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一種治療類風濕性關節炎的紫草提取物及其軟膠囊.pdf

摘要
申請專利號:

CN201010132446.1

申請日:

2010.03.26

公開號:

CN102198124B

公開日:

2014.10.29

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 專利權的轉移IPC(主分類):A61K 31/222變更事項:專利權人變更前權利人:山東靶點藥物研究有限公司變更后權利人:正大青春寶藥業有限公司變更事項:地址變更前權利人:264006 山東省煙臺市開發區萬壽山路1號科技大廈西側中國煙臺留學生創業園區生物醫藥大廈6樓變更后權利人:310023 浙江省杭州市西溪路551號登記生效日:20141126|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 31/222申請日:20100326|||文件的公告送達IPC(主分類):A61K 31/222收件人:郎躍武文件名稱:視為未提出通知書|||文件的公告送達IPC(主分類):A61K 31/222收件人:劉軍鋒文件名稱:手續合格通知書|||公開
IPC分類號: A61K31/222; A61K31/122; A61K9/48; A61P19/02; A61P19/04; A61P37/02 主分類號: A61K31/222
申請人: 山東靶點藥物研究有限公司
發明人: 劉珂; 劉軍鋒; 范華英; 邵萌; 于翠翠; 于黎鑫; 趙海青; 竇玉梅; 梁麗娟
地址: 264006 山東省煙臺市開發區萬壽山路1號科技大廈西側中國煙臺留學生創業園區生物醫藥大廈6樓
優先權:
專利代理機構: 代理人:
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201010132446.1

授權公告號:

|||102198124B||||||||||||

法律狀態公告日:

2014.12.17|||2014.10.29|||2013.03.27|||2012.04.18|||2012.04.11|||2011.09.28

法律狀態類型:

專利申請權、專利權的轉移|||授權|||實質審查的生效|||文件的公告送達|||文件的公告送達|||公開

摘要

本發明公開了一種紫草提取物及其制備方法,該紫草提取物含有乙酰阿卡寧為0.10~25%,異戊酰阿卡寧為0~20%,α-甲基丁酰阿卡寧為0~20%,β,β-二甲基丙烯酰阿卡寧為0~30%(按高效液相色譜峰面積歸一化法計)。本發明還公開了以紫草提取物為原料的軟膠囊及軟膠囊的制備方法。本發明還公開了所述的紫草提取物在制備治療類風濕性關節炎藥物中的用途。

權利要求書

1.一種治療類風濕性關節炎的紫草提取物,其特征為該提取物中含有乙酰阿卡寧為0.10~25%,異戊酰阿卡寧為0~20%,α-甲基丁酰阿卡寧為0~20%,β,β-二甲基丙烯酰阿卡寧為0~30%(按高效液相色譜峰面積歸一化法計)。2.根據權利要求1所述的紫草提取物,其特征為該提取物中含有乙酰阿卡寧為10~20%,異戊酰阿卡寧為10~15%,α-甲基丁酰阿卡寧為10~15%,β,β-二甲基丙烯酰阿卡寧為15~25%(按高效液相色譜峰面積歸一化法計)。3.權利要求1所述的紫草提取物的制備方法,其特征在于包括下列步驟:取新疆紫草藥材飲片,50-60℃條件下10-20倍量(體積∶質量,ml∶g)石油醚(60-90℃)浸提2-4次,每次浸提1-3小時,提取液濃縮回收溶劑,得浸膏,再以浸膏10-20倍重量的硅膠進行柱層析分離,以石油醚-乙酸乙酯體系洗脫,薄層色譜檢查,合并萘醌類成分,即得紫草提取物。4.根據權利要求3所述的制備方法,其特征為該提取物通過以下方法制備,取新疆紫草藥材飲片,55℃條件下15倍量(體積∶質量,ml∶g)石油醚(60-90℃)浸提3次,每次浸提3小時,提取液濃縮回收溶劑,得浸膏,再以15倍量硅膠柱層析,石油醚-乙酸乙酯體系洗脫,薄層色譜檢查,合并萘醌類成分,即得紫草提取物。5.含有權利要求1所述的紫草提取物的口服制劑,其特征為該提取物的劑型為軟膠囊。6.根據權利要求5所述的軟膠囊,其特征為該提取物的軟膠囊劑型的組方為:紫草提取物25-50g、大豆油450-475g、明膠100g、甘油40g、對羥基苯甲酸甲酯0.16g、對羥基苯甲酸丙酯0.04g、蒸餾水適量;制備方法為:取明膠加入適量蒸餾水使其吸水膨脹,另將甘油、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯和剩余蒸餾水置煮膠鍋中加熱至70-80℃,混合均勻,加入膨脹的明膠攪拌,熔融,保溫1-2小時,靜置,刮去上浮的泡沫,用紗布過濾,保溫待用;取紫草提取物溶于大豆油中,制備藥液;將已制備好的囊殼液和藥液在軟膠囊成型機中制成軟膠囊,再進行定型、干燥、洗丸、揀丸、包裝,制成軟膠囊。7.權利要求1所述的紫草提取物在制備治療類風濕性關節炎藥物中的用途。

說明書

一種治療類風濕性關節炎的紫草提取物及其軟膠囊

技術領域

本發明涉及中藥制藥技術領域,具體涉及一種治療類風濕性關節炎的紫草提取物及其軟膠囊,還涉及紫草提取物及其軟膠囊的制備方法。

背景技術

類風濕性關節炎屬自身免疫性疾病,是因機體免疫系統對自身成分發生免疫反應而導致的疾病狀態。其基本特征為:可檢測到高效價的自身抗體和/或自身應答性T細胞;自身抗體或應答T細胞作用于自身組織細胞,造成損傷或功能障礙;為一累及周圍關節為主的多系統性炎癥性自身免疫疾病。在歐美的患病率為1%,我國約為0.32-0.36%。該病發病可見于任何年齡和地區,以35-50歲青壯年居多,女性發病率高,為男性的2-3倍。

類風濕性關節炎目前的治療藥物有(1)非甾體抗炎藥(NSAIDs),這類藥物為改善關節炎癥狀的常用藥,不能控制病情。且由于該類藥物的作用靶點多為COx酶,結果使體內前列腺素合成受到抑制,長期服用,會致使胃炎、胃潰瘍和胃出血等嚴重的消化道副作用。(2)改善病情的抗風濕藥(DMARDs),這類藥物多為免疫抑制劑,這類藥物可改善患者的關節癥狀,阻止關節結構的破壞,但不能消除滑膜炎癥反應,且有肝損傷、骨髓抑制等毒副作用。(3)糖皮質激素,這類藥物有強大的抗炎作用,迅速消除關節腫脹,減輕疼痛。但不能根治,停藥后會復發,長期使用將出現骨質疏松、軟骨破壞等副作用。(4)生物制劑,主要為腫瘤壞死因子(TNF-α)拮抗劑,包括依那昔普(Etanercept)和英夫利昔單抗(Infliximab)。TNF-α拮抗劑可明顯改善類風濕性關節炎患者的臨床指標及生活質量,安全性好。但這類藥物的缺點是價格昂貴,普通患者根本用不起。

紫草為常用中藥,為紫草科多年生草本植物,因其根呈紫色得名,最早記載于《神農本草經》,具有清熱涼血,活血,解毒透疹之功效。

經研究,紫草的主要成分有兩大類:一類是水溶性成分,目前研究比較少,初步認為主要是多糖和糖蛋白的混合物;另一類是脂溶性成分,包括紫草萘醌類、酚酸類、生物堿類、苯酚、黃酮類等。其中最值得注意的是紫草萘醌類化合物。研究表明,紫草萘醌類化合物是紫草的主要有效成分,其含量占3-6.5%,具有多種生理和藥理活性,如愈傷抗炎、抗菌抗病毒、解熱、止血、抗腫瘤、保肝、降血糖、鎮靜和調節免疫等作用。

紫草萘醌類化合物主要包括阿卡寧衍生物和紫草素衍生物,兩者屬于同分異構體,它們的結構如下:

阿卡寧衍生物

紫草素衍生物

阿卡寧衍生物是紫草科植物新疆紫草(軟紫草Arnebia?euchroma(Royle)Johnst)中的主要脂溶性有效成分,近年的研究發現,阿卡寧衍生物具有多種生物活性,包括具有促進傷口愈合、抗炎、抗微生物、抗腫瘤等作用[Vassilios?P.Papageorgiou?et?al,Angew.Chem.Int.Ed.1999,38,270-300;V.P.Papageorgiou?et?al,Current?Organic?Chemistry,2006,10,2123-2142]。

公開號為CN101434530A中國專利申請公開了一種從紫草根中提取紫草素的方法,其特征是將紫草根與含醇水溶液按一定料液比混合放入勻漿機中勻漿提取,將勻漿后所得的混合物固液分離,得提取液,將固形物再與含醇水溶液按一定料液比混合放入勻漿機中勻漿提取,將提取液合并后減壓濃縮,得到紫草素粗產品。

另外,中國專利ZL200310124125.7等也公開了多種紫草提取物的制備方法,如上同樣的原因,由于對設備要求高、工藝繁瑣、產量低、成本高等原因,無法在產業上應用。且提取物多為粗提物,基礎物質不明確,缺乏對其質量進行有效控制的方法。

從紫草中研制開發出療效確切,毒副作用小,質量可控,使用方便的紫草中藥劑型,具有可行性和必要性。

發明內容

本發明提供一種治療類風濕性關節炎的紫草提取物,其中乙酰阿卡寧為0.10~25%,異戊酰阿卡寧為0~20%,α-甲基丁酰阿卡寧為0~20%,β,β-二甲基丙烯酰阿卡寧為0~30%(按高效液相色譜峰面積歸一化法計)。

高效液相色譜條件為流動相:乙腈-水-甲酸(700∶300∶0.5),流速:1ml/min,檢測波長:518nm,柱溫:30℃。

本發明提供的紫草提取物優選為,其中乙酰阿卡寧為10~20%,異戊酰阿卡寧為10~15%,α-甲基丁酰阿卡寧為10~15%,β,β-二甲基丙烯酰阿卡寧為15~25%(按高效液?相色譜峰面積歸一化法計)。

本發明的提取物通過以下提取方法獲得:取新疆紫草藥材飲片,50-60℃條件下10-20倍量(體積∶質量,ml∶g)石油醚(60-90℃)浸提2-4次,每次浸提1-3小時,提取液濃縮回收溶劑,得浸膏,再以浸膏10-20倍重量的硅膠進行柱層析分離,以石油醚-乙酸乙酯體系洗脫,薄層色譜檢查,合并萘醌類成分,即得紫草提取物。

制備紫草提取物方法最佳為:取新疆紫草藥材飲片,55℃條件下15倍量(體積∶質量,ml∶g)石油醚(60-90℃)浸提3次,每次浸提3小時,提取液濃縮回收溶劑,得浸膏,再以15倍量硅膠柱層析,石油醚-乙酸乙酯體系洗脫,薄層色譜檢查,合并萘醌類成分,即得紫草提取物。

將有效劑量的本發明提取物和藥學上可接受的口服藥物載體可做成軟膠囊劑。

本發明軟膠囊具體的組方為:紫草提取物25-50g、大豆油475g、明膠100g、甘油40g、對羥基苯甲酸甲酯0.16g、對羥基苯甲酸丙酯0.04g、蒸餾水適量。

制備方法為:

1)、制膠:取明膠加入適量蒸餾水使其吸水膨脹,另將甘油、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯和剩余蒸餾水置煮膠鍋中加熱至70-80℃,混合均勻,加入膨脹的明膠攪拌,熔融,保溫1-2小時,靜置,刮去上浮的泡沫,用紗布過濾,保溫待用;

2)、配液:取紫草提取物溶于大豆油中,制備藥液;

3)、壓丸:將已制備好的囊殼液和藥液在軟膠囊成型機中制成軟膠囊;

4)、定型:將軟膠囊放入轉籠中冷卻定型;

5)、干燥:將軟膠囊放入軟膠囊定型機中干燥;

6)、洗丸:將干燥好的軟膠囊放入三足離心機中清洗;

7)、揀丸:通過目測對半成品進行篩選,剔除產品中的異形產品;

8)、包裝:采用高密度聚乙烯瓶包裝,增加包裝的密閉性及不透光性。

相關試驗顯示,本發明提供的紫草提取物體外對內毒素激活小鼠腹腔巨噬細胞、分泌炎癥細胞因子TNF-α和IL-1具有顯著的抑制作用。在體內在類風濕性關節炎模型----佐劑性關節炎模型和膠原性關節炎中明顯抑制大鼠關節腫脹度,降低多發性關節炎指數評分。病理可見,紫草總萘醌可明顯減少大鼠滑膜中炎性細胞浸潤,抑制滑膜細胞的增殖,表現對滑膜和關節軟骨組織的保護作用。免疫方面,紫草總萘醌可降低大鼠增高的胸腺指數和脾臟指數,增強對胸腺、脾臟免疫器官的保護作用。

本品與臨床常用藥物潑尼松(10mg/kg)、雷公藤多甙(30mg/kg)、注射用重組人II型?腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白(商品名:益賽普)(0.8mg/kg)藥效對比結果顯示,在AA模型中紫草10、20mg/kg劑量組具有明顯抑制大鼠原發和繼發足腫脹,降低關節炎指數評分。其中10mg/kg劑量組藥效強度與雷公藤多甙相當,20mg/kg劑量組藥效強度明顯優于陽性對照藥-雷公藤多甙;20mg/kg劑量組藥效強度與潑尼松相當。在CIA模型中,紫草總萘醌各劑量組都有明顯抑制大鼠原發和繼發足腫脹,降低關節炎指數評分作用,藥效強度都強于益賽普組。其中5mg/kg劑量組藥效強度與雷公藤多甙相當,10mg/kg劑量組藥效強度明顯優于陽性對照藥-雷公藤多甙。

雷公藤多甙和潑尼松具有免疫抑制作用,我們的藥效學實驗結果可見明顯降低大鼠脾指數,病理切片下可見大鼠胸腺皮質髓質明顯變薄。脾淋巴細胞稀疏,脾小節明顯減少。而紫草總萘醌各劑量組大鼠平均體重及臟器指數均高于雷公藤多甙和潑尼松組,而且其進食量、外觀毛色及活動狀態均優于雷公藤多甙和潑尼松組大鼠。病理切片胸腺和脾臟結果可見紫草總萘醌各劑量組無明顯影響。

藥效學實驗結果說明了紫草總萘醌對大鼠實驗性關節炎的免疫性炎癥有治療作用,且還具有良好的調節免疫和抗炎作用。

另外,本發明提供的軟膠囊基礎物質明確、有效成分質量穩定可控、服用方便、吸收好。

附圖說明

圖1紫草提取物對AA大鼠致炎側足腫脹度的影響

圖2紫草提取物對AA大鼠繼發側足腫脹度的影響

圖3紫草提取物對AA大鼠體重變化的影響

圖4紫草提取物對AA大鼠關節炎指數評分的影響

圖5紫草提取物對AA大鼠胸腺、脾指數的影響

圖6紫草提取物對CIA大鼠致炎側足腫脹度的影響

圖7紫草提取物對CIA大鼠繼發側足腫脹度的影響

圖8紫草提取物對CIA大鼠體重變化的影響

圖9紫草提取物對CIA大鼠關節炎指數評分的影響

具體實施方式

以下實施例更詳細地說明本發明,但不以任何形式限制本發明。

紫草提取物的制備

實施例1

取新疆紫草(軟紫草Arnebia?euchroma(Royle)Johnst)藥材飲片100Kg(購自煙臺醫藥商城,批號:20080911),55℃條件下1500L石油醚浸提3次,每次3小時,提取液濃縮回收溶劑,得到約4.72Kg浸膏,以70kg硅膠柱層析,石油醚-乙酸乙酯體系洗脫,薄層檢查得紫草提取物約3Kg。

經HPLC分析,高效液相色譜條件為流動相:乙腈-水-甲酸(700∶300∶0.5),流速:1ml/min,檢測波長:518nm,柱溫:30℃。

乙酰阿卡寧的含量為15.1%;異戊酰阿卡寧的含量為12.7%;α-甲基丁酰阿卡寧的含量為10.2%;β,β-二甲基丙烯酰阿卡寧的含量為24.2%。

實施例2

取新疆紫草(軟紫草Arnebia?euchroma(Royle)Johnst)飲片50Kg(購自新疆石河子,批號:20090213),50℃條件下500L石油醚浸提2次,每次2小時,提取液濃縮回收溶劑,得到約2.01Kg浸膏,40kg硅膠柱層析,石油醚-乙酸乙酯體系洗脫,得紫草提取物約1.2Kg。

經HPLC分析,高效液相色譜條件為流動相:乙腈-水-甲酸(700∶300∶0.5),流速:1ml/min,檢測波長:518nm,柱溫:30℃。

乙酰阿卡寧的含量為24.1%;異戊酰阿卡寧的含量為18.2%;α-甲基丁酰阿卡寧的含量為19.4%;ββ-二甲基丙烯酰阿卡寧的含量為28.5%。

實施例3

取新疆紫草(軟紫草Arnebia?euchroma(Royle)Johnst)藥材50Kg(購自新疆石河子,批號:20090213),50℃條件下2000L石油醚浸提1次,3小時,提取液濃縮同收溶劑,得到約1.92Kg浸膏,20kg硅膠柱層析,石油醚-乙酸乙酯體系洗脫,乙醇除去所含蠟質,得紫草提取物約1.08Kg。

經HPLC分析,高效液相色譜條件為流動相:乙腈-水-甲酸(700∶300∶0.5),流速:1ml/min,檢測波長:518nm,柱溫:30℃。

乙酰阿卡寧的含量為10.4%;異戊酰阿卡寧的含量為10.6%;α-甲基丁酰阿卡寧的含量為10.9%;ββ-二甲基丙烯酰阿卡寧的含量為15.2%。

軟膠囊的制備

實施例4

取明膠100g加入適量蒸餾水使其吸水膨脹,另將甘油40g、對羥基苯甲酸甲酯0.16g、對羥基苯甲酸丙酯0.04g和剩余蒸餾水置煮膠鍋中加熱至70-80℃,混合均勻,加入膨脹的明膠攪拌,熔融,保溫1-2小時,靜置,刮去上浮的泡沫,用紗布過濾,保溫待用;取25g?紫草提取物溶于475g大豆油中,制備藥液;將已制備好的囊殼液和藥液在軟膠囊成型機中制成軟膠囊,再進行定型、干燥、洗丸、揀丸、包裝,制成軟膠囊粒。

實施例5

取明膠100g加入適量蒸餾水使其吸水膨脹,另將甘油40g、對羥基苯甲酸甲酯0.16g、對羥基苯甲酸丙酯0.04g和剩余蒸餾水置煮膠鍋中加熱至70-80℃,混合均勻,加入膨脹的明膠攪拌,熔融,保溫1-2小時,靜置,刮去上浮的泡沫,用紗布過濾,保溫待用;取50g紫草提取物溶于450g大豆油中,制備藥液;將已制備好的囊殼液和藥液在軟膠囊成型機中制成軟膠囊,再進行定型、干燥、洗丸、揀丸、包裝,制成軟膠囊粒。

紫草提取物中紫草提取物的分離與鑒定

試驗例1

1.1材料

受試樣品:紫草提取物,按實施例1制備。

1.2分離

總紫草提取物經過硅膠柱層析,分別用石油醚∶乙酸乙酯=100∶1;100∶1;100∶2;100∶4比例洗脫,所得洗脫液蒸干溶劑后再分別用石油醚或石油醚、乙酸乙酯和甲醇以一定的比例重結晶,分別得到化合物1紅褐色顆粒狀結晶-乙酰阿卡寧、化合物2鮮紅色鱗片狀結晶-去氧阿卡寧、化合物3紅褐色片狀狀結晶-ββ-二甲基丙烯酰阿卡寧。而色譜圖一上的峰4經過檢驗是一對同分異構體,因此我們又通過制備液相進行分離,分離條件是:流動相:THF∶H2O=45∶55;流速:1ml/min;檢測波長:515nm。分離得到的化合物4紅色粘稠物α-甲基丁酰阿卡寧和化合物5紅色粘稠物異戊酰阿卡寧。

1.3鑒定

1)乙酰阿卡寧的鑒定:

1H-NMR譜(CDCl3,400MHz,δ)低場信號δ12.58(1H,s)、δ12.43(1H,s)是活潑氫信號,表示可能有酚羥基結構。芳香區的質子信號δ7.19(2H,s,)、說明苯環取代后是一個對稱的結構6.99(1H,s,)另一個不飽和氫信號、6.02(H,dd,J=4.8Hz,6.68Hz)、5.12(1H,t,J=7.28Hz),說明為烯鍵氫或者氫與氧相連、2.62,2.47(2H,m)推測有-CH2-結構、2.14(3H,s)、1.69(3H,s)、1.60(3H,s)推測該化合物有三個-CH3信號。

13C-NMR譜(CDCl3,400MHz,δ)δ178.2(C-4),176.7(C-1),169.7(C-1′),167.5(C-8),167(C-5),148.2(C-3),136.1(C-14),132.9(C-6),132.7(C-7),131.5(C-2),117.7(C-13),111.8(C-9),111.6(C-10),69.5(C-11),32.8(C-12),25.7(C-18),20.9(C-15),17.9(C-16)?以上波譜數據與文獻[Chien-Chang?Shen,Wan-Jr?Syu;Antimicrobial?Activities?ofNaphthazarins?from?Arnebia?euchroma;J.Nat.Prod?2002,65,1857-1862]報道的乙酰阿卡寧數據對比,基本一致,故鑒定化合物為乙酰阿卡寧,其結構如下:

2)ββ-二甲基丙烯酰阿卡寧的鑒定:

1H-NMR譜(CDCl2,400MHz,δ)低場信號δ12.60(1H,s)、δ12.44(1H,s)是活潑氫信號表示可能有酚羥基結構。芳香區的質子信號δ7.18(2H,s,)、說明苯環取代后是一個對稱的結構,6.98(1H,s,)另一個不飽和氫信號、6.01(H,dd,J=4.60Hz,6.68Hz)說明此碳旁有兩個不同的氫信號,5.78(H,s)可能是烯鍵氫信號,5.15(1H,t,J=7.24Hz)推測有-CH-CH2-結構,2.63,2.48(2H,m,),2.16(3H,s)、1.94(3H,s,)、1.69(3H,s)、1.58(3H,s),推測該化合物有4個-CH3信號。

13C-NMR譜(CDCl3,400MHz,δ)δ179.0(C-4),177.5(C-1),166.9(C-8),166.3(C-5),165.3(C-1′),158.9(C-3′),149.1(C-2),135.8(C-14),132.6(C-6),132.5(C-7),131.6(C-3),118.0(C-13),115.3(C-2′),111.9(C-9),111.6(C-10),68.6(C-11),32.9(C-12),27.5(C-5′),25.7(C-15),20.4(C-4′),17.9(C-16).

以上波譜數據與文獻[Chien-Chang?Shen,Wan-Jr?Syu;Antimicrobial?Activities?ofNaphthazarins?from?Arnebia?euchroma;J.Nat.Prod?2002,65,1857-1862]報道的ββ-二甲基丙烯酰阿卡寧數據對比,其核磁數據基本一致,故鑒定化合物為ββ-二甲基丙烯酰阿卡寧,其結構如下:

3)α-甲基丁酰阿卡寧的鑒定:

1H-NMR譜(CDCl2,400MHz,δ)低場信號δ12.59(1H,s)、δ12.42(1H,s)是活潑氫信號表示可能有酚羥基結構。芳香區的質子信號δ7.18(2H,s,)說明苯環取代后是一個對稱的結構,7.00(1H,s,)另一個不飽和氫信號、6.03(H,dd,J=4.48Hz,7.16Hz)說明此碳旁有兩個不同的氫信號,5.13(1H,t,J=7.32Hz)推測是-CH-CH2-結構、2.62,2.48(H,m,)2.44(H,m,)1.49、1.69(H,m,)、1.69(3H,s)、1.57(3H,s)、1.17(3H,d)、0.95(3H,d),推測該化合物有4個-CH3信號。

13C-NMR譜(CDCl3,400MHz,δ)δ178.3(C-4),176.8(C-1),175.4(C-1′),167.4(C-8),166.9(C-5),148.6(C-2),135.9(C-14),132.8(C-6),132.7(C-7),131.4(C-3),118.0(C-13),111.9(C-9),111.6(C-10),69.0(C-11),41.0(C-2′),33.0(C-12),26.7(C-3′),25.7(C-15),17.9(C-16),16.4(C-5′),11.5(C-4′).

以上波譜數據與文獻[Chien-Chang?Shen,Wan-Jr?Syu;Antimicrobial?Activities?ofNaphthazarins?from?Arnebia?euchroma;J.Nat.Prod.2002,65,1857-1862]報道的α-甲基丁酰紫草素對比,其核磁數據基本一致,故鑒定化合物為α-甲基丁酰紫草素,其結構如下:

4)異戊酰阿卡寧的鑒定:

1H-NMR譜(CDCl2,400MHz,δ)低場信號δ12.59(1H,s)、δ12.43(1H,s)是活潑氫信號表示可能有酚羥基結構。芳香區的質子信號δ7.19(2H,s,)、說明苯環取代后是一個對稱的結構,6.99(1H,s,),芳香區另一個不飽和氫信號,6.14(1H,dd,J=4.48Hz,J=7.20Hz),說明此碳旁有兩個不同的氫信號、5.13(1H,t,J=7.16Hz)推測有-CH-CH2-結構2.62,2.48(H,m),2.44(2H,m),2.13(H,m,)、1.69(3H,s)、1.58(3H,s)、0.97(3H,d,J=1.24Hz),0.98(3H,d,J=1.36Hz),推測該化合物有4個-CH3信號。

13C-NMR譜(CDCl3,400MHz,δ)δ178.2(C-4),176.7(C-1),171.8(C-1′),167.5(C-8),166.9(C-5),148.5(C-2),136.0(C-14),132.9(C-6),132.7(C-7),131.5(C-3),117.9(C-13),111.8(C-9),111.6(C-10),69.2(C-11),43.4(C-2′),33.0(C-12),25.8(C-3′),25.7(C-15),22.4(C-5′),22.3(C-4′),17.9(C-16).

以上波譜數據與文獻[Chien-Chang?Shen,Wan-Jr?Syu;Antimicrobial?Activities?ofNaphthazarins?from?Arnebia?euchroma;J.Nat.Prod.2002,65,1857-1862]報道的異戊酰紫草素數據對比,其核磁數據基本一致,故鑒定化合物為異戊酰紫草素,其結構如下:

紫草提取物的藥效學試驗

試驗例2.紫草提取物對大鼠佐劑關節炎的影響

2.1材料

受試樣品:紫草提取物,按實施例1制備。

2.2方法與結果

80只雄性SD大鼠按體重隨機分為8組,分別為:正常組、模型組、空白基質組、醋酸潑尼松組(10mg/kg)、雷公藤多甙組(30mg/kg)、紫草低劑量組(5mg/kg)、紫草中劑量組(10mg/kg)、紫草高劑量組(20mg/kg),每組10只。在造模前用足趾容積測量儀測所有大鼠左右足的足趾容積后,每只大鼠左足墊皮內注射完全弗式佐劑0.1ml造膜。造模后1h開始給藥,連續給藥28d;造模后每天測量AA大鼠左足容積(原發腫脹),并同時于第9d、11d、13d、15d、19d、23d、27d測對側足容積;致炎后第15d開始關節炎指數評分,每天一次。末次給藥后1h,稱取大鼠的體質量,腹主動脈取血測TNF-α。

實驗結果顯示,紫草提取物可明顯降低AA大鼠關節腫脹度(圖1、2),改善大鼠體重降低(圖3)及關節炎指數評分(圖4),可以有效地改善關節炎的癥狀。可降低血清中TNF-α含量(表1),具有抗炎消腫、調節免疫的作用。可明顯減少AA大鼠滑膜中炎性細胞浸潤,抑制滑膜細胞的增殖,表現對滑膜和關節軟骨組織的保護作用。

表1紫草提取物對AA大鼠血清中TNF-α含量的影響(?n=10)

與正常組比較ΔP<0.01;與模型組比較*P<0.05,**P<0.01

結論:紫草提取物對大鼠佐劑關節炎有明顯的治療作用。

試驗例3.紫草提取物對膠原誘導大鼠關節炎的影響

3.1材料

受試樣品:紫草提取物,按實施例1制備。

3.2方法與結果

70只雄性Wistar大鼠按體重隨機分為7組,分別為:正常組、模型組、益賽普組(0.8mg/kg)、雷公藤多甙組(30mg/kg)、紫草低劑量組(5mg/kg)、紫草中劑量組(10mg/kg)、紫草高劑量組(20mg/kg),每組10只。造模時于每只大鼠左足足墊皮內注射牛II型膠原乳劑0.1ml;初次免疫10天后每只大鼠距尾根部2-3cm處皮下同等劑量加強免疫一次;14d后造模成功開始給藥,連續給藥28d;造模前用足趾容積測量儀測所有大鼠左右足的足趾容積,造模后每天測量CIA大鼠左足容積(原發腫脹),并同時于造模后10d開始隔天測對側足足趾容積;造模后12d開始關節炎指數評分,每隔2d評分1次,連續32d;末次給藥后1h,稱取大鼠的體質量,腹主動脈取血。

實驗結果表明,紫草提取物可抑制CIA大鼠的足爪腫脹(圖5、6),改善大鼠體重降低(圖7),降低多發性關節炎指數評分(圖8),減輕CIA大鼠的炎癥表現。

結論:紫草提取物對膠原誘導大鼠關節炎有明顯的治療作用。

試驗例4.紫草提取物對PDE4活性的抑制作用

4.1材料

受試樣品:紫草提取物,按實施例1制備。

4.2方法與結果

PDE4酶的提取方法參照文獻方法獲得[陳武,姜代勛,楊柳,等.豬嗜中性粒細胞cAMP磷酸二酯酶的提取與活性檢測[J].北京農學院學報,2003,18(4):242-244.],即參照上述文獻方法制備豬嗜中性粒細胞,粒細胞用Ca/Mg?PBS稀釋至約1011個/L,再將該稀釋液在冰浴中用玻璃勻漿器制成勻漿,顯微鏡下確認細胞被粉碎均勻,即得富含PDE4的酶樣。

首先測定酶的活性:cAMP用Ca/Mg?PBS配成100μmol.L-1,酶樣設4個取樣量,用Ca/Mg?PBS定容至100μL,加樣過程在冰浴中進行,具體加樣量見表2.加樣后各管置35℃中恒溫孵育30min,然后于100℃水浴中2-3min終止反應,各管于4℃15000r/min離心30min,取上清70μL,用超純水稀釋5倍(加入280μlddH2O),HPLC進樣20μL,254nm波長下檢測,流動相為甲醇∶磷酸緩沖液=10∶90。實驗結果詳見圖9。

表2:酶反應的加樣量

PDE活性以底物的水解百分率表示:

其次是測定紫草提取物對PDE活性的影響:酶反應在Ca/Mg?PBS中進行,cAMP用緩沖液配成100μmol.L-1,反應時取65μL,酶樣量30μL,藥物分五個不同濃度,用量為1μL,對照管和樣品管加入提取的PDE4酶樣,空白對照管加入滅活的酶樣,用緩沖液定容至100μL,加樣順序見表3。

表3酶反應加樣順序及劑量

加樣后各管置35℃中恒溫孵育30min,然后于100℃水浴中2-3min終止反應,各管于4℃15000r/min離心30min,取上清70μL,用超純水稀釋5倍(加入280μlddH2O),HPLC進?樣20μL,254nm波長下檢測,流動相為甲醇∶磷酸緩沖液=10∶90。結果詳見表4。

表4紫草提取物對PDE4活性的影響

4.3試驗結論:紫草提取物對PDE4具有抑制活性,當紫草提取物的濃度達到5000μg/ml時,對PDE4的抑制活性達到了91.2%。

試驗例5.紫草提取物抑制LPS誘導的小鼠巨噬細胞TNF-α和IL-1釋放的實驗

5.1材料

受試樣品:紫草提取物,按實施例1制備。

5.2方法與結果

取對數生長期的RAW264.7細胞,調整細胞密度為5×105cells/ml,將細胞懸液加入到96孔培養板中)(200μl/孔),放入二氧化碳培養箱中培養1小時,后加入LPS終濃度為1μg/ml和不同濃度的紫草提取物(終濃度為0.15,0.3,0.6,1.2,2.4μg/ml),加藥完成后,將96孔培養板放入CO2培養箱中培養6h,取細胞上消按照TNF-α和IL-1βELISA試劑盒說明書測定細胞上清中TNF-α和IL-1β的活性。結果詳見表5、6。

實驗結果表明在0.15~2.4μg/ml紫草提取物對LPS誘導的小鼠巨噬細胞RAW264.7的炎癥因子TNF-α和IL-1β的分泌具有抑制作用。

表5紫草提取物對LPS誘導小鼠巨噬細胞分泌的TNF-α抑制結果

表6紫草提取物對LPS誘導小鼠巨噬細胞分泌的IL-1β抑制結果

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一種 治療 類風濕性關節炎 紫草 提取物 及其 軟膠囊
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