鬼佬大哥大
  • / 203
  • 下載費用:30 金幣  

基因沉默治療劑的脂質體有效遞送方法和組合物.pdf

摘要
申請專利號:

CN200980148321.3

申請日:

2009.10.16

公開號:

CN102231979B

公開日:

2014.10.29

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效號牌文件類型代碼:1604號牌文件序號:101152731771IPC(主分類):A61K 9/127專利申請號:2009801483213申請日:20091016|||公開
IPC分類號: A61K9/127 主分類號: A61K9/127
申請人: 瑪瑞納生物技術有限公司
發明人: 巴里·A·波利斯基; 羅格·C·阿達米; 邁克爾·V·滕普林; 皮埃羅·哈維; 雷切爾·E·約翰斯; 賈亞·S·吉亞納尼; 邁克爾·E·休斯頓
地址: 美國華盛頓
優先權: 2008.10.16 US 61/106,062; 2009.04.07 US 61/167,379
專利代理機構: 隆天國際知識產權代理有限公司 72003 代理人: 吳小瑛;任曉華
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN200980148321.3

授權公告號:

102231979B||||||

法律狀態公告日:

2014.10.29|||2011.12.14|||2011.11.02

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明提供了通過使活性劑的含水溶液與處于有機溶劑中的含有一種或多種DILA2氨基酸化合物或脂質的脂質體形成組分的溶液接觸以形成撞擊流體而制備的治療物的脂質體遞送的方法和組合物。本發明提供了包括使用流速、pH和溫育時間控制用于治療應用的脂質體組分的形成的方法。可以收集所述撞擊流體并溫育以制備包裹所述活性劑的脂質體制劑。所述組合物可以用緩沖液淬火并通過切向流和滲濾以及用于形成藥物組合物的其它方式過濾。本發明提供了遞送藥物負載的有效性。組合物可以包含含有一種或多種載體顆粒的脂質體,其中每一種載體顆粒均具有活性劑和肽,其中所述肽的質量和脂質體的質量之和與所述活性劑質量之比小于約15。

權利要求書

1.一種制備包含活性劑的組合物的方法,所述方法包括:
a)提供第一流體,所述第一流體包含活性劑的含水緩沖溶液;
b)提供第二流體,所述第二流體包含處于有機溶劑中的一種或多種脂質
體形成化合物的非水溶液;
c)使所述第一流體與所述第二流體撞擊,由此形成所述有機溶劑濃度為
約20%至約50%v/v且pH為約6至約7.4的撞擊流體;
d)在收集容器中于約20℃至約35℃的溫度下溫育所述撞擊流體約0.5小
時至約8小時,由此形成含有脂質體的溫育物。
2.如權利要求1所述的方法,其進一步包括通過向所述溫育物中加入足
以使所述有機溶劑的濃度小于約20%v/v的緩沖劑而使所述溫育物淬火。
3.如權利要求1所述的方法,其中,所述脂質體形成化合物為一種或多
種DILA2氨基酸化合物。
4.如權利要求1所述的方法,其中,所述脂質體形成化合物中的一種為
PONA,即C18:1-正Arg-C16。
5.如權利要求1所述的方法,其進一步包括使所述第一流體的體積流率
是所述第二流體的體積流率的兩倍或更高。
6.如權利要求1所述的方法,其進一步包括使所述第一流體的體積流率
是所述第二流體的體積流率的三倍或更高。
7.如權利要求1所述的方法,其進一步包括使所述第一流體的體積流率
是所述第二流體的體積流率的五倍或更高。
8.如權利要求1所述的方法,其進一步包括將所述撞擊流體的pH調節為
約3至約6。
9.如權利要求1所述的方法,其進一步包括在約3至約6的pH下溫育。
10.如權利要求1所述的方法,其進一步包括向所述收集容器加入緩沖劑
以調節所述有機溶劑的濃度。
11.如權利要求1所述的方法,其進一步包括所述活性劑以大于約50%的
水平被包裹在脂質體中。
12.如權利要求1所述的方法,其進一步包括所述活性劑以大于約70%的
水平被包裹在脂質體中。
13.如權利要求1所述的方法,其中,所述活性劑為基因沉默劑、基因調
節劑、反義試劑、肽核酸試劑、核酶試劑、RNA試劑或DNA試劑。
14.如權利要求1所述的方法,其中,所述活性劑為UsiRNA。
15.如權利要求1所述的方法,其中,所述活性劑為藥物化合物。
16.如權利要求1所述的方法,其中,所述脂質體組合物在45℃的溫度下
保持基因沉默活性達7天。
17.如權利要求1所述的方法,其中,所述脂質體組合物在45℃的溫度下
保持包裹所述活性劑達7天。
18.如權利要求1所述的方法,其中,在切向流過濾后,所述脂質體尺寸
均一,其直徑小于約160nm。
19.如權利要求1所述的方法,其中,在切向流過濾后,所述脂質體尺寸
均一,其平均直徑為約40nm至約160nm。
20.如權利要求1所述的方法,其中,在切向流過濾后,所述脂質體尺寸
均一,其平均直徑為約80nm至約150nm。
21.如權利要求1所述的方法,其進一步包括通過切向流過濾和滲濾過濾
所述溫育物。
22.如權利要求1所述的方法,其進一步包括對所述溫育物進行滅菌。
23.如權利要求1所述的方法,其進一步包括用不同的藥學上可接受的緩
沖劑交換所述有機溶劑。
24.如權利要求1所述的方法,其進一步包括向所述第一流體中加入有機
溶劑使其濃度為約1%至約40%v/v。
25.如權利要求1所述的方法,其中,所述有機溶劑為(C1-6)烷醇濃度為
約40%至約99%v/v的注射用無菌水溶液。
26.如權利要求1所述的方法,其中,所述有機溶劑為(C1-6)烷醇濃度為
約70%至約95%v/v的注射用無菌水溶液。
27.如權利要求1所述的方法,其中,所述溫育時間為約1小時至約4小時。
28.由權利要求1-27中任一項所述的方法制備的藥物組合物。
29.一種向生物細胞遞送治療性核酸的方法,其包括根據權利要求1-27
中任一項所述的方法制備組合物和用所述組合物處理所述細胞。
30.一種抑制生物細胞中基因表達的方法,其包括根據權利要求1-27中
任一項所述的方法制備組合物和用所述組合物處理所述細胞。
31.一種抑制哺乳動物中基因表達的方法,其包括根據權利要求1-27中
任一項所述的方法制備組合物和向所述哺乳動物施用所述組合物。
32.一種治療人的疾病的方法,其包括根據權利要求1-27中任一項所述
的方法制備組合物并向所述人施用所述組合物,其中所述疾病為癌、膀胱癌、
肝癌、肝病、高膽固醇血癥、炎癥性疾病、代謝疾病、炎癥、關節炎、類風
濕關節炎、腦炎、骨折、心臟病和病毒性疾病。
33.根據權利要求1-27中任一項所述的方法制備的組合物用于治療疾病
的應用,其中所述疾病包括癌、膀胱癌、肝癌、肝病、高膽固醇血癥、炎癥
性疾病、代謝疾病、炎癥、關節炎、類風濕關節炎、腦炎、骨折、心臟病和
病毒性疾病。
34.根據權利要求1-27中任一項所述的方法制備的組合物在制備治療疾
病的藥物中的應用,其中所述疾病包括癌、膀胱癌、肝癌、肝病、高膽固醇
血癥、炎癥性疾病、代謝疾病、炎癥、關節炎、類風濕關節炎、腦炎、骨折、
心臟病和病毒性疾病。
35.一種包含脂質體的組合物,所述脂質體含有一種或多種載體顆粒,
每種載體顆粒均包含活性核酸試劑和肽,其中,所述肽的質量和所述脂質體
的質量之和與所述核酸試劑的質量的比值小于約15。
36.如權利要求35所述的組合物,其中,所述肽的質量和所述脂質體的
質量之和與所述核酸試劑的質量的比值小于約12。
37.如權利要求35所述的組合物,其中,所述肽的質量和所述脂質體的
質量之和與所述核酸試劑的質量的比值小于約10。
38.如權利要求35所述的組合物,其中,所述肽的質量和所述脂質體的
質量之和與所述核酸試劑的質量的比值小于約9。
39.如權利要求35所述的組合物,其中,所述肽的質量和所述脂質體的
質量之和與所述核酸試劑的質量的比值小于約8。
40.如權利要求35所述的組合物,其中,所述肽的質量和所述脂質體的
質量之和與所述核酸試劑的質量的比值小于約5。
41.如權利要求35所述的組合物,其中,所述組合物在體內用于ApoB基
因沉默的敲減活性為50%或更高。
42.如權利要求35所述的組合物,其中,所述組合物在體內用于ApoB基
因沉默的敲減活性為70%或更高。
43.如權利要求35所述的組合物,其中,所述組合物在體內用于ApoB基
因沉默的敲減活性為90%或更高。
44.如權利要求35所述的組合物,其中,所述組合物包含含有氨基酸脂
質的脂質體。
45.如權利要求35所述的組合物,其中,所述組合物包含帶電荷的載體
顆粒。
46.如權利要求35所述的組合物,其中,所述組合物包含帶負電荷的載
體顆粒。
47.如權利要求35所述的組合物,其中,所述組合物包含帶正電荷的載
體顆粒。
48.如權利要求35所述的組合物,其中,所述活性核酸試劑為RNAi誘導
劑或反義試劑。
49.如權利要求35所述的組合物,其中,所述活性核酸試劑為RNAi誘導
劑或反義試劑,各個脂質體均含有500或更多拷貝的所述活性劑分子。
50.如權利要求35所述的組合物,其中,所述活性核酸試劑為RNAi誘導
劑或反義試劑,各個脂質體均含有1000或更多拷貝的所述活性劑分子。
51.如權利要求35所述的組合物,其中,所述活性核酸試劑為RNAi誘導
劑或反義試劑,各個脂質體均含有5000或更多拷貝的所述活性劑分子。
52.如權利要求35所述的組合物,其中,所述肽為可切割的肽。
53.如權利要求35所述的組合物,其中,所述肽為可交聯的肽。
54.如權利要求35所述的組合物,其中,所述肽為具有SEQ?ID?NO:373
的PN4110。
55.如權利要求35所述的組合物,其中,所述肽為具有SEQ?ID?NO:375
的PN183。
56.一種向細胞遞送活性核酸試劑的方法,所述方法包括制備權利要求
35-55中任一項所述的組合物和用所述組合物處理細胞。
57.一種抑制細胞中基因表達的方法,所述方法包括制備權利要求35-55
中任一項所述的組合物和用所述組合物處理細胞。
58.一種抑制哺乳動物體內基因表達的方法,所述方法包括制備權利要
求35-55中任一項所述的組合物和向所述哺乳動物施用所述組合物。
59.一種治療人的疾病的方法,其中,所述疾病選自包括類風濕性關節
炎的炎癥性疾病,包括高膽固醇血癥的代謝性疾病,肝病,腦炎,骨折,心
臟病,包括肝炎和流感的病毒性疾病,以及癌癥,所述方法包括制備權利要
求35-55中任一項所述的組合物和向所述人施用所述組合物。
60.權利要求35-55中任一項所述的組合物在制備用于治療疾病的藥物
中的應用,所述疾病包括包括類風濕性關節炎的炎癥性疾病,包括高膽固醇
血癥的代謝性疾病,肝病,腦炎,骨折,心臟病,包括肝炎和流感的病毒性
疾病,以及癌癥。
61.權利要求35-55中任一項所述的組合物用于治療疾病的應用,所述疾
病選自包括類風濕性關節炎的炎癥性疾病,包括高膽固醇血癥的代謝性疾病,
肝病,腦炎,骨折,心臟病,包括肝炎和流感的病毒性疾病,以及癌癥。

說明書

基因沉默治療劑的脂質體有效遞送方法和組合物

技術領域

本發明整體上涉及用于遞送生物活性劑和藥物試劑的方法、組合物和應
用。本發明的方法和組合物可用于將治療劑遞送至所選的細胞、組織、器官
或受治療者。本發明的實施方式可以提供包括核酸試劑在內的藥物和治療劑
的遞送以及制備物質并利用其進行藥物遞送的方法。特別地,本發明涉及方
法和包含脂質體或層狀囊泡的組合物,和其它形式的遞送增強組合物和制劑,
以及治療方法和這些遞送物質的應用。

序列表

本申請包含在此通過EFS-Web作為2009年10月14日創建的名為
MD-08-16PCT.txt的ASCII文件提交的序列表,其大小為99,662字節,通過
引用整體并入本文。

背景技術

治療性化合物向受治療者的遞送會因為受限于化合物到達靶細胞或組織
的能力或受限于細胞內化合物的進入或通行而受到阻礙。治療性物質的遞送
通常受限于細胞膜。針對遞送的這些屏障和限制可能導致需要使用比實現預
期結果更高的化合物濃度,這樣就帶來了毒性作用和副作用的風險。

某些治療性化合物的遞送的再一個制約是需要保護化合物在運輸過程中
免受降解。特別地,通過血液循環的全身遞送可使所述化合物經受多種蛋白、
酶以及免疫學成分和因子。

一種遞送策略是利用天然或合成的親脂性載體分子或聚合物載體分子來
改善化合物向細胞內的運輸。這些物質可以充分利用為選擇性進入細胞同時
仍排除外源分子(如核酸和蛋白)而存在的機制。例如,陽離子脂質可以與藥
物試劑相互作用,并與細胞膜接觸。還可以將某些天然的和合成的親脂性分
子并入(organize)作為藥物試劑載體的脂質體或顆粒。納米或亞微尺寸的脂質
體可以充分利用為選擇性進入細胞而存在的機制,例如細胞內吞作用。脂質
體藥物載體可以保護藥物分子免受降解,同時改善細胞對其的攝取。而且,
脂質體藥物載體可以通過靜電和其它相互作用包裹或結合某些化合物,并可
以與帶負電荷的細胞膜相互作用以啟動跨膜運輸。

脂質體的缺點是治療性脂質體制劑的生物學活性通常依賴于進入脂質體
中的活性劑荷載程度。通常,期望高程度的荷載以提供高的治療活性。此外,
脂質體的荷載還需要保持在制劑內的額外的載體分子。

脂質體用于藥物試劑遞送的另一個制約在于使用脂質體增加了遞送制劑
的質量。治療性制劑的生物學活性及其相對毒性將受到諸如用于制備制劑的
親脂性分子和載體之類的其它組分的性質和質量的影響。用于遞送活性劑的
常規基于脂質的脂質體制劑可具有脂質分子的質量與活性劑的質量比值高
10至15倍率。通常,脂質或載體與活性劑的較低比率更有效并被人所期望。
對于用于核酸試劑的此脂質體制劑,每個脂質體可以包含不高于數百拷貝的
核酸試劑分子。

其中,對調節性RNA的了解和RNA干擾(RNAi)、RNAi治療、RNA藥
物、反義治療和基因治療的開發已經加大了對將活性核酸試劑引入細胞的有
效手段的需求。通常,核酸在細胞或血漿內僅保持穩定有限的時間。但是,
基于核酸的試劑能夠在隨后可以被分散以用于細胞遞送的組合物和制劑中保
持穩定。

需要用于全身和局部遞送藥物和生物學活性分子的方法、組合物和應用。
其中,需要用于制備并使用提高了生物活性治療分子的遞送效率的遞送結構
和載體(包括脂質體形式)的方法。期望利用數量降低的載體物質,尤其對于
脂質體制劑、基因沉默治療劑和其它制劑,產生高效遞送和高生物活性。

發明內容

本發明提供了用于細胞內和體內遞送最終作為治療劑的藥物試劑的新型
方法、組合物和制劑,其通常維持細胞保護作用且相對低毒。本發明的方法
和組合物可用于將藥物試劑遞送至所選的細胞、組織和器官。

在一些方面,本發明提供了向細胞遞送活性核酸試劑或分子的過程、組
合物和方法。所述活性劑可以或者通過藥物作用或者通過產生RNA干擾或
反義或核酶作用的應答,而產生治療或藥理作用。本發明的活性劑可用于調
節基因表達或用于基因治療。

本發明的實施方式提供了用于制備包括含有一種或多種活性劑的脂質體
組合物在內的組合物的多種方法,所述方法通過提供包含活性劑的含水緩沖
溶液的第一流體,提供包含處于有機溶劑中的一種或多種脂質體形成化合物
的非水溶液的第二流體,使第一流體與第二流體撞擊,由此形成所述有機溶
劑濃度為約20%至約50%v/v的撞擊流體(impinging?stream)。所述撞擊流體
的pH可以為約6至約7.4。所述撞擊流體可以在收集容器中于約20℃至約
35℃的溫度下溫育約0.5小時至約8小時,由此形成含有脂質體的溫育物。

在某些實施方式中,用于制備包含一種或多種活性劑的組合物的方法可
以包括,通過向所述溫育物中加入足以使所述有機溶劑的濃度小于約20%v/v
的緩沖劑而使所述溫育物淬火。

在一些方面,本發明的脂質體形成化合物可以為一種或多種DILA2氨基
酸化合物。DILA2氨基酸化合物是含有可以形成脂質體的氨基酸基團的合成
有機化合物。DILA2氨基酸化合物可以在所述氨基酸基團的N-末端或C-末
端或上述兩端含有遞送增強尾或親脂性尾。

在一些變式中,用于制備含有一種或多種活性劑的組合物的方法可以進
一步包括使含有所述活性劑的第一流體的體積流率是含有脂質體形成分子的
第二流體的體積流率的兩倍或更高。在某些變式中,第一流體的體積流率是
第二流體的體積流率的三倍或更高,或者是第二流體的體積流率的五倍或更
高。

本發明的活性劑可以是UsiRNA、含核酸的試劑、基因沉默劑、基因調
節劑、反義試劑、肽核酸試劑、核酶試劑、RNA試劑或DNA試劑。在一些
實施方式中,所述活性劑可以是藥物化合物或小分子藥物。

用于制備含有一種或多種活性劑的脂質體組合物的方法可以進一步包括
向收集容器中加入緩沖劑以調節所述有機溶劑的濃度。所述撞擊流體的pH
經調節可以為約3至約6。所述溫育步驟可以在pH為約3至約6下進行。

在某些方面,所述活性劑可以以大于約50%、或大于約70%的水平被包
裹在脂質體中。

在一些方面,本發明可以提供在45℃的溫度下保持基因沉默活性達7天
的脂質體組合物。在某些方面,所述脂質體組合物可以在45℃的溫度下保持
包裹活性劑達7天。

本發明的方法可以包括通過切向流過濾和滲濾而過濾所述溫育物。在切
向流過濾后,所述脂質體尺寸均一,其直徑可以小于約160nm,或者平均直
徑可以為約40nm至約160nm,或約80nm至約150nm。在進一步的實施方
式中,所述溫育物可以經滅菌,且所述有機溶劑可以用不同的藥學上可接受
的緩沖劑交換。

在本發明的某些方法中,可以通過切向過濾和滲濾而對溫育物進行過濾。
在某些實施方式中,所述溫育物可以經過滅菌。

本發明的方法可以包括向第一流體中加入有機溶劑使其濃度為約1%至
約40%v/v。

所述有機溶劑可以為(C1-6)烷醇濃度為約40%至約99%v/v或約70%至
約95%的無菌注射水溶液。

本發明的方法的溫育時長可以為約1小時至約4小時。

本發明進一步涉及通過本發明方法的任一變式制備的藥物組合物。

總的來說,本發明包括用于向生物細胞遞送治療性核酸的方法。

在一些實施方式中,本發明提供了通過根據本發明方法制備組合物并用
所述組合物處理細胞而抑制生物細胞中的基因表達的方法。

本文公開的抑制哺乳動物中基因表達的方法包括根據本發明方法制備組
合物并向所述哺乳動物施用所述組合物。

本發明的實施方式可進一步提供通過根據本發明方法制備組合物并向人
施用所述組合物而治療人類疾病的方法,其中所述疾病為癌、膀胱癌、肝癌、
肝病、高膽固醇血癥、炎癥性疾病、代謝疾病、炎癥、關節炎、類風濕關節
炎、腦炎、骨折、心臟病和病毒性疾病。

本發明進一步涉及治療疾病的組合物的應用和組合物在制備用于治療疾
病的藥物中的應用。

本發明提供了用于向細胞遞送生物試劑的多種組合物和制劑。更特別地,
在某些方面,本發明提供了大小為納米級的脂質體制劑和載體顆粒。所述載
體顆粒可以被荷載在脂質體內,在遞送中可以顯示提高的穩定性,并且可以
有效地遞送藥物試劑以調節基因表達或活性。

本發明提供了用于改善藥物和生物活性分子的全身和局部遞送的組合
物、方法和應用。特別地,本申請還提供了用于制備和使用可以以提高的遞
送效率在細胞內遞送活性劑的遞送結構和載體的新型組合物和方法。

在一些實施方式中,本發明提供了包含脂質體的組合物,所述脂質體含
有一種或多種載體顆粒,每種載體顆粒都含有活性核酸試劑和肽其中,所述
肽的質量和所述脂質體的質量之和與所述核酸試劑的質量的比率小于約15,
或者小于約12,或者小于約10,或者小于約9,或者小于約8,或者小于約
5.

在某些實施方式中,本發明提供了在體內用于ApoB基因沉默的敲減活
性為50%或更高、或70%或更高、或者90%或更高的組合物。

在一些變式中,本發明的組合物可以包含含有氨基酸脂質的脂質體。

在某些方面,本發明的組合物可以包含帶電荷的載體顆粒、帶負電荷的
載體顆粒或者帶正電荷的載體顆粒。

在某些變式中,所述活性核酸試劑可以為RNAi誘導劑或反義試劑。每
種脂質體均可以包含500或更高拷貝、或者1000或更高拷貝、或者5000或
更高拷貝的活性劑分子。

在一些變式中,用于載體顆粒的肽可以為可切割的肽或者可交聯的肽。
在一些實施方式中,所述肽是PN4110或PN183。

本發明提供了用于向細胞遞送活性核酸試劑的方法,所述方法包括制備
脂質體組合物并用所述組合物處理所述細胞。

在某些方面,本發明提供了用于抑制細胞中基因表達的方法,所述方法
包括制備脂質體組合物并用所述組合物處理所述細胞。

在某些方面,本發明提供了用于抑制哺乳動物中基因表達的方法,所述
方法包括制備脂質體組合物并向所述哺乳動物施用所述組合物。

在一些實施方式中,本發明提供了治療人類疾病的方法,所述疾病選自
包括類風濕性關節炎的炎癥性疾病,包括高膽固醇血癥的代謝性疾病,肝病,
腦炎,骨折,心臟病,包括肝炎和流感的病毒性疾病以及癌癥,該方法包括
制備脂質體組合物并向人類施用該組合物。

在某些實施方式中,本發明提供了脂質體組合物在制備用于治療疾病的
藥物中的應用,所述疾病包括包括類風濕性關節炎的炎癥性疾病,包括高膽
固醇血癥的代謝性疾病,肝病,腦炎,骨折,心臟病,包括肝炎和流感的病
毒性疾病以及癌癥。

在某些變式中,本發明提供了脂質體組合物用于治療疾病的應用,所述
疾病包括包括類風濕性關節炎的炎癥性疾病,包括高膽固醇血癥的代謝性疾
病,肝病,腦炎,骨折,心臟病,包括肝炎和流感的病毒性疾病以及癌癥。

本發明的該發明內容和具體實施方式以及附圖、所附實施例和權利要求
書整體上都作為本發明的公開內容。

附圖說明

圖1:本發明的脂質體實施方式的示意圖,其中某些脂質體形成化合物
形成了雙層囊泡10。在該實施方式中,所述脂質體的外層受到與一種脂質體
形成分子的頭部基團連接的聚乙二醇鏈20的保護。脂質體外層還有特異性靶
向細胞或組織的配體30。在該實施方式中,所述脂質體囊泡包含活性干擾性
RNA組分的負載,其包括縮合的RNA納米顆粒40、雙鏈RNA雙螺旋肽共
軛物50、三鏈mdRNA?60、切丁酶底物RNA?70、具有長突出端80的dsRNA
和具有平末端90的siRNA,這些組分并入本實施方式中。

圖2:用于制備本發明的脂質體組合物的某些實施方式的流程圖。分別
制備包括活性劑溶液、緩沖溶液和一種或多種脂質體形成化合物的溶液的試
劑溶液并放置于容器200中。使活性劑溶液和脂質體形成化合物的溶液在撞
擊流體210中接觸。將撞擊流體收集在收集容器220中。將所收集的物質置
于所述容器中進行溫育過程230,該步驟之后通過淬火240使所述物質穩定。
使淬火的物質進行過濾過程250。濾液輸出物260繼續進行整理(finishing)過
程。

圖3:用于整理本發明的脂質體組合物的某些實施方式的流程圖。所述
脂質體組合物(可以為來自脂質體組合物的制備的濾液輸出物)經滅菌300。用
于運載經滅菌的組合物的器皿在310填裝并在320整理,之后在330冷凍所
述無菌組合物并在340儲藏。將最終的組合物進行運輸350以備使用。

圖4:用于制備本發明的脂質體組合物的某些實施方式的流程圖。將活
性劑溶液維持在容器400中。將含有脂質體形成組分(例如DILA2化合物或
脂質體)的溶液維持在獨立的容器410中。將緩沖溶液維持在另一個容器420
中。利用獨立的蠕動泵430以獨立選擇的流速抽吸溶液。所述溶液可以任選
流過串聯濾器或者在裝入容器前過濾。在撞擊過程中,所述活性劑溶液與含
有脂質體形成組分的溶液在接觸點434接觸。所述撞擊流體可以任選流過一
個或多個混合管436。所述撞擊流體進入收集容器440用于溫育過程。淬火
過程緩沖溶液可以任選維持在獨立的容器450中。所述脂質體組合物460從
收集容器440流出并進入過濾過程。

圖5:用于制備本發明的脂質體組合物的某些實施方式的流程圖。將來
自收集容器的輸出460的穩定化脂質體組合物置于容器500中。將經過滲濾
的緩沖溶液維持在獨立的容器520中。蠕動泵502提供了穩定化脂質體組合
物從容器500經過含中空纖維膜的管504的循環。切向流經由該循環而發生
以通過除去濾液530而濃縮穩定化的脂質體組合物。加入來自容器520的置
換緩沖液可允許以固定或可變體積滲濾。任選地,可以利用蠕動泵506進行
穩定化脂質體組合物的滲析以驅動來自容器540的滲析緩沖溶液。特定濃度
的所述穩定化脂質體組合物被輸出550至整理過程。

圖6:圖6顯示聚精氨酸結合區與增加聚精氨酸結合區長度的dsRNA的
結合。圖6中,利用PN3499(總共含有10個精氨酸的二聚體肽)觀察到最強
的結合(具有取代SYBR-Gold染料的最佳能力)。

具體實施方式

本發明的實施方式還提供了包括核酸試劑的藥物和治療劑的遞送以及制
備物質并利用其進行藥物遞送的方法。

本發明進一步涉及可用于將各種分子和結構遞送至細胞的新型藥物遞送
增強方法和組合物。本發明提供了最終意在藥物的遞送、治療劑以及疾病和
病癥的診斷和治療、包括對受治療者基因表達或活性調控產生響應的那些疾
病和病癥的診斷和治療的多種方法、化合物、組合物、制劑和應用。更具體
地,本發明涉及方法和包含脂質體或層狀囊泡的組合物,和其它形式的遞送
增強組合物和制劑,以及這些遞送物質的治療方法和應用。

本發明的方法和組合物可進一步用于遞送治療劑、預防劑和診斷劑,如
核酸試劑、多核苷酸、肽、蛋白以及小分子化合物和藥物。

本發明的組合物和方法可用于諸如包裹在脂質體或層狀囊泡中的之類形
式的治療劑的遞送。這些形式可以包括各種直徑的納米顆粒。

其中,對調節性RNA的了解和RNA干擾(RNAi或iRNA)、RNAi治療、
RNA藥物、反義治療或核酶治療以及DNA基因治療的開發已經加大了對將
活性核酸試劑引入細胞的有效手段的需求。通常,核酸在引入至細胞或血漿
內時僅保持穩定有限的時間。但是,基于核酸的試劑能夠被穩定在組合物和
制劑中,然后所述組合物和制劑可以被施用并分散以用于細胞遞送。

核酸試劑包括含有核酸的任何分子,例如基因沉默劑、基因調節劑、反
義試劑、肽核酸試劑、核酶試劑、RNA試劑和DNA試劑。

在一些實施方式中,本發明的組合物和方法可用于遞送包裹在脂質體中
的治療劑。在這些實施方式中,治療劑可以稱作負載。

例如,圖1顯示了本發明的脂質體實施方式的示意圖,其中某些親脂性
分子形成雙層囊泡10。在該實施方式中,所述脂質體的外層受到與一種親脂
性分子的頭部基團連接的聚乙二醇鏈20的保護。脂質體外層還有特異性靶向
細胞或組織的配體30。在該實施方式中,所述脂質體囊泡包含活性RNA組
分的負載,其包括縮合的RNA納米顆粒40、雙鏈RNA雙螺旋肽共軛物50、
三鏈mdRNA?60、切丁酶底物RNA?70、具有長突出端80的dsRNA和具有平
末端90的siRNA,這些組分并入本實施方式中。其它形式的治療劑負載可
以包括微RNA、發夾RNA、DNA或核酶形式。

通常,在本發明的方法和組合物中可以使用任何活性劑作為負載。在一
些實施方式中,所述負載可以為小的有機分子藥物試劑。在某些實施方式中,
所述負載可以為帶負電荷的治療劑或中性治療劑。

本發明一些方面提供的方法和組合物可以以可釋放形式或組合物遞送治
療劑。可釋放形式和組合物包括結合并釋放活性劑的分子、結合活性劑并卸
載有助于釋放該試劑的部分(moiety)的分子、結合活性劑并隨后在生物隔室內
以有助于該試劑的釋放的方式調節的分子,以及含有與釋放介導劑化合物混
合的活性劑結合的分子的組合物。

在某些方面,本發明提供了用于制備適合遞送治療劑的脂質體組合物的
方法和儀器。在某些實施方式中,本發明的活性劑為UsiRNA。本發明的方
法可以提供核酸試劑的脂質體組合物,例如雙鏈或三鏈RNA結構、RNA肽
共軛物、縮合的RNA納米顆粒、切丁酶底物RNA、dsRNA、siRNA、微RNA、
發夾RNA和其它活性RNA形式。

本發明的活性劑可以為活性RNA試劑的肽縮合物。例如,通過縮合活
性RNA試劑和肽或其它生物分子、RNA和多聚物質的縮合物而形成的納米
顆粒可以作為負載而荷載至本發明的脂質體組合物中。所述納米顆粒可以為
交聯的。

在進一步的實施方式中,本發明的活性劑可以為肽、蛋白、蛋白酶、抗
體、單克隆抗體、基于抗體的藥物、疫苗試劑或小分子藥物。

含有活性劑的組合物可以為含水溶液。

本文使用的術語“含水溶液”是指水溶液、無菌水溶液或主體溶劑為水的
任何溶液。含水溶液可以包含,例如一些有機溶劑。

含水溶劑的實例包括水、注射用無菌水、Ringer溶液和等滲氯化鈉溶液。

含有脂質體形成分子或親脂性分子的組合物可以為非水溶液。

本文使用的術語“非水溶液”是指主體溶劑不是水的任何溶液。非水溶液
可以包含一些水。

非水溶劑的實例包括易于與水、烷醇、(C1-6)烷醇、乙醇、異丙醇、異
丁醇、仲丁醇、叔丁醇、烷醇-水、乙醇-水、乙腈、丙酮、甲酮、二甲基亞
砜、表面活性劑溶液、去污劑溶液及它們的混合物混合的有機溶劑。

用于脂質體組合物的方法

本發明的實施方式可以提供用于制備含有活性劑的含脂質體組合物的多
種方法以及藥物遞送的方法。

在一些方面,可以通過撞擊兩種組合物,例如含有一種或多種活性劑的
組合物和含有一種或多種脂質體形成分子的獨立的組合物而制備脂質體組合
物。

通常,本發明的脂質體結構在完成制備方法的所有步驟前不是以完全活
性形式構成的。本發明方法的每個步驟都需要一定的時間。通常,脂質體組
合物的形成比例將依賴于多種可變因素(例如流速、溫度、pH和各組分的濃
度)的組合的不可預測的作用。在一些實施方式中,使用溫育時間以控制形成
過程。

圖2顯示了用于制備本發明的脂質體組合物的某些實施方式的流程圖。
圖2中,單獨制備包括活性劑溶液、緩沖溶液和一種或多種脂質體形成化合
物的溶液的試劑溶液并置于溶液容器200中。所述試劑溶液可任選單獨過濾
或者在無菌條件下制備。所述活性劑溶液和脂質體形成化合物的溶液在撞擊
過程210中接觸。將撞擊流體收集在收集容器220中。將所收集的物質保持
在容器中用于溫育過程230,該步驟之后通過淬火240而使物質穩定。使淬
火的物質進行過濾過程250。移除過濾輸出物260至整理過程。

本發明包括用于制備脂質體組合物的包括撞擊過程的方法的實施方式。
撞擊過程可以具有通過使包含有活性劑的組合物與含有脂質體形成分子的組
合物撞擊而產生撞擊流體的一個或多個步驟。

在一些方面,本發明用于制備活性劑的脂質體組合物的方法可以具有溫
育過程的一個或多個步驟。溫育過程可以包括收集撞擊流體并將其保持在容
器中持續溫育時間。

本發明的實施方式可進一步包括用于制備脂質體組合物的方法,其中所
溫育的組合物被淬火。可以通過加入溶劑、緩沖劑或稀釋劑至所溫育的組合
物流體或組合物的混合物中而進行淬火。淬火可以將特定組分(例如有機溶
劑或分散劑)的濃度稀釋至預定水平以下。通常,所溫育的組合物的淬火可
以形成在進一步的過程或整理步驟中穩定的組合物。淬火的步驟是可操作的
以使所溫育的可包含脂質體結構的組合物穩定。

收集容器中撞擊流體的溫育以及方法的其它步驟可以提供其中的活性劑
被脂質體高度包裹的脂質體制劑。例如,在某些實施方式中,本發明的脂質
體組合物和結構的形成可需要撞擊、混合、稀釋、收集、溫育、調節pH、淬
火和過濾的任何步驟。

用于制備本發明的脂質體組合物的方法可以進一步包括一個或多個過濾
步驟。過濾步驟可用于改變多種過程參數,例如控制或改變組分的濃度或者
改變粒度或分散性以及其它物理溶液參數。

圖3顯示了用于整理本發明的脂質體組合物的某些實施方式的流程圖。
參見圖3,所述脂質體組合物(可以為來自脂質體組合物的制備的濾液輸出物)
經滅菌300。用于運載無菌組合物的容器在310填裝并在320后處理,之后
在330冷凍所述無菌組合物并在340儲藏。將最終的組合物進行運輸350以
備使用。

本發明涉及物質的滅菌、填裝和整理至容器以及所形成的制劑的儲藏的
過程可以使用本領域已知的步驟和方法,例如Remington’s?Pharmaceutical?
Sciences(18th?ed.1990)中描述的那些。

用于評價脂質體的包裹、大小和一般制備的一些方法描述在,例如
WO2001005374,美國專利公開號20040142025和20070252295以及美國專
利號6,843,942。

撞擊和混合

在某些方面,本發明提供了用于制備活性劑的脂質體組合物的多種方法
和加工條件。

圖4顯示了用于制備本發明的脂質體組合物的某些實施方式的過程圖。
參見圖4,將活性劑溶液維持在容器400中。將含有脂質體形成組分(例如
DILA2氨基酸化合物或脂質體)的溶液維持在獨立的容器410中。將緩沖溶液
維持在另一個容器420中。利用獨立的蠕動泵430以獨立選擇的流速經由轉
移管402抽吸溶液。所述溶液可以任選流過串聯濾器或者在裝入相應容器前
過濾。在撞擊過程中,所述活性劑溶液可以在接觸點434與含有脂質體形成
組分的溶液接觸。所述接觸點可以為任何形狀、角度、方向或尺寸。所述撞
擊流體可以任選流過一個或多個湍動的混合管436。所述撞擊流體進入收集
容器440。所述緩沖溶液可以從容器420泵入至收集容器440中。在收集容
器440中收集的混合物可以在溫育過程中持續一段時間。淬火過程緩沖溶液
可以任選維持在獨立的容器450中。所述淬火脂質體組合物460從收集容器
440流出并進入過濾過程。

在某些實施方式中,容器450中的緩沖溶液可以任選地用于稀釋撞擊流
體,并且可以在收集器皿前或者在任何混合管前與撞擊流體接觸。

如上文討論的,為了形成脂質體組合物,本發明的某些過程提供了撞擊
流體,其經歷了在轉移管中并任選地在湍動混合管中混合、在器皿或容器中
收集、溫育過程和淬火。所淬火的物質被輸出以用于過濾和整理。

撞擊流體通常來自使活性劑的組合物與含有脂質體形成分子的組合物接
觸。所述撞擊流體可僅與所述組合物接觸以形成單個流體。所述撞擊流體通
常可以不提供所述組合物的完全相互分散或相互混合。在任選步驟中,可以
將撞擊流體置于湍動混合條件。

所述撞擊流體的pH可以控制在約3至約9的范圍內。在一些實施方式
中,撞擊流體的pH可以為約5至約8,或者約6至約7,或者約7.4。在某
些變式中,所述撞擊流體的pH為約3至約6。可以在撞擊流體通過轉移管轉
移的過程中或者在混合管中或者在收集容器中調節所述撞擊流體的pH。在某
些實施方式中,所述撞擊流體的起始pH為約5至約8,或者約6至約7.4,
或者在起始撞擊后調節pH至約3至約6的范圍內。在某些實施方式中,所
述撞擊流體的pH一直為約7.4。

可任選地在撞擊前過濾用于形成撞擊流體的組合物。本發明的含有一種
或多種活性劑的組合物可以通過,例如流式過濾技術以除去尺寸大于約200
納米(nm)或大于約300nm或大于約500nm的不期望的顆粒或者相而過濾。含
有多種脂質體形成分子的組合物可以通過,例如流式過濾技術以除去尺寸大
于約200nm或大于約300nm或大于約500nm的不期望的顆粒或者相而過濾。

撞擊流體的溫度可以控制在約15℃至約37℃的范圍內。

本發明的方面進一步提供了,可以利用所撞擊的組合物的流度控制所述
撞擊流體組合物。通常,各組合物將流過所選直徑的管,因此在撞擊流體中
合并的流體的相對體積流率提供了描述撞擊流體中各種組分的濃度的方式。

例如,當通過撞擊流過直徑相同的管的兩個獨立的流體而形成撞擊流體
時,所述獨立流體的流度將決定撞擊流體中組分的濃度(與初始流體中組分濃
度相比)。因此,可使用流速在用于制備具有特定性質的脂質體組合物的撞擊
流體中產生期望的組合物。

在某些實施方式中,可以使用流體的流速控制活性劑相對于脂質體形成
分子的濃度,和包括溶劑或鹽的濃度以及混合力和剪切力在內的其它參數。
本發明的實施方式包括用于制備脂質體制劑的方法,在該方法中通過調節加
工設備的流速有利地增強了活性劑的包裹和脂質體粒度。

在某些方面,本發明的方法可以采用相同直徑的管,用于使活性劑組合
物的流體與含有親脂性分子的組合物的流體撞擊。在某些變式中,所述組合
物的流速可以相同或不同。在特定的實施方式中,含有活性劑的組合物的流
速可以不等于含有親脂性分子的組合物的流速。例如,在某些實施方式中,
含有活性劑的組合物的流速可以為含有親脂性分子的組合物的流速的兩倍。
在其它變式中,含有活性劑的組合物的流速可以為含有親脂性分子的組合物
的流速的兩倍或更多,或在一些實施方式中,含有活性劑的組合物的流速可
以為含有親脂性分子的組合物的流速的三倍或更多,或者含有活性劑的組合
物的流速可以為含有親脂性分子的組合物的流速的五倍或更多。

通常,所述設備的管可以為任何直徑。在某些實施方式中,本發明的方
法可以采用不同直徑的管,用于使活性劑組合物的流體與含有脂質體形成分
子的組合物的流體撞擊。在某些變式中,所述管的直徑可以相同或不同。例
如,在某些實施方式中,容納活性劑溶液的管的直徑可以為容納親脂性分子
的溶液的管的直徑的四分之三。在其它變式中,容納活性劑溶液的管的直徑
可以為容納親脂性分子的溶液的管的直徑的二分之一。在其它變式中,容納
活性劑溶液的管的直徑可以大于容納親脂性分子的溶液的管的直徑。

在一些實施方式中,可以使用用于流通混合的某些方式使撞擊流體進一
步混合。流通混合的方式包括具有一個或多個通道、毛細管或者通過排列以
改變流向的通路的混合儀,其中所述通道、毛細管或通路可以分支并再連接
一次或多次以提供湍動混合。流通混合的方式可任選地包括機械攪拌儀、振
蕩器或攪拌棒、刀片、槳、盤或葉片。

用于湍動混合的雷諾數可以大于2000,或者大于2400。

可以通過調節撞擊流體的流速來控制湍動混合儀中混合流體的滯留時
間。在某些變式中,可以使用撞擊流體在湍動混合儀中的流速和滯留時間來
控制脂質體顆粒的分級(sizing)。

用于流通混合的湍動混合管的實例為Cole-Parmer串聯靜止混合儀
K-04669-52,316不銹鋼管混合儀;3/16″管OD,21元件。

在本發明的各方法中使用的設備的器皿、管和其它流動元件都可以由對
所用反應物和溶劑為惰性的且適合于諸如溫度和pH的反應條件的任何材料
制備。所述材料的實例包括聚合物、金屬、不銹鋼、玻璃和陶瓷。所述器皿、
管和其它流動元件還可以涂覆有惰性物質。

通常,所述器皿、管和其它流體元件與可控制各個步驟中的溶液和混合
物的流速的一個或多個可控泵流體相通。所述設備可以包括多種閥,例如用
于控制流動的檢測閥。所述器皿、管和其它流動元件可以與可包括箍或O形
環在內的多種緊固件相連。所述設備可以在流動通路的各個點具有溫度傳感
器。

本發明的方法和設備可用批次或連續過程。

收集容器、溫育過程和淬火過程

參見圖4,在一些實施方式中,所述撞擊流體進入收集容器440中。在
收集容器440中,所收集的撞擊流體進入溫育過程。

所述溫育過程可以包括混合所收集的物質的一個或多個步驟,用稀釋緩
沖液稀釋的一個或多個步驟,調節收集容器中的pH的一個或多個步驟,以
及將所收集的物質在特定溫度下保持溫育時間的一個或多個步驟。

可以利用,例如機械攪拌器、振蕩器或攪拌棒、刀片、槳、盤或葉片使
所收集的物質在收集容器中混合。

在一些變式中,可以通過使活性劑的組合物與含有脂質體形成化合物的
組合物接觸并向撞擊流體中加入緩沖劑、溶劑或稀釋劑,而形成撞擊流體。
緩沖劑、溶劑或稀釋劑的添加可以在混合或收集所述撞擊流體之前進行,或
者可以作為溫育過程的一部分而在收集容器中進行。緩沖劑、溶劑和稀釋劑
的添加降低了收集容器中的活性劑、脂質體形成分子和諸如另一種溶劑的其
它組分的濃度。

在一些實施方式中,不論是向轉移管中或是向混合管中或向收集容器中
的撞擊流體中加入緩沖劑、溶劑或稀釋劑,可以將有機溶劑的濃度稀釋至約
50%(v/v)或更低,或約40%(v/v)或更低,或約35%(v/v)或更低,或約33%(v/v)
或更低,或約30%(v/v)或更低,或約25%(v/v)或更低,或約22%(v/v)或更
低,或約20%(v/v)或更低。

在收集容器中所收集的混合物或組合物的pH可以控制在約3至約9的
范圍內。在一些實施方式中,所收集的撞擊流體的pH被調節至約5至約8
或者約6至約7.4的范圍內。在某些實施方式中,所收集的混合物的pH為約
5至約8,并且在初始撞擊后pH被調節至約3至約6的范圍內。在一些變式
中,所收集的撞擊流體的pH被維持在約7.4。本發明的脂質體組合物還可以
在其中各步驟的pH均為約7.4的方法中形成。

在一些方面,收集容器中收集的混合物或組合物經歷溫育保持期
(incubation?hold?period)。在收集容器中溫育的保持期時長可以為數分鐘至數
小時,或者約15分鐘至約8小時,或者約0.5小時至約8小時,或者約0.5
小時至約4小時,或者約1小時至約4小時,或者約1小時至約2小時。

在所述方法的變式中,湍動混合發生在用緩沖劑、溶劑或稀釋劑稀釋撞
擊流體之后,并且溫育的保持期可以為約0.5小時至約8小時,或者約1小
時至約4小時,或者約1小時至約2小時。

在某些變式中,湍動混合發生在用緩沖劑、溶劑或稀釋劑稀釋撞擊流體
之前,并且溫育的保持期可以為數分鐘至數小時,或者約15分鐘至約8小時,
或者約0.5小時至約8小時,或者約0.5小時至約4小時,或者約1小時至約
4小時,或者約1小時至約2小時。

溫育過程的溫育期的時長通常可依賴于其它過程參數,例如撞擊流的流
速以及溫度和pH。

在保持期內,在收集容器中收集的組合物的溫度可以被控制在約15℃至
約37℃,或者約22℃至約35℃。

在一些方面,可以通過快速添加緩沖劑、溶劑或稀釋劑來對溫育物淬火
而終止溫育過程。所述淬火步驟可以將有機溶劑的濃度降低至約20%(v/v)
或更低,或約15%(v/v)或更低,或約10%(v/v)或更低,或約5%(v/v)或更低。

在一些實施方式中,所述淬火過程可進一步產生含有包裹活性劑的脂質
體的穩定化脂質體組合物。

過濾和整理

如上文所討論的,在一些實施方式中,撞擊流體經歷混合、收集、溫育
過程以及淬火過程。經淬火的物質可以是穩定化的脂質體組合物,其可以被
輸出以用于過濾和整理。

圖5顯示了通過過濾和整理制備本發明的脂質體組合物的某些實施方式
的過程圖。參見圖5,將穩定化的脂質體組合物,例如經淬火的脂質體組合
物460裝載至容器500中。將滲濾緩沖溶液保持在單獨的容器520中。蠕動
泵502提供了穩定化的脂質體組合物從容器500通過含有中空纖維膜的管
504的循環。切向流過濾在經過該循環時發生以濃縮穩定化的脂質體組合物,
并且從含有中空纖維膜的管504除去濾液530。將來自容器520的置換緩沖
劑加入至所述循環中可以允許以固定或可變的體積滲濾。還可以通過加入緩
沖劑對穩定化的脂質體組合物進行稀釋,以獲得制劑中活性劑的終濃度。任
選地,可以利用蠕動泵506進行穩定化脂質體組合物的滲析以驅動來自容器
540的滲析緩沖液。特定濃度的穩定化脂質體組合物被輸出550至整理步驟。

通常,濾液530可以包含有機溶劑和未包裹的活性劑。因此,濾液的去
除可以去除并降低穩定化脂質體組合物中有機溶劑的濃度,并去除未包裹的
活性劑。

通常,經淬火的溫育物中活性劑濃度可以低于期望用于制備藥物組合物
的范圍。在一些實施方式中,經淬火的溫育物中非水溶劑的濃度可以對于制
備藥物組合物來說太高。如上文所討論的,可以通過切向流過濾和滲濾調節
這些濃度。

在一些實施方式中,經淬火的溫育物循環至中空纖維切向流過濾設備或
者筒式或盒式切向流過濾設備。在不加入緩沖劑或溶劑循環時,切向流過濾
將脂質體組合物保留在體積降低的緩沖劑或溶劑中,由此提高其濃度。

可以將類似的設備用在滲濾模式中以除去非水溶劑并用滲濾緩沖劑取代
之。在滲濾模式中,通過加入滲濾緩沖劑而將循環滯留物的體積保持基本恒
定。因此,在進入滲透時有機溶劑的濃度降低并被去除。

可以通過向滲濾步驟的滯留物中加入緩沖劑而調節活性劑的濃度,以獲
得期望的終濃度。可以隨后將濃度經過調節的滯留物提供至滅菌單元,在此
使用直流式過濾對滯留的產物溶液進行滅菌。滅菌的產物可用在無菌的裝瓶
過程,并將產品瓶儲藏在低溫。可以使用快速冷凍、凍干和低溫凍干以及其
它方式用以制備和保藏所述產品。

在某些實施方式中,為了達到期望的活性劑濃度,可以首先通過切向流
過濾,然后滲濾以除去有機溶劑,然后通過額外的切向流過濾并最后用緩沖
劑、溶劑或稀釋劑的稀釋,來濃縮經過淬火的溫育物。

Mark?C.Porter,Handbook?of?Industrial?Membrane?Technology(Noyes?
1990),第186-87頁中給出了用于過濾的方法和物質的實例。Munir?Cheryan,
Ultrafiltration?and?Microfiltration?Handbook(1998)中給出了過濾的一些方面。

活性劑的包裹

脂質體顆粒對活性劑的包裹程度通常受多個過程參數的影響。

在一些實施方式中,溫育過程后脂質體顆粒對活性劑的包裹程度為50%
或更高,或者60%或更高,或者70%或更高,或者80%或更高,或者90%或
更高,或者95%或更高,或者96%或更高,或者97%或更高,或者98%或更
高,或者99%或更高,或者基本為100%。

本發明的活性劑脂質體組合物通常包含均一尺寸的脂質體顆粒。所述脂
質體粒度直徑可以為約300nm或更低,或者約250nm或更低,或者約200nm
或更低,或者約180nm或更低,或者約160nm或更低,或者約150nm或
更低,或者約140nm或更低,或者約130nm或更低,或者約120nm或更
低,或者約110nm或更低,或者約100nm或更低,或者約90nm或更低,
或者約80nm或更低,或者約70nm或更低。

所述脂質體粒度的范圍可以為約50nm至約500nm,或者約60nm至約
400nm,或者約70nm至約300nm,或者約70nm至約200nm,或者約70nm
至約160nm,或者約80nm至約160nm。

在一些變式中,所述穩定化的脂質體組合物可以包含小于約10%的在脂
質體顆粒之外且未包裹的活性劑,或者小于約8%的未包裹的活性劑,或者
小于約5%的未包裹的活性劑,或者小于約4%的未包裹的活性劑,或者小于
約3%的未包裹的活性劑,或者小于約2%的未包裹的活性劑,或者小于約1%
的未包裹的活性劑。

穩定化脂質體組合物中活性劑的包裹水平可以為約70%至約99%,或者
約80%至約99%,或者約90%至約99%,或者約95%至約99%。穩定化脂質
體組合物中活性劑的包裹水平可以基本為100%。

基因沉默治療劑的有效遞送

本發明整體上涉及用于遞送生物活性劑和藥物試劑的新型化合物和組合
物及其方法和應用。本發明的化合物和組合物可用于向所選擇的細胞、組織、
器官或受治療者遞送治療劑。更具體地,本發明涉及包括核酸試劑在內的治
療劑的遞送,以及用于制備并使用包含肽的物質以遞送生物活性劑和藥物試
劑的方法。

本發明提供了藥物和生物學活性分子的全身和局部有效遞送的多種化合
物、組合物、方法和應用。可以通過利用包括肽在內的多種載體分子將活性
劑高程度地荷載至脂質體中而產生有效遞送。本發明的化合物和組合物可以
實現活性劑的高效遞送。

遞送效率的一種計算是遞送效率比。本文使用的遞送效率比是載體分子
的總質量與活性劑的質量的比。遞送效率比越低,與活性劑相比的載體物質
的質量越低,且潛在的不期望的毒性和副作用越低。如本文所使用的,較低
的遞送效率比更有利且更為人所期望。

本發明整體涉及用于核酸遞送的載體和制劑的領域。用于核酸的載體包
括與包括可交聯和可切割肽結構在內的肽組分形成的化合物和組合物。更具
體地,本發明提供了與核酸結合以形成復合物或縮合組合物的可交聯肽結構
和可切割肽結構。

在一些實施方式中,本發明提供了由肽和核酸形成的復合物。這些復合
物包含具有肽和核酸的復合物的核心結構和具有多個肽和核酸層的核心結
構。適合與核酸形成本發明的復合物的肽包括任意陽離子肽。

在一些方面,肽和核酸的復合物、縮合物或納米顆粒可以被荷載至脂質
體脂質中。本發明的脂質體制劑可以為生物活性劑和藥物試劑尤其是核酸試
劑提供穩定的遞送系統。

在一些方面,本發明的組合物和制劑可以提供毒性降低的生物活性。

本發明還提供了在改變基因表達或活性中使用本發明的載體、肽、核酸
構建體或與肽的復合物以及制劑(任選地與細胞靶向組分和其它藥物制劑組
分組合)的方法。

本發明提供了用于向細胞遞送生物活性劑的多種載體組合物。更具體地,
本發明提供了核酸試劑被縮合成小顆粒的大小為納米級的多種載體結構。所
述載體顆粒可以在遞送中具有提高的穩定性,并且可有效地遞送活性劑。荷
載至脂質體中的載體顆粒的制劑可以提供提高的穩定性和遞送效率。

本發明的新型化合物和組合物可以實現系列有利遞送效率比。在一些實
施方式中,本發明的組合物提供了用于RNAi誘導試劑的小于15或小于10
的遞送效率比。

本發明的組合物和方法可用于遞送治療劑、預防劑和診斷劑,例如核酸、
多核苷酸、肽、蛋白和小分子化合物和藥物。這些組合物可以包括各種直徑
的納米顆粒。

本發明提供了用于細胞內和體內遞送最終用作治療劑的通常維持細胞保
護作用且相對低毒的活性劑的新型化合物、組合物和制劑。本發明的化合物
和組合物可用于為改變疾病狀態或表型而向所選擇的細胞、組織、器官或隔
室內遞送活性劑。

在一些方面,本發明提供了向細胞遞送RNA結構以產生RNA干擾應答、
反義作用或基因組表達的調節或調整的化合物、組合物和方法。

在一些變式中,本發明提供了向細胞遞送DNA結構或含DNA的物質的
化合物、組合物和方法。

本文使用的術語“肽核酸復合物”是指與核酸結合或復合的肽。

誘導RNAi的反義試劑的有效遞送

在一些方面,本發明的組合物和方法通過提供具有高濃度或密度的活性
劑分子的載體顆粒而提供了活性劑的有效遞送。可以將載體顆粒荷載至脂質
體中以在藥物制劑中提供高濃度或密度的活性劑分子。

在某些方面,本發明的組合物和方法提供了具有多種遞送效率比的
RNAi誘導劑或反義試劑的制劑。本發明的用于RNAi誘導劑或反義試劑的
制劑的遞送效率比可以有利地為小于15,或者小于12,或者小于10,或者
小于9,或者小于8,或者小于5。

在某些實施方式中,可以利用由與陽離子肽縮合的核酸試劑組成的載體
顆粒實現有效遞送。例如,基于與核酸試劑(例如RNAi誘導劑或反義試劑)
組合的陽離子肽的電荷,所述載體顆粒可以包括其中高達6個或更多個肽結
合區可以結合至活性RNA試劑的結構。

在一些變式中,在含有由荷載至脂質體中的核酸試劑(例如RNAi誘導劑
或反義試劑)組成的載體顆粒的制劑中,脂質體的每個顆粒可以具有大于500
或者大于1,000或者大于5,000或者大于6,000或者大于7,000或者大于8,000
或者大于9,000或者大于10,000或者更多拷貝的RNAi誘導劑或反義試劑分
子。

例如,在一些方面,對于N∶P為2、密度為1g/cc、顆粒體積為1.26×106
nm3且由MW?3781.2的肽(7個凈正電荷)和MW?13,500的雙鏈RNA(40個凈
負電荷)組成的球形顆粒,顆粒質量為1.26×10-9μg,且顆粒的每個雙鏈RNA
具有11.4個肽。在該實例中,遞送效率比為肽質量與RNA質量的比,為3.2。
由RNA表示的顆粒的質量分數為0.24,顆粒中雙鏈RNA分子的數量為
13,369,每顆粒的肽分子數為1.53×105。換句話說,含有這些載體顆粒且不
含額外的載體分子的制劑遞送效率比為3.2,且基于顆粒的RNAi試劑質量分
數荷載為24%。

脂質體制劑

在一些方面,本發明的載體顆粒可以被荷載或包裹在脂質體制劑中。例
如,在一些實施方式中,載體顆粒可以被包裹在脂質體制劑中而遞送(例如美
國專利申請12/114,284所公開的)。

在某些實施方式中,與沒有本發明的肽載體顆粒組合物的RNA脂質體
制劑相比,包裹在脂質體制劑中遞送的本發明的載體顆粒的藥物制劑可以將
雙鏈RNA的負載量提高20倍。

例如,在一些實施方式中,與沒有本發明的肽載體顆粒組合物的RNA
脂質體制劑相比,包裹在脂質體制劑中遞送的本發明的載體顆粒的藥物制劑
可以將載體物質的量降低45%。

在一些實施方式中,用于RNA試劑的載體顆粒的藥物制劑包括使用肽
遞送核酸的含肽的遞送系統。該系統可以將可并入至脂質體制劑的RNA試
劑的負載量提高。利用包含肽的納米顆粒,遞送效率以及遞送系統的組織分
布型式可以增強。在一些實施方式中,所述遞送系統可以證明每個脂質體顆
粒將RNA負載量提高高達20倍,同時將載體賦形劑的總量降低約45%。在
一些變式中,例如通過ApoB的體內敲減所計算的,與沒有肽的脂質體制劑
相比,所述系統可以實現RNA試劑的30%的降低,同時在小鼠肝臟中和小
鼠空腸中維持85%的敲減。因此,本發明的載體顆粒的藥物制劑可顯著提高
RNA試劑(例如siRNA、mdRNA或反義試劑)的遞送效率。

載體納米顆粒

在一些實施方式中,可以按照2008年10月16日提交的美國專利申請
61/106,062的描述制備本發明的載體顆粒。

本發明的載體顆粒通常為均一粒度。所述載體粒度直徑可以為約300nm
或更低,或者約250nm或更低,或者約200nm或更低,或者約180nm或
更低,或者約160nm或更低,或者約150nm或更低,或者約140nm或更
低,或者約130nm或更低,或者約120nm或更低,或者約110nm或更低,
或者約100nm或更低,或者約90nm或更低,或者約80nm或更低,或者
約70nm或更低。

本發明的活性劑載體顆粒的粒度的范圍可以為,例如約50nm至約500
nm,或者約60nm至約400nm,或者約70nm至約300nm,或者約70nm
至約200nm,或者約70nm至約160nm,或者約80nm至約160nm。

在一些實施方式中,本發明的活性劑載體顆粒可以帶負電荷。例如,由
RNAi試劑和陽離子肽組成的載體顆粒可以被縮合從而使所述顆粒保留負電
荷。

在一些實施方式中,本發明的活性劑載體顆粒可以帶正電荷。例如,由
RNAi試劑和陽離子肽組成的載體顆粒可以被縮合從而使所述顆粒獲得正電
荷。

載體和肽結合區

在一些方面,可以用通過結合至生物活性核酸組分而與所述核酸縮合的
肽組分形成本發明的載體化合物和組合物,以形成納米尺寸的顆粒。

在一些實施方式中,適合本發明的載體組合物的肽描述于2008年11月
19日提交的美國專利申請61/116,258中。

在具有一個或多個結合區的肽與核酸結合時,可形成載體。

在某些變式中,肽的多于一個陽離子結合區可以與相同或不同的核酸分
子結合。

本發明的可交聯和可切割的肽構建體可以有利地具有多個陽離子殘基,
其沿著肽鏈分布在一個或多個結合區內。可以使用陽離子殘基的數量和分布
的變化而改變肽與活性劑的結合強度。

本發明的肽包括具有足以與核酸結合的正電荷的結合區和一個或多個連
接子基團的陽離子肽。本發明的肽的結合區可以具有足以與核酸結合的正電
荷。連接子基團可以彼此連接以將兩個或更多個肽交聯在單個分子內。

本發明的能夠與活性核酸試劑縮合以形成載體顆粒的肽可以具有足以與
核酸結合的正電荷和足以形成包含結合核酸的自交聯構建體的連接子基團。

本發明提供了具有足以與核酸結合的帶正電荷的殘基且能夠形成自交聯
肽的肽。

在一些實施方式中,所述生物活性劑為能夠與陽離子肽結合的核酸試劑。
核酸試劑可以結合1個、2個、3個、4個、5個或6個肽或更多肽,以形成
復合物。可以通過核酸-肽復合物的聚合和結合而形成縮合物顆粒。

在一些實施方式中,核酸試劑可以結合具有多于一個肽的部分從而使所
述肽連接多于一種核酸試劑。

可以通過混合本發明的可交聯的或可切割的肽和與所述肽結合的生物活
性劑而形成載體結構或構建體。所述肽與所述試劑的結合可以在發生所述肽
的交聯的同一時間進行,或者在所述肽被交聯前或者交聯后進行。

在一些方面,所述載體是交聯的肽構建體,其可以為肽和核酸的縮合物。
所述縮合物可以形成可以并入生物活性劑(例如核酸)的納米尺寸的載體顆
粒。

可交聯的肽

在一些實施方式中,本發明的可交聯的肽可以包含可交聯的末端殘基或
基團。

例如,可交聯的肽可以具有可以通過形成肽間二硫鍵(形成肽的二聚體)
而交聯的單個末端半胱氨酸殘基。

在一些變式中,所述肽可以包含可以交聯以形成多聚肽構建體的一個或
多個巰基基團,其中所述多聚肽構建體與生物活性劑結合并且可以為生物活
性劑的載體。

在一些實施方式中,可交聯的基團可以形成可以在低pH下被切割或者
可以被蛋白或酶作用而切割的可切割的交聯。可切割的交聯的實例包括化學
上可切割的酸不穩定交聯和酶可切割的交聯。

可交聯的基團的實例包括具有高達1000個原子、雙功能連接子、雙功能
交聯子和雜雙功能連接子的有機基團。所述可交聯的基團可以是肽殘基的取
代基或者可以連接至肽的末端。

在某些實施方式中,可交聯的肽結構包括在各個末端具有可交聯的基團
的肽。在一些變式中,可交聯的肽結構包括在各個末端具有可交聯的基團的
肽的二聚體、三聚體和多聚體。

可切割的肽

在一些方面,本發明提供了含有位于肽序列的各部分之間的內部可切割
連接子基團的可切割肽。

在一些實施方式中,可切割的肽可以具有通過可切割基團連接在一起的
兩個陽離子結合區。所述可切割基團可以被切割以使肽的多個結合區彼此分
離。

所述陽離子結合區可以與生物活性劑(例如核酸)結合。

在一些變式中,與不可切割的肽相比,所述肽的使結合區分離的連接子
基團的切割可以允許肽從生物活性劑上更快速地解離。

可以通過化學還原或者通過細胞內環境中多種蛋白或酶的作用,切割在
細胞內可切割的連接子。

縮合顆粒和可釋放的形式

本發明的化合物和組合物包括由一個或多個肽組分和一個或多個活性劑
組成的縮合物顆粒或載體。

通常,由肽和活性劑形成的縮合物顆粒可以為陰離子、中性或陽離子。
對于載體顆粒的體內遞送,可以優選中性或陽性離子形式。縮合物顆粒可以
指核心顆粒。

在一些實施方式中,可以用可交聯肽的第一部分和活性劑形成縮合物顆
粒。可以向所述顆粒中加入一個或多個額外的相同或不同可交聯肽的層。

在一些變式中,可以用可切割肽的第一部分和活性劑形成縮合物顆粒。
可以向所述顆粒中加入一個或多個額外的相同或不同可切割肽的層。

在某些實施方式中,可以用可切割肽的第一部分和活性劑形成縮合物顆
粒。可以向所述顆粒中加入一個或多個額外的可交聯肽層。

在一些變式中,可以用可交聯肽的第一部分和活性劑形成縮合物顆粒。
可以向所述顆粒中加入一個或多個額外的可切割肽層。

在一些實施方式中,可以用可交聯或可切割肽的第一部分和活性核酸劑
形成陰離子縮合物顆粒。可以向所述陰離子顆粒中加入一個或多個額外的陽
離子可交聯或可切割肽的層,以形成中性或陽離子載體顆粒。

在某些變式中,可以用可交聯或可切割肽的第一部分和活性核酸劑形成
陰離子縮合物顆粒。可以向所述陰離子顆粒中加入一個或多個額外的陽離子
可交聯或可切割肽的層,以形成中性或陽離子載體顆粒。可以向所述中性或
陽離子載體顆粒中加入一個或多個額外的陰離子溶內體(endosomolytic)化合
物的層,以形成中性或陽離子載體顆粒。

在一些方面,所述活性劑可以為一種或多種藥物化合物,一種或多種反
義試劑,一種或多種RNAi誘導劑,或者一種或多種含DNA的試劑。

在一些實施方式中,可以通過將縮合物顆粒或分層的載體顆粒荷載至陽
離子脂質體中而制備本發明的組合物或制劑。

在一些實施方式中,本發明的組合物和方法可以提供可釋放形式或組合
物的治療劑的遞送。可釋放的形式或組合物包括結合并釋放活性劑的分子、
結合活性劑并卸載有助于釋放該試劑的部分的分子、結合活性劑并隨后在生
物隔室內以有助于該試劑的釋放的方式調節的分子,以及含有與釋放介導化
合物混合的活性劑結合的分子的組合物。

本文使用的可釋放形式包括含有本發明的可交聯或可切割肽的形式,或
者含有溶內體化合物或物質的形式。

加合物或載體顆粒可以包含可切割的肽結構或基質。某些事件,例如載
體進入含有能夠切割所述肽交聯的化合物的生物環境或隔室,可以觸發肽結
構的切割。肽連接子基團的切割可以在細胞內在胞質溶膠中或在各種細胞隔
室或細胞外隔室內發生。

二硫化物肽連接子基團的切割可以通過化學發生,例如通過用三(2-羧乙
基)膦鹽酸鹽(TCEP)、二硫蘇糖醇(DTT)或巰基乙醇來還原二硫化物而進行。

在某些實施方式中,可以使用二硫化物還原酶切割肽二硫化物鍵。

一旦在細胞內,二硫化物交聯可以被還原,由此釋放用于有效遞送的活
性劑。認為內涵體的環境是還原的且介導二硫化物的還原以及活性劑的釋放。

可以通過肽交聯的斷裂或切割,以及通過生物活性劑從所述肽的解離而
在細胞內發生釋放。

本發明的肽和肽構建體可有利地包含1個、2個或更多個具有1個或多
個帶正電荷的氨基酸殘基的結合區。所述結合區可以在鏈中連接,所述鏈中
一個帶正電荷的結合區通過可切割的交聯可切割地連接下一個結合區。

所述陽離子區可以作為用于諸如核酸試劑的活性劑的結合區,并且數個
陽離子區可以結合至同一活性劑以共同使肽與活性劑連接。

在某些實施方式中,本發明的可釋放形式包括肽和核酸的縮合物顆粒,
其中所述肽組分包括可以被切割以實現核酸的釋放的交聯。所述肽的連接子
基團的切割可以由肽環境的變化而觸發,例如在從細胞外運輸至細胞內結構
域中發生的變化,或者在細胞對內涵體的內吞或攝取和遞送過程中的變化。

用于肽的可切割的連接子的實例包括酸可切割基團,例如在內吞作用過
程中或者通過與溶酶體的細胞內相互作用而可被切割的腙。

在一些實施方式中,可由酸不穩定連接子產生活性劑的釋放。

酸不穩定連接子的實例包括含有原酸酯基團、腙、順式-乙酰甲基、縮醛、
縮酮、甲硅烷基醚、硅氮烷、亞胺、檸檬酸酐(citriconic?anhydride)、馬來酸
酐、冠醚、氮雜冠醚、硫雜冠醚、二硫代苯甲基基團、順式烏頭酸、順式羧
基鏈三烯、甲基丙烯酸及其混合物的連接子。

酸不穩定基團和連接子的實例描述在美國專利7,098,032、6,897,196、
6,426,086、7,138,382、5,563,250和5,505,931中。

用于肽的可裂解連接子的實例包括組織蛋白酶可切割的連接子,例如可
以被細胞內組織蛋白酶裂解的Val-Cit。用于組織蛋白酶B、D和L的底物序
列的實例分別示于表1、2和3中。可切割的連接子包括組織蛋白酶B、D
和L底物的二肽、三肽和四肽亞單位(P2-P2′)。

表1:組織蛋白酶B底物




表2:組織蛋白酶D底物






表3:組織蛋白酶L底物



在一些變式中,本發明可釋放形式包括肽和核酸以及溶內體化合物的縮
合物顆粒。在這些變式中,溶內體化合物可有助于從內涵體釋放核心顆粒和
活性劑至細胞中,而肽組分可以包括可以被切割以實現核酸在細胞內從核心
縮合物顆粒的釋放和解離的交聯。

溶內體化合物的實例包括氯喹、4-氨基喹啉、氨基喹啉、阿莫地喹、細
胞滲透肽、轉運蛋白(Transportan)、穿透素、來自流感病毒的血凝素融合肽(見,
例如,Han等,Nat.Struct.Biol.第8卷,715-720,2001)以及基于流感病毒的
肽diINF7。

在某些實施方式中,載體顆粒或構建體可以與用于細胞或亞細胞遞送的
靶向試劑一起配制。在一些變式中,載體顆粒可以與合成聚合物(例如聚乙二
醇(PEG))組合,以降低非特異作用或與血液組分的相互作用。合適的合成聚
合物包括聚乙二醇鏈(PEG)或PEG共聚物,例如PEG-聚氨酯或PEG-聚丙烯。
參見,例如J.Milton?Harris,Poly(ethylene?glycol)chemistry:biotechnical?and?
biomedical?applications(1992)。

使用方法

本發明包括用于向細胞遞送治療性核酸的方法,所述方法包括制備包含
含有核酸試劑的載體顆粒的組合物和用所述組合物處理細胞。

本發明包括用于抑制細胞中基因表達的方法,所述方法包括制備包含含
有核酸試劑的載體顆粒的組合物和用所述組合物處理細胞。

本發明包括用于抑制哺乳動物基因表達的方法,所述方法包括制備包含
含有核酸試劑的載體顆粒的組合物和向所述哺乳動物施用所述組合物。

本發明包括用于治療人類疾病的方法,所述疾病選自包括類風濕關節炎
的炎癥性疾病,包括高膽固醇血癥的代謝性疾病,肝病,腦炎,骨折,心臟
病,包括肝炎和流感的病毒性疾病以及癌癥;所述方法包括制備脂質體組合
物和向人施用所述組合物。

活性劑

在一些方面,本發明提供了用于制備適合遞送治療劑的組合物的方法。
本發明的方法可以提供核酸試劑組合物,例如縮合的RNA納米顆粒、雙鏈
或三鏈RNA結構、RNA肽共軛物、切丁酶底物RNA、dsRNA、siRNA、微
RNA、發夾RNA和其它活性調節性RNA形式、包括反義RNA和反義DNA
在內的反義治療劑形式、以及DNA和含DNA的形式。

本發明的活性劑可以為單鏈或雙鏈核酸。本發明的活性劑可以為抗原性
或免疫原性蛋白或者多肽。

本發明的活性劑可以為活性劑的肽縮合物。例如,活性劑可以由通過縮
合活性劑與肽或其它生物分子而形成的納米顆粒組成,或者由活性劑與肽、
生物分子或聚合分子的縮合物或復合物組成。可以交聯納米顆粒或縮合物。
納米顆粒或縮合物可以作為負載而荷載至脂質體組合物中。

本發明的活性劑可以為反義或正義DNA或RNA寡核苷酸,或者經修飾
的DNA或RNA寡核苷酸,其通過多種相互作用結合靶核酸序列以阻斷靶序
列的轉錄或翻譯。反義或正義試劑可以與核苷酸雙螺旋形成三螺旋,或者可
以為核酶,或者可以編碼包括啟動子序列或增強子序列在內的轉錄或翻譯調
節序列。反義或正義寡核苷酸可用于阻斷蛋白的表達,并且可以具有經修飾
的核苷堿基或糖基基團,或者其它基團,或者可以與生物分子、肽或蛋白共
軛,用于增強穩定性或活性。可以通過本文描述的組合物和方法將反義或正
義寡核苷酸遞送至含有其靶核酸的細胞中。如本文所述,可以使用寡核苷酸-
載體復合物或者脂質體制劑將反義或正義寡核苷酸遞送至含有其靶核酸的細
胞中。

可交聯和可切割的肽

本發明的可交聯的肽包括具有式I所示結構的可交聯肽:

A-B??式I

其中,A為2至約16個氨基酸殘基的肽,其可以含有陽離子結合區,B
為可交聯的基團,其中A在pH7下含有一個或多個帶正電荷的殘基。

B的實例包括半胱氨酸。

B的其它實例包括具有高達1000個原子、雙功能連接子、雙功能交聯子
和雜雙功能連接子、氨基甲酸酯和酯的有機基團。

A的實例包括陽離子肽。

A的實例包括具有式II所示結構的陽離子肽:

(Xaa1)m-(Xaa2)n-(Xaa3)o-(Xaa4)p??式II

其中Xaa為氨基酸殘基,各Xaa1、Xaa2、Xaa3和Xaa4均為獨立選擇的
相同或不同的氨基酸殘基,各m、n、o和p均為0至4,只要m、n、o和p
之和為2或更高,其中Xaa1、wXaa2、Xaa3和Xaa4中的一個或多個是在pH7
下帶正電荷的殘基。

可以制備陽離子肽,其中例如A的殘基具有堿性側鏈。具有堿性側鏈的
氨基酸的實例包括精氨酸(Arg)、高精氨酸(高Arg)(側鏈
-(CH2)4NH(C=NH)NH2)、正精氨酸(正Arg)(側鏈-(CH2)2NH(C=NH)NH2)、正
-正精氨酸(正正Arg)(側鏈-(CH2)NH(C=NH)NH2)、鳥氨酸、賴氨酸、高賴氨
酸、組氨酸、1-甲基組氨酸、吡啶基丙氨酸(Pal)、天冬酰胺、N-乙基天冬酰
胺、谷氨酰胺和4-氨基苯丙氨酸及其側鏈經修飾的衍生物。

本文使用的術語“高”,當指氨基酸時,表示額外的碳被加入至側鏈,術
語“正”,當指氨基酸時,表示從側鏈減去碳。因此,高賴氨酸表示側鏈
-(CH2)5NH2。

還可以制備其中殘基的側鏈含有可電離基因或取代基的陽離子肽。

在一些實施方式中,所示陽離子殘基為NG-甲基精氨酸、對稱或不對稱
的NG,NG-二甲基精氨酸、NG-甲基-高精氨酸、對稱或不對稱的NG,NG-二甲基
-高精氨酸、NG-甲基-正精氨酸、對稱或不對稱的NG,NG-二甲基-正精氨酸或
NG-甲基-正-正精氨酸、對稱或不對稱的NG,NG-二甲基-正-正精氨酸.

在一些實施方式中,所示陽離子殘基為NG-乙基精氨酸、對稱或不對稱
的NG,NG-二乙基精氨酸、NG-乙基-高精氨酸、對稱或不對稱的NG,NG-二乙基
-高精氨酸、NG-乙基-正精氨酸、對稱或不對稱的NG,NG-二乙基-正精氨酸或
者NG-乙基-正-正精氨酸、對稱或不對稱的NG,NG-二乙基-正-正精氨酸。

在某些實施方式中,所示陽離子殘基為NG-烷基精氨酸、對稱或不對稱
的NG,NG-二烷基精氨酸、NG-烷基-高精氨酸、對稱或不對稱的NG,NG-二烷基
-高精氨酸、NG-烷基-正精氨酸、對稱或不對稱的NG,NG-二烷基-正精氨酸或
者NG-烷基-正-正精氨酸、對稱或不對稱的NG,NG-二烷基-正-正精氨酸。

在一些實施方式中,所示陽離子殘基為含胍或含脒的側鏈的氨基酸。例
如,Xaa殘基的側鏈可以包含諸如胍基、脒基、二氫咪唑、4-胍基-苯基、4-
脒基-苯基、N-脒基-哌啶、N-脒基-哌嗪、4,5-二氫咪唑、2-(N-脒基)-吡咯烷
基或4-[(2-氨基嘧啶基)]乙基的基團。

陽離子殘基的實例可以具有包括以下結構及其鹽形式的側鏈:


本發明的可切割的肽包括式I所示結構的二聚體的肽,例如二聚體
A-B-B-A,其中連接子基團B能夠彼此連接,并且其中-B-B-連接是可以切割
的。

例如二聚體A-B-B-A可以為A-B-(S-S)-B-A,其中(S-S)為二硫鍵。

-B-B-連接的其它實例包括具有高達1000原子的有機基團、由雙功能連
接子形成的連接、由雙功能交聯子形成的連接和由雜雙功能連接子形成的連
接、肼連接子、氨基甲酸酯連接和酯連接。

本發明的可交聯的肽包括具有式II所示結構的可交聯肽:

B-A-B式II

其中,A為2至約16個氨基酸殘基的肽,B為以上定義的可交聯基團,
其中A在pH7下含有一個或多個帶正電荷的殘基。

B的實例包括半胱氨酸。

A的實例包括陽離子肽。

本發明的可切割的肽包括式II所示結構的二聚體、三聚體或多聚體,例
如二聚體B-A-B-B-A-B和多聚體-(B-A-B)n-,其中連接子基團B能夠彼此連
接,并且其中-B-B-連接是可以切割的。這些可切割肽中的一些由于其在各個
末端保留了可交聯基團而保持可交聯。

適合制備本發明的肽的陽離子結合區的實例示于表4。本發明的可交聯
的肽可以具有在圖4所示的肽的N-末端或C-末端連接有半胱氨酸的表4所
示的結合區。本發明的可交聯肽可以形成二聚體。

表4:用于制備肽的結合區

?SEQ?ID?NO:
??結合區
??195
??GRKKRRQRRRPPQ
??196
??KKKRKV
??197
??KKKRKVKKKRKV
??198
??GRKKRR
??199
??RRRPPQ
??200
??WKKKK
??201
??RRRPPQH
??202
??KKRRQH
??203
??RRR
??204
??RRRR
??205
??RRRRR
??206
??KKK
??207
??RRRRWW
??208
??RRRWW
??209
??RRWW
??210
??KKWW
??211
??KKKWW
??212
??WHHRRKK
??213
??RRKKHHWW
??214
??KKRRW
??215
??KKRRHW
??216
??KKRRHHW
??217
??KKRRQ
SEQ?ID?NO:
????結合區
????218
????KKRRQ
????219
????GRKKRRQ
????220
????QGRKKRR
????221
????RRH
????222
????RRRH
????223
????RRRRH
????224
????RRRRRH
????225
????KKH
????226
????KKKH
????227
????HWKKRR
????228
????HWKKRR
????229
????PPHRRR
????230
????PPHRRR
????231
????GRKKRRVRRRPPQ
????232
????WWHHKKRRGGRRKKHHWW
????233
????WWHHKKRR
????234
????YYHHKKRR
????235
????RRKKHHYY
????236
????VQAAIDYING
????237
????WWRRHH
????238
????HHRRWW
????239
????YYRRHH
????240
????HHRRYY
????241
????WWRRR
????242
????RRRWW
????243
????YYRRR
????244
????RRRYY
????245
????WWRRRHH
SEQ?ID?NO:
????結合區
????246
????HHRRRWW
????247
????YYRRRHH
????248
????HHRRRYY
????249
????WWRRRR
????250
????RRRRWW
????251
????YYRRRR
????252
????RRRRYY
????253
????WWRRRRHH
????254
????HHRRRRWW
????255
????YYRRRRHH
????256
????HHRRRRYY
????257
????WWHH-Orn-Orn-RR
????258
????WWHHHRRR
????259
????WWHHHRRR
????260
????WWWHHHHRRR
????261
????WWWKKRRR
????262
????KKKWRRW
????263
????WRRRWRR
????264
????WWHHKKRR
????265
????WWCHHKKCRR
????266
????WWHHHRRR
????267
????WWHHCKKRR
????268
????WWHHKKCRR
????269
????RRWWKKHH
????270
????WWHHKKKK
????271
????WWHHRRRR
????272
????RRRRHH
????273
????HHKKKK
??SEQ?ID?NO:
??結合區
??274
??HHRRRR
??275
??YYRRRRHH
??276
??YYKKKKHH

本發明的可切割肽的實例示于表5。

表5:可切割的肽

?SEQ?ID?NO:
??肽
??277
??GRKKRRV-Cit-RRRPPQ
??278
??GRKKRRV-Cit-RRKKRG
??279
??RRRPPQV-Cit-PPRRR
??280
??RRKKRGV-Cit-GRKKRR
??281
??QPPRRRV-Cit-RRRPPQ
??282
??WKKKKV-Cit-KKKKW
??283
??KKKKWV-Cit-WKKKK
??284
??HQPPRRRV-Cit-RRRPPQH
??285
??QPPRRRV-Cit-RRRPPQ
??286
??HQRRKKV-Cit-KKRRQH
??287
??RRV-Cit-RR
??288
??RRRV-Cit-RRR
??289
??RRRRV-Cit-RRRR
??290
??RRRRRV-Cit-RRRRR
??291
??KKV-Cit-KK
??292
??KKKV-Cit-KKK
??293
??KKKKV-Cit-KKKK
??294
??KKKKKV-Cit-KKKKK
??295
??WWRRRRV-Cit-RRRRWW
??296
??WWRRRV-Cit-RRRWW
??297
??WWRRV-Cit-RRWW
?SEQ?ID?NO:
??肽
??298
??WWKKV-Cit-KKWW
??299
??WWKKKV-Cit-KKKWW
??300
??WWKKKKV-Cit-KKKKWW
??301
??KKRRHHWV-Cit-WHHRRKK
??302
??WWHHKKRRV-Cit-RRKKHHWW
??303
??WRRKKV-Cit-KKRRW
??304
??WHRRKKV-Cit-KKRRHW
??305
??WHHRRKKV-Cit-KKRRHHW
??306
??QRRKKV-Cit-KKRRQ
??307
??KKRRQV-Cit-QRRKK
??308
??RRKKRGV-Cit-GRKKRR
??309
??GRKKRRV-Cit-RRKKRG
??310
??QRRKKRGV-Cit-GRKKRRQ
??311
??QGRKKRRV-Cit-RRKKRGQ
??312
??HRRV-Cit-RRH
??313
??HRRRV-Cit-RRRH
??314
??HRRRRV-Cit-RRRRH
??315
??HRRRRRV-Cit-RRRRRH
??316
??HKKV-Cit-KKH
??317
??HKKKV-Cit-KKKH
??318
??HKKKKV-Cit-KKKKH
??319
??HKKKKKV-Cit-KKKKKH
??320
??HWKKRRV-Cit-RRKKWH
??321
??RRKKWHV-Cit-HWKKRR
??322
??PPHRRRV-Cit-RRRHPP
??323
??RRRHPPV-Cit-PPHRRR
??324
??YYHHKKRRC-二硫鍵-CRRKKHHYY
??325
??YYHHKKRRV-Cit-RRKKHHYY
?SEQ?ID?NO:
??肽
??326
??WWRRC-二硫鍵-CRRWW
??327
??WWRRV-Cit-RRWW
??328
??YYRRC-二硫鍵-CRRYY
??329
??YYRRV-Cit-RRYY
??330
??WWRRHHC-二硫鍵-CHHRRWW
??331
??WWRRHHV-Cit-HHRRWW
??332
??YYRRHHC-二硫鍵-CRRHHYY
??333
??YYRRHHV-Cit-RRHHYY
??334
??WWRRRC-二硫鍵-CRRRWW
??335
??WWRRRV-Cit-RRRWW
??336
??YYRRRC-二硫鍵-CRRRYY
??337
??YYRRRV-Cit-RRRYY
??338
??WWRRRHHC-二硫鍵-CHHRRRWW
??339
??WWRRRHHV-Cit-HHRRRWW
??340
??YYRRRHHC-二硫鍵-CRRRHHYY
??341
??YYRRRHHV-Cit-RRRHHYY
??342
??WWRRRRC-二硫鍵-CRRRRWW
??343
??WWRRRRV-Cit-RRRRWW
??344
??YYRRRRC-二硫鍵-CRRRRYY
??345
??YYRRRRV-Cit-RRRRYY
??346
??WWRRRRHHC-二硫鍵-CHHRRRRWW
??347
??WWRRRRHHV-Cit-HHRRRRWW
??348
??YYRRRRHHC-二硫鍵-CRRRRHHYY
??349
??YYRRRRHHV-Cit-RRRRHHYY
??350
??WWHHKKRRWV-Cit-WRRKKHHWW
??351
??WWHH-Orn-Orn-RRV-Cit-RR-Orn-Orn-HHWW
??352
??WWHHC-二硫鍵-CKKRR

本文使用的氨基酸名稱和命名是指相應氨基酸的任意立體異構體。

在表5中,在肽序列內部的基團可以提供切割位點。例如,內部切割位
點可以為二硫鍵或Val-Cit連接。

如美國專利公開20080166363中描述的,可切割的連接的實例包括
Phe-Lys、Val-Cit、Ala-Leu、Leu-Ala-Leu和Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ?ID?NO:376)。

給藥途徑

本發明的活性劑組合物可以用在藥物組合物中。向受治療者施用本發明
的脂質體制劑可以通過腸胃外、口服、通過吸入、局部、粘膜、直腸或經口
頰。腸胃外應用包括皮下、皮內、靜脈內、肌內、關節內、滑膜內、干內
(intrastemal)、鞘內、病灶內、顱內注射或輸注技術。

有效量

用于治療特定疾病的本發明活性劑組合物的有效量通常是足以改善或減
輕疾病癥狀的量。本發明的活性劑組合物的有效量可以為足以引起由所述試
劑產生的任何生物作用的量。所述組合物可以作為單劑量施用,或者可以通
過重復給藥而施用。

DILA2氨基酸脂質體形成化合物

本發明的脂質體組合物可以包括US?2008-0317839?A1中公開的一種或
多種DILA2氨基酸化合物。

DILA2氨基酸化合物是可以在某種條件下形成脂質體結構的合成有機
化合物。可以通過在氨基酸的N-末端或C-末端或者兩端用遞送增強尾或親
脂性尾取代,形成DILA2氨基酸化合物。在一些實施方式中,氨基酸核心可
以包括一個或多個氨基酸,或者可以為2至20個氨基酸殘基的肽。

DILA2氨基酸化合物可以為陽離子的或非陽離子的,其中非陽離子包括
中性或陰離子。除非另有指明,否則本文使用的物質的生理狀態或離子性是
指pH約為7的環境。

在一些方面,DILA2氨基酸化合物可以以可釋放的形式提供治療劑的遞
送。可釋放的形式和組合物經設計以足以產生細胞對試劑的攝取,從而提供
治療作用。

可釋放的形式包括結合并釋放活性劑的DILA2氨基酸化合物。在一些實
施方式中,可以由酸不穩定連接子提供活性劑的釋放。

酸不穩定連接子的實例包括含有原酸酯基團、腙、順式-乙酰甲基、縮醛、
縮酮、甲硅烷基醚、硅氮烷、亞胺、檸檬酸酐、馬來酸酐、冠醚、氮雜冠醚、
硫雜冠醚、二硫代苯甲基基團、順式烏頭酸、順式羧基鏈三烯、甲基丙烯酸
及其混合物的連接子。

酸不穩定基團和連接子的實例見于美國專利7,098,032、6,897,196、
6,426,086、7,138,382、5,563,250和5,505,931。

本發明的化合物和組合物的可釋放形式包括結合活性劑且能將有助于該
試劑釋放的部分放出的分子。在一些實施方式中,DILA2氨基酸化合物可以
包括釋放小分子(如幫助遞送試劑至細胞的乙醇)的基團。DILA2氨基酸化合
物可以結合活性劑,且隨后與細胞接觸,或隨后在具有低于生理pH的局部
pH的生物隔室內運輸,在酸性環境中水解以釋放幫助遞送試劑的乙醇。在一
些實施方式中,小分子(如幫助遞送試劑的乙醇)可以結合到親脂性組分。

在一些實施方式中,DILA2氨基酸化合物可以與釋放小分子(如幫助遞送
試劑至細胞的乙醇)的化合物混合。

本發明的化合物和組合物的可釋放形式包括DILA2氨基酸化合物,其可
以結合活性劑,隨后與細胞接觸,或隨后在具有低于生理pH的局部pH的生
物隔室內運輸,在酸性環境中調節成陽離子形式從而幫助釋放試劑。

在一些實施方式中,DILA2氨基酸化合物可以結合活性劑,且可以與在
酸性環境中可被調節成陽離子形式從而幫助釋放活性劑的化合物混合。

可水解和可調節的基團實例在美國專利號6,849,272;6,200,599;以及
G.Gregoriadis(編輯),Liposome?Technology,第3版(CRC?Press?2006)的Z.H.
Huang和F.C.Szoka,“Bioresponsive?liposomes?and?their?use?for?
macromolecular?delivery,”中給出。

在一些實施方式中,本發明的化合物和組合物的可釋放形式包括能結合
活性劑的DILA2氨基酸化合物,且可以與在酸性環境中能調節為中性形式從
而幫助釋放活性劑的脂質或化合物混合。可以隨后進入酸性環境以與細胞接
觸,或隨后在具有低于生理pH的局部pH的生物隔室內運輸。

可從陰離子調節至中性形式的化合物的實例包括膽固醇琥珀酸單酯
(CHEMS),如美國專利號6,897,196、6,426,086和7,108,863中所述。在一些
實例中,如Cullis,1463?Biochimica?et?Biophysica?Acta?107-14(2000)中的描述,
CHEMS顯示pH敏感的多態性。

在一些實施方式中,本發明的化合物和組合物的可釋放形式包括能結合
活性劑的DILA2氨基酸化合物,其可與pH敏感性聚合材料混合。

pH敏感性聚合材料的實例在美國專利號6,835,393中給出。

在一些實施方式中,活性劑的釋放可以通過酶可裂解肽來提供。

在一些方面中,本發明提供了如式I所示的一系列的DILA2氨基酸化合
物及其鹽:

R3-(C=O)-Xaa-Z-R4????????????????????????????式I

其中

Xaa是具有通式-NRN-CR1R2-(C=O)-的任意D-或L-氨基酸殘基,或2至
20個氨基酸殘基的肽,其中

R1是非氫,取代或未取代的氨基酸側鏈;

R2是氫或由碳、氧、氮、硫和氫原子組成且具有1至20個碳原子的有
機基團或C(1-5)烷基、環烷基、環烷基烷基、C(3-5)烯基、C(3-5)炔基、C(1-5)
烷酰基、C(1-5)烷酰氧基、C(1-5)烷氧基、C(1-5)烷氧基-C(1-5)烷基、C(1-5)
烷氧基-C(1-5)烷氧基、C(1-5)烷基-氨基-C(1-5)烷基-、C(1-5)二烷基-氨基-C(1-5)
烷基-、硝基-C(1-5)烷基、氰基-C(1-5)烷基、芳基-C(1-5)烷基、4-聯苯-C(1-5)
烷基、羧基或羥基;

RN是氫或由碳、氧、氮、硫和氫原子組成且具有1至20個碳原子的有
機基團或C(1-5)烷基、環烷基、環烷基烷基、C(3-5)烯基、C(3-5)炔基、C(1-5)
烷酰基、C(1-5)烷酰氧基、C(1-5)烷氧基、C(1-5)烷氧基-C(1-5)烷基、C(1-5)
烷氧基-C(1-5)烷氧基、C(1-5)烷基-氨基-C(1-5)烷基-、C(1-5)二烷基-氨基-C(1-5)
烷基-、硝基-C(1-5)烷基、氰基-C(1-5)烷基、芳基-C(1-5)烷基、4-聯苯-C(1-5)
烷基、羧基或羥基;

R3是衍生自天然存在的或合成的磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、
鞘脂、神經酰胺、鞘磷脂、腦苷脂或神經節苷脂的親脂性尾;或取代或未取
代的C(3-22)烷基、C(6-12)環烷基、C(6-12)環烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、
C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基;或任意其它的天
然存在的或合成的脂質的親脂性尾或下文描述的任一脂質的親脂性尾,而且
可以包括類固醇;

R4是衍生自天然存在的或合成的磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、
鞘脂、神經酰胺、鞘磷脂、腦苷脂或神經節苷脂的親脂性尾;或取代或未取
代的C(3-22)烷基、C(6-12)環烷基、C(6-12)環烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、
C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基;或任意其它的天
然存在的或合成的脂質的親脂性尾或下文描述的任一脂質的親脂性尾,而且
可以包括類固醇;

Z是NH、O、S、-CH2S-、-CH2S(O)-或由選自氫、碳、氧、氮和硫原子
的1至40個原子組成的有機連接子。

在一些實施方式中,R3獨立地是取代或未取代的C(6-22)烷基或C(6-22)
烯基;R4獨立地是取代或未取代的C(6-22)烷基或C(6-22)烯基。

殘基Xaa可以是D-或L-立構中心。

在一些實施方式中,R1是非氫取代或未取代的氨基酸側鏈,其中側鏈取
代基是由選自氫、碳、氧、氮和硫原子的1至40個原子組成的有機基團。

在一些實施方式中,Z是烷基或有機連接子合成聚合物,如聚乙二醇鏈
(PEG),或PEG共聚物,如PEG-聚氨酯或PEG-聚丙烯。參見如J.Milton?Harris,
Poly(ethylene?glycol)chemistry:biotechnical?and?biomedical?applications
(1992)。

在一些實施方式中,本發明提供了如上式I所示的一系列DILA2氨基酸
化合物,其中:

Xaa是具有通式-NRN-CR1R2-(C=O)-的任意D-或L-氨基酸,其中

R1是非氫取代或未取代的氨基酸的堿性側鏈;

R2是氫,或C(1-5)烷基,

RN是氫,或C(1-5)烷基,

R3是衍生自天然存在的或合成的磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、
鞘脂、神經酰胺、鞘磷脂、腦苷脂或神經節苷脂的親脂性尾;或取代或未取
代的C(3-22)烷基、C(6-12)環烷基、C(6-12)環烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、
C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基;或任意其它的天
然存在的或合成的脂質的親脂性尾,或下文描述的任一脂質的親脂性尾,而
且可以包括類固醇;

R4是衍生自天然存在的或合成的磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、
鞘脂、神經酰胺、鞘磷脂、腦苷脂或神經節苷脂的親脂性尾;或取代或未取
代的C(3-22)烷基、C(6-12)環烷基、C(6-12)環烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、
C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基;或任意其它的天
然存在的或合成的脂質的親脂性尾,或下文描述的任一脂質的親脂性尾,而
且可以包括類固醇;

Z是NH、O、S、-CH2S-、-CH2S(O)-或由選自氫、碳、氧、氮和硫原子
的1至40個原子組成的有機連接子。

在一些實施方式中,本發明提供了如上式I所示的一系列DILA2氨基酸
化合物,其中:

Xaa是具有通式-NRN-CR1R2-(C=O)-的任意D-或L-氨基酸,其中

R1是非氫取代或未取代的氨基酸的堿性側鏈;

R2是氫,或C(1-5)烷基,

RN是氫,或C(1-5)烷基,

R3是取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)環烷基、C(6-12)環烷基-C(3-22)
烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基或C(6-12)烷氧基-C(3-22)
烷基;

R4是取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)環烷基、C(6-12)環烷基-C(3-22)
烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基或C(6-12)烷氧基-C(3-22)
烷基;

Z是NH、O、S、-CH2S-、-CH2S(O)-或由選自氫、碳、氧、氮和硫原子
的1至40個原子組成的有機連接子。

在一些實施方式中,本發明提供了如上式I所示的一系列DILA2氨基酸
化合物,其中:

Xaa是具有通式-NRN-CR1R2-(C=O)-的任意的D-或L-氨基酸,其中

R1是非氫取代或未取代的氨基酸的堿性側鏈;

R2是氫,或C(1-5)烷基,

RN是氫,或C(1-5)烷基,

R3是取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)環烷基、C(6-12)環烷基-C(3-22)
烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基或C(6-12)烷氧基-C(3-22)
烷基;

R4是取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)環烷基、C(6-12)環烷基-C(3-22)
烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基或C(6-12)烷氧基-C(3-22)
烷基;

Z是NH。

在一些實施方式中,本發明提供了如上式I所示的一系列DILA2氨基酸
化合物,其中:

Xaa是具有通式-NRN-CR1R2-(C=O)-的任意的D-或L-氨基酸,其中

R1是非氫取代或未取代的氨基酸的堿性側鏈;

R2是氫,或C(1-5)烷基,

RN是氫,或C(1-5)烷基,

R3是取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)環烷基、C(6-12)環烷基-C(3-22)
烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基或C(6-12)烷氧基-C(3-22)
烷基;

R4是取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)環烷基、C(6-12)環烷基-C(3-22)
烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基或C(6-12)烷氧基-C(3-22)
烷基;

Z是O。

可以制備陽離子DILA2氨基酸化合物,其中例如Xaa具有堿性側鏈。具
有堿性側鏈的氨基酸實例包括精氨酸(Arg)、高精氨酸(高Arg)(側鏈
-(CH2)4NH(C=NH)NH2)、正精氨酸(正Arg)(側鏈-(CH2)2NH(C=NH)NH2)、正-
正精氨酸(正正Arg)(側鏈-(CH2)NH(C=NH)NH2)、鳥氨酸、賴氨酸、高賴氨酸、
組氨酸、1-甲基組氨酸、吡啶基丙氨酸(Pal)、天冬酰胺、N-乙基天冬酰胺、
谷氨酰胺和4-氨基苯丙氨酸和它們的側鏈經修飾的衍生物。

在本文中,術語“高”,當指氨基酸時,是指額外的碳添加到側鏈,而術
語“正”,當指氨基酸時,是指碳從側鏈減去。因此,高賴氨酸是指側鏈
-(CH2)5NH2。

可以制備陰離子DILA2氨基酸化合物,其中例如Xaa是谷氨酸或天冬氨
酸。

還可以制備陽離子和陰離子DILA2氨基酸化合物,其中氨基酸側鏈含有
電離基團或取代基。

可以制備非陽離子DILA2氨基酸化合物,其中例如Xaa是亮氨酸、纈氨
酸、丙氨酸或絲氨酸。

在一些實施方式中,Xaa是NG-甲基精氨酸、對稱的或不對稱的NG,NG-
二甲基精氨酸、NG-甲基-高精氨酸、對稱的或不對稱的NG,NG-二甲基-高精氨
酸、NG-甲基-正精氨酸、對稱的或不對稱的NG,NG-二甲基-正精氨酸或NG-甲
基-正-正精氨酸、對稱的或不對稱的NG,NG-二甲基-正-正精氨酸。

在一些實施方式中,Xaa是NG-乙基精氨酸、對稱的或不對稱的NG,NG-
二乙基精氨酸、NG-乙基-高精氨酸、對稱的或不對稱的NG,NG-二乙基-高精氨
酸、NG-乙基-正精氨酸、對稱的或不對稱的NG,NG-二乙基-正精氨酸或NG-乙
基-正-正精氨酸、對稱的或不對稱的NG,NG-二乙基-正-正精氨酸。

在一些實施方式中,Xaa是NG-烷基精氨酸、對稱的或不對稱的NG,NG-
二烷基精氨酸、NG-烷基-高精氨酸、對稱的或不對稱的NG,NG-二烷基-高精氨
酸、NG-烷基-正精氨酸、對稱的或不對稱的NG,NG-二烷基-正精氨酸或NG-烷
基-正-正精氨酸、對稱的或不對稱的NG,NG-二烷基-正-正精氨酸。

在一些實施方式中,Xaa是含胍或含脒側鏈的氨基酸。例如,Xaa殘基
的側鏈可以包括如胍基、脒基、二氫咪唑、4-胍基-苯基、4-脒基-苯基、N-
脒基-哌啶、N-脒基-哌嗪、4,5-二氫咪唑、2-(N-脒基)-吡咯烷基或4-[(2-氨基
嘧啶基)]乙基的基團。

Xaa側鏈的實例包括以下結構,及其鹽的形式:


適合可釋放形式的DILA2氨基酸化合物的氨基酸的取代側鏈的實例包
括pKa為約5至約7.5或約6至約7的釋放官能團。通常,弱堿的釋放官能
團在局部pH高于pKa時可以表現出顯著的中性形式,且在局部pH低于pKa
時可以表現出顯著的離子形式。弱酸的釋放官能團在局部pH高于pKa時可
以表現出離子形式,且在局部pH低于pKa時可以表現出中性形式。參見,
如P.Heinrich?Stahl,Handbook?of?Pharmaceutical?Salts,(2002)。

在一些實施方式中,Xaa可以具有含pKa為5至7.5的官能團的側鏈。

適合可釋放形式的DILA2氨基酸化合物的氨基酸的取代側鏈的實例包
括1-甲基組氨酸。

適合可釋放形式的DILA2氨基酸化合物的氨基酸的取代側鏈的實例包
括3,5-二碘酪氨酸。

適合可釋放形式的DILA2氨基酸化合物的氨基酸的取代側鏈的實例包
括以下結構:


DILA2氨基酸化合物的實例包括結構:



適合可釋放形式的DILA2氨基酸化合物的氨基酸側鏈上的取代基實例
包括衍生自下述的可釋放官能團:3,5-二碘-酪氨酸、1-甲基組氨酸、2-甲基
丁酸、2-鄰-茴香基丙酸、內消旋-酒石酸、4,6-二甲基嘧啶胺、對苯二甲酸、
肌酸酐、丁酸、N,N-二甲基-1-萘胺、戊酸、4-甲基戊酸、N-甲基苯胺、1,10-
鄰二氮雜菲、3-吡啶羧酸、己酸、丙酸、4-氨基苯甲酸、2-甲基丙酸、庚酸、
辛酸、環己烷羧酸、喹啉、3-氨基喹啉、2-氨基苯甲酸、4-吡啶羧酸、壬酸、
三聚氰胺、8-羥基喹啉、三甲基乙酸、6-甲氧基喹啉、4-(甲基氨基)苯甲酸、
對甲基苯胺、3-(甲基氨基)苯甲酸、蘋果酸、N-乙基苯胺、2-苯甲基吡啶、3,6-二
硝基苯酚、N,N-二甲基苯胺、2,5-二甲基哌嗪、對氨基苯乙醚、5-甲基喹啉、
2-苯基苯并咪唑、吡啶、吡啶甲酸、3,5-二碘酪氨酸,對茴香胺、2-(甲基氨
基)苯甲酸、2-氨基噻唑、戊二酸、己二酸、異喹啉、衣康酸、鄰苯二甲酸、
苯并咪唑、哌嗪、庚二酸、吖啶、菲啶、琥珀酸、甲基丁二酸、4-甲基喹啉、
3-甲基吡啶、7-羥基異喹啉、丙二酸、甲基丙二酸、2-甲基喹啉、2-乙基吡啶、
2-甲基吡啶、4-甲基吡啶、組胺、組氨酸、馬來酸、順式-1,2-環己烷二胺、
3,5-二甲基吡啶、2-乙基苯并咪唑、2-甲基苯并咪唑、卡可基酸、呸啶
(Perimidine)、檸檬酸、異檸檬酸、2,5-二甲基吡啶、罌粟堿、6-羥基-4-甲基
蝶啶、L-甲狀腺素、3,4-二甲基吡啶、甲氧基吡啶、反式-1,2-環己烷二胺、2,5-
吡啶二胺、l-1-甲基組氨酸、l-3-甲基組氨酸、2,3-二甲基吡啶、黃蝶呤、1,2-
丙烷二胺、N,N-二乙基苯胺、阿脲酸、2,6-二甲基吡啶、L-肌肽、2-氨基吡啶、
N-b-丙氨酰組氨酸、毛果蕓香堿、1-甲基咪唑、1H-咪唑、2,4-二甲基吡啶、
4-硝基苯酚、2-硝基苯酚、酪氨酰胺、5-羥基喹唑啉、1,1-環丙烷二羧酸、2,4,6-
三甲基吡啶、佛羅那、2,3-二氯苯酚、1,2-乙二胺、1-氨基異喹啉和它們的組
合物。

在一些實施方式中,對應式I的一系列DILA2氨基酸化合物的結構如下:


其中R1、R2、RN、R3和R4如上定義。

在一些實施方式中,R3和R4是獨立選擇的親脂性尾,其賦予充分的親
脂特性或親脂性,如被水/辛醇分隔開,從而遞送通過膜或被細胞攝取。當用
于DILA2氨基酸化合物中時,這些尾提供兩性分子。親脂性尾尤其可以衍生
自磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、鞘脂、神經酰胺、鞘磷脂、腦苷脂
或神經節苷脂等,且可以包括類固醇。

在一些實施方式中,R3和R4可以獨立地是具有甘油骨架的親脂性尾。

在一些實施方式中,R3和R4可以獨立地是C10烷基、C11烷基、C12
烷基、C13烷基、C14烷基、C15烷基、C16烷基、C17烷基、C18烷基、
C19烷基、C20烷基、C21烷基或C22烷基。

在一些實施方式中,R3和R4可以獨立地為具有下述結構之一的親脂性
尾:


在上述結構中,X代表直接連接到氨基酸殘基端的尾原子,且以數字指
示記作其一原子,例如“18:3”。在一些實施方式中,X可以是碳、氮或氧原
子。

在一些實施方式中,R3和R4可以獨立地是具有下述結構之一的親脂性
尾:


其中X如上定義。

在一些實施方式中,R3和R4是獨立選擇的親脂性尾,其可以包括膽固
醇、固醇或類固醇,如甾烷、雌烷、雄烷、孕烷、膽烷、膽甾烷、麥角甾烷、
菜油甾烷、多孔甾烷、豆甾烷、柳珊瑚甾烷(gorgostane)、羊毛甾烷、環波羅
烷、以及前述的任何固醇或動物甾醇衍生物和它們的生物中間體和前體,可
以包括如膽固醇、羊毛固醇、豆甾烷醇、二氫羊毛甾醇、酵母甾醇、酵母甾
烯醇、鏈甾醇、7-脫氫膽固醇它們的混合物和衍生物。

在一些實施方式中,R3和R4可以獨立地衍生自脂肪酸樣尾,如衍生自
肉豆蔻酸(C14:0)烯基、棕櫚酸(C16:0)烯基、硬脂酸(C18:0)烯基、油酸(C18:1,
雙鍵在碳9)烯基、亞油酸(C18:2,碳雙鍵在碳9或12)烯基、亞麻酸(C18:3,
雙鍵在碳9、12或15)烯基、花生四烯酸(C20:4,雙鍵在碳5、8、11或14)
烯基和二十碳五烯酸(C20:5,雙鍵在碳5、8、11、14或17)烯基的尾。其它
的脂肪酸樣尾的實例參見Donald?Voet和Judith?Voet,Biochemistry,第3版
(2005),第383頁。

在一些實施方式中,R3和R4可以獨立地衍生自類異戊二烯。

在本文中,術語“氨基酸”包括天然存在的和非天然存在的氨基酸。因此
DILA2氨基酸化合物可以由遺傳編碼的氨基酸、天然存在的非遺傳編碼的氨
基酸或合成氨基酸制得。

氨基酸的實例包括Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、
Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val。

氨基酸的實例包括吖丁啶、2-氨基十八烷酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二
酸、2,3-二氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、2,3-二氨基丁酸、2,4-二氨基
丁酸、2-氨基異丁酸、4-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2,2′-二氨基庚二酸、6-氨
基己酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、鎖鏈素、鳥氨酸、瓜氨酸、N-甲基異亮
氨酸、正亮氨酸、叔亮氨酸、苯甘氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、肌
氨酸、N-乙基甘氨酸、環己基甘氨酸、4-氧代-環己基甘氨酸、N-乙基天冬酰
胺、環己基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、萘基丙氨酸、吡啶基丙氨酸、3-氯丙氨
酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-鹵代苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、
3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、青霉胺、2-噻吩基丙氨酸、蛋氨酸、蛋氨酸亞
砜、高精氨酸、正精氨酸、正-正精氨酸、N-乙酰基賴氨酸、4-氨基苯丙氨酸、
N-甲基纈氨酸、高半胱氨酸、高絲氨酸、羥基賴氨酸、別-羥基賴氨酸、3-
羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、異鎖鏈素、別-異亮氨酸、6-N-甲基賴氨酸、正
纈氨酸、O-烯丙基-絲氨酸、O-烯丙基-蘇氨酸、α-氨基己酸、α-氨基戊酸和焦
谷氨酸。

在本文中,術語“氨基酸”包括α-和β-氨基酸。

其它氨基酸殘基可參見Fasman,CRC?Practical?Handbook?of?Biochemistry?
and?Molecular?Biology,CRC?Press,Inc.(1989)。

通常,化合物可以包括一種或多種手性中心。含一種或多種手性中心的
化合物可以包括被稱為“異構體”、“立體異構體”、“非對映異構體”、“對映異
構體”、“光學異構體”或“外消旋混合物”的那些。立體化學命名公約,例如
Cahn,Ingold和Prelog的立體異構體命名法,以及確定立體化學和分離立體
異構體的方法是本領域已知的。參見,例如Michael?B.Smith和Jerry?March,
March’s?Advanced?Organic?Chemistry,第5版,2001。本發明的化合物和結構
意欲包括所有可能的異構體、立體異構體、非對映異構體、對映異構體和/
或光學異構體,其應理解為以指定化合物或結構,包括其任何混合物、消旋
體或其它形式存在。

DILA2氨基酸化合物的實例包括R3-(C=O)-Arg-NH-R4,其中Arg是D-或
L-精氨酸,且R3和R4獨立地是烷基或烯基。

DILA2氨基酸化合物的實例包括以下結構:


DILA2氨基酸化合物的實例包括以下結構:


DILA2氨基酸化合物的實例包括以下結構:



DILA2氨基酸化合物的實例包括R3-(C=O)-正Arg-NH-R4,其中正Arg
是D-或L-正精氨酸,且R3和R4獨立地是烷基或烯基。

DILA2氨基酸化合物的實例包括以下結構:




DILA2氨基酸化合物的實例包括R3-(C=O)-正正Arg-NH-R4,其中正正
Arg是D-或L-正-正精氨酸,且R3和R4獨立地是烷基,如庚基、辛基、壬基、
癸基和十一烷基。

DILA2氨基酸化合物的實例包括以下結構:


DILA2氨基酸化合物的實例包括R3-(C=O)-高Arg-NH-R4,其中高Arg
是D-或L-高精氨酸,且R3和R4獨立地是烷基,如庚基、辛基、壬基、癸基
和十一烷基。

DILA2氨基酸化合物的實例包括R3-(C=O)-4-吡啶基丙氨酸-NH-R4,其
中吡啶基丙氨酸是D-或L-吡啶基丙氨酸,且R3和R4獨立地是烷基,如庚基、
辛基、壬基、癸基和十一烷基。DILA2氨基酸化合物R3-(C=O)-吡啶基丙氨
酸-NH-R4的實例包括藥學上可接受的吡啶鹽,如4-[N-甲基吡啶基]丙氨酸氯
化物。吡啶基丙氨酸DILA2氨基酸化合物的實例包括以下結構:


DILA2氨基酸化合物的實例包括R3-(C=O)-Lys-NH-R4,其中R3和R4獨
立地是烷基或烯基。

DILA2氨基酸化合物的實例包括以下結構:





DILA2氨基酸化合物的實例包括R3-(C=O)-His-NH-R4,其中R3和R4獨
立地是烷基或烯基。HisDILA2氨基酸化合物的實例包括以下結構:


DILA2氨基酸化合物的實例包括R3-(C=O)-Xaa-O-R4,其中R3是烷基且
R4是鞘氨基醇。

DILA2氨基酸化合物的實例包括以下結構:


DILA2氨基酸化合物的實例包括R3-(C=O)-Xaa-NH-R4,其中R3和R4是
烷基或烯基。DILA2氨基酸化合物的實例包括以下結構:


DILA2氨基酸化合物的實例包括以下結構:


DILA2氨基酸化合物的實例包括以下結構:


DILA2氨基酸化合物的實例包括以下結構:


C18:1-Ser(琥珀酰化)-C16

DILA2氨基酸化合物的實例包括(C10酰基)-Arg-NH-(C10烷基)(SEQ?ID?
NO:11)、(C12酰基)-Arg-NH-(C12烷基)(SEQ?ID?NO:11)、(C14酰
基)-Arg-NH-(C14烷基)(SEQ?ID?NO:11)、(C16酰基)-Arg-NH-(C16烷基)(SEQ?
ID?NO:11)、(C18酰基)-Arg-NH-(C18烷基)(SEQ?ID?NO:11)、(C10酰基)-高
Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-高Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-高
Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-高Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-高
Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-正Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-正
Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-正Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-正
Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-正Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-正-正
Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-正正Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-正正
Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-正正Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-正正
Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-4-Pal-NH-(C10烷基)、(C12酰
基)-4-Pal-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-4-Pal-NH-(C14烷基)、(C16酰
基)-4-Pal-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-4-Pal-NH-(C18烷基)、(C10酰
基)-4-Pal(Me)-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-4-Pal(Me)-NH-(C12烷基)、(C14
酰基)-4-Pal(Me)-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-4-Pal(Me)-NH-(C16烷基)和(C18
酰基)-4-Pal(Me)-NH-(C18烷基)。

通常,名稱“C14-正Arg-C14”例如是指(C13烷基)-(C=O)-正Arg-NH-(C14
烷基),其等同于(C14酰基)-正Arg-NH-(C14烷基)。

DILA2氨基酸化合物的實例包括(C10酰基)-D-Arg-L-Arg-NH-(C10烷
基)、(C12酰基)-D-Arg-L-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰
基)-D-Arg-L-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-D-Arg-L-Arg-NH-(C16烷基)、
(C18酰基)-D-Arg-L-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-D-高Arg-L-高
Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-D-高Arg-L-高Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰
基)-D-高Arg-L-高Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-D-高Arg-L-高Arg-NH-(C16
烷基)、(C18酰基)-D-高Arg-L-高Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-D-正Arg-L-
正Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-D-正Arg-L-正Arg-NH-(C12烷基)、(C14
酰基)-D-正Arg-L-正Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-D-正Arg-L-正
Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-D-正Arg-L-正Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰
基)-D-正-正Arg-L-正正Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-D-正正Arg-L-正正
Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-D-正正Arg-L-正正Arg-NH-(C14烷基)、(C16
酰基)-D-正-正Arg-L-正-正Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-D-正-正Arg-L-
正-正Arg-NH-(C18烷基)。

DILA2氨基酸化合物的實例包括(C10酰基)-His-Arg-NH-(C10烷基)、
(C12酰基)-His-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-His-Arg-NH-(C14烷基)、(C16
酰基)-His-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-His-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰
基)-His-Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-His-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰
基)-His-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-His-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰
基)-His-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-His-Arg-(C10烷基)、(C12酰
基)-His-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-His-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰
基)-His-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-His-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰
基)-His-Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-His-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰
基)-His-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-His-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰
基)-His-Arg-NH-(C18烷基)。

DILA2氨基酸化合物的實例包括(C10酰基)-His-Asp-NH-(C10烷基)、
(C12酰基)-His-Asp-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-His-Asp-NH-(C14烷基)、(C16
酰基)-His-Asp-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-His-Asp-NH-(C18烷基)、(C10酰
基)-His-Asp-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-His-Asp-NH-(C12烷基)、(C14酰
基)-His-Asp-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-His-Asp-NH-(C16烷基)、(C18酰
基)-His-Asp-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-His-Asp-(C10烷基)、(C12酰
基)-His-Asp-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-His-Asp-NH-(C14烷基)、(C16酰
基)-His-Asp-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-His-Asp-NH-(C18烷基)、(C10酰
基)-His-Asp-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-His-Asp-NH-(C12烷基)、(C14酰
基)-His-Asp-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-His-Asp-NH-(C16烷基)、(C18酰
基)-His-Asp-NH-(C18烷基)。

DILA2氨基酸化合物的實例包括(C10酰基)-Pal-Arg-NH-(C10烷基)、
(C12酰基)-Pal-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-Pal-Arg-NH-(C14烷基)、(C16
酰基)-Pal-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-Pal-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰
基)-Pal-Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-Pal-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰
基)-Pal-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-Pal-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰
基)-Pal-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-Pal-Arg-(C10烷基)、(C12酰
基)-Pal-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-Pal-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰
基)-Pal-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-Pal-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰
基)-Pal-Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-Pal-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰
基)-Pal-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-Pal-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰
基)-Pal-Arg-NH-(C18烷基)。

可以將DILA2氨基酸化合物制備成聚合體或多聚體,如二聚體、三聚體
或四聚體。聚合體或多聚體可以制備自一種或多于一種的DILA2氨基酸化合
物。在一些實施方式中,聚合體或多聚體DILA2氨基酸化合物可以通過在氨
基酸側鏈上提供巰基或其它可交聯基團或使用連接的或系鎖的(tethered)氨基
酸結構(如鎖鏈素或瓜氨酸)來制備。在其它的實施方式中,聚合體或多聚體
DILA2氨基酸化合物可以用生物共軛連接子化學方法來制備。

DILA2氨基酸化合物的實例包括以下結構:


DILA2氨基酸化合物可以制備成具有共價連接到氨基酸側鏈的肽或聚
合物鏈的共軛物。肽或聚合物鏈可以利用氨基酸側鏈反應基團來連接,例如
分別利用半胱氨酸或蛋氨酸的硫醇或甲基硫醇基團,或絲氨酸的醇基,或賴
氨酸的氨基。肽或聚合物鏈可以利用取代或修飾的氨基酸側鏈的任何反應基
團來連接。各種連接子基團,如NHS、馬來酰亞胺基和生物共軛技術和連接
子都可以使用。

DILA2氨基酸化合物可以制備成連接寡聚或聚合框架的構建體。例如,
DILA2氨基酸化合物可以與聚乙二醇、聚丙二醇、寡核苷酸網狀物或網格、
聚(氨基酸)、碳水化合物、葡聚糖、水凝膠或淀粉連接。

DILA2氨基酸化合物可以制備成連接藥物化合物或組合物或生物活性
劑的構建體。例如,DILA2氨基酸化合物可以與核酸藥物如調節性或干擾性
RNA連接。

DILA2氨基酸化合物的實例包括以下結構:


其中R是任意的氨基酸側鏈。

本發明的化合物和組合物可以引入包括聚合體結構的增溶或官能化基團
或結構。參見,如.R.L.Dunn和R.M.Ottenbrite,Polymeric?Drugs?and?Drug?
Delivery?Systems,ACS?Symp.Ser.469(1991)。可以對DILA2氨基酸化合物進
行衍生化以便提高溶解性,例如連接二醇,制備季銨或帶電基團,連接羥基
或胺基如醇、多元醇或聚醚,或連接聚乙烯亞胺、聚乙二醇或聚丙二醇。連
接的聚合體組分如聚乙二醇的分子量可以是任何值,例如200、300、400、
500、750、1000、1250、1500、2000、3000、4000、5000、7500、10,000、
15,000、20,000、25,000或30,000Da或更大。例如,聚乙二醇鏈可以通過氨
基酸側鏈的氨基或其它反應基團來連接。

通常,在本文中,除非另外說明,常規的化學術語是指指定類型的所有
基團,包括具有任何數量和類型的原子的基團。例如“烯基”廣義上是指具有
如下文定義的2至22個碳原子的烷基,其中(C18:1)烯基是指具有18個碳原
子和1個雙鍵的烯基。

在本文中,術語“烷基”是指飽和的,支鏈的或無支鏈的,取代或未取代
的含有1至22個碳原子的脂肪族基團。這些定義可以應用于其它基團的烷基
部分,例如烷氧基、烷酰基、芳烷基和下文定義的其它基團。在本文中,術
語“環烷基”是指飽和的,取代或未取代的含3至12個碳原子的環烷基環。

在本文中,術語“烯基”是指不飽和的,支鏈的或無支鏈的,取代或未取
代的具有2至22個碳原子和至少1個碳碳雙鍵的烷基或環烷基。在本文中,
術語“炔基”是指不飽和的,支鏈的或無支鏈的,取代或未取代的具有2至22
個碳原子和至少1個碳碳三鍵的烷基或環烷基。

在本文中,術語“烷氧基”是指共價鍵合氧原子的烷基、環烷基、烯基或
炔基。在本文中,術語“烷酰基”是指-C(=O)-烷基,其還可稱作“酰基”。在本文
中,術語“烷酰氧基”是指-O-C(=O)-烷基。在本文中,術語“烷基氨基”是指基團
-NRR’,其中R和R’各自是氫或烷基,且至少R和R’之一是烷基。烷基氨
基包括如哌啶基的基團,其中R和R’形成環。術語“烷基氨基烷基”是指-烷
基-NRR’。

在本文中,術語“芳基”是指各環中有4至12個原子的任何穩定的單環、
雙環或多環碳環系統,其中至少一個環是芳香族。芳基的一些實例包括苯基、
萘基、四氫萘基、茚滿基和聯苯。其中芳基取代基是雙環,且一個環是非芳
香族,應該理解連接的是芳環。芳基可以是取代或未取代的。

在本文中,術語“雜芳基”是指任何穩定的各環有4至12個原子的單環的、
雙環的或多環的碳環系統,其中至少一個環是芳香族,且含有1至4個選自
氧、氮和硫的雜原子。雜芳基的一些實例包括吖啶基、喹喔啉基、吡唑基、
吲哚基、苯并三唑基、呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、
異喹啉基、唑基、異唑基、吡嗪基、噠嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基
和四氫喹啉基。雜芳基包括含氮雜芳基的N-氧化物衍生物。

在本文中,術語“雜環”或“雜環基”是指5至22個原子的芳香族或非芳香
族環系統,其中1至4個環原子是選自氧、氮和硫的雜原子。因此,雜環可
以是雜芳基或其二氫或四氫形式。

在本文中,術語“芳酰基”是指衍生自芳香羧酸的芳基基團,如取代的苯
甲酸。術語“芳烷基”在本文中是指鍵合烷基的芳基,例如苯基。

在本文中,術語“羧基”表示式-C(=O)OH或-C(=O)O-的基團。術語“羰基”
和“酰基”在本文中是指氧原子與碳原子以雙鍵鍵合的基團>C=O。在本文中,
術語“羥基”是指-OH或-O-。在本文中,術語“腈”或“氰基”是指-CN。術語“鹵
素”或“鹵代”是指氟代(-F)、氯代(-Cl)、溴代(-Br)和碘代(-I)。

在本文中,術語“取代的”是指原子具有一個或多個取代或取代基,其可
以相同或不同,且可以包括氫取代基。因此,術語烷基、環烷基、烯基、炔
基、烷氧基、烷酰基、烷酰氧基、烷基氨基、烷基氨基烷基、芳基、雜芳基、
雜環、芳酰基和芳烷基在本文中是指包括取代的變體的基團。取代的變體包
括線性的、分支的和環狀變體,和具有代替一個或多個連接到該基團上任意
碳原子的氫的取代基的基團。可連接到基團上碳原子的取代基包括烷基、環
烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷酰基、烷酰氧基、烷基氨基、烷基氨基烷基、
芳基、雜芳基、雜環、芳酰基、芳烷基、酰基、羥基、氰基、鹵代、鹵代烷
基、氨基、氨基酰基、烷基氨基酰基、酰氧基、芳氧基,芳氧基烷基、巰基、
硝基、氨基甲酰基、氨基甲酰基和雜環。例如,術語乙基包括但不限
于:-CH2CH3、-CHFCH3、-CF2CH3、-CHFCH2F、-CHFCHF2、-CHFCF3
、-CF2CH2F、-CF2CHF2、-CF2CF3和如上所述的其它變體。通常,取代基可
以進一步被任何原子或原子基團取代。

DILA2氨基酸化合物可以通過本領域已知的方法來合成。

制備各種有機基團和保護基團的方法是本領域已知的,且通常其應用和
修飾也在本領域技術人員的能力范圍內。參見如Stanley?R.Sandler和Wolf?
Karo,Organic?Functional?Group?Preparations(1989);Greg?T.Hermanson,
Bioconjugate?Techniques(1996);Leroy?G.Wade,Compendium?Of?Organic?
Synthetic?Methods(1980);保護基團的實例見于T.W.Greene和P.G.M.Wuts,
Protective?Groups?In?Organic?Synthesis(第3版,1991)。

例如,可以根據以下路線合成DILA2氨基酸化合物PONA:



具有足夠堿性的本發明的肽或蛋白組合物的藥學上可接受的鹽可以是與
例如無機酸或有機酸的酸加成鹽,所述無機酸或有機酸如鹽酸、氫溴酸、硫
酸、硝酸、磷酸、氯磺酸、三氟乙酸、檸檬酸、馬來酸、醋酸、丙酸、草酸、
蘋果酸、馬來酸、丙二酸、富馬酸或酒石酸,和烷烴磺酸或芳烴磺酸,如甲
磺酸、乙磺酸、苯磺酸、氯苯磺酸、甲苯磺酸、萘磺酸、萘二磺酸和樟腦磺
酸。

具有足夠酸性的本發明的肽或蛋白組合物的藥學上可接受的鹽可以是堿
金屬鹽,例如鈉或鉀鹽,或堿土金屬鹽,例如鈣或鎂鹽,或鋅或錳鹽,或銨
鹽,或可提供生理學上可接受陽離子的有機堿的鹽,例如甲胺、二甲胺、三
甲胺、三乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、乙二胺、三乙醇胺、N-甲基
葡糖胺、哌啶、嗎啉或三-(2-羥基乙基)胺的鹽,且包括氨基酸如精氨酸的鹽,
和有機酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸的鹽。參見如Berge等,J.Pharm.Sci.
66:1-19,1977。

包含干擾RNA制劑和DILA2氨基酸化合物、脂質、肽或蛋白的本發明
組合物的鹽或藥學上可接受的鹽還可以包含干擾RNA試劑和DILA2氨基酸
化合物、脂質、肽或蛋白的鹽復合物。干擾RNA試劑和DILA2氨基酸化合
物、脂質、肽或蛋白的鹽復合物可以自干擾RNA試劑的藥學上可接受的鹽
形成,或自DILA2氨基酸化合物、脂質、肽或蛋白的藥學上可接受的鹽形成。

本發明的某些化合物可以同時包括堿性和酸性官能團,這能將化合物制
成堿或酸加成鹽。

本發明的一些化合物、肽和/或蛋白組合物可以具有一個或多個手性中心
和/或幾何異構中心(E-和Z-異構體),且應該理解本發明涵蓋全部此類光學異
構體、非對映異構體、幾何異構體和它們的混合物。

本發明涵蓋本文公開的任何和全部互變異構體、溶劑化物或非溶劑化物、
水合或非水合形式、以及化合物的任何原子同位素形式、肽和/或蛋白組合物。

脂質

在本發明的一些方面中,一種或多種DILA2氨基酸化合物和一種或多種
脂質可以用于遞送和施用調節性RNA組分、RNA拮抗劑、干擾性RNA或
核酸。更具體地,本發明的組合物可以包括一種或多種DILA2氨基酸化合物
以及陽離子脂質和非陽離子脂質。

陽離子脂質可以是單陽離子或聚陽離子。一些陽離子脂質包括中性脂質
和在特定pH下大致具有零凈電荷的脂質,例如,兩性脂質。非陽離子脂質
也包括陰離子脂質。

在一些實施方式中,組合物是RNA組分與DILA2氨基酸化合物和陽離
子脂質的混合物或復合物。在一些實施方式中,組合物可以是一種或多種調
節性或干擾性RNA試劑與一種或多種DILA2氨基酸化合物和一種或多種陽
離子脂質的混合物或復合物。

本發明的化合物和組合物可以與各種用于遞送活性劑至有機體細胞、組
織、器官或區域的靶向配體或試劑混合或連接。靶向試劑的實例包括抗體、
受體的配體、肽、蛋白、凝集素、(聚)糖、半乳糖、甘露糖、環糊精、核酸、
DNA、RNA、核酸適配子和聚氨基酸。

陽離子脂質的實例包括N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化
銨(DOTMA);1,2-雙(油酰氧基)-3-3-(三甲基銨)丙烷(DOTAP)、1,2-雙(二肉豆
蔻氧基)-3-3-(三甲基氨)丙烷(DMTAP);1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-二甲基羥基
乙基溴化銨(DMRIE);二甲基雙十八烷基溴化銨(DDAB);3-(N-(N′,N′-二甲基
氨基乙烷)氨基甲酰)膽固醇(DC-Chol);3β-[N′,N′-二胍基乙基-氨基乙烷]氨基
甲酰膽固醇(BGTC);2-(2-(3-(雙(3-氨基丙基)氨基)丙基氨基)乙酰胺基)-N,N-
雙十四烷基乙酰胺(RPR209120);它們的藥學上可接受的鹽和它們的混合物。

陽離子脂質的實例包括1,2-二烯酰基-錫-甘油基-3-乙基磷酸膽堿(EPC),
如1,2-二油酰-錫-甘油基-3-乙基磷酸膽堿、1,2-二硬脂酰-錫-甘油基-3-乙基磷
酸膽堿、1,2-二棕櫚酰-錫-甘油基-3-乙基磷酸膽堿、它們的藥學上可接受的鹽
和它們的混合物。

陽離子脂質的實例包括1,2-二硬脂酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷
(DSDMA)、1,2-二油酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、1,2-二亞油酰
氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)和1,2-二亞油酰氧基-N,N-二甲基-3-
氨基丙烷(DLenDMA)。

聚陽離子脂質的實例包括四甲基四棕櫚酰精胺(TMTPS)、四甲基四油烯
基精胺(TMTOS)、四甲基四月桂基精胺(TMTLS)、四甲基四肉豆蔻基精胺
(TMTMS)、四甲基二油烯基精胺(TMDOS)、它們的藥學上可接受的鹽和它們
的混合物。

聚陽離子脂質的實例包括2,5-雙(3-氨基丙基氨基)-N-(2-(雙十八烷基氨
基)-2-氧乙基)戊酰胺(DOGS);2,5-雙(3-氨基丙基氨基)-N-(2-(二(Z)-十八碳-9-
二烯基氨基)-2-氧乙基)戊酰胺(DOGS-9-en);2,5-雙(3-氨基丙基氨基)-N-(2-(二
(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基氨基)-2-氧乙基)戊酰胺(DLinGS);
3-β-(N4-(N1,N8-二羰苯酰氧基亞精胺)氨基甲酰)膽固醇(GL-67)、
(9Z,9’Z)-2-(2,5-雙(3-氨基丙基氨基)戊氨基)丙烷-1,3-二基-雙十八碳-9-烯酸酯
(DOSPER);2,3-二油烯氧基-N-[2(精胺甲酰氨基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙銨三
氟乙酸酯(DOSPA);它們的藥學上可接受的鹽和它們的混合物。

陽離子脂質的實例包括DS404-28?BGTC(CAS?182056-06-0)、
DOSPER(CAS?178532-92-8)、GL-67(179075-30-0)、RPR209120(CAS?
433292-13-8)、DOGS(12050-77-7)、DOGS(9-en,C18:1)、DLinGS(C18:2)和
DOTMA(104162-48-3)。

陽離子脂質的實例描述于美國專利4,897,355、5,279,833、6,733,777、
6,376,248、5,736,392、5,334,761、5,459,127、2005/0064595、5,208,036、
5,264,618、5,279,833、5,283,185、5,753,613和5,785,992中。

在一些實施方式中,組合物是RNA組分和DILA2氨基酸化合物和非陽
離子脂質的混合物或復合物。在一些實施方式中,組合物是一種或多種RNA
組分和一種或多種DILA2氨基酸化合物和一種或多種非陽離子脂質的混合
物或復合物。

非陽離子脂質包括中性、兩性和陰離子脂質。因此,非陽離子兩性脂質
可以包括陽離子頭基。

非陽離子脂質的實例包括1,2-二月桂酰-錫-甘油(DLG);1,2-二肉豆蔻酰-
錫-甘油(DMG);1,2-二棕櫚酰-錫-甘油(DPG);1,2-二硬脂酰-錫-甘油(DSG);
1,2-二月桂酰-錫-甘油基-3-磷脂酸(鈉鹽;DLPA);1,2-二肉豆蔻酰-錫-甘油基
-3-磷脂酸(鈉鹽;DMPA);1,2-二棕櫚酰-錫-甘油基-3-磷脂酸(鈉鹽;DPPA);
1,2-二硬脂酰-錫-甘油基-3-磷脂酸(鈉鹽;DSPA);1,2-二花生酰-錫-甘油基-3-
磷酸膽堿(DAPC);1,2-二月桂酰-錫-甘油基-3-磷酸膽堿(DLPC);1,2-二肉豆
蔻酰-錫-甘油基-3-膽堿磷酸(DMPC);1,2-二棕櫚酰-錫-甘油基-0-乙基-3-膽堿
磷酸(氯化物或三氟甲磺酸鹽;DPePC);1,2-二棕櫚酰-錫-甘油基-3-膽堿磷酸
(DPPC);1,2-二硬脂酰-錫-甘油基-3-膽堿磷酸(DSPC);1,2-二月桂酰-錫-甘油
基-3-磷酸乙醇胺(DLPE);1,2-二肉豆蔻酰-錫-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DMPE);
1,2-二棕櫚酰-錫-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE);1,2-二硬脂酰-錫-甘油基-3-磷
酸乙醇胺(DSPE);1,2-二月桂酰-錫-甘油基-3-磷酸甘油(鈉鹽;DLPG);1,2-
二肉豆蔻酰-錫-甘油基-3-磷酸甘油(鈉鹽;DMPG);1,2-二肉豆蔻酰-錫-甘油
基-3-磷酸-錫-1-甘油(銨鹽;DMP-錫-1-G);1,2-二棕櫚酰-錫-甘油基-3-磷酸甘
油(鈉鹽;DPPG);1,2-二硬脂酰-錫-甘油基-3-磷酸甘油(鈉鹽;DSPG);1,2-
二硬脂酰-錫-甘油基-3-磷酸-錫-1-甘油(鈉鹽;DSP-錫-1-G);1,2-二棕櫚酰-錫-
甘油基-3-磷酸-L-絲氨酸(鈉鹽;DPPS);1-棕櫚酰-2-亞油酰-錫-甘油基-3-膽堿
磷酸(PLinoPC);1-棕櫚酰-2-油酰-錫-甘油基-3-膽堿磷酸(POPC);1-棕櫚酰-2-
油酰-錫-甘油基-3-磷酸甘油(鈉鹽;POPG);1-棕櫚酰-2-油酰-錫-甘油基-3-磷
酸甘油(鈉鹽;POPG);1-棕櫚酰-2-油酰-錫-甘油基-3-磷酸甘油(銨鹽;POPG);
1-棕櫚酰-2-4o-錫-甘油基-3-膽堿磷酸(P-溶-PC);1-硬脂酰-2-溶-錫-甘油基-3-
膽堿磷酸(S-溶-PC);和它們的混合物。

非陽離子脂質的實例包括聚合化合物和聚合物脂質共軛物或聚合脂質,
如含有分子量為300、500、1000、1500、2000、3500或5000的PEG區的聚
乙二醇化的脂質,包括聚乙二醇、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二肉豆
蔻酰-錫-甘油基-3-磷酸乙醇胺(鈉鹽;DMPE-MPEG-2000);N-(羰基-甲氧基聚
乙二醇-5000)-1,2-二肉豆蔻酰-錫-甘油基-3-磷酸乙醇胺(鈉鹽;
DMPE-MPEG-5000);N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二棕櫚酰-錫-甘油基
-3-磷酸乙醇胺(鈉鹽;DPPE-MPEG-2000);N-(羰基-甲氧基聚乙二醇5000)-1,2-
二棕櫚酰-錫-甘油基-3-磷酸乙醇胺(鈉鹽;DPPE-MPEG-5000);N-(羰基-甲氧
基聚乙二醇750)-1,2-二硬脂酰-錫-甘油基-3-磷酸乙醇胺(鈉鹽;
DSPE-MPEG-750);N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-錫-甘油基
-3-磷酸乙醇胺(鈉鹽;DSPE-MPEG-2000);N-(羰基-甲氧基聚乙二醇5000)-1,2-
二硬脂酰-錫-甘油基-3-磷酸乙醇胺(鈉鹽;DSPE-MPEG-5000);膽固醇硫酸酯
鈉鹽(SCS);它們的藥學上可接受的鹽和它們的混合物。

非陽離子脂質的實例包括聚合脂質,如DOPE-PEG、DLPE-PEG、
DDPE-PEG?DLinPE-PEG和二酰基甘油-PEG-2000或二酰基甘油-PEG-5000。

非陽離子脂質的實例包括聚合脂質,如多支聚乙二醇化化合物,例如
DSPE-PTE020和DSPE-AM0530K。

非陽離子脂質的實例包括聚合脂質,如DSPE-PG8G聚甘油脂質。

非陽離子脂質的實例包括二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二植烷酰磷脂酰
乙醇胺(DPhPE)、1,2-二油酰-錫-甘油基-3-膽堿磷酸(DOPC)和1,2-二植烷酰-
錫-甘油基-3-膽堿磷酸(DPhPC)。

非陽離子脂質的實例包括膽固醇、固醇和類固醇,如甾烷、雌烷、雄烷、
孕烷、膽烷、膽甾烷、麥角甾烷、菜油甾烷、多孔甾烷、豆甾烷、柳珊瑚甾
烷、羊毛甾烷、環波羅烷、以及前述物質的任何固醇或動物甾醇衍生物和它
們的生物中間體和前體,其包括例如膽固醇、羊毛固醇、豆甾烷醇、二氫羊
毛甾醇、酵母甾醇、酵母甾烯醇、鏈甾醇、7-脫氫膽固醇和它們的混合物和
衍生物。

非陽離子脂質的實例包括聚乙二醇化的膽固醇和膽甾烷3-氧代(C1-22酰
基)衍生物,如膽固醇乙酸酯、膽固醇花生四烯酸酯、膽固醇丁酸酯、膽固醇
己酸酯、膽固醇辛酸酯、膽固醇正癸酸酯、膽固醇十二烷酸酯、膽固醇肉豆
蔻酸酯、膽固醇棕櫚酸酯、膽固醇山崳酸酯、膽固醇硬脂酸酯、膽固醇神經
酸酯、膽固醇壬酸酯、膽固醇正戊酸酯、膽固醇油酸酯、膽固醇反油酸脂、
膽固醇芥酸酯、膽固醇庚酸酯、膽固醇反亞油酸酯、膽固醇亞油酸脂和它們
的混合物和衍生物。

非陽離子脂質的實例包括衍生自植物固醇的化合物,包括植物甾醇、β-
谷甾醇、菜油甾醇、麥角甾醇、菜子甾醇、δ-7-豆甾醇、δ-7-燕麥甾醇和它們
的混合物和衍生物。

非陽離子脂質的實例包括膽汁酸、膽酸、鵝膽酸、甘氨膽酸、牛磺膽酸、
脫氧膽酸、石膽酸、甲基石膽酸和它們的混合物和衍生物。

非陽離子脂質的實例包括衍生自類固醇的化合物,包括糖皮質激素、皮
質醇、氫化可的松、皮質脂酮、Δ5-孕烯醇酮、孕酮、去氧皮質脂酮、17-OH-
孕烯醇酮、17-OH-孕酮、11-去氧皮質醇、脫氫表雄甾酮、硫酸脫氫表雄甾酮、
雄烯二酮、醛甾酮、18-羥基皮質甾酮、四氫化可的索、四氫化可的松、可的
松、波尼松、6α-甲基強的松、9α-氟-16α-羥基波尼松龍、9α-氟-16α-甲基波尼
松龍、9α-氟皮質醇和它們的混合物和衍生物。

非陽離子脂質的實例包括衍生自類固醇的化合物,包括雄激素、睪酮、
二氫睪酮、雄(甾)烯二醇、雄(甾)烯二酮、雄(甾)烯二酮、3α,5α-雄(甾)烷二醇
和它們的混合物和衍生物。

非陽離子脂質的實例包括衍生自類固醇的化合物,包括雌激素、雌三醇、
雌素酮、雌二醇和它們的混合物和衍生物。

非陽離子脂質的實例包括衍生自光甾醇和維生素D化合物的化合物。

非陽離子脂質的實例包括具有范圍從C10:0至C22:6的尾的脂質,例如
DDPE(C10:0)(CAS?253685-27-7)、DLPE(C12:0)(CAS?59752-57-7)、
DSPE(C18:0)(CAS?1069-79-0)、DOPE(C18:1)(CAS?4004-05-1)、
DLinPE(C18:2)(CAS?20707-71-5)、DLenPE(C18:3)(CAS?34813-40-6)、
DARAPE(C20:4)(CAS?5634-86-6)、DDHAPE(C22:6)(CAS?123284-81-1)、
DPhPE(16:0[(CH3)4])(CAS?201036-16-0)。

陰離子脂質的實例包括磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、磷脂酰膽堿、血小板活
化因子(PAF)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰-DL-甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇
(pi(4)p、pi(4,5)p2)、心磷脂(鈉鹽)、溶血磷脂、氫化磷脂、鞘脂、神經節苷脂、
植物鞘氨醇、鞘氨醇、它們的藥學上可接受的鹽和它們的混合物。

用于遞送RNA治療劑的應用

在一些方面中,本發明大體涉及調節性RNA和RNA干擾、反義治療劑
和RNA治療劑的遞送領域。更具體地說,本發明涉及核糖核酸的組合物和
制劑,和其用于藥劑和作為治療劑用于遞送的用途。本發明大體涉及在RNA
干擾中使用核糖核酸在細胞或在哺乳動物中進行基因表達的基因特異性抑
制,從而改變疾病狀態或表型的方法。

RNA干擾是指通過稱作短干擾性RNA(siRNA)的雙鏈RNA(dsRNA)介導
的序列特異性轉錄后基因沉默的方法。參見Fire等,Nature?391:806,1998,和
Hamilton等,Science?286:950-951,1999。RNAi為不同菌群和門為共有,而且
確信是抵抗外來基因表達的進化保守性細胞防御機制。參見Fire等,Trends?
Genet.15:358,1999。

因此RNAi是普遍存在的內源機制,其利用小型的非編碼RNA來沉默基
因表達。參見Dykxhoorn,D.M.和J.Lieberman,Annu.Rev.Biomed.Eng.
8:377-402,2006。RNAi可以調節參與細胞死亡、分化和發育的重要基因。
RNAi還可以防止基因組免受由轉座子和病毒編碼的遺傳元件侵襲。當將
siRNA導入細胞中時,它可以結合內源RNAi結構,從而破壞含具高度特異
性的互補序列的mRNA的表達。任何致病基因和任何細胞類型或組織都可以
潛在地被靶向。該技術已經快速用于基因功能分析和藥物靶的發現和確認。
控制性RNAi也具有很大的治療前途,雖然將siRNA導入體內細胞還存在著
許多障礙。

雖然RNAi的機制尚未完全表征,但認為是通過切割靶mRNA。RNAi
應答涉及稱為RNA誘導的沉默復合物(RISC)的核酸內切酶復合物,其介導互
補于siRNA雙螺旋反義鏈的單鏈RNA的切割。靶RNA的切割發生在互補于
siRNA雙螺旋反義鏈的區域中間(Elbashir等,Genes?Dev.15:188,2001)。

實現RNAi的一個方法是將siRNA引入細胞或在細胞中表達siRNA。另
外一個方法是利用稱作切丁酶的內源核糖核酸酶III酶。切丁酶的一個活性是
將長dsRNA加工成siRNA。參見Hamilton等,Science?286:950-951,1999;
Berstein等,Nature?409:363,2001。衍生自切丁酶的siRNA通常是全長約21
至23個核苷酸,并有約19個堿基對雙螺旋化。參見Hamilton等,見上;Elbashir
等,Genes?Dev.15:188,2001。實質上,可以將長dsRNA作為siRNA的前體導
入細胞。

本發明提供了一系列的組合物、制劑和方法,其包括調節性RNA、干擾
性核酸或其前體與包括DILA2氨基酸化合物、脂質和天然或合成的聚合物在
內的各種組分的組合。

在本文中,術語“dsRNA”是指任何雙鏈RNA分子,其能抑制或下調基因
表達,例如以序列特異性方式通過促進RNA干擾(“RNAi”或“iRNA”)或基因
沉默。本發明的dsRNA可以是適合切丁酶的底物,或是適合與RISC結合以
通過RNAi來介導基因沉默的底物。dsRNA的一條或兩條鏈可以進一步包括
末端磷酸基團,如5’-磷酸或5’,3’-二磷酸。在本文中,dsRNA分子,除了至
少一個核糖核苷酸之外,可以進一步包括取代、化學修飾的核苷酸和非核苷
酸。

dsRNA分子的實例可參見例如美國專利申請號11/681,725、美國專利號
7,022,828和7,034,009和PCT國際申請公開號WO/2003/070897。

如PCT國際申請公開號WO2008/147824中的描述,本發明的核酸試劑
的實例可以包含一個或多個無環單體。無環單體的實例包括WO2008/147824
的圖1和2中所示的單體D至單體J。

本發明的活性劑的實例包括含有WO2008/147824中的無環單體的核酸
分子。

本發明的活性劑的實例包括UsiRNA。UsiRNA是包含UNA的siRNA,
其中UNA是“開鎖的核苷堿基類似物”(unlocked?nucleobase?analog)。
WO2008/147824的無環單體D至無環單體J是UNA的實例。

經修飾的核苷酸的實例參見美國專利號6,403,566、6,509,320、6,479,463、
6,191,266、6,083,482、5,712,378和5,681,940。經修飾的核苷酸可以具有以下
結構:


其中,X是O或CH2,Y是O,且Z是CH2;R1選自下述基團:腺嘌呤、
胞嘧啶、鳥嘌呤、次黃嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶和雜環,其中雜環是選自下
述基團:取代的1,3-二嗪、未取代的1,3-二嗪和未取代的7H咪唑并[4,5]1,3-
二嗪;且R2、R3獨立地選自基團H、OH、DMTO、TBDMSO、BnO、THPO、
AcO、BzO、OP(NiPr2)O(CH2)2CN、OPO3H、二磷酸鹽和三磷酸鹽,其中R2
和R3同時可以是PhCHO2、TIPDSO2或DTBSO2。在本文中,縮寫“Ac”是指
乙酰基;縮寫“Bn”是指苯甲基;縮寫“Bz”是指苯甲酰基;縮寫“DMT”是指二
甲氧基三苯甲基;縮寫“THP”是指四氫吡喃基;縮寫“TBDMS”是指叔丁基二
甲基甲硅烷基;縮寫“TIPDS”是指四異丙基二甲硅烷基;和縮寫“DTBS”是指
二(叔丁基)甲硅烷基。

另外,在本文中,術語“dsRNA”、“RNAi誘導劑”和“RNAi制劑”與其它
用于描述能介導序列特異性RNAi的核酸分子的術語是同義的,包括部分雙
螺旋RNA(meroduplex?RNA,mdRNA)、帶切口的dsRNA(ndsRNA)、缺口的
dsRNA(gdsRNA)、短干擾性核酸(siRNA)、siRNA、微RNA(miRNA)、單鏈
RNA、短發夾RNA(shRNA)、短干擾性寡核苷酸、短干擾性取代的寡核苷酸、
短干擾性修飾的寡核苷酸、化學修飾的dsRNA和轉錄后基因沉默性
RNA(ptgsRNA)、以及上述任一的前體。

術語“大雙鏈(ds)RNA”是指大于約40個堿基對(bp)至約100bp或更大,
尤其是高至約300bp至約500bp的任意雙鏈RNA。大dsRNA序列可以代表
mRNA片段或完整的mRNA。雙鏈結構可以通過自身互補的核酸分子形成或
通過兩種或多種不同的互補核酸分子鏈退火形成。

在一些方面中,dsRNA包括包含第一鏈(反義)和第二鏈(正義)的兩個分
離的寡核苷酸,其中所述反義鏈和所述正義鏈是自身互補的(即各鏈含有與另
一條鏈核苷酸序列互補的核苷酸序列,且兩條分離的鏈形成雙螺旋或雙鏈結
構,例如,其中雙鏈區是約15至約24個堿基對,或約26至約40個堿基對);
反義鏈包括互補于靶核酸分子(如人mRNA)中的核苷酸序列的核苷酸序列或
其部分;且正義鏈包括對應于(即同源于)靶核酸序列中的核苷酸序列或其部
分(如對應于靶核酸約15至約25個核苷酸或約26至約40個核苷酸的正義鏈
或其部分)。

在一些實施方式中,dsRNA可以組裝自單一寡核苷酸,其中dsRNA的
自身互補的正義鏈和反義鏈一起通過核酸基連接子或非核酸基連接子相連
接。在一些實施方式中,dsRNA分子的第一(反義)鏈和第二(正義)鏈通過如
本文描述的和本領域所已知的核苷酸或非核苷酸連接子共價連接。在一些實
施方式中,第一dsRNA分子通過本領域已知的核苷酸或非核苷酸連接子與至
少一個第二dsRNA分子共價連接,其中第一dsRNA分子可以與多個其它
dsRNA分子(相同或不同)或其其任意組合物連接。在一些實施方式中,連接
的dsRNA可以包括與連接的dsRNA形成部分雙螺旋的第三鏈。

在一些方面,本文所述的dsRNA分子形成具有三條或更多鏈的部分雙螺
旋RNA(mdRNA),例如′A′(第一或反義)鏈、′S1′(第二)鏈和′S2′(第三)鏈,其中
′S1′和′S2′鏈與′A′鏈的非重疊區互補并與之形成堿基對(bp)(如mdRNA可以具
有A:S1S2形式)。S1、S2或更多的鏈共同本質上含有′A′鏈的正義鏈。通過′S1′
和′A′鏈退火形成的雙鏈區與通過′S2′和′A′鏈退火形成的雙鏈區不相同且非重
疊。mdRNA分子是“缺口”分子,意思是范圍為0個核苷酸到高至約10個核
苷酸的“缺口”。在一些實施方式中,A:S1雙螺旋與A:S2雙螺旋被產生于′A′
鏈的至少一個非配對核苷酸(高至約10個非配對核苷酸)的缺口分開,所述缺
口位于A:S1雙螺旋和A:S2雙螺旋之間,而且不同于一種或多種′A′、′S1′或′S2′
鏈的3’-端的任何一個或多個非配對核苷酸。在一些實施方式中,A:S1雙螺
旋與A:B2雙螺旋被在A:S1雙螺旋和A:S2雙螺旋間的零核苷酸缺口分開(即
其中多核苷酸分子中僅位于兩個核苷酸間的磷酸二酯鍵被打開或缺失的缺
口),其也稱作帶切口的dsRNA(ndsRNA)。例如,A:S1S2可以由具有總共約
14個堿基對至約40個堿基對的至少兩個雙鏈區的dsRNA組成,且雙鏈區被
約0至約10個核苷酸的缺口分開,任選地具有平末端,或A:S1S2可以具有
由高至10個核苷酸的缺口分開的至少兩個雙鏈區的dsRNA組成,其中至少
一個雙鏈區含有約5個堿基對至13個堿基對。

如本文所述,含有三條或更多條鏈的dsRNA可以被稱作“部分雙螺
旋”RNA(mdRNA)。mdRNA分子的實例可以參見美國臨時專利申請
60/934,930和60/973,398。

dsRNA或大dsRNA可以包括取代或修飾,其中所述取代或修飾可以在
磷酸骨架鍵、糖、堿基或核苷中。所述核苷取代可以包括天然的非標準核苷(如
5-甲基尿苷或5-甲基胞苷或2-硫代胸腺嘧啶核糖核苷),且所述骨架、糖或核
苷修飾可以包括烷基或雜原子取代或添加,如甲基、烷氧基烷基、鹵素、氮
或硫或本領域已知的其它修飾。

另外,在本文中,術語“RNAi”的意思等同于用于描述序列特異性RNA
干擾的其它術語,如轉錄后基因沉默、翻譯抑制或表觀遺傳學。例如,本發
明的dsRNA分子可以用于在轉錄后水平或轉錄前水平或其組合上通過表觀
遺傳學沉默基因。

在一些方面中,本發明提供了包括靶向一種或多種基因或靶轉錄物的一
種或多種RNAi誘導劑以及一種或多種遞送組分的組合物。遞送組分的實例
包括DILA2氨基酸化合物、脂質、肽、聚合物、聚合脂質和它們的共軛物。

本發明的組合物和制劑可以用于將RNAi誘導實體如dsRNA、siRNA、
mdRNA、miRNA、shRNA或RNAi誘導載體遞送至完整的哺乳動物受治療
者的細胞內,而且可以用于將這些制劑遞送至培養中的細胞內。

本發明還提供了將一種或多種RNAi誘導劑或實體遞送至哺乳動物體內
的細胞、器官和組織的方法。在一些方面,可以通過不同的途徑引入包含
RNAi誘導實體的組合物以使其在體內轉運并被一種或多種器官或組織內的
細胞攝取,在此可以調控靶轉錄物的表達。

通常,本發明包括RNAi誘導劑,其是預防和治療以各種異常過程為特
征的疾病或病癥的有用治療劑。例如,感染哺乳動物的病毒可以通過控制宿
主細胞的細胞機制來進行復制。參見如Fields?Virology(2001)。因此,dsRNA
可用于破壞控制病毒產生或復制的病毒路徑。

本發明包括通過利用具有廣譜抵抗靶病毒株效力的一種或多種治療性
RNAi誘導劑來治療或預防受治療者病毒感染的方法。本發明的RNAi誘導
劑可以靶向已知的病毒變異株或病毒變異體中的病毒基因序列,并且在這些
變異體內表現出靶病毒基因的序列特異性基因沉默。例如,RNAi誘導劑可
以靶向和表現出抵抗流感病毒季節毒株以及流感變異株的效力。

本發明的組合物和制劑可以用于在體外遞送藥物制劑或生物活性劑至各
種細胞。體外遞送的細胞實例包括表皮細胞如A549、永久細胞系如HeLa、
肝細胞瘤細胞如HepG2、大鼠膠質肉瘤細胞如9L/LacZ、人單核細胞如THP-1、
馬-達二氏犬腎細胞(MDCK)、各種纖維原細胞系和在存在或缺失各種血清的
情況下培養的原代細胞等。

本發明的組合物和制劑可用于在體內遞送藥物試劑或生物活性劑至各種
細胞、組織或器官。體內遞送試劑的方法包括局部、腸內和腸胃外途徑。體
內遞送試劑的方法實例包括顆粒或液滴吸入,鼻或鼻咽滴劑、顆粒或懸浮液
遞送,透皮和經粘膜途徑,以及通過肌肉內、皮下、靜脈內、動脈內、心臟
內、鞘內、骨內、腹膜內和硬膜外的注射或輸注途徑。

在一些實施方式中,試劑可以通過直接接觸來源于哺乳動物受治療者的
細胞、組織或器官而離體給藥。

利用本發明的組合物或制劑來遞送的藥物試劑或生物活性劑可以是任何
形式,包括例如純凈形式、結晶形式、固體形式、納米顆粒、縮合形式、復
合物形式或共軛物形式。

本發明還提供了遞送一種或多種RNAi誘導實體至哺乳動物體內的器官
和組織的方法。在一些實施方式中,可以通過不同的途徑引入包含RNAi誘
導實體、一種或多種DILA2氨基酸化合物和一種或多種脂質組分的組合物以
使其在體內轉運并被一種或多種器官或組織內的細胞攝取,在此可以調控靶
轉錄物的表達。

本發明提供了含有治療性遞送核酸和基因沉默RNA的各種DILA2氨基
酸化合物或脂質的藥學上可接受的核酸組合物。具體地說,本發明提供了用
于體外和體內遞送dsRNA以降低、下調或沉默靶核酸序列翻譯或基因表達的
組合物和方法。這些組合物和方法可用于預防和/或治療哺乳動物中的疾病。
在本發明的示例性的方法中,使核糖核酸分子如siRNA或shRNA與DILA2
氨基酸化合物接觸以配制成能施用于細胞或受治療者(如哺乳動物)的組合
物。在一些實施方式中,本發明提供了通過使含核酸的組合物與細胞接觸來
在細胞內遞送siRNA或shRNA的方法。

在示例性的實施方式中,本發明包括包含核酸分子如雙鏈RNA(dsRNA)、
短干擾性RNA(siRNA)或短發夾RNA(shRNA)的組合物,所述核酸分子與
DILA2氨基酸化合物和聚合脂質混合或復合以形成提高核酸分子細胞內遞
送的組合物。在一些實施方式中,本發明的遞送組合物可以包括dsRNA和可
以是陽離子或非陽離子的一種、兩種或多種DILA2氨基酸化合物。在某些變
式中,遞送組合物可以包含dsRNA、DILA2氨基酸化合物和一種或多種聚合
脂質。在一些實施方式中,遞送組合物可以包括dsRNA、一種或多種DILA2
氨基酸化合物、一種或多種脂質和一種或多種聚合脂質。本發明的組合物可
以形成穩定顆粒,其能引入作為干擾性RNA制劑的dsRNA。本發明的組合
物和制劑可以包括進一步的遞送增強組分或賦形劑。

在一些實施方式中,本發明的組合物包括直徑約5nm至約400nm的穩定
的含RNA顆粒。在一些實施方式中,顆粒可以具有約10nm至約300nm的均
勻直徑。在一些實施方式中,顆粒可以具有約50nm至約150nm的均勻直徑。

在本發明的示例性的組合物中,雙鏈RNA可以與DILA2氨基酸化合物混
合或復合,以形成相比于使靶細胞與裸dsRNA接觸能提高dsRNA細胞內遞送
的組合物。

在一些實施方式中,本發明的組合物可以包含占DILA2氨基酸化合物和
脂質(如果存在)總量約0.5%至約70%(摩爾%)的一種或多種DILA2氨基酸化
合物,和包括任何聚合組分但不包括RNA組分的遞送增強組分。在一些實
施方式中,本發明的組合物可以包括約10%至約55%的一種或多種DILA2
氨基酸化合物。在一些實施方式中,本發明的組合物可以包括約15%至約35%
的一種或多種DILA2氨基酸化合物。

在一些實施方式中,本發明的組合物可以包含占DILA2氨基酸化合物和
脂質(如果存在)總量約2%至約95%(摩爾%)的一種或多種非陽離子脂質,和
包括任何聚合組分但不包括RNA組分的遞送增強組分。在一些實施方式中,
本發明的組合物可以包含約20%至約75%或約45%至約75%或約45%至約
55%的一種或多種非陽離子脂質。在一些實施方式中,本發明的組合物可以
包含約10%至約50%的一種或多種非陽離子脂質。

在一些實施方式中,本發明的組合物可以包含占DILA2氨基酸化合物和
脂質(如果存在)總量約0.2%至約20%(摩爾%)的一種或多種聚合脂質,和包
括任何聚合組分但不包括RNA組分的遞送增強組分。在一些實施方式中,
本發明的組合物可以包括約0.5%至約10%的一種或多種聚合脂質。在一些實
施方式中,本發明的組合物可以包含占組合物約1%至約5%的一種或多種聚
合脂質。

核酸治療劑組合物和應用

在一些實施方式中,本發明提供了一種治療哺乳動物受治療者疾病或病
癥的方法。可以向患有與能被該組合物降低、減少、下調或沉默的基因表達
或過表達相關疾病或病癥的受治療者施用包含干擾性RNA、DILA2氨基酸化
合物、非陽離子脂質、聚合脂質和一種或多種遞送增強組分或賦形劑的治療
有效量的本發明組合物。

本發明包括通過向受治療者施用治療有效量的組合物來治療肺部疾病,
如呼吸窘迫、哮喘、囊性纖維化、肺纖維化、慢性阻塞性肺病、支氣管炎或
肺氣腫的方法。

本發明包括治療包括癌癥、膀胱癌、肝癌、肝病、高膽固醇血癥、炎癥
性疾病、代謝性疾病、炎癥、關節炎、類風濕性關節炎、腦炎、骨折、心臟
病、病毒性疾病、肝炎和流感在內的疾病的方法。

制備脂質體的方法參見例如G.Gregoriadis,Liposome?Technology(CRC?
Press?1984),和M.J.Ostro,Liposomes(Marcel?Dekker?1987)。

可以首先在適合的培養基如細胞培養基中將核酸組分、DILA2氨基酸化
合物和其它組分混合在一起,然后添加一種或多種脂質或化合物至該混合物。
可選地,可以首先在適合的培養基如細胞培養基中混合DILA2氨基酸化合
物,然后添加核酸組分。

在本發明的一些實施方式中,將dsRNA與一種或多種DILA2氨基酸化
合物或一種或多種DILA2氨基酸化合物和非陽離子脂質的組合物混合。

干擾性RNA試劑還可以與DILA2氨基酸化合物或聚合脂質復合或共軛,
并與一種或多種非陽離子脂質,或一種或多種非陽離子和陽離子脂質的組合
物混合。

可以首先將干擾性RNA試劑和DILA2氨基酸化合物混合在一起,然后
加入一種或多種非陽離子脂質或加入到適合培養基如細胞培養基中的非陽離
子和陽離子脂質組合。可選地,可以首先混合DILA2氨基酸化合物和脂質組
分,然后加入適合培養基中的RNA試劑。

在一些實施方式中,本發明包括膠束分散組合物,其含有與DILA2氨基
酸化合物和分散劑混合或復合的藥物或活性劑,從而形成提供細胞內遞送藥
物或活性劑的組合物。

在一些實施方式中,本發明的分散組合物可以包括一種或多種藥物或活
性劑、一種或多種DILA2氨基酸化合物和一種或多種分散劑。在某些變式中,
遞送組合物可以包括藥物或活性劑、分散劑、DILA2氨基酸化合物和任選的
聚合脂質。本發明的分散組合物可以形成能引入藥物或活性劑的穩定顆粒。

在一些方面中,本發明的分散組合物可以包含直徑約5nm至約400nm的
穩定的核酸分散顆粒。在一些實施方式中,顆粒可以具有約10nm至約300nm
的均勻直徑。在一些實施方式中,顆粒可以具有約50nm至約150nm的均勻
直徑。

膠束分散體可以用于配制和改進包括RNAi治療劑的藥物或活性劑的生
物利用率。膠束分散體可以提供具有疏水性油樣核心的分散液滴或納米顆粒。
分散納米顆粒可以懸浮在連續水相中。分散結構利用脂質體結構來遞送活性
劑可以避免固有的某些弱勢,而且因為親脂性核心而可以提供遞送優勢。

本發明提供了一系列的膠束分散組合物,其包含用于藥物或藥劑且用于
遞送和施用RNA制劑的DILA2氨基酸化合物或脂質和分散劑。

分散劑的實例包括合成化合物,包括聚氧甘油酯,如聚乙二醇化的癸酰
基甘油酯、乙氧基二甘醇、聚乙二醇化的脂肪酸甘油酯、二甘醇單乙醚和它
們的混合物。分散劑的實例包括LABRAFIL、LABRASOL、ARLATONE、
TRANSCUTOL和它們的混合物。分散劑的實例包括合成的化合物,如烷基
磷酸-N-甲基乙醇胺和烷氧基肌氨酸(alkoylsarcosine)。分散劑的實例包括
FOS-MEA和CRODASINIC。

在一些實施方式中,本發明的遞送組合物可以包括藥物或活性劑、一種
或多種油、一種或多種DILA2氨基酸化合物和乳化劑和穩定劑脂質。在某些
變式中,遞送組合物可以包括藥物或活性劑、油、脂質乳化劑、DILA2氨基
酸化合物、非陽離子脂質和聚合脂質。

本發明的組合物可以形成可以引入藥物或活性劑的穩定顆粒。在一些方
面中,本發明的組合物包括直徑為約5nm至約400nm的穩定的藥物或活性
劑乳劑顆粒。在一些實施方式中,顆粒具有約10nm至約300nm的均勻直
徑。在一些實施方式中,顆粒具有約50nm至約150nm的均勻直徑。

在一些實施方式中,藥物或活性劑可以與油、乳化劑、DILA2氨基酸化
合物和聚合體穩定化的脂質混合或復合,以形成提高細胞內遞送藥物或活性
劑的組合物。

水包油乳劑可以用于配制和提高包括RNAi治療劑的藥物或活性劑的生
物利用率。

水包油乳劑可以提供具有圍繞疏水性油核心的DILA2氨基酸化合物或
脂質層的乳劑液滴或納米顆粒。乳劑液滴或納米顆粒可以懸浮在連續水相中。
利用脂質體結構來遞送活性劑,乳劑結構可以避免固有的某些弱勢,并且因
為親脂性核心而能提供遞送優勢。

本發明提供了一系列的新型乳劑組合物,包括新型組成和干擾性RNA
試劑與油、乳化劑、DILA2氨基酸化合物和脂質組分的使用。

油的實例包括合成的油、丙二醇脂肪酸酯、乙二醇醚、甘油油、膽固醇
油、植物油、花生油、精油、礦物油、脂質可溶性化合物如生育酚和維生素
E和它們的混合物。油的實例包括合成油,如CAPRYOL?90(丙二醇單酯)、
CAPRYOL?PGMC(丙二醇單酯)、LABRAFAC?PC(丙二醇單酯)、LABRAFAC?
PG(丙二醇二酯)、LAUROGLYCOL?90(丙二醇單酯)、LAUROGLYCOL?
FCC(丙二醇單酯)、PLUROL?OLEIQUE?CC?497(丙二醇單酯)、LABRAFAC?
LIPOPHILE?WL?1349(甘油三酯)、PECEOL(甘油單酯)、MAISINE?35-1(甘油
單酯)和它們的混合物。

用于RNA治療劑的組合物和方法

本發明提供了利用調節性RNA如通過RNA干擾來調節基因表達的組合
物和方法。本發明的組合物可以遞送核糖核酸試劑至能產生RNAi應答的細
胞。可用于本發明的核酸試劑的實例包括雙鏈核酸、修飾的或降解抗性的核
酸、RNA、siRNA、siRNA、shRNA、miRNA、piRNA、RNA拮抗劑、單鏈
核酸、DNA-RNA嵌合體、反義核酸和核酶。在本文中,術語siRNA、siRNA
和shRNA分別包括siRNA、siRNA和shRNA的前體。例如,術語siRNA包
括適合作為切丁酶底物的RNA或雙鏈RNA。

可用于本發明的核糖核酸試劑可以靶向各種基因。適合作為靶標的人基
因的實例特別包括TNF、FLT1、VEGF家族、ERBB家族、PDGFR家族、
BCR-ABL和MAPK家族等。適合作為靶標的人基因的實例和其核酸序列包
括描述于下述文獻中的那些:PCT/US08/55333、PCT/US08/55339、
PCT/US08/55340、PCT/US08/55341、PCT/US08/55350、PCT/US08/55353、
PCT/US08/55356、PCT/US08/55357、PCT/US08/55360、PCT/US08/55362、
PCT/US08/55365、PCT/US08/55366、PCT/US08/55369、PCT/US08/55370、
PCT/US08/55371、PCT/US08/55372、PCT/US08/55373、PCT/US08/55374、
PCT/US08/55375、PCT/US08/55376、PCT/US08/55377、PCT/US08/55378、
PCT/US08/55380、PCT/US08/55381、PCT/US08/55382、PCT/US08/55383、
PCT/US08/55385、PCT/US08/55386、PCT/US08/55505、PCT/US08/55511、
PCT/US08/55515、PCT/US08/55516、PCT/US08/55519、PCT/US08/55524、
PCT/US08/55526、PCT/US08/55527、PCT/US08/55532、PCT/US08/55533、
PCT/US08/55542、PCT/US08/55548、PCT/US08/55550、PCT/US08/55551、
PCT/US08/55554、PCT/US08/55556、PCT/US08/55560、PCT/US08/55563、
PCT/US08/55597、PCT/US08/55599、PCT/US08/55601、PCT/US08/55603、
PCT/US08/55604、PCT/US08/55606、PCT/US08/55608、PCT/US08/55611、
PCT/US08/55612、PCT/US08/55615、PCT/US08/55618、PCT/US08/55622、
PCT/US08/55625、PCT/US08/55627、PCT/US08/55631、PCT/US08/55635、
PCT/US08/55644、PCT/US08/55649、PCT/US08/55651、PCT/US08/55662、
PCT/US08/55672、PCT/US08/55676、PCT/US08/55678、PCT/US08/55695、
PCT/US08/55697、PCT/US08/55698、PCT/US08/55701、PCT/US08/55704、
PCT/US08/55708、PCT/US08/55709和PCT/US08/55711。

要遞送的本發明RNA可以具有互補于病毒基因區域的序列。例如,本
發明的某些組合物和方法可以用于調節流感病毒的病毒基因組的表達。在一
些實施方式中,本發明提供了通過RNA干擾來調節流感病毒的表達和感染
活性的組合物和方法。流感病毒的表達和/或活性可以通過向細胞遞送例如具
有互補于流感病毒的RNA聚合酶亞單位區域的序列的短干擾性RNA分子來
進行調節。靶向流感病毒的RNA實例參見美國專利公開號20070213293?A1。

在一些實施方式中,本發明提供了通過給受治療者施用含有效量的
RNAi誘導化合物,如短干擾性寡核苷酸分子或其前體,來抑制受治療者內
靶轉錄物表達的組合物和方法。RNAi利用小干擾性RNA(siRNA)來靶向信使
RNA(mRNA)和削弱翻譯。本發明使用的siRNA可以是切丁酶加工的前體,
例如加工成siRNA的長dsRNA。本發明提供了治療或預防與靶轉錄物表達
或由靶轉錄物編碼的肽或蛋白活性相關的疾病或病癥的方法。

基于RNAi的治療策略可以通過切斷病毒或微生物的生長或功能,以及
通過切斷內源基因產物在疾病通道中的功能來治療多種疾病。

在一些實施方式中,本發明提供了遞送RNAi誘導實體如短干擾性寡核
苷酸分子和其前體的新型組合物和方法。具體地,本發明提供了包含靶向受
治療者細胞、組織和/或器官的一種或多種轉錄物的RNAi誘導實體的組合物。

siRNA可以是具有約19個核苷酸長度的互補性區域的兩條RNA鏈。
siRNA任選包括一個或兩個單鏈突出端或環。

shRNA可以是具有自身互補區域的單一RNA鏈。單一RNA鏈可以形成
具有莖和環和任選地在RNA的5′和/或3′部分的一種或多種非配對部分的發
夾結構。

活性治療劑可以是具有改良的體內核酸酶降解抗性和/或改善的細胞攝
取的化學修飾的RNA,其保留RNAi活性。

本發明的siRNA試劑可以是具有互補于靶基因區域的序列。本發明的
siRNA可以具有29至50個堿基對,例如具有互補于靶基因區序列的dsRNA。
另外,雙鏈核酸可以是dsDNA。

在一些實施方式中,活性劑可以是能夠調控基因產物表達的短干擾性核
酸(siRNA)、短干擾性RNA(siRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、微RNA或短發夾
RNA(shRNA)。

提供了對比方法和組合物,其靶向與受治療者特定疾病狀況相關的一種
或多種不同基因的表達,包括已知由于與所選疾病狀況相關的決定因素或促
成因素使其表達異常增加的多種基因中的任意基因。

本發明的RNAi誘導化合物可以與其它已知療法聯合來治療疾病。

在一些實施方式中,本發明涉及包含與遞送增強化合物混合或復合或共
軛的小核酸分子(如短干擾性核酸、短干擾性RNA、雙鏈RNA、微RNA或
短發夾RNA)的組合物。

在本文中,術語“調節性RNA”、“短干擾性核酸”、“siRNA”、“短干擾性
RNA”、“短干擾性寡核苷酸分子”和“化學修飾的短干擾性核酸分子”是指通過
以序列特異性方式介導RNA干擾(RNAi)或基因沉默來調節、抑制或下調基
因表達或如病毒復制的任何核酸分子。調節性RNA包括單鏈RNA拮抗劑。

在一些實施方式中,siRNA是含有自身互補的正義和反義區域的雙鏈多
核苷酸分子,其中反義區含有互補于用于下調表達的靶核糖核酸分子中的核
苷酸序列的核苷酸序列或其部分,且正義區包含對應于(即,其在序列上實質
一致)靶核糖核酸序列的核苷酸序列或其部分。

在本文中,“siRNA”是指小干擾性核糖核酸,即相對短長度的雙鏈核酸
或任選地其較長前體。在一些實施方式中,本發明中可用siRNA的長度優選
為約20至50bp的長度。但是,在此對可用siRNA(包括siRNA)長度沒有特
殊限制。例如,siRNA可以最初以前體形式存在于細胞中,所述前體形式與
遞送至靶細胞時或遞送至靶細胞后表現和發揮基因沉默活性的siRNA的最
終或加工形式實質上不同。例如,siRNA的前體形式可以包括前體序列元件,
所述元件在遞送時或遞送后就會被加工、降解、改變或切割,以產生在細胞
內有介導基因沉默活性的siRNA。在一些實施方式中,可用的siRNA具有的
前體長度為例如約100至200個堿基對或50至100個堿基對或少于約50個
堿基對,其在靶細胞內會產生有活性的,加工過的siRNA。在其它實施方式
中,可用的siRNA或siRNA前體長度約為10至49bp或15至35bp或約21
至30bp。

在本發明的一些實施方式中,增強多核苷酸遞送的多肽可以用于促進核
酸分子包括siRNA的大核酸前體的遞送。例如,本文的方法和組合物可用于
提高代表期望siRNA的“前體”的較大核酸的遞送,其中前體氨基酸可以在遞
送至靶細胞之前、期間或之后被切割或被加工,從而形成用于在靶細胞內調
節基因表達的活性siRNA。

例如,選擇的dsRNA前體多核苷酸可以是環狀的單鏈多核苷酸,其具有
兩個或多個環結構和含有自身互補的正義和反義區的莖,其中所述反義區含
有互補于靶核酸分子中的核苷酸序列的核苷酸序列或其部分,且所述正義區
具有對應于靶核酸序列的核苷酸序列或其部分,且其中所述環狀多核苷酸可
以被在體內或體外加工,以產生能誘導RNAi的活性dsRNA分子。

本發明的siRNA分子,特別是非前體形式,可以是少于30個堿基對或
約17至19bp或19至21bp或21至23bp。

siRNA可以在哺乳動物系統內介導選擇性基因沉默。具有短環和莖內19
至27個堿基對的發夾RNA也選擇性地沉默與雙鏈莖內序列同源的基因的表
達。哺乳動物細胞可以將短發夾RNA轉變為siRNA以介導選擇性基因沉默。

RISC介導具有互補于siRNA雙螺旋反義鏈的序列的單鏈RNA切割。靶
RNA的切割發生在互補于siRNA雙螺旋反義鏈的區域內。21個核苷酸的
siRNA雙螺旋通常在包含兩個核苷酸3′-突出端時活性最高。

用脫氧核糖核苷酸代替具有2-核苷酸3′突出端的21-mer?siRNA雙螺旋的
3′-突出端片段可能對RNAi活性無副作用。將siRNA各末端的高至4個核苷
酸用脫氧核糖核苷酸代替是可以接受的。

可選地,siRNA可以作為單個或多個轉錄產物來遞送,所述轉錄產物由
編碼單個或多個siRNA且指向其在靶細胞內表達的多核苷酸載體所表達。在
這些實施方式中,欲在靶細胞內表達的siRNA終轉錄產物的雙鏈部分可以是
如15至49bp、15至35bp或約21至30bp長。

在本發明的一些實施方式中,其中兩條鏈配對的siRNA的雙鏈區可以包
括凸起或錯配的部分,或凸起和錯配的部分。其中兩條鏈配對的siRNA的雙
鏈部分不限于完全配對的核苷酸片段,且可以包含由于如錯配(相應的核苷酸
不互補)、凸起(在一條鏈上缺失對應的互補核苷酸)或突出端引起的非配對部
分。在不干擾siRNA形成的情況下可以包含非配對部分。在一些實施方式中,
“凸起”可以包含1至2個非配對的核苷酸,且其中兩條鏈配對的siRNA的雙
鏈區可以包括約1至7或約1至5個凸起。另外,包括在siRNA雙鏈區內的
“錯配”部分可以存在的數量是約1至7或約1至5個。錯配情況中最常見的
是,一個核苷酸是鳥嘌呤,另一個是尿嘧啶。所述錯配可以歸因于如在編碼
正義RNA的對應DNA中C突變成T、G突變成A或其混合,但其它原因也
是可以預料的。

本發明的siRNA的末端結構可以是平末端或粘性(突出)末端,只要
siRNA保持其沉默靶基因表達的活性。粘性(突出端)末端結構并不限于3′突
出端,且包括5′突出結構,只要其保持誘導基因沉默的活性。另外,突出核
苷酸的數量并不限于2個或3個核苷酸,而可以是任意數量的核苷酸,只要
其保持誘導基因沉默的活性。例如,突出端可以包含1至約8個核苷酸或2
至4個核苷酸。

具有突出端結構的siRNA的長度可以表述為配對的雙螺旋部分和各末
端的任意突出部分。例如,具有2-bp?3’反義突出端的25/27-mer?siRNA雙螺
旋具有25-mer正義鏈和27-mer反義鏈,其中配對部分長度為25bp。

任意突出端序列都可以具有對靶基因的低特異性,而且可以與靶基因序
列不互補(反義)或不相同(正義)。只要siRNA保持基因沉默活性,其就可以
在突出端部分包括低分子量結構,例如天然RNA分子(如tRNA、rRNA、病
毒RNA),或人工RNA分子。

siRNA的末端結構可以具有莖-環結構,其中雙鏈核酸的一側末端通過連
接子核酸例(如連接子RNA)連接。雙鏈區(莖部分)的長度可以是如15至49bp
或15至35bp或約21至30bp。可選地,作為靶細胞中表達的siRNA的終
轉錄產物的雙鏈區長度可以是如約15至49bp或15至35bp或約21至30bp。

siRNA可以包含具有互補于靶核酸分子中的核苷酸序列的核苷酸序列的
單鏈多核苷酸或其部分,其中單鏈多核苷酸可以包含末端磷酸基團如5′-磷酸
(參見如Martinez等,Cell.110:563-574,2002,和Schwarz等,Molecular?Cell?
10:537-568,2002),或5′,3′-二磷酸。

在本文中,術語siRNA不限于僅含天然存在的RNA或DNA的分子,
但也包括化學修飾的核苷酸和非核苷酸。在一些實施方式中,本發明的短干
擾性核酸分子缺少含2′-羥基(2′-OH)的核苷酸。在一些實施方式中,短干擾性
核酸不需要存在用于介導RNAi等的具有2′-羥基的核苷酸,照此,本發明的
短干擾性核酸分子任選地不包括任何核糖核苷酸(如具有2′-OH基團的核苷
酸)。然而,不需要在siRNA分子中存在核糖核苷酸來維持RNAi的siRNA
分子可以具有一個或多個連接的連接子或其它連接或結合的基團、實體或包
含具有2′-OH基團的一種或多種核苷酸的鏈。siRNA分子可以在至少約5%、
10%、20%、30%、40%或50%的核苷酸位置包含核糖核苷酸。

在本文中,術語siRNA包括能介導序列特異性RNAi的核酸分子,例如,
短干擾性RNA(siRNA)分子、雙鏈RNA(dsRNA)分子、微RNA分子、短發夾
RNA(shRNA)分子、短干擾性寡核苷酸分子、短干擾性核酸分子、短干擾性
修飾的寡核苷酸分子、化學修飾的siRNA分子和轉錄后基因沉默
RNA(ptgsRNA)分子等。

在一些實施方式中,siRNA分子包括分離的正義和反義序列或區域,其
中正義和反義區通過核苷酸或非核苷酸連接子分子共價連接,或通過離子相
互作用、氫鍵、范德華相互作用、疏水相互作用和/或堆集相互作用非共價連
接。

“反義RNA”是具有互補于靶基因mRNA的序列的RNA鏈,其能通過結
合靶基因mRNA來誘導RNAi。

“正義RNA”是具有互補于反義RNA的序列的RNA鏈,且與其互補的反
義RNA退火而形成siRNA。

在本文中,術語“RNAi結構”或“RNAi前體”是指RNAi誘導化合物,如
小干擾性RNA(siRNA)、發夾RNA和能在體內被切割而形成siRNA的其它
RNA種類。本文的RNAi前體還包括表達載體(也稱作RNAi表達載體),其
能產生在細胞內形成dsRNA或發夾RNA的轉錄物,和/或產生能在體內生成
siRNA的轉錄物。

短干擾雜交體(siHybrid)分子是具有與siRNA相似功能的雙鏈核酸。取代
是雙鏈RNA分子,短干擾雜交體由RNA鏈和DNA鏈組成。優選地,該RNA
鏈是結合靶mRNA的反義鏈。通過將DNA和RNA鏈雜交而生成的短干擾
雜交體具有雜交互補部分,且優選具有至少一個3’突出端。

本發明所用的siRNA可以組裝自兩個分離的寡核苷酸,其中一條鏈是正
義鏈且另一條是反義鏈,其中反義鏈和正義鏈是自身互補的(即,各鏈含有互
補于另一條鏈中的核苷酸序列的核苷酸序列;如,其中反義鏈和正義鏈形成
雙螺旋或雙鏈結構,例如,其中雙鏈區是約19個堿基對)。反義鏈可以包括
互補于靶核酸分子中的核苷酸序列的核苷酸序列或其部分,且正義鏈可以包
含對應于靶核酸序列的核苷酸序列或其部分。可選地,siRNA可以組裝自單
個寡核苷酸,其中siRNA的自身互補的正義區和反義區是通過基于核酸的或
基于非核酸的連接子而連接。

在一些實施方式中,用于細胞內遞送的siRNA可以是具有雙螺旋、不對
稱雙螺旋、發夾或不對稱的發夾二級結構的多核苷酸,其具有自身互補的正
義區和反義區,其中所述反義區含有互補于分離的靶核酸分子中的核苷酸序
列的核苷酸序列或其部分,且所述正義區含有對應于靶核酸序列的核苷酸序
列或其部分。

可在siRNA中進行的化學修飾的實例包括引入硫代磷酸酯核苷酸間鍵、
2′-脫氧核糖核苷酸、2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-脫氧-2′-氟代核糖核苷酸、“通
用堿基”核苷酸、“無環”核苷酸、5-C-甲基核苷酸和末端甘油基和/或反向脫氧
無堿基殘基。

siRNA分子的反義區可以在所述反義區的3’-端上包括硫代磷酸酯核苷
酸間鍵。反義區可以在所述反義區的5’-端上包含約1至約5個硫代磷酸酯核
苷酸間鍵。siRNA分子的3′-端核苷酸突出端可以包括在核酸糖、堿基或骨架
上可進行化學修飾的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。3′-端核苷酸突出端可以
包括一種或多種通用堿基核糖核苷酸。3′-端核苷酸突出端可以包括一種或多
種無環核苷酸。

例如,化學修飾的siRNA可以在一條鏈內具有1、2、3、4、5、6、7、
8或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵,或可以在各鏈內具有1至8個或更多個
硫代磷酸酯核苷酸間鍵。硫代磷酸酯核苷酸間鍵可以存在于siRNA雙螺旋的
一條或兩條寡核苷酸鏈上,例如在正義鏈、反義鏈或兩條鏈上。

siRNA分子可以包括在正義鏈、反義鏈或兩條鏈上的3’-端、5’-端或3′-
和5’-端的一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。例如,示例性的siRNA分子
可以包括在正義鏈、反義鏈或兩條鏈上的5′-端的1、2、3、4、5或更多個連
續的硫代磷酸酯核苷酸間鍵。

在一些實施方式中,siRNA分子包括在正義鏈、反義鏈或兩條鏈上的1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個嘧啶硫代磷酸酯核苷酸間鍵。

在一些實施方式中,siRNA分子包括在正義鏈、反義鏈或兩條鏈上的1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個嘌呤硫代磷酸酯核苷酸間鍵。

siRNA分子可以包括環狀核酸分子,其中siRNA在長度上是約38至約
70個核苷酸,例如約38、40、45、50、55、60、65或70個核苷酸,具有約
18至約23個堿基對,例如約18、19、20、21、22或23個堿基對,其中環
狀寡核苷酸形成具有約19個堿基對和2個環的啞鈴型結構。

環狀siRNA分子可以包括2個環基序,其中siRNA分子的一個或兩個
環部分是生物可降解的。例如,環狀siRNA分子的環部分可以在體內轉化以
生成具有3′-端突出端的雙鏈siRNA分子,如包含約2個核苷酸的3′-端核苷
酸突出端。

siRNA分子中的修飾的核苷酸可以在反義鏈、正義鏈或兩者上。例如,
修飾的核苷酸可以具有Northern構型(如Northern假回轉環;參見如Saenger,
Principles?of?Nucleic?Acid?Structure,Springer-Verlag?ed.,1984)。具有Northern
構型的核苷酸實例包括鎖定核酸(LNA)核苷酸(如2′-O,4′-C-亞甲基-(D-核糖
呋喃糖基)核苷酸)、2′-甲氧基乙氧基(MOE)核苷酸、2′-甲基-硫代-乙基,2′-脫
氧-2′-氟代核苷酸、2′-脫氧-2′-氯代核苷酸、2′-疊氮核苷酸和2′-O-甲基核苷酸。

化學修飾的核苷酸可以對核酸酶降解具有抗性,且同時保持介導RNAi
的能力。

雙鏈siRNA分子的正義鏈可以在正義鏈的3’-端、5’-端或3′和5’-端上具
有端帽部分,如反向的脫氧無堿基部分。

共軛物的實例包括描述于2003年4月30日提交的Vargeese等人的美國
申請序列號10/427,160中的共軛物和配體,其整體(包括附圖)引入本文作為
參考。

在本發明的一些實施方式中,共軛物可以通過生物可降解的連接子共價
連接化學修飾的siRNA分子。例如,共軛分子可以與化學修飾的siRNA分
子的正義鏈、反義鏈或兩條鏈的3’-端連接。

在一些實施方式中,共軛分子與化學修飾的siRNA分子的正義鏈、反義
鏈或兩條鏈的5’-端連接。在一些實施方式中,共軛分子與化學修飾的siRNA
分子的正義鏈、反義鏈或兩條鏈的3’-端和5’-端或其任意組合連接。

在一些實施方式中,共軛分子包括能促進化學修飾的siRNA分子遞送至
生物系統如細胞內的分子。

在一些實施方式中,連接化學修飾的siRNA分子的共軛分子是聚乙二
醇、人血清白蛋白或介導細胞攝取的細胞受體的配體。本發明期望的能連接
化學修飾的siRNA分子的特異性共軛分子的實例描述于Vargeese等,美國專
利公開號20030130186和20040110296中。

siRNA可以包含將siRNA的正義區和siRNA的反義區相連接的核苷酸、
非核苷酸或混合的核苷酸/非核苷酸連接子。在一些實施方式中,核苷酸連接
子可以是3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸長。在一些實施方式中,核苷
酸連接子可以是核酸適配子。在本文中,術語“適配子”或“核酸適配子”包括
特異性結合靶分子的核酸分子,其中核酸分子包含在其自然狀態下被靶分子
識別的序列。另外,適配子可以是結合非自然結合核酸的靶分子的核酸分子。

例如,適配子可以用于結合蛋白的配體結合域,從而可以防止天然存在
的配體與蛋白發生相互作用。參見例如Gold等,Annu.Rev.Biochem.64:763,
1995;Brody和Gold,J.Biotechnol.74:5,2000;Sun,Curr.Opin.Mol.Ther.2:100,
2000;Kusser,J.Biotechnol.74:27,2000;Hermann和Patel,Science?287:820,
2000;和Jayasena,Clinical?Chemistry?45:1628,1999。

非核苷酸連接子可以是無堿基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水
化合物、脂質、聚烴或其它聚合化合物(例如,如那些具有2至100個乙二醇
單元的聚乙二醇)。具體的實例包括下述文獻中描述的那些:Seela和Kaiser,
Nucleic?Acids?Res.18:6353,1990和Nucleic?Acids?Res.15:3113,1987;Cload和
Schepartz,J.Am.Chem.Soc.113:6324,1991;Richardson和Schepartz,J.Am.
Chem.Soc.113:5109,1991;Ma等,Nucleic?Acids?Res.21:2585,1993和
Biochemistry?32:1751,1993;Durand等,Nucleic?Acids?Res.18:6353,1990;
McCurdy等,Nucleosides?&?Nucleotides?10:287,1991;Jaschke等,Tetrahedron?
Lett.34:301-304,1993;Ono等,Biochemistry?30:9914,1991;Arnold等,國際
公開號WO89/02439;Usman等,國際公開號WO95/06731;Dudycz等,國
際公開號WO95/11910;和Ferentz和Verdine,J.Am.Chem.Soc.113:4000,
1991。

“非核苷酸連接子”是指能引入核酸鏈內代替一個或多個核苷酸單元(包
括糖和/或磷酸取代)且使保留的堿基表現其酶活性的基團或化合物。所述基
團或化合物可以是無堿基的,因為其在如糖的C1位置上不含有常規公認的
核苷酸堿基,如腺苷、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶。

在一些實施方式中,修飾的siRNA分子可以具有磷酸骨架修飾,包括一
種或多種硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、嗎啉代、酰
胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰酰胺化物、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基
磺酸酯、縮甲醛(formacetal)、硫代縮甲醛(thioformacetal)和/或烷基甲硅烷基
取代。寡核苷酸骨架修飾的實例在Hunziker和Leumann,Nucleic?Acid?
Analogues:Synthesis?and?Properties,in?Modern?Synthetic?Methods,VCH,第
331-417頁,1995和Mesmaeker等,Novel?Backbone?Replacements?for?
Oligonucleotides,in?Carbohydrate?Modifications?in?Antisense?Research,ACS,第
24-39頁,1994中給出。

可以化學修飾的siRNA分子可以通過下述方法合成:(a)合成siRNA分
子的兩條互補鏈;和(b)在適合獲得雙鏈siRNA分子的條件下將兩條互補鏈一
起退火。在一些實施方式中,siRNA分子互補部分的合成是通過固相寡核苷
酸合成,或通過固相串聯寡核苷酸合成來實現的。

寡核苷酸(如某些修飾的寡核苷酸或缺失核糖核苷酸的寡核苷酸部分)是
利用本領域熟知的方法來合成,例如下述文獻中所描述的:Caruthers等,
Methods?in?Enzymology?211:3-19,1992;Thompson等,國際PCT公開號
WO99/54459;Wincott等,Nucleic?Acids?Res.23:2677-2684,1995;Wincott等,
Methods?Mol.Bio.74:59,1997;Brennan等,Biotechnol?Bioeng.61:33-45,1998;
和Brennan,美國專利號6,001,311。包括本發明的某些siRNA分子在內的
RNA的合成根據如下文獻所述的方法進行,例如Usman等,J.Am.Chem.Soc.
109:7845,1987;Scaringe等,Nucleic?Acids?Res.18:5433,1990;和Wincott等,
Nucleic?Acids?Res.23:2677-2684,1995;Wincott等,Methods?Mol.Bio.74:59,
1997。

在本文中,“不對稱發夾”是線性siRNA分子,其含有反義區、環部分和
正義區,所述環部分可包含核苷酸或非核苷酸,所述正義區在具有足夠可與
反義區堿基配對的互補核苷酸且形成具有環的雙螺旋的前提下包含少于反義
區的核苷酸。

在本文中,“不對稱的雙螺旋”是具有兩條分離的鏈的siRNA分子,其含
有正義區和反義區,其中正義區在具有足夠可與反義區堿基配對的互補核苷
酸且形成具有環的雙螺旋的前提下包含少于反義區的核苷酸。

在本文中,“調控基因表達”是指上調或下調靶基因的表達,其可以包括
上調或下調細胞中存在的mRNA水平或mRNA翻譯或由靶基因編碼的蛋白
或蛋白亞單位的合成。

術語“抑制”、“下調”或“減少表達”在本文中是將指基因的表達、或編碼
一種或多種蛋白或蛋白亞單位的RNA分子或相當的RNA分子的表達的水
平,或由靶基因編碼的一種或多種蛋白或蛋白亞單位的水平或活性降低到低
于在缺失本發明的核酸分子(如siRNA)時觀察到的水平。

在本文中,“基因沉默”是指在細胞中部分或完全抑制基因表達,還可以
稱作“基因敲減”。基因沉默的程度可以通過本領域已知的方法來確定,其中
的一些總結在國際公開號WO99/32619。

本文中,術語“核糖核酸”和“RNA”是指含有至少一個核糖核苷酸殘基的
分子。核糖核苷酸是在β-D-核糖-呋喃糖部分的2′位置具有羥基的核苷酸。這
些術語包括雙鏈RNA、單鏈RNA、分離的RNA,如部分純化的RNA、基本
純的RNA、合成的RNA、重組產生的RNA、以及通過添加、刪除、取代、
修飾和/或改變一個或多個核苷酸而不同于天然存在的RNA的修飾的和改變
的RNA。RNA的改變可以包括例如向如siRNA的末端或如在RNA的一個
或多個核苷酸內部添加非核苷酸材料。

RNA分子中的核苷酸包括非標準的核苷酸,如非天然存在的核苷酸或化
學合成的核苷酸或脫氧核苷酸。這些改變的RNA可以被稱作類似物。

“高度保守序列區域”是指靶基因中一個或多個區域的核苷酸序列在從一
代到另一代或從一個生物體系到另一個生物體系沒有顯著變化。

“正義區”是指具有互補于siRNA分子的反義區的siRNA分子的核苷酸序
列。另外,siRNA分子的正義區可以包含與靶核酸序列具有同源性的核酸序
列。

“反義區”是指具有互補于靶核酸序列的siRNA分子的核苷酸序列。另外,
siRNA分子的反義區可以包括具有互補于siRNA分子的正義區的核酸序列。

“靶核酸”是指其表達或活性待調節的任何核酸序列。靶核酸可以是DNA
或RNA。

“互補”是指核酸通過常規Watson-Crick或通過其它的非常規結合模式可
以與另一個核酸序列形成氫鍵。

在本文中,術語“生物可降解連接子”是指設計成作為生物可降解連接子
以將一個分子與另一個分子連接(例如,生物活性分子與siRNA分子或siRNA
分子的正義和反義鏈連接)的核酸或非核酸連接子分子。如此設計生物可降解
連接子,使得其穩定性可以為特定目的(如遞送至特定組織或細胞類型)而發
生調節。基于核酸的生物可降解連接子分子的穩定性可以以不同的方式調節,
例如,通過核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸和化學修飾的核苷酸的組合,所述
化學修飾的核苷酸如2′-O-甲基、2′-氟代、2′-氨基、2′-O-氨基、2′-C-烯丙基、
2′-O-烯丙基和其它的2′-修飾的或堿基修飾的核苷酸。生物可降解的核酸連接
子分子可以是二聚體、三聚體、四聚體或更長的核酸分子,例如長度為約2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個
核苷酸的寡核苷酸,或可以包括具有磷基鍵例如氨基磷酸酯或磷酸二酯鍵的
單核苷酸。生物可降解的核酸連接子分子還可以包括核酸骨架、核酸糖或核
酸堿基修飾。

對于如本文所述的2′-修飾的核苷酸,“氨基”是指2′-NH2或2′-O-NH2,其
可以是修飾的或未修飾的。所述修飾的基團描述于例如,Eckstein等,美國
專利號5,672,695和Matulic-Adamic等,美國專利號6,248,878中。

本發明使用的遞送核酸分子的輔助或補充方法描述于,例如,Akhtar等,
Trends?Cell?Bio.2:139,1992;″Delivery?Strategies?for?Antisense?Oligonucleotide?
Therapeutics,″Akhtar編輯,1995,Maurer等,Mol.Membr.Biol.16:129-140,
1999;Hofland和Huang,Handb.Exp.Pharmacol.137:165?192,1999;和Lee
等,ACS?Symp.Ser.752:184-192,2000。Sullivan等,國際PCT公開號
WO94/02595中進一步描述了遞送酶核酸分子的常規方法。

核酸分子可以在制劑中施用,所述制劑包括一種或多種組分,如藥學上
可接受的載體、稀釋劑、賦形劑、助劑、乳化劑、緩沖劑、穩定劑或防腐劑。

在本文中,術語“載體”是指藥學上可接受的固體或液體稀釋劑、溶劑、
填充劑或包裹材料。載體的實例包括鹽水、生物學上和藥學上的緩沖系統和
生物學上可接受的介質。含水的液體載體可以包括藥學上可接受的添加劑,
如酸化劑、堿化劑、抗菌防腐劑、抗氧化劑、緩沖劑、螯合劑、絡合劑、增
溶劑、潤濕劑、溶劑、懸浮劑和/或粘度增強劑、張力劑、潤濕劑或其它生物
相容性材料。上述范疇的組分實例可參見U.S.Pharmacopeia?National?
Formulary,1990,第1857-1859頁,以及Raymond?C.Rowe等,Handbook?of?
Pharmaceutical?Excipients,第5版,2006,和″Remington:The?Science?and?
Practice?of?Pharmacy,″第21版,2006,David?B.Troy編輯。

防腐劑的實例包括苯酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸酯、間甲酚、
硫柳汞、苯扎氯銨和它們的混合物。

表面活性劑的實例包括油酸、失水山梨醇三油酸酯、聚山梨醇酯、卵磷
脂、磷脂酰膽堿、各種長鏈甘油二酯和磷脂和它們的混合物。

磷脂的實例包括磷脂酰膽堿、卵磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂
酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺和它們的混合物。

分散劑的實例包括乙二胺四乙酸。

氣體的實例包括氮氣、氦氣、氯氟烴(CFC)、氫氟烴(HFC)、二氧化碳、
空氣和它們的混合物。

在一些實施方式中,siRNA和/或多肽可以包裹入脂質體或存留在脂質體
內部或外部或存在于脂質體層內或通過離子電滲施用或加入到其它載體,如
水凝膠、環糊精、生物可降解納米膠囊、生物粘性微球或蛋白質載體。參見,
例如O′Hare和Normand,PCT國際公開號WO00/53722。可選地,核酸組合
物可以通過直接注射或通過利用輸注泵來局部遞送。本發明核酸分子的直接
注射,無論經皮下、經肌肉內或經皮內,都可以利用標準的針和注射器操作
法,或采用無針技術,如Conry等,Clin.Cancer?Res.5:2330-2337,1999,和
Barry等,國際PCT公開號WO99/31262中所描述。

本發明的組合物可以有效地用作藥物制劑。藥物制劑預防、調節患者中
疾病狀態或其它不良狀況的發生或嚴重程度,或治療(減輕一種或多種癥狀至
可檢測或可測量的程度)患者中疾病狀態或其它不良狀況。

在一些實施方式中,本發明提供了藥物組合物和方法,特征是存在或施
用一種或多種多核酸,所述多核酸通常是與DILA2氨基酸化合物或脂質結
合、復合或共軛的一種或多種siRNA,其可以進一步與藥學上可接受的載體
如稀釋劑、穩定劑或緩沖劑配伍。

通常地,siRNA會靶向以高水平表達的基因,該基因作為與受治療者疾
病或不良狀況相關的決定因素或促成因素。在這種情況下,siRNA會有效地
下調該基因的表達水平,從而預防、減輕或降低一種或多種相關疾病癥狀的
嚴重性或復發。可選地,對于各種不同的疾病模型來說,靶基因的表達不一
定會隨著疾病或其它不良狀況的結果或結局而提高,通過降低基因表達(即降
低選定的mRNA的水平和/或靶基因的蛋白產物的水平),下調靶基因將仍然
會獲得治療結果。可選地,本發明的siRNA可以靶向較低表達的一個基因,
這可以導致上調“下游”基因,該“下游”基因的表達被該靶基因的產物或活性
負性調節。

本發明的siRNA可以以任何形式給藥,例如經透皮或通過局部注射(如
在銀屑病斑塊位點上局部注射以治療牛皮癬,或局部注射入患銀屑病關節炎
或RA患者關節內)。在更具體的實施方式中,本發明提供了制劑和施用治療
有效量的直接抵抗TNF-α的mRNA的siRNA的方法,該siRNA有效下調
TNF-αRNA,并因此降低或預防一種或多種TNF-α相關炎癥性病癥。提供了
對比方法和組合物,其針對與動物受治療者中所選疾病狀況相關的一種或多
種不同基因的表達,包括已知其表達隨著與所選疾病狀況相關的決定因素或
促成因素會異常增加的大量基因中的任何基因。

本發明的組合物還可以配制,并用作口服給藥的片劑、膠囊或酏劑,直
腸給藥的栓劑,無菌溶液,注射給藥的懸浮液,以及本領域已知的其它形式。

藥理學組合物或制劑是指適合給藥的形式的組合物或制劑,例如全身給
藥至細胞或患者,包括如人類。適合的形式部分依賴于用途或進入途徑,例
如經口服、經透皮、經上皮或通過注射。所述形式并不妨礙組合物或制劑到
達靶細胞(即,希望帶負電的核酸遞送到的細胞)。例如,注入到血液中的藥
理學組合物應該是可溶的。其它因素是本領域已知,包括如毒性的考慮因素。

“全身給藥”是指藥物在血液中體內全身吸收或累積,隨后分布到全身。
會導致全身吸收的給藥途徑包括但不限于:經靜脈、經皮下、經腹腔、吸入、
口服、經肺內和經肌肉內。

適合與本發明的核酸分子一起配制的試劑的實例包括:P-糖蛋白抑制劑
(如Pluronic?P85),其能提高藥物進入CNS(Jolliet-Riant和Tillement,Fundam.
Clin.Pharmacol.13:16-26,1999);生物可降解的聚合物,如在腦內植入后用
于緩釋遞送的聚(DL-丙交酯-乙交酯共聚物)微球(Emerich,D.F等,Cell?
Transplant?8:47-58,1999,Alkermes,Inc.,Cambridge,Mass.);和載藥納米顆粒,
如由聚氰基丙烯酸丁酯制成的那些,其能遞送藥物穿過血腦屏障并能改變神
經攝取機制(Prog.Neuropsychopharmacol?Biol.Psychiatry?23:941-949,1999)。
用于本發明核酸分子遞送方法的其它實例包括描述于下述文獻中的材料:
Boado等,J.Pharm.Sci.87:1308-1315,1998;Tyler等,FEBS?Lett.421:280-284,
1999;Pardridge等,PNAS?USA.92:5592-5596,1995;Boado,Adv.Drug?Delivery?
Rev.15:73-107,1995;Aldrian-Herrada等,Nucleic?Acid?Res.26:4910-4916,
1998;和Tyler等,PNAS?USA.96:7053-7058,1999。

本發明還包括所制備的用于儲藏或給藥的組合物,其包括在藥學可接受
的載體或稀釋劑中的藥學有效量的期望化合物。治療使用的可接受的載體或
稀釋劑是藥物領域所熟知的,且描述于,例如Remington′s?Pharmaceutical?
Sciences,Mack?Publishing?Co.(A.R.Gennaro編輯,1985)中。例如,可以使用
防腐劑、穩定劑、染料和增味劑。這些包括苯甲酸鈉、山梨酸和對羥基苯甲
酸酯。另外,抗氧化劑和懸浮劑也可以使用。

藥學有效劑量是預防、抑制疾病狀態的發生,治療或改善疾病狀態的癥
狀到一定程度所需的劑量。活性核酸的給藥量應該是每日每千克體重0.01mg
至50mg。

水性懸浮液可以包括與適合制備水性懸浮液的賦形劑混合的活性材料。
所述賦形劑是懸浮劑,例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙甲基纖維素、
海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃芪樹膠和阿拉伯樹膠;分散劑或潤濕劑可以
是天然存在的磷脂,例如,卵磷脂,或環氧烷與脂肪酸的縮合產物,例如聚
氧乙烯硬脂酸酯,或環氧乙烷與長鏈脂肪醇的縮合產物,例如十七烷基亞乙
氧基鯨蠟醇(heptadecaethyleneoxycetanol),或環氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖
醇的偏酯的縮合產物,如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯,或環氧乙烷與衍生自
脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產物,例如聚乙烯山梨聚糖單油酸酯。含水
懸浮液還可以包括一種或多種防腐劑,例如對羥基苯甲酸乙酯或對羥基苯甲
酸正丙酯、一種或多種著色劑、一種或多種增味劑和一種或多種增甜劑,如
蔗糖或糖精。

油性懸浮液可以通過在植物油如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油,或
在礦物油如液體石蠟中懸浮活性成分來配制。油性懸浮液可以包括增稠劑,
例如蜂蠟、硬石蠟或十六醇。可添加增甜劑和增味劑以提供可口的口服制劑。
這些組合物可以通過添加抗氧化劑如抗壞血酸來進行保存。

適合通過加水制備水性懸浮液的可分散粉劑和顆粒提供與分散劑或潤濕
劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑混合的活性組分。也可以存在其它賦形劑,
例如增甜劑、增味劑和著色劑。

本發明的藥物組合物還可以是水包油乳劑型。油相可以是植物油或礦物
油或兩者的混合物。合適的乳化劑可以是天然存在的橡膠,例如阿拉伯樹膠
或黃芪樹膠,天然存在的磷脂,例如大豆、卵磷脂,和衍生自脂肪酸和己糖
醇、酸酐的酯或偏酯,例如山梨聚糖單油酸酯,和所述偏酯與環氧乙烷的縮
合產物,例如聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯。乳劑還可以包括增甜劑和增味劑。

藥物組合物可以是無菌注射的水性或油性懸浮液形式。該懸浮液可以按
照本領域已知的方法,利用上文所述的適合的分散劑或潤濕劑和懸浮劑來配
制。無菌注射制劑也可以是在無毒的胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌
注射溶液或懸浮液,例如在1,3-丁二醇中的溶液。其中可以使用的可接受的
載體和溶劑是水、Ringer溶液和等滲氯化鈉溶液。另外,無菌的不揮發性油
可用作溶劑或懸浮介質。為此,任何溫和的不揮發性油都可以使用,包括合
成的甘油單酯或甘油二酯。另外,發現脂肪酸如油酸可用于制備注射劑。

siRNA還可以以栓劑形式給藥,例如用于藥物的直腸給藥。這些組合物
可以通過將藥物與適合的非刺激性賦形劑混合來制備,該賦形劑在常溫下是
固體但在直腸溫度下是液體,因此其能在直腸中溶解而將藥物釋放。所述材
料包括可可油和聚乙二醇。

siRNA可以通過使用核酸酶抗性基團如2′-氨基、2′-C-烯丙基、2′-氟代、
2′-O-甲基、2′-H修飾來進行廣泛地修飾,以提高穩定性。綜述參見Usman
和Cedergren,TIBS?17:34,1992;Usman等,Nucleic?Acid?Symp.Ser.31:163,
1994。siRNA結構可以利用常規方法通過凝膠電泳來純化或通過高壓液相層
析來純化,并在水中重懸浮。

包含修飾(堿基、糖和/或磷酸)的化學合成的核酸分子可以防止其被血清
核糖核酸酶降解,這可以增加其效力。參見,例如Eckstein等,國際公開號
WO92/07065;Perrault等,Nature?344:565,1990;Pieken等,Science?253,314,
1991;Usman和Cedergren,Trends?in?Biochem.Sci.17:334,1992;Usman等,
國際公開號WO93/15187;和Rossi等,國際公開號WO91/03162;Sproat,
美國專利號5,334,711;和Gold等,美國專利號6,300,074。全部上述參考文
獻都描述了能對本文描述的核酸分子的堿基、磷酸和/或糖實體進行的各種化
學修飾。

在現有技術中有一些實例描述了能夠引入核酸分子并且會顯著提高其核
酸酶穩定性和功效的糖、堿基和磷酸修飾。例如,寡核苷酸通過用核酸酶抗
性基團,例如,2′-氨基、2′-C-烯丙基、2′-氟代、2′-O-甲基、2′-O-烯丙基、2′-H
核苷酸堿基修飾來修飾,以提高穩定性和/或提高生物活性。綜述參見Usman
和Cedergren,TIBS?17:34,1992;Usman等,Nucleic?Acid?Symp.Ser.31:163,
1994;Burgin等,Biochemistry?35:14090,1996。核酸分子的糖修飾已經被現
有技術所廣泛描述。參見Eckstein等,國際公開PCT號WO92/07065;Perrault
等,Nature?344:565-568,1990;Pieken等,Science?253:314-317,1991;Usman
和Cedergren,Trends?in?Biochem.Sci.17:334-339,1992;Usman等,國際公開
PCT號WO?93/15187;Sproat,美國專利號5,334,711和Beigelman等,J.Biol.
Chem.270:25702,1995;Beigelman等,國際PCT公開號WO97/26270;
Beigelman等,美國專利號5,716,824;Usman等,美國專利號5,627,053;
Woolf等,國際PCT公開號WO98/13526;Thompson等,Karpeisky等,
Tetrahedron?Lett.39:1131,1998;Earnshaw和Gait,Biopolymers(Nucleic?Acid?
Sciences)48:39-55,1998;Verma?and?Eckstein,Annu.Rev.Biochem.67:99-134,
1998;和Burlina等,Bioorg.Med.Chem.5:1999-2010,1997。這些出版物描述
了確定將糖、堿基和/或磷酸修飾等引入核酸分子而不調節催化性的位點的常
規方法和策略。在這些指導下,如本文所述,類似的修飾可用于修飾本發明
的siRNA核酸分子,只要siRNA在細胞內促進RNAi的能力不被顯著抑制。

雖然包含硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和/或5′-甲基膦酸酯鍵的寡核苷酸
核苷酸間鍵的化學修飾會提高穩定性,但是過度的修飾會導致某些毒性或降
低活性。因此,當設計核酸分子時,應該最小化這些核苷酸間鍵的量。這些
鍵的濃度降低就會降低毒性,而使這些分子獲得增加的效力和較高的特異性。

在一些實施方式中,本發明涉及具有磷酸骨架修飾的修飾的siRNA分
子,所述磷酸骨架修飾包括一種或多種硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦
酸酯、磷酸三酯、嗎啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰酰胺化物、聚
酰胺、磺酸酯、磺胺、氨基磺酸酯、縮甲醛(formacetal)、硫代縮甲醛
(thioformacetal)和/或烷基甲硅烷基取代。寡核苷酸骨架修飾的綜述參見
Hunziker和Leumann,Nucleic?Acid?Analogues:Synthesis?and?Properties,in?
Modern?Synthetic?Methods,VCH,1995,第331-417頁,和Mesmaeker等,″Novel?
Backbone?Replacements?for?Oligonucleotides,in?Carbohydrate?Modifications?in?
Antisense?Research,″ACS,1994,第24-39頁。

遞送核酸分子的方法描述于Akhtar等,Trends?Cell?Bio.2:139,1992;
″Delivery?Strategies?for?Antisense?Oligonucleotide?Therapeutics,″Akhtar編輯,
1995;Maurer等,Mol.Membr.Biol.16:129-140,1999;Hofland和Huang,Handb.
Exp.Pharmacol.137:165-192,1999;和Lee等,ACS?Symp.Ser.752:184-192,
2000。Beigelman等,美國專利號6,395,713和Sullivan等,PCT?WO94/02595
進一步描述了遞送核酸分子的常規方法。這些指導方案可以用于遞送幾乎任
何核酸分子。核酸分子可以通過本領域技術人員已知的各種方法來施用給細
胞,包括但不限于通過脂質體內部或外部包裹、通過離子電滲或通過引至其
它載體,如生物可降解的聚合物、水凝膠、環糊精(參見如Gonzalez等,
Bioconjugate?Chem.10:1068-1074,1999;Wang等,國際PCT公開號
WO03/47518和WO03/46185)、乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)和PLCA微球(參
見如美國專利號6,447,796和美國專利申請公開號US2002130430)、生物可降
解納米膠囊和生物粘性微球,或通過蛋白質載體(O′Hare和Normand,國際
PCT公開號WO00/53722)。可選地,核酸/載體組合物可以通過直接注射或采
用輸注泵來局部遞送。直接注射本發明核酸分子,無論經皮下、經肌肉內或
經皮內,都可以利用常規針和注射器操作法或采用無針技術進行,如Conry
等,Clin.Cancer?Res.5:2330-2337,1999和Barry等,國際PCT公開號
WO99/31262中所描述的。本發明的分子可以用作藥物制劑。藥物制劑預防、
調節受治療者疾病狀態的發生,或治療受治療者疾病狀態(減輕癥狀至某種程
度,優選全部癥狀)。

“RNA”是指含有至少一個核糖核苷酸殘基的分子。“核糖核苷酸”意思是
在β-D-核糖-呋喃糖部分的2′位置具有羥基的核苷酸。該術語包括雙鏈RNA、
單鏈RNA、分離的RNA,如部分純化的RNA、基本純的RNA、合成的RNA、
重組產生的RNA,以及通過添加、刪除、取代和/或改變一種或多種核苷酸
而不同于天然存在的RNA的改變的RNA。所述改變可以包括例如在RNA
的一個或多個核苷酸上添加非核苷酸物質到如siRNA末端或內部。在本發明
的RNA分子中的核苷酸還包括非標準核苷酸,如非天然存在的核苷酸或化
學合成的核苷酸或脫氧核苷酸。這些改變的RNA可以被稱作天然存在的
RNA的類似物或相似物。

“帽結構”是指在寡核苷酸的任一末端所引入的化學修飾(參見,如
Adamic等,美國專利號5,998,203,引入本文作為參考)。這些末端修飾保護
核酸分子免受核酸外切酶降解,并且幫助在細胞內的遞送和/或定位。該帽可
以存在在5′-端(5′-帽)或3′-端(3′-帽)或可以存在著兩端。在非限制性實例中,
5′-帽包括但不限于甘油基、反向脫氧無堿基殘基(部分);4′,5′-亞甲基核苷酸;
1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸、4′-硫代核苷酸;碳環核苷酸;1,5-脫水己糖醇核
苷酸;L-核苷酸;α-核苷酸;堿基修飾的核苷酸;二硫代磷酸酯鍵;蘇-戊呋
喃糖基核苷酸;無環3′,4′-開環核苷酸;無環3,4-二羥基丁基核苷酸;無環3,5-
二羥基戊基核苷酸,3′-3′-反向核苷酸部分;3′-3′-反向無堿基部分;3′-2′-反向
核苷酸部分;3′-2′-反向無堿基部分;1,4-丁二醇磷酸酯;3′-氨基磷酸酯;磷
酸己酯;磷酸氨基己酯;3′-磷酸酯;3′-硫代磷酸酯;二硫代磷酸酯;或橋連
或非橋連甲基膦酸酯部分。

3′-帽的實例包括但不限于甘油基、反向脫氧無堿基殘基(部分)、4′,5′-亞
甲基核苷酸;1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸;4′-硫代核苷酸、碳環核苷酸;5′-
氨基-烷基磷酸酯;1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯;3-氨基丙基磷酸酯;6-氨基己
基磷酸酯;1,2-氨基十二烷基磷酸酯;羥基丙基磷酸酯;1,5-脫水己糖醇核苷
酸;L-核苷酸;α-核苷酸;堿基修飾的性核苷酸;二硫代磷酸酯;蘇-戊呋喃
糖基核苷酸;無環3′,4′-開環核苷酸;3,4-二羥基丁基核苷酸;3,5-二羥基戊基
核苷酸、5′-5′-反向核苷酸部分;5′-5′-反向無堿基部分;5′-氨基磷酸酯;5′-硫
代磷酸酯;1,4-丁二醇磷酸酯;5′-氨基;橋連和/或非橋連5′-氨基磷酸酯、硫
代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯、橋連或非橋連甲基膦酸酯和5′-巰基部分(詳細
描述參見Beaucage和Lyer,Tetrahedron?49:1925,1993;其引入以供參考)。

術語“非核苷酸”是指能引至核酸鏈代替一種或多種核苷酸單元(包括糖
和/或磷酸取代)且允許殘留堿基表現其酶活性的任何基團或化合物。所述基
團或化合物是無堿基的,原因是不包含常規公認的核苷酸堿基,如腺苷、鳥
嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶,因此在1′-位置缺失堿基。

在本文中,“核苷酸”如本領域所公認的,包括天然堿基(標準)和本領域
熟知的修飾的堿基。所述堿基通常位于核苷酸糖部分的1′位置。核苷酸通常
包括堿基、糖和磷酸基團。核苷酸可以在糖、磷酸和/或堿基部分是未修飾的
或修飾的,(還可互換地稱為核苷酸類似物、修飾的核苷酸、非天然核苷酸、
非標準核苷酸等;參見,如Usman和McSwiggen,見上;Eckstein等,國際
PCT公開號WO92/07065;Usman等,國際PCT公開號WO93/15187;Uhlman?
&?Peyman,見上,其在此全部引入以供參考)。本領域已知的修飾的核酸堿
基的一些實例總結在Limbach等,Nucleic?Acid?Res.22:2183,1994。可引入核
酸分子的堿基修飾的某些非限制性實例包括肌苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-
酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二羥尿苷、萘基、
氨基苯基、5-烷基胞苷(如5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(如胸腺嘧啶核苷)、5-鹵
代尿苷(如5-溴代尿苷)或6-氮雜嘧啶或6-烷基嘧啶(如6-甲基尿苷)、丙炔等
(Burgin等,Biochemistry?35:14090,1996;Uhlman和Peyman,見上)。該方面
中“修飾的堿基”意思是在1′位置上除腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶之外
的核苷酸堿基或其等同物。

“靶位點”或“靶序列”或“靶定的序列”意思是靶核酸(如RNA)內部的序
列,即通過siRNA構建體介導切割而被“靶向標”,所述siRNA構建體在其反
義區內含有互補于靶序列的序列。

siRNA分子可以與DILA2氨基酸化合物或陽離子脂質復合,封裝在脂質
體內,或以其它方式遞送到靶細胞或組織。核酸或核酸復合物可以被引至或
不引至生物聚合物內,通過注射、輸注泵或支架局部給藥。在另一個實施方
式中,聚乙二醇(PEG)可以共價地連接本發明的siRNA化合物或多肽或兩者。
連接的PEG可以是任何分子量,優選約2,000至約50,000道爾頓(Da)。

正義區可以通過連接子分子,如多核苷酸連接子或非核苷酸連接子,與
反義區相連。

“反向重復序列”是指含有正義和反義元件的核酸序列,當該重復序列被
轉錄時,所述正義和反義元件的位置能夠讓它們可以形成雙鏈的siRNA。反
向重復序列可以任選地包括連接子或異源序列,如在重復序列的兩個元件間
的自切割核酶。反向重復序列元件具有足夠的長度,以便形成雙鏈RNA。通
常,反向重復序列的各元件為約15至約100個核苷酸長,優選約20至30
個堿基的核苷酸,優選約20至25個核苷酸長,如20、21、22、23、24、25、
26、27、28、29或30個核苷酸長。

“核酸”是指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其單鏈或雙鏈型聚合物。該
術語包括含已知核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或鍵的核酸,該核酸是合成
的、天然存在的和非天然存在的,具有與參照核酸相似的結合特性,且以與
參照核苷酸相似的方式代謝。所述類似物的實例包括但不限于硫代磷酸酯、
氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2′-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。

“大雙鏈RNA”是指尺寸大于約40bp的任何雙鏈RNA,例如大于100bp
或更優選大于300bp。大dsRNA的序列可以代表mRNA片段或完整mRNA。
大dsRNA的最大尺寸不受本文的限制。雙鏈RNA可以包括修飾的堿基,其
中可以對磷酸糖骨架或核苷進行修飾。所述修飾可以包括氮或硫雜原子或本
領域已知的任何其它修飾。

雙鏈結構可以由自身互補的RNA鏈來形成,如出現發夾或微RNA,或
通過兩條不同的互補RNA鏈退火。

“重疊”是指兩個RNA片段在一條鏈上具有多個核苷酸重疊的序列,例如
其中多個核苷酸(nt)數量少到2至5個核苷酸或5至10個核苷酸或更多。

“一種或多種dsRNA”是指在初級序列基礎上相互不同的dsRNA。

“靶基因或mRNA”是指任何感興趣的基因或mRNA。靶基因或mRNA
可以包括發育基因和調節基因,以及代謝或結構基因或編碼酶的基因。靶基
因可以是內源或外源的。靶基因可以以直接或間接影響表型特征的方式在表
型被研究的那些細胞中或在生物體中表達。所述細胞包括成體或胚胎動物或
植物體內的任何細胞,包括配子或任何分離的細胞,如存在于永生細胞系或
原代細胞培養物中。

遞送活性劑的應用

本發明的化合物和組合物可以用于遞送任何生理學上或生物學上的活性
劑以及活性劑的任何組合,如上所述或如本領域所知。活性劑可以在本發明
的組合物和用途中以足以提供期望的生理學上的或改善的效應的量存在。

本發明的化合物和組合物能夠定向地提高在哺乳動物受治療者內的一系
列的藥劑和生物學活性劑的遞送,包括小分子化合物和藥物、肽、蛋白、抗
體、單克隆抗體、基于抗體的藥物和疫苗試劑。

活性劑的實例包括肽、蛋白、核酸、雙鏈RNA、補血劑、抗感染藥;抗
癡呆藥;抗病毒劑、抗腫瘤劑、、解熱藥、止痛劑、消炎藥、抗潰瘍劑、抗變
應性劑、抗抑郁劑、精神藥物、強心劑、抗心律失常劑,血管擴張劑、抗高
血壓藥、降壓利尿劑、抗糖尿藥、抗凝劑、降膽固醇劑、骨質疏松癥治療劑、
激素、抗生素、疫苗、細胞因子、激素、生長因子、心血管因子、細胞粘附
因子、中樞或周圍神經系統因子、體液電解質因子、血液有機物質、骨生長
因子、胃腸道因子、腎因子、結締組織因子、感官因子、免疫系統因子、呼
吸系統因子、生殖器官因子、雄激素、雌激素、前列腺素、生長激素、促性
腺激素、白介素、類固醇、細菌性類毒素、抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、
人源化抗體、抗體片段和免疫球蛋白。

活性劑的實例包括促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子、胰島素、因
子VII、因子VIII、因子IX、干擾素、肝素、水蛭素原、水蛭聯(hirulos)和水
蛭素。

活性劑的實例包括嗎啡、氫嗎啡酮、氧嗎啡酮、羥甲左嗎喃、烯丙左嗎
喃、可待因、納美芬、納洛芬、納洛酮、納屈酮、丁丙諾啡、布托啡諾或納
布啡、可的松、氫化可的松、氟氫可的松、潑尼松、氫化潑尼松、甲潑尼龍、
氟羥氫化潑尼松、地塞米松、倍他米松、帕拉米松、氟輕松、秋水仙素、醋
氨酚、非甾體抗炎劑NSAID、阿昔洛韋、利巴韋林、三氟胸苷、阿糖呋喃糖
腺嘌呤(Ara-A)、酰基鳥苷、去甲脫氧鳥嘌呤核苷、疊氮胸苷、二脫氧腺苷、
二脫氧胞苷、安體舒通、睪酮、雌二醇、黃體酮、促性腺激素、雌激素、孕
酮、罌粟堿、硝基甘油、舒血管腸肽、降鈣素基因相關肽、賽庚啶、多慮平、
丙咪嗪、甲腈咪胺、右美沙芬、氯氮平、超氧物歧化酶、神經腦啡肽酶、兩
性霉素B、灰黃霉素、咪康唑、酮康唑、噻康唑、伊曲康唑、氟康唑、頭孢
菌素、四環素、氨基葡糖苷、紅霉素、慶大霉素、多粘菌素B、五氟尿嘧啶、
博來霉素、氨甲喋呤、羥基脲、二脫氧肌苷、氟尿苷、6-巰基嘌呤、阿霉素、
道諾霉素、去甲氧正定霉素、紫杉酚、紫杉醇、生育酚、奎尼丁、哌唑嗪、
異搏定、硝苯吡啶、硫氮草酮、組織纖溶酶原激活物TPA、表皮生長因子EGF、
酸性或堿性成纖維細胞生長因子FGF、血小板衍生生長因子PDGF、轉化生
長因子TGF-α或β、舒血管腸肽、腫瘤壞死因子TNF、下丘腦釋放因子、促
乳素、促甲狀腺激素TSH、促腎上腺皮質激素ACTH、甲狀旁腺素PTH、促
卵泡激素FSF、黃體生成素釋放激素LHRH、內啡肽、胰高血糖素、降鈣素、
催產素、卡貝縮宮素、aldoetecone、腦啡肽、生長抑素、生長激素、生長調
節素、α-黑色素細胞刺激素、利多卡因、舒芬太尼、特布他林、氟哌利多、
東莨菪堿、促性腺激素釋放激素、環吡司、丁螺環酮、色甘酸鈉、咪達唑侖、
環孢菌素、賴諾普利、卡托普利、地拉普利、雷尼替丁、法莫替丁、超氧化
物歧化酶、天門冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脫氨酶、腺苷脫氨酶核糖核酸
酶、胰蛋白酶、化學胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、鈴蟾肽、P物質、加壓素、α-
球蛋白、轉鐵蛋白、血纖蛋白原、β-脂蛋白、β-球蛋白、凝血素、血漿銅藍
蛋白、α2-糖蛋白α2-球蛋白、胎球蛋白、α1-脂蛋白、α1-球蛋白、白蛋白和
前白蛋白。

活性劑的實例包括阿片樣物質或阿片樣物質拮抗劑、例如嗎啡、氫嗎啡
酮、氧嗎啡酮、羥甲左嗎喃、烯丙左嗎喃、可待因、納美芬、納洛芬、納洛
酮、納屈酮、丁丙諾啡、布托啡諾和納布啡;皮質酮、例如可的松、氫化可
的松、氟氫可的松、潑尼松、氫化潑尼松、甲潑尼龍、氟羥氫化潑尼松、地
塞米松、倍他米松、帕拉米松、氟輕松;其它消炎藥、例如秋水仙素、布洛
芬、茚甲新和吡羅昔康;抗病毒藥物,例如阿昔洛韋、利巴韋林、三氟胸苷、
阿糖呋喃糖腺嘌呤、酰基鳥苷、去甲脫氧鳥嘌呤核苷、疊氮胸苷、二脫氧腺
苷、二脫氧胞苷;抗雄激素例如安體舒通;雄激素、例如睪酮;雌激素、例
如雌二醇;孕酮;肌肉松弛劑、例如罌粟堿;血管擴張劑、例如硝基甘油、
舒血管腸肽和降鈣素相關基因肽;抗組胺、例如賽庚啶;具有組胺受體位點
阻斷活性的試劑、例如多慮平、丙咪嗪和甲氰咪胺;止咳藥、例如右美沙芬;
神經松弛劑例如氯氮平;抗心律失常藥;鎮癇劑;酶,例如超氧化物歧化酶
和神經腦啡肽酶;抗真菌劑,例如兩性霉素B、灰黃霉素、咪康唑、酮康唑、
噻康唑、伊曲康唑和氟康唑;抗細菌劑、例如青霉素、頭孢菌素、四環素、
氨基葡糖苷、紅霉素、慶大霉素、多粘菌素B;抗癌劑、例如五氟尿嘧啶、
博來霉素、氨甲喋呤和羥基脲、雙脫氧肌苷、氟尿苷、6-巰基嘌呤、阿霉素、
道諾霉素、去甲氧正定霉素、紫杉酚和紫杉醇;抗氧化劑、例如生育酚、類
視黃醇、類葫蘿卜素、泛醌、金屬螯合劑和植酸;抗心律失常劑、例如奎尼
丁;抗高血壓劑例如哌唑嗪、維拉帕米、硝苯吡啶和地爾硫卓;鎮痛藥例如
醋氨酚和阿斯匹林;單克隆和多克隆抗體、包括人源化抗體和抗體片段;反
義寡核苷酸;和RNA、調節性RNA、干擾性RNA、DNA和含有編碼治療肽
和蛋白的基因的病毒載體。

用于給藥的組合物和制劑

在本文中,術語“給藥”包括直接和間接地遞送化合物或組合物至作用位
點的全部方法。本發明的化合物和組合物可以單獨給藥,或者與本文未公開
的其他化合物、組合物或治療劑組合給藥。

本發明的組合物和方法可以通過各種粘膜給藥模式給藥至受治療者,包
括經口、經直腸、經陰道、經鼻內、經肺內或經透皮遞送,或通過局部遞送
至眼、耳、皮膚或其它粘膜表面。在本發明的一些方面,粘膜組織層包括上
皮細胞層。上皮細胞可以是肺部的、氣管的、支氣管的、齒槽的、鼻的、口
腔的、表皮的或腸胃的。本發明的組合物可以使用推進器給藥,如機械噴霧
器,以及加壓的、電動的或其它類型的推進器。

本發明的組合物可以作為鼻或肺噴霧以水溶液給藥,而且可以采用本領
域技術人員熟知的各種方法以噴霧形式分散。本發明組合物的肺部遞送可以
通過將組合物以液滴、顆粒或噴霧的形式給藥來實現,其可以是,例如、煙
霧化的、霧化的或成霧狀的。肺部遞送可以以液滴、顆粒或噴霧形式,通過
鼻或支氣管通道來進行組合物給藥。組合物顆粒、噴霧或氣溶膠可以是液體
或固體形式。適合以鼻部噴霧來分散液體的優選系統公開在美國專利號
4,511,069中。所述制劑可以便利地通過將本發明的組合物溶解在水中以制備
水溶液,并將所述溶液滅菌來制備。制劑可以存在于多劑容器中,例如美國
專利號4,511,069公開的密封性分散系統中。其它適合的鼻部噴霧遞送系統描
述于Transdermal?Systemic?Medication,Y.W.Chien?ed.,Elsevier?Publishers,New?
York,1985中;和美國專利號4,778,810中。另外的氣溶膠遞送形式可以包括例
如壓縮空氣噴霧器、噴射噴霧器、超聲噴霧器和壓電噴霧器,其遞送溶解或
懸浮在藥物溶劑例如水、乙醇或其混合物中的生物活性劑。

本發明的鼻部和肺部噴施溶液通常包括藥物或要遞送的藥物,任選地與
表面活性劑如非離子表面活性劑(如聚山梨醇酯-80)和一種或多種緩沖液一起
配制。在本發明的某些實施方式中,鼻部噴施溶液進一步包括推進劑。鼻部
噴施溶液的pH可以是約pH?6.8至7.2。使用的藥學溶劑還可以是pH?4至6的弱
酸性水緩沖液。可以添加其它組分來增強或保持化學穩定性,包括防腐劑、
表面活性劑、分散劑或氣體。

在某些實施方式中,本發明是包括含有本發明組合物的溶液和用于肺部、
粘膜或鼻內噴霧或氣溶膠的推進器的藥品。

本發明組合物的劑型可以是液滴或乳劑形式、或是噴霧劑形式的液體。

本發明的組合物的劑型可以是固體,其可以在施用前在液體中重構。固
體可以以粉末給藥。固體可以是膠囊、片劑或凝膠形式。

在本發明中為了配制適合肺部遞送的組合物,可以將生物活性劑與不同
藥學上可接受的添加劑或遞送增強組分以及適合分散活性劑的基質或載體組
合。添加劑或遞送增強組分的實例包括pH調節劑,如精氨酸、氫氧化鈉、甘
氨酸、鹽酸、檸檬酸和它們的混合物。其它添加劑或遞送增強組分包括局部
麻醉劑(如芐醇)、等滲劑(如氯化鈉、甘露醇、山梨糖醇)、吸附抑制劑(如吐
溫80)、增溶劑(如環糊精和其衍生物)、穩定劑(如血清白蛋白)和還原劑(如谷
胱甘肽)。當用于粘膜遞送的組合物是液體時,參考將0.9%(重量/體積)生理鹽
溶液的張力作為單位所測定,通常將制劑的張力調節到在給藥位點的粘膜內
不會引起實質上不可逆的組織損害的值。通常,將溶液的張力調節到約1/3
至3的值,更通常是1/2至2,最通常是3/4至1.7。

生物活性劑可以分散在基質或載體內,其可以包含具有分散活性劑和任
何需要的添加劑能力的親水性化合物。基質可以選自范圍廣泛的適合載體,
包括但不限于聚羧酸或其鹽、羧酸酐(如馬來酸酐)與其它單體(如(甲基)丙烯
酸甲酯、丙烯酸等)的共聚物;親水性乙烯基聚合物,如聚乙酸乙烯酯、聚乙
烯醇、聚乙烯吡咯烷酮;纖維素衍生物,如羥甲纖維素、羥丙纖維素等;和
天然聚合物,如殼聚糖、膠原、海藻酸鈉、明膠、透明質酸和它們的無毒金
屬鹽。生物可降解的聚合物可以選作基質或載體,例如聚乳酸、聚(乳酸-羥
基乙酸)共聚物、聚羥基丁酸、聚(羥基丁酸-羥基乙酸)共聚物和它們的混合物。
合成的脂肪酸酯,如聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸糖酯等可被用作載體。親
水性聚合物和其它載體可以單獨使用或者組合使用,可通過部分結晶化、離
子鍵合、交聯等來賦予該載體提高的結構完整性。提供的載體可以是各種形
式,包括用于直接施用至鼻粘膜的流體或粘性溶液、凝膠、貼劑、粉末、微
球和膜劑。使用本發明所選的載體可以促進生物活性劑的吸收。

生物活性劑可以按照各種方法與基質或載體組合,活性劑的釋放可以通
過擴散、載體分解或相關的水通道制劑而進行。在某些情況下,活性劑分散
在自適合的聚合物如2-氰基丙烯酸異丁酯(參見,如Michael等,J.Pharmacy?
Pharmacol.43:1-5,1991)制備的微膠囊(微球)或納米膠囊(納米球)內,和分散在
施于鼻粘膜的生物相容性的分散介質內,這會在延長的時間內產生持續不斷
的遞送和生物活性。

用于粘膜、鼻或肺部遞送的制劑可以包括作為基質或賦形劑的親水性低
分子量化合物。所述親水性低分子量化合物提供通道介質,水溶性活性劑如
生理性活性肽或蛋白通過該通道介質可以通過該基質擴散至吸收活性劑的身
體表面。親水性低分子量化合物任選地從粘膜或給藥環境吸收水分和溶解水
溶性活性肽。親水性低分子量化合物的分子量通常不大于10,000,且優選不
大于3000。親水性低分子量化合物的實例包括多元醇化合物,如寡糖、二糖
和單糖,包括蔗糖、甘露醇、乳糖、L-阿拉伯糖、D-赤蘚糖、D-核糖、D-木
糖、D-甘露糖、D-半乳糖、乳果糖、纖維二糖、龍膽二糖、甘油、聚乙二醇
和它們的混合物。進一步的親水性低分子量化合物的實例包括N-甲基吡咯烷
酮,醇(如寡乙烯基醇、乙醇、乙二醇、丙二醇等)和它們的混合物。

本發明的組合物可選地包括與所需生理條件近似的藥學上可接受的載體
物質,如pH調節劑和緩沖劑、張力調節劑和潤濕劑,例如乙酸鈉、乳酸鈉、
氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、失水山梨醇單月桂酸酯、油酸三乙醇胺和它們的
混合物。對于固體組合物,可以使用無毒的藥學上可接受的載體,其包括例
如藥物梯度的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡
萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。

在本發明的某些實施方式中,生物活性劑可以以時間釋放制劑的形式給
藥,例如,以在包括緩慢釋放聚合物的組合物中的形式。活性劑可以采用防
御快速釋放的載體來制備,例如控釋載體,如聚合物、微膠囊化的遞送系統
或生物粘性膠。在本發明的各種組合物中,活性劑的延長遞送可以大約通過
在組合物中包括延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁水凝膠和明膠)來獲得。

在本發明的某些實施方式中,組合物可以包括一種或多種天然或合成表
面活性劑。某些天然的表面活性劑可存在于人肺(肺表面活性劑)中,是磷脂
和蛋白的復合混合物,該混合物在肺泡的空氣-液體表面形成單層,降低呼氣
時的表面張力接近于0,并防止肺泡破裂。超過90%(重量)的肺表面活性劑是
由磷脂組成,其中大約40至80%是DPPC,且剩余的是不飽和的卵磷脂POPG、
POPC和磷脂酰甘油。剩余的10%(重量)的表面活性劑由血漿蛋白和脫輔基蛋
白(如表面蛋白(SP)-A、SP-B、SP-C和SP-D)組成。

可用于本發明的天然的表面活性劑的實例包括SURVANTATM(貝拉康
坦)、CUROSURFTM(poractantalfa)和INFASURFTM(calfactant)和它們的混合物。

合成的表面活性劑的實例包括:西那普肽;二棕櫚酰卵磷脂、棕櫚酰油
酰磷脂酰甘油和棕櫚酸的組合物;SURFAXINTM(lucinactant);和
EXOSURFTM(colfosceril);可以包括四丁酚醛、DPPC和十六醇的組分;和它
們的混合物。

制備遞送組合物的方法包括利用塞滿規定孔徑的聚碳酸酯薄膜濾劑的
Northern?Lipids?Lipex?Extruder系統的乙醇注射法和擠壓法。可以使用利用探
針針尖和浴超聲波儀的超聲處理法來獲得均勻大小的顆粒。均質和單分散顆
粒大小可以通過不添加核酸組分來獲得。對于體外轉染組合物來說,在轉染
劑制成并用緩沖組分穩定后,可以添加核酸組分。對于體內遞送組合物來說,
核酸組分是制劑的一部分。

本發明的組合物和制劑可以通過各種途徑來給藥,例如以經由靜脈、腸
胃外或腹膜內途徑實現全身遞送。在某些實施方式中,可以細胞內遞送制劑,
例如在靶組織如肺或肝的細胞中,或在炎性組織中。本發明包括通過移取受
治療者細胞,將試劑遞送至已移出的細胞內,并將細胞再引至受治療者內,
來遞送制劑的組合物和方法。在某些實施方式中,本發明提供了體內遞送制
劑的方法。可以將組合物經靜脈、皮下或腹膜內給藥至受治療者。在某些實
施方式中,本發明提供了體內遞送制劑至哺乳動物患者肺部的方法。

本發明的活性劑脂質體組合物可以用在用于體內的藥物組合物中。向受
治療者施用本發明的活性劑脂質體組合物可以通過腸胃外、口服、通過吸入、
局部、粘膜、直腸或口頰途徑。腸胃外使用包括皮下、皮內、靜脈內、肌內、
關節內、滑膜內(intrasynovial)、干內(intrastemal)、鞘內、病灶內、顱內注射
或輸注技術。

用于治療特定疾病的本發明活性劑脂質體組合物的有效量通常是足以改
善或減輕疾病癥狀的量。所述組合物可以作為單劑量施用,或者可以通過重
復給藥而施用。

其它實施方式

本文引用的全部出版物、參考文獻、專利、專利出版物和專利申請都明
確地以其整體引入本文作為參考。

雖然本發明描述了一些實施方式,且許多詳細內容是為了進行說明,本
領域的技術人員顯而易見的是,本發明包括另外的實施方式,且本文描述的
某些詳細內容可以適當地在不脫離本發明的情況下改變。本發明包括所述另
外的實施方式、改變和相等物。特別是,本發明包括各種說明性的組分和實
例的特征、術語或要素的任意組合。

本文使用的術語“一個(種)”和本發明描述的和權利要求中的類似術語解
釋為包括單數和多數。

術語“含有”、“具有”、“包括”和“”解釋為開放式術語,其意思是例如“包
括但不限于”。因此,術語如“含有”、“具有”、“包括”和“包含”解釋為包括性
的,而不是排他性的。

本文一定范圍的數值敘述是指落入該范圍內的單獨的各值和任何分散數
值,如同其在本文單獨敘述一樣,而不論該范圍內的某些數值是否確切表述。
例如,范圍“4至12“包括且并不限于數值5、5.1、5.35和大于或等于4且小
于或等于12的任何其它整數、分數或有理數。應該理解,本文使用的特定值
是示例性的,且并不限制本發明的范圍。

本文一定范圍的碳原子數量的敘述是指落入該范圍內的單獨的各值和任
何分散數值,如同其在本文單獨敘述一樣而不論該范圍內的某些數值是否確
切表述。例如,術語“C1-22“包括但不限于C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、
C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、
C21和C22。

本文提供的技術術語定義應該解釋為包括沒有說明的那些與本領域技術
人員已知的術語相關的意思,且并不意欲限制本發明的范圍。本文提供的技
術術語定義應該解釋為優于本領域的可選定義或通過參考引入本文的定義,
在某種程度上可選定義會跟本文提供的定義發生沖突。

本文所給的實施例,和本文所用的示例性語言僅僅是出于解釋的目的,
且并不意欲限制本發明的范圍。

當給出了一系列實施例時,如適合本發明的一系列化合物或分子,對于
本領域的技術人員來說,很顯然所列的化合物或分子的混合物也是適合的。

實施例

實施例1

制備含有RNA的脂質體制劑的方法

本實施例描述了用于制備含有RNA的脂質體制劑的方法的實施方式。
所述方法中使用的一些物質總結于以下:

C18:1-正Arg-C16(棕櫚酰油酰正精氨酸,PONA)(MDRNA,Inc.)(化學式
量683.3)

1,2-二肉豆蔻酰基-錫-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二
醇)-2000](銨鹽)(DMPE-PEG2k)(Genzyme?Pharmaceuticals,Cambridge,
Mass.)

膽固醇(Solvay?Pharmaceuticals)

膽固醇半琥珀酸酯(CHEMS)GMP(Merck?Eprova?AG)

乙醇(純的,200標準酒精度);注射用無菌水

磷酸鈉:單價堿,無水,二價堿,無水

蔗糖,99+%

5N氫氧化鈉;2N鹽酸;冰醋酸

三乙醇胺(Tris)USP級(Research?Organics)

150mL容量的0.2μm過濾瓶,PES

校準的20μL、200μL和1mL?Rainin移液器

Iso-disc濾器PTFE25-10

Cole-Parmer在線靜止混合儀

Watson?Marlow?520Di泵;Watson?Marlow?523泵;Filtertec泵

Vivaflow?50?100,00MWCO?PES(Sartorius)

Slide-a-Lyser滲析盒10,000MWCO(Pierce)

按照以下步驟制備緩沖溶液蔗糖磷酸(SUP)制劑緩沖劑(20mM磷酸鈉、
215mM蔗糖,pH7.4)。將2.17g無水磷酸二氫鈉和8.79g無水磷酸氫二鈉加
入至含3600mL?Milli-Q?DI水的量筒中,并利用攪拌棒充分混合。利用5N氫
氧化鈉或2N鹽酸將pH調節至pH7.4。緩慢加入294.38g蔗糖并充分溶解。
將最終水體積調節至4L。利用0.2μm濾器過濾溶液。

按照以下步驟制備含25mM脂質體形成分子的90%v/v乙醇USP儲備溶
液。將90mL乙醇USP(200標準酒精度)分散在經高壓滅菌的干凈的100mL?
Pyrex瓶中。向乙醇中連續加入1291umol?C18:1-正Arg-C16(PONA)、721.6
umol膽固醇半琥珀酸酯(CHEMS)粉、61.7umol?DMPE-PEG2K粉和515umol
膽固醇。將所述組分均加入至溶液中并利用攪拌棒充分混合。對混合物進行
超聲處理15分鐘。加入10mL注射USP用無菌水并充分混合。將所述儲備
溶液通過1um孔徑的ISO-DISC濾器PTFE-25mm過濾。將儲備溶液儲藏在
80℃并通過具有蒸發光散射檢測的反相HPLC分析DILA2氨基酸化合物和脂
質組分。

按照以下步驟在注射用無菌水中制備siRNA儲備溶液。將5mL注射用
無菌水分散在無菌的15mL?Falcon管中。向管中加入100mg?siRNA粉并充分
渦旋。利用10mL注射器使溶液通過0.22uM?Millex?GP濾器單元過濾。將
siRNA溶液儲藏在-20℃并以1∶1000稀釋以通過OD(A260和A280)檢測純度
和濃度。

用Watson?Marlow?520Di蠕動泵校準流速為40mL/分鐘。將泵設定為
210rpm并且從管道系統分離。通過泵過40mL?90%的乙醇以清洗管線。將乙
醇泵至燒杯中15秒并稱重以確定流速(mL/分鐘)。調節泵速以提供40±0.5
mL/分鐘的流速。以類似的方式對用于siRNA和蔗糖磷酸溶液的泵進行校準。

使用三種溶液按照下述步驟制備siRNA制劑。(a)用于泵送的第一溶液為
siRNA溶液。通過在50mL錐形管用SUP緩沖劑稀釋siRNA并充分渦旋來
制備第一溶液。(b)用于泵送的第二溶液是DILA2氨基酸化合物和三種脂質
的溶液。制備包含以下脂質的混合脂質的90%乙醇儲備液:CHEMS、膽固
醇和DMPE-PEG。。向所述脂質儲備液中加入DILA2氨基酸化合物。向所述
脂質儲備液中加入含Tris的注射用無菌水溶液試樣,以在溶液中形成1∶1摩
爾Tris∶CHEMS濃度。通過用正置換移液器將混合的脂質儲備液移至50mL
錐形管中,用90%乙醇稀釋并充分渦旋,制備用于泵送的第二溶液。(c)用于
泵送的第三溶液為SUP緩沖溶液。

按照以下步驟制備siRNA制劑。將第一siRNA溶液和第二脂質體形成
分子溶液同時泵至撞擊流體中。將前1mL流出的撞擊流體丟棄,然后將
siRNA制劑收集在器皿中。使用Watson?Marlow?323泵將SUP緩沖溶液泵至
器皿中,以將乙醇的濃度調節至約33%。在板式磁性攪拌儀上在溫和震蕩下
將siRNA制劑在器皿中溫育1小時。

溫育之后,將制劑荷載至具有10,000MWCO的Pierce?slide-a-lyzer滲析
盒中,并在4℃用100體積的SUP滲析12-18小時。

該實施例進一步描述了通過切向流和滲濾制備含RNA的脂質體制劑的
方法的實施方式。除了用切向流過濾(TFF)過程取代最后的滲析步驟外,
siRNA制劑如上文提供。

在板式磁性攪拌儀上在輕柔震蕩2分鐘內將siRNA制劑稀釋至10%(v/v)
乙醇終濃度。

用50mL?70%乙醇USP清洗使用Sartorius?Vivaflow?50?100,000MWCO
PES膜的TFF系統,然后利用100mL?70%的乙醇以60mL/分鐘的泵流速再
循環。用50mL無菌水清洗TFF系統,然后用100mL無菌水以60mL/分鐘
的泵流速再循環。用50mL?SUP清洗TFF系統,然后用100mL?SUP以60mL/
分鐘的泵流速再循環。

將稀釋的siRNA制劑荷載至TFF器皿中,并濃縮5次至siRNA的終濃
度為0.5mg/mL(進料壓力~20psi,滯留物壓力<0.2psi,透過液流速~2mL/
分鐘)。每cm2膜所處理的配制在脂質體組合物中的siRNA的最大量為1mg。

通過5體積SUP(其中乙醇已除去)的滲濾以2mL/分鐘的流速對濃縮的
siRNA制劑進行過濾。

將濃縮的siRNA制劑進一步濃縮至期望體積(1mg/ml?siRNA)。

該實施例進一步描述了通過siRNA脂質體制劑的無菌過濾制備含RNA
的脂質體制劑的方法的實施方式。按照以上描述提供siRNA制劑。將10mL?
siRNA制劑抽入10mL聚丙烯注射器中,并除去氣泡。將siRNA制劑通過
0.22uM?Millex?GP濾器單元過濾。對注射器施加中等壓力以使10mg?siRNA
制劑(1mg?siRNA/mL)通過Millex?GP濾器單元過濾。將該藥物產品的1mL
試樣于80℃儲藏在3mL?I型無菌玻璃管中以備后用。

實施例2

siRNA脂質體制劑

本發明的脂質體siRNA制劑的實施方式示于表6。

表6:脂質體siRNA制劑

??組分
??μM
??MW
??mg/ml
??給藥(mg/kg)
??dsRNA
??7.5
??13255.4
??0.100
??1.0
??DMPE-PEG2K
??38.5
??2815
??0.108
??1.1
??chol
??366.2
??386
??0.141
??1.4
??CHEMS
??506.8
??486
??0.246
??2.5
??PONA
??929.3
??683
??0.635
??6.3

實施例3

物理過程參數對含RNA的脂質體組合物的影響

在該實施例中,觀察了用于收集、溫育和淬火的某些過程參數對siRNA
脂質體組合物的性質的影響。通過使用實施例1中描述的基本方法制備組合
物。

在各個實施例中,所述組合物的活性劑為用于沉默ApoB的dsRNA。所
述脂質體形成組分為含DILA2氨基酸化合物C18:1-正Arg(NH3Cl)-C16以及
脂質膽固醇半琥珀酸酯(CHEMS,Anatrace,CH210)、膽固醇(Anatrace?CH200)
和DMPE-PEG2k(Genzyme)的乙醇-水溶液。

在第一實施例中,如表7所示,觀察了收集步驟中有機溶劑的濃度對脂
質體粒度以及分散性的影響。根據流速和轉移管直徑計算有機溶劑乙醇的濃
度。表7中各制劑的溫育時間均為4小時。

表7:脂質體siRNA制劑的收集和溫育

??制劑
??pH
??Z-avg
?PdI?Avg
??包裹
??在33%EtOH收集
??7.4
??152
??0.11
??89%
??在37%EtOH收集
??7.4
??161
??0.12
??89%
??在40%EtOH收集
??7.4
??242
??0.30
??89%

表7的結果表明,總的來說脂質體顆粒的大小隨收集器中有機溶劑乙醇
濃度的提高而提高。粒度分布的分散性也隨有機溶劑濃度的提高而提高。表
7的結果表明,利用由撞擊流體和收集容器中混合物(pH7.4)制備的脂質體組
合物實現了活性siRNA試劑的高水平包裹。

在第二實施例中,觀察了溫育時間對脂質體siRNA制劑在小鼠體內的基
因沉默活性的影響。在小鼠肝臟內測定了脂質體制劑的體內ApoB基因沉默
活性。用于沉默ApoB的一些RNAi試劑描述在WO08/109357中。

在小鼠肝臟內測定了某些脂質體制劑在體內的ApoB基因沉默活性并與
小鼠血清膽固醇水平相比較。在體內的ApoB?mRNA降低活性和體內相應的
血清膽固醇降低示于表8。表8中的各脂質體制劑為[C18-正
Arg-C16/CHEMS/chol/DMPE-PEG2k(50/28/20/2)]。各情況下的劑量均為1.0
mg/kg/天。利用收集容器中基于流速和轉移管直徑的33%的乙醇濃度制備各
個制劑。

表8:溫育時間對小鼠體內基因沉默活性的影響

??溫育時間(hr)
??體內ApoB敲減(%)
??血清膽固醇的降低(%)
??0
??19
??8
??1
??31
??24
??2
??38
??6
??4
??51
??27

表8的結果表明,含有ApoB基因沉默性RNAi試劑的脂質體制劑在體
內的基因沉默性敲減活性隨溫育時間的提高而提高至有利的水平。

在第三實施例中,如表9所示,觀察了溫育時間對脂質體siRNA制劑在
體內的基因沉默活性的影響。在這些試驗中,利用滲析而非TFF過濾制備脂
質體siRNA制劑。利用撞擊流體和收集容器中的混合物(pH7.4)制備所示組合
物。如表9所示,收集容器中有機溶劑乙醇的濃度變化為30-36%。表9中的
各脂質體制劑為[C18-正Arg-C16/CHEMS/chol/DMPE-PEG2k(50/28/20/2)]。

表9:收集容器中各濃度乙醇下溫育對脂質體siRNA制劑的體內基因沉默活
性的影響


表9的結果表明,當使用溫育時間時,含ApoB基因沉默性RNAi試劑
的脂質體制劑在小鼠體內的基因沉默活性顯著提高至有利水平。

在第四實施例中,如表10所示,觀察了對脂質體siRNA制劑淬火對其
在小鼠體內的基因沉默活性的影響。在這些試驗中,利用撞擊流體和收集容
器中的混合物(pH7.4)和1小時溫育時間來制備脂質體siRNA制劑。如表10
所示,收集容器中有機溶劑乙醇的濃度從33%淬火至降低的濃度。表10中
的各脂質體制劑為[C18-正Arg-C16/CHEMS/chol/DMPE-PEG2k]。通過計算
siRNA活性劑在淬火后1小時和48小時的平均粒度和包裹,確定所示制劑
的穩定性。

表10:脂質體siRNA制劑的淬火


表10中的結果表明,含有RNAi試劑的脂質體制劑在淬火至低于約25%
的乙醇濃度后48小時的時間內保持了RNAi試劑的穩定的平均粒度和高水平
包裹。

實施例4

pH對通過溫育制備的脂質體組合物的影響

在該實施例中,觀察了pH對脂質體組合物的制備的影響。使用實施例1
中描述的基本方法通過撞擊和溫育制備組合物。

所示活性劑為在含水溶液中制備的1mg/mL的沉默ApoB的dsRNA。

所述脂質體形成組分為含DILA2氨基酸化合物C18:1-正
Arg(NH3Cl)-C16以及脂質膽固醇半琥珀酸酯(CHEMS,Anatrace,CH210)、膽
固醇(Anatrace?CH200)和DMPE-PEG2k(Genzyme)的乙醇溶液。DILA2氨基
酸化合物和脂質的相對量為(50/28/20/2),其表示用于所示組合物的各組分
(C18:1-正Arg(NH3Cl)-C16/CHEMS/膽固醇/DMPE-PEG2k)相對于DILA2氨基
酸化合物加脂質的總量的百分數(w/w)。

如表11所示,在pH7.4和pH4下制備了Z-平均粒度為128-137nm的
dsRNA制劑。表11的制劑的制備方法是向撞擊流體中加入緩沖劑以調節乙
醇的濃度至約33%,然后為湍動混合。收集流體,并將所收集的混合物溫育
1小時。

表11:pH7.4和4下的脂質體組合物


總之,表11所示的結果以及實施例3的表7、9和10所示的結果表明,
在pH為7.4下制備了脂質體包裹的RNAi誘導劑的制劑。

實施例5

通過流速控制制備含RNA脂質體組合物

在該實施例中,通過利用RNAi試劑溶液和脂質體形成組分的溶液的流
速控制撞擊流體組合物而制備脂質體組合物。利用實施例1描述的基礎方法
通過撞擊和溫育制備組合物,不同之處在于對RNAi試劑溶液和脂質體形成
組分的溶液的流速進行調節以獲得收集容器中沒有額外SUP緩沖劑的有機
溶劑和RNAi-試劑的某種濃度。利用收集并溫育1小時的撞擊流體制備所示
制劑。pH為7.4,活性劑為用于沉默ApoB的dsRNA。

所述脂質體形成組分為含DILA2氨基酸化合物C18:1-正
Arg(NH3Cl)-C16以及脂質膽固醇半琥珀酸酯(CHEMS,Anatrace,CH210)、膽
固醇(Anatrace?CH200)和DMPE-PEG2k(Genzyme)的乙醇溶液。DILA2氨基
酸化合物和脂質的相對量為(50/28/20/2)。

如表12所示,利用RNAi試劑溶液的流速與脂質體形成組分的溶液的流
速之比為1.7∶1、3∶1和5∶1制備dsRNA制劑。

表12:具有受控制的流速比的脂質體組合物的制備



表12的結果表明,利用RNAi試劑溶液的流速與脂質體形成組分的溶液
的流速之比為約2至約5制備了具有活性劑的良好包裹和用于小鼠體內
ApoB的基因沉默活性的脂質體組合物。

表12的結果表明,利用RNAi試劑溶液的流速與脂質體形成組分的溶液
的流速之比為約3至約5實現了低至80nm的平均粒度和低的粒度分散性。

實施例6

含RNA的脂質體組合物的過濾

在該實施例中,觀察了通過切向流過濾濃縮活性RNAi試劑在脂質體組
合物的制備中的影響。利用實施例1中描述的基本方法通過在收集容器中收
集22%EtOH下的撞擊流體并溫育30分鐘而制備pH7.4的組合物。將組合
物淬火至EtOH濃度為10%,用于切向流過濾。

所述脂質體形成組分為含DILA2氨基酸化合物C18:1-正Arg-C16以及脂
質膽固醇半琥珀酸酯(CHEMS,Anatrace,CH210)、膽固醇(Anatrace?CH200)和
DMPE-PEG2k(Genzyme)的乙醇溶液。DILA2氨基酸化合物和脂質的相對量
為(50/28/20/2)。

利用Amersham?PES柱通過切向流過濾對制劑進行過濾。如表13所示,
在所進行的將活性RNAi試劑的濃度濃縮高達16倍的切向流過濾下,所示組
合物保持了活性RNAi試劑的穩定的相關粒度和包裹。活性RNAi試劑的終
濃度高達5mg/ml。

表13:利用溫育和過濾制備的脂質體RNAi制劑的體內基因沉默活性


實施例7

含RNA的脂質體組合物的穩定性

在該實施例中,觀察了在提高的溫度下持續7天的脂質體組合物的穩定
性。使用實施例1中描述的基本方法通過撞擊和溫育1小時制備組合物。使
用湍動混合管,并且收集容器中EtOH的濃度為33%。制備后,將制劑在45℃
保持7天。7天后,平均粒度為116nm,包裹為71%。對于經過熱處理的制
劑,在7天后沒有觀察到小鼠體內ApoB基因沉默活性的損失。

實施例8

肽結合區

利用染料結合試驗測定陽離子肽與RNAi誘導劑結合的相對強度。

以7.8μl制備RNAi誘導劑(10ml)以制備20μg/ml的儲備液,然后為75μl/
孔。以3.75μl制備SYBR-Gold稀釋液(15ml),對于2.5×儲備液為1∶4000稀
釋。

將肽溶解在含5%葡萄糖的Hepes緩沖劑中并稀釋。對肽進一步稀釋,
從而可以向各個孔加入75μl以形成期望的N∶P(范圍為0-4)。認為肽的純度
為50%,但實際肽量未知。

進行SYBR-Gold染料結合試驗。利用每孔150μl的樣本體積進行96孔
板測定。pH7.4的10mM?hepes/5%葡萄糖中dsRNA的終濃度為10μg/ml。將
肽稀釋至不同的工作溶液從而加入等體積以達到不同的N/P比。對于添加過
程,首先加入dsRNA(75μl,20μg/ml)然后為150μl?2.5×SYBR-Gold。然后
加入肽(75μl),以競爭SYBR染料。總體積為300μl。根據緩沖劑中單獨的
染料背景校正熒光。在Molecular?Devices讀板儀上讀取的SYBR-Gold?ex/em
為495nm/537nm。

通過轉移至384孔板以利用Wyatt粒度儀測定,而對制劑粒度進行測定。
所轉移的96孔板的每個孔均為一式兩份。板中保持的體積為200μl。

在適當的時候,通過二硫鍵還原或酶促裂解觸發肽的釋放。以半胱氨酸
作為末端的肽可以通過谷胱甘肽還原而裂解。含V-Cit的肽可以通過組織蛋
白酶B的酶促裂解而裂解。細胞內存在的谷胱甘肽為0.1至10mM,溶酶體
中存在的組織蛋白酶B為1mM。(對于0.14ng/μl的組織蛋白酶B,參見BMC?
Gastroenterology?2002,2:16)。

對于釋放,向一式兩份的孔之一加入終濃度為1mM的適當分子,然后
隨時間測定SYBR?GOLD熒光。

如圖6所示,聚精氨酸結合區與dsRNA的結合隨聚精氨酸結合區的長度
而提高。在圖6中,利用PN3499、肽(SEQ?ID?NO:353)RRRRRCCRRRRR(總
共含10個精氨酸的二聚體肽)觀察到了最強的結合(取代SYBR-Gold染料的
最佳能力)。

實施例9

在A549細胞中的PPIB基因表達敲減的體外試驗

親環素B(PPIB)基因敲減測定可被用作干擾性RNA遞送制劑的主要活性
的體外試驗。通常,以較小的變化按照以下描述進行測定。

親環素B(PPIB)基因表達敲減是在人肺泡上皮基底細胞A549中測定的。
為了進行PPIB基因敲減測定,用干擾性RNA制劑轉染A549細胞,轉染后24
小時制備總RNA,并通過RT-PCR對PPIB?mRNA進行分析。進行36B4(酸性核
糖體磷蛋白PO)mRNA表達的QRT-PCR,從而進行標準化。

以7,500個細胞/孔(96孔)接種A549細胞,在培養基中過夜培養。轉染時
的匯合度為約50%。轉染復合物的制備是通過將干擾性RNA加至培養基
(OptiMEMTM)并渦旋,分別將遞送制劑加至培養基(OptiMEMTM)并渦旋,最
后將培養基中的干擾性RNA與培養基中的遞送制劑混合,室溫下溫育20分
鐘,從而獲得轉染復合物。用新鮮的OptiMEMTM代替溫育細胞的培養基,將
轉染復合物加至各孔中。在37℃和5%CO2溫育細胞5小時,然后添加完全培
養基(至最終的胎牛血清濃度10%),并繼續溫育直至轉染后24小時。

為了進行PPIB基因敲減,將細胞裂解,制備RNA(Invisorb?RNA?Cell?HTS?
96-Kit/C,Invitek,Berlin,或RNeasy?96?Kit,Qiagen)。在DNA?Engine?Opticon2
熱循環儀(BioRad)上,利用一步qRT-PCR試劑盒(Invitrogen)進行定量
RT-PCR。

PPIB所用的引物是:

(SEQ?ID?NO:354)

5’-GGCTCCCAGTTCTTCATCAC-3’(正向)和

(SEQ?ID?NO:355)

5’-CCTTCCGCACCACCTC-3’(反向)以及

(SEQ?ID?NO:356)

5’-FAM-CTAGATGGCAAGCATGTGGTGTTTGG-TAMRA-3’作為探針。

對于36B4,引物是:

(SEQ?ID?NO:357)

5’-TCTATCATCAACGGGTACAAACGA-3’(正向)和

(SEQ?ID?NO:358)

5’-CTTTTCAGCAAGTGGGAAGGTG-3’(反向)以及

(SEQ?ID?NO:359)

5’-FAM-CCTGGCCTTGTCTGTGGAGACGGATTA-TAMRA-3’作為探
針。

本發明的一些雙鏈RNA(dsRNA)的結構示于表14。

表14:雙鏈RNA



在表14中,“mU”表示2′-O-甲基尿苷,“mC”表示2′-O-甲基胞苷,“s”表
示硫代磷酸酯鍵。

實施例10

利用層狀載體和所觸發的釋放肽進行PPIB基因表達敲減

在A549細胞中針對PPIB基因敲減活性對RNAi誘導劑的納米顆粒載體
進行測定。以特定N/P比最初形成dsRNA?RNAi誘導劑和所觸發的釋放肽的
二元復合物。加入溶內體試劑,其將N/P比調節至最終值。

通常通過首先將dsRNA渦旋在HEPES/葡萄糖緩沖劑中而制備層狀載體
制劑。在渦旋下加入所觸發的釋放肽以與dsRNA復合。對復合物溫育15分
鐘。加入戊二醛并允許核心交聯1.5小時。通過加入pH?7.4的1M?Tris緩沖
液使反應淬火。加入溶內體試劑,并在加入至細胞前溫育載體混合物15分鐘。

利用含有所觸發的釋放肽的層狀載體進行的PPIB基因表達敲減測定如
表15所示。表15的結果表明,在溶內體試劑存在下,含有所觸發的釋放肽
的載體可有效地將活性dsRNA試劑遞送至細胞以產生顯著的基因沉默作用。

表15:利用所觸發的釋放肽進行的PPIB基因表達敲減


在該實施例中使用的物質如下:

PN4110

SEQ?ID?NO:373

WWHHKKRRCCRRKKHHWW

PN3033(diINF7)

SEQ?ID?NO:374

NH2-GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGC-CO2H

最終的N/P比對利用含有所觸發的釋放肽的層狀載體的PPIB基因表達
敲減測定的影響,結果如表16所示。表16中的結果表明,在溶內體試劑存
在下,含有所觸發的釋放肽的載體可有效地將活性dsRNA試劑遞送至細胞以
產生顯著的基因沉默作用。此外,表16的結果還表明,在2.5-3.5的較低終
N/P比時,含有所觸發的釋放肽的層狀載體在體外的敲減得到增強。

表16:終N/P比對體外基因敲減的影響


實施例11

具有有利的低遞送效率比的載體顆粒

利用用PN4110縮合的DX227制備一批載體納米顆粒。本批的遞送效率
比為0.63。顆粒直徑為223nm(Z-avg,PDI?0.2)。

利用用PN183縮合的DX4227制備一批載體納米顆粒。本批的遞送效率
比為1.28。顆粒直徑為208nm(Z-avg,PDI?0.2)。

本實施例使用以下物質:

PN183

SEQ?ID?NO:375

NH2-KETWWETWWTEWSQPGRKKRRQRRRPPQ

實施例12

由荷載有載體顆粒的氨基酸脂質制備的脂質體制劑

利用表17所示的組成制備RNAi試劑和氨基酸脂質的脂質體制劑。針對
ApoB的RNAi試劑描述在WO08/109357中。

表17:ApoB?RNAi試劑和氨基酸脂質的脂質體制劑



實施例13

利用由荷載有肽縮合物載體顆粒的氨基酸脂質制備的脂質體制劑在體外
對HepG2細胞中ApoB基因沉默敲減

測定了由荷載有肽縮合物載體顆粒的氨基酸脂質制備的脂質體制劑在體
外的ApoB基因沉默活性。由在HepG細胞中的體外試驗獲得ApoB基因敲
減活性。計算了所示制劑的標準化的ApoB?mRNA表達值。

用于HepG試驗的方法和方案如以下:

第1天:向孔中加入25μL復合物,然后向孔中含有10%FBS的DMEM
或者無血清的OPTIMEM中加入75μL細胞。對于無血清的OPTIMEM,在
4至5小時后加入100μL含20%血清的完全培養基,使最終的FBS濃度為
10%。

第2天:在24小時裂解細胞,制備RNA,并針對ApoB和36B4進行
qRT-PCR,或者在第3天針對GAPDH?mRNA進行qRT-PCR。

制備脂質體制劑[C18:1-正Arg-C16/CHEMS/chol/DMPE-PEG2k
(50/32/16/2)],其中C18:1-正Arg-C16是美國專利申請12/114,284中描述的氨
基酸脂質。使所示脂質體制劑荷載肽縮合物載體顆粒DX4227/PN4110。最初
的N/P比為0.8。與Qneg相比,對于100nM?DX4227?RNAi試劑,該制劑顯
示91%的敲減。

如表18所示,制備額外的脂質體制劑[C18:1-正
Arg-C16/CHEMS/chol/DMPE-PEG2k(50/32/16/2)]并使其荷載有肽縮合物載
體顆粒DX4227/PN183。

表18:脂質體制劑在HepG中的體外ApoB基因沉默敲減


如表18所示,與Qneg相比,對于濃度為25nM和2.5nM的DX4227?RNAi
試劑,這些制劑顯示有利的高敲減活性。

實施例14

利用由荷載有肽縮合物載體顆粒的氨基酸脂質制備的脂質體制劑在體內
對ApoB基因的沉默敲減

利用由荷載有含ApoB基因沉默RNAi試劑的肽縮合物載體顆粒的氨基
酸脂質制備脂質體制劑。在小鼠體內測定這些脂質體制劑的ApoB基因沉默
活性并與小鼠血清膽固醇水平相比。體內ApoB?mRNA的活性降低和體內相
應的血清膽固醇降低示于表19中。表19中的脂質體制劑為[C18:1-正
Arg-C16/CHEMS/chol/DMPE-PEG2k(50/32/16/2)],并且每種情況下的劑量均
為2mg/kg。

表19:利用荷載有肽縮合物載體顆粒的脂質體制劑在小鼠體內沉默ApoB基


表19的結果表明,荷載有含ApoB基因沉默RNAi試劑的肽縮合物載體
顆粒的脂質體制劑在小鼠體內有利地得到良好耐受,原因是,在給藥后48
小時體重增加整體高于沒有肽縮合物載體顆粒的同一制劑。

此外,表19的結果還表明,荷載有肽縮合物載體顆粒的脂質體制劑在體
內對ApoB基因沉默具有有利的高活性(在降低ApoB?mRNA和降低血清膽固
醇兩方面)。表19的結果表明,優選1.0的較高初始N/P和0.6-0.7的較低的
終N/P。

利用荷載有含ApoB基因沉默RNAi試劑的肽縮合物載體顆粒的氨基酸
脂質制備其它脂質體制劑。在小鼠體內測定這些脂質體制劑的ApoB基因沉
默活性并與小鼠血清膽固醇水平相比。體內的ApoB?mRNA降低活性和體內
的相應血清膽固醇降低示于表20。

表20:利用荷載有肽縮合物載體顆粒的脂質體制劑在小鼠體內的ApoB基因
沉默


對于表20中荷載有肽縮合物載體顆粒的脂質體制劑,制劑3的遞送效率
比為9.21,制劑4的遞送效率比為9.86。

表20的結果表明,荷載有含ApoB基因沉默RNAi試劑的肽縮合物載體
顆粒的脂質體制劑在小鼠體內有利地得到良好耐受,原因是,在給藥后48
小時的體重增加,而沒有肽縮合物載體顆粒的同一制劑的體重降低。

此外,表20的結果還表明,荷載有肽縮合物載體顆粒的脂質體制劑在體
內對ApoB基因沉默具有有利的高活性(在降低ApoB?mRNA和降低血清膽固
醇兩方面)。




















































































關 鍵 詞:
基因 沉默 治療 脂質體 有效 遞送 方法 組合
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
關于本文
本文標題:基因沉默治療劑的脂質體有效遞送方法和組合物.pdf
鏈接地址:http://www.wwszu.club/p-6417992.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
鬼佬大哥大