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肽配體定向藥物遞送.pdf

摘要
申請專利號:

CN200880114789.6

申請日:

2008.11.05

公開號:

CN101855237B

公開日:

2014.10.22

當前法律狀態:

終止

有效性:

無權

法律詳情: 未繳年費專利權終止IPC(主分類):C07K 7/00申請日:20081105授權公告日:20141022終止日期:20151105|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C07K 7/00申請日:20081105|||公開
IPC分類號: C07K7/00; C07K17/08; A61K38/08; A61K9/127; A61K47/48; A61P35/00; C07K14/71 主分類號: C07K7/00
申請人: 上海交通大學
發明人: 徐宇虹; 宋姝賢; 劉丹
地址: 200240 中國上海市閔行區東川路800號
優先權: 2007.11.05 CN PCT/CN2007/003129
專利代理機構: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280 代理人: 曹津燕
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200880114789.6

授權公告號:

|||101855237B||||||

法律狀態公告日:

2016.12.21|||2014.10.22|||2010.11.24|||2010.10.06

法律狀態類型:

專利權的終止|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明基于其3D晶體結構,本發明提供了用于結合EGFR表面口袋的新型肽配體(Leu-Ala-Arg-Leu-Leu-Thr)。當與脂質體表面PEG部分的遠端接合時,肽定向脂質體被EGFR高表達的癌細胞(H1299和SPCA1)特異性且有效地結合和攝取。向細胞靶向遞送脂質體抗癌藥物阿霉素可以在體外獲得更好的療效。在體內,通過尾靜脈注射靶向脂質體,使用活體動物熒光顯像系統研究其在異種移植腫瘤組織中的分布和蓄積的時間過程。看到LARLLT靶向脂質體在腫瘤位點逐步富集,并且優選在注射后保持80小時以上。

權利要求書

1: 一種包含選自下列的序列的肽 : SEQ ID NO : 1、 SEQ ID NO : 3、 SEQID NO : 4、 SEQ ID NO : 5、 SEQ ID NO : 6、 SEQ ID NO : 7 和 SEQ ID NO : 8, 其中肽的長度為大約 6 個到大約 15 個 氨基酸。
2: 根據權利要求 1 所述的肽, 其包含 SEQ ID NO : 1。
3: 根據權利要求 1 所述的肽, 其由 SEQ ID NO : 1 組成。
4: 一種包含與肽結合的脂質的分子, 該肽包含選自下列的序列 : SEQID NO : 1、 SEQ ID NO : 3、 SEQ ID NO : 4、 SEQ ID NO : 5、 SEQ ID NO : 6、 SEQID NO : 7 和 SEQ ID NO : 8。
5: 根據權利要求 4 所述的分子, 其包含位于所述脂質和所述肽之間的接頭。
6: 根據權利要求 5 所述的分子, 其中所述脂質為 1, 2- 二硬脂酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷 酸乙醇胺 (DSPE)。
7: 根據權利要求 5 所述的分子, 其中所述接頭包含聚乙二醇 (PEG)。
8: 根據權利要求 4 所述的分子, 其包含 1, 2- 二硬脂酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸乙醇 胺 -N-[ 甲氧基 ( 聚乙二醇 )-2000](DSPE-PEG2000)。
9: 根據權利要求 4 所述的分子, 其包含 SEQ ID NO : 1。
10: 一種脂質體, 其包含 : 包含與肽結合的脂質的分子, 其中肽包含選自下列的序列 : SEQ ID NO : 1、 SEQ ID NO : 3、 SEQ IDNO : 4、 SEQ ID NO : 5、 SEQ ID NO : 6、 SEQ ID NO : 7 和 SEQ ID NO : 8。
11: 根據權利要求 10 所述的脂質體, 其中所述分子包含位于所述脂質和所述肽之間的 接頭。
12: 根據權利要求 10 所述的脂質體, 其中所述脂質為 1, 2- 二硬脂酰基 -sn- 甘油 基 -3- 磷酸乙醇胺 (DSPE)。
13: 根據權利要求 12 所述的脂質體, 其中所述接頭包含聚乙二醇 (PEG)。
14: 根據權利要求 12 所述的脂質體, 其包含 1, 2- 二硬脂酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸乙 醇胺 -N-[ 甲氧基 ( 聚乙二醇 )-2000](DSPE-PEG2000)-LARLLT。
15: 根據權利要求 10 所述的脂質體, 其中所述脂質體進一步包含選自下列的脂質 : 磷 脂酰膽堿、 磷脂酰甘油和溶血脂質。
16: 根據權利要求 10 所述的脂質體, 其中所述脂質體包括 1, 2- 二棕櫚酰基 -sn- 甘油 基 -3- 磷酸膽堿 (DPPC) 和單硬脂酰基磷脂酰膽堿 (MSPC)。
17: 根據權利要求 10 所述的脂質體, 其進一步包含選自治療化合物和顯像化合物的化 合物。
18: 根據權利要求 17 所述的脂質體, 其中所述脂質體包含雙分子層并限定內部空間, 所述化合物位于脂質體的內部空間、 脂質體的雙分子層之中或者位于內部空間和雙分子層 之中。
19: 根據權利要求 17 所述的脂質體, 其中所述治療化合物為抗癌化合物。
20: 根據權利要求 19 所述的脂質體, 其中所述抗癌化合物選自 : 烷化劑、 抗代謝物、 紡 錘體毒素植物生物堿、 細胞毒性抗腫瘤抗生素、 拓撲異構酶抑制劑、 單克隆抗體或其片段、 光敏劑、 激酶抑制劑、 抗腫瘤酶和酶的抑制劑、 細胞凋亡誘導劑、 生物反應調節劑、 抗激素、 類視黃醇和含鉑化合物。 2
21: 根據權利要求 19 所述的脂質體, 其中所述抗癌化合物選自 : 多烯紫衫醇、 阿霉素和 卡鉑。
22: 根據權利要求 17 所述的脂質體, 其包含顯像劑。
23: 根據權利要求 17 所述的脂質體, 其包括 1, 2- 二硬脂酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸乙 醇胺 -N-[ 甲氧基 ( 聚乙二醇 )-2000](DSPE-PEG2000)-LARLLT, 其中所述治療劑為卡鉑。
24: 一種向有需要的受試者給予化合物的方法, 其包括 : 將化合物與肽結合, 該肽包含選自下列的序列 : SEQ ID NO : 1、 SEQ IDNO : 3、 SEQ ID NO : 4、 SEQ ID NO : 5、 SEQ ID NO : 6、 SEQ ID NO : 7 和 SEQID NO : 8; 以及 用結合肽的化合物接觸受試者。
25: 根據權利要求 24 所述的方法, 其中所述肽連接脂質, 肽連接的脂質為脂質體形式。
26: 根據權利要求 24 所述的方法, 其中所述肽連接的脂質包含位于所述脂質和所述肽 之間的接頭。
27: 根據權利要求 25 所述的方法, 其中所述脂質為 1, 2- 二硬脂酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷 酸乙醇胺 (DSPE)。
28: 根據權利要求 26 所述的方法, 其中所述接頭包含聚乙二醇 (PEG)。
29: 根 據 權 利 要 求 25 所 述 的 方 法, 其 中 所 述 肽 連 接 的 脂 質 包 含 1, 2- 二 硬 脂 酰 基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸乙醇胺 -N-[ 甲氧基 ( 聚乙二醇 )-2000](DSPE-PEG2000)-LARLLT。
30: 根 據 權 利 要 求 24 所 述 的 方 法, 其 中 所 述 脂 質 體 進 一 步 包 含 1, 2- 二 棕 櫚 酰 基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸膽堿 (DPPC) 和單硬脂酰基磷脂酰膽堿 (MSPC), 其中所述脂質體具 有從大約 39.0℃到大約 45℃的凝膠向液體的相變溫度。
31: 根據權利要求 24 所述的方法, 其中所述脂質體進一步包含聚乙二醇化的脂質。
32: 根據權利要求 24 所述的方法, 其中所述化合物選自治療化合物和顯像化合物。
33: 根據權利要求 24 所述的方法, 其中所述脂質體包含雙分子層并限定內部空間, 所 述化合物位于脂質體的內部空間、 脂質體的雙分子層之中或者位于內部空間和雙分子層之 中。
34: 根據權利要求 32 所述的方法, 其中所述治療化合物為抗癌化合物。
35: 根據權利要求 34 所述的方法, 其中所述抗癌化合物選自 : 烷化劑、 抗代謝物、 紡錘 體毒素植物生物堿、 細胞毒性抗腫瘤抗生素、 拓撲異構酶抑制劑、 單克隆抗體或其片段、 光 敏劑、 激酶抑制劑、 抗腫瘤酶和酶的抑制劑、 細胞凋亡誘導劑、 生物反應調節劑、 抗激素、 類 視黃醇和含鉑化合物。
36: 根據權利要求 34 所述的方法, 其中所述抗癌化合物選自多烯紫衫醇、 阿霉素和卡 鉑。
37: 根據權利要求 32 所述的方法, 其中所述化合物為顯像劑。
38: 根據權利要求 24 所述的方法, 其中所述方法還包括加熱受試者的一部分。 39. 根據權利要求 38 所述的方法, 其中所述加熱包括應用電磁能量、 紅外輻射或超聲 波。 40. 一種治療有需要的受試者的癌癥的方法, 其包括 : 向受試者給予脂質體, 其中該脂質體包含與肽結合的脂質, 該肽包含選自下列的序列 : SEQ ID NO : 1、 SEQ ID NO : 3、 SEQ ID NO : 4、 SEQ IDNO : 5、 SEQ ID NO : 6、 SEQ ID NO : 7 和 SEQ 3 ID NO : 8, 并且脂質體包含抗癌化合物。 41. 根據權利要求 40 所述的方法, 其中所述肽連接脂質。 42. 根據權利要求 41 所述的方法, 其中所述肽連接的脂質包含位于所述脂質和所述肽 之間的接頭。 43. 根據權利要求 41 所述的方法, 其中所述脂質為 1, 2- 二硬脂酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷 酸乙醇胺 (DSPE)。 44. 根據權利要求 41 所述的方法, 其中所述接頭包括聚乙二醇 (PEG)。 45. 根 據 權 利 要 求 41 所 述 的 方 法, 其 中 所 述 肽 連 接 的 脂 質 包 含 1, 2- 二 硬 脂 酰 基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸乙醇胺 -N-[ 甲氧基 ( 聚乙二醇 )-2000](DSPE-PEG2000)-LARLLT。 46. 根 據 權 利 要 求 40 所 述 的 方 法, 其 中 所 述 脂 質 體 進 一 步 包 含 1, 2- 二 棕 櫚 酰 基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸膽堿 (DPPC) 和單硬脂酰基磷脂酰膽堿 (MSPC), 并且其中所述脂質 體具有從大約 39.0℃到大約 45℃的凝膠向液體的相變溫度。 47. 根據權利要求 40 所述的方法, 其中所述脂質體包含聚乙二醇化的脂質。 48. 根據權利要求 40 所述的方法, 其中所述脂質體包括雙分子層并限定內部空間, 所 述抗癌化合物位于脂質體的內部空間、 脂質體的雙分子層之中或者位于內部空間和雙分子 層之中。 49. 根據權利要求 40 所述的方法, 其中所述抗癌化合物選自烷化劑、 抗代謝物、 紡錘體 毒素植物生物堿、 細胞毒性抗腫瘤抗生素、 拓撲異構酶抑制劑、 單克隆抗體或其片段、 光敏 劑、 激酶抑制劑、 抗腫瘤酶和酶的抑制劑、 細胞凋亡誘導劑、 生物反應調節劑、 抗激素、 類視 黃醇和含鉑化合物。 50. 根據權利要求 40 所述的方法, 其中所述抗癌化合物選自多烯紫衫醇、 阿霉素和卡 鉑。 51. 根據權利要求 40 所述的方法, 其中所述方法進一步包括加熱受試者的一部分。 52. 根據權利要求 51 所述的方法, 其中所述加熱包括應用電磁能量、 紅外輻射或超聲 波。
39: 0℃到大約 45℃的凝膠向液體的相變溫度。 31. 根據權利要求 24 所述的方法, 其中所述脂質體進一步包含聚乙二醇化的脂質。 32. 根據權利要求 24 所述的方法, 其中所述化合物選自治療化合物和顯像化合物。 33. 根據權利要求 24 所述的方法, 其中所述脂質體包含雙分子層并限定內部空間, 所 述化合物位于脂質體的內部空間、 脂質體的雙分子層之中或者位于內部空間和雙分子層之 中。 34. 根據權利要求 32 所述的方法, 其中所述治療化合物為抗癌化合物。 35. 根據權利要求 34 所述的方法, 其中所述抗癌化合物選自 : 烷化劑、 抗代謝物、 紡錘 體毒素植物生物堿、 細胞毒性抗腫瘤抗生素、 拓撲異構酶抑制劑、 單克隆抗體或其片段、 光 敏劑、 激酶抑制劑、 抗腫瘤酶和酶的抑制劑、 細胞凋亡誘導劑、 生物反應調節劑、 抗激素、 類 視黃醇和含鉑化合物。 36. 根據權利要求 34 所述的方法, 其中所述抗癌化合物選自多烯紫衫醇、 阿霉素和卡 鉑。 37. 根據權利要求 32 所述的方法, 其中所述化合物為顯像劑。 38. 根據權利要求 24 所述的方法, 其中所述方法還包括加熱受試者的一部分。 39. 根據權利要求 38 所述的方法, 其中所述加熱包括應用電磁能量、 紅外輻射或超聲 波。
40: 一種治療有需要的受試者的癌癥的方法, 其包括 : 向受試者給予脂質體, 其中該脂質體包含與肽結合的脂質, 該肽包含選自下列的序列 : SEQ ID NO : 1、 SEQ ID NO : 3、 SEQ ID NO : 4、 SEQ IDNO : 5、 SEQ ID NO : 6、 SEQ ID NO : 7 和 SEQ 3 ID NO : 8, 并且脂質體包含抗癌化合物。
41: 根據權利要求 40 所述的方法, 其中所述肽連接脂質。
42: 根據權利要求 41 所述的方法, 其中所述肽連接的脂質包含位于所述脂質和所述肽 之間的接頭。
43: 根據權利要求 41 所述的方法, 其中所述脂質為 1, 2- 二硬脂酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷 酸乙醇胺 (DSPE)。
44: 根據權利要求 41 所述的方法, 其中所述接頭包括聚乙二醇 (PEG)。
45: 根 據 權 利 要 求 41 所 述 的 方 法, 其 中 所 述 肽 連 接 的 脂 質 包 含 1, 2- 二 硬 脂 酰 基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸乙醇胺 -N-[ 甲氧基 ( 聚乙二醇 )-2000](DSPE-PEG2000)-LARLLT。
46: 根 據 權 利 要 求 40 所 述 的 方 法, 其 中 所 述 脂 質 體 進 一 步 包 含 1, 2- 二 棕 櫚 酰 基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸膽堿 (DPPC) 和單硬脂酰基磷脂酰膽堿 (MSPC), 并且其中所述脂質 體具有從大約 39.0℃到大約 45℃的凝膠向液體的相變溫度。
47: 根據權利要求 40 所述的方法, 其中所述脂質體包含聚乙二醇化的脂質。
48: 根據權利要求 40 所述的方法, 其中所述脂質體包括雙分子層并限定內部空間, 所 述抗癌化合物位于脂質體的內部空間、 脂質體的雙分子層之中或者位于內部空間和雙分子 層之中。
49: 根據權利要求 40 所述的方法, 其中所述抗癌化合物選自烷化劑、 抗代謝物、 紡錘體 毒素植物生物堿、 細胞毒性抗腫瘤抗生素、 拓撲異構酶抑制劑、 單克隆抗體或其片段、 光敏 劑、 激酶抑制劑、 抗腫瘤酶和酶的抑制劑、 細胞凋亡誘導劑、 生物反應調節劑、 抗激素、 類視 黃醇和含鉑化合物。
50: 根據權利要求 40 所述的方法, 其中所述抗癌化合物選自多烯紫衫醇、 阿霉素和卡 鉑。
51: 根據權利要求 40 所述的方法, 其中所述方法進一步包括加熱受試者的一部分。
52: 根據權利要求 51 所述的方法, 其中所述加熱包括應用電磁能量、 紅外輻射或超聲 波。

說明書


肽配體定向藥物遞送

    發明背景
     在癌癥的治療中, 廣泛使用了化學療法, 但藥物對正常組織的毒性導致的嚴重副 作用經常削弱其療效。為了改善化療劑的治療指數, 許多研究已經將重點放在向腫瘤組織 特異性遞送藥物, 而避免向正常組織遞送藥物的策略上。
     已經開發并且已經在患者中使用了幾種基于脂質體的抗癌藥物制劑, 與非脂質體 制劑相比, 它們具有更好的療效和更小的副作用。Doxil( 也被稱為 Caelyx) 是最成功的產 品之一 (1), 其包含涂覆 PEG 的脂質體 ( 隱形脂質體 ), 具有延長的血清半衰期和通過滲漏 脈管系統 (leakyvasculatures) 逐步外滲并在腫瘤中蓄積的能力。除了這樣的被動靶向機 制外, 還提出了主動靶向策略, 其中使用抗體或靶向配體對脂質體定向, 以進一步促進載藥 脂質體與腫瘤之間的相互作用。已經對抗體靶向免疫脂質體進行了深入研究, 并且在動物 和臨床研究中都表現出潛力 (2-6)。同時, 為了治療癌癥, 還檢驗了以小分子配體 (7, 8) 和 肽 (9, 10) 構建主動靶向脂質體。
     與計算機模擬 (in silico) 或體外 (in vitro) 結合研究相比, 用于結合的體內 (in vivo) 環境復雜得多, 其中有許多解剖學上的屏障以及來自如網狀內皮系統 (RES) 的 天然清除機制和其他非特異性相互作用的干擾。 已經利用免疫脂質體和小分子靶向脂質體 確定了許多變量 (variables)(33, 34)。已經確定了幾種影響各種主動靶向脂質體的藥物 代謝動力學特性和外滲行為的因素 (33, 34)。對表面結合的配體的免疫清除是主要關注點 (35, 36)。發現包含 IgG 的免疫脂質體與 Fc 受體相互作用并被迅速清除 (37, 38, 39)。甚至 小分子配體葉酸的結合都會導致體內脂質體的 RES 清除增強 (8)。 此外, 還發現表面配體密 度 (40) 和 PEG 接頭的長度 (8, 9) 都很重要。
     表皮生長因子受體 (EGFR) 在很多種人類癌癥中過表達, 包括但不限于肺癌、 乳腺 癌、 膀胱癌和卵巢癌。還發現其與各種晚期疾病和不良預后的特征有關 (11)。已有報道稱 各種 EGFR 靶向載體和接合物能夠提高細胞毒性藥物、 毒素或放射性核素向癌細胞的遞送, 并抑制動物模型中腫瘤的生長 (12-16)。Mamot 及其同事開發出一種 EGFR 特異性免疫脂質 體, 一系列研究表明其在體內和體外都有較好的遞送特性和抗腫瘤效果 (17-19)。
     已經有幾種藥物被成功地開發成 EGFR 靶向, 包括酪氨酸激酶抑制劑特羅凱
     () 和易瑞沙(), 以及其封閉抗體愛必妥()。除了設計定向于 EGFR 的藥物外, 其他策略是開發能夠將現有治療劑定向至 EGFR 的系統。許多研 究已經開發出利用其天然配體 - 表皮生長因子 (EGF), 來靶向遞送細胞毒性藥物、 毒素、 脂 質體, 以及其它藥物 / 基因遞送系統和放射性核素系統 (12-15)。 但是 EGF 對癌癥細胞的內 源性促增殖效應一直是關注點。提出了兩種其它策略。一種是使用抗體或抗體片段來定向 結合到 EGFR(17, 18, 27), 另一種是使用較小的肽或 EGF 片段 (12, 28, 29)。能與 EGFR 強有 力地特異性結合, 但具有小免疫原性和促增殖效應的小肽是非常需要的。
     在本領域內還需要有效地向靶細胞, 例如 EGFR 過表達的細胞遞送治療劑的材料 和方法。本發明滿足了這種需求及其他需求。
     發明概述本發明提供能夠用于向期望的靶細胞遞送藥物, 例如治療劑和 / 或顯像劑的肽。 在一個實施方案中, 本發明提供的肽包含選自下列的序列 : SEQID NO : 1、 SEQ ID NO : 3、 SEQ ID NO : 4、 SEQ ID NO : 5、 SEQ ID NO : 6、 SEQID NO : 7 和 SEQ ID NO : 8。在一個實施方案中, 肽可以包含序列 LARLLT(SEQ ID NO : 1)。本發明的肽可以是任意長度, 例如長度為從大約 6 個氨基酸到大約 15 個氨基酸或從大約 6 個氨基酸到大約 10 個氨基酸。本發明的肽的長 度可以是 6、 7、 8、 9、 10 或更多個氨基酸。在某些實施方案中, 本發明的肽的長度為 6 個氨基 酸, 并由選自 SEQ ID NO : 1、 SEQ ID NO : 3、 SEQ ID NO : 4、 SEQ ID NO : 5、 SEQ ID NO : 6、 SEQ ID NO : 7 和 SEQ ID NO : 8 的序列組成。在某些實施方案中, 本發明的肽可以由氨基酸序列 LARLLT 組成。 本發明還提供了模擬本發明的肽的 EGFR 結合活性的模擬肽, 以及保留其功能 的氨基酸取代。
     在另一個實施方案中, 本發明的肽和模擬肽可以直接或間接地連接一種或多種化 合物。在某些實施方案中, 本發明的肽與治療劑和 / 或顯像劑連接。在一個實施方案中, 本 發明提供了包含脂質和肽的分子, 所述肽包含選自下列的序列 : SEQ ID NO : 1、 SEQ ID NO : 3、 SEQ ID NO : 4、 SEQ IDNO : 5、 SEQ ID NO : 6、 SEQ ID NO : 7 和 SEQ ID NO : 8。在某些實施方 案中, 肽可以包含序列 LARLLT。 任選地, 肽可以通過使用接頭間接地連接到脂質。 可以使用 本領域技術人員已知的任何接頭。 可以與本發明的肽和模擬肽連接的適合脂質的例子包括 但不限于, 1, 2- 二硬脂酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸乙醇胺 (DSPE)。在某些實施方案中, 接頭 可以包括聚乙二醇 (PEG)。連接接頭的脂質的例子為 1, 2- 二硬脂酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷 酸乙醇胺 -N-[ 甲氧基 ( 聚乙二醇 )-2000](DSPE-PEG2000)。 這樣的分子可以進一步連接一 種或多種本發明的肽和模擬肽。
     本發明的肽和模擬肽可以連接活性劑, 例如治療劑和 / 或顯像劑。連接可以是直 接或間接的。 本發明的肽和模擬肽可以通過肽或模擬肽與活性劑上的官能團直接反應來連 接活性劑。本發明的肽和模擬肽可以通過肽和活性劑與接頭反應間接連接活性劑。通常, 接頭為能夠與肽和活性劑都形成共價連接的雙官能分子。
     在另一個實施方案中, 本發明包括脂質體。本發明的脂質體的例子為包含含有本 發明的脂質和肽的分子的脂質體, 例如所述肽包含選自下列的序列 : SEQ ID NO : 1、 SEQ ID NO : 3、 SEQ ID NO : 4、 SEQ ID NO : 5、 SEQ IDNO : 6、 SEQ ID NO : 7 和 SEQ ID NO : 8。在某些實 施方案中, 肽可以包含序列 LARLLT。 如上所述, 用于本發明的脂質體的分子可以包含位于脂 質部分與肽部分之間的接頭。在一個實施方案中, 脂質可以為 1, 2- 二硬脂酰基 -sn- 甘油 基 -3- 磷酸乙醇胺 (DSPE)。 在一個實施方案中, 接頭可以為聚乙二醇 (PEG)。 在一個實施方 案中, 脂質 - 接頭 - 肽的組合可以為 1, 2- 二硬脂酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸乙醇胺 -N-[ 甲 氧基 ( 聚乙二醇 )-2000](DSPE-PEG2000)-LARLLT。 本發明的脂質體可以使用任何本領域技 術人員已知的脂質或脂質組合來制備。 可以用于制備脂質體的適合脂質的例子包括但不限 于磷脂 ( 例如, 磷脂酰膽堿、 磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺 ), 溶血脂質和聚乙二醇化的磷脂。 適合的脂質可以以任意比率組合。 任選地, 用于本發明的脂質體可以為熱敏脂質體, 其由具 有從大約 39.0℃到大約 45℃的凝膠向液體的相變溫度的脂質組成。基于摩爾百分比, 一個 適合的脂質體的例子可以包含的 DPPC ∶ MSPC 的比率為 99 ∶ 1、 98 ∶ 2、 97 ∶ 3、 96 ∶ 4、 95 ∶ 5、 90 ∶ 10 到大約 80 ∶ 20、 75 ∶ 25、 70 ∶ 30、 65 ∶ 35、 60 ∶ 40 或甚至 51 ∶ 49。可 以將一種或多種其他脂質 ( 例如肽 - 接頭 - 脂質和 / 或聚乙二醇化的脂質 ) 結合到熱敏脂質體中。 本發明的脂質體可以進一步包含一種或多種選自治療化合物和顯像化合物的化 合物。 通常, 本發明的脂質體包括雙分子層并限定內部空間, 且化合物處在脂質體的內部空 間、 脂質體的雙分子層之中或者處在內部空間和雙分子層之中。 在某些實施方案中, 化合物 可以與脂質體外部相結合。 一種適合包含在本發明脂質體中的化合物類型的例子為抗癌化 合物。適合的抗癌化合物的例子包括但不限于烷化劑、 抗代謝物、 紡錘體毒素植物生物堿、 細胞毒性抗腫瘤抗生素、 拓撲異構酶抑制劑、 單克隆抗體或其片段、 光敏劑、 激酶抑制劑、 抗 腫瘤酶和酶的抑制劑、 細胞凋亡誘導劑、 生物反應調節劑、 抗激素、 類視黃醇和含鉑化合物。 在某些實施方案中, 本發明的脂質體可以包含多烯紫衫醇。 在某些實施方案中, 本發明的脂 質體可以包含阿霉素。 在某些實施方案中, 本發明的脂質體可以包含含鉑化合物, 例如卡鉑 或順鉑。
     本發明還提供了向需要化合物的受試者給予化合物的方法。 此方法通常包括使化 合物與肽結合, 所述肽包含選自下列的序列 : SEQ ID NO : 1、 SEQ ID NO : 3、 SEQ ID NO : 4、 SEQ ID NO : 5、 SEQ ID NO : 6、 SEQ ID NO : 7 和 SEQ ID NO : 8, 以及用肽 - 結合的化合物接觸受試 者。在某些實施方案中, 肽可以包含序列 LARLLT。結合可以為共價或非共價的。在某些實 施方案中, 肽可以直接或間接地連接活性劑。在某些實施方案中, 肽連接脂質且肽 - 連接的 脂質是脂質體形式。被遞送的化合物可以是脂質體的一部分, 例如位于脂質雙分子層之中 或者可以包含在脂質體的內部空間中。備選地, 肽可以連接化合物, 而化合物可以被包括 在脂質體中, 例如在脂質體雙分子層之中或內部空間中。當肽連接脂質時, 肽 - 連接的脂質 可以包含位于脂質和肽之間的接頭。用于本發明方法的合適脂質的例子為 1, 2- 二硬脂酰 基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸乙醇胺 (DSPE)。適合的接頭可以包括聚乙二醇 (PEG)。因此, 通過
     接頭連接本發明的肽的脂質的例子為 1, 2- 二硬脂酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸乙醇胺 -N-[ 甲 氧基 ( 聚乙二醇 )-2000](DSPE-PEG2000)-LARLLT, 其可以結合到脂質體中并用在本發明的 方法中。本領域技術人員已知的任何其他脂質都可以包括在本發明包含脂質 - 接頭 - 肽的 脂質體之中。在某些本發明的方法中, 化合物可以與包含上述肽 - 接頭 - 脂質的脂質體相 結合, 并且脂質體可以具有從大約 39.0℃到大約 45℃的凝膠向液體的相變溫度。可以向有 需要的受試者給予這種脂質體, 并且受試者的一部分可以被加熱到高于脂質體凝膠向液體 的相變溫度的溫度。
     可以使用任何合適的加熱靶組織的方法, 例如應用射頻輻射, 應用可以是高強度 聚焦超聲的超聲, 應用微波輻射, 如溫水浴、 光的產生紅外輻射的來源以及如放射性同位 素、 或電場和磁場產生的輻射的其他形式外部和內部應用的輻射。
     可以使用本發明的方法給予任何化合物。可以給予的化合物的合適的例子包括 但不限于治療化合物和顯像化合物, 其直接或間接地連接本發明的肽或可以包括在脂質體 中, 該脂質體包含連接到本發明的肽的脂質。 在本發明的一個方法中, 脂質體可以包含雙分 子層并限定內部空間, 化合物可以處在脂質體的內部空間、 脂質體的雙分子層或者內部空 間和雙分子層之中。本發明的方法可以用于遞送治療性化合物, 例如抗癌化合物。抗癌化 合物包括但不限于烷化劑、 抗代謝物、 紡錘體毒素植物生物堿、 細胞毒性抗腫瘤抗生素、 拓 撲異構酶抑制劑、 單克隆抗體或其片段、 光敏劑、 激酶抑制劑、 抗腫瘤酶和酶的抑制劑、 細胞 凋亡誘導劑、 生物反應調節劑、 抗激素、 類視黃醇和含鉑化合物。 在某些實施方案中, 本發明的方法可以用于遞送多烯紫衫醇。 在某些實施方案中, 本發明的方法可以用于遞送阿霉素。 在某些實施方案中, 本發明的方法可以用于遞送含鉑化合物, 例如卡鉑或順鉑。
     在一個實施方案中, 本發明提供了治療癌癥的方法。該方法可以包括向有需要 的受試者給予與本發明的肽結合的抗癌化合物。一個結合的例子是將本發明的肽直接或 間接地連接抗癌化合物。另一個例子是將抗癌化合物包括在脂質體中, 其中該脂質體包 含與肽結合的脂質, 該肽包含選自下列的序列 : SEQ ID NO : 1、 SEQ ID NO : 3、 SEQ ID NO : 4、 SEQ ID NO : 5、 SEQ ID NO : 6、 SEQ ID NO : 7 和 SEQ ID NO : 8。在某些實施方案中, 肽可 以包含序列 LARLLT。通常, 肽直接或通過接頭連接脂質。合適的脂質為 1, 2- 二硬脂酰 基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸乙醇胺 (DSPE)。合適的接頭為聚乙二醇 (PEG)。因此, 在一個例 子中, 肽 - 接頭 - 脂質可以結合到脂質體中, 脂質體用于遞送抗癌化合物, 該肽 - 接頭 - 脂 質 為 1, 2- 二 硬 脂 酰 基 -sn- 甘 油 基 -3- 磷 酸 乙 醇 胺 -N-[ 甲 氧 基 ( 聚 乙 二 醇 )-2000] (DSPE-PEG2000)-LARLLT。可以用于制備脂質體的合適脂質的例子包括但不限于, 磷脂 ( 例 如, 磷脂酰膽堿、 磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺 ), 溶血脂質和聚乙二醇化的磷脂。任選地, 用 于本發明治療癌癥的方法的脂質體可以具有從大約 39.0℃到大約 45℃的凝膠向液體的相 變溫度。按摩爾百分比計, 一個合適的脂質體的例子包含的 DPPC ∶ MSPC 的比率為 99 ∶ 1、 98 ∶ 2、 97 ∶ 3、 96 ∶ 4、 95 ∶ 5、 90 ∶ 10 到大約 80 ∶ 20、 75 ∶ 25、 70 ∶ 30、 65 ∶ 35、 60 ∶ 40 或甚至 51 ∶ 49。可以將肽 - 接頭 - 脂質結合到脂質體中。可以使用的任何已知的抗癌劑 包括但不限于, 烷化劑、 抗代謝物、 紡錘體毒素植物生物堿、 細胞毒性抗腫瘤抗生素、 拓撲異 構酶抑制劑、 單克隆抗體或其片段、 光敏劑、 激酶抑制劑、 抗腫瘤酶和酶的抑制劑、 細胞凋亡 誘導劑、 生物反應調節劑、 抗激素、 類視黃醇和含鉑化合物。 在某些實施方案中, 抗癌化合物 可以為多烯紫衫醇。在某些實施方案中, 抗癌化合物可以為阿霉素。在某些實施方案中, 抗 癌化合物可以為含鉑化合物, 例如卡鉑。 在某些本發明治療癌癥的方法中, 抗癌化合物可以 與包含上述肽 - 接頭 - 脂質的脂質體相結合, 并且脂質體具有從大約 39.0℃到大約 45℃的 凝膠向液體的相變溫度。該方法可以進一步包括加熱受試者的一部分。可以使用任何加熱 受試者的方法, 例如應用微波能量、 其他電磁波能量、 射頻消融、 高強度聚焦超聲、 超聲波、 應用熱水等。
     附圖簡述
     圖 1.EGFR 上 LARLLT 和對照肽的對接結構 (Docked structure)。A. 來自 PDB 的 EGFR 結構模型, 填充星號的區域為 EGF 結合位點, 圈出的區域為我們選擇用于對接的結合 口袋。B.EGFR 口袋內 LARLLT 的最低能量對接構象。肽以球 - 棒模式表示。潛在的氫鍵以 圓柱體示出。C.EGFR 口袋內對照肽的最低能量對接構象。
     圖 2. 配體定向結合到 EGFR 高表達細胞的脂質體的熒光顯微鏡研究。區域 A : LARLLT、 對照肽和 EGF 靶向脂質體與 H1299 細胞的結合。(i)LARLLT 脂質體, (iii)EGF 脂質 體, (v) 對照肽脂質體。(ii)、 (iv)、 (vi) 為 (i)、 (ii)、 (v) 中相同區域的相差顯微圖。區 域B: 在 50x 摩爾過量的游離配體存在下, 在 4℃或 37℃下 LARLLT 靶向脂質體與 H1299 的 結合。(i) 在 37℃下采用過量游離 LARLLT 時的結合, (ii) 在 37℃下無游離 LARLLT 時的結 合, (iii) 在 4℃下采用過量游離 LARLLT 時的結合, (iv) 在 4℃下無游離 LARLLT 時的結合, (v) 在 37℃下采用過量游離 EGF 時的結合, 以及 (vi) 在 37℃下無游離 EGF 時的結合。區域 C: LARLLT、 對照肽脂質體與 SPC-A1 細胞的結合。(i)LARLLT 脂質體, (iii) 對照肽脂質體,(ii) 和 (iv) 為 (i) 和 (iii) 中相同區域的相差顯微圖。
     圖 3.H1299 細胞對接合 LARLLT 的脂質體的內化。A. 胞飲的 LARLLT 脂質體的相差 和熒光圖像的疊加。 B. 使用共焦熒光顯微鏡的 Z stack 掃描模式得到的從細胞的頂部到底 部的 11 張切片。
     圖 4. 包含阿霉素的靶向脂質體的細胞殺傷作用。A.H1299 細胞。計算的采用 LARLLT 脂質體 ( 黑菱形 ) 時的 IC50 為~ 13μg/ml, 對照肽脂質體 ( 空方形 ) 為 85μg/ml, 以及單獨的游離阿霉素 ( 黑三角 ) 為 5.7μg/ml ; B.SPCA1 細胞。計算的采用 LARLLT 脂質 體 ( 黑菱形 ) 時的 IC50 為~ 5μg/ml, 對照肽脂質體 ( 空方形 ) 為 15μg/ml, 以及單獨的 游離阿霉素 ( 黑三角 ) 為 2μg/ml。
     圖 5. 荷瘤小鼠中 Cy5.5 和 Cy5.5 標記的肽的熒光圖。所示圖像是在注射游離的 Cy5.5 染料、 LARLLT-Cy5.5 和對照肽 -Cy5.5 的 1 小時和 6 小時后拍攝的。
     圖 6. 肽定向脂質體在腫瘤組織中的分布和蓄積的熒光圖。 所示圖像 ( 從左到右 ) 為小鼠的彩圖 (light picture), 在注射 LARLLT 脂質體 ( 上列 ) 和對照肽脂質體 ( 下列 )1 小時、 6 小時、 12 小時、 24 小時、 48 小時和 80 時之后拍攝的熒光圖。
     圖 7 為顯示在藥物注射后的不同時間點, 在裸鼠的異種移植 H460 瘤塊內蓄積的阿 霉素的濃度的柱狀圖。實心黑柱代表注射阿霉素溶液后的腫瘤阿霉素濃度。帶虛線的黑柱 代表注射常規阿霉素脂質體后的腫瘤阿霉素濃度, 帶波浪線的黑柱代表注射 LARLLT 修飾 的阿霉素脂質體后的腫瘤阿霉素的濃度。
     圖 8 為顯示用各種包含濃度為 0.01 到 10μg/ml 的阿霉素的制劑處理 H460 細胞 時觀測到的熒光的線圖。x =游離阿霉素, ◇= D4* 脂質體, ▲= D44+4 脂質體, ○= D42+2 * 脂質體, ●= Thermodox 脂質體。D4 為包含 SEQID NO : 1 的脂質體, D4 為包含 SEQ ID NO : 2 的脂質體。D4-ThermoDox2+2 包含的 DPPC ∶ MSPC ∶ DSPE-MPEG2000 ∶ D4-DSPE-MPEG2000 的摩爾比為 90 ∶ 10 ∶ 2 ∶ 2, 以及 D4-ThermoDox4+4 包含的 DPPC ∶ MSPC ∶ DSPE-MPEG2000 ∶ D4-DSPE-MPEG2000 的摩爾比為 90 ∶ 10 ∶ 4 ∶ 4。 D4*-ThermoDox 包含的 DPPC ∶ MSPC ∶ DSPE-MPEG2000 ∶ D4*-DSPE-MPEG2000 的摩爾比為 90 ∶ 10 ∶ 2 ∶ 2。
     發明詳述
     肽
     本發明提供的小肽能夠與 EGFR 強有力且特異性地結合。通常, 本發明的肽和模擬 肽能夠與 EGFR 結合且不會誘發免疫原性反應和 / 或促增殖效應。
     本發明的示例性肽為包含氨基酸序列 Leu Ala Arg Leu Leu Thr(SEQID NO : 1) 的 肽。本發明的肽的另外例子包括但不限于, 其中 SEQ ID NO : 1 中的一個或多個氨基酸被不 同的氨基酸取代的肽。在某些實施方案中, SEQID NO : 1 中僅有一個位點將被取代。在某些 實施方案中, SEQ ID NO : 1 中有一個以上的位點將被取代。 SEQ ID NO : 1 的任意位點都可以 被取代。在某些實施方案中, SEQ ID NO : 1 中的一個或多個位點將被一個或多個天然存在 的氨基酸取代。在某些實施方案中, SEQ ID NO : 1 中的一個或多個位點將被一個或多個非 天然存在的氨基酸取代。在某些實施方案中, 本發明的肽可以包含一個或多個 D- 氨基酸。
     通常, 本發明的肽的氨基酸取代可以為保守取代。本發明所使用的保守取代是指 用一個物理和 / 或化學特性相似的氨基酸取代另一個氨基酸。標準的遺傳學上的編碼氨基 酸可以根據其特性, 尤其是極性和電荷進行分類。一種簡便的分組如下 : 甘氨酸和丙氨酸 ;絲氨酸、 蘇氨酸、 天冬酰胺、 谷氨酰胺和半胱氨酸 ; 賴氨酸、 精氨酸和組氨酸 ; 天冬氨酸和谷 氨酸 ; 纈氨酸、 亮氨酸、 異亮氨酸和蛋氨酸 ; 以及苯丙氨酸、 色氨酸和酪氨酸。來自一個組的 氨基酸被相同組中的另一種氨基酸取代被稱之為 “保守取代” 。 該取代通常不會從本質上影 響本發明的肽的性質, 例如與 EGFR 結合的能力。本發明的肽包括與 SEQ ID NO : 1 的區別僅 在于有一個或多個保守取代的肽。
     本發明的肽的例子包括但不限于 :
     Leu Ala Arg Leu Leu Thr(SEQ ID NO : 1)
     Xaa1Ala Arg Leu Leu Thr(SEQ ID NO : 3)
     Leu Xaa2Arg Leu Leu Thr(SEQ ID NO : 4)
     Leu Ala Xaa3Leu Leu Thr(SEQ ID NO : 5)
     Leu Ala Arg Xaa4Leu Thr(SEQ ID NO : 6)
     Leu Ala Arg Leu Xaa5Thr(SEQ ID NO : 7)
     Leu Ala Arg Leu Leu Xaa6(SEQ ID NO : 8)
     Xaa1 選自纈氨酸、 異亮氨酸和蛋氨酸 ; Xaa2 是甘氨酸 ; Xaa3 選自賴氨酸和組氨酸 ; Xaa4 選自纈氨酸、 異亮氨酸和蛋氨酸 ; Xaa5 選自纈氨酸、 異亮氨酸和蛋氨酸 ; 以及 Xaa6 選自 絲氨酸、 天冬酰胺、 谷氨酰胺和半胱氨酸。本發明還涉及包含多于一個上述取代的肽。 此外, 本發明涉及表現出與本發明的肽相同的結合 EGFR 能力的非肽化合物。這 種能夠模仿本發明的肽的活性的模擬肽或 “小分子” 可以用于實施本發明。本領域技術人 員能夠利用熟知的技術設計出模擬肽, 如在 Fauchere J., Adv.Drug Res.15 : 29(1986) ; 和 Evans 等, J.Med.Chem.30 : 1229(1987) 中描述的技術。
     可以以類似于本發明的肽的方式使用具有結合 EGFR 能力的模擬肽。通常, 這樣的 模擬肽具有的一個或多個肽鍵任選地被可以轉化為具有期望性質的鍵取代, 期望的性質如 對體內化學降解有抗性。這種鍵包括但不限于 --CH2NH--、 --CH2S--、 --CH2CH2--、 --CH = CH--、 --COCH2--、 --CH(OH)CH2-- 和 --CH2SO--。
     本發明的肽和模擬肽可以與任何期望的物質相結合, 以將物質遞送到期望的靶細 胞。合適的物質的例子包括但不限于, 化合物 ( 例如, 活性劑、 治療劑、 顯像劑等 ), 脂質體 ( 例如, 熱敏脂質體和隱形脂質體 ) 和納米顆粒 ( 例如, 蛋白納米顆粒、 金屬納米顆粒和結晶 小分子納米顆粒 )。
     本發明的肽和模擬肽與被遞送的物質的結合可以為共價或非共價的, 以及直接或 間接的。在某些實施方案中, 本發明的肽可以共價地連接到被遞送的物質上, 例如通過接 頭。
     接頭的例子為能夠共價連接本發明的肽和被遞送的物質的交聯劑。 交聯劑通常與 本發明的肽和被連接的物質上存在的功能基團 ( 例如 -OH、 NH2、 COOH 和 -SH 基團 ) 反應。由 于不同交聯劑與不同功能基團反應的能力不同, 可以選擇不同的交聯劑。
     通過本領域目前已知的活化官能團接合或偶聯多肽的技術是特別適用的。參 見, 例 如 Aurameas 等, Scand.J.Immunol., Vol.8, Suppl.7 : 7-23(1978) 和 美 國 專 利 第 4,493,795、 3,791,932 和 3,839,153 號, 它們被特別引入本發明作為肽偶聯的公開內容。 此 外, 可以進行位點定向的偶聯反應從而將偶聯后多肽定向造成的任何活性損失減至最小。 參見, 例如 Rodwell 等, Biotech., 3: 889-894(1985), 和美國專利第 4,671,958 號。示例性
     的加成連接方法包括使用 Michael 加成反應產物, 二醛如戊二醛, Klipstein 等, J.Infect. Dis., 147 : 318-326(1983) 等, 或使用碳二亞胺技術, 正如使用水溶性碳二亞胺形成酰胺 鍵。備選地, 可以使用異型雙官能交聯劑 SPDP(N- 琥珀酰亞胺 -3-(2- 吡啶二硫代 )- 丙酸 酯 ) 接合肽, 其中已經引入了 N- 或 C- 端半胱氨酸。
     本發明闡明的肽與活性劑的接合, 可以受到本領域熟知的化學接合方法的影響, 如形成肽鍵、 使用縮合劑、 利用熟知的雙功能交聯試劑。接合可以是直接地, 包括不涉及任 何插入部分的鍵, 例如直接的肽鍵, 或者間接的, 其中包含插入部分的鍵, 如蛋白質或肽, 例 如血漿白蛋白或其他間隔 (spacer) 分子。例如, 鍵可以通過異型雙官能團或同型雙官能交 聯劑, 例如碳二亞胺、 戊二醛、 N- 琥珀酰亞胺 -3-(2- 吡啶二硫代 )- 丙酸酯 (SPDP) 及衍生 物、 雙馬來酰亞胺、 4-(N- 馬來酰亞胺基甲基 ) 環己烷 -1- 羧酸酯等形成。 還可以在不使用外 加交聯劑的情況下, 通過利用被接合分子上的反應基團來完成交聯。化學交聯肽分子的方 法是本領域內普遍知曉的, 并且多種異型或同型雙官能試劑在例如美國專利第 4,355,023、 4,657,853、 4,676,980、 4,925,921 和 4,970,156 中有描述, 其他的交聯試劑可通過商業 途徑獲得, 例如來自 Pierce Chemical Co., Rockford, IL.61105, 其中每一篇都引入本發 明作為參考。在生理條件下, 可以采用可裂解交聯劑, 尤其是形成可裂解的二硫鍵的交聯 劑, 使接合物裂解形成游離的治療劑。這種可裂解的交聯劑的例子為 4- 琥珀酰亞胺氧羰 基 -a-(2- 吡啶二硫代 )- 甲苯。進行這樣的接合, 包括交聯, 應當不會實質上影響肽或與其 結合的活性劑的所需功能。 在本發明的一個實施方案中, 本發明的肽和模擬肽可以連接納米顆粒。可以使 用多種納米顆粒, 如不同的聚合物納米微粒和金屬納米微粒、 脂質體、 囊泡 (niosomes)、 固體脂質顆粒、 膠束、 量子點、 樹枝狀化合物 (dendrimers)、 微囊、 細胞、 細胞形骸 (cell ghosts)、 脂蛋白和不同的納米裝配體 (nanoassemblies)。 蛋白納米顆粒可以使用本領域中 任何已知的技術制備, 例如使用改進的去溶劑化 - 交聯法。水溶液中的蛋白 (2%, w/v) 可 以與活性劑在緩沖液中孵育, 然后逐滴加入乙醇形成結合活性劑的蛋白納米顆粒。這些可 以與本發明的肽交聯, 例如使用戊二醛。 利用硼氫化鈉作為還原劑, 根據標準濕化學方法可 以合成金納米顆粒。
     在一個實施方案中, 本發明的肽和模擬肽可以連接脂質, 包括但不限于直接連接 到脂質的頭部基團區域, 或者通過如聚合物 ( 例如 PEG) 的接頭連接到頭部基團區域, 并結 合到脂質體中。脂質體 ( 可以是熱敏脂質體, 即具有從大約 39.0℃到大約 45℃的凝膠向液 體的相變溫度的脂質體 ) 通常包含活性劑 ( 例如, 治療劑和 / 或顯像劑 )。
     本發明的脂質體通常包含一種或多種磷脂酰膽堿。 可以用于實施本發明的磷脂酰 膽堿的適合例子包括但不限于, 1, 2- 二月桂酰 -sn- 甘油基 -3- 磷酸膽堿 (DLPC)、 1, 2- 二肉 豆蔻酰 -sn- 甘油基 -3- 磷酸膽堿 (DMPC)、 1, 2- 二棕櫚酰 -sn- 甘油基 -3- 磷酸膽堿 (DPPC)、 1, 2- 二硬脂酰 -sn- 甘油基 -3- 磷酸膽堿 (DSPC)、 1, 2- 二油酰 -sn- 甘油基 -3- 磷酸膽堿 (DOPC) 和 1- 棕櫚酰 -2- 由酰 -sn- 甘油基 -3- 磷酸膽堿 (POPC)。
     本發明的脂質體通常包含一種或多種磷脂酰甘油, 磷脂酰甘油的適合的例子包 括但不限于, 1, 2- 二肉豆蔻酰 -sn- 甘油基 -3- 磷酸甘油 (DMPG)、 1, 2- 二棕櫚酰 -sn- 甘 油基 -3- 磷酸甘油 (DPPG)、 1, 2- 二硬脂酰 -sn- 甘油基 -3- 磷酸甘油 (DSPG) 和 1- 棕櫚 酰 -2- 油酰 -sn- 甘油基 -3- 磷酸甘油 (POPG)。
     本發明的脂質體通常包含一種或多種溶血脂質。本發明所使用的 “溶血脂質” 是 指任何僅包括一個共價連接到甘油部分的酰基鏈的磷脂酸衍生物 (1, 2- 二酰基 -sn- 甘油 基 -3- 磷酸酯 )。磷脂酸衍生物包括但不限于磷脂酰膽堿、 磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺。本 領域技術人員已知的任何溶血脂質可以用于實施本發明。溶血脂質包括但不限于, 單棕櫚 酰磷脂酰膽堿 (MPPC)、 單月桂酰磷脂酰膽堿 (MLPC)、 單肉豆寇酰磷脂酰膽堿 (MMPC)、 單硬 脂酰磷脂酰膽堿 (MSPC) 及其混合物。
     本發明的脂質體還可以包含連接了親水聚合物的脂質, 例如共價連接 PEG 的脂 質。
     活性劑
     本發明的肽和模擬肽可以用于遞送活性劑。本發明所使用的 “活性劑” 包括任何 期望遞送到受試者的特定部位的化合物。任何活性劑都可以用于實施本發明。
     抗癌藥物可以用作本發明的熱敏脂質體中的活性劑。抗癌藥物的合適的例子包 括:
     烷化劑, 例如氮芥 ( 例如, 苯丁酸氮芥、 氮芥、 環磷酰胺、 異環磷酰胺、 苯丙氨酸氮 芥 ), 亞硝基脲類 ( 例如, 卡莫司汀、 福莫司汀、 洛莫司汀、 鏈脲佐菌素 )、 含鉑化合物 ( 例如, 卡鉑、 順鉑、 奧沙利鉑、 BBR3464), 白消安, 達卡巴嗪, 雙氯乙基甲胺 (Mechlorethamine), 甲 基芐肼, 替莫唑胺, 塞替派和尿嘧啶氮芥 ; 抗代謝物, 以例如葉酸 ( 例如, 氨基蝶呤、 氨甲蝶呤、 培美曲塞、 雷替曲塞 ), 嘌呤代 謝 ( 例如, 克拉曲濱、 氯法拉濱、 氟達拉濱、 巰基嘌呤、 噴司他丁、 硫鳥嘌呤 ), 嘧啶代謝 ( 例 如, 卡培他濱、 阿糖胞苷、 氟尿嘧啶、 氟尿苷、 吉西他濱 ) 為靶點 ;
     紡錘體毒素植物生物堿, 例如紫杉烷 ( 例如, 多烯紫衫醇、 紫杉醇 ) 和長春花 ( 例 如, 長春花堿、 長春新堿、 長春地辛、 長春瑞賓 ) ;
     細胞毒性 / 抗腫瘤抗生素, 例如蒽環類抗生素 ( 例如, 柔紅霉素、 阿霉素、 表柔比 星、 伊達比星、 米托蒽醌、 戊柔比星、 洋紅霉素、 nacetyladriamycin、 柔紅霉素苯腙、 5- 亞氨 基柔紅霉素 (5-imidodaunomycin)、 N30 乙酰柔紅霉素 (acetyldaunomycin) 和表柔比星 ), 博來霉素, 絲裂霉素和放線菌素 ;
     拓撲異構酶抑制劑, 例如喜樹堿類 ( 例如, 喜樹堿、 拓撲替康、 伊立替康 ), 鬼臼 ( 例 如, 依托泊苷、 替尼泊苷 )。
     單克隆抗體或其片段, 例如阿倫單抗 (Alemtuzumab)、 貝伐單抗 (Bevacizumab)、 西妥昔單抗 (Cetuximab)、 吉妥單抗 (Gemtuzumab)、 帕尼單抗 (Panitumumab)、 利妥昔單抗 (Rituximab)、 托西莫單抗 (Tositumomab) 和曲妥珠單抗 (Trastuzumab) ;
     光敏劑, 例如氨基乙酰丙酸、 氨基乙酰丙酸甲酯、 卟吩姆鈉和維替泊芬 ;
     激 酶 抑 制 劑, 例 如 達 沙 替 尼 (Dasatinib)、 埃 羅 替 尼 (Erlotinib)、 吉非替尼 (Gefitinib)、 伊馬替尼 (Imatinib)、 拉帕替尼 (lapatinib)、 尼羅替尼 (Nilotinib)、 索拉 非尼 (Sorafenib)、 舒尼替尼 (Sunitinib) 和凡德他尼 (Vandetanib) ;
     酶, 例如天冬酰胺酶、 培門冬酶, 和酶抑制劑, 如羥基脲 ;
     細胞凋亡誘導劑, 例如三氧化二砷、 萬珂 (Velcade) 和奧利默森鈉 (Genasense) ;
     生物反應調節劑, 例如地尼白介素 (Denileukin Diftitox) ;
     抗激素, 例如醋酸戈舍瑞林、 醋酸亮丙瑞林、 雙羥萘酸曲普瑞林、 醋酸甲地孕酮、 他
     莫昔芬 (Tamoxiifen)、 托瑞米芬、 氟維斯群、 睪內酯、 阿那曲唑、 依西美坦和來曲唑 ;
     類視黃醇, 例如 9- 順 - 視黃酸和全 - 反 - 視黃酸。
     在其他實施方案中, 本發明的熱敏脂質體可以包含一種以上的抗腫瘤劑, 或者一 種以上的熱敏脂質體可以用于本發明的方法, 其中每種都包含不同的活性劑, 例如不同的 抗癌藥物。
     可以用于實施本發明的其他活性劑包括但不限于, 抗生素、 抗真菌劑、 抗炎劑、 免 疫抑制劑、 抗感染劑、 抗病毒劑、 驅蟲和抗寄生蟲化合物。
     活性劑可以為顯像劑。適合用于本發明的脂質體制劑的顯像劑包括超聲造影劑、 X- 射線造影劑 ( 例如, 金和鋇基藥劑、 碘海醇、 威視派克 (Visipaque) 和其他碘基藥劑, 以及 其他微粒藥劑 )、 磁共振造影劑 ( 例如, 含錳、 鐵、 釓和其他鑭系元素的順磁性材料 )、 核醫學 藥劑 ( 如放射性同位素或含放射性同位素的化合物 )。
     使用方法
     可以利用任何合適的途徑向受試者給予與本發明的肽相結合的活性劑, 例如靜脈 內、 動脈內、 肌肉內、 腹膜內、 皮下、 皮內、 關節內、 鞘內、 側腦室內以及其他途徑, 如吸入、 口 服或直接在粘膜上 ( 舌下 )。使用本發明的材料和方法可以治療任何組織。可以使用本發 明的材料和方法治療的組織的例子包括但不限于, 肝、 腎、 骨骼、 軟組織、 頭和頸部組織、 肌 肉、 腎上腺組織、 肺、 胸、 甲狀腺 (thryroid)、 胰腺、 包括子宮內膜和宮頸組織的子宮組織、 卵 巢和前列腺。可以被治療的組織包括癌組織, 其他患病或受損的組織, 若是期望的話, 還有 健康組織。
     使用本發明的方法給予受試者的活性劑的劑量可以由本領域技術人員確定, 適宜 在延長的時間周期內靜脈內給藥, 例如從大約 1 分鐘到大約 24 小時。
     正如本領域內已知的, 可以根據載體中包含的活性劑來調節活性劑的劑量。
     當活性劑被結合到包含本發明的肽的熱敏脂質體中時, 在給予熱敏脂質體之前和 / 或期間和 / 或之后可以加熱受試者的靶組織。 在一個實施方案中, 首先加熱靶組織 ( 例如 10 到 30 分鐘 ), 加熱后盡可能塊地將熱敏脂質體遞送至受試者。在另一個實施方案中, 熱 敏脂質體被遞送到受試者, 給藥后盡可能快地加熱靶組織。加熱可以持續長達 3 小時。
     可以使用任何適合的加熱靶組織的方式, 例如應用射頻輻射, 應用可以為高強度 聚焦超聲的超聲波, 應用微波輻射, 如溫水浴、 光的產生紅外輻射的來源以及其他形式的外 部和內部應用的輻射, 如由放射性同位素或電場和磁場產生的輻射。
     對于相關領域的普通技術人員而言非常顯而易見的是, 在不背離本發明的范圍或 其任何實施方案的情況下, 可以對本發明所述的方法及應用做出其他合適的修改和改進。 現在已經詳細描述了本發明, 參考以下實施例將更加清楚地理解本發明, 因此所包括的實 施例僅是為了說明而不意在限制本發明。 實施例 實施例 1
     蛋黃磷脂酰膽堿、 1, 2- 二硬脂酰 -sn- 甘油基 -3- 磷酸乙醇胺 (DSPE), 1, 2- 二硬脂 酰 -sn- 甘油基 -3- 磷酸乙醇胺 -N-[ 甲氧基 ( 聚乙二醇 )-2000](DSPE-PEG2000)、 1, 2- 二硬 脂酰 -sn- 甘油基 -3- 磷酸乙醇胺 -N-[ 馬來酰亞胺 ( 聚乙二醇 )2000](DSPE-PEG2000-Mal)
     和膽固醇都購自 Avanti Polar Lipids(AL, USA)。Lissamine TM 羅丹明 B, 1, 2- 雙十六酰 基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸乙醇胺 ( 羅丹明 DHPE) 和 N-( 熒光素 - 硫代氨甲酰 )-1, 2- 雙十六 酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸乙醇胺 ( 熒光素 DHPE) 購自 Invitrogen 公司。N- 琥珀酰亞胺 3-(2- 吡啶二硫代 )- 丙酸酯 (SPDP) 和三 ( 羧乙基 ) 膦 (TCEP) 購自 PierceBiotechnology, Inc.。Cy5.5Mono NHS Ester 由 GE Healthcare 提供。所有其他分析純級的化學品獲自國 藥集團化學試劑有限公司 (SinopharmChemical Reagent Co.Ltd, 中國, 上海 )。
     非活性狀態的 EGFR 的晶體結構是從 PDB 下載的 (http://www.rcsb.org/pdb/, code : 1NQL)。建立 3D 結構模型, 并使用由 Sheng-Hung Wang 博士提供的 PSCAN 2.2.2 程 序 (http://home.pchome.com.tw/team/gentamicin/mol/mol.htm) 掃 描 侯 選 的 結 合 口 袋。選擇頂部附近表面上的口袋, 如圖 1 所示。認真分析口袋中的氨基酸殘基結構, 基于 Mekler-Idlis 的氨基酸配對理論 (20) 設計出包含 132 個六肽 (Hexapeptides) 的集中庫。
     使用 Autodock3.0 篩選庫, 并對與 EGFR 表面口袋的結合分級。為了加速計算, 在 多重處理器上運行程序, 我們修改了軟件從而能夠進行平行計算。所有的計算都是在上海 交通大學超級計算中心 (SJTUsupercomputing center) 中的 SGI Onyx3800 機器上進行的。 首先對 132 個肽初篩, 選出 50 個具有較低結合能量的肽。 對于每個肽, 分別進行了 100 次對 接 (docking) 嘗試, 每次對接由 250,000 次能量評估組成, 其中使用了拉馬克 (Lamarckian) 遺傳算法局部搜索 (genetic algorithm local search, (GALS)) 算法 (21)。基于 Csaba 和 David(22) 描述的方法選擇所有其他對接參數。使用相同的算法, 在精確的搜索相中用 1 千萬次能量評估來進一步評估所選擇的 50 個肽。比較肽的最低對接能量, 選出 20 個最 低的, 送至合成和濕法篩分。BIACore 結合研究表明, 其中兩種肽以濃度依賴方式結合到 EGFR。尤其是具有序列 LARLLT(SEQ ID NO : 1) 的肽 ( 在對接研究中排在第四位 ) 明顯是潛 在的結合物。
     在 PSCAN 程序的協助下選出的結合口袋如圖 1A 所示 ( 圈出的 )。該結合口袋位 于易于從外部接近的表面上, 但是又不太靠近 EGF 結合位點。我們推定該口袋的空間結構 不太可能因有或沒有 EGF 的結合和 EGFR 二聚作用而變化。口袋底部有一些疏水殘基, 開 口處周圍有親水殘基 ( 帶電殘基 : Asp51、 Glu73、 Glu110、 Arg48、 Lys56、 Arg74 ; 極性殘基 : Thr106、 Ser53、 Ser62)。
     將我們所選擇的用于本研究的兩個肽 (LARLLT 和對照肽 ) 對接到口袋中, 尋找 最佳的對接結構。就最低對接能量和自由結合能量而言, LARLLT 分別為 -17.9kcal/mol 和 -8.54kcal/mol, 對照肽分別為 -12.52kcal/mol 和 -3.85kcal/mol。
     如圖 1B 所示, 肽 LARLLT 精確定位于口袋中, 幾乎所有的殘基都與 EGFR 上的殘基 相互作用。存在六個潛在的氫鍵, 涉及位于兩端 (LEU1、 ALA2 和 THR6) 和中心 (ARG3) 的殘 基。在 N- 端, LEU1 的氨基氫與 GLU73 的羧基氧相互作用, ALA2 主鏈的氧與 GLU73 主鏈的酰 胺氫相互作用。在羧基端, THR6 既是氫鍵供體, 也是受體, 使用其羧基端的氧與 SER53 的羥 基氫相互作用, 其側鏈的羥基氫與 ASP51 的羧基氧相互作用。在中間, ARG3 通過靜電相互 作用 ( 與 GLU73 和 GLU110) 和氫鍵與 EGFR 相互作用。這三個精確分隔的關鍵殘基 (LEU1、 THR6、 ARG3) 像錨一樣固定于 EGFR 口袋中后, 它們還利用更疏水的口袋底部, 促進了 LARLLT 的較疏水性殘基 ALA2、 LEU4 和 LEU5 之間的相互作用。如對接結構所示 ( 圖 1), LARLLT 上 的殘基與 EGFR 之間的詳細相互作用非常符合 M-I 配對理論 (20)。相反地, 如圖 1C 所示, 對照肽 SEQ ID NO : 2 具有相同的氨基酸組成但是其序列被 打亂, 甚至不能在口袋內中匹配。帶電 ARG1 與 ASP51 相互作用, 但是其他相互作用都太弱 而不能固定對照肽。
     實施例 2
     由 GL Biochem Ltd.(Shanghai) 合成并純化肽 LARLLT, 通過 HPLC 和 MS 確認結構 * 和純度。為了對比, 還合成了命名為 D4 具有與 LARLLT 相同的氨基酸組成, 但是序列被打 亂的肽 (RTALLL, 對照肽 (SEQ IDNO : 2))。為了對兩種肽進行熒光標記, 以 1 ∶ 2 的摩爾比 將 Cy5.5-NHS 與 LARLLT 或對照肽混合, 25℃下孵育過夜, 避光。使用的熒光肽沒有經進一 步純化。
     實施例 3
     將 EGF 或 LARLLT/ 對照肽溶解在 PBS-EDTA 中, 并在室溫下與溶解于 DMSO 中的 N- 琥珀酰亞胺 -3-(2- 吡啶二硫代 )- 丙酸酯 (SPDP) 以 1 ∶ 1.2 的摩爾比混合 1 小時, 然 后凍干。同時, 將氯仿中的 DSPE-PEG2000-Mal 脂質蒸干形成薄膜, 并在 HEPES 緩沖液 (pH 7.4) 中水化, 濃度大約為 0.4mM。 為了接合, 將硫化的 (thioated) 的蛋白或肽加到三 (2- 羧 乙基 ) 膦 (TCEP) 溶液中, 在室溫和氮氣下孵育 1 小時, 迅速與 MAL-PEG2000-DSPE 膠束溶液 以 5 ∶ 1 的摩爾比混合, 并在 10℃和氮氣下保持攪拌反應過夜。通過 HPLC 分析, 此反應后 幾乎所有的 Mal-PEG-DSPEs 都被修飾。過量的蛋白質 / 肽可以使用標準技術除去, 例如通 過凝膠過濾柱、 透析等。 實施例 4
     使用干膜水化法制備所有的脂質體, 隨后通過 100nm 膜擠出數次。本研究中使用 的絕大多數脂質體都始于以下的脂質組成 : EPC ∶ CHOL ∶ DSPE-PEG = 10 ∶ 5 ∶ 0.5。除 了羅丹明或熒光素標記的脂質體以外, 將羅丹明 -DHPE 或熒光素 -DHPE 加到大約為 0.6%摩 爾總脂質的脂質組合物中。
     對于 Cy5.5 標記的脂質體, 首先以 3 ∶ 1 ∶ 3.5 的摩爾比在氯仿中混合 Cy5.5-NHS、 DSPE 和三乙胺, 在 25℃下孵育過夜 ( 避光 ), 合成 Cy5.5-DSPE。將得到的 Cy5.5-DSPE 以大 約 0.5%摩爾總脂質的量結合到脂質組合物中。形成脂質體后通過透析除去過量的 Cy5.5。
     實施例 5
     按照已開發的跨膜梯度方法 (23, 24) 制備包封阿霉素的脂質體。簡言之, 在 pH 4.0 的 125mM 硫酸銨中將脂質水化, 并擠出獲得~ 100nm 的脂質體。然后在 HEPES 緩沖液 (pH 7.5) 中透析, 用 20mM HEPES、 150mMNaCl(pH 7.5) 稀釋到所需濃度。加入阿霉素, 與脂 質體一起在 60℃下孵育 10 分鐘。
     基于 Ishida 等開發的方法稍作改進 (25), 將接合配體的脂質插到預制的脂質體 中。簡言之, 以 9 ∶ 100 的摩爾脂質比, 將 DSPE-PEG2000- 配體膠束溶液加到預制的脂質 體溶液中, 并在 60℃下孵育 1 小時 ( 包含阿霉素的脂質體為 55℃下 30 分鐘 )。然后采用 SnakeSkinTM 可打褶的 (Pleated) 透析管 10,000MWCO(Pierce Chemical 公司 ) 在 PBS 中透 析該溶液 4 小時。作為對照的 mPEG2000-DSPE 膠束也被混合并以相同的比率孵育以制備出 非靶向脂質體。
     通過巰基 - 馬來酰亞胺偶聯反應將肽配體接合到 DSPE-PEG2000 上。 監測反應并用 反相 HPLC 分析來確認。 使用廣泛使用的孵育方法 (25) 將得到的肽 -PEG-DSPE 或 mPEG-DSPE
     對照結合到預制的脂質體中。 在孵育過程中, 我們測試了不同的肽 -PEG- 脂質 ( 或 mPEG- 脂 質 ) 與脂質的比率 (3 ∶ 100、 6 ∶ 100 和 9 ∶ 100 摩爾 ), 選擇 9 ∶ 100 的比率來阻止脂質體 與大多細胞的非特異性結合。我們證實了該方法不會干擾脂質體的完整性。在操作過程之 中和之后, 泄漏的包封的阿霉素不超過 5%。使用 Zetasizer3000H(Malvern Instruments) 通過光子相關光譜法 (PCS) 確定脂質體的最終尺寸分布。與剛擠出時制備的脂質體 ( ~ 110nm) 相比, 肽脂質結合之后的顆粒尺寸稍微大些 (130 ~ 150nm), 但是仍然穩定。
     實施例 6
     在本研究中, 使用均具有高 EGFR 表達水平的人非小細胞肺癌細胞系 H1299 和人肺 腺癌細胞系 SPCA1。 在 37℃下, 含有 5% CO2 的潮濕空氣中, 用包含 10%胎牛血清的 RPMI1640 培養基培養細胞。
     由上海腫瘤研究所 (Shanghai Cancer Institute) 動物實驗中心制備 H1299 和 SPCA1 異種移植小鼠模型。 接種腫瘤細胞后約 3-4 周 ( 腫瘤大小為直徑約 5-7mm), 它們被用 于體內成像實驗中, 之后人工處死。動物研究方案經上海交通大學藥學院動物研究委員會 (the Animal Study Committeeof Shanghai Jiaotong University, School of Pharmacy) 批準。 實施例 7
     將 EGFR 高表達的 H1299 或 SPCA1 細胞置于直徑 35mm 的培養皿中 ( 每個培養皿 6 1×10 個細胞 ), 并在 RPMI1640 培養基中培養 24 ~ 48 小時。當細胞培養達到大約 80 % 匯合時, 在 RPMI1640 中稀釋配體 - 接合的羅丹明脂質體, 并在 4℃或 37℃下加到培養皿中。 在競爭性結合實驗中, 在加入 LARLLT 結合的脂質體之前 2 小時, 將 50 倍摩爾過量的游離 LARLLT 或 EGF 加到培養基中。在特定的溫度下孵育細胞 4 小時, 隨后用 PBS(pH 7.4) 清洗 六次。 使用共聚焦激光掃描顯微鏡 (CLSM, Zeiss LSM, 德國 ) 可以看見剩余的邊界和內化的 熒光脂質體。為了進行流式細胞術研究, 將 H1299 或 SPCA1 細胞置于直徑 35mm 的孔中, 直 到細胞生長到大約 80%匯合。 在 37℃下細胞與配體 - 修飾的熒光素標記的脂質體一起孵育 3 小時后, 用 PBS 清洗細胞, 并用胰蛋白酶處理形成懸浮液, 用流式細胞儀 (BDFACSCalibur, Becton Dickinson) 進行分析。
     在體外測試 EGF、 LARLLT 或對照肽修飾的羅丹明標記的脂質體與 EGFR 高表達細 胞的結合能力。如圖 2A 所示, EGF 和 LARLLT 修飾的脂質體與 H1299 細胞廣泛地結合。EGF 修飾的脂質體與 LARLLT 修飾的脂質體相比, 熒光稍強, 表明與 EGF 的結合更緊密。但是采 用對照肽, 幾乎沒有顯示出熒光。用另一種 EGFR 表達細胞系 SPC-A1 觀察到類似情形 ( 圖 2C)。
     在不同的溫度下, 進一步評估 H1299 細胞中詳細的結合特征。4°時, 主要在細胞 表面上觀察到熒光, 大部分熒光可以被過量的未標記的游離 LARLLT 競爭除去 ( 圖 2B-iii 和 iv)。但是 37°時, 游離的 LARLLT 的競爭效應不太明顯 ( 圖 2B-I 和 ii), 表明 LARLLT 與 EGFR 結合后, 可能有主動胞飲作用和受體轉向 (turnaround)。 還值得注意的是 37°時存在 的游離 EGF 一定程度上實際影響了 LARLLT 脂質體的熒光, 雖然并不完全 ( 圖 2B-v 和 vi)。 這可能是結合后 EGF 干擾 LARLLT 的胞飲途徑。
     圖 3 顯示了在較高放大倍數下 ( 圖 3A) 以及 Z stack 連續掃描圖像 ( 圖 3B) 中 H1299 細胞對 LARLLT 修飾的脂質體的結合和攝取。 在細胞內許多胞吞泡中觀察到脂質的熒
     光。值得注意的是, LARLLT 與遠離 EGF 結合位點的 EGFR 上的微小表面口袋的結合能夠啟 動這種主動胞飲作用。
     為在較大的細胞群中比較結合到脂質體中的 LARLLT 和對照肽的不同結合效率, 我們使用了流式細胞術。用熒光素 -DSPE 標記脂質體, 并分別加到 H1299 和 SPCA1 細胞中。 孵育 3 小時后, 75%的結合 LARLLT 脂質體的 H1299 細胞顯示出強熒光 (101 ~ 103FL1 值 ), 但是對照肽脂質體結合后, 僅有 27%的細胞顯示出熒光。對于 SPCA1 細胞而言, 68%的結 合 LARLLT 脂質體的細胞顯示出熒光 (35 ~ 103FL1 值 gate), 僅有 17%的結合對照肽的細 胞顯示出熒光。
     實施例 8
     以 104 細胞 / 孔的密度將 H1299 和 SPCA1 細胞置于 96- 孔板中并培養過夜。在培 養基中加入游離的阿霉素、 LARLLT 修飾的阿霉素脂質體和對照肽修飾的阿霉素脂質體, 并 孵育 2 小時。然后用新鮮培養基清洗細胞, 并讓其再生長 48 小時。經過不同處理后, 使用 MTT 分析測定細胞活力 (26)。
     通過 LARLLT 或對照肽接合的脂質來修飾裝載阿霉素的脂質體, 并將其加到 EGFR 高表達的細胞中。使用 MTT 分析細胞殺傷作用。在 H1299 和 SPCA1 兩種細胞中, 與對照肽 修飾的脂質體相比, LARLLT 修飾的脂質體更好地遞送藥物 ( 圖 4A 和 B)。在兩種情況下, 計 算的 LARLLT 脂質體的 IC50 所表示的細胞毒性為對照肽脂質體的大約 3-5 倍。
     實施例 9
     通過尾靜脈向 H1299 或 SPCA1 異種移植荷瘤小鼠注射 Cy5.5、 LARLLT-Cy5.5、 對照 肽 -Cy5.5 以及 LARLLT 和對照肽結合的 Cy5.5 標記的脂質體。隨后在不同的時間點麻醉小 鼠, 并用 Optix 體內熒光成像系統 (GE Healthcare) 成像。除了 Cy5.5 染料僅作為對照以 外, 所有其他組都包括至少 3 只小鼠。顯示了每組中最具代表性的相同小鼠的代表性圖像。 為了消除 Cy5.5(0.8-1.1ns) 產生的大部分自發熒光的干擾, 已經使用熒光壽命 gating 處 理圖像。
     使用近紅外染料 Cy5.5 標記 LARLLT 和對照肽, 將其通過尾靜脈注射到 H1299 荷瘤 小鼠。注射后不同時間點對小鼠體內 Cy5.5 的熒光分布成像。在所有組中, 包括無染料的 對照組, 首先看到全身的熒光, 然后很快進一步看到腎和膀胱中的熒光。 為了避免腎和膀胱 中強熒光的干擾, 我們僅示出皮下荷瘤區域的聚焦成像掃描 ( 圖 5)。在 Cy5.5 染料注射的 小鼠中, 腫瘤區域的熒光信號與背景一樣。但是在 LARLLT-Cy5.5 注射的小鼠中, 在注射后 1 到 6 小時之間, 與周圍組織相比, 腫瘤組織中的熒光信號更強。相反地, Cy5.5- 對照肽注 射的小鼠在腫瘤區域內未顯示出任何熒光聚集。
     通過尾靜脈向 H1299 荷瘤小鼠注射 LARLLT 和對照肽修飾的 Cy5.5 標記的脂質體。 在注射后的不同時間掃描小鼠全身, 對不同時間點荷瘤區域的熒光強度定量。如圖 6 所示, 從 6 小時起, LARLLT 修飾的脂質體逐漸蓄積在腫瘤區域內。甚至在 80 小時之后, 信號與反 差仍然明顯。 但是對于對照肽修飾的脂質體而言, 腫瘤區域內的熒光強度總是與背景一樣。 我們計算出腫瘤區域內熒光強度與全身信號的相對比率 ( 表 1)。使用 eXplore OptiView 1.0.0.0 軟件計算腫瘤區域和全身的熒光強度 (NC)。還列出了腫瘤區域內的熒光百分比。
     表 1 注射熒光脂質體后不同時間點腫瘤區域內的熒光強度
     注射后 1 小時起比率實際上變得越來越好, 直到 76-80 小時。當其看起來處于穩 定狀態時, 表明腫瘤內部靶向脂質體逐漸蓄積以及之后保持強勁的勢頭。
     在某些實施方案中, 本發明的肽和模擬肽可以被設計為與遠離 EGF 結合位點的表 面口袋結合。由于肽和 EGF 之間沒有直接的結合競爭, 即使肽的結合親和力可能低于 EGF 的結合親和力, 這樣也可以使得本發明的肽和模擬肽 ( 及連接肽的治療劑 ) 與 EGFR 高表達 的細胞結合。
     當本發明的肽和模擬肽接合到不同的化合物, 例如接合到 PEG2000-DSPE 的遠端, 并結合到脂質體內時, 本發明的肽和模擬肽保留了其 EGFR 結合能力, 并介導 EGFR 高表達細 胞對化合物 ( 例如脂質體 ) 的特異性連接和攝取。如上所示, 當體內注射連接到本發明的 肽和模擬肽的化合物 ( 例如上文所示的結合肽的脂質體 ) 時, 化合物被定向到靶細胞 ( 例 如, 腫瘤細胞 ), 導致接合肽的化合物 ( 例如, 接合肽的脂質體 ) 在靶點 ( 例如, 在腫瘤中 ) 蓄積。
     在我們的研究中, 我們僅使用了 PEG2000 接頭, 當包含配體的脂質在 2-4 ∶ 100 的 脂質比率條件下被結合時, 發現在體內與細胞的接合最為顯著 ( 具有最小的背景非特異性 結合 )。可以使用本領域技術人員已知的任何其他接頭。同樣可以使用其他比率的脂質。
     在體內使用相同的脂質體制劑。脂質體具有相對高的表面配體 -PEG 密度, 在腫瘤 內緩慢蓄積。 事實上, 幾項早期研究已經表明在循環和外滲期間, 主動靶向脂質體的表現充 其量與隱形脂質體相似 (4, 6, 41)。當它們與癌癥細胞緊密結合并促進細胞攝取時, 它們的 靶向優點僅在外滲到腫瘤組織后才是顯著的 (8, 42)。我們利用體內熒光成像系統的觀察 ( 圖 6) 與該機制吻合。發現結合配體的 LARLLT 脂質體長時間停留于腫瘤組織內 ( > 80 小 時 )。 然而對照組在 12-24 小時時間點附近未表現出在腫瘤組織內有顯著蓄積, 如同我們預 期的非靶向隱形脂質體一樣。
     小動物體內熒光成像是一種新開發的工具, 用于監測標記的藥物和遞送系統的生 物分布。由于 Cy5.5 具有較高的組織滲透性和低背景, 其成為最普遍使用的染料。體內成 像技術的主要優點在于其非侵入性, 可以在整個研究過程中連續監測相同的活體動物。許 多早期研究已經使用放射性標記的藥物或脂質來追蹤其在體內的分布, 為獲得平均讀數必 須在不同時間點處死大量動物。 根據我們的經驗, 使用體內成像系統, 研究組中的不同動物 仍然可能在其綜合健康狀況、 生理學、 代謝、 腫瘤尺寸和位置等方面有差異。主動靶向脂質 體以時間排序的分布情況還與用其他方法所報道的內容 (8, 41) 一致。
     實施例 10
     評估使用本發明的肽的靶向脂質體增強藥物在靶腫瘤中蓄積的能力。向 H460 荷 瘤裸鼠靜脈注射 5mg/kg 阿霉素。將游離的阿霉素 ( 圖 7, Dox) 與結合到聚乙二醇化脂質體 中的阿霉素 ( 圖 7, PEG) 以及結合到包含本發明的肽的脂質體中的阿霉素 ( 圖 7, D4) 進行 比較。注射后 0.5h、 6h 和 48h 處死小鼠, 切除腫瘤并分析阿霉素的含量。每組實驗使用的 動物數為 N = 3。
     如圖 7 所示, 與游離的阿霉素以及聚乙二醇化的脂質體中的阿霉素相比, 包含本 發明的肽的脂質體導致在腫瘤蓄積的阿霉素明顯更多。
     實施例 11
     對包含本發明的肽的脂質體的結合 FACS 分析
     在無菌條件下, 用細胞培養板培養 H-460 細胞, 并通過刮離收集。加入脂質體樣品 * ( 空 Thermodox 脂質體、 ThermoDox、 D4-ThermoDox、 D4 -ThermoDox, 其中 D4ThermoDox 包含 * SEQ ID NO : 1, D4 ThermoDox 包含 SEQ ID NO : 2) 和鹽酸阿霉素, 并在 37℃下與 H-460 細胞 一起孵育 4 小時。測試包含不同量的本發明的肽 (D4-ThermoDox) 的兩種不同脂質體。兩 種脂質體被命名為 D4-ThermoDox2+2, 其包含的 DPPC ∶ MSPC ∶ DSPE-MPEG2000 ∶ D4-DSPE-M PEG2000 的摩爾比為 90 ∶ 10 ∶ 2 ∶ 2, D4-ThermoDox4+4, 其包含的 DPPC ∶ MSPC ∶ DSPE-MP EG2000 ∶ D4-DSPE-MPEG2000 的摩爾比為 90 ∶ 10 ∶ 4 ∶ 4。D4*-ThermoDox 包含的 DPPC ∶ MSPC ∶ DSPE-MPEG2000 ∶ D4*-DSPE-MPEG2000 的摩爾比為 90 ∶ 10 ∶ 2 ∶ 2。 孵育后, 用 PBS 清洗細胞 4 次, 使用阿霉素熒光 ( 在 488nm 下激發, 在 575nm 下發射 ) 通過 FACS 計數。
     檢驗以下各組 : a. 非治療對照組 ; b.ThermoDox 大約為 0.01-10μg( 阿霉素 )/ mL ; c.D4-ThermoDox2+2 大 約 為 0.01-10μg( 阿 霉 素 )/mL ; d.D4-ThermoDox4+4 大 約 為 * 0.01-10μg( 阿霉素 )/mL ; e.D4 -ThermoDox 大約為 0.01-10μg( 阿霉素 )/mL ; 和 f. 鹽酸 阿霉素 0.01-10μg。
     實驗至少重復三次, 顯示了相同實驗中有代表性的柱狀圖。具體的數值可能因細 胞數量和 FACS 參數的變化而變化, 但是總體模式和制劑差異總是一致的。
     在劑量為 10μg/ml 時, 體內 D4-ThermoDox(2+2) 的阿霉素熒光強度比 ThermoDox * 和 D4 -ThermoDox 更強, 僅比游離的鹽酸阿霉素弱。假定游離藥物相對更易于滲透穿過 細胞膜, 經證實 D4- 脂質體比對照脂質體更易結合到 H460 細胞。在劑量為 1μg/ml 時, D4-ThermoDox(2+2, 4+4) 處理的細胞比 ThermoDox 和 D4*-ThermoDox 處理的細胞產生的阿 霉素熒光信號更多。劑量為 0.1μg/ml 和 0.01μg/ml 時, 不同制劑的脂質體之間沒有顯著 差異。
     圖 8 為每個 FACS 柱狀圖的平均值相對每種測試制劑所給予阿霉素的量繪制的線 圖。使用藥物溶液的阿霉素攝取 ( 平均熒光強度 ) 最高, 是因為其能夠非常有效地滲透細 胞膜。比較不同的脂質體制劑, 兩種 D4 脂質體制劑比 Thermodox 對照和 D4* 脂質體對照好 得多。
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