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作為光動力學療法用載體系統的基于磷酸鈣的納米粒子.pdf

摘要
申請專利號:

CN200980151463.5

申請日:

2009.12.18

公開號:

CN102256622B

公開日:

2014.10.29

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 41/00申請日:20091218|||公開
IPC分類號: A61K41/00; A61K9/16 主分類號: A61K41/00
申請人: 拜萊泰克公開股份有限公司; 杜伊斯堡-埃森大學
發明人: 雅尼納·思科維爾特茲; 卡茲維爾·蓋內森; 馬蒂亞斯·埃普勒; 阿諾·威赫; 蘇珊娜·葛拉菲; 布克哈德·吉特; 福爾克爾·阿爾布雷希特
地址: 德國耶拿
優先權: 2008.12.19 EP 08022155.9
專利代理機構: 中原信達知識產權代理有限責任公司 11219 代理人: 劉慧;楊青
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200980151463.5

授權公告號:

102256622B||||||

法律狀態公告日:

2014.10.29|||2012.03.07|||2011.11.23

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明提供了負載藥用光敏劑的光動力學療法用納米粒子制劑和它們的制備方法,所述制劑包含疏水性或親水性光敏劑、磷酸鈣納米粒子和在某些情況下包含輔助試劑例如穩定劑。本發明的基于磷酸鈣的納米粒子制劑提供了極好的儲存穩定性和供靜脈內或局部施用的治療有效量的光敏劑。在優選的實施方案中,四吡咯衍生物例如卟啉、二氫卟酚和菌綠素是被配制在用于光動力學腫瘤療法的磷酸鈣納米粒子制劑中的優選疏水性光敏劑。另外,pTPPP是用于光動力學腫瘤療法的優選的親水性光敏劑。在另一個優選的實施方案中,親水性的陽離子和陰離子光敏劑,尤其吩嗪吩噻嗪和氧雜蒽系列的那些,已被發現能夠滅活致病菌,并且是被配制在用于抗菌光動力學療法的磷酸鈣納米粒子制劑中的優選光敏劑。在另一個實施方案中,光敏性納米粒子制劑可用于通過使用熒光成像方法定位細胞、組織或細菌。

權利要求書

1.光動力學療法用納米粒子藥用制劑,其包含:
·結晶或無定形的生物降解性陶瓷芯,其直徑在5-1000nm的范圍
內;更具體在50-250nm的范圍內;
·治療有效量的疏水性或親水性光敏劑;
·穩定劑;
其中所述陶瓷芯是實心或空心的,且所述陶瓷芯的材料選自磷酸
鈣或碳酸鈣,其中Ca2+還能夠被其他離子例如Mg2+、Al3+或Sr2+(部分
或完全地)代替;
其中所述疏水性或親水性光敏劑選自四吡咯衍生物(即卟啉,二氫
卟酚和菌綠素)、吩嗪和吩噻嗪染料(即甲苯胺藍,亞甲基藍和番紅
素)、和氧雜蒽染料(即赤蘚紅);以及
其中所述穩定劑選自陽離子性、非離子性或陰離子性聚合物(即聚
苯乙烯磺酸鹽(PSS),羧甲基纖維素(CMC),聚烯丙胺鹽酸鹽(PAH),聚
乙烯亞胺。
2.權利要求1的光動力學療法用納米粒子藥用制劑,其包含治療
有效量的疏水性或親水性光敏劑;
其中所述疏水性或親水性光敏劑是用磷酸基團、典型為每分子1
到4個磷酸基團官能化的四吡咯衍生物。
3.權利要求1的納米粒子藥用制劑,其中光敏劑的治療有效濃度
是1至500μM。
4.權利要求2的納米粒子藥用制劑,其中光敏劑的治療有效濃度
是1至100μM。
5.權利要求1的納米粒子藥用制劑,其中所述光敏劑選自替莫泊
芬、亞甲基藍、甲苯胺藍、番紅素和赤蘚紅。
6.權利要求1至5任一項的納米粒子藥用制劑,其中所述納米粒
子配有靶向配體,尤其是抗體和抗體片段或RGD肽。
7.權利要求1至6任一項的納米粒子藥用制劑在光動力學療法中
的應用。
8.權利要求1至6任一項的納米粒子藥用制劑在光動力學腫瘤療
法中的應用。
9.權利要求1至6任一項的納米粒子藥用制劑在抗菌光動力學療
法中的應用。
10.權利要求1至6任一項的納米粒子藥用制劑在關節炎和類似
的炎性疾病的光動力學治療中的應用。
11.權利要求1至6任一項的納米粒子藥用制劑在牙周病的光動
力學治療中的應用。
12.權利要求1或2的納米粒子制劑的醫療應用,其中生物學靶
向分子附著于納米粒子的表面。

說明書

作為光動力學療法用載體-系統的基于磷酸鈣的納米粒子

發明背景

技術領域

本發明涉及制備含有疏水性或親水性光敏劑的納米粒子制劑,和
它們在光動力學療法、特別是腫瘤和抗菌療法中采用靜脈內或局部施
用的應用。

現有技術陳述

近年來,磷酸鈣納米粒子因其高度的生物相容性引起越來越多的
關注,這應歸于磷酸鈣構成哺乳動物骨和牙齒的無機礦物質的事實(S.V.
Dorozhkin,M.Epple,Angew.Chem.,Int.Ed.,2002,41,3130-3146;M.
Vallet-Regi,Dalton?Trans.,2006,5211-5220;C.Rey,C.Combes,C.
Drouet,H.Sfihi,A.Barroug,Mater.Sci.Eng.,C,2007,27,198-5220)。磷
酸鈣納米粒子還可以充當藥物載體,例如用于核酸(V.Sokolova,M.
Epple,Angew.Chem.Int.Ed.,2008,47,1382-1395)或用于抗腫瘤藥物
(B.Palazzo,M.Iafisco,M.Laforgia,N.Margiotta,G.Natile,CL.Bianchi,
D.Walsh,S.Mann,N.Roveri,Adv.Funct.Mater.,2007,17,2180-2188;
E.Boanini,M.Gazzano,K.Rubini,A.Bigi,Adv.Mater.,2007,19,
2499-2502;X.Cheng,L.Kuhn,Int.J.Nanomed.2007,2,667-674)。例如,
用DNA-和siRNA-覆層的磷酸鈣納米粒子實現了成功的細胞轉染(A.
Maitra,Exp.Rev.Mol.Diagn.,2005,5,893-905;Y.Kakizawa,S.
Furukawa,A.Ishii,K.Kataoka,J.Controlled?Release,2006,111,368-370;
V.V.Sokolova,I.Radtke,R.Heumann,M.Epple,Biomaterials,2006,27,
3147-3153;D.Olton,J.Li,M.E.Wilson,T.Rogers,J.Close,L.Huang,
N.P.Kumta,C.Sfeir,Biomaterials,2007,28,1267-1279;V.Sokolova,A.
Kovtun,O.Prymak,W.Meyer-Zaika,E.A.Kubareva,E.A.Romanova,
T.S.Oretskaya,R.Heumann,M.Epple,J.Mater.Chem.,2007,17,
721-727)。另一個例子公開在Kuhn的美國專利2008/0241256?A1中。在
這里,描述了適合將活性劑靶向遞送給腫瘤細胞和淋巴腺的磷酸鈣納
米粒子活性劑結合物,用于治療癌癥和治療或預防癌癥轉移。即使增
強的藥物遞送系統可以提供超越現有技術制劑的許多優點,但被吸附
到磷酸鈣納米粒子上的抗癌藥物是化療劑或激素釋放激動劑,因為它
們干擾了正常細胞生長以及癌細胞生長,可能具有許多嚴重的副作用。

無機納米粒子相對于有機納米粒子展現出各種各樣的優點:它們
不受微生物株攻擊,它們經常是無毒的,容易制備,并且儲存穩定性
通常良好(V.Sokolova,M.Epple,Angew.Chem.,Int.Ed.,2008,47,
1382-1395)。尤其磷酸鈣納米粒子滿足所有這些優點,因為它們兼具生
物降解性和生物相容性(D.Tadic,F.Beckmann,K.Schwarz,M.Epple,
Biomaterials?2004,47,3335-3340;C.Schiller,M.Epple,Biomaterials?
2003,24,2037-2043;D.Tadic,F.Peters,M.Epple,Biomaterials?2002,23,
2553-2559;S.V.Dorozhkin,M.Epple,Angew.Chem.Int.Ed.2002,41,
3130-3146)。另外,它們在結構上和化學上非常接近于人骨中的礦物質
(S.Weiner,H.D.Wagner,Annu.Rev.Mater.Sci.1998,28,271-298)。磷
酸鈣納米粒子的另一個好處是摻入鑭系元素的可能性。這些摻雜鑭系
元素的粒子顯示熒光,因此很容易地可以追蹤通過例如細胞的路徑。(A.
Doat,M.Fanjul,F.Pelle,E.Hollande,A.Lebugle,Biomaterials?2003,24,
3365-3371;A.Doat,F.Pelle,N.Gardant,A.Lebugle,J.Solid?State?Chem.
2004,177,1179-1187;A.Lebugle,F.Pelle,C.Charvillat,I.Rousselot,J.
Y.Chane-Ching,Chem.Commun.2006,606-608;S.Padilla?Mondejar,A.
Kovtun,M.Epple,J.Mater.Chem.2007,17,4153-4159;V.Sokolova,A.
Kovtun,R.Heumann,M.Epple,J.Biol.Inorg.Chem.2007,12,174-179)。

光動力學療法(PDT)是開發用于各種各樣的醫療應用中的有前景
的技術,并被認為是公認的破壞腫瘤的療法(T.D.Mody,J.Porphyrins?
Phthalocyanines,2000,4,362-367)。光動力學療法利用光和光敏劑(染料)
來達到它想要的醫療效果。大量的天然存在的染料和合成染料已經被
評價為是有潛力的光動力學療法用光敏劑。也許受到最廣泛研究的光
敏劑類別是四吡咯大環化合物。它們當中,尤其是卟啉和二氫卟酚已
被測試了它們的PDT功效。

然而,許多光敏劑制劑不具有改善生物利用度的化學、藥理和/或
光物理性質,因此所述光敏劑不具有實現有效PDT治療的效用。

因此,已經進行了許多嘗試,通過改變光敏劑的藥代動力學和生
物分布來改善它的生物利用度。提供有機納米粒子作為藥物載體,
Allemann等人的美國專利2004/0047913?A1公開了納米粒子光敏劑,其
包含綠色卟啉和選自聚酯聚合物例如D,L-丙交酯-乙交酯共聚物和聚
D,L-丙交酯的納米粒子。然而,正如前面提到的那樣,有機納米粒子已
經顯示出,與無機納米粒子相比,表現出各種各樣的缺點。此外,基
于生物降解性聚合物的藥物遞送載體經常可以形成聚合物酸性副產
物、或降解成可能改變活性劑釋放所處的環境的片段,并可能不利地
影響它們與之相互作用的藥物和/或組織。

供PDT應用的包含連著光敏劑的發光納米粒子的另一種光敏劑制
劑公開在Chen等人的美國專利2007/0218049?A1中。暴露于X-射線、
α粒子、β粒子、中子和γ射線所發射的電離輻射下時,發光納米粒子發
出光來活化光敏劑,隨后在癌細胞中產生PDT殺滅效應。因為發光納
米粒子需要被暴露于電離輻射源下,所以失去了高選擇性殺死腫瘤細
胞且對周圍組織損害最小的重要優點。即使通過光敏劑的活化來放大
在癌細胞中的殺滅效應,但電離輻射必須經過以便治療腫瘤的健康組
織例如皮膚或器官還是經歷了電離輻射的危險效應。

成功用于光動力學腫瘤療法的大多數物質是親脂性物質,由于它
們在水中的固有的低溶解度,需要以適當的方法配制,以提高它們的
攝取和生物利用度。另一方面,高度親水性的物質不能用于光動力學
腫瘤療法,因為它們在腫瘤組織中不能充分累積。

PDT的另一個可能的應用是治療由病原微生物引起的感染性疾病
(M.Wainwright,Photodiagn.Photodyn.Ther.,2005,2,263-272)。在感染
性疾病治療中不變的問題是藥劑缺乏用于治療這些疾病的特異性。其
次,微生物可以適應并因此消除大多數經過化學設計的抗微生物藥的
效應,產生抗藥株,它們需要活性更高的成分來阻止抗藥株的活動。
在這個方面,PDT由于它的作用方式不同,已經被鑒定為是有希望的
供選方案。另外,僅有非常低的形成抗藥菌株的可能性。

PDT在治療各種類型疾病中的應用,由于光敏劑(PS)的固有特性
而受到限制。這些限制包括它們的高成本、在宿主有機體中延長的滯
溜、顯著的皮膚光毒性、在生理溶液中的低溶解度(這也降低了它供血
管內施用的實用性,因為它可以引起血栓栓塞性事故)、和靶向效率低。
這些缺點,特別是現有技術中PS的缺點,導致施用很高劑量的光敏劑,
這顯著增加了光敏劑在非損傷組織中累積的可能性和伴隨的影響非損
傷部位的風險。

降低成本和降低本底毒性的工作已在進行中,但是與本發明的開
展無關。改善在生理溶液中的溶解度、皮膚光毒性效應、在宿主有機
體中的滯溜和較低程度靶向效率的工作,是本發明在利用PDT治療各
種各樣的增生和相關疾病以及細菌感染方面提供新的和非顯而易見的
改善的領域。此外,因為光動力學療法在治療癌癥及其他疾病中的應
用迅速增加,對于新的光敏劑制劑也有更大的需要。這些新的光敏劑
制劑必須是穩定的、容易制造和處置的。

發明目的和發明概要

本發明的一個目的是提供基于包含穩定劑的磷酸鈣納米粒子的光
敏劑制劑和制備方法,供它們用于PDT、尤其是光動力學腫瘤療法中。

本發明的另一個目標是提供基于包含穩定劑的磷酸鈣納米粒子的
光敏劑制劑和制備方法,供它們用于抗菌PDT中。

本發明的又一個目的是提供基于不含穩定劑的磷酸鈣納米粒子的
親水性光敏劑的光敏劑制劑和制備方法,供用于PDT。

本發明的又一個目標是提供基于磷酸鈣納米粒子的光敏劑制劑和
制備方法,供它們用于診斷和通過使用熒光成像方法定位細胞、組織
或細菌。

簡單說來,本發明提供了用于光動力學療法的負載藥用光敏劑的
納米粒子制劑和它們的制備方法,所述制劑包含疏水性或親水性光敏
劑、磷酸鈣納米粒子和在某些情況下的輔助試劑例如穩定劑。本發明
的基于磷酸鈣的納米粒子制劑提供了極好的儲存穩定性和供靜脈內或
局部施用的治療有效量的光敏劑。在優選的實施方案中,四吡咯衍生
物例如卟啉、二氫卟酚和菌綠素是被配制在用于光動力學腫瘤療法的
磷酸鈣納米粒子制劑中的優選的疏水性光敏劑。另外,pTPPP是用于
光動力學腫瘤療法的優選的親水性光敏劑。在另一個優選的實施方案
中,親水性陽離子性和陰離子性光敏劑,尤其吩嗪吩噻嗪和氧
雜蒽系列的那些,已經發現能夠滅活致病菌,是被配制在用于抗菌光
動力學療法的磷酸鈣納米粒子制劑中的優選光敏劑。在另一個實施方
案中,光敏納米粒子制劑可用于通過使用熒光成像方法定位細胞、組
織或細菌。

以上概括的和其他的本發明目的、特征和優點將通過結合附圖閱
讀下面的描述而變得明顯。

附圖說明

圖1a-1顯示PSS官能化并且負載mTHPP的磷酸鈣納米粒子的紫
外光譜。

圖1a-2呈現了PSS司能化的磷酸鈣粒子在有和沒有吸附的mTHPP
時的熱重分析比較。

圖1a-3顯示了PSS-穩定化的磷酸鈣納米粒子在有和沒有mTHPP
時的X-射線粉末衍射圖,以及豎線顯示計算出的羥基磷灰石反射。

圖1a-4顯示了PSS官能化并且負載mTHPP的磷酸鈣納米粒子在
超速離心后的SEM圖像。

圖1a-5呈現了負載mTHPP并且PSS穩定化的磷酸鈣納米粒子的
熒光光譜。

圖1a-6顯示負載mTHPP并且PSS/PAH官能化的磷酸鈣納米粒子
在超速離心后的SEM顯微圖。

圖1b-1顯示CMC官能化并且負載mTHPP的磷酸鈣納米粒子的紫
外光譜。

圖1b-2呈現CMC官能化的磷酸鈣粒子在有和沒有吸附的mTHPP
時的熱重分析。

圖1b-3顯示了CMC穩定化的磷酸鈣納米粒子在有和沒有mTHPP
時的X-射線粉末衍射圖,以及計算出的羥基磷灰石反射。

圖1b-4顯示了CMC官能化并且負載mTHPP的磷酸鈣納米粒子的
SEM圖像。

圖2-1呈現了PSS官能化并且負載MB的磷酸鈣納米粒子的紫外
光譜。

圖2-2顯示了PSS官能化并且負載MB的磷酸鈣納米粒子的SEM
圖像。

圖3-1顯示了pTPPP官能化的磷酸鈣納米粒子在再分散后的SEM
圖。

圖3-2比較了分散的pTPPP官能化的磷酸鈣納米粒子(pTPPP的有
效濃度:10±2μM)和pH?7.4的pTPPP水溶液(10μM)的熒光發射光譜。

圖3-3顯示離心過的(固態)pTPPP官能化的磷酸鈣納米粒子的熒光
發射光譜。

圖4顯示PSS官能化并且負載mTHPP的磷酸鈣納米粒子在粒子
上的mTHPP濃度為16.7μM時的細胞試驗代表性結果。

圖5顯示金黃色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus)DSM1104(ATCC?
25923)在PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)中的細菌懸浮液通過基于磷酸鈣納米
粒子的亞甲基藍制劑(30分鐘溫育,然后照射)所導致的光動力學滅活。

圖6顯示金黃色葡萄球菌DSM1104(ATCC?25923)和銅綠假單胞菌
(Pseudomonas?aeruginosa)DSM1117(ATCC?27853)在PBS(磷酸鹽緩
沖鹽水)中的細菌懸浮液通過基于磷酸鈣納米粒子的mTHPP制劑(90分
鐘溫育,然后照射)所導致的光動力學滅活。

圖7顯示了光敏劑pTPPP在純態(水溶液)中的光動力學效應和在
本發明的磷酸鈣納米粒子制劑中的光動力學效應的比較。

優選實施方案的詳細說明

光動力學療法已經顯示出在許多應用例如腫瘤治療和抗菌療法中
的有效性超過現有技術技術。然而,PDT功效取決于使用的光和光敏
劑二者。現有技術的光敏劑制劑存在許多缺點,例如在生理溶液中的
溶解度不當、儲存穩定性不當、長期組織滯溜、皮膚光毒性延長和對
不健康區域的靶向效率低下。因此,對于技術性質和物化性質比現有
技術化合物更好的新的光敏劑制劑有更強的需要。本發明通過提供穩
定的、便于制造和處置的光敏劑制劑,滿足了對現有技術制劑的要求。
此外,本發明提供了在生理溶液中的溶解度改善和有效治療增生和相
關疾病以及細菌感染的光敏劑制劑。另外,提供了新的供選物,以穩
定化的無機納米粒子形式遞送疏水性和親水性光敏劑。

在優選的實施方案中,提供了基于磷酸鈣的、負載藥用光敏劑的、
供PDT應用的納米粒子制劑。它們包含疏水性或親水性光敏劑、磷酸
鈣和穩定劑。

對于腫瘤的光動力學治療而言,親水性光敏劑是優選的,但是不
限于pTPPP,而疏水性光敏劑是優選的,但是不限于基于四吡咯的光
敏劑,基于四吡咯的光敏劑選自卟啉、二氫卟酚或菌綠素,其最大吸
光度在640-780nm的范圍內。

對于抗菌光動力學療法而言,光敏劑優選選自吩嗪吩噻嗪或
氧雜蒽染料(即,甲苯胺藍、亞甲基藍和它們的衍生物,番紅素(safranin)
及其衍生物,赤蘚紅及其衍生物)。

優選的穩定劑是陰離子性聚電解質聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)和羧甲
基纖維素(CMC),和陽離子性聚電解質聚烯丙胺鹽酸鹽(PAH)和聚乙烯
亞胺(PEI)。已表明,磷酸鈣納米粒子可以被這些聚合電解質穩定化(H.
Urch,C.Geismann,M.Ulbricht,M.Epple,Materialwiss.und?
Werkstofftech.,2006,37,422-425)。此外,使用公知的逐層(layer-by-layer)
技術,可以在磷酸鈣納米粒子上添加最多三個電荷交替的聚合物層(G.
Decher,Science,1997,277,1232-1237)。通過適當的工藝,磷酸鈣芯可
以溶解,留下聚合電解質囊殼(J.Schwiertz,W.Meyer-Zaika,L.
Ruiz-Gonzalez,J.M.Gonzalez-Calbet,M.Vallet-Regi,M.Epple,2008,J.
Mater.Chem.,18,3831-3834)。在沉積于聚苯乙烯核心上的這些聚合物
層中摻入低分子量物質的可能性在文獻中是已知的(Z.Dai,A.Voigt,S.
Leporatti,E.Donath,L.H.Adv.Mater.2001,13,
1339-1342)。

在優選的實施方案中,提供了基于磷酸鈣的納米粒子光敏劑制劑
的制備方法。該法包括以下步驟:

1)通過鈣和磷酸根溶液的連續沉淀法形成納米粒子;

2)在磷酸鈣納米粒子沉淀期間添加穩定劑,例如PSS或CMC;

3)在沉淀之前、期間或之后添加光敏劑;

4)使用逐層方法使穩定化的負載光敏劑的磷酸鈣粒子官能化。

在用PSS穩定化的磷酸鈣納米粒子的情況下,在沉淀之后短時間
內將光敏劑添加到該分散體中。在用CMC穩定化的磷酸鈣納米粒子的
情況下,在沉淀之前將光敏劑添加到磷酸鹽組分中。另外,使用逐層
方法,PSS穩定化并且負載光敏劑的磷酸鈣粒子可以通過PAH被進一
步官能化。CMC官能化并且負載光敏劑的粒子可以通過PEI被進一步
官能化。因此,對于納米粒子分散體,存在范圍廣闊的官能化可能性,
這也涉及嚴格控制它們的電荷(陰離子的或陽離子的)。

在另一個優選的實施方案中,提供了不需要添加穩定劑而制備基
于磷酸鈣的納米粒子光敏劑制劑的方法。所述方法包括下列步驟:

1)通過鈣和磷酸根溶液的連續沉淀法形成納米粒子;

2)在沉淀之前、期間或之后添加光敏劑。

在非官能化的磷酸鈣粒子的情況下,將光敏劑直接加到磷酸鈣分
散體中。

本發明制劑的特別的優點是,有時光敏劑可以用磷酸鈣進行配制,
而不使用附加的穩定劑(實施例3)。因此,在本發明中描述的方法允許
配制高度親水性的光敏劑例如pTPPP。一般說來,這樣高度親水性的
光敏劑因為它們的水溶性差,不適合用于光動力學腫瘤療法。令人驚
訝地發現,高度親水性的光敏劑例如pTPPP當如本發明描述被配制在
磷酸鈣納米粒子中時,變得對HT29腫瘤細胞有PDT活性(實施例6,
顯示純pTPPP和在磷酸鈣納米粒子制劑中的pTPPP的不同活性)。

光敏納米粒子制劑可用于將光敏劑分子靶向于不想要的細胞或組
織或細菌細胞或其他不希望的目標,并在用適當的光源輻射之后,破
壞所述靶。另外,在另一個實施方案中,光敏制劑也可用于通過使用
熒光成像方法來定位不想要的細胞或組織或細菌細胞或其他不希望的
目標,所述熒光成像方法以通常的紫外線吸收波長產生可見熒光(對照
實施例3)。成像可以通過通常照射可見光波長或近紅外波長,不用結
合或結合光敏劑的光化學活化來完成。

磷酸鈣構成哺乳動物骨和牙齒的無機礦物,因此磷酸鈣納米粒子
被身體所充分耐受。因而,它們起到非常有效的藥物物質用運載器的
作用,并具有高度的生物相容性和生物降解性。通過將光敏劑結合到
磷酸鈣納米粒子之上和之中,可以把不溶于水的光敏劑分散在水中。
從而可以避免使用醇性溶液。

介紹以下實例,為本技術領域的普通技術人員提供如何制造本發
明的負載光敏劑的磷酸鈣納米粒子并顯示它們的光動力活性的完全的
和說明性的公開內容和描述,所述公開內容和描述不準備限制發明人
所認為的本發明的范圍。進行了所有努力以確保關于所使用的數值(例
如量、溫度等等)的準確性,但是應該容許一些實驗誤差和偏差。

實施例1a-包含PSS穩定化的磷酸鈣納米粒子和疏水性光敏劑
5,10,15,20-四(3-羥苯基)-卟啉(mTHPP)的制劑的制備說明

在室溫下,通過將體積比為1∶1∶2的乳酸鈣(18mM)、(NH4)2HPO4
(10.8mM)、和PSS(2g?l-1)的水溶液迅速泵送到裝有4體積份的水的攪
拌容器中,制備用PSS覆層的納米粒子。PSS官能化和穩定化了新出
現的磷酸鈣納米粒子(H.Urch,C.Geismann,M.Ulbricht,M.Epple,
Materialwiss.und?Werkstofftech.,2006,37,422-425.)。鈣和磷酸根溶液
的pH預先用氨溶液調節到10。一分鐘之后,以相對于磷酸鹽溶液的
體積為1∶5直至1∶1的體積比添加mTHPP(1.5mM,在2-丙醇中)。膠體
分散體的最終pH是9.3至9.5。4天之后,通過以66,000g超速離心30
分鐘,將粒子與抗衡離子(乳酸根,NH4+,Na+)、過量的PSS(溶解的)
和未吸附的mTHPP分離。離心的納米粒子在水中再分散,再次離心和
再分散。所有的制備均使用超純水(Purelab?ultra儀器,得自ELGA)。

產物通過各種各樣的分析法進行表征。用Netzsch?STA?409PC儀
器進行熱重分析(TG)(動態氧氣氛50ml?min-1;加熱速率1K?min-1;敞口
的氧化鋁坩堝)。X-射線粉末衍射(XRD;Siemens?D500衍射計;Cu?Kα
輻射,),和掃描電子顯微術聯合能量分散X-射線光譜術
(SEM-EDX;ESEM?Quanta?400FEG,FEI;金-鈀[80∶20]-濺射樣品;EDX
檢測器:S-UTW-Si(Li))。用Zetasizer?nanoseries(Malvern?Nano-ZS,激
光器:λ=532nm)儀器執行動態光散射(DLS)和ζ電位的測定。使用裝
備有二極管陣列多色儀和75W氙燈的J&M熒光分光光度計
(Analytische?Mess-und?Regeltechnik?FL3095-500),在室溫下測量發射光
譜和激發光譜。將發射光譜針對檢測器靈敏度進行校正,以及將激發
光譜針對激發光的強度進行校正。用Varian?Cary?WinUV分光光度計
在1cm石英比色杯中記錄紫外-可見光吸收譜。

被吸附到粒子上的mTHPP的量通過紫外光譜、以記錄校準曲線來
確定。圖1a-1顯示了負載mTHPP的磷酸鈣膠體的典型吸收光譜。該吸
收光譜類似于溶解的mTHPP的吸收光譜。

圖1a-2顯示了PSS官能化的磷酸鈣納米粒子在有和沒有吸附的
mTHPP時的熱重分析。第一重量損失對應于化合物的失水,在兩種樣
品類型上,第一重量損失非常類似。第二重量損失表明聚合物部分的
燃燒;這種情況下聚合物的量相差大約3.5%;顯然mTHPP在一定程
度上抑制PSS-吸附。負載mTHPP的磷酸鈣納米粒子的第三重量損失為
2.9%,對應于未負載的粒子所缺少的mTHPP的燃燒。該mTHPP量與
定量紫外光譜法的結果相符。最后的重量損失表明由礦物相的碳酸鹽
含量所導致的二氧化碳損失。這些結果也被元素分析所證實(C,H,N,
Ca,PO43-)。鈣與磷酸根的比率是1.67,即化學計量的羥磷灰石比率。

圖1a-3顯示了PSS穩定化的磷酸鈣納米粒子在有和沒有吸附的
mTHPP時的X-射線粉末衍射圖。如寬的衍射峰所指示的,所述粒子包
含納晶羥磷灰石Ca5(PO4)3(OH)構成。

圖1a-4顯示了PSS官能化并且負載mTHPP的磷酸鈣納米粒子的
SEM圖像。粒子直徑為大約80-100nm,具有相當的單分散粒度分布。

動態光散射測量證實了這些結果。粒子的ζ電位是大約-20mV。
盡管ζ電位比較低,但粒子在分散體中穩定達幾個星期之久。

另外,通過逐層技術,有可能在PSS官能化并且負載mTHPP的
磷酸鈣粒子上沉積別的聚合物層(G.Decher,Science,1997,277,
1232-1237;J.Schwiertz,W.Meyer-Zaika,L.Ruiz-Gonzalez,J.M.
Gonzalez-Calbet,M.Vallet-Regi,M.Epple,J.Mater.Chem.,2008,18,
3831-3834)。向粒子分散體中添加1∶1體積比的PAH,一種陽離子性聚
電解質(4g?l-1,pH?7)。通過66,000g超速離心30分鐘,將粒子與過量
的PAH分離。離心過的納米粒子在超純水中再分散。紫外光譜類似于
沒有第二聚合物層的粒子。熒光測量顯示沉積PAH層后熒光強度降低
(圖1a-5)。

動態光散射測量顯示粒子直徑輕度增加。通過SEM對此進行了證
實(圖1a-6)。粒子的直徑是100-120nm。ζ電位是大約+50mV,這證實
了陽離子性聚電解質PAH的吸附。

實施例1b-包含CMC穩定化的磷酸鈣納米粒子和疏水性光敏劑
5,10,15,20-四(3-羥苯基)-卟啉(mTHPP)的制劑的制備說明

在室溫下,通過將體積比為1∶1∶1的乳酸鈣(18mM)、(NH4)2HPO4
(10.8mM)、和CMC(2g?l-1)的水溶液迅速泵送到裝有4體積份的水的攪
拌容器中,制備用CMC覆層的磷酸鈣納米粒子。在沉淀之前,將光敏
劑mTHPP(1.5mM,在2-丙醇中)相對于磷酸鹽溶液體積以20∶1直至5∶1
的體積比與磷酸鹽組分混合。CMC官能化和穩定化了新出現的磷酸鈣
納米粒子。鈣和磷酸根溶液的pH預先用氨溶液調節到10。膠體分散
體的最終pH是9.2至9.5。通過以66,000g超速離心30分鐘,將粒子
與抗衡離子(乳酸根,NH4+,Na+)、過量的溶解的CMC和未吸附的
mTHPP分離。離心過的納米粒子在水中再分散,再次離心和再分散。
所有的制備均使用超純水(Purelab?ultra儀器,得自ELGA)。為了實現
該膠體系統的穩定性,所述分散體必須用水以1∶5的體積比稀釋。

產物通過各種各樣的分析法表征。用Netzsch?STA?409PC儀器進
行熱重分析(TG)(動態氧氣氛50ml?min-1;加熱速率1K?min-1;敞口的氧
化鋁坩堝)。X-射線粉末衍射(XRD;Siemens?D500衍射計;Cu?Kα輻射,
),和掃描電子顯微術聯合能量分散X-射線光譜術
(SEM-EDX;ESEM?Quanta?400FEG,FEI;金-鈀[80∶20]-濺射樣品;EDX
檢測器:S-UTW-Si(Li))。用Zetasizer?nanoseries(Malvern?Nano-ZS,激
光器:λ=532nm)儀器執行動態光散射(DLS)和ζ電位的測定。使用裝
備有二極管陣列多色儀和75W氙燈的J&M熒光分光光度計
(Analytische?Mess-und?Regeltechnik?FL3095-500),在室溫下測量發射光
譜和激發光譜。將發射光譜針對檢測器靈敏度進行校正,以及將激發
光譜針對激發光的強度進行校正。用Varian?Cary?WinUV分光光度計在
1cm石英比色杯中記錄紫外-可見光吸收譜。

被吸附到粒子上的mTHPP的量通過紫外光譜法測量。圖1b-1顯
示了負載mTHPP的磷酸鈣膠體的典型吸附。除了較寬的峰以外,吸收
光譜接近于游離mTHPP的吸收光譜。

圖1b-2顯示了CMC官能化的磷酸鈣納米粒子在有和沒有吸附的
mTHPP時的熱重分析結果。第一重量損失對應于化合物的失水。負載
mTHPP的粒子比未負載粒子高4.5%。第二重量損失是由于聚合物的燃
燒所導致;這種情況下,該量相差3.5%。顯然,這種情況下,mTHPP
在一定程度上促進CMC-吸附。負載mTHPP的磷酸鈣納米粒子的第三
重量損失2.6%應歸于mTHPP的燃燒。最后的重量損失表明由礦物相
的碳酸鹽含量所導致的二氧化碳損失。這些結果也被元素分析證實。
鈣與磷酸根的比率是1.76,略高于化學計量的羥磷灰石的比率(1.67)。

圖1b-3顯示了CMC穩定化的磷酸鈣納米粒子在有和沒有吸附的
mTHPP時的X-射線粉末衍射圖。所述粒子是X-射線無定形的,即沒
有明確的峰可識別。豎線顯示計算的羥磷灰石Ca5(PO4)3(OH)的峰位置。

圖1b-4顯示了CMC官能化并且負載mTHPP的磷酸鈣納米粒子的
SEM圖像。粒子的直徑為大約80-100nm,具有相當的單分散粒度分布。

動態光散射測量證實了這些結果。粒子的ζ電位是大約-20mV。
盡管ζ電位低,但粒子在分散體中穩定達幾個星期之久。

另外,通過逐層技術,可以在CMC官能化并且負載mTHPP的磷
酸鈣粒子上沉積別的聚合物層(G.Decher,Science,1997,277,
1232-1237;J.Schwiertz,W.Meyer-Zaika,L.Ruiz-Gonzalez,J.M.
Gonzalez-Calbet,M.Vallet-Regi,M.Epple,J.Mater.Chem.,2008,18,
3831-3834)。向粒子分散體中添加8∶1體積比的陽離子性聚電解質
PEI(2g?l-1,pH?10.4)。通過66,000g超速離心30分鐘,將粒子與過量的
PEI分離。離心過的納米粒子在超純水中再分散。粒子的大小增加到大
約40nm并且ζ電位是+30mV,這證實了正性聚電解質PEI的吸附。粒
子在分散體中穩定達幾個星期之久。

結論是,有可能制備不同官能化的并且負載mTHPP的磷酸鈣納米
粒子。所有的膠體系統穩定達幾個星期。所有樣品的粒度分布低于多
分散性指數(PDI)0.3,這說明動態光散射測量的可靠性。SEM圖像證實
粒度分布窄。磷酸鈣納米粒子上被吸附的mTHPP的量通過紫外光譜法
和熱重分析測量。粒子的內部結構從無定形到納晶羥磷灰石變化。

實施例2-包含磷酸鈣納米粒子和親水性光敏劑亞甲基藍(MB)的
制劑的制備說明

在室溫下,通過將體積比為1∶1∶2的乳酸鈣(18mM)、(NH4)2HPO4
(10.8mM)和PSS(2g?l-1)的水溶液迅速泵送到裝有4體積份的水的攪拌
容器中,制備用PSS覆層的納米粒子。PSS官能化和穩定化了所形成
的磷酸鈣納米粒子。鈣和磷酸根溶液的pH預先用氫氧化鉀溶液調節到
10。一分鐘之后,以相對于磷酸鹽溶液為1∶1的體積比添加MB(0.003
M)。通過以150,000g超速離心30分鐘,將粒子與抗衡離子(乳酸根,
NH4+,K+,Na+,Cl+)、過量的溶解的PSS和未吸附的MB分離。離心
過的納米粒子在水中再分散,再次離心和再分散。所有的制備均使用
超純水(Purelab?ultra儀器,ELGA)。

產物通過各種各樣的分析法表征。用Netzsch?STA?409PC儀器進
行熱重分析(TG)(動態氧氣氛50ml?min-1;加熱速率1K?min-1;敞口的氧
化鋁坩堝)。X-射線粉末衍射(XRD;Siemens?D500衍射計;Cu?Kα輻射,
),和掃描電子顯微術聯合能量分散X-射線光譜術
(SEM-EDX;ESEM?Quanta?400FEG,FEI;金-鈀[80∶20]-濺射樣品;EDX
檢測器:S-UTW-Si(Li))。用Zetasizer?nanoseries(Malvern?Nano-ZS,激
光器:λ=532nm)儀器執行動態光散射(DLS)和ζ電位的測定。使用裝
備有二極管陣列多色儀和75W氙燈的J&M熒光分光光度計
(Analytische?Mess-und?Regeltechnik?FL3095-500),在室溫下測量發射和
激發光譜。將發射光譜針對檢測器靈敏度進行校正,激發光譜針對激
發光的強度進行校正。用Varian?Cary?WinUV分光光度計在1cm石英
比色杯中記錄紫外-可見光吸收譜。

被吸附到粒子上的MB的量通過紫外光譜法測量。圖2-1顯示了
負載MB的磷酸鈣膠體的典型吸收。該吸收模式類似于游離MB的吸
收模式。

圖2-2顯示了PSS官能化并且負載MB的磷酸鈣納米粒子的SEM
圖像。粒子的直徑為大約50-80nm,具有相當的單分散粒度分布。這些
粒子的ζ電位是大約-20mV。盡管ζ電位比較低。但所述粒子在分散體
中穩定達幾個星期。

結論是,可以制備PSS官能化并且負載MB的磷酸鈣納米粒子。
這些粒子穩定達幾個星期。樣品的粒度分布低于多分散性指數0.3,這
說明動態光散射測量的可靠性。SEM圖像證實粒度分布窄。磷酸鈣納
米粒子上被吸附的MB的量通過紫外光譜法驗證。

實施例3-包含磷酸鈣納米粒子和磷酸鹽官能化的親水性光敏劑
(pTPPP)的制劑的制備說明

將Ca(NO3)2.4H2O(3mM)和(NH4)2HPO4(1.8mM)的水溶液泵送到
攪拌容器中,來制備磷酸鈣納米粒子(T.Welzel,I.Radtke,W.
Meyer-Zaika,R.Heumann和M.Epple,J.Mater.Chem.,2004,14,
2213-2217)。鈣和磷酸根溶液的pH預先用0.1N?NaOH水溶液調節到9。
混合數秒之后,用注射器取納米粒子分散體。通過以5ml∶10ml的比率
迅速混合pTPPP的鈉鹽的水溶液(30μM)與分散的磷酸鈣納米粒子,來
制備膠體。膠體分散體的最終pH在7.5和8.5之間。膠體避光儲存在
4-8℃下。通過在371,000g超速離心,將粒子與抗衡離子(NO3-,NH4+,
Na+)和未吸附的pTPPP分離。離心過的納米粒子用100ml無水乙醇洗
滌,并且在水中再分散或在空氣中干燥。所有的制備均使用超純水
(Purelab?ultra儀器,ELGA)。

通過紫外光譜法確定,在超速離心之后上清液中溶解的pTPPP的
量是大約30%,即被添加的pTPPP的總量的大約70%被吸附到磷酸鈣
表面上。通過取得合成中使用的卟啉、鈣和磷酸根的量,如下估算納
米粒子中pTPPP的含量:如果我們假定所有的鈣和磷酸根都作為羥磷
灰石即Ca5(PO4)3OH從溶液沉淀出來,則固相中pTPPP的最大含量是
大約0.7×5.5重量%=3.9重量%。通過燃燒元素分析進行摻雜pTPPP
的納米粒子的元素分析,得到2.32重量%C和2.73重量%H。因為氫
還可以來自氫氧根基團以及來自被吸附的水,我們只使用碳含量,得
到所述固體中pTPPP的負載為5.2重量%。我們得出結論,即固體中
pTPPP的負載是4-5重量%左右。我們將這兩種方法之間的差異歸咎于
實驗的不確定性。

吸附性染料pTPPP和官能化的納米粒子通過NMR光譜法(Bruker?
300MHz)、ESI-MS光譜測定法(Bruker?BioTOF?III,裝備有電噴電離槍)、
X-射線粉末衍射(XRD;Siemens?D500衍射計;Cu?Kα輻射,)、
傅里葉變換紅外光譜法(FTIR;Bruker-Vortex?70儀器)和掃描電子顯微
術聯合能量分散X-射線光譜術(SEM-EDX;ESEM?Quanta?400FEG,FEI;
金-鈀[80∶20]-濺射樣品;EDX檢測器:S-UTW-Si(Li))表征。用Zetasizer?
nanoseries(Malvern?Nano-ZS,激光器:λ=532nm)儀器執行動態光散射
(DLS)和ζ電位的測定。使用裝備有二極管陣列多色儀和75W氙燈的
J&M熒光分光光度計(Analytische?Mess-und?Regeltechnik?FL3095-500),
在室溫下測量發射光譜和激發光譜。將發射光譜針對檢測器靈敏度進
行校正,以及將激發光譜針對激發光的強度進行校正。用Varian?Cary?
WinUV分光光度計在1cm石英比色杯中記錄紫外-可見光吸收譜。

掃描電子顯微術顯示出近似球狀的納米粒子(圖3-1)。

在410nm激發波長處,分散的膠體的發射光譜包含在653nm處的
強譜帶,該譜帶的肩峰在705nm處(圖3-2)。在pH?7.4,pTPPP的部分
質子化形式在發射光譜中在650nm和712nm處顯示兩條強譜帶。將該
光譜與分散的納米粒子的發射光譜相比。在分散的納米粒子的情況下,
觀察到在705nm處的寬的肩峰而不是在712nm處的強峰。分散的納米
粒子的吸收和發射光譜中觀察到的光譜改變可能是由pTPPP與磷酸鈣
表面的靜電相互作用所引起的。還測量了離心過的(無溶劑,即固
體)pTPPP官能化的磷酸鈣納米粒子的發射光譜。粒子在近紫外區在
306nm處被激發(圖3-3)。發射光譜顯示在472nm和597nm處的兩個強
峰,這與固體卟啉符合良好。

從圖3-2和3-3明顯看出,負載pTPPP的納米粒子顯示出可以用
于它們的體內檢測的熒光信號。

實施例4-實施例1的制劑(具有光敏劑mTHPP)在HT29腫瘤細
胞系上的細胞試驗

根據以下程序進行細胞試驗:

在人類結腸惡性腺瘤細胞系HT29中確定光敏活性。HT29細胞系
生長在補充有的10%熱滅活的胎牛血清(FCS,cc-pro?GmbH)、1%青霉
素(10000IU)和鏈霉素(10,000μg?ml-1,cc-pro?GmbH)的DMEM(cc-pro?
GmbH)中。細胞在加濕的溫育箱(含5%CO2的空氣,37℃)中保持單層
培養物。

納米粒子制劑的儲液在暗處和4℃下保存。在沒有酚紅但補充了
10%FCS的RPMI?1640培養基中進行進一步稀釋,分別達到最終的光
敏劑濃度為2μM或10μM。

將2×104個細胞/毫升接種在微孔板中(2×105個細胞/孔)。細胞用含
有10%FCS和2μM或10μM光敏劑的新鮮培養基(沒有酚紅的RPMI)
溫育24小時,然后暴露于光下。在光敏化作用之前,洗滌細胞,用沒
有酚紅和10%FCS的RPMI溫育,然后在室溫下用652nm二極管激光
器(Ceralas?PDT?652,biolitec?AG)以100mW?cm-2(50J?cm-2)的固定注量
率進行輻照。輻照后,細胞在加濕的溫育箱(含5%CO2的空氣,37℃)
中溫育24小時,直至進行細胞活力測定。

細胞活力通過XTT測定進行評價。將500mg?XTT(3′-[苯基-氨基羰
基)-3,4-四唑]-雙(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸鈉,Applichem?GmbH)溶解
在500ml?PBS-緩沖液(沒有Ca2+和Mg2)并無菌過濾。將溶液在-20℃在
暗處儲存直到使用。需要包含PMS(N-甲基二苯并吡嗪甲基硫酸酯,
Applichem?GmbH)的無菌溶液作為XTT的活化試劑。將0.383mg?PMS
溶解于1ml?PBS-緩沖液中。該溶液應該冷凍儲存并且不應該暴露于光
下。XTT試劑溶液在37℃水浴中解凍,在使用之前立即添加活化溶液
(PMS)。為了制備用于一個微孔板(96孔)的足夠反應溶液,將0.1ml活
化溶液(PMS)給到5ml?XTT試劑中。微孔板中的培養基用沒有酚紅和
10%FCS的新鮮RPMI(100μl)更換,然后每孔添加50μl?XTT反應溶液。
微孔板在37℃和5%CO2條件下溫育2-3小時,直到形成橙色染料。溫
和地搖動微孔板,以將所述染料均勻地分布到孔中。

用分光光度計(Tecan?Infinite?200,Tecan?Group?Ltd.)在490nm波長
測量樣品的吸光度。為了測量參比吸光度(以測量非特異性讀數),使用
630-690nm波長。

實施例5-實施例2的制劑(具有光敏劑MB)在細菌細胞培養物上
的細胞試驗

根據以下程序實施細胞試驗:

用于我們的研究的菌株是革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌
DSM1104(ATCC?25923)和銅綠假單胞菌DSM1117(ATCC?27853)。該菌
株的細胞在37℃在胰酶大豆肉湯(Merck?KGaA?Darmstadt,德國)中有氧
生長過夜。通過離心和再懸浮在無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中,收獲細
胞。在600nm、1cm路徑長度下的最終OD(光密度)是0.015。將等份(190
μl)的細菌懸浮液放置在具有透明底的無菌黑色96-孔板(Costar?3603,
Corning?Inc.,USA)中。添加10μl的基于磷酸鈣納米粒子的亞甲基藍制
劑。將板在室溫下在暗處溫育30分鐘。溫育之后,將樣品通過光纖維
從板底部暴露于665nm二極管激光器(Ceralas?PDT,biolitec?AG,德國)發
出的光下,該激光器功率設置為0.55W,照射時間100秒。這些設置的
注量率是大約1W?cm-2(用Optometer?P-9710,Gigahertz-Optik?GmbH,
Puchheim,德國,測得)。使用這一照射時間,所產生的能量注量是大
約100J?cm-2。對照孔含有10μl?PBS而不是亞甲基藍制劑,并且沒有
暴露于激光下。用于暗毒性的對照樣品包含亞甲基藍制劑,但是沒有
暴露于激光下。光照后,從板的孔中取出樣品,用胰酶大豆肉湯稀釋
并使用螺旋接種儀Eddy?Jet(iul?Instruments,Barcelona,西班牙)在胰酶
大豆瓊脂平板上鋪板。在充分溫育之后,使用菌落計數器Countermat?
Flash(iul?Instruments,Barcelona,西班牙)計算集群形成單位數(CFU?
ml-1)。

該試驗的結果顯示在圖5中。通過PDT治療發現殺滅效應為大約
90%。

實施例6-實施例1b的制劑(具有光敏劑mTHPP)在細菌細胞培
養物上的細胞試驗

對于本試驗,使用CMC/PEI官能化的磷酸鈣粒子。

除了溫育時間分別是30分鐘和90分鐘以外,根據實施例5提供
的程序進行試驗。

本試驗的結果顯示在圖6中。發現PDT治療針對革蘭氏陽性和革
蘭氏陰性菌株的殺滅效應均為大約98到100%。

實施例7-實施例3的制劑(具有光敏劑mTPPP)和純光敏劑
pTPPP在HT29腫瘤細胞系上的細胞試驗

本試驗按照實施例4提供的程序實施。調節純光敏劑溶液的濃度,
使得等于納米粒子中所包含的量。

從圖7明顯看出,光敏劑pTPPP如果在水溶液中被應用于HT29
細胞培養物,則不顯示光動力活性。另一方面,如果所述光敏劑在磷
酸鈣納米粒子制劑中被應用,它在10μM的濃度下顯示出非常強的光
毒性。

在參考附圖描述了本發明的優選實施方案的情況下,要了解,本
發明不局限于精確的實施方案,本技術領域的技術人員可以在其中實
施各種各樣的改變和修改而不背離權利要求書中所限定的本發明的范
圍或精神。

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