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烏骨雞黑色素提取物在制備防治抑郁癥的藥物中的用途.pdf

摘要
申請專利號:

CN201010535778.4

申請日:

2010.11.03

公開號:

CN102462696B

公開日:

2014.10.29

當前法律狀態:

終止

有效性:

無權

法律詳情: 未繳年費專利權終止IPC(主分類):A61K 35/12申請日:20101103授權公告日:20141029終止日期:20151103|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 35/12申請日:20101103|||公開
IPC分類號: A61K35/12; A61P25/24 主分類號: A61K35/12
申請人: 賀毅; 李博
發明人: 賀毅; 李博
地址: 100054 北京市豐臺區佑安門外大街西頭條10號
優先權:
專利代理機構: 北京金思港知識產權代理有限公司 11349 代理人: 邵毓琴
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201010535778.4

授權公告號:

|||102462696B||||||

法律狀態公告日:

2016.12.21|||2014.10.29|||2013.04.17|||2012.05.23

法律狀態類型:

專利權的終止|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了烏骨雞黑色素提取物在制備防治抑郁癥的藥物中的用途,其中,所述烏骨雞黑色素提取物作為所述藥物的活性成分。本發明中烏骨雞黑色素提取物可通過雙酶水解法并結合堿液除蛋白來制備。根據本發明可知,烏骨雞黑色素提取物具有良好的抗抑郁作用,可用于制備防治抑郁癥的藥物。

權利要求書

1: 烏骨雞黑色素提取物在制備防治抑郁癥的藥物中的用途, 其中, 所述烏骨雞黑色素 提取物作為所述藥物的活性成分。
2: 根據權利要求 1 所述的用途, 其中, 所述藥物還包含藥學上可接受的載體。
3: 根據權利要求 1 所述的用途, 其中, 所述藥物的劑型包括膠囊劑、 片劑、 顆粒劑、 膏 劑、 散劑、 口服液以及注射劑。
4: 根據權利要求 1 所述的用途, 其中, 所述烏骨雞黑色素提取物的提取方法包括如下 步驟 : 1). 制備烏骨雞肉泥 ; 2). 雙酶水解 : 采用木瓜蛋白酶和風味酶消化步驟 1) 制得的烏骨雞肉泥 ; 3). 采用堿液除蛋白。
5: 根據權利要求 4 所述的用途, 其中, 步驟 2) 包括如下步驟 : A. 向步驟 1) 制得的烏骨雞肉泥中添加重量比為 1 ∶ 1 至 1 ∶ 3 的蒸餾水, 加熱至 90℃ 至 100℃并保溫 10 分鐘至 20 分鐘, 然后冷卻至 60℃至 70℃, 調節 pH 為 5.0 至
6: 0, 然后向 其中加入終濃度為 3.0%至 4.0%的木瓜蛋白酶, 在 60℃至 70℃條件下消化 2 小時至 4 小 時; B. 將步驟 A 所得的混合物冷卻至 50℃至 60℃, 調節 pH 為 5.5 至 6.5, 向所述混合物中 加入終濃度為 0.4%至 0.7%的風味酶, 在 50℃至 60℃條件下消化 5 小時至 7 小時 ; C. 將步驟 B 所得的混合物加熱至 90℃至 100℃并保溫 20 分鐘至 40 分鐘 ; 靜置分層, 收集上層黑色素懸浮層 ; 在 3500×g 至 4500×g 條件下離心 10 分鐘至 20 分鐘。 6. 根據權利要求 4 所述的用途, 其中, 步驟 3) 的操作方法如下 : 以 1 ∶ 8 至 1 ∶ 15( 按體積計 ) 的比例向所述步驟 2) 所得的物質中添加 pH 為 8 至 10 的 NaOH 溶液, 加熱至 55℃至 75℃并保溫 1 小時至 2 小時, 然后, 在 3500×g 至 4500×g 條 件下離心 5 分鐘至 10 分鐘, 收集沉淀。
7: 根據權利要求 4 所述的用途, 其中, 步驟 2) 包括如下步驟 : A. 向步驟 1) 制得的烏骨雞肉泥中添加重量比為 1 ∶ 1 的蒸餾水, 加熱至 100℃并保溫 15 分鐘, 然后冷卻至 65℃, 調節 pH 至 5.5, 然后向其中加入終濃度為 3.8%的木瓜蛋白酶, 在 65℃下消化 2 小時 ; B. 將步驟 A 所得的混合物冷卻至 55℃, 調節 pH 至 6.0, 加入終濃度為 0.6%的風味酶, 在 55℃下消化 6 小時 ; C. 將步驟 B 所得的混合物加熱至 100℃并保溫 30 分鐘 ; 靜置分層, 收集上層黑色素懸 浮層 ; 在 4000×g 條件下離心 15 分鐘。
8: 根據權利要求 4 所述的用途, 其中, 步驟 3) 的操作方法如下 : 以 1 ∶ 10( 按體積計 ) 的比例向所述步驟 2) 所得的物質中添加 pH 為 10 的 NaOH 溶液, 加熱至 60℃并保溫 1.5 小時, 然后, 在 4000×g 條件下離心 5 分鐘, 收集沉淀。
9: 根據權利要求 1 至 8 任一項所述的用途, 其中, 將所述烏骨雞黑色素提取物懸浮于生 理鹽水中使用。

說明書


烏骨雞黑色素提取物在制備防治抑郁癥的藥物中的用途

    技術領域 本發明涉及烏骨雞黑色素提取物的醫藥用途, 特別涉及烏骨雞黑色素提取物在制 備防治抑郁癥的藥物中的新用途。
     背景技術 抑郁癥是一種情感障礙性精神疾病, 主要表現為情緒低落、 思維遲緩以及運動抑 制, 常伴有睡眠障礙、 消化功能減弱、 軀體不適、 自責自罪, 嚴重的甚至出現自殘、 自殺觀念 及行為。
     隨著社會經濟發展、 生活節奏加快以及生活壓力增加, 抑郁癥已成為現代社會危 害全人類身心健康的常見病, 其發病率逐年攀升。據世界衛生組織 (WTO) 最新統計分析, 抑 郁癥是危害人類健康最嚴重的十大疾病之一, 預計到 2020 年, 可能成為僅次于心血管病的 第二大疾病。抑郁癥的高發病率、 致死率、 致殘率和疾病負擔已引起社會的廣泛重視。
     目前對抑郁癥的確切發病機制尚不清楚, 因此其臨床治療效果尚不令人滿意, 用 于防治抑郁癥的化學合成藥物目前主要有三環類抗抑郁劑、 單胺氧化酶抑制劑和 5- 羥色 胺重吸收抑制劑等, 雖然它們具有一定療效, 但存在藥物依賴、 毒副作用大、 易復發等缺陷, 從而限制其廣泛使用。
     因此, 尋求高效、 低毒副作用的防治抑郁癥的天然來源藥物成為該領域新的研究方向。
     烏骨雞黑色素是從烏骨雞提取的一種以吲哚環為主體的含硫異聚物, 屬于動物源 性真黑色素。現代醫學研究表明, 烏骨雞黑色素具有抗紫外線、 螯合重金屬離子、 抗腫瘤以 及提高機體免疫力等功能。迄今為止, 烏骨雞黑色素或其提取物在制備防治抑郁癥的藥物 方面的用途尚無報道。
     發明內容
     本發明提供了烏骨雞黑色素提取物在制備防治抑郁癥的藥物中的用途, 其中, 所 述烏骨雞黑色素提取物作為所述藥物的活性成分。
     根據本發明所述的烏骨雞黑色素提取物的用途, 其中, 所述藥物還包含藥學上可 接受的載體。
     根據本發明所述的烏骨雞黑色素提取物的用途, 其中, 所述藥物的劑型包括膠囊 劑、 片劑、 顆粒劑、 膏劑、 散劑、 口服液以及注射劑。
     本發明中烏骨雞黑色素提取物可采用如下的提取方法獲得, 該方法包括如下步驟 :
     1). 制備烏骨雞肉泥 ;
     2). 雙酶水解 : 采用木瓜蛋白酶和風味酶消化步驟 1) 制得的烏骨雞肉泥 ;
     3). 采用堿液除蛋白。
     作為本發明的優選實施方式, 上述提取方法中, 步驟 2) 包括如下步驟 :
     A. 向步驟 1) 制得的烏骨雞肉泥中添加重量比為 1 ∶ 1 至 1 ∶ 3 的蒸餾水, 加熱至 90℃至 100℃并保溫 10 分鐘至 20 分鐘, 然后冷卻至 60℃至 70℃, 調節 pH 為 5.0 至 6.0, 然后向其中加入終濃度為 3.0%至 4.0%的木瓜蛋白酶, 在 60℃至 70℃條件下消化 2 小時至 4 小時 ;
     B. 將步驟 A 所得的混合物冷卻至 50℃至 60℃, 調節 pH 為 5.5 至 6.5, 向所述混合 物中加入終濃度為 0.4%至 0.7%的風味酶, 在 50℃至 60℃條件下消化 5 小時至 7 小時 ;
     C. 將步驟 B 所得的混合物加熱至 90℃至 100℃并保溫 20 分鐘至 40 分鐘 ; 靜置分 層, 收集上層黑色素懸浮層 ; 在 3500×g 至 4500×g 條件下離心 10 分鐘至 20 分鐘。
     作為本發明的優選實施方式, 上述提取方法中, 步驟 3) 的操作方法如下 :
     以 1 ∶ 8 至 1 ∶ 15( 按體積計 ) 的比例向所述步驟 2) 所得的物質中添加 pH 為 8 至 10 的 NaOH 溶液, 加熱至 55℃至 75℃并保溫 1 小時至 2 小時, 然后, 在 3500×g 至 4500×g 條件下離心 5 分鐘至 10 分鐘, 收集沉淀。
     作為本發明的更加優選的實施方式, 上述提取方法中, 步驟 2) 包括如下步驟 :
     A. 向步驟 1) 制得的烏骨雞肉泥中添加重量比為 1 ∶ 1 的蒸餾水, 加熱至 100℃并 保溫 15 分鐘, 然后冷卻至 65℃, 調節 pH 至 5.5, 然后向其中加入終濃度為 3.8%的木瓜蛋白 酶, 在 65℃下消化 2 小時 ;
     B. 將步驟 A 所得的混合物冷卻至 55℃, 調節 pH 至 6.0, 加入終濃度為 0.6%的風 味酶, 在 55℃下消化 6 小時 ;
     C. 將步驟 B 所得的混合物加熱至 100℃并保溫 30 分鐘 ; 靜置分層, 收集上層黑色 素懸浮層 ; 在 4000×g 條件下離心 15 分鐘。
     作為本發明的更加優選的實施方式, 上述提取方法中, 步驟 3) 的操作方法如下 :
     以 1 ∶ 10( 按體積計 ) 的比例向所述步驟 2) 所得的物質中添加 pH 為 10 的 NaOH 溶液, 加熱至 60℃并保溫 1.5 小時, 然后, 在 4000×g 條件下離心 5 分鐘, 收集沉淀。 根據本發明所述的烏骨雞黑色素提取物的用途, 其中, 可將所述烏骨雞黑色素提 取物懸浮于生理鹽水中使用。
     本發明經過動物實驗證實了烏骨雞黑色素提取物具有防治抑郁癥的作用, 可用于 制備防治抑郁癥的藥物。
     附圖說明
     圖 1a 是根據本發明實施例 1 小鼠懸尾實驗不動時間基礎測試值的統計分析圖。 圖 1b 是根據本發明實施例 1 小鼠懸尾實驗不動時間正式測試值的統計分析圖。 圖 2 是根據本發明實施例 2 小鼠強迫游泳實驗不動時間測試值的統計分析圖。具體實施方式
     下面將結合附圖和實施例來進一步詳細描述本發明。
     在本發明的實施例中, 分別利用小鼠懸尾實驗和小鼠強迫游泳實驗來評價烏骨雞 黑色素提取物對實驗性動物抑郁癥模型的保護作用。
     實施例中的試驗數據均采用 GraphPad Prism 5.0 軟件進行統計分析并繪制分析 圖, 組間數據差異用單因素方差分析 (ANOVA) 進行統計分析, 并繼之以 Tukey 氏事后檢驗法 進行檢驗。
     1、 實驗材料 : 烏骨雞黑色素提取物烏骨雞黑色素的提取可以采用本領域已知的方法, 本發明采用了雙酶水解法并結 合堿液除蛋白來提取烏骨雞黑色素, 其中, 分別使用木瓜蛋白酶和風味酶 ( 也可使用復合 蛋白酶 ) 進行第一步和第二步的酶解。具體操作步驟如下 :
     1). 制備烏骨雞肉泥
     將市售的烏骨雞屠宰, 去毛, 去內臟, 去骨, 保留骨膜, 絞成肉泥, 取肉泥 1000g ;
     2). 雙酶水解
     A. 向步驟 1) 制得的烏骨雞肉泥中添加蒸餾水, 蒸餾水與雞肉泥的重量比為 1 ∶ 1, 攪拌均勻, 加熱至 100℃并保溫 15 分鐘, 然后冷卻至 65℃, 調節 pH 至 5.5, 加入終濃 度為 3.8%的木瓜蛋白酶 ( 購自廣西南寧龐博生物工程有限公司 ), 攪拌均勻, 在 65℃下消 化 2 小時 ;
     B. 將步驟 A 所得的混合物冷卻至 55℃, 調節 pH 至 6.0, 然后, 向所述混合物中加入 終濃度為 0.6%的風味酶 ( 購自廣西南寧龐博生物工程有限公司 ), 在 55℃下消化 6 小時 ;
     C. 通過將步驟 B 所得的混合物加熱至 100℃并保溫 30 分鐘, 對酶進行滅活 ; 靜置 分層, 收集上層黑色素懸浮層 ; 在 4000×g 條件下離心 15 分鐘, 收集沉淀, 得到烏骨雞黑色 素粗提品 ; 3). 采用堿液除蛋白。
     以 1 ∶ 10( 按體積計 ) 的比例向步驟 3) 所得的粗提品中添加 pH 為 10 的 NaOH 溶 液, 攪拌均勻, 加熱至 60℃并保溫 1.5 小時, 然后, 在 4000×g 條件下離心 5 分鐘, 收集沉淀 ; 重復該過程, 共 4 次。
     使用蒸餾水洗滌上述方法所得的沉淀 3 次, 真空干燥洗滌后的沉淀物, 得到烏骨 雞黑色素精提品。
     由上述步驟 1) 的 1000g 烏骨雞肉泥獲得了 1g 烏骨雞黑色素精提品。
     取上述烏骨雞黑色素提取方法制備的烏骨雞黑色素精提品, 以 0.2g/ml 的濃度將 其懸浮于生理鹽水中備用。
     2、 實驗動物 :
     8 周齡 C57/B6 小鼠 ( 購于北京維通利華實驗動物技術有限公司 ), 雌雄各半。使 小鼠自由飲食飲水, 12 小時黑暗白晝節律, 實驗前適應環境 3 天。
     實施例 1 : 烏骨雞黑色素提取物對小鼠懸尾實驗抑郁癥模型的保護作用
     1、 實驗動物分組和篩選
     在給藥前, 測試小鼠懸尾實驗基礎測試值, 如下進行懸尾實驗 : 用粘性膠帶粘住小 鼠尾部末端約 2 厘米的部位, 將小鼠倒懸, 固定于水平橫桿上, 頭部距桌面約 10 厘米。在小 鼠兩側用隔板隔開動物視線, 防止相互影響。 使小鼠前后左右均無攀抓的地方, 一段時間后 小鼠因失望而活動減少。記錄 6 分鐘內后 4 分鐘的不動時間。淘汰基礎值超出 65 到 130 秒范圍的小鼠, 選出 20 只小鼠作為合格動物供實驗用, 隨機分為兩組, 每組 10 只 ( 其基礎 測試值具體數據參見下表 1)。 其中, 一組為空白對照組, 每天 1 次給予 200ul 生理鹽水腹腔 注射 ; 一組為烏雞黑色素提取物組, 每天 1 次給予 30mg/Kg 烏雞黑色素提取物腹腔注射, 兩 組均連續注射 7 天。
     表1: 小鼠懸尾實驗不動時間基礎測試值 ( 單位 : 秒)
     5CN 102462696 A 小鼠編號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
     說空白對照組 120 95 123 89 79 91 87 84 112 67明書烏骨雞黑色素提取物組 96 104 70 95 83 98 87 92 98 1174/6 頁對表 1 的數據采用 GraphPad Prism 5.0 軟件進行統計分析和 Tukey 氏事后檢驗 ( 參見圖 1a)。
     如圖 1a 所示, 在小鼠懸尾實驗基礎值測試中, 在給藥前的空白對照組和烏骨雞黑 色素提取物給藥組之間, 后 4 分鐘的不動時間測試值在統計學上并無差別, 說明分組合理。
     2、 小鼠懸尾實驗正式試驗
     末次給藥后 1 小時, 如上述操作方法進行小鼠懸尾實驗, 記錄 6 分鐘內后 4 分鐘內 累計的不動時間。( 具體數據參見下表 2)。
     表2: 小鼠懸尾實驗正式試驗不動時間正式測試值 ( 單位 : 秒)
     小鼠編號 1 2 3 4 5 6 空白對照組 126 89 144 87 90 103 烏骨雞黑色素提取物組 89 102 37 82 49 766CN 102462696 A 7 8 9 10
     76 85 106 53說明書92 62 54 645/6 頁對表 2 的數據采用 GraphPad Prism 5.0 軟件進行統計分析和 Tukey 氏事后檢驗 ( 參見圖 1b, “*” 表示與空白對照組之間的對比, P < 0.05)。
     如圖 1b 所示, 在小鼠懸尾實驗正式試驗中, 烏骨雞黑色素提取物組與空白對照組 相比后 4 分鐘的不動時間測試值明顯減小, 在統計學上具有顯著性差異, 與圖 1a 的烏骨雞 黑色素提取物組用藥前的基礎測試值相比后 4 分鐘的不動時間顯著降低, 說明烏骨雞黑色 素提取物對小鼠懸尾實驗抑郁癥模型具有保護作用。
     實施例 2 : 烏骨雞黑色素提取物對小鼠強迫游泳實驗抑郁癥模型的保護作用
     在懸尾實驗后次日上午進行強迫游泳實驗。將小鼠放入水深 10cm 的 2000ml 燒杯 ( 高 20cm, 直徑 14cm) 中, 水溫保持在 25℃。一開始將小鼠置于水中時, 小鼠拼命游泳并試 圖爬上燒杯, 一段時間后, 小鼠因失望而活動減弱。 如果小鼠保持漂浮狀態只用鼻子呼吸表 示抑郁, 如果小鼠游泳說明不抑郁。觀察 6 分鐘, 記錄后 4 分鐘內累計的不動時間 ( 在水面 漂浮狀態的時間 )。試驗完后用毛巾將小鼠擦干, 放回鼠籠。
     表3: 小鼠強迫游泳實驗不動時間測試值 ( 單位 : 秒)
     小鼠編號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 空白對照組 113 108 91 102 99 132 125 97 106 82 7 烏骨雞黑色素提取物組 75 84 76 82 76 110 90 65 88 對表 3 的數據采用 GraphPad Prism 5.0 軟件進行統計分析和 Tukey 氏事后檢驗 ( 參見圖 2, 其中, “**” 表示與空白對照組之間的對比, P < 0.01)。
     如圖 2 所示, 在小鼠強迫游泳實驗中, 烏骨雞黑色素提取物組與空白對照組相比 后 4 分鐘的不動時間測試值明顯減小, 在統計學上具有顯著性差異, 說明烏骨雞黑色素提 取物對小鼠強迫游泳實驗抑郁癥模型具有保護作用。
     通過以上小鼠懸尾實驗和小鼠強迫游泳實驗可知, 烏骨雞黑色素提取物具有明顯 的抗抑郁效果, 可用于制備防治抑郁癥的藥物。
     盡管在上述實施方式中通過將烏骨雞黑色素提取物懸浮于生理鹽水中使用, 但 是, 以烏骨雞黑色素提取物作為活性成分用于制備防治抑郁癥的藥物還可添加藥學上可接 受的載體, 所述載體包括藥學領域的常規稀釋劑、 賦形劑、 填充劑、 粘合劑、 濕潤劑、 崩解劑、 吸收促進劑、 表面活性劑、 矯味劑、 防腐劑等。所述藥物可以制備成臨床上可接受的各種劑 型, 例如膠囊劑、 片劑、 顆粒劑、 膏劑、 散劑、 口服液以及注射劑等, 前述各種劑型均可以按照 藥學領域的常規方法來制備。
     以上所公開的僅為本發明的具體實施方式, 僅用于對本發明進行舉例說明, 不能 以此限定本發明之保護范圍, 本領域技術人員在不脫離本發明實質的前提下可以進行各種 修改、 變化或替換, 但是, 依照本發明所作的各種等同變化, 仍屬于本發明所涵蓋的范圍。
    

關 鍵 詞:
烏骨雞 黑色素 提取物 制備 防治 抑郁癥 藥物 中的 用途
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