖溶液;和(21)其它用于藥物劑型的無毒的相容物質。某些實施方式中,本發明藥物組合物是無熱原的,即,給病人施用時不會引起明顯的體溫升高。
術語“藥學上可接受的鹽”指相對無毒的抑制劑的無機酸加成鹽及有機酸加成鹽。這些鹽可以在對抑制劑進行最后分離和純化期間原地制備,或通過分別將游離堿形式的純化抑制劑與合適的有機酸或無機酸反應,分離所形成的鹽制備。代表性的鹽包括氫溴酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、乙酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、萘酸鹽(naphthylate)、甲磺酸鹽、葡萄糖酸鹽、乳糖酸鹽、十二烷基磺酸鹽和氨基酸鹽等。(例如參見Berge等(1977)“藥學上的鹽”,J.Pharm.Sci.66:1-19)。
其它情況下,用于本發明方法的抑制劑可含有一個或更多個酸性官能團,這樣能與藥學上可接受的堿形成藥學上可接受的鹽。在這些情況下,術語“藥學上可接受的鹽”指相對無毒的抑制劑的無機堿及有機堿加成鹽。這些鹽同樣可以在對抑制劑進行最后分離和純化期間原地制備,或通過分別將游離酸形式的純化抑制劑與合適的堿(如藥學上可接受的金屬陽離子的氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽)、氨水或藥學上可接受的有機伯胺、仲胺或叔胺反應制備。典型的堿金屬鹽或堿土金屬鹽包括鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽和鋁鹽等。用于形成堿加成鹽的典型的有機胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等(例如參見,上述Berge等的文獻)。
在組合物中還可以存在潤濕劑、乳化劑和潤滑劑(如十二烷基硫酸鈉和硬脂酸鎂)以及著色劑、釋放劑、包衣材料、甜味劑、調味劑和香料、防腐劑和抗氧化劑。
藥學上可接受的抗氧化劑包括:(1)水溶性抗氧化劑,如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等;(2)油溶性抗氧化劑,如棕櫚酸抗壞血酯、丁羥茴醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、棓酸丙酯、α-生育酚等;和(3)金屬螯合劑,如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
適合于口服的劑型可為膠囊劑、扁囊劑、丸劑、片劑、糖錠(以調味劑為基礎,通常為蔗糖、阿拉伯膠或黃蓍膠)、粉劑、顆粒劑;或含水的或無水的溶液劑或混懸劑;或水包油或油包水乳液劑;或酏劑或糖漿劑;或軟錠劑(使用惰性基質,如明膠和甘油,或蔗糖和阿拉伯膠)和/或漱口劑等,每一種均含有預先確定量的抑制劑作為活性成分。組合物還可以以大丸劑、干藥糖劑或糊劑使用。
在用于口服的固體劑型(膠囊劑、片劑、丸劑、糖衣丸劑、粉劑、顆粒劑等)中,活性成分與一種或更多種藥學上可接受的載體混合,如檸檬酸鈉或磷酸氫鈣;和/或下列任一種:(1)填充劑或增量劑,如淀粉、環糊精、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸;(2)粘合劑,如羧甲基纖維素、海藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯膠;(3)保濕劑,如甘油;(4)崩解劑,如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉;(5)溶液阻滯劑,如石蠟;(6)吸收加速劑,如季銨化合物;(7)濕潤劑,如乙酰乙醇和甘油單硬脂酸酯;(8)吸收劑,如高嶺土和膨潤土;(9)潤滑劑,如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉和它們的混合物;以及(10)著色劑。就膠囊劑、片劑和丸劑而言,藥物組合物還可以含有緩沖劑。相似類型的固體組份也可以作為填充劑用于使用乳糖或乳糖(milk sugars)以及高分子量的聚乙二醇等賦形劑的軟、硬填充明膠膠囊。
可通過壓制或模壓制備片劑,任選使用一種或更多種助劑。可使用粘合劑(如明膠或羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(如羥乙酸淀粉鈉或交聯羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑制備壓制片劑。可通過在合適的機器中對惰性稀釋液濕潤的粉狀抑制劑混合物進行模壓制備模制片。
片劑及糖衣丸劑、膠囊劑、丸劑和顆粒劑等其它固體劑型可任選地用包衣和外殼(如腸溶衣和制藥領域熟知的其它包衣)劃痕(scored)或制備。還可以對它們進行配制以便對其中使用的活性成分進行緩釋或控釋,例如,使用不同比例的羥丙基甲基纖維素、其它聚合物基質、脂質體和/或微球體,以提供目標釋放形式。可以通過諸如用持留細菌過濾器過濾或結合使用殺菌劑對它們進行滅菌,形成滅菌組合物形式,可在使用前不久溶于無菌水或一些其它的無菌注射介質。這些組合物還可以任選地含有遮光劑,組合物可以僅僅(或優選)在胃腸道的特定部位釋放活性成分(任選緩釋方式)。可使用的埋入組合物的例子包括聚合物和蠟。如果需要,活性成分也可以與上述一種或更多種賦形劑形成微膠囊形式。
口服用液體劑型包括藥學上可接受的乳劑、微乳劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑和酏劑。除活性成分外,液體劑型中可含有本領域常用的惰性稀釋劑,例如水或其它溶劑;穩定劑和乳化劑,例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特別是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫呋喃甲醇、聚乙二醇和脫水山梨糖醇的脂肪酸酯,以及它們的混合物。
除惰性稀釋劑外,此類口服組合物還可包括佐劑,如潤濕劑、乳化劑和混懸劑、甜味劑、調味劑、著色劑、香精和防腐劑。
除活性成分外,混懸劑可含有混懸劑,例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨糖醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂和黃蓍膠,以及它們的混合物。
直腸和陰道給藥用的劑型可以是栓劑,可通過將一種或更多種抑制劑與一種或更多種合適的無刺激性賦形劑或載體(例如包括可可脂、聚乙二醇、栓劑蠟或水楊酸酯)混合制備,它在室溫下為固體,但在體溫下為液體,因此將在直腸或陰道中熔化并釋放活性劑。
適于陰道給藥的劑型還包括陰道栓劑、衛生棉條(tampons)、乳膏劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴霧劑型,含有本領域已知的合適的載體。
用于局部或透皮給予抑制劑的劑型包括粉劑、噴霧劑、油膏劑、糊劑、乳膏劑、洗劑、凝膠劑、溶液劑、貼劑和吸入劑。活性組分可在無菌條件下與藥學上可接受的載體以及任何可能需要的防腐劑、緩沖劑或推進劑混合。
除抑制劑外,油膏劑、糊劑、乳膏劑和凝膠劑可含有賦形劑,如動植物脂肪、油、蠟、石蠟、淀粉、黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨潤土、硅酸、滑石和氧化鋅,或它們的混合物。
除抑制劑外,粉劑和噴霧劑可含有賦形劑,如乳糖、滑石、硅酸、氫氧化鋁、硅酸鈣和聚酰胺粉,或這些物質的混合物。噴霧劑可另外含有通常的推進劑,如含氯氟烴和揮發性未取代烴(如丁烷及丙烷等)。
或者可以通過氣溶膠給予抑制劑。這通過制備含有該組合物的水性氣溶膠、脂質體制劑或固體顆粒來實現。可使用無水混懸劑(如氟碳推進劑)。優選聲波噴霧器(sonic nebulizer),因為它們暴露在剪切下的制劑達到最小,剪切可引起化合物的降解。
通常地,通過將試劑的水溶液或混懸液與常規的藥學上可接受的載體和穩定劑一起配制制備水性氣溶膠。載體和穩定劑根據特定組合物的需要而變化,但典型包括非離子表面活性劑(吐溫類、普朗尼克類、脫水山梨糖醇酯類、卵磷脂、氫化蓖麻油類)、藥學上可接受的潛溶劑(如聚乙二醇、血清白蛋白等無害蛋白質、油酸、甘氨酸等氨基酸、緩沖劑、鹽類、糖類或糖醇)。氣溶膠一般由等滲溶液制備。
透皮貼劑的額外益處是向身體控制釋放抑制劑。這種劑型可通過使試劑溶解或分散于合適的介質中制備。還可使用吸收促進劑以增加透過皮膚的抑制劑的通量。可通過提供速度控制膜或使抑制劑分散于聚合物基質或凝膠中控制該通量速度。
適用于胃腸道外給藥的本發明藥物組合物含有與一種或更多種藥學上可接受的無菌水溶液或非水溶液、分散劑、混懸劑或乳劑或無菌粉劑組合的一種或更多種抑制劑,它可在使用前不久重新形成無菌的可注射溶液或分散液,可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、使制劑與擬受藥的血液等滲的溶質或混懸劑或增稠劑。
本發明藥物組合物中可使用的合適的水性載體及非水載體的例子包括:水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合適的混合物、橄欖油等植物油、油酸乙酯等可注射有機酯。通過使用卵磷脂等包衣材料、維持分散液中的顆粒大小以及使用表面活性劑等方式可保持適當的流動性。
這些組合物還可以含有佐劑,如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。通過使用各種抗細菌劑和抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸(phenol sorbic acid)等)可確保防止微生物起作用。還優選在組合物中包括張力調節劑,如糖類、氯化鈉等。此外,可通過使用單硬脂酸鋁和明膠等延遲吸收的試劑延長注射藥劑的吸收。
有時,為了延長藥效,優選減緩對皮下注射或肌肉注射藥物的吸收。例如將藥物溶解或混懸于賦形劑油中以延遲對胃腸道外給予的藥物的吸收。
通過使抑制劑在聚丙交酯-聚乙交酯等生物可降解聚合物中形成微膠囊基質制備可注射的長效制劑。根據藥物與聚合物的比例、所使用的具體聚合物的性質,可對藥物的釋放速度進行控制。其它生物可降解聚合物的例子包括聚原酸酯和聚酸酐。還可以將藥物埋于與體組織相容的脂質體或微乳中以制備長效注射制劑。
給予制劑的方式可以為口服、胃腸道外給予、局部給予或經直腸給予。當然,對于每一條給藥途徑,均以合適的劑型給藥。例如,以注射劑、吸入劑、洗眼劑、油膏劑、栓劑、輸液劑形式給予片狀或膠囊藥物;以洗劑或油膏劑形式局部給藥以及以栓劑形式直腸給藥。優選口服。
這里使用的短語“胃腸道外給藥”指不同于腸內給藥和局部給藥的給藥模式,通常為注射給藥,包括但不限于靜脈內的、肌肉內的、動脈內的、鞘內的、囊內的、眶內的、心內的、皮內的、腹膜內的、穿鞘的、皮下的、表皮下的、關節內的、包囊下的、蛛網膜下的、脊柱內的和胸骨內的注射和輸液。
這里使用的短語“全身給藥”和“外周給藥”指不直接將配體、藥物或其它物質給入中樞神經系統,以致于進入病人的全身從而進行代謝及其它類似的過程,例如,皮下給藥。
可通過任何合適的給藥途徑對人和其它動物施用這些抑制劑,進行治療,包括通過口附、經鼻給藥(例如以噴霧形式),直腸給藥、陰道給藥、胃腸道外給藥、腦池內給藥和局部給藥(以粉劑、油膏劑或滴劑形式),包括經頰給藥、舌下給藥。
無論選擇何種給藥途徑,可利用本領域熟練人員已知的常規方法將本發明抑制劑(可以合適的水合物形式使用)和/或藥物組合物配制成藥學上可接受的劑型。
本發明藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可以變化,從而對于特定的病人,活性成分的用量、組合和給藥方式能有效實現所希望的治療反應,且對病人無毒。
本公開化合物在藥學上可接受的混合物中的濃度隨著一些因素而變化。這些因素包括化合物的施用劑量、所使用的化合物的藥物動力學特征以及給藥途徑。一般地,本發明組合物可以是胃腸道外給予的水溶液,含有約0.1-10%w/v本公開化合物,以及其它物質。典型的劑量范圍為每日約0.01-約50mg/kg體重,以1-4個分次劑量給予。每個分次劑量所含有的本發明化合物可以相同或不同。有效劑量取決于包括病人的全面健康狀況以及所選擇的化合物的劑型和給藥途徑等一些因素。
本發明的另一個方面,提供了一種結合療法,其中將一種或更多種其它治療劑與蛋白酶抑制劑共同使用。這種結合治療可通過同時、連續或分別定量給予單個治療組分的方式實現。
某些實施方式中,本發明化合物與化學治療劑結合使用。合適的化學治療劑可包括天然產物,如長春花屬生物堿(即,長春堿、長春新堿、長春瑞賓)、紫杉醇、表鬼臼毒素(即,表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷)、抗生素(放線菌素(放線菌素D)、柔紅霉素(daunorubicin)、阿霉素和去甲氧柔紅霉素(idarubicin))、蒽環霉素(anthracyclines)、米托蒽醌(mitoxantrone)、博萊霉素(bleomycins)、普卡霉素(plicamycin)(光輝霉素(mithramycin))和絲裂霉素(mitomycin)、酶(L-天冬酰胺酶,對L-天冬酰胺進行系統代謝,剝奪沒有能力合成自身天冬酰胺的細胞);抗血小板劑;抗增殖/抗有絲分裂烷基化劑,如氮芥子氣(氮芥、環磷酰胺及類似物、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥)、氮雜環丙烷和甲密胺(methylmelamines)(六甲密胺和噻替哌(thiotepa))、磺酸烷基酯(白消安(busulfan))、亞硝基脲(亞硝脲氮芥(carmustine,BCNU)及類似物,鏈脲霉素)、trazenes-達卡巴嗪(dacarbazinine)(DTIC);抗增殖/抗有絲分裂抗代謝物,如葉酸類似物(氨甲基葉酸(methotrexate))、嘧啶類似物(氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟尿苷(floxuridine)和阿糖胞苷(cytarabine))、嘌呤類似物和相關的抑制劑(巰嘌呤(mercaptopurine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、噴司他丁(pentostatin)和2-氯去氧腺苷);芳香酶抑制劑(阿那曲唑(anastrozole)、依西美坦(exemestane)和來曲唑(letrozole));以及鉑配位絡合物(順鉑(cisplatin)、卡波鉑(carboplatin))、甲基芐肼(procarbazine)、羥基脲、曼托坦(mitotane)、氨魯米特(aminoglutethimide);激素(即,雌激素)和促激素,如促黃體生成素釋放素(LHRH)激動劑(性瑞林(goserelin)、醋酸亮丙瑞林(leuprolide)和曲普瑞林(triptorelin))。其它的化學治療劑可包括氮芥(mechlorethamine)、喜樹堿、異環磷酰胺(ifosfamide)、他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、吉西他濱(gemcitabine)、長春瑞賓(navelbine),或前述化合物的任何類似物或衍生物。
某些實施方式中,本發明化合物與類固醇結合使用。合適的類固醇可包括,但不限于21-乙酰氧基孕烯醇酮、阿氯米松(alclometasone)、阿爾孕酮、安西縮松(amcinonide)、丙酸倍氯米松(beclomethasone)、倍他米松(betamethasone)、布地縮松(budesonide)、氯強的松(chloroprednisone)、氯倍他索(ciobetasol)、氯可托龍(clocortolone)、氯潑尼醇(cloprednol)、皮質酮、可的松(cortisone)、可的伐唑(cortivazol)、去氟可特(deflazacort)、羥潑尼縮松(desonide)、去羥米松(desoximetasone)、地塞米松(dexamethasone)、雙氟拉松(diflorasone)、二氟米松(diflucortolone)、醋丁二氟龍(difuprednate)、甘草次酸(enoxolone)、氟_米松(fluazacort)、氟氯縮松(flucloronide)、氟米松(flumethasone)、氟尼縮松(flunisolide)、醋酸氟輕松(fluocinoloneacetonide)、氟輕松(fluocinonide)、氟可丁酯(fluocortin butyl)、氟可龍(fluocortolone)、氟氫縮松(fluorometholone)、醋酸氟培龍(fluperolone acetate)、醋酸氟甲叉龍(fluprednidene acetate)、氟潑尼龍(fluprednisolone)、氟氫縮松(flurandrenolide)、丙酸氟地松(fluticasone propionate)、氟甲酰龍(formocortal)、哈西縮松(halcinonide)、鹵倍他索丙酸酯(halobetasol propionate)、鹵米松(halometasone)、氫化可的松(hydrocortisone)、氯替潑諾(loteprednol etabonate)、馬潑尼酮(mazipredone)、甲羥孕酮(medrysone)、甲基潑尼松(meprednisone)、甲基強的松龍(methylprednisolone)、糠酸莫米他松(mometasone furoate)、對氟米松(paramethasone)、潑尼卡松(prednicarbate)、強的松龍(prednisolone)、強的松龍25-二乙氨基乙酸酯(prednisolone 25-diethylaminoacetate)、強的松龍磷酸鈉(prednisolone sodiumphosphate)、強的松(prednisone)、強的松龍戊酸酯(prednival)、甲烯強的松龍(prednylidene)、雙甲丙酰龍(rimexolone)、硫氫可的松(tixocortol)、去炎松(triamcinolone)、醋酸去炎松(triamcinolone acetonide)、丙炎松氨丁酯(triamcinolonebenetonide)、己酸丙炎松(triamcinolone hexacetonide),以及它們的鹽和/或衍生物。
某些實施方式中,本發明化合物與免疫治療劑結合使用。合適的免疫治療劑可包括,但不限于環孢菌素(cyclosporine)、沙立度胺(thalidomide)和單克隆抗體。單克隆抗體可以是裸的或綴合的,如利妥昔單抗(rituximab)、托西莫單抗(tositumomab)、阿倫單抗(alemtuzumab)、依帕珠單抗(epratuzumab)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumabozogamicin)、貝伐單抗(bevacizumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、埃羅替尼(erlotinib)和曲妥珠單抗(trastuzumab)。
實施例
方案1:實施例1的合成

(B)的合成
在NBoc亮氨酸(50.0mmol,11.56g)和苯丙氨酸甲酯(50.0mmol,10.78g)的DMF(500mL)溶液中加入HOBT(10.81g,80.0mmol)和DIEA(200.0mmol,25.85g,35mL)。在冰浴中將混合物冷卻至0℃,5分鐘內分次加入BOP(80.0mmol,35.38g)。反應液置于一個氬氣壓下,攪拌過夜。反應液用鹽水(1000mL)稀釋,并用乙酸乙酯(5×200mL)萃取。合并有機層,用水(10×100mL)和鹽水(2×150mL)洗滌,經硫酸鎂干燥。過濾去除硫酸鎂,減壓脫除揮發物,得到(A)(18.17g)。在50mL 0℃冷卻的80%TFA/DCM溶液中加入BocNHLeuPheOMe(45.86mmol,18.0g)。攪拌溶液,2小時內使之升至室溫。減壓脫除揮發物,得到油。在該油中加入BocNHhPhe(45.86mmol,12.81g)、DMF(500mL)、HOBT(73.37mmol,9.91 g)和DIEA(183.44mmol,23.70g,32.0mL)。在冰水浴中將混合物冷卻至0℃,5分鐘內分次加入BOP(73.37mmol,32.45g)。將反應液置于氬氣下過夜,使之升至室溫。反應液用水(1500mL)稀釋,并用DCM(5×300mL)萃取。合并有機層,用水(6×300mL)和鹽水(1×300mL)洗滌,經硫酸鎂干燥。過濾去除硫酸鎂,減壓脫除揮發物,得到黃色固體。在該固體中加入200mL 95%乙醇,加熱混合物至65℃以使固體全部溶解。然后在溶液中加入1000mL冷凍水,收集所得沉淀物,得到(B)(21.59g)。
(C)的合成
將化合物(B)(1.47mmol,0.81g)與TFA/DCM(80%)混合,室溫下攪拌1小時,此時濃縮混合物,并在高真空下放置2小時,生成三肽胺(Q)的TFA鹽。在TFA鹽(1.47mmol)的DMF(10mL)0℃溶液中加入DIEA(4.4mmol,0.77mL),然后加入芐氧基乙酰氯(2.21mmol,0.343mL)。在一個氮氣壓下,攪拌反應液2小時,使之回升至室溫。混合物用鹽水(15mL)稀釋,用乙酸乙酯萃取(3×15mL)。合并有機層,用水(2×15mL)和鹽水(1×15mL)洗滌,經硫酸鈉干燥。過濾去除硫酸鈉,減壓脫除揮發物。粗物質經快速色譜純化得到(C)(0.83g)。
(D)的合成
在冷卻至0℃的(C)(1.38mmol,0.830g)的甲醇/水(3∶1,28mL)懸浮液中加入氫氧化鋰(13.8mmol,0.331g)。18小時后,在5℃下,用20mL飽和氯化銨使反應猝滅,進一步用150mL水稀釋。用1N鹽酸調節反應混合物的pH至2,過濾收集固體,得到(D)(0.900g)。
(E)的合成
將化合物(D)(0.17mmol,0.10g)溶解于甲醇(10mL)中,加入Pd-C(5%,0.08g),在一個氫氣壓下,室溫下攪拌反應混合物2小時。然后用氬氣吹掃混合物,經硅藻土過濾,濃縮得到(E)。
化合物1的合成
攪拌下,向(F)(見:Bioorg.Med.Chem.Letter 1999,9,2283-88)(0.164mmol)的DMF(2mL)溶液中加入(E)(0.17mmol)、DIEA(0.652mmol,0.114mL)和HOBT(0.266mmol,0.036g)。在冰浴中將混合物冷卻至0℃,分次加入BOP(0.262mmol,0.116g)。在一個氬氣壓下,5℃下攪拌混合物過夜。反應液用鹽水(15mL)稀釋,用乙酸乙酯萃取。有機層用水、飽和碳酸氫鈉和鹽水洗滌,經無水硫酸鎂干燥。過濾除去硫酸鎂,減壓脫除揮發物。用制備HPLC純化粗物質,得到化合物1(IC50 20S CT-L<50nM,IC50基于細胞的CT-L<100nM)。
方案2:實施例2的合成

(G)的合成
將化合物(C)(1.0mmol,0.601g)溶解于甲醇(25mL)中,加入Pd-C(10%,600mg),在一個氫氣壓下,室溫下攪拌反應混合物48小時。然后用氬氣吹掃混合物,經硅藻土過濾,濃縮得到(G)(600mg)。
(H)的合成
在0℃的(G)(1.0mmol,0.511g)的DCM(40mL)溶液中加入DIEA(2.0mmol,0.348mL)和二芐基磷酰氯(2.0mmol,0.593g)。在一個氮氣壓下,室溫下,攪拌反應液過夜。然后真空濃縮反應液,粗物質經快速色譜純化得到(H)(0.181g)。
(I)的合成
在冷卻至0℃的(H)(0.11mmol,0.090g)的甲醇/水(3∶1,4mL)懸浮液中加入氫氧化鋰(1.6mmol,0.4mL,4M水溶液)。45分鐘后,在5℃下,用10mL飽和氯化銨使反應猝滅。用1N鹽酸調節反應混合物的pH至2,用乙酸乙酯萃取。有機層經水和鹽水洗滌,經無水硫酸鎂干燥。過濾除去硫酸鎂,減壓脫除揮發物,得到(I)。
(J)的合成
攪拌下,向(F)(見:Bioorg.Med.Chem.Letter 1999,9,2283-88)(0.082mmol)的DMF(2mL)溶液中加入(I)(0.082mmol,0.062g)、DIEA(0.328mmol,0.057mL)和HOBT(0.133mmol,0.018g)。在冰浴中將混合物冷卻至0℃,分次加入BOP(0.131mmol,0.058g)。在一個氬氣壓下,5℃下攪拌混合物過夜。反應液用水(15mL)稀釋,過濾收集得到(J)(0.081g)。
化合物2的合成
在(J)(0.005mmol,0.005g)的THF(1mL)溶液中加入4滴水和10%Pd/C(5mg)。在氫氣下,室溫下攪拌混合物1小時,用硅藻土過濾,用碳酸鈉(0.263g溶于3mL水)處理濾液。過濾收集固體,放置在高度真空中,得到化合物2(0.004g)。
方案3:實施例3的合成

(L)的合成
在(K)(0.19mmol,0.10g)的THF(20mL)溶液中加入碘化鉀(0.038mmol,0.0063g)、二甲胺(0.456mmol,0.228mL,2M TFH溶液),在一個氮氣壓下,攪拌混合物過夜,減壓脫除揮發物,粗物質用乙酸乙酯(15mL)吸收,用水(2×10mL)和鹽水(2×10mL)洗滌,經硫酸鎂干燥。過濾除去硫酸鎂,減壓脫除揮發物,得到(L)(0.100g)。
(M)的合成
在冷卻至0℃的(L)(0.186mmol,0.100g)的甲醇/水(3∶1,4mL)懸浮液中加入氫氧化鋰(1.86mmol,0.045g)。12小時后,在5℃下,用20mL飽和氯化銨使反應猝滅,進一步用10mL水稀釋。用1N鹽酸調節反應混合物的pH至3,用氯仿(3×15mL)萃取,經硫酸鎂干燥。過濾除去硫酸鎂,減壓脫除揮發物,得到(M)。
化合物3的合成
攪拌下,向(F)(見:Bioorg.Med.Chem.Letter 1999,9,2283-88)(0.082mmol)的DMF(1mL)溶液中加入(M)(0.021mmol)、DIEA(0.28mmol,0.05mL)和HOBT(0.133mmol,0.018g)。在冰浴中將混合物冷卻至0℃,分次加入BOP(0.131mmol,0.058g)。在一個氬氣壓下,5℃下攪拌混合物過夜。然后用鹽水(15mL)稀釋反應液,用乙酸乙酯萃取。有機層用水、飽和碳酸氫鈉和鹽水洗滌,經無水硫酸鎂干燥。過濾除去硫酸鎂,減壓脫除揮發物。得到化合物3(IC50 20S CT-L<100nM,基于細胞的CT-L<100nM)。
方案4:實施例4的合成

(N)的合成
將化合物(B)(1.80mmol,1.0g)與TFA/DCM(80%)混合,室溫下攪拌1小時,此時濃縮混合物,并在高真空下放置2小時,生成三肽胺的TFA鹽。在0℃的TFA鹽(1.80mmol)的DMF(10mL)溶液中加入DIEA(3.6mmol,0.7mL),然后加入氯乙酰氯(2.7mmol,0.215mL)。在一個氮氣壓下,攪拌反應液過夜,使之回升至室溫。混合物用鹽水(15mL)稀釋,用乙酸乙酯萃取(3×15mL)。合并有機層,用水(2×15mL)和鹽水(2×15mL)洗滌,經硫酸鈉干燥。過濾去除硫酸鈉,減壓脫除揮發物。粗物質懸浮于乙酸乙酯中,過濾得到(N)(0.640g)。
(O)的合成
在(N)(0.094mmol,0.050g)的THF(10mL)溶液中加入碘化鉀(0.019mmol,0.0032g)和哌啶(0.113mmol,0.0096g),在一個氮氣壓下,攪拌混合物過夜,減壓脫除揮發物,粗物質用乙酸乙酯(15mL)吸收,用水(2×10mL)和鹽水(2×10mL)洗滌,經硫酸鎂干燥。過濾除去硫酸鎂,減壓脫除揮發物,得到(O)。
(P)的合成
在冷卻至0℃的(O)(0.094mm0l)的甲醇/水(3∶1,4mL)懸浮液中加入氫氧化鋰(0.94mmol,0.023g)。12小時后,在5℃下,用20mL飽和氯化銨使反應猝滅,進一步用10mL水稀釋。用1N鹽酸調節反應混合物的pH至3,用DCM(3×15mL)萃取,經硫酸鎂干燥。過濾除去硫酸鎂,減壓脫除揮發物,得到(P)。
化合物4的合成
攪拌下,向(F)(見:Bioorg.Med.Chem.Letter 1999,9,2283-88)(0.082mmol)的DMF(2mL)溶液中加入(P)(0.082mmol,0.046g)、DIEA(0.328mmol,0.057mL)和HOBT(0.133mmol,0.018g)。在冰浴中將混合物冷卻至0℃,分次加入BOP(0.131mmol,0.058g)。在一個氬氣壓下,5℃下攪拌混合物過夜。反應液用水(15mL)稀釋,用乙酸乙酯萃取。有機層用水、飽和碳酸氫鈉和鹽水洗滌,經無水硫酸鎂干燥。過濾除去硫酸鎂,減壓脫除揮發物。得到化合物4(0.034g)(IC5020SCT-L<100nM,IC50基于細胞的CT-L<100nM)。
方案5:實施例5的合成

(T)的合成
除了用(Q)代替(F),用環丙基乙酸代替(E),基本按照將(E)轉化成1的步驟得到化合物(T)。
(U)的合成
除了用(T)代替(C),基本按照將(C)轉化成(D)的步驟得到化合物(U)。
化合物5的合成
除了用(U)代替(E),基本按照將(E)轉化成1的步驟得到化合物5。
方案6:實施例6的合成

(W)的合成
將化合物(V)(0.25g,0.39mmol)與12mL TFA/DCM(80%)混合,室溫下攪拌1小時,此時濃縮混合物,并在高真空下放置2小時,生成三肽胺的TFA鹽。使粗胺鹽溶于6mL DMF中,加入2-嗎啉代乙酸(0.074g,0.507mmol),然后加入DIEA(0.504g,0.68mL,3.90mmol)。在冰浴中將混合物冷卻至0℃,加入PyBOP(0.32g,0.62mmol),在一個氬氣壓下,攪拌反應液過夜,使之回升至室溫。混合物用鹽水(50mL)稀釋,用乙酸乙酯萃取(5×20mL)。合并有機層,用飽和碳酸氫鈉(5×15mL)和鹽水(1×25mL)洗滌,經硫酸鎂干燥。過濾去除硫酸鎂,減壓脫除揮發物得到酯中間體(0.195g)。在酯中間體(0.150g,0.23mmol)中先后加入Pd/C(0.05g)和5mL甲醇及乙酸乙酯(1∶1)的混合物,將混合物放置于一個氫氣壓下。2小時后,用一塞子硅藻土過濾內容物,真空濃縮得到(W)(0.12g)。
化合物6的合成
攪拌下,向(F)(見:Bioorg.Med.Chem.Letter 1999,9,2283-88)(1.3當量,0.27mmol,0.083mg)的甲腈(5mL)溶液中加入(W)(1當量,0.17mmol,0.10g)、DIEA(10當量,1.73mmol,0.30mL)和HOBT(1.6當量,0.27mmol,0.037mg)。在冰浴中將混合物冷卻至0℃,分次加入PyBOP(1.6當量,0.27mmol,0.14g)。在一個氬氣壓下,5℃下攪拌混合物過夜。然后用飽和氯化鈉稀釋反應液,用乙酸乙酯萃取。有機層用水和鹽水洗滌,經無水硫酸鎂干燥,濃縮成一團。將粗物質溶于最小量的甲醇中,緩慢加至迅速攪拌的0℃冷凍水(100mL)中,然后通過過濾分離得到化合物6(0.080g)。
方案7:實施例7的合成

(X)的合成
在NBoc亮氨酸(19.81g,85.67mmol,1.0當量)和苯丙氨酸芐酯(25.0g,85.67mmol,1.0當量)的甲腈(900mL)溶液中加入和DIEA(44.29g,60mL,342.68mmol,4.0當量)。在冰浴中將混合物冷卻至0℃。向該混合物中加入HOBT(18.52g,137.08mmol,1.6當量),然后在5分鐘內分次加入PyBOP(71.33g,137.08mmol,1.6當量)。將反應液置于一個氬氣壓下,攪拌過夜。減壓脫除揮發物,余下的物質被500mL乙酸乙酯吸收,用飽和碳酸氫鈉、水和鹽水洗滌,經硫酸鎂干燥。過濾去除硫酸鎂,減壓除去揮發物,得到(X)。
(Y)的合成
在0℃冷卻的70%TFA/DCM(150mL)溶液中加入(X)(25.0g,53.35mmol,1.0當量)。在2小時內,攪拌該溶液,并使之回升至室溫,此時濃縮混合物,并在高度真空下放置2小時,生成二肽胺的TFA鹽。在所得到的油中加入BocNHhPhe(14.68g,53.35mmol,1.0當量)、550mL甲腈和DIEA(27.58g,37.2mL,213.4mmol,4.0當量),在冰浴中將混合物冷卻至0℃。在冷卻的混合物中加入HOBT(11.53g,85.36mmol,1.6當量),然后在5分鐘內分次加入PyBOP(44.42g,85.36mmol,1.6當量)。氬氣下,將反應液放置過夜,使之回升至室溫,此時形成白色沉淀物。冷卻反應混合物,過濾收集固體,然后用冷的甲腈洗滌,得到(Y)(24.86g)。
(Z)的合成
將化合物(Y)(0.023mol,14.5g)與TFA/DCM(80%)混合,室溫下攪拌1小時,此時濃縮混合物,并在高度真空下放置2小時,生成三肽胺的TFA鹽。在TFA鹽(0.023mol,1當量)的甲腈(120mL)溶液中,加入4-氯丁酰氯(1.2當量,0.028mol,0.32mL)和DIEA(4當量,0.092mol,16mL)。室溫下攪拌混合物2小時,然后通過快速色譜濃縮和純化,得到(Z)(8g)。
(AA)的合成
在(Z)(1當量,0.095mmol,60mg)的無水丙酮(8mL)溶液中加入碘化鈉(5當量,0.47mmol,70.5mg)。在一個氮氣壓下,回流條件下攪拌混合物過夜。然后濃縮反應混合物至干,殘渣用DCM吸收。有機層用水和鹽水洗滌,經無水硫酸鎂干燥,濃縮得到黃色固體(AA)(50mg)。
(BB)的合成
在(AA)(30mg,0.041mmol)的THF(2mL)溶液中加入二甲胺(1.2當量,0.05mmol,2M THF溶液,25μL)和DIEA(1當量,0.041mmol,7.2μL)。室溫下攪拌混合物過夜,濃縮至干。殘渣用乙酸乙酯吸收,用水和鹽水洗滌,經無水硫酸鎂干燥,濃縮得到油狀產物。將粗酯溶于甲醇/乙酸乙酯(1∶1,10mL)中,加入Pd-C(5%,20mg),在一個氫氣壓下,室溫下攪拌反應混合物2小時。然后用氬氣吹掃混合物,經硅藻土過濾,濃縮得到(BB)(21mg)。
化合物7的合成
攪拌下,向(F)(見:Bioorg.Med.Chem.Letter 1999,9,2283-88)(1.2當量,0.054mmol)的DMF(3mL)溶液中加入(BB)(1當量,0.045mmol,21mg)、DIEA(4當量,0.18mmol,31μL)和HOBT(1.6當量,0.072mmol,10mg)。在冰浴中將混合物冷卻至0℃,分次加入PyBOP(1.6當量,0.072mmol,37mg)。然后在一個氮氣壓下,5℃下攪拌混合物過夜。反應液用飽和氯化鈉稀釋,用乙酸乙酯萃取。有機層用水和鹽水洗滌,經無水硫酸鎂干燥,濃縮至油,該油經快速色譜純化得到化合物7(16.7mg)(IC50 20S CT-L<50nM,基于細胞的CT-L<150nM)。
方案8:實施例8的合成

(CC)的合成
將化合物(Y)(1.55g,0.0023mol)溶于甲醇/乙酸乙酯(1∶1,40mL)中,加入Pd-C(5%,500mg)。在氫氣下,室溫下攪拌混合物2小時,然后經硅藻土過濾,濃縮得到羧酸中間體。攪拌下,向(F)(見:Bioorg.Med.Chem.Letter 1999,9,2283-88)(1.2當量,2.55mmol,436mg)的DMF(50mL)溶液中加入羧酸中間體(1當量,2.12mmol,1.24g)、DIEA(4當量,8.48mmol,1.5mL)和HOBT(1.6當量,3.39mmol,458mg)。在冰浴中將混合物冷卻至0℃,分次加入PyBOP(1.6當量,3.39mmol,1.76g)。在一個氮氣壓下,5℃下攪拌混合物過夜。反應液用飽和氯化鈉稀釋,用乙酸乙酯萃取。有機層用水和鹽水洗滌,經無水硫酸鎂干燥,濃縮至油,該油經快速色譜純化得到(CC)(356mg)。
化合物8的合成
將化合物(CC)(23.6mg,0.034mmol)與TFA/DCM(80%)混合,室溫下攪拌1小時,此時濃縮混合物,并在高度真空下放置2小時,生成四肽胺的TFA鹽。在TFA鹽的DCM溶液中加入1,3,5-三甲基-1-H-吡唑-4-磺酰氯(1.2當量,0.041mmol,8.5mg)和TEA(4當量,0.136mmol,26μL),在室溫下攪拌混合物過夜。濃縮粗品混合物至干,殘渣用乙酸乙酯吸收。有機層用水和鹽水洗滌,經無水硫酸鎂干燥,濃縮至油,該油經快速色譜純化得到化合物8(2mg)(IC50 20S CT-L<100nM,基于細胞的CT-L<100nM)。
方案9:實施例9的合成

化合物9的合成
將化合物(CC)(63.7mg,0.092mmol)與TFA/DCM(80%)混合,室溫下攪拌1小時,此時濃縮混合物,并在高度真空下放置2小時,生成四肽胺的TFA鹽。在TFA鹽的DCM溶液中加入異氰酸苯酯(1.5當量,0.14mmol,15μL)和DIEA(3當量,0.276mmol,50μL),在室溫下攪拌混合物過夜。濃縮粗品混合物至干,殘渣用乙酸乙酯吸收。有機層用水和鹽水洗滌,經無水硫酸鎂干燥,濃縮至油,該油經快速色譜純化得到化合物9(2.8mg)。
方案10:實施例10的合成

化合物10的合成
將化合物(CC)(48.5mg,0.07mmol)與TFA/DCM(80%)混合,室溫下攪拌1小時,此時濃縮混合物,并在高度真空下放置2小時,生成四肽胺的TFA鹽。在TFA鹽的DCM溶液中加入異硫氰酸苯酯(1.5當量,0.105mmol,20μL)和DIEA(3當量,0.21mmol,40μL),在室溫下攪拌混合物過夜。濃縮粗品混合物至干,殘渣用乙酸乙酯吸收。有機層用水和鹽水洗滌,經無水硫酸鎂干燥,濃縮至油,該油經快速色譜純化得到化合物10(1mg)。
等同
本領域的熟練人員將認識到,或者僅僅使用常規試驗就能夠確定多種與這里所述化合物及其應用方法等同的化合物及方法。這種等同被認為落入本發明的范圍內,并被后面的權利要求所覆蓋。
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