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塞爾托利細胞微膠囊化方法、所獲得的微膠囊及其用于預防和治療1型糖尿病的用途.pdf

摘要
申請專利號:

CN200980151428.3

申請日:

2009.12.18

公開號:

CN102256601B

公開日:

2014.10.29

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 9/50申請日:20091218|||公開
IPC分類號: A61K9/50 主分類號: A61K9/50
申請人: 生長激素護理公司d/b/a奧特尤賽爾公司
發明人: 里卡爾多·卡拉菲奧雷; 喬瓦尼·盧卡; 馬里奧·卡爾維蒂; 恩尼奧·比切蒂; 保羅·普塞蒂; 弗朗西斯卡·法拉里諾; 克勞迪奧·納斯特魯齊
地址: 美國紐約
優先權: 2008.12.19 IT RM2008A000686
專利代理機構: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240 代理人: 李丙林;張英
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200980151428.3

授權公告號:

102256601B||||||

法律狀態公告日:

2014.10.29|||2012.02.08|||2011.11.23

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及經微膠囊化制成水凝膠類微膠囊的塞爾托利細胞(SC),用于預防和/或治療1型糖尿病(T1?DM),以及涉及用于制造形狀優選為微球體的微膠囊的方法。

權利要求書

1.一種用于制造含有塞爾托利細胞(SC)的水凝膠類微膠囊的方法,
包含下列步驟:
a.制造在濃度為1至5%w/v的超純海藻酸鈉的鹽水溶液中的
SC均勻懸浮液,其純度對于細胞組分而言大于90%;
b.以10至60ml/min的速率抽吸所述懸浮液,并將其引入到針
狀元件中;
c.通過注入3至7升/min的流體流來擠出所述針狀元件內的所
述懸浮液,從而獲得均勻尺寸的連續微滴流;
d.將所述流的所述微滴引入到含有二價陽離子或聚陽離子物
質的水溶液中,從而發生凝膠化并獲得所述微膠囊。
2.根據權利要求1所述的方法,其中,所述針狀元件在其側壁上具有
鈕孔開口,并且所述流體流通過所述開口加入。
3.根據前述權利要求中至少一項所述的方法,其中,所述微膠囊由海
藻酸鈉制成,其濃度為1-3%w/v,其中內毒素含量不超過20EU/g
且蛋白質含量低于0.4%。
4.根據前述權利要求中至少一項所述的方法,其中,所述流體流通過
發生器獲得,并在用于所述步驟c)中之前經受下列步驟處理:
a.降低壓力,從而在瞬態流/非瞬態流之間獲得小于0.3巴的
壓力降;
b.調節,以便在瞬態流/非瞬態流之間獲得較高的重現性,以
及在路徑數和所產生的流體流之間獲得線性關系;
c.在0和10NL/min之間調節和調整所述流出流。
5.根據前述權利要求中至少一項所述的方法,其中,對從步驟d)中
獲得的所述微膠囊進行洗滌和/或隨后用天然和/或人工聚合物進一
步涂覆。
6.根據前述權利要求中至少一項所述的方法可獲得的包含SC的微膠
囊。
7.根據權利要求6所述的微膠囊,其含有至少20×106個SC。
8.作為用于預防和治療T1?DM的單獨的治療劑的SC。
9.包含根據權利要求6或7所述的微膠囊以及生理上可耐受的載體的
組合物,所述組合物用于預防和治療T1?DM。
10.用于從多糖懸浮液開始制造微膠囊的設備,包含:
a.用于所述懸浮液的容器
b.用于通過針狀元件遞送所述懸浮液流體的裝置;
c.用于中斷能夠與所述針狀元件配合的所述流的裝置,以制造
微膠囊,
其特征在于,所述用于中斷所述流的所述裝置包含用于在受控
壓力下在所述針狀元件中注入流體流的系統。
11.根據權利要求10所述的設備,其中,用于注入流體流的所述系統包
括在所述針狀元件側壁上獲得的紐扣開口,所述紐扣開口用于在受
控壓力下注入所述流體。
12.根據權利要求10或11的至少一項所述的設備,其中,所述用于遞
送的裝置包含捕捉管、蠕動泵和針狀元件。
13.根據權利要求10至12中的至少一項所述的裝置,其中,用于注入
的所述系統包含連接元件、流體發生器,優選空氣發生器,以及用
于調節壓力的裝置。

說明書

塞爾托利細胞微膠囊化方法、所獲得的微膠囊及其用于預防和治療1型糖尿病的用途

技術領域

本發明涉及經微膠囊化制成水凝膠類微膠囊的塞爾托利細胞(sertoli?
cell)(SC)在預防和/或治療1型糖尿病(T1DM)方面的用途,以及涉
及一種用于制造形狀優選為微球體的微膠囊的方法。本發明的產品目標在
于能夠誘導被糖尿病病理破壞的β-細胞的新生并且“切斷”導致T1?DM的
這種破壞的同一自身免疫過程。

微膠囊化SC的治療允許預防和治療T1?DM,而無需借助任何黑索金
(hexogen)胰島(人或動物)移植。應當注意,由SC微膠囊化獲得的產
品足以與“傳統”藥物相比。

背景技術

目前全世界1型糖尿病(T1?DM)發病率為一年約30,000新病例。
主要但并非僅影響青年和青少年的1型DM發病機理主要是自身免疫機制
破壞了產生胰島素的大多數胰腺β-細胞。簡言之,有機體失去了對負責胰
島素制造的胰腺β-細胞的免疫耐受性,并誘導主要由細胞介導的、與自身
抗體的產生關聯、導致β-細胞自毀的免疫應答。

基于施用黑索金胰島素的現行T1?DM療法傾向于將糖類穩態恢復為
盡可能接近于在生理狀態下所觀察到的狀態。然而,胰島素療法不能重現
(reproduce)正常β-細胞對促分泌刺激的應答所特有的胰島素分泌的脈動
節奏(脈動節律,pulsating?rhythm)。

所以,生理和穩定的內分泌-胰腺功能的恢復代表從根本上解決病理
問題的最終目標。為此,提出了新策略,如移植所有胰腺或移植從人供體
胰腺中分離的胰島。

當前使用的黑索金胰島素療法無論如何都無法代表治療T1?DM的最
終療法。為了解決這個問題,早已提出這樣的途徑,其設想了移植全部胰
腺器官或從人或動物供體的胰腺中分離出的胰島。

胰島移植與全部胰腺移植相比侵襲性較小但具有類似問題,特別是:

1、來自死亡供體的人胰腺的有效性降低,結果胰島的有效性降低。

2、使得接受者需要接受終身的一般藥理免疫抑制方案。然而,用于
阻止移植組織免疫排斥的此種治療選擇方案受副作用困擾,該副作用當前
仍了解很少,但潛在地非常嚴重。

3、異源性胰島的移植排斥,因為當前使用的免疫抑制藥物中沒有一
種能夠有效地阻止它們。

4、經移植的胰島組織隨著時間的推移存活率較低。

塞爾托利細胞(SC)的功能最近被再次評價,并從僅睪丸精小管的
結構支撐上升為有無數營養和免疫功能的真正生物化學實驗室。特別地,
已證明,SC培養物產生了抑制B和T淋巴細胞(1)增殖的分子。而且,
為了增強它們的免疫調節功能,該SC可以誘導T、B細胞的細胞凋亡和,
通過使其配體FAS連接到被靶細胞(2)表達的FAS的天然殺傷物(natural?
killer)。

SC實施其免疫調節作用的另一種機制是制造轉化生長因子-β
(TGF-β)(3)。這種分子影響了對Th2型(保護性免疫)的偏愛高于Th1
型(非保護性免疫)的T?CD4+淋巴細胞分化的表型。總之,塞爾托利
(Sertoli)活性因此可以對T1?DM具有直接的臨床重要性,因為β-細胞被
主要由淋巴細胞Th1(INF-γ陽性)組成的滲入物破壞。

而且,SC免疫調節效果與分化和抗細胞凋亡的數個生長因子的產生
相關聯,如轉化生長因子(TGF-D)、膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)、
白介素-1(IL-1)、干細胞因子(cKit-配體)、Fas/Fas配體(Fas-L)、激活
素A和最終BCL-w(4)。

最相關的現有技術(參考文獻5)描述了將SC引入到超純藻酸鹽微
膠囊中的方法,所得微膠囊平均直徑為520±14μm。

在寫本文時,在國際水平上這樣的膠囊是令人滿意的:直徑為約500
μm并且“尾部(tail)”百分比不大于5%。該膠囊直徑和尾部百分比都是
非常重要的參數。該第一個參數應盡可能減小從而允許更有效的代謝物交
換,對于該第二個參數,最近發現甚至<5%的尾部百分比都可能會引發具
有非常重大影響的炎癥,因為形成了“抵抗減弱部(loci?minoris?
resistentiae)”,其中細胞抗原將被暴露。

發明內容

本發明人意外地發現一種能夠在不存在尾部結構的情況下制造較小
尺寸的均勻微膠囊的方法,該尾部結構可以封裝SC同時保持它們的活力
和功能不受影響。

考慮到上面情況,本發明人首次提出,通過在不存在黑索金胰島組織
的情況下移植經微膠囊化制成水凝膠類微球體的SC來預防和/或治療T1
DM的可能性。

因此,本發明的目的在于制造包含根據權利要求1所述的塞爾托利細
胞(SC)的水凝膠類微膠囊的方法。

附圖說明

本說明書附有九個附圖,其示出:

圖1.豬SC的微觀照片。A:免疫細胞化學,通過將該制劑和抗苗勒
氏(anti-mullerian)抑制因子(MIS)抗體一起孵化獲得。B:免疫細胞化
學,通過將該制劑與抗波形蛋白(anti-vimentin)抗體一起孵化獲得。C-D:
為了證明間質細胞和管周細胞的存在較少,利用組織化學技術對該制劑進
行處理,從而評價用堅牢紅染色的堿性磷酸酶(管周細胞特有的)(C),
和用硝基藍四唑染色的3-β-羥基-類固醇脫氫酶活性(間質特有的)的存在
率(D)。

圖2.通過“空氣-單噴射器(air-monojet)”制造經微膠囊化制成藻酸
鹽類水凝膠的SC的設備(組A)。組B示出所設計系統的最重要的組件。

圖3.利用BaCl2(A-C)和CaCl2+多鳥氨酸(B-D)作為膠凝劑,通
過霧化系統“空氣-單噴射器”獲得的藻酸鹽類微顆粒的微觀照片。

圖4.在植入后4個月的NOD大鼠腹腔中回收之后,與鋇(A)和鈣
(B)離子交聯的多糖微顆粒透明區(亮場,clear?field)的微觀照片。圖
C示出用EB/FDA雙重染色之后,通過熒光顯微鏡觀察裝入到海藻酸鋇中
的微膠囊化的SC所獲得的微觀照片。

圖5.由NOD大鼠(Taconic)供應者宣稱的T1DM自發發病的百分
比(85%)(A)可與用空微膠囊治療的“自然(naive)”對照組的前驅糖
尿病動物顯示的那些(B)相比。另一方面,組C示出用膠囊化SC治療
的前驅糖尿病動物的T1DM發病百分比大大降低,僅為9%(預防效果)。

圖6.用微膠囊化SC治療的患有明顯自發性糖尿病的NOD大鼠(組
E)移植后平均血糖值(治療效果)。

圖7.用微膠囊化SC治療的動物脾細胞的RT-PCR分析。結果表明
對于組C和組E動物(參見部分VII),SC的治療可以增大陽性的體內
Foxp3細胞數目。這個結果表示T細胞數目有著重要的增長,該T細胞具
有調節特征,即,能夠調節免疫應答涉及的數個細胞的活化和增殖。

圖8.前驅/糖尿病NOD大鼠(A)和自發性糖尿病大鼠(B)的胰島
的組織學分析。該圖片表明該胰島完全不受島周和島內胰島素滲入物
(insulitic?infiltrate)約束。組C和D示出用空膠囊治療的前驅糖尿病“自
然”NOD大鼠(C)和患有自發性糖尿病大鼠(D)的胰島的組織學分析。

圖9.根據本發明的設備的布局。

具體實施方式

首先,制造了SC的均勻多糖懸浮液:該溶液純度就細胞組分而言為
90%,該溶液是在濃度為1至5%w/v,有利地為1至3%w/v的超純海藻
酸鈉鹽水溶液中獲得的。所使用的海藻酸鹽是超純的,因為它表現出的內
毒素含量不大于20EU/g且蛋白質含量<0.4%;空氣有利地用作流體。SC
預先用胰蛋白酶和EDTA處理(2min),以便獲得均勻的細胞懸浮液。利
用下面技術對它進行評價:

·免疫細胞化學技術,將該制劑與抗苗勒氏抑制因子(MIS)抗體
和熒光素抗波形蛋白抗體一起孵化,其分別標記僅被SC表達的
MIS和波形蛋白分子。

·組織化學技術,以便評價管周細胞特有的堿性磷酸酶(用堅牢紅
染色)的存在率,以及另一方面為間質細胞特有的3-β-羥基-類固
醇脫氫酶(用硝基藍四唑染色)的存在率。

用此種組織化學分析法獲得的結果可以證明管周細胞和間質
(Leydig)細胞的存在率為5-8%;而且,這些細胞群體(當以這些比例
存在時)對確保有利于SC正確功能的分子“串擾(cross-talk)”有用。

以10至60ml/min的速率抽吸這種懸浮液,通過利用流體流,有利
地受控壓力下的空氣吸入和擠出從而產生連續的尺寸均勻的微滴流。將如
此抽吸的懸浮液引入到針狀元件中從而使其分成高度均勻的微滴。有利
地,該針狀元件在其側表面上有鈕孔開口,通過該鈕孔開口以3-7升/分鐘
的速率引入流體流從而獲得連續的均勻尺寸的微滴流。該流體流從發生器
中獲得并在使用之前經受以下步驟處理:經受降低壓力,從而在瞬變流-
非瞬變流之間獲得不小于0.3巴的壓力降;經受調節,從而在瞬變流-非
瞬變流之間獲得高重現性并在旋轉數和分散流體流之間獲得線性關系,在
0至10NL/min之間調節和控制輸出流。

該微滴的平均直徑為300至700μm,標準偏差小于40μm。將所獲
得的微滴引入到水溶液中,有利地使用包含二價陽離子或聚陽離子物質的
注射制劑用無菌水,F.U,從而發生膠凝化并獲得所述微膠囊。

本發明的進一步目的是作為單獨治療劑預防和根治T1?DM的塞爾托
利細胞。

有利地,根據本發明的工藝,該抽吸可以通過蠕動泵以10至16ml/min
流速連續進行,并且所述擠出通過“空氣-單噴射器”系統利用3至7l/min
的流體流,優選空氣進行。在該工藝中,先前方法(包括“最相關現有技
術”中使用的方法)中不存在的下面系統組件確保了,所述空氣流的精確
校準、整個方法的特征元件。在與所述階段b)的所述懸浮液接觸之前,
利用下述設備對所述空氣流進行下述操作;

·膜壓減小器Swagelok(KPR1JRF411A20000),其能夠確保輸出
壓力的高重現性并以便在瞬變流/非瞬變流之間獲得小于0.3巴
的非常小的壓力降,用于穩定空氣流和使空氣流運送到可再生的
擠壓機中;

·通過微米閥Swagelok(SS-SS6MM)調節,向壓力調節器輸出,
該壓力調節器允許以在瞬變流/非瞬變流的高重現性非常精細地
調節輸出空氣流(0-10NL/min),并維持旋轉數和分散流之間的
線性關系;

·在該微米閥下游安設由Precision?Fluid(RAGK41-TOSS-SSNNN
-M741A-TTCGN*A)供應的旋轉浮標型流量計(ROTAMETRO)
Yokogawa,其允許精確而快速地閱讀輸出流(0-10NL/min),因
而允許通過該微米閥對其進行調節。

本發明的進一步目的是包含可根據本發明工藝獲得的SC的微膠囊,
其特征之一在于與所表現出的微膠囊化SC的IGF-1分泌與非微膠囊化SC
或“游離”SC的相同。

本發明的進一步目的是有利地為根據本發明工藝微膠囊化的塞爾托
利細胞,作為單獨的治療劑來制造預防和根治T1?DM的藥物的應用。

根據本發明,可以對獲得的微膠囊執行洗滌操作,和/或用天然和/或
人工聚合物進一步包覆。

與現有技術相比,本發明工藝允許a)制造較小尺寸、直徑固定(從
300μm開始),優選為均勻的微膠囊,而不存在“尾部”結構,且沒有使微
膠囊化SC的活力和功能喪失;b)使微膠囊化SC的數目從每毫升海藻酸
鹽106個SC增加到每毫升海藻酸鹽206個SC,這可想象地暗示著在最小
的可能體積的聚合物中植入大量SC的可能性,和c)增加微膠囊化SC的
功能,特別是與IGF-1制造相關的功能,其分泌物從50ng/ml/20×106個細
胞變化為基本等于“游離”SC的80ng/ml/20×106個細胞。

參考本發明,應當注意

1、首次提出將微膠囊化SC作為誘導被自身免疫過程破壞的患者β-
細胞新生的最終治療途徑。

2.已獲得了對微膠囊化工藝的最優化,其導致制造具有改進的特征
的微膠囊,如平均尺寸減小、多分散性降低以及不存在微膠囊的形態畸形
(“尾部”和聚結)。

本發明的進一步方面是包含SC的組合物,該SC與生理上可耐受的
載體一起容納在可通過本發明工藝獲得的微膠囊中,用于預防和治療T1
DM。載體的實例由用于腹膜內施用的鹽水組成。

下面是本發明的詳細方面。

聚合物的純化

市場上無法購得可用于微膠囊化SC的高純形式聚合物,該高純形式
是腸胃外施用,如人移植所需應用所嚴格要求的。在這些情況下,實際上,
需要嚴格的國際認可的“質量控制”標準(參見guidelines?of?the?Ministry?of?
Health?and?of?U.S.Pharmacopeia)。

實際上,大多數商業產品的內毒素水平都非常高(一般在30,000和
60,000EU/g之間),這使得它們完全不適合于移植程序,移植程序要求內
毒素水平不大于100EU/g。因為上面的原因,用于制造微顆粒的所有聚合
物都適合經受隨后的純化循環,該循環使得存在的內毒素大幅減少。

SC的分離

可從一般為青春期前的各種動物來源中分離和純化出SC。麻醉之后,
對動物執行雙側睪丸切除術。在除去副睪之后,對該睪丸執行多酶消化
(multienzymatic?digestion)處理。該消化處理完成后,過濾管狀組織。將
如此獲得的小管放置在37℃、5%CO2氣氛下的培養物中。在孵化器中
48小時之后,該SC開始粘附到培養皿中,形成細胞單層。對所得SC的
純度、活力和功能進行分析。該細胞活力測試通常在分離之后常規地立即
進行、在培養的第二天,以及緊接在微膠囊化過程之前和之后進行。

微膠囊化塞爾托利細胞的制造

可將該SC固定到由各種水凝膠組成的微膠囊中,該水凝膠由單獨使
用或混合使用的親水性聚合物組成。該微膠囊工藝的起始階段設想了獲得
連續和校準的微滴流。可以利用各種程序獲得微滴:(a)“空氣-單噴射器”
微膠囊包裝器、(b)自動振動式膠囊包裝器、(c)靜電式微膠囊包裝器、
(d)微流控芯片系統(microfluidic?lab-on-a-chip?system)。

一旦獲得具有受控和均勻尺寸的微滴流后,這些通過凝膠化程序轉化
成固體微球體。例如,處理聚集的SC單層從而獲得均勻的細胞懸浮液,
將該SC重懸在各種超純聚合溶液(按“純化聚合物”部分中描述的方法獲
得)中,最后,洗滌和分離在凝膠浴中獲得的微膠囊。所制造的微膠囊可
以照原樣使用或用各種天然、半合成或合成的聚合物層進一步包覆。因此,
所提出的方法允許(如圖3中的圖所示)將SC固定在尺寸高度均勻的微
膠囊中,而沒有形態缺陷(存在聚結或“尾部”結構),從而確保該膠囊化
細胞的活力和功能特征得以維持。

膠囊化SC的體內生物相容性

該微顆粒生物相容性通過腹膜內植入進行評價,該腹膜植入通過剖腹
術進行。在整個體內研究中監測每個接受動物的體重。在移植后的不同時
間,將微膠囊移出(explant)從而評價該膠囊化細胞的形態和功能。回收
的微球體的一般特征可通過顯微分析確定,評價膠囊表面形態和存在的任
何炎性細胞。微膠囊化SC的活力也可以利用EB/FDA的雙重染色技術評
價。

微膠囊化SC的體內活性評價

已證明鹽水中微膠囊化SC的腹膜內移植能夠預防和治療人T1?DM
的“嚴謹型(stringent)”動物模型,如NOD大鼠,中的T1?DM。有利地,
但非絕對,從根據本發明的SC微膠囊化過程中獲得的產物通過腹膜內施
用而施用,該產品用鹽水運送。

本發明的進一步目的是有利地用于應用本發明工藝、用于制造微膠囊
的設備。該設備及其操作參考圖9進行描述。第一容器2與流量分配裝置
4配合,該分配裝置4有利地為容積泵,并通過捕捉管(catching?tube)3
將懸浮液1遞送給針狀元件5。該針狀元件5在其側壁具有鈕孔開口6,
和輸出孔7。聯接件8允許來自發生器9并被調節裝置11調節的受壓流體
流10,優選空氣進入到元件5的內部。通過適當地調節流10,可以中斷
懸浮液流并獲得均勻尺寸的微滴13,該微滴在包含存在于第二容器12中
的二價陽離子的溶液中形成凝膠。上述空氣噴射儀器和所述條件適于獲得
均勻的微膠囊。

可在無菌條件和GLP下使用的微膠囊包裝器原型的開發

實施例

塞爾托利細胞微膠囊化成為海藻酸鹽類微球體的過程以及體內生物
相容性和功能的評價

聚合物的純化

通過相繼的過濾過程獲得的海藻酸鈉用作制造微膠囊的原料聚合物
(base?polymer),其通常可以1-6%(w/v)溶液形式利用,并適當地儲存
在4至6℃的避光場所中。隨著時間的推移所述化合物可以穩定約5年,
其內毒素含量不大于20EU/g,實際上無蛋白質含量(<0.4%-美國FDA“生
物不可見性(bioinvisibility)”的另一標準)。

從青春期前幼豬中的SC的分離

從幼豬(7-15天大)“大白豬(Large-White)”的睪丸中分離出SC。
在通過肌肉注射0.1mg/kg阿扎哌隆(azaperon)(40mg/ml,
Janssen,Brusselle,Belgium)和15mg/kg開他敏(ketamine)(100
mg/ml,Gellini?Farmaceutici)進行麻醉之后,對該豬執行雙側睪丸切除術。
在除去副睪之后,從白膜中剝去睪丸,將其切成小組織片段(1-3mm3),
并立即基于HBSS(Sigma?Chemical?Co,St.Louis,USA)中的膠原酶P(Roche?
Diagnostics,S.p.A.,Monza,Italy)(2mg/ml)對該片段進行第一次酶消化處
理。該消化持續到細精管的分離。所收集的小管然后用HBSS洗滌,并在
500r.p.m下離心。在洗滌之后,該小管用含有胰蛋白酶(2mg/ml)和DNAse?
I(Sigma)的HBSS溶液孵化。在完成第二次消化之后,該胰蛋白酶溶液
用Hank′s+20%FBS進行1∶1稀釋從而終止其酶活性。在用HBSS進一步
洗滌之后,通過在300rpm下的輕微離心從管周細胞中分離出小管。包含
管狀組織的“球粒”適合用帶有500μm網孔的不銹鋼過濾器過濾。最后,
為了除去污染該制劑的任何管周細胞和間質細胞,將包含該小管的懸浮液
進一步在800rpm下離心5分鐘,所得球粒用甘氨酸溶液1M和pH?7.2的
HBSS中的EDTA?2mM處理7分鐘。

將如此獲得的小管放置在37℃,5%CO2氣氛下的HAM?F12
(Euroclone)中的培養物中,該培養物補充有維甲酸0.166nM(Sigma)
和5ml/500ml胰島素-轉鐵蛋白-硒(ITS)(Becton?Dickinson#354352)。培
養48小時之后,該SC開始粘附該培養皿,形成細胞單層。為了除去殘余
的生殖細胞(如所知的,如果植入在腹膜腔中其可引起無性細胞瘤
(dysgerminoms)),用緩沖液三(羥甲基)-氨基甲烷鹽酸鹽(TRIS)(Sigma)
處理該SC單層,該緩沖溶液可以通過滲透裂解消除殘余的生殖細胞。最
后,SC在上述條件下生長,通常在75cm2燒瓶中。

對所得SC的純度、活力和功能進行分析。通過免疫細胞化學技術評
價,SC的純度大于90%,將該制劑與抗苗勒氏抑制因子(MIS)和熒光
素抗波形蛋白抗體一起孵化,其分別標記僅被SC表達的MIS和波形蛋白
分子的(圖1A、B)。

為了證明作為可能的污染物的間質和管周細胞的減少,對SC制劑進
行組織化學評價。這些測試允許評價管周細胞特有的堿性磷酸酶(用堅牢
紅染色)的存在率,和間質特有的3-β-羥基-類固醇脫氫酶(用硝基藍四唑
染色)的存在率(圖1C、D)。用這些組織化學分析法獲得的結果可以證
明管周細胞和間質細胞的存在率為5-8%;而且,這些細胞群體(當以這
些比例存在時)對確保有利于SC正確功能的分子“串擾”有用。

SC的活力通過用溴化乙錠(EB)和熒光素雙醋酸酯(FDA)(Sigma)
的處理確定。通過熒光顯微鏡觀察到的細胞在所有條件下都表現出大于95
%的活力。細胞活力測試通常在分離之后常規地立即進行、在培養的第二
天,以及緊接在微膠囊化過程之前和之后進行。

C)膠囊化塞爾托利細胞的微滴的制造

將該SC固定到由各種單獨使用或混合使用的多糖聚合物組成的微膠
囊中。所選聚合物是在我們實驗室超純化的海藻酸鈉。微膠囊化過程的起
始階段設想了從在聚合物濃度可在1和5%(w/v)之間變化的水性多糖
懸浮液中的SC細胞懸浮液開始獲得連續和校準的微滴流。

各種程序是并且可以用于獲得微滴:(a)“空氣-單噴射器”微膠囊包
裝器、(b)自動振動式膠囊包裝器、(c)靜電式微膠囊包裝器、(d)微流
控芯片系統。

特別地,該方法選擇基于半自動化、緊密的、可滅菌并可運送的微膠
囊包裝器(圖2示出該系統的總體外觀)的(a),已允許制造包含尺寸(300
μm至700μm直徑)高度尺寸均勻的SC的微膠囊,而沒有任何明顯的形
態缺陷(如存在聚結或“尾部”結構),并且重要的是,沒有使微膠囊化SC
失去活力和功能。

圖2的組B系統化地描述了通過“空氣-單噴射器”的微膠囊化過程的
程序

D)制備超純的海藻酸鹽類微膠囊

一旦獲得具有受控和均勻尺寸的微滴流后,這些通過凝膠化程序轉化
成固體微球體,該程序設想了根據在我們實驗室開發且生效的方法由二價
離子形成離子連接物(ionic?link)。

特別地,用0.05%胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Garndisland,USA)處理
聚集的SC單層(2min),以便獲得均勻的細胞懸浮液。洗滌后,通過血
球計算分析對該SC進行計數,并測試其活力。然后,將SC重懸在各種
超純聚合懸浮液中,該懸浮液中AG的濃度可在1.5-2%(w/v)之間變化。
對于用“空氣-單噴射器”系統制造微膠囊,通過蠕動泵,以10至16ml/min
的流速連續抽吸該聚合物中的SC懸浮液。然后通過該“空氣-單噴射器”系
統(利用3至7l/min的空氣流)擠出該細胞懸浮液。整個過程中,保持
SC懸浮液處在輕微攪拌狀態下,從而阻止該細胞的聚集以及SC在其中非
均勻分布的微膠囊形成的可能。

所制得的微滴利用包含二價陽離子如Ca+2或Ba+2(0.5-2.5%,w/v)的
溶液膠凝。以這種方式,將該微滴瞬間轉化成凝膠微球體。然后,將該微
膠囊放在凝膠浴中,持續一段可在2和15分鐘之間變化的時間。在這個
步驟結束時,用鹽水對該微膠囊執行重復的洗滌循環。

所制造的微膠囊可以照原樣使用或通過在包含天然、半合成或合成的
陽離子聚合物的溶液中相繼孵化而被進一步包覆。例如,使用0.12%(持
續10分鐘)和0.06%(持續6分鐘)的聚-L-鳥氨酸(PLO)。最后,用
PLO包覆的微膠囊利用稀釋的多糖溶液進一步處理,從而提供高度生物相
容的最終外包覆層。

圖3示出通過均僅僅利用鋇離子的上述步驟(A-C),和用鈣/聚鳥氨
酸/聚合物離子多層涂覆的步驟(B-D)獲得的海藻酸鹽類微膠囊的微觀照
片。因此,所提出的方法允許(如圖3中的圖所示)將SC固定在高度尺
寸均勻的微膠囊中,而沒有形態缺陷如存在聚結或“尾部”結構,并最終確
保該膠囊化細胞的活力和功能特征得以維持。

E)膠囊化SC的體內生物相容性

在通過腹膜內施用100mg/kg開他敏(Parke-Davis/Pfizer,Karlsruhe,
德國)和15mg/kg甲苯噻嗪(xylazine)(Bayer,Leverkusen,德國)誘導
的全身麻醉之后,通過在雌性NOD大鼠(意大利,Harlan,重量約為25g)
腹膜腔上的小剖腹術引入該海藻酸鹽微顆粒。將106微膠囊化SC植入每
只動物中。在整個體內研究過程中監測每只接受大鼠的體重。

移植4個月之后,麻醉后從該動物的腹膜腔內移出微膠囊,從而評價
其內含物的形態和功能。該微膠囊利用鹽水通過腹膜洗滌回收。回收的微
球體的一般特征可通過顯微分析確定,評價膠囊表面形態和存在的任何炎
性細胞。還可以利用EB/FDA的雙重染色技術評價該微膠囊化SC的活力。

圖4(A-B)中示出的微觀照片表明該多肽微顆粒保持著高生物相容
性標準,如膠囊表面上存在最低水平的炎性細胞所示的。而且,在植入后
4個月(圖4C),海藻酸鋇(圖4A)和海藻酸鈣(圖4B)中的微膠囊化
SC都保持著優異的活力水平。

E)微膠囊化SC的體內和體外活性評價

本發明可以應用于移植生物技術領域,例如預防和治療T1?DM。實
際上,在我們實驗室我們已證明海藻酸鋇微球體中微膠囊化SC的腹膜內
移植(206/大鼠)能夠預防和治療人T1?DM的“嚴謹型”動物模型,如NOD
大鼠的T1?DM。特別地,經微膠囊化制成海藻酸鋇(BaAG)微球體的SC
在72小時的培養之后移植在前驅糖尿病NOD大鼠腹膜腔中,而且明顯受
到糖尿病的影響。該植入是在全身麻醉的情況下通過剖腹術進行的。然后
每周檢查受移植動物的體重以及餐前和餐后血糖。我們所依照的實驗方案
設想了對多組動物進行不同的治療,如下所指出的。

組A:“自然”前驅糖尿病對照動物(用空微膠囊治療)

組B:自發性糖尿病對照動物(用空微膠囊治療)

組C:通過腹膜內植入微膠囊化SC治療的“自然”前驅糖尿病動物

組D:通過腹膜內植入“游離”SC(206/大鼠)治療的“自然”前驅糖尿
病動物

組E:通過腹膜內植入微膠囊化SC治療的自發性糖尿病動物

在體內研究過程中,處死一些動物從而通過收集脾、胰周淋巴結和胰
腺,用并行的組織形態學和免疫細胞化學檢查評價外周免疫布局。

NOD大鼠體內實驗的完整分析已可以證明在罹患自發性糖尿病的前
驅糖尿病動物中的移植的微膠囊化SC可以獲得如下所示重要的治療結
果。

-(A)微膠囊化SC能夠阻止NOD大鼠的T1?DM發病。這種極好
的(sensational)結果可以通過分析T1?DM自發性發病的百分比而獲得。
實際上,這種病理自發地發生在A組的85%的動物中(圖5B)。這個結
果與NOD大鼠的供應商(Taconic)宣稱的T1?DM發生百分比完全一致(圖
5A)。

另一方面,在C組動物(用膠囊化SC治療的前驅糖尿病動物)中,
T1DM發病百分比僅為9%(圖5C)。最后,在D組動物(通過腹膜內植
入“游離”SC治療的前驅糖尿病動物)中,T1?DM發病百分比相比“自然”
組動物的發病百分比(19%)大大降低,但高于C組動物(圖5D)。

-(B)在植入后的7至15天,該微膠囊化SC能夠使已患有自發性
糖尿病E組(N=30)中多于60%大鼠的血糖值(達到低于200mg/dl的
血糖水平)恢復正常(圖6A)。另一方面,B組動物(用空膠囊治療的糖
尿病動物)總是保持著高血糖水平,它們在1-2周內很快死亡。最后,F
組動物(N=30)(通過腹膜內植入“游離”SC治療的糖尿病動物)可以使血
糖值正常化,但是百分比較低,約等于40%。

-(C)對淋巴結、胰腺和脾進行的研究已證明,SC能夠“再教育
(re-educating)”C和E組動物的免疫系統,“阻擋”導致疾病的自身免疫
攻擊,如與對受治療動物脾細胞的實時聚合酶鏈反應(PCR)結果相關的
圖7所示。特別地,此種結果表明,用SC治療的其中一個主要效果是它
們在活體內誘導Foxp3+細胞的能力。Foxp3是T細胞的選擇性標記物,該
T細胞具有調節特征,即,能夠調節涉及免疫應答的數個細胞的活化和增
殖,其數目在NOD大鼠模型中降低。

-(D)對所研究的所有動物組進行的組織化學測定表明,與對照組
(A和B)相比,利用SC的治療能夠除去C組和E組動物中胰腺水平的
胰島素單核滲入物(圖8)。而且,此種效果之后即為胰腺間充質干細胞的
活化,該干細胞能夠產生新β-細胞,該新β-細胞能夠使利用SC治療的動
物血糖恢復正常,因為它們不再被自身免疫攻擊漸漸破壞。在用SC治療
后,免疫應答的再調節通過活化吲哚胺2,3-二氧化酶(IDO)免疫調節途
徑介導,其同種型也在SC中被表達和功能化。

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