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一種將蛋白質遞送到細胞中的方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN200880021216.9

申請日:

2008.04.30

公開號:

CN101686940B

公開日:

2014.10.22

當前法律狀態:

終止

有效性:

無權

法律詳情: 未繳年費專利權終止IPC(主分類):A61K 9/133申請日:20080430授權公告日:20141022終止日期:20150430|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 9/133申請日:20080430|||公開
IPC分類號: A61K9/133; A61K47/34; C08L89/00; A61K38/16; C08L67/08 主分類號: A61K9/133
申請人: 新加坡科技研究局
發明人: 楊義燕; 王勇; 阿什林靈智·李
地址: 新加坡新加坡市
優先權: 2007.04.30 US 60/924,092
專利代理機構: 北京金信立方知識產權代理有限公司 11225 代理人: 黃麗娟;徐琳
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200880021216.9

授權公告號:

|||101686940B||||||

法律狀態公告日:

2016.06.22|||2014.10.22|||2010.05.19|||2010.03.31

法律狀態類型:

專利權的終止|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明提供了一種由陽離子型聚合物形成的膠束與蛋白質的復合物以及使用該復合物將蛋白質遞送到細胞中的方法。

權利要求書

權利要求書
1、  一種膠束-蛋白質復合物,其包括:
陽離子型聚合物的膠束,該陽離子型聚合物具有通式I的結構:
-(W-X-Y-Z)p-(W′-X′-Y′-Z′)q-;
和蛋白質,該蛋白質具有用來與所述膠束復合的區域;
所述蛋白質通過蛋白質與所述聚合物之間的相互作用復合到所述膠束的外部;
其中,在通式I中:
W、X、Y和Z各自獨立地選自

和不存在,
其中W、X、Y和Z中只有一個為不存在,且W、X、Y和Z中至少一個為包含與R或R′結合的氮的基團;
W′、X′、Y′和Z′各自獨立地選自

和不存在,
其中W′、X′、Y′和Z′中只有一個為不存在,且W′、X′、Y′和Z′中至少一個為包含與R″或R″′結合的氮的基團;
R和R′各自獨立地為H、烷基或雜烷基;
R″和R″′各自獨立地為疏水基;
p和q各自獨立地為大于零的整數;以及
m、n、r、s、t、m′、n′、r′、s′和t′各自獨立地為大于0的整數。

2、  根據權利要求1所述的膠束-蛋白質復合物,其中,所述蛋白質的用來與所述膠束復合的區域為負電荷區域、極性區域或疏水區域。

3、  根據權利要求1或2所述的膠束-蛋白質復合物,其中,所述陽離子型聚合物包括聚{N-甲基二乙烯胺癸二酸酯)-共-[(膽甾醇基氧羰基酰氨基乙基)甲基二(亞乙基)溴化銨]癸二酸酯}。

4、  根據權利要求1~3中任一項所述的膠束-蛋白質復合物,其中,所述蛋白質為寡肽、肽、多肽、全長蛋白質、蛋白質片段、蛋白質結構域或融合蛋白。

5、  根據權利要求1~4中任一項所述的膠束-蛋白質復合物,其中,所述蛋白質為生物活性蛋白質。

6、  根據權利要求5所述的膠束-蛋白質復合物,其中,所述蛋白質包括激素、受體配體、轉錄因子、轉錄增強子、轉錄抑制因子、酶、激酶、磷酸酯酶、核酸酶、蛋白酶、生長因子、抗體或細胞毒性蛋白質。

7、  根據權利要求6所述的膠束-蛋白質復合物,其中,所述生長因子包括神經膠質衍生的親神經因子,所述細胞毒性蛋白質包括凝集素A,以及所述抗體包括赫賽汀。

8、  根據權利要求1~7中任一項所述的膠束-蛋白質復合物,其進一步包含附加的治療劑。

9、  根據權利要求8所述的膠束-蛋白質復合物,其中,所述附加的治療劑為包含在所述膠束內部的藥劑。

10、  根據權利要求8所述的膠束-蛋白質復合物,其中,所述附加的治療劑為復合到所述膠束外部的藥劑或核酸分子。

11、  一種將蛋白質遞送到細胞中的方法,其包括:
使根據權利要求1~10中任一項所述的膠束-蛋白質復合物與細胞接觸以使所述膠束-蛋白質復合物被吸收到細胞中。

12、  根據權利要求11所述的方法,其中,所述細胞為體外細胞。

13、  根據權利要求12所述的方法,其中,所述細胞為體內細胞,并且所述方法包括向被試者施用所述膠束-蛋白質復合物。

14、  根據權利要求13所述的方法,其中,所述被試者是人。

15、  根據權利要求11~14中任一項所述的方法,其中,所述蛋白質為生物活性蛋白質并且在遞送到細胞中后保持生物活性。

16、  一種藥物組合物,其包含根據權利要求1~10中任一項所述的膠束-蛋白質復合物。

17、  根據權利要求16所述的藥物組合物,其進一步包含可藥用的載體。

18、  根據權利要求1~10中任一項所述的膠束-蛋白質復合物用于將蛋白質遞送到被試者的細胞中的用途。

19、  根據權利要求18所述的用途,其中,所述被試者是人。

20、  根據權利要求18或19所述的用途,其中,所述蛋白質為生物活性蛋白質并且在遞送到細胞中后保持生物活性。

說明書

說明書一種將蛋白質遞送到細胞中的方法
相關申請的交叉引用
本申請要求享有于2007年4月30日提交的美國臨時專利申請第60/924,092號的優先權,其全部內容在此通過參考的方式并入。
技術領域
本發明主要涉及將蛋白質遞送到細胞中的方法。
背景技術
對各種病癥、疾病和狀態的治療途徑可以設想將生物活性蛋白質遞送到細胞中,從而使該蛋白質能夠在細胞環境內執行其生物學功能。
現存的將生物活性蛋白質遞送到細胞中的方法包括例如顯微注射[6,7]和電穿孔[8,9]的物理方法,該方法可證實難以應用在活體內。
分子技術包括使蛋白轉導域(PTD)與活性蛋白質結合從而介導蛋白質的細胞吸收。三個最活躍地研究的PTD源自Drosophilia anntennapedia肽、HSV-VP22蛋白和HIV-TAT蛋白轉導基序。通過這些PTD穿過細胞膜的轉導的發生機制目前尚未充分了解,但是研究已顯示,肽和蛋白質的遞送與PTD中正電荷賴氨酸和精氨酸殘基的含量和分布密切相關[10,11]。
正在日益興起的合理的給藥研究中的另一途徑涉及陽離子型脂質和聚合物。例如,聚乙烯亞胺(PEI)結合蛋白質通過離子電荷相互作用能夠進入細胞[12]。蛋白質與PEI的結合必需在溫和條件下進行從而使蛋白質免于變性。而且,PEI的細胞毒性也限制其在活體內的應用,特別是具有高分子量的PEI。
因此,需要將蛋白質(包括生物活性蛋白質或抗體)遞送到細胞中的另一途徑。
發明內容
一方面,本發明提供了一種膠束-蛋白質復合物,其包含:
陽離子型聚合物的膠束,所述陽離子型聚合物具有通式I-(W-X-Y-Z)p-(W′-X′-Y′-Z′)q-的結構;和蛋白質,所述蛋白質具有用來與所述膠束復合的區域。所述蛋白質通過蛋白質與陽離子型聚合物之間的相互作用復合到所述膠束的外部。
在通式I中,W、X、Y和Z各自獨立地選自
和不存在,其中W、X、Y和Z中只有一個為不存在,且W、X、Y和Z中至少一個為包含與R或R′結合的氮的基團。
而且,在通式I中,W′、X′、Y′和Z′各自獨立地選自
和不存在,其中W′、X′、Y′和Z′中只有一個為不存在,且W′、X′、Y′和Z′中至少一個為包含與R″或R′″結合的氮的基團。
此外,在通式I中,R和R′各自獨立地為H、烷基或雜烷基(heteroalkyl);R″和R′″各自獨立地為疏水基;p和q各自獨立地為大于零的整數;以及m、n、r、s、t、m′、n′、r′、s′和t′各自獨立地為大于0的整數。
在本發明提供的膠束-蛋白質復合物中,所述陽離子型聚合物可包括聚{N-甲基二乙烯胺癸二酸酯)-共-[(膽甾醇基氧羰基酰氨基乙基)甲基二(亞乙基)溴化銨]癸二酸酯}(poly{N-methyldietheneamine sebacate)-co-[(cholesteryloxocarbonylamido ethyl)methyl bis(ethylene)ammonium bromide]sebacate})。所述蛋白質可為寡肽、肽、多肽、全長蛋白質、蛋白質片段、蛋白質結構域(protein domain)或融合蛋白,并且可為生物活性的。
在各種實施方式中,所述蛋白質可包括激素、受體配體、轉錄因子、轉錄增強子、轉錄抑制因子、酶、激酶、磷酸酯酶、核酸酶、蛋白酶、生長因子、抗體或細胞毒性蛋白質。在特別的實施方式中,所述生長因子可包括神經膠質衍生的親神經因子,所述細胞毒性蛋白質可包括凝集素A,以及所述抗體可包括赫賽汀(herceptin)。
本發明提供的膠束-蛋白質復合物可進一步包含附加的治療劑,其包括包含在所述膠束內部的藥劑或者復合到所述膠束外部的藥劑或核酸分子。
另一方面,本發明提供了一種將蛋白質遞送到細胞中的方法。該方法包括使如本申請所述的膠束-蛋白質復合物與細胞接觸以使膠束-蛋白質復合物被吸收到細胞中。
所述細胞可為體外細胞,或者可為體內細胞,所以該方法包括向被試者(包括例如人)施用所述膠束-蛋白質復合物。
在一些實施方式中,所述蛋白質為生物活性蛋白質并且在遞送到細胞中后保持生物活性。
再一方面,本發明提供了一種藥物組合物,其包含如本申請所述的膠束-蛋白質復合物。所述藥物組合物可進一步包含可藥用的載體。
又一方面,本發明提供了如本申請所述的膠束-蛋白質復合物用于將蛋白質遞送到被試者的細胞中的用途。所述被試者可為人。
在各種實施方式中,所述蛋白質為生物活性蛋白并且在遞送到細胞中后保持生物活性。
結合附圖,在回顧本發明的具體實施方式的下列描述后,對于本領域普通技術人員來說,本發明的其它方面和特點將變得明顯。
附圖說明
在圖中,只通過實施例說明本發明的實施方式:
圖1:P(MDS-共-CES)膠束/凝集素A復合物的粒度和ζ電勢。各條件重復三次測試。用誤差棒顯示標準差。
圖2:在用包含固定濃度的凝集素A和變化濃度的P(MDS-共-CES)的膠束/凝集素A復合物孵育后MDA-MB-231(a)、HepG2(b)、HeLa(c)和4T1(d)細胞的生活力。各條件重復八次測試。用誤差棒顯示標準差。
圖3:在用包含變化濃度的凝集素A和固定濃度的P(MDS-共-CES)的膠束/凝集素A復合物孵育后MDA-MB-231(a)、HepG2(b)、HeLa(c)和4T1(d)細胞的生活力。各條件重復八次測試。用誤差棒顯示標準差。
圖4:將P(MDS-共-CES)膠束介導的凝集素A和BioPorter介導的凝集素A遞送到MDA-MB-231(a)、HepG2(b)、HeLa(c)和4T1(d)細胞中的比較研究。在含血清培養基中分別以(a)20ppm、(b)50ppm、(c)40ppm和(d)100ppm的固定濃度使用P(MDS-共-CES)。各條件重復八次測試。用誤差棒顯示標準差。
具體實施方式
本方法和組合物涉及生物可降解的陽離子膠束與蛋白質之間的復合物的形成,以及這種復合物用于將蛋白質遞送到細胞內部的用途。
以前,在美國專利申請第10/849,498號(公開為US 2005/0260276)中描述了新的陽離子核-殼膠束。該申請涉及生物可降解的陽離子核-殼膠束用于遞送藥物(包括在膠束內部封裝的藥物)以及遞送核酸分子(包括與膠束外部結合的核酸分子)的用途。形成膠束的聚合物由具有連接到主鏈中季氨基(quaternary amino group)處的主鏈上的疏水側基的親水主鏈組成。該帶電季氨基賦予聚合物聚陽離子性質、沿著主鏈分布的非中和正電荷。該聚合物還包含沿著主鏈的叔氨基(tertiary amino group),其可被質子化和去質子化,從而使該聚合物在生理環境中具有緩沖效應[14]。
如在US 2005/0260276中所述,通過在膠束裝配過程中用聚合物包合藥物而將藥物容易地封裝在膠束內部。盡管一些疏水基可位于膠束外部,但是許多藥物包含疏水部分,例如疏水環結構,從而使藥物與趨向與膠束結構的內部分離的聚合物上的疏水側基之間結合。
同樣,如在US 2005/0260276中所述,如DNA的核酸可以容易地與膠束外部結合。核酸是具有沿著分子主鏈有規則地分布的負電荷的柔性分子,并因此能夠與膠束表面的輪廓相符并且與位于膠束外表面的陽離子電荷靜電結合。
相反,蛋白質可以折疊成復雜結構,包括球狀結構,特別是在活性通常取決于蛋白質的構象折疊的生物活性蛋白質的情況下。蛋白質即使在具有負電荷區域時亦不會與聚陰離子核酸具有相同的電荷分布,并且往往是不能以與核酸相同的方式與膠束的表面一致。同樣,蛋白質往往對環境(包括微環境)十分敏感,并且在不適宜的條件下可變性,導致生物活性喪失。盡管蛋白質伴隨這些明顯的困難,本發明人現已證實了先前所述的膠束能夠令人驚訝地用于將蛋白質(包括折疊的生物活性蛋白質)遞送到細胞中。
在保留蛋白質可具有的生物活性的同時,所述核-殼膠束可用于將該蛋白質遞送到細胞內部。細胞毒素凝集素A用作示范性的具有生物活性的蛋白質,并且如下列實施例1所述,與BioPorter(包括陽離子脂質的商業可利用的蛋白質載體)相比,凝集素A被更加有效地遞送到細胞中。同樣,在通過膠束遞送時凝集素A針對各種癌細胞系的細胞毒性比在通過BioPorter遞送時的高得多。因此,本方法可導致蛋白質被非常有效地遞送到細胞中的同時保持蛋白質可具有的任何生物活性。所述膠束-蛋白質復合物具有多種應用,包括體外應用、研究和人的醫學應用。
盡管將凝集素A用作示范性蛋白質,但是本發明所述的方法和復合物意欲延伸到通常蛋白質,包括抗體,例如赫賽汀;可以理解的是,本發明的方法和復合物不依賴于在該方法或復合物中所用的蛋白質的任何特定氨基酸序列或者生物活性。
因此,提供了一種將蛋白質遞送到細胞內部的方法。由生物可降解的、陽離子型兩親性聚合物(amphilic polymer)形成的膠束用作遞送載體并且用來與要被遞送的蛋白質形成復合物。然后,使該復合物與將要向其中遞送蛋白的細胞接觸。該復合物適當地帶正電荷并且具有使復合物被胞吞的適當尺寸并因此被細胞吸收,從而將蛋白質遞送到細胞中。
首先,提供了與蛋白質復合的膠束。如US 2005/0260276中所述,示范性的膠束包含陽離子型聚合物。如上所述,該聚合物具有包含氨基的親水主鏈。在形成聚合物主鏈的骨架的親水分子中的氨基為叔氨基。所述叔氨基可根據pH被質子化或者去質子化,根據溶液條件影響凈正電荷。然而,經由至少一部分叔氨基將疏水側基連接到親水主鏈上,其通過將這些氨基永久地轉變成帶正電荷的基團(即季氨基),從而導致聚合物為陽離子型的(不管pH)。
所述陽離子型聚合物具有通式I的結構:
-(W-X-Y-Z)p-(W′-X′-Y′-Z′)q
W、X、Y和Z各自獨立地選自
和不存在。
W、X、Y和Z中只有一個為不存在,且W、X、Y和Z中至少一個為包含與R或R′結合的氮的基團。
W′、X′、Y′和Z′各自獨立地選自
和不存在。
W′、X′、Y′和Z′中只有一個為不存在,且W′、X′、Y′和Z′中至少一個為包含與R″或R′″結合的氮的基團。
R和R′各自獨立地為H、烷基或雜烷基。
此處所用的烷基指的是含有1~20個碳原子、1~12個碳原子或1~8個碳原子的直鏈或支鏈飽和烴一價基團并且任選用例如烷氧基((任選低級)烷基的烷氧基)、鹵素、三氟甲基、氰基、羧基、氨基甲酸酯、磺酰基或氨磺酰取代。
此處所用的雜烷基的主烴鏈的部分如上述烷基所定義,但是包含一個或多個雜原子(例如N、O、S等)。
R″和R′″各自獨立地為疏水基。
此處所用的疏水基為通過從疏水分子中除去氫而形成的一價基團,所述疏水分子例如為膽甾醇、聚乳酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚己酸內酯、聚碳酸酯或多酚。
p和q各自獨立地為正整數,例如1~2000、1~1000或1~500的整數。將要理解的是,各-(W-X-Y-Z)-和各-(W′-X′-Y′-Z′)-單體可以沿著聚合物主鏈隨機排列,并且上述式I并沒有必須地暗示單體在嵌段中排列。
m、n、r、s、t、m′、n′、r′、s′和t′各自獨立地為大于0的整數,例如1~20的整數、1~12的整數或1~8的整數。
在具體的實施方式中,所述聚合物可以具有通式II的結構:

對于式II,p、q、n、s、t、n′、s′、t′、R和R″各自如上述式I中所限定。
在具體的實施方式中,所述聚合物可以具有通式III的結構:

對于式III,p、q、n、s、t、n′、s′、t′、R和R″各自如上述式I中所限定。
在具體的實施方式中,所述聚合物可以具有通式IV的結構:

對于式IV,p、q、m、n、r、t、m′、n′、r′、t′、R、R′、R″和R′″各自如上述式I中所限定。
在具體的實施方式中,如在US 2005/0260276中所述,所述聚合物包含聚{N-甲基二乙烯胺癸二酸酯)-共-[(膽甾醇基氧羰基酰氨基乙基)甲基二(亞乙基)溴化銨]癸二酸酯}(P(MDS-共-CES))。在具體的實施方式中,所述聚合物為P(MDS-共-CES)。
由于沿著主鏈包含酯基和氨酯基,如上所述的聚合物是生物可降解的。同樣,由于沿著主鏈設置的酯基、醚基和氨基以及沿著主鏈在氨基處的主鏈上接枝的疏水基,所述聚合物是兩親的。聚合物的兩親性使聚合物形成膠束,當在水溶液或親水性溶液中形成時,疏水基趨向于定位朝向膠束的內部,而親水的陽離子主鏈趨向于定位朝向膠束的外部。
從式I-IV中可以看出,用接枝的疏水基取代主鏈的程度因帶正電荷的第四位取代的氨基的形成而影響聚合物的總的靜電荷和正電荷分布。因此,為了使膠束與蛋白質形成復合物從而將蛋白質遞送到細胞中,用接枝的疏水基取代主鏈至足夠的程度,以使聚合物形成膠束并且向聚合物提供適當的陽離子電荷。例如,取代程度可為約1%~約100%、約10%~約90%、約20%~約50%、約25%~約40%。或者取代程度可為小于約100%、小于約90%、小于約80%、小于約50%、小于約40%、小于約30%、小于約20%、大于約25%、大于約30%、大于約40%、大于約50%、大于約80%、大于約90%。用(主鏈上包括疏水基取代基的季氨基的數目)除以(適合用疏水基取代的可能的氨基的數目)乘以100%測量得出取代程度的百分比。
所述聚合物鏈長具有足夠的重均分子量以使聚合物形成膠束,包括通過自裝配。在各種實施方式中,所述聚合物的重均分子量為約1kDa~約50kDa、約1kDa~約30kDa、約5kDa~約30kDa、約5kDa~約20kDa、約5kDa~約15kDa、約8kDa~約12kDa或約3kDa~約8kDa。
所述聚合物可以通過本領域已知的標準化學技術制備,包括在US2005/0260276描述的那些和在下列實施例中描述的那些。例如,適合的縮合反應可用于使適合的單體反應來得到所需的親水主鏈。然后,可使該主鏈與適合的疏水分子反應從而進行聚合物主鏈上的叔氨基的氮原子與疏水分子中的弱電子中心(electron-poor centre)間的反應。
具體地,在US 2005/0260276中、在Wang等人Nat.Mater.2006,5,791中和在下述實施例1中描述了P(MDS-共-CES)的合成機制。
因此,可以將所述陽離子型聚合物裝配成膠束。使用本領域已知的標準方法和如US 2005/0260276中所述的方法可以形成膠束。例如,膠束通常可以通過溶解技術、透析技術或者通過本領域已知的單乳膠技術形成。
所述陽離子型聚合物可以被設計為自裝配成膠束,包括通過使用其中將陽離子型聚合物溶于適合的溶劑(如極性非質子溶劑(例如二甲基甲酰胺))中而后對水和緩沖水溶液進行透析的透析技術,包括如US 2005/0260276中和在下列實施例中所述。
膠束大小是這樣大小的膠束:膠束在與蛋白質形成復合物時可具有使蛋白質要被遞送到其中的細胞對膠束-蛋白質復合物進行胞吞作用的足夠尺寸。例如,膠束的截面尺寸可為小于約1μm、約250nm以下、約180nm以下、約10nm~約250nm、約50nm~約200nm、約100nm~約200nm、約100nm~約180nm、約130nm~約160nm、約150nm。
在本發明所述的方法中,膠束與蛋白質復合。本文所用術語“膠束-蛋白質復合物”或者本文所用術語蛋白質與膠束“復合”或者形成“復合物”指的是膠束與蛋白質間的相互作用,其足夠穩定以使蛋白質與膠束結合從而將其遞送到細胞中。本文所用術語向細胞中“遞送”或者“遞送到”細胞中指的是使蛋白質從細胞的外部進入到細胞的內部,使其局限在細胞溶質中或在細胞的細胞器內。
本文所用蛋白質指的是兩個或更多個氨基酸通過肽(酰胺)鍵連接在一起形成的鏈,并且包括多肽、抗體、全長蛋白質、蛋白質片段、蛋白質結構域或融合蛋白。多肽可為寡肽或肽。
由于蛋白質在特定生物背景下具有生物學功能,例如,酶活性、與如另一蛋白質或蛋白質結構域或核酸序列的靶分子結合、激素活性、細胞信號活性、轉錄激活或抑制活性、細胞生長或細胞周期調節、抗癌活性或細胞毒素活性,所以蛋白質可為生物活性蛋白質。
蛋白質將具有用來與膠束形成復合物的區域或部分。例如,通過蛋白質上可利用的各種官能團與膠束外部上可利用的互補官能團之間的疏水、靜電或氫鍵結合相互作用,蛋白質可與膠束形成復合物。
因此,為了使膠束與要被遞送到細胞中的蛋白質復合,該蛋白質可具有帶負電荷的或陰離子的區域,例如蛋白質的部分或者附著于蛋白質上的標簽部分。蛋白質上的負電荷使蛋白質與陽離子膠束通過靜電相互作用形成復合物。例如,如果蛋白質是短的寡肽,則該寡肽沿著其長度可包含一個或多個帶負電荷的氨基酸,例如天冬氨酸或谷氨酸。如果蛋白質為折疊鏈(包括全長蛋白質、抗體、蛋白質結構域或融合蛋白),則蛋白質可包含由于帶負電荷的氨基酸位于蛋白質表面的空間排布而帶負電荷的蛋白質的表面上的區域。例如在生物活性蛋白質或蛋白質結構域的C端,蛋白質可以設計成具有一段長度的包含帶負電荷的氨基酸的氨基酸的融合蛋白。或者,可以用帶負電荷的基團或附著于蛋白質上的標簽修飾蛋白質。將理解的是,任何修飾(包括通過融合額外的氨基酸或者通過附著帶負電荷的標簽)的進行都應當不干擾蛋白質的生物學功能。
或者,為了使膠束與要被遞送到細胞中的蛋白質復合,蛋白質可具有疏水區域,例如蛋白質或附著于蛋白質上的標簽的部分。蛋白質的疏水區域使蛋白質與陽離子膠束通過與暴露在膠束外部上的任意疏水側基的疏水相互作用而形成復合物。例如,如果蛋白質為短的寡肽,則該寡肽沿著其長度可包含一個或多個疏水氨基酸,例如苯丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸。如果蛋白質為折疊鏈(包括全長蛋白質、抗體、蛋白質結構域或融合蛋白),則蛋白質可包含由于疏水氨基酸位于蛋白質表面的空間排布而疏水的蛋白質的表面上的區域。例如在生物活性蛋白質或蛋白質結構域的C端,蛋白質可以設計成具有一段長度的包含疏水氨基酸的氨基酸的融合蛋白。或者,可以用疏水基或附著于蛋白質上的標簽修飾蛋白質。將理解的是,任何修飾(包括通過融合額外的氨基酸或者通過附著疏水標簽)的進行都應當不干擾蛋白質的生物學功能。
或者,為了使膠束與要被遞送到細胞中的蛋白質復合,該蛋白質可具有極性或帶電的區域,例如蛋白質的部分或者附著于蛋白質上的標簽部分。蛋白質上的極性或帶電基團使蛋白質與陽離子膠束通過氫鍵結合相互作用形成復合物。例如,如果蛋白質是短的寡肽,則該寡肽沿著其長度可包含一個或多個極性或帶電氨基酸,該氨基酸含有能夠充當氫鍵供體或受體基團的官能團,例如,酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酰胺或賴氨酸。如果蛋白質為折疊鏈(包括全長蛋白質、抗體、蛋白質結構域或融合蛋白),則蛋白質可包含由于極性或帶電氨基酸位于蛋白質表面的空間排布而成為極性或帶電的蛋白質的表面上的區域。例如在生物活性蛋白質或蛋白質結構域的C端,蛋白質可以設計成具有一段長度的包含極性或帶電氨基酸的氨基酸的融合蛋白。或者,可以用含有能夠充當氫鍵供體或受體基團的官能團的極性或帶電的基團或附著于蛋白質上的標簽修飾蛋白質。將理解的是,任何修飾(包括通過融合額外的氨基酸或者通過附著極性或帶電的標簽)的進行都應當不干擾蛋白質的生物學功能。
具體的可與膠束復合以遞送到細胞中的蛋白質可以包含或者為激素、受體配體、轉錄因子、轉錄增強子、轉錄抑制因子、酶、激酶、磷酸酯酶、核酸酶、蛋白酶、生長因子(例如神經膠質衍生的親神經因子)、細胞毒性蛋白質(例如凝集素A)或抗體(例如赫賽汀)。
如需要,膠束可以用于與蛋白質一起向細胞中遞送附加的治療劑。例如,如US 2005/0260276中所述,藥劑(例如藥物)可以在膠束形成的過程中被包含在膠束的內部。或者,如果藥劑具有足夠的負電荷、極性氫鍵供體或受體基團或者疏水域,則該藥劑可以以與蛋白質相同的方式與膠束的外部復合。核酸和蛋白質都可以與膠束的外部復合,這樣可以確保細胞內的特異定向和/或協同治療效果。
因此,將膠束與要被遞送到細胞中的蛋白質,以及任選附加的治療劑復合,包括小分子藥物或者核酸。通過將膠束加入到包含蛋白質和可選的附加治療劑的溶液中(如果要與膠束的外部復合)可以使膠束被復合。
使用常規實驗室方法,可以使蛋白質與膠束的質量比最優化從而確保復合物的適當形成并且提供具有所需大小和ζ電勢的復合物。在具體的實施方式中,膠束:蛋白質的質量比為約0.2以上,或約1以上,或約2.5以上,或約5以上,或約10以上,或約20以上,或約30以上,或約40以上,或約50以上能夠確保有效且穩定的復合物形成。可以使用ζ電勢(表面電荷量度)作為精確測量復合物形成的參數。例如,正ζ電勢(例如約5mV以上、約5mV~約20mV或者約20mV~約100mV)可用于表示蛋白質與膠束之間形成適當的復合物。
一旦與蛋白質復合的膠束被提供(包括任何可選的附加治療劑),則該復合物可被遞送到細胞中從而使蛋白質被吸收到細胞中。
向細胞中的遞送包括使膠束-蛋白質復合物與細胞的表面接觸。在沒有限定到任何具體理論的情況下,細胞可以胞吞膠束-蛋白質,導致膠束-蛋白質復合物被吸收到細胞中。一旦進入細胞內部,該復合物可以解離,將蛋白質釋放到細胞腔隙中,例如內涵體。在內涵體中,聚合物中至少一些叔氨基可質子化,造成內涵體膜的分解并且使復合物從內涵體中逸出,從而將蛋白質釋放到細胞溶質中。
蛋白質要被遞送到其中的細胞可為任何細胞,包括體外細胞、培養細胞或被試者內的體內細胞。除非另外指定,本文所用術語“細胞”指并且包括環境允許的單細胞、多細胞或細胞群體。細胞可為體外細胞(包括從被試者體內移植的細胞),或者細胞可為被試者體內的體內細胞。同樣地,除非另外指定,術語“細胞”也包括環境允許的單細胞。
細胞可以來自于任何生物體,例如昆蟲、微生物(包括細菌)或者動物(包括哺乳動物(包括人))。
如上所述,在遞送到細胞中時,蛋白質可以保持其生物學功能(如有)。使用已知的方法和技術(包括蛋白質檢測方法、免疫測定和熒光標記技術),技術人員可以容易地確定是否蛋白質已被遞送到細胞中。如果對細胞內特定的生物學功能存在直接或間接測定法,則技術人員也可以容易地確定蛋白質是否保持其生物學功能。例如,如果將要檢測激酶活性,則可以比較遞送蛋白質之前和之后的靶蛋白的磷酸化水平,其包括使用放射標記的磷酸鹽。
此外,本發明提供了如上所述的膠束-蛋白質復合物,包括包含附加的治療劑的膠束-蛋白質復合物。
另外,本發明提供了上述膠束-蛋白質復合物用于將蛋白質遞送到細胞中的用途,或者上述膠束-蛋白質復合物用于制造將蛋白質遞送到細胞中的藥劑的用途,其包括在細胞為被試者體內的體內細胞的情況下。
為了幫助向被試者施用這種膠束-蛋白質復合物,可以將該復合物配制成藥物組合物中的成分。
因此,本發明提供了包含如上所述的膠束-蛋白質復合物的藥物組合物。所述藥物組合物可以進一步包含可藥用的稀釋劑或載體。所述藥物組合物可以常規地包含可藥用濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑和各種相容的載體。對于遞送的全部形式,可以將所述膠束-蛋白質復合物配制在生理鹽溶液中。
通過所選的施用途徑、與生物活性蛋白質的相容性(如果合適)和標準制藥實踐確定可藥用的稀釋劑或載體的比例和特性。
通過用于制備適合向被試者施用的可藥用的組合物的已知方法可以制備所述藥物組合物,所以使有效量的膠束-蛋白質復合物和任何附加的活性物質(一種)或物質(多種)以混合物的形式與可藥用的載體組合。向被試者施用有效量的膠束-蛋白質復合物。本文所用術語“有效量”指在實現預期效果(例如將蛋白質遞送到被試者體內的靶細胞或細胞群體中)所需的劑量和時間段內有效的量。
例如,在雷明頓氏藥物科學(Remington’s Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Company,Easton,Pa.,USA 1985)中描述了適合的載體。在此基礎上,該組合物包括,但不限于,與一種或多種可藥用的載體或稀釋劑聯合且包含在具有適合的pH值且與生理液體等滲的緩沖溶液中的膠束-蛋白質復合物溶液。
在儲藏和使用的普通條件下,這些藥物組合物可包含防止微生物生長且會保持蛋白質的任何生物活性的防腐劑。本領域技術人員會知道如何制備適合的制劑。例如,在雷明頓氏藥物科學中和在美國藥典(1999年出版的國家處方集(USP 24 NF19))中描述了選擇和制備適合制劑的常規程序和成分。或者,在無需防腐劑的情況下,可以在充分接近于使用的時間時,通過混合膠束與蛋白質溶液配制復合物。
在向患者施用時,以為實現所需效果的有效的量和劑量以及足夠的時間段內施用膠束-蛋白質復合物。例如,可以以遞送可以起到緩解、改善、減輕、改進、穩定、防止蔓延、延遲或慢化進程或者治愈感染、疾病或病癥作用的蛋白質所需的數量和劑量施用所述膠束-蛋白質復合物,或者例如抑制、減少或損害與疾病有關的酶的活性。與疾病有關的酶是一種與代謝或生化途徑有關的酶,該酶在所述途徑被中斷時,或者在酶或途徑的調控被中斷或抑制時,酶的活性與疾病或病癥的發作和進程有關。
向被試者施用的膠束-蛋白質復合物的有效量可以根據例如膠束-蛋白質復合物的藥效性質、施用方式、被試者的年齡、身體狀況和體重、病癥和疾病狀態的性質和程度、治療的頻率、治療的并發性類型(如有)以及膠束-蛋白質復合物的濃度和形式的各種因素發生變化。
基于以上因素,本領域技術人員可以確定適合的量。根據被試者的臨床反應,最初可以以可按照需要調節的適合的量配合施用。膠束-蛋白質復合物的有效量可以根據經驗確定并且取決于可以安全地施用的膠束-蛋白質復合物的最大量。然而,施用的膠束-蛋白質復合物的量應為產生所需效果的最小量。
如本領域技術人員所理解的,根據所選的施用途徑,可以以各種形式向被試者施用所述藥物組合物。優選非經口途徑,特別是如果生物活性劑以相同的方式與膠束-蛋白質復合物同時施用。本發明的組合物可以采用手術或者通過注射向所需部位施用。在不同的實施方式中,可通過注射(非腸道注射、皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、直接注射到靶組織或者器官等)直接在所需部位施用該組合物。
通過下列非限定性的實施例進一步例示本方法和用途。
實施例
實施例1
在該實施例中,使用凝集素A作為示范性的要被遞送到細胞中的陰離子生物活性蛋白質。幾十年來,研究一直集中在來自槲寄生提取物的凝集素作為人類癌癥的治療活性物質。許多研究已經描述了在幾個體外體系中有效力的和細胞毒性的韓國槲寄生誘導細胞凋亡的能力。從韓國槲寄生(Viscumalbum var.Coloratum)的提取物中分離的細胞毒素凝集素是在腫瘤細胞中誘導細胞凋亡的糖蛋白[1]。報道顯示了韓國槲寄生凝集素-II(ML-II)是對Molt4細胞的細胞毒素[2,3],并且能夠通過半胱天冬蛋白酶級聯的激活致使U937細胞發生細胞凋亡而死亡[4]。
關于這種V.album的抗癌活性應歸于凝集素A,凝集素A屬于2型核糖體失活蛋白(RIP II),由兩個二硫化物連接的蛋白質亞單位組成[1,3]。具有rRNA N-糖苷酶活性的催化活性A-鏈通過引起28S rRNA中第4324位的腺嘌呤的脫嘌呤而使核糖體失活[5]。這導致蛋白質生物合成期間細胞翻譯的易位步驟的破壞,并由此,發生細胞死亡。
凝集素A的對應物,B-鏈,不是直接具有細胞毒素性質,而是用于通過與細胞表面上的具有適合的糖基的糖蛋白結合而介導細胞毒素A-鏈的輸送和定向。由于凝集素A僅僅能夠在其已被引入到細胞中后發揮其細胞毒性作用,所以凝集素B同樣對促進連續的通過胞吞的內化起到重要作用[3]。
通過重組方法從植物提取物或其產品中分離ML II具有如繁重的純化工作和擴大的問題的困難。因此,本實施例提供了用于細胞內遞送凝集素A的另一穩定和足以勝任的載體。
材料和方法
材料:重組凝集素A(Mw:30.7kDa)出品于新加坡南洋工科大學(Nanyang Technological University,Singapore)的Ho Sup Yoon’s實驗室。根據先前報道的規程合成P(MDS-共-CES)[13]。二甲基亞砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF)購自美國Sigma-Alrich。用于膠束制備的透析緩沖液使用來自美國默克(Merck,USA)的ACS等級的乙酸鈉和乙酸自行制備。除非另外規定,全部試劑和溶劑均為商品級,并且被公認使用。MDA-MB-231、HeLa、HepG2和4T1細胞系從美國ATCC獲得并且按照ATCC的建議培養。HepG2和HeLa生長在DMEM中,MDA-MB-231在Leibovitz L-15中以及4T1生長在RPMI1640中。全部培養基補充有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(HyClone,USA)。BioPorterTM購自美國Genlantis,并且按照制造商的指導使用。3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四氮唑(3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)(MTT)購自美國Sigma,其以濃度為5mg/ml在磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.4)中使用,并且用0.22μm過濾器過濾該溶液以除去藍甲結晶(blue formazan crystal)。
P(MDS-共-CES)膠束的制備與特性:通過三步合成制得P(MDS-共-CES)[13]。首先,通過N-甲基二乙醇胺和癸二酰氯(sebacoyl chloride)之間的縮聚制備主鏈,聚(N-甲基二乙烯胺癸二酸酯)(PMDS)。使用過量三乙胺除去氫氯化物并且限制叔胺的質子化作用。接著,在酰胺化反應中使膽甾醇氯甲酸酯與2-溴乙胺氫溴酸鹽反應。然后,通過季銨化反應將生成的疏水N-(2-溴乙基)氨基甲酰基膽甾醇(N-(2-bromoethyl)carbarmoyl cholesterol)接枝到親水聚(N-甲基二乙烯胺癸二酸酯)主鏈上以得到最終產物。主鏈為聚酯,而側鏈包含潛在可水解的不穩定氨酯基,致使該共聚物可降解。膽甾醇的接枝程度為約28.5%。如凝膠滲透色譜法所測量的,P(MDS-共-CES)的重均分子量(Mw)為~5.0kDa,多分散指數為1.7。為了制備陽離子膠束,將15.0mg的P(MDS-共-CES)溶于5.0ml的DMF中,將其置于分子量分離點為2000Da的透析膜中(Spectrum Laboratories,USA)。然后,在室溫下將該透析袋浸漬于pH 4.6的500ml的20mM乙酸鈉/乙酸緩沖液中24小時。在24小時進程期間,頭8小時每小時一次用新鮮的緩沖液替換透析緩沖液。在透析過程的結尾,生成的膠束溶液然后在無菌環境中通過0.22μm過濾器過濾以除去大的附聚物。使用具有動態光散射能力(散射角:90°)且裝備有658nm的He-Ne激光束的zetasizer粒度分析儀(zetasizer(Malvern Instruments Zetasizer Nano ZS,UK))定性得出膠束的大小和ζ電勢。每個測量重復三次并且得出平均值。
膠束/凝集素A復合物的形成:在實驗過程中將用于該項研究的重組凝集素A保持在冰浴中以防止溫度變化引起其結構穩定性的破壞。首先向pH6.0乙酸鈉/乙酸緩沖液中加入凝集素A。然后通過將新鮮制備的膠束溶液以變化的質量比加入到蛋白質溶液中形成膠束/凝集素A復合物,并且輕輕混合。將該復合物溶液在室溫下靜置30分鐘,之后將其定性并引入到癌細胞中。
細胞毒性研究:將HepG2、HeLa、MDA-MB-231和4T1癌細胞以每孔1×104個細胞的密度接種到96孔板上,并且在100μl的培養基中培養。然后,將培養板返回培養箱中孵育24小時以在施用膠束/凝集素A復合物之前使匯合度達到70%-80%。當達到所需的細胞匯合度時,從每個孔中除去消耗的培養基并更換為100μl的預先制備的復合物溶液。在用復合物孵育4小時之后,用新鮮的培養基替換培養基。然后將培養板返回培養箱中并且在5%CO2中在37℃保持2天。每種條件重復測試八次。在2天孵育結束時,用100μl的新鮮培養基加20μl的MTT溶液替換培養基。然后將培養板返回培養箱中并且在5%CO2中在37℃另外保持3天。然后除去每個孔中的培養基和過量MTT。然后將200μl的DMSO加入到每個孔中以溶解納入的紫甲結晶。從每個孔中取出100μl等分部分并轉移到新的96孔板中。然后,使用微孔板酶標儀(PowerWave X,Bio-tek Instruments,USA)在550nm以及690nm參考波長處測定培養板。甲結晶的吸光度讀數為在550nm的吸光度讀數減去在690nm的吸光度讀數。結果表示為空白的吸光度的百分比。
結果和討論
膠束與膠束/凝集素A復合物的特性:如圖1所示,空白P(MDS-共-CES)膠束的平均粒度為140nm且ζ電勢為約28mV。在膠束與凝集素A的質量比在5以下的較低情況下,聚合物的量不足以充分濃縮并結合凝集素A,并且粒度對于胞內吸收可能太大(>160nm)。在質量比在5以上的情況下,復合物的大小較相似地保持在大約150nm而ζ電勢在25~30mV之間,這表明在這些質量比下,凝集素A被充分濃縮并與膠束復合。復合物的小的粒度和正ζ電勢致使它們適合胞內細胞吸收。
凝集素A、膠束和膠束/凝集素A復合物的細胞毒性:評價凝集素A、膠束和膠束/凝集素A復合物對MDA-MB-231、HeLa、HepG2和4T1細胞的細胞毒性作用。空白膠束具有非選擇性細胞毒性,其隨著劑量的增加而增大。因此,首先要使聚合物濃度最優化以將其細胞毒性作用減至最小,而同時,提供足夠的要有效遞送的凝集素A的量。圖2顯示了聚合物濃度對處于固定濃度的凝集素A的凝集素A的細胞毒性的作用。觀察到,空白P(MDS-共-CES)膠束在低濃度下對全部四種細胞系都不具有顯著的細胞毒性。在高濃度下,尤其對MDA-MB-231、HepG2和HeLa細胞其的確產生了細胞毒性。此外,單純的凝集素A對細胞沒有發揮顯著的細胞毒性,這說明在沒有輸送載體的情況下,凝集素A不能進入細胞并發揮其細胞毒素性質。明顯相反,在使用P(MDS-共-CES)膠束遞送凝集素A時,癌細胞被成功地消除。在用適量的用于遞送凝集素A的聚合物處理后,剩下的活細胞的百分比對于全部四種細胞系顯著下降。
從圖2還可以觀察到,對于全部測試的細胞系,凝集素A的細胞毒性作用在低聚合物濃度的情況下是不顯著的,可能是因為凝集素A沒有充分濃縮且膠束/凝集素A復合物的大小對于有效的細胞吸收太大。另一方面,空白P(MDS-共-CES)膠束尤其在高濃度下具有非選擇性細胞毒性。因此,必需確定最佳的聚合物濃度。對于MDA-MB-231,最佳的P(MDS-共-CES)濃度確定為20ppm。對此的原因是由于在固定凝集素A濃度為1ppm的情況下,聚合物濃度增加超過20ppm,細胞生活力相對恒定地保持在22-34%。然而,在聚合物濃度從20~1ppm減少時,細胞生活力不斷地增大。更重要的是,在20ppm時,聚合物沒有顯示出明顯的細胞毒性。通過將相同的原理應用于其它三種細胞系,分析HeLa、HepG2和4T1的最適宜聚合物濃度分別為50、40和100ppm。
在確定并固定最適宜聚合物濃度的情況下,而后進行研究來確定凝集素A的IC50值。圖3顯示了在變化的凝集素A濃度下的細胞生活力,由此MDA-MB-231、HeLa、HepG2和4T1細胞的凝集素A的IC50值分別確定為0.2、0.5、10和50ppm。各種細胞系間的IC50的不同揭示了它們對膠束/凝集素A復合物的細胞毒性不同程度的敏感性。MDA-MB-231細胞顯示了最小的對復合物的細胞毒性作用的耐受性,其后為HeLa、HepG2和4T1細胞。
圖4顯示了在沒有使用膠束的情況下,凝集素A沒有顯示出明顯的細胞毒性,特別是針對MDA-MB-231、HepG2和4T1細胞,甚至在80~100ppm下,這進一步證實了凝集素A本身不能進入細胞。然而,陽離子膠束有效地介導凝集素A的細胞吸收。比較使用膠束的凝集素A的細胞毒性與通過BioPorter誘導的凝集素A的細胞毒性。如圖4所示,在全部四種測試的細胞系中,BioPorter介導的凝集素A的細胞毒性作用在含血清的細胞培養基中比在不含血清培養基中的低,這是由于在血清的存在下其不穩定。然而,通過膠束/凝集素A復合物誘導的凝集素A的細胞毒性即使在含血清培養基中仍然明顯高于BioPorter/凝集素A復合物在不含血清培養基中產生的。這可能是因為細胞吸收越多,膠束/凝集素A復合物的穩定性和內體緩沖能力越強。
如向癌細胞遞送生物活性凝集素A所示,這些實驗證實了生物可降解的陽離子P(MDS-共-CES)膠束可以成功地用于蛋白質的細胞內遞送。膠束/凝集素A復合物對于介導細胞吸收足夠的小并且具有適合的正電荷分布。該膠束同時具有良好的內體緩沖能力從而誘導凝集素A在被細胞吸收后的細胞內釋放。即使在含血清培養基中通過P(MDS-共-CES)膠束遞送的凝集素A的細胞毒性也明顯高于通過BioPorterTM誘導的。因此,這些膠束看用作蛋白質(包括生物活性蛋白和蛋白質)的細胞內遞送的載體。
在本說明書中提及的所有出版物和專利申請都在本申請中引用作為參考,就如同每一篇出版物或專利申請被具體單獨指出以被引用作為參考那樣。任何出版物的引用為在申請日前公開的內容并且不應將其解釋為由于在前發明的這些公開而承認本發明不被賦予更早的日期。
如在本說明書和所附權利要求書中所用的單數形式的“一”、“一種”和“該”包括復數含義,除非文意另有明確表示。在本申請說明書和所附權利要求書中,所用術語“包括”、“包含”、“含有”和這些術語的其它形式意指非限定的包含含義,即是說,在沒有排除其它任何元素或成分的情況下,包括具體所述元素或成分。除非另外定義,本文所用全部技術和科學術語具有與本發明所屬技術領域的普通技術人員通常理解的相同含義。
雖然通過用于清楚理解的說明和實施例已經在一定程度上詳細描述了前述發明,對本領域普通技術人員來說,顯而易見的是,鑒于本發明的教導,在沒有脫離所附權利要求的實質或范圍的情況下,可以另外進行一些變化和修改。
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