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一種花粉超臨界萃取提取物及其制備與應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201210552311.X

申請日:

2012.12.18

公開號:

CN103040941B

公開日:

2014.10.29

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 36/57申請日:20121218|||公開
IPC分類號: A61K36/57; A61K36/66; A61K36/899; A61P13/08; A61P35/00 主分類號: A61K36/57
申請人: 浙江工業大學
發明人: 楊開; 孫培龍; 蔡敏; 高粱; 何榮軍
地址: 310014 浙江省杭州市下城區潮王路18號
優先權:
專利代理機構: 杭州天正專利事務所有限公司 33201 代理人: 黃美娟;冷紅梅
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210552311.X

授權公告號:

103040941B||||||

法律狀態公告日:

2014.10.29|||2013.05.15|||2013.04.17

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及一種安全性高的具有5α-還原酶抑制活性的花粉超臨界萃取提取物及其制備與應用。所述花粉超臨界萃取提取物由如下方法制得:稱取花粉原料,加入萃取釜中,擰緊萃取釜蓋子,經超臨界CO2萃取儀萃取1~3h,萃取溫度30~60℃,萃取壓力為200~500bar,萃取結束后收集得到所述花粉超臨界萃取提取物;所述花粉原料來自虞美人、五味子或玉米。本發明的有益性主要體現在:采用本發明方法,可獲得3種具有較好5α-還原酶抑制活性的花粉超臨界萃取提取物,原料來源安全,而且本發明采用的超臨界萃取過程不涉及有毒有害的有機溶劑,制成品毒副作用較少,安全性高,十分有利于后續醫藥保健食品的開發。

權利要求書

權利要求書一種花粉超臨界萃取提取物,由如下方法制得:稱取花粉原料,加入萃取釜中,擰緊萃取釜蓋子,經超臨界CO2萃取儀萃取1~3h,萃取溫度30~60℃,萃取壓力為200~500bar,萃取結束后收集得到所述花粉超臨界萃取提取物;所述花粉原料來自虞美人、五味子或玉米。
制備權利要求1所述花粉超臨界萃取提取物的方法,所述方法包括:稱取花粉原料,加入萃取釜中,擰緊萃取釜蓋子,經超臨界CO2萃取儀萃取1~3h,萃取溫度30~60℃,萃取壓力為200~500bar,萃取結束后收集得到所述花粉超臨界萃取提取物;所述花粉原料來自虞美人、五味子或玉米。
如權利要求2所述的方法,其特征在于所述萃取在溫度35~55℃、壓力250~350Bar下進行。
如權利要求1所述花粉超臨界萃取提取物在制備5α?還原酶抑制劑中的應用。
如權利要求1所述花粉超臨界萃取提取物在制備治療良性前列腺增生(Benign Prostatic Hyperplasia,BPH)的藥物中的應用。
如權利要求1所述花粉超臨界萃取提取物在制備治療前列腺癌的藥物中的應用。

說明書

說明書一種花粉超臨界萃取提取物及其制備與應用
(一)技術領域
本發明涉及一種安全性高的具有5α?還原酶抑制活性的花粉超臨界萃取提取物及其制備與應用。
(二)背景技術
良性前列腺增生(Benign Prostatic Hyperplasia,BPH)是指尿道附近細胞的良性腺瘤性增生,增生的前列腺擠壓尿道,導致一系列排尿障礙癥狀,如尿頻尿急、夜尿、尿流細弱、尿不盡等排尿障礙,嚴重影響患者的生活質量,目前已經成為世界范圍內影響老年人健康和生活質量的主要疾病之一。在美國70%年齡在50歲以上的男性患BPH,前列腺癌居美國男性癌癥發病率的首位、死亡率第二位。隨著社會人口老齡化,我國BPH的發生率也逐年增加,目前我國有近2億老年人,60~75歲的老年男性約78%患有BPH,其中25%需要接受各種治療。
BPH的臨床癥狀可分為三類:1)刺激癥狀:尿頻、尿急及夜尿次數增多,急迫性尿失禁。2)梗阻癥狀:排尿躊躇、尿線變細、尿終末滴瀝、間歇性排尿及膀胱尿不能排空等排尿困難癥狀。3)梗阻并發癥:尿潴留、血尿、膀胱結石、充溢性尿失禁、腎功能損害及腹壓增高引起的癥狀。另外前列腺增生不及時治療的話不僅影響前列腺結構及功能,還有可能導致性功能障礙及不育。
BPH作為老年男性的常見病,伴隨著人口的老齡化,其發病率隨之迅速增加,但其治病機理至今仍未弄清,導致BPH產生的機理,目前認為主要有4種途徑:激素?內分泌途徑、生長因子途徑、上皮?間質細胞相互作用途徑、細胞凋亡與基因調控途徑。其中wilson等提出的雙氫睪酮(DHT)學說較為公認,認為引起BPH發病的原因是DHT大量的積累導致的。
除手術治療外,目前臨床應用的藥物主要包括三大類,即α1腎上腺素受體拮抗劑,抗雄激素藥以及其他一些藥物等。其中抗雄激素的治療可以使增生的前列腺縮小,主要包括兩類藥物:(1)5α?還原酶抑制劑:阻止睪酮轉化為雙氫睪酮,此類藥品有非那雄胺、依立雄胺、度他雄胺等;(2)雄激素受體拮抗劑:阻止雙氫睪酮與受體結合,如舍尼通。
5a?還原酶存在I型和II兩種同功酶,兩種酶都為疏水性多膚,46 氨基酸序列同源。免疫化組織化學研究發現兩異構體酶表達具有相對的組織特異性,I型酶主要在皮膚和肝臟表達,II型酶則主要在包皮、前列腺、精囊和附皋中表達。 5α?還原酶是靶細胞內的微粒體膜蛋白,以還原型輔酶II(NADPH)作為供氫體,催化以類固醇為底物的一系列反應。雄激素生成、代謝和轉化都依賴于5α?還原酶,因為5α?還原酶在睪酮(T)轉化為雙氫睪酮(DHT)的過程(參見下式)中起著還原酶的作用,DHT為T的活性形式,為前列腺分化、生長發育所必需。

但是過量DHT的存在將會導致機體紊亂,內分泌失調,是許多內分泌疾病的病因,除產生前列腺癌PC(prostatic cancer)和良性前列腺增生外,還會產生痤瘡粉刺、女性多毛癥、男性禿頂和皮脂溢等常見病。
5α?還原酶抑制劑治療BHP的原理是在假兩性畸形患者體內的前列腺組織中5α?還原酶Ⅱ基因發生不可逆的突變,突變的基因在編碼5α?還原酶的過程中發生異常,以致產生的5α?還原酶存在缺陷,從而使T不能有效的轉換為DHT,前列腺不能正常發育,由此產生了5α?還原酶抑制劑治療BHP的想法。研究表明用5α?還原酶抑制劑治療BPH后,可見到前列腺體積縮小,說明5α?還原酶抑制劑可以作為治療BPH的有效藥物,因此對于5α?還原酶及其抑制劑的研究也成了近幾十年BPH研究領域的重點和熱點。通過抑制5α?還原酶抑制T→DHT過程的發生降低體內DHT的含量,不會引起體內T的減少,也不會引帶來性功能障礙、骨質疏松等副作用。在一系列檢測5α?還原酶抑制劑對BPH治療情況的實驗中,發現5α?還原酶抑制劑可顯著的降低患者得前列腺癌的風險。
T與5α?還原酶和它的輔酶NADPH形成的復合物(E?NADPH)結合,在5α?還原酶催化還原作用下,依賴NADPH作為供氫體,T被還原為DHT。如果有某種抑制劑(Inhibitor)存在,由于抑制劑的結構和T類似,抑制劑同樣也可以與復合物機結合,這樣抑制劑就與T相互競爭與復合物結合,從而減少了T向DHT的轉化,因而降低了體內DHT的含量,從而緩解了體內由于DHT含量過高引起的種種疾病。
因而5α?還原酶可作為藥物治療的分子靶點,篩選對該酶具有抑制作用的化合物可以作為治療以上疾病的有效藥物。用5α?還原酶抑制劑治療雄性激素依賴性的皮膚和前列腺疾病比激素治療產的產生的副作用要小。
目前已發現的5α?還原酶抑制劑主要分為兩大類,一類為甾體5α?還原酶抑制劑,一類為非甾體5α?還原酶抑制劑。然而由于這些合成抑制劑往往帶有很多不良反應,如代表性合成藥物非那雄甾可以引起男性乳房女子化、肌肉生長受損和嚴重的肌肉疾病等副作用,而這些副作用是這類藥物本身固有的,難以通過結構改造來消除,因而從天然植物中尋找高效低毒的新型5α?還原酶抑制劑一直是人們夢寐以求的目標。
近十多年來,人們通過藥效篩選,在多種植物發現了具有5 α?還原酶抑制成分,主要以脂溶性化合物為主,包括苯丙素類、萜類、醌類、三萜及甾體類;水溶性化合物主要包括鞣質類、黃酮類化合物。
花粉是有花植物雄蕊中雄性生殖細胞,它包含著孕育植物新生命所需的全部營養成分和精華,營養價值十分豐富,包括蛋白質、碳水化合物、不飽和脂肪酸、酚類、各種維生素和微量元素等,在國內外被譽為“天然微型營養庫”、“全能營養庫”和“完全營養食品”,是人類天然食品中的瑰寶。花粉不但能提供人類機體組織細胞的生長和修復所需的豐富營養原料,同時花粉中的一些生物活性物質對機體的生理功能具有不同程度的調節作用,如防治心血管疾病、降血脂、調節神經系統機能、提高機體免疫功能、抗衰老和抗癌等,是一種藥食同源食品。
花粉用于治療前列腺疾病的歷史較長,早在1960年瑞典烏普沙拉大學醫院Ask?Upmark就報道一種花粉制劑用于治療前列腺功能紊亂和前列腺炎有很高的治愈率。花粉水溶性提取物和脂溶性提取物都顯示了一定的抗前列腺疾病效果,其中的藥效成分主要是脂肪酸、多酚及黃酮類、甾體以及含氮化合物,但以上研究都是以油菜蜂花粉為原料進行的。
目前市場上流通的治療前列腺增生的花粉制劑如浙江康恩貝的“前列康”和瑞典的“舍尼通”(Cernilton)等,就是以油菜花粉或黑麥花粉提取物為主制成的。舍尼通早在1972年就經瑞典藥物管理局(MPA)批準花粉有效成分作為治療前列腺疾病的藥品上市,由梯牧草26%、玉米26%、黑麥19%、榛26%、水楊6%、白楊6%、法蘭西菊6%和松5%共8種花粉混合提取、制劑而成,價格比較昂貴。這些藥物在臨床長期使用,已被證明能有效地改善良性前列腺肥大癥狀(BPH)及并發癥,長期使用無毒副作用,同時花粉促進機體代謝及造血和免疫功能,適合中老年人長期使用。
在已有專利方面:由浙江康恩貝制藥股份有限公司和浙江康恩貝藥品研究開發有限公司申請的“油菜蜂花粉有效部位群的制備方法”CN 200410084433.6。該發明以油菜花粉為原料,將破壁后的油菜花粉用乙醇或丙酮等浸泡提取,提取液濃縮揮去溶劑得脂溶性提取物,再用40~60%的乙醇溶解,石油醚萃取、濃縮和干燥后得到脂溶性有效部位,油菜花粉渣加水浸泡提取,提取液濃縮并醇沉后得水溶性有效部位。將脂溶性有效部位與水溶性有效部位按花粉實際生藥提取量合并混勻,即為油菜花粉有效部位群,具有治療前列腺增生、前列腺炎作用。
由浙江康恩貝制藥股份有限公司和浙江康恩貝藥品研究開發有限公司申請“油菜蜂花粉有效部位藥物及制備方法和用途”CN 200410073514.6。該發明以油菜花粉為原料,經有機溶劑提取、萃取制備花粉提取物,然后花粉提取物進一步通過硅膠柱純化精制,得到具有體外抗前列腺腫瘤的有效部位。
由浙江海正藥業股份有限公司和上海醫藥工業研究院申請的“一種破壁花粉的提取物及其提取方法和應用”CN 200710043270.0,將向日葵、油菜等破壁花粉經超臨界萃取后獲得的超臨界萃取物,具有較佳的抗炎和抗前列腺增生作用。所用超臨界二氧化碳溫度優選在35~55℃,壓力25~40MPa。
由浙江海正藥業股份有限公司和上海醫藥工業研究院申請的“一種破壁花粉的提取物及其提取方法和應用”CN 200710043271.5,將向日葵、油菜等破壁花粉用水(3~10倍)在30~60℃提取5~10h,4000?8000轉/分離心30~60min,然后用≤10KD的陶瓷膜過濾,取截留部分經真空冷凍等干燥得到粉末,該提取物經動物實驗顯示,具有較強的抗炎和抗前列腺增生作用。
由上海醫藥工業研究院申請的“一種油菜破壁花粉提取物及其提純方法和應用”CN 200710043856.7,該發明將油菜破壁花粉采用超臨界二氧化碳萃取物用大孔樹脂富集,經乙醇洗脫,收集洗脫液干燥。提取物具有較佳的抗炎、抗前列腺增生、抗前列腺纖維化等功效。
在論文方面,Yong?Hui Li 等人從油菜花粉超臨界提取物分離得到的亞麻酸和甘油三亞油酸單苷酯具有較強的5α?還原酶抑制效果(Chem. Pharm. Bull. 2009,57(4) 401—404)。湖北中醫學院的孫弘在油菜花粉的乙醇提取物中發現有活性成分,經過硅膠柱層析分離得到的一種多聚醚顯示了體外5α?還原酶抑制活性(從油菜花粉中篩選5α?還原酶抑制劑,碩士學位論文,2009)。
另外在抗前列腺癌方面,朱赤紅,杜靈彬,高赟等研究發現油菜花粉脂溶性提取物(BPE)對體外培養的人前列腺癌細胞PC?3和DU?145生長具有明顯的抑制作用。
杭州師范大學的戴菁池采用CCK?8法檢測發現油菜花粉提取物對體外培養的人前列腺癌PC?3、DU?1 45細胞及肺腺癌A549細胞具有生長抑制作用(油菜花粉提取物對前列腺癌細胞生長抑制效應及機理的實驗研究,碩士學位論文,2007)。
由上可知,目前對花粉5α?還原酶抑制的原料(尤其是我國)絕大多數都是集中于油菜花粉等少數品種,而自然界中的花粉品種有成千上萬,其他品種是否也有類似效果?另外已有的前列康的主要成分是油菜花粉。在其的說明書中所寫的作用機理為抑制5 α?還原酶將睪酮轉化為二氫睪酮,但其中起作用的化學成分也一直未能揭示。此外上述專利文獻中有許多采用了乙醇、丙酮等有機溶劑提取,不僅在生產過程中易燃易爆、對環境產生危害,而且需高溫將提取液中溶劑蒸發,濃縮過程中萜烯類等揮發物質損失較大,活性成分遭到破壞,另外有機溶劑萃取不可避免對終產品造成毒性殘留,影響其最終應用。 
(三)發明內容
本發明目的是提供一種安全性高的具有5α?還原酶抑制活性的花粉超臨界萃取提取物及其制備與應用。
本發明采用的技術方案是:
一種花粉超臨界萃取提取物,由如下方法制得:稱取花粉原料,加入萃取釜中(為防止塞住出口管路,可將少許脫脂棉預先墊入萃取釜底部),擰緊萃取釜蓋子,經超臨界CO2萃取儀萃取1~3h,萃取溫度30~60℃,萃取壓力為200~500bar,萃取結束后收集得到所述花粉超臨界萃取提取物;所述花粉原料來自虞美人、五味子或玉米。
本發明還涉及制備所述花粉超臨界萃取提取物的方法,所述方法包括:稱取花粉原料,加入萃取釜中,擰緊萃取釜蓋子,經超臨界CO2萃取儀萃取1~3h,萃取溫度30~60℃,萃取壓力為200~500bar,萃取結束后收集得到所述花粉超臨界萃取提取物;所述花粉原料來自虞美人、五味子或玉米。
優選的,所述萃取在溫度35~55℃、壓力250~350Bar下進行。
本發明還涉及所述花粉超臨界萃取提取物在制備5α?還原酶抑制劑中的應用,具體涉及所述花粉超臨界萃取提取物在制備治療良性前列腺增生(Benign Prostatic Hyperplasia,BPH)或前列腺的藥物中的應用。
本發明采用了新型的超臨界CO2萃取技術(Supercritical Fluids Extraction,SFE),超臨界流體萃取是利用超臨界狀態下的流體作為萃取溶劑,從液體或固體物料中萃取出某種組分的一種分離技術。超臨界流體在具有較高的溶解能力的同時還具有較高的傳質速率、較好的流動性能和很快達到平衡的能力。而且,由于溫度和壓力在臨界點附近的微小變化能夠引起溶解能力的顯著變化,這使得超臨界流體具有良好的可調節性和選擇性。它克服了傳統萃取法費時費力、回收率低、污染嚴重、操作繁瑣等問題,特別是消除了有機溶劑對人體和環境的危害,因此被喻為“綠色環保技術”,并已廣泛應用于醫藥、食品、化妝品及香料工業等領域。CO2因其無毒、無味、不燃、無殘留、價廉、易精制等特點,常被用作天然產物超臨界萃取的溶劑。另外超臨界流體萃取由于是在常溫高壓無氧的條件下萃取,避免了花粉中“熱敏性”“易氧化”萜烯類、芳香性活性物質。
5α?還原酶的制備:取清潔級WISTAR雄性大鼠5只,禁食不禁水過夜后脫頸椎處死,取出肝臟冰臺上剪碎。用預冷的緩沖液在玻璃勻漿器制成1:5勻漿,在4℃下,10000 g勻漿15 min,取胞漿部分100000 g離心l h,沉淀即為粗肝臟微粒提取物,加入一定體積緩沖液,并用玻璃勻漿器懸浮。分裝,-80℃冰箱保存。
5α?還原酶的體外篩選模型:睪酮75 μM,NADPH 40 μM,酶提取液66 μg,在含有1,4?二硫代蘇糖醇(DTT)1 mM,磷酸鈉20 mM,pH 6.5的緩沖溶液中,在37℃的溫度下,反應4 min。連續監測4 min內340 nm處反應體系吸光值的變化,以變化的速度為5α?還原酶的活力。根據NADPH標準曲線、抑制劑活力單位及抑制百分率的計算公式,計算出抑制率的大小。
5α?還原酶活力單位定義:在溫度為37℃的反應體系中,使NADPH濃度每分鐘下降1 μmol/L的酶量為一個活力單位。
抑制百分率=(1-抑制劑活力/酶活力)×100%
本申請發明人實驗發現虞美人、五味子、玉米三種花粉超臨界提取物抑制5α?還原酶效果較明顯,其半抑制濃度(IC50)分別為:虞美人花粉,120~150 μg/mL;五味子花粉,80~110 μg/mL;玉米花粉,120~150 μg/mL;與陽性對照非那雄胺的半抑制濃度(IC50=32.5 μg/mL)較為接近,其他花粉(包括油菜花粉)均不具有明顯的體外抑制5α?還原酶活性。此外發明人也進行了花粉的乙醇和水提取物制備,發現醇提物和水提物活性遠不如超臨界提取物。
本發明的有益性主要體現在:采用本發明方法,可獲得3種具有較好5α?還原酶抑制活性的花粉超臨界萃取提取物,原料來源安全,而且本發明采用的超臨界萃取過程不涉及有毒有害的有機溶劑,制成品毒副作用較少,安全性高,十分有利于后續醫藥保健食品的開發。
(四)具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述,但本發明的保護范圍并不僅限于此:
實施例1:
虞美人花粉(采自甘肅武威)→稱取3 g→加入30 ml體積的萃取釜(少許脫脂棉預先墊入萃取釜底部,以防止塞住出口管路),擰緊萃取釜蓋子→超臨界CO2萃取儀(SFE?prime,美國ASI公司)萃取2 h,萃取溫度40 ℃,萃取壓力為300 bar→萃取結束后用小玻璃瓶收集超臨界萃取物,并對其進行體外5α?還原酶抑制活性實驗,測得其IC50=138 μg/mL。
實施例2:
五味子花粉(采自內蒙臨河)→稱取4 g→加入30 ml體積的萃取釜(少許脫脂棉預先墊入萃取釜底部,以防止塞住出口管路),擰緊萃取釜蓋子→超臨界CO2萃取儀(SFE?prime,美國ASI公司)萃取3 h,萃取溫度53 ℃,萃取壓力為350 bar→萃取結束后用小玻璃瓶收集超臨界萃取物,并對其進行體外5α?還原酶抑制活性實驗,測得其IC50=92 μg/mL,
實施例3:
玉米花粉(采自山西長治)→稱取5g→加入30 ml體積的萃取釜(少許脫脂棉預先墊入萃取釜底部,以防止塞住出口管路),擰緊萃取釜蓋子→超臨界CO2萃取儀(SFE?prime,美國ASI公司)萃取1.5 h,萃取溫度45 ℃,萃取壓力為250 bar→萃取結束后用小玻璃瓶收集超臨界萃取物,并對其進行體外5α?還原酶抑制活性實驗,測得其IC50=138 μg/mL,
實施例5:三種花粉超臨界提取物的脂肪酸和甾醇分析
脂肪酸分析:脂肪酸甲酯化,取超臨界萃取物10 mg左右,加入1 ml 0.5N NaOH?CH3OH溶液,充氮90 ℃水浴皂化10 min,冷卻至室溫后加入1 ml的14%三氟化硼?甲醇溶液,于60 ℃水浴酯化5 min,冷卻后加入6 ml正己烷萃取,萃取液加適量無水硫酸鈉去除痕量水,0.45 μm微孔過濾后待色譜檢測用。
氣相色譜條件:色譜柱,DB?23;載氣,N2,1 kg/cm2;進樣溫度,260 ℃;進樣量,1 μl;升溫方式為130 ℃保留1 min,5 ℃/min上升到170 ℃,保留3 min,2.7 ℃/min上升到215 ℃,保留8 min,40 ℃/min上升到230 ℃,保留1 min。
根據對照品的出峰時間進行定性,數據處理系統按面積歸一法得到各脂肪酸在超臨界提取物中脂肪酸的相對百分含量。

注:ND表示未檢測到。
甾醇分析:取0.100 g 超臨界萃取物與10% 氫氧化鉀乙醇溶液(m/V)5 mL 加入到25 mL三角瓶中,在80℃水浴中回流加熱30 min后,加入30 mL飽和NaCl 溶液,轉入分液漏斗中,用25 mL正己烷萃取3 次,水洗至pH 中性后以無水硫酸鈉脫水,于旋轉蒸發器上40℃蒸干。加入吡啶和衍生化試劑混合物(吡啶:衍生化試劑=3:1),70℃反應30 min后進行色譜分析。
氣相色譜條件:毛細管柱:HP?5MS 柱(30 m×0.25 mm,0.32 μm);升溫程序:起始溫度150 ℃,保持4 min,以10℃/min 升至240℃,保持2 min,然后以5℃/min 升至310 ℃,保持13 min。進樣口溫度310℃;載氣流速1.0 mL/min;分流比20:1。
質譜條件:電子轟擊離子源(EI);電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃;接口溫度300 ℃;掃描質量范圍20~510 u。各組分經過與標準品對照及NIST 標準譜庫檢索相匹配,確定其結構。采用面積歸一法得到各甾醇在超臨界提取物中的相對百分含量。

由檢測結果所見,按照本發明方法制得的3種5α?還原酶抑制劑潛在的活性成分為脂肪酸和甾醇類物質,由于采用的制備工藝過程不涉及有毒有害溶劑,不僅環境友好,而且使用安全性高,因此具有潛在的BPH和前列腺癌的醫藥保健食品開發應用價值。

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一種 花粉 臨界 萃取 提取物 及其 制備 應用
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