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FOXP3肽疫苗.pdf

摘要
申請專利號:

CN200780051977.4

申請日:

2007.12.26

公開號:

CN101641369B

公開日:

2014.10.22

當前法律狀態:

終止

有效性:

無權

法律詳情: 未繳年費專利權終止IPC(主分類):C07K 7/06申請日:20071226授權公告日:20141022終止日期:20151226|||授權|||實質審查的生效|||公開
IPC分類號: C07K7/06; A61K39/00; A61K48/00; A61P35/00; A61P37/02; A61P37/04; C12N5/00 主分類號: C07K7/06
申請人: 腫瘤療法科學股份有限公司
發明人: 角田卓也; 大澤龍司
地址: 日本神奈川縣
優先權: 2007.01.03 US 60/878,615; 2007.03.22 US 60/896,472
專利代理機構: 北京市柳沈律師事務所 11105 代理人: 羅天樂
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200780051977.4

授權公告號:

|||101641369B||||||

法律狀態公告日:

2017.02.15|||2014.10.22|||2010.03.24|||2010.02.03

法律狀態類型:

專利權的終止|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明提供了Foxp3肽,其包含SEQ?ID?NO:3-5,7-9,12,15-19,22,24,27-30,37,67或74的氨基酸序列,并提供了如下的Foxp3肽,其包含上述的氨基酸序列并且其中替換或添加了1個、2個或數個氨基酸,并具有細胞毒T細胞誘導能力(inducibility),本發明還提供了包含這些Foxp3肽的用于調控調節T細胞的藥物。本發明的Foxp3肽可以用作疫苗。

權利要求書

1: 一種肽,其由SEQ?ID?NO:3-5、7-9、12、15-19、22、24、27-30、 37、67或74的氨基酸序列組成。
2: 一種具有細胞毒T細胞誘導能力的肽,其中該肽包含選自下組的氨 基酸序列: (a)SEQ?ID?NO:3-5、7-9、12、17、67或74,和 (b)SEQ?ID?NO:3-5、7-9、12、17、67或74,其中替換或添加了1個、 2個或數個氨基酸。
3: 權利要求2的肽,其中自N端起第二個氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、 甲硫氨酸或色氨酸。
4: 權利要求2或3的肽,其中C端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、異亮 氨酸、色氨酸或甲硫氨酸。
5: 一種具有細胞毒T細胞誘導能力的肽,其中該肽包含選自下組的氨 基酸序列: (a)SEQ?ID?NO:15-19、22、24、27-30或37,和 (b)SEQ?ID?NO:15-19、22、24、27-30或37,其中替換或添加了1個、 2個或數個氨基酸。
6: 權利要求5的肽,其中自N端起第二個氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸。
7: 權利要求5或6的肽,其中C端氨基酸是纈氨酸或亮氨酸。
8: 權利要求2或5的肽,其中被替換的肽包含SEQ?ID?NO:95、97或 98的氨基酸序列。
9: 用于調節T-reg細胞的藥劑,其包含權利要求1-7中任一項的一種或 多種肽,或編碼所述肽的多核苷酸。
10: 權利要求9的藥劑,其意圖用于抑制T-reg細胞的增殖。
11: 權利要求9的藥劑,其意圖施用于HLA抗原為HLA-A24的受試者。
12: 權利要求9的藥劑,其意圖施用于HLA抗原為HLA-A02的受試者。
13: 權利要求9的藥劑,其意圖用于抑制T-reg細胞的功能。
14: 權利要求9的藥劑,其意圖用于治療癌癥。
15: 權利要求14的藥劑,其是疫苗。
16: 權利要求15的藥劑,其除了包含權利要求2、5的肽或編碼該肽的 多核苷酸之外,還包含具有誘導針對癌性細胞的細胞毒T細胞的能力的其 它肽,或者編碼所述其它肽的其它多核苷酸。
17: 一種外來體,所述外來體在其表面上呈遞包含HLA抗原和權利要 求2或5的肽的復合物。
18: 權利要求14的外來體,其中所述HLA抗原是HLA-A24。
19: 權利要求14的外來體,其中所述HLA抗原是HLA-A2402。
20: 權利要求14的外來體,其中所述HLA抗原是HLA-A02。
21: 權利要求14的外來體,其中所述HLA抗原是HLA-A0201。
22: 通過施用權利要求2、5的肽或編碼該肽的多核苷酸來誘導具有高 的細胞毒T細胞誘導能力的抗原呈遞細胞的方法。
23: 通過施用權利要求2、5的肽或編碼該肽的多核苷酸來誘導細胞毒 T細胞的方法。
24: 一種誘導權利要求19的具有高細胞毒T細胞誘導能力的抗原呈遞 細胞的方法,其中該方法包括向抗原呈遞細胞轉移包含編碼權利要求2或5 的肽的多核苷酸的基因。
25: 一種分離的細胞毒T細胞,其是被權利要求2的肽誘導的。
26: 一種抗原呈遞細胞,其包含HLA抗原與權利要求2或5的肽之間 形成的復合物。
27: 權利要求25的抗原呈遞細胞,其是通過權利要求21的方法誘導的。
28: 一種調節受試者體內T-reg細胞的方法,包括向所述受試者施用疫 苗,所述疫苗包含權利要求2的肽或該肽的免疫活性片段,或編碼該肽的 多核苷酸。

說明書


FOXP3肽疫苗

    【技術領域】

    【相關申請的交叉引用】

    本申請要求享受分別于2007年1月3日和2007年3月22日遞交的美國臨時專利申請No.60/878,615和美國臨時專利申請No.60/896,472的權益,并通過提述并入它們的全部內容。

    本發明涉及生物學領域,更具體地,涉及癌癥治療領域。特別地,本發明涉及Foxp3肽,它們可以極其有效地用作癌癥疫苗,并涉及用于治療和預防腫瘤的藥物。

    背景技術

    已經證明,CD8+細胞毒T淋巴細胞(CTLs)可以識別來源于MHC?I類分子上呈遞的腫瘤相關抗原(TAAs)的表位肽,然后殺死腫瘤細胞。自從MAGE家族作為第一個TAA實例被發現以來,利用免疫學方法已經發現了許多其他的TAAs(Boon?T,Int?J?Cancer?54:177-80,1993;Boon?T?et?al.,J?Exp?Med183:725-9,1996;van?der?Bruggen?P?et?al.,Science?254:1643-7,1991;BrichardV?et?al.,J?Exp?Med?178:489-95,1993;Kawakami?Y?et?al.,J?Exp?Med?180:347-52,1994),并且其中一些作為免疫治療的靶標現已處于臨床開發階段。

    可以誘導強烈并且特異的抗腫瘤免疫應答的新TAA的鑒定,為進一步開發各類癌癥中的肽疫苗接種的臨床應用策略提供了保證(Harris?CC,J?NatlCancer?Inst?88:1442-5,1996;Butterfield?LH?et?al.,Cancer?Res?59:3134-42,1999;Vissers?JLM?et?al.,Cancer?Res?59:5554-9,1999;Van?der?Burg?SH?et?al.,JImmunol?156:3308-14,1996;Tanaka?F?et?al.,Cancer?Res?57:4465-8,1997;Fujie?T?et?al.,Int?J?Cancer?80:169-72,1999;Kikuchi?M?et?al.,Int?J?Cancer?81:459-66,1999;Oiso?M?et?al.,Int?J?Cancer?81:387-94,1999)。

    已經進行了各種類型的抗原特異性免疫治療,然而,迄今為止,就腫瘤的顯著退縮這一點而言,所獲得的臨床功效甚低(Rosenberg?SA?et?al.,NatMed?10:909-15,2004)。一個主要的原因是,來自晚期癌癥患者的腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)和外周血淋巴細胞(PBL)的免疫應答不佳(Miescher?S?et?al.,J?Immunol?136:1899-907,1986)。這種由腫瘤誘導的免疫抑制是對腫瘤抗原應答不良(Young?RC?et?al.,Am?J?Med?52:63-8,1972),T細胞增殖不足(Alexander?JP?et?al.,Cancer?Res?53:1380-7,1993),細胞因子產生減少(Horiguchi?S?et?al.,Cancer?Res?59:2950-6,1999),和T細胞和天然殺傷細胞的信號傳導缺陷(Kono?K?et?al.,Clin?Cancer?Res?11:1825-8,1996,Kiessling?R?etal.,Cancer?Immunol?Immunother?48:353-62,1999)的原因。

    為了提高免疫治療的臨床功效,重要的是克服腫瘤所誘導的免疫抑制因子的影響。免疫耐受以及針對自身免疫的保護作用是由多種中樞和外周性的機制造成的,包括胸腺中自反應T細胞的克隆刪除,和在外周遇到自身抗原時無反應性的誘導。最近人們已經闡明,以共表達CD4和CD25標志為特征的調節T細胞(T-regs)是一類功能上獨特的T細胞群體,它們發揮維持免疫內平衡(immune?homeostasis)的作用(Sakaguchi?S?et?al.,J?Immunol.155:1151-64,1995,Dieckmann?D?et?al.,J?Exp?Med?193:1303-10,2001)。T-reg細胞是抑制各類免疫應答的主要參與者之一(Miescher?S?et?al.,J?Immunol136:1899-907,1986;Young?RC?et?al.,Am?J?Med?52:63-72,1972;Alexander?JPet?al.,Cancer?Res?53:1380-7,1997;Horiguchi?S?et?al.,Cancer?Res?59:2950-6,1999;Kono?K?et?al.,Clin?Cancer?Res?11:1825-8,1996;Kiessling?R?et?al.,Cancer?Immunol?Immunother?48:353-62,1999)。

    盡管對于T-reg的產生和功能至關重要的分子相互作用和信號途徑尚不完全清楚,但是T-reg需要由Foxp3基因(GenBank登錄號No.NM_014009;SEQ?ID?NO?1)編碼的叉頭狀轉錄因子(forkhead?transcription?factor)scurfin(Foxp3;SEQ?ID?NO?2),該因子控制它們的發育和調節性質(Fontenot?JD?et?al.,Nat?Immunol?4:330-6,2003,Hori?S?et?al.,Science?299:1057-61,2003,KhattriR?et?al.,Nat?Immunol?4:304-6,2003)。進一步,用經Foxp3?mRNA轉染的樹突細胞對小鼠進行疫苗接種可引發Foxp3特異的CTL應答(Smita?N?et?al.,Cancer?Res.Jan?1;67(1):371-80,2007)。

    因此,Foxp3可作為癌癥免疫治療的靶標,而且,Foxp3編碼的蛋白的部分肽可以作為被CTL識別的抗原。

    發明概要

    為了提高免疫治療的臨床功效,重要的是克服被腫瘤誘導的免疫抑制因子。已經發現T-reg細胞是抑制各種類型免疫應答的主要參與者之一。因此,開發出靶向Foxp3表達性T-reg的疫苗,以克服T-reg誘導的免疫抑制,是非常重要的。

    本發明是基于,至少部分地基于,從Foxp3的基因產物中鑒定了可引發特異針對相應Foxp3肽或表位的細胞毒T淋巴細胞(CTLs)表位肽。用來自Foxp3的結合HLA-A*24和HLA-A*02的候選肽刺激健康供體的外周血單核細胞(PBMC)。已經證明,這些肽是HLA-A24或HLA-A02限制性表位肽,可以誘導強烈而特異的針對表達Foxp3的T-reg的免疫應答。

    因此,本發明提供了用于調節免疫抑制的方法,這些方法包括施用本發明Foxp3多肽地步驟。施用Foxp3多肽可誘導例如細胞毒T淋巴細胞的抗免疫抑制作用(也就是逆轉或對抗免疫抑制)。因此,本發明提供了用于誘導抗免疫抑制的方法,這些方法包括施用Foxp3多肽的步驟,并提供了包含Foxp3多肽的用于調節免疫抑制的藥劑。

    在一個方面中,本發明提供了肽,所述肽包含選自下組的氨基酸序列或由其組成:SEQ?ID?NO:3-5,7-9,12,15-19,22,24,27-30,37,67或74。

    在另一個方面中,本發明提供了具有細胞毒T細胞誘導能力的肽,其中該肽包含選自下組的氨基酸序列或由其組成:

    (a)SEQ?ID?NO:3-5,7-9,12,17,67或74;和

    (b)SEQ?ID?NO:3-5,7-9,12,17,67或74,其中替換或添加了1個、2個或數個氨基酸。

    在進一步的方面中,本發明提供了具有細胞毒T細胞誘導能力的肽,其中該肽包含選自下組的氨基酸序列:

    (a)SEQ?ID?NO:15-19,22,24,27-30,或37,和

    (b)SEQ?ID?NO:15-19,22,24,27-30,或37,其中替換或添加了1個、2個或數個氨基酸。

    關于實施方案,在一些實施方案中,自N端起的第二個氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸。在一些實施方案中,C端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸。在一些實施方案中,自N端起的第二個氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸。在一些實施方案中,C端氨基酸是纈氨酸或亮氨酸。例如,經取代的肽包含SEQ?ID?NO:95,97或98的氨基酸序列。

    本發明進一步提供了組合物,其包含本發明的Foxp3肽或編碼本發明Foxp3肽的多核苷酸,和藥學上可接受的載體或賦形劑。在一些實施方案中,該組合物被配制成作為疫苗施用。

    組合物可以包括一種本發明的肽,或多種不同的本發明的Foxp3肽。這些組合物可用于抑制T-reg細胞,例如抑制T-reg細胞的增殖或阻遏其功能。

    在一些實施方案中,所述組合物包含一種或多種這樣的Foxp3肽,它們可在HLA抗原是HLA-A24的受試者中引發抑制T-reg細胞的免疫應答。在一些實施方案中,所述組合物包含一種或多種這樣的Foxp3肽,它們可在HLA抗原是HLA-A02的受試者中引發抑制T-reg細胞的免疫應答。

    在另一個方面中,本發明提供了這樣的組合物,它們包含編碼本發明的Foxp3肽的多核苷酸。在一些實施方案中,該組合物包括編碼多個本發明Foxp3肽的多個(例如兩個或更多個)多核苷酸。在一些實施方案中,該組合物包含編碼多個本發明Foxp3肽的多核苷酸。

    在一些實施方案中,該組合物包含其它具有誘導針對癌性細胞的細胞毒T細胞的能力的肽,或者編碼所述其它肽的其它多核苷酸。

    在進一步的方面中,本發明提供一種外來體(exosome),其表面上呈遞包含HLA抗原和本發明Foxp3肽的復合物。在一些實施方案中,所述HLA抗原選自下組:HLA-A24,HLA-A2402,HLA-A02和HLA-A0201。

    在一個相關的方面中,本發明提供用于治療癌癥(例如減少腫瘤細胞生長,促進腫瘤細胞死亡)的方法,所述方法是通過向個體施用Foxp3肽或編碼Foxp3肽的多核苷酸。

    在另一個方面中,本發明提供誘導具有高的細胞毒T細胞誘導能力的抗原呈遞細胞的方法,所述方法是通過施用本發明的Foxp3肽或編碼Foxp3肽的多核苷酸。

    在另一個方面中,本發明提供誘導細胞毒T細胞的方法,所述方法是通過施用本發明的Foxp3肽或編碼Foxp3肽的多核苷酸。

    在一個相關方面中,本發明提供了一種分離的細胞毒T細胞,其是被本發明Foxp3肽誘導的。

    在另一個方面中,本發明提供了一種抗原呈遞細胞,其包含HLA抗原與本發明的Foxp3肽之間形成的復合物。在一些實施方案中,該抗原呈遞細胞是分離的。

    在進一步的方面中,本發明提供了調節受試者中T-reg細胞的方法,包括向受試者施用疫苗,該疫苗包含本發明的Foxp3肽或該肽的免疫活性片段,或者編碼該肽的多核苷酸。

    在本發明方法的實施中,受試者或患者可以是人。

    應當理解,無論是前述的發明概要還是下文的詳細說明都是例示性的實施方案,對本發明或本發明的其他變化實施方案不構成限制。

    附圖簡述

    [圖1]圖1顯示的照片顯示了對用來源于Foxp3的肽誘導后的CTL進行的IFN-gamma?ELISPOT測定的結果。在圖1A中,如下編號的孔中的CTL:用Foxp3-A24-9-363(SEQ?ID?NO?3)刺激的2號和7號孔,用Foxp3-A24-9-366(SEQ?ID?NO?7)刺激的1號孔和6號孔,用Foxp3-A24-9-190(SEQ?ID?NO?9)刺激的5號孔,用Foxp3-A24-10-87(SEQ?ID?NO?67)和Foxp3-A24-10-60(SEQID?NO?74)刺激的7號孔,與對照相比,顯示出強烈的IFN-gamma產生。在圖1B中,如下編號的孔中的CTL:用Foxp3-A24-9-207(SEQ?ID?NO?4)刺激的4號孔,用Foxp3-A24-9-332(SEQ?ID?NO?5)刺激的6號孔,用Foxp3-A24-9-337(SEQ?ID?NO?8)刺激的6號孔,和用Foxp3-A24-10-114(SEQID?NO?12)刺激的1號孔,與對照相比,顯示出強烈的IFN-gamma產生。

    [圖2A-B]圖2顯示的照片顯示了對用來源于Foxp3的肽誘導后的CTL進行的IFN-gamma?ELISPOT測定的結果。在圖2A中,如下編號的孔中的CTL:用Foxp3-A2-9-390(SEQ?ID?NO?15)刺激的2號孔,用Foxp3-A2-9-69(SEQ?ID?NO?16)刺激的2號孔,用Foxp3-A2-9-252(SEQ?ID?NO?17)刺激的6號孔,用Foxp3-A2-10-359(SEQ?ID?NO?22)刺激的4號孔,用Foxp3-A2-263(SEQ?ID?NO?24)刺激的7號孔,和用Foxp3-A2-10-94(SEQ?ID?NO?27)刺激的2號孔和5號孔,與對照相比,顯示出強烈的IFN-gamma產生。在圖2B中,如下編號的孔中的CTL:用Foxp3-A2-10-233(SEQ?ID?NO?28)刺激的全部孔,用Foxp3-A2-10-152(SEQ?ID?NO?29)刺激的6號孔和7號孔,用Foxp3-A2-10-77(SEQ?ID?NO?30)刺激的5號孔,和用Foxp3-A2-10-246(SEQID?NO?37)和用Foxp3-A2-10-94(SEQ?ID?NO?27)刺激的1號孔,與對照相比,顯示出強烈的IFN-gamma產生。

    [圖2C]在圖2C中,如下編號的孔中的CTL:用Foxp3-A2-9-390(SEQID?NO?15)刺激的1號,2號,4號,5號,7號,9號,11號孔和12號孔,用Foxp3-A2-9-304(SEQ?ID?NO?19)刺激的5號孔和11號孔,用Foxp3-A2-9-68(SEQ?ID?NO?7)刺激的7號孔,和用Foxp3-A2-9-252(SEQ?ID?NO?17)刺激的12號孔,與對照相比,顯示出強烈的IFN-gamma產生。

    [圖3A-D]圖3顯示,對陽性孔中的細胞進行擴增并執行IFN-gammaELISA測定。在圖3A,B和C中,與對照(實方形)相比,用Foxp3-A02-9-390(SEQ?ID?NO:15)刺激的CTL系(實菱形)顯示強烈的IFN-gamma產生。在圖3D中,與對照(實方形)相比,用Foxp3-A02-9-252(SEQ?ID?NO:17)處理的CTL系(實菱形)顯示強烈的IFN-gamma產生。

    [圖3E-G]在圖3E中,與對照(實方形)相比,用Foxp3-A24-10-60(SEQID?NO:74)處理的CTL系(實菱形)顯示強烈的IFN-gamma產生。在圖3F中,與對照(實方形)相比,用Foxp3-A02-10-94(SEQ?ID?NO:27)處理的CTL系(實菱形)顯示強烈的IFN-gamma產生。在圖3G中,與對照(實方形)相比,用Foxp3-A24-10-87(SEQ?ID?NO:67)處理的CTL系(實菱形)顯示強烈的IFN-gamma產生。

    [圖4]圖4顯示了針對內源表達Foxp3和HLA-A*02或24的靶細胞的特異CTL活性。在圖4A和B中,用Foxp3-A02-9-390(SEQ?ID?NO:15)和Foxp3-A02-9-252(SEQ?ID?NO:17)生成的CTL系針對用Foxp3和HLA-A02二者轉染的293T顯示出高度的特異CTL活性。而另一方面,它針對對照沒有顯示出顯著的特異CTL活性。在圖4C中,用Foxp3-A02-9-252(SEQ?IDNO:17)生成的CTL系針對用Foxp3和HLA-A24二者轉染的293T顯示高度的特異CTL活性。另一方面,它針對對照沒有顯示出顯著的特異CTL活性。

    [圖5]圖5顯示了Foxp3-252_h和Foxp3-252_m肽的體內免疫原性測定。將IFA偶聯肽或僅IFA在第0天和第7天皮下注射到BALB/c小鼠體內。在第14天,收集經接種小鼠的脾細胞,并用作應答(responder)細胞。經相應肽(空心方形)沖擊或沒有用肽(實心方形)沖擊過的1x104RLmalel細胞用作刺激(stimulator)細胞,用于IFN-gamma?ELISPOT測定。用Foxp3-252_h(A)和Foxp3-252_m(B)對5只小鼠(M1-M5)進行接種,對3只小鼠(N1-N3)進行沒有任何肽的IFA注射,作為每個測定的對照。

    [圖6]圖6顯示了用Foxp3表位肽進行疫苗接種的體內抗腫瘤效果。在第0天,將1x105個4T1乳腺癌細胞系注射到BALB/c小鼠體內。在第3和10天,注射與Foxp3-252_h(-空心圓-),Foxp3-252_m(-實心方塊-)偶聯的IFA或者沒有偶聯肽(-實心三角形-)的IFA。作為正常腫瘤生長對照,在本測定中還制備了沒有接種疫苗的小鼠(-x-)。用Foxp3表位肽進行接種觀察到了顯著的腫瘤生長抑制差異。*,P<0.01;**,P<0.005。

    [圖7A-B]圖7顯示了Foxp3-9-252取代物對HLA分子的親和性的測定。在圖7A中,用Foxp3-9-252-WT誘導的CTL識別在HLA-A2分子上呈遞Foxp3-9-252-9V肽的細胞。進行IFN-gamma?ELISPOT測定,分別使用經Foxp3-9-252-WT肽誘導的CTL系作為應答細胞,經Foxp3-9-252-WT或Foxp3-9-252-9V肽沖擊的T2細胞作為刺激細胞。制備未經肽沖擊的T2細胞作為對照。在圖7B中,Foxp3-9-252-9V和Foxp3-9-252-WT顯示相似的對HLA-A2分子的親和性。進行IFN-gamma?ELISPOT測定,分別使用經Foxp3-9-252-WT肽誘導的CTL系作為應答細胞(1x105個細胞/孔)和經Foxp3-9-252-WT(-實心圓-),Foxp3-9-252-9V(-空心圓-)或HIV-A02(-實心三角形-)肽沖擊的T2細胞作為刺激細胞(1x104個細胞/孔)。制備未經肽沖擊的T2細胞作為對照。在每種肽和肽濃度下,刺激細胞的肽沖擊在37攝氏度下進行2小時。

    [圖7C-D]在圖7C中,CTL可以被靶向HLA-A2分子的Foxp3-9-252取代物的刺激所誘導。針對所有靶向HLA-A2分子的取代肽的CTL是根據“材料和方法”中描述的方法產生的。用Foxp3-9-252-3M刺激的3號和7號孔,用Foxp3-9-252-3L刺激的7號孔,和用Foxp3-9-252-9V刺激的8號孔中的細胞與對照相比顯示了IFN-gamma產生。在圖7D中,用Foxp3-9-252-9V產生的CTL可識別涂布有Foxp3-9-252-WT肽的刺激細胞。用Foxp3-9-252-9V肽誘導的CTL系被用作應答細胞。與Foxp3-9-252-9V(-實心圓-)或與Foxp3-9-252-WT(-空心圓-)肽溫育過的T2細胞,或沒有用肽(-空心方形-)溫育過的T2細胞在本測定中用作刺激細胞(1x104個細胞/孔)。

    發明詳細說明

    I.定義

    除非特別指出,否則本文使用的詞語“一個(或一種)”、“某個(或某種)”和“該”是指“至少一個(或至少一種)”。

    術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用,指氨基酸殘基的聚合物。這些術語適用于這樣的氨基酸聚合物,其中一個或多個氨基酸殘基是經修飾的殘基或者是非天然存在的殘基,例如相應的天然存在氨基酸的人工化學模擬物,也適用于天然存在的氨基酸聚合物。

    本文使用的術語“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸,以及與天然存在氨基酸相似地發揮功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是那些由遺傳密碼編碼的氨基酸,以及那些翻譯后在細胞內被修飾的氨基酸(例如羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸)。短語“氨基酸類似物”是指具有和天然存在的氨基酸相同的基本化學結構(α碳與一個氫原子、一個羧基、一個氨基和一個R基結合),但具有經修飾的R基或者經修飾的骨架的化合物(例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍)。短語“氨基酸模擬物”是指具有與一般氨基酸不同的結構但相似的功能的化學化合物。

    在本文中,氨基酸用其眾所周知的三字母符號或者IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的單字母符號表示。

    在本文中,除非特別指出,術語“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”可互換使用,并且與氨基酸類似,可以用它們普遍接受的單字母編碼表示。

    除非另外定義,否則本文使用的全部技術和科學術語的意思與本發明所屬領域的普通技術人員所公知的意思相同。當存在矛盾時,以本專利說明書包括定義為準。

    II.肽

    為了證明來自Foxp3的肽可以發揮被細胞毒T細胞(CTLs)所識別的抗原的功能,在本發明中,對由Foxp3亞序列構成的肽進行了分析,看它們是否是被世界上常見的HLA等位基因——HLA-A24或HLA-A02——限制的抗原表位(Date?Y?et?al.,Tissue?Antigens?47:93-101,1996;Kondo?A?et?al.,JImmunol?155:4307-12,1995;Kubo?RT?et?al.,J?Immunol?152:3913-24,1994)。,利用關于它們對HLA-A24和HLA-A02的結合親和性的信息鑒定出由Foxp3亞序列組成的HLA-A24和HLA-A02結合肽的候選物。在用載有這些肽的樹突細胞(DCs)體外刺激T細胞之后,用如下的肽成功地建立了CTL:

    Foxp3-A24-9-363(SEQ?ID?NO?3),

    Foxp3-A24-9-366(SEQ?ID?NO?7),

    Foxp3-A24-9-190(SEQ?ID?NO?9),

    Foxp3-A24-9-207(SEQ?ID?NO?4),

    Foxp3-A24-9-332(SEQ?ID?NO?5),

    Foxp3-A24-9-337(SEQ?ID?NO?8),

    Foxp3-A24-10-114(SEQ?ID?NO?12),

    Foxp3-A2-9-390(SEQ?ID?NO?15),

    Foxp3-A2-9-69(SEQ?ID?NO?16),

    Foxp3-A2-9-252(SEQ?ID?NO?17),

    Foxp3-A2-10-359(SEQ?ID?NO?22),

    Foxp3-A2-10-263(SEQ?ID?NO?24),

    Foxp3-A2-10-94(SEQ?ID?NO?27),

    Foxp3-A2-10-233(SEQ?ID?NO?28),

    Foxp3-A2-10-152(SEQ?ID?NO?29),

    Foxp3-A2-10-77(SEQ?ID?NO?30),

    Foxp3-A2-10-246(SEQ?ID?NO?37),

    Foxp3-A2-9-68(SEQ?ID?NO?18),

    Foxp3-A2-9-304(SEQ?ID?NO?19),

    Foxp3-A24-10-87(SEQ?ID?NO?67)和

    Foxp3-A24-10-60(SEQ?ID?NO?74)。

    建立的這些CTL針對經肽沖擊的靶細胞顯示出強烈而特異的CTL活性。這些結果與如下的結論一致,即:Foxp3是被CTL識別的抗原,并且

    Foxp3-A24-9-363(SEQ?ID?NO?3),

    Foxp3-A24-9-366(SEQ?ID?NO?7),

    Foxp3-A24-9-190(SEQ?ID?NO?9),

    Foxp3-A24-9-207(SEQ?ID?NO?4),

    Foxp3-A24-9-332(SEQ?ID?NO?5),

    Foxp3-A24-9-337(SEQ?ID?NO?8),

    Foxp3-A24-10-114(SEQ?ID?NO?12),

    Foxp3-A2-9-390(SEQ?ID?NO?15),

    Foxp3-A2-9-69(SEQ?ID?NO?16),

    Foxp3-A2-9-252(SEQ?ID?NO?17),

    Foxp3-A2-10-359(SEQ?ID?NO?22),

    Foxp3-A2-10-263(SEQ?ID?NO?24),

    Foxp3-A2-10-94(SEQ?ID?NO?27),

    Foxp3-A2-10-233(SEQ?ID?NO?28),

    Foxp3-A2-10-152(SEQ?ID?NO?29),

    Foxp3-A2-10-77(SEQ?ID?NO?30),

    Foxp3-A2-10-246(SEQ?ID?NO?37),

    Foxp3-A2-9-68(SEQ?ID?NO?18),

    Foxp3-A2-9-304(SEQ?ID?NO?19),

    Foxp3-A24-10-87(SEQ?ID?NO?67)和

    Foxp3-A24-10-60(SEQ?ID?NO?74)是被HLA-A24和HLA-A2限制的表位肽。因為Foxp3在大多數癌癥患者中表達,并且與由腫瘤所致免疫抑制因子(immunosuppressive?factors?due?to?tumors)所誘導的免疫抑制有關,所以Foxp3是用于免疫治療的良好靶標,用于提高針對癌癥的抗原特異性免疫治療的臨床功效。

    因此,本發明提供了九肽(由9個氨基酸殘基構成的肽)和十肽(由10個氨基酸殘基構成的肽)。本發明的Foxp3肽結合HLA分子,并誘導細胞毒T淋巴細胞(CTLs)中的細胞毒活性。更具體地,本發明提供了由選自SEQ?IDNO:3-5,7-9,12,15-19,22,24,27-30,37,67或74的氨基酸序列所組成的肽。

    一般地,現在可以在互聯網上獲得軟件程序,例如Parker?KC.et?al,JImmunol.1994?Jan?1;152(1):163-75中描述的程序,用于通過計算機(in?silico)計算各種肽與HLA抗原之間的結合親和性。與HLA抗原的結合親和性可以在體外測量,例如在下列文獻中描述的:Parker?KC.et?al,J?Immunol.1994Jan?1;152(1):163-75.;Nukaya?I.et?al,Int?J?Cancer.1999Jan?5;80(1):92-7.;Kuzushima?K,et?al.((2001)Blood.;98(6):1872-81.;Journal?of?ImmunologicalMethods,1995,185:181-190.;Protein?Science,2000,9:1838-1846)。

    而且,本發明的Foxp3肽在保留其CTL誘導能力的前提下可以在兩側具有額外的氨基酸殘基。這些具有CTL誘導能力的肽可以少于大約40個氨基酸,例如少于大約20個氨基酸,例如少于大約15個氨基酸。位于由選自SEQ?ID?NO:3-5,7-9,12,15-19,22,24,27-30,37,67和74的氨基酸序列組成的肽之兩側的氨基酸序列不受限制,可以由任何類型的氨基酸組成,只要其不抑制所述肽的CTL誘導能力即可。因此,本發明還提供了具有CTL誘導能力的肽,其包括選自下組的氨基酸序列:SEQ?ID?NO:3-5,7-9,12,15-19,22,24,27-30,37,67和74。

    一般知道,對蛋白質中的一個或多個氨基酸進行修飾不會影響蛋白質的功能,或者在某些情況下,甚至會提高原始蛋白質的期望功能。實際上,經過修飾的肽(也就是,由通過向原始參考序列替換或添加1個、2個或數個氨基酸殘基進行修飾而得到的氨基酸序列組成的肽)已知可以保持原始肽的生物活性(Mark?et?al.,Proc?Natl?Acad?Sci?USA?81:5662-6,1984;Zoller?andSmith,Nucleic?Acids?Res?10:6487-500,1982;Dalbadie-McFarland?et?al.,ProcNatl?Acad?Sci?USA?79:6409-13,1982)。因此,根據本發明的一個實施方案,本發明具有CTL誘導能力的肽可以由如下的氨基酸構成,其包含氨基酸序列SEQ?ID?NO:3-5,7-9,12,15-19,22,24,27-30,37,67或74,其中添加和/或替換了一個或數個氨基酸。

    本領域的技術人員會認識到,向一個氨基酸序列進行個別的添加或替換以改變單個氨基酸或少部分的氨基酸,其結果仍然會保留原始氨基酸側鏈的性質;因此被稱作“保守替換”或“保守修飾”,其中蛋白質的改變可產生具有相似功能的蛋白質。可提供功能上相似氨基酸的保守替換表是本領域眾所周知的。氨基酸側鏈性質的實例由疏水性氨基酸(A,I,L,M,F,P,W,Y,V),親水性氨基酸(R,D,N,C,E,Q,G,H,K,S,T),和具有如下共同功能基團或特征的側鏈:脂肪族側鏈(G,A,V,L,I,P);含羥基的側鏈(S,T,Y);含硫原子的側鏈(C,M);含羧酸和酰胺的側鏈(D,N,E,Q);含堿基的側鏈(R,K,H);和含芳香基的側鏈(H,F,Y,W)。此外,如下8組中,每組包含的各個氨基酸彼此是構成保守替換的:

    1)丙氨酸(A),甘氨酸(G);

    2)天冬氨酸(D),谷氨酸(E);

    3)天冬酰胺(N),谷氨酰胺(Q);

    4)精氨酸(R),賴氨酸(K);

    5)異亮氨酸(I),亮氨酸(L),甲硫氨酸(M),纈氨酸(V);

    6)苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y),色氨酸(W);

    7)絲氨酸(S),蘇氨酸(T);和

    8)半胱氨酸(C),甲硫氨酸(M)(見例如Creighton,Proteins(1984)).

    這些經過保守修飾的肽也被看作是本發明的肽。然而,本發明的肽不僅限于此,可以包括非保守修飾,只要肽保留CTL誘導能力即可。而且,經過修飾的肽不排除CTL誘導性肽的多態性變異體、種間同源物和Foxp3的等位基因(alleles)。

    可以僅對少數(例如1個,2個或數個)或少部分的氨基酸殘基進行修飾(添加或替換),同時仍然保留必要的CTL誘導能力(即CTL激活)。這里,術語“數個”是指5個或者更少,或者例如3個或者更少。被修飾的氨基酸殘基的百分比可以是SEQ?ID?NO:3-5,7-9,12,15-19,22,24,27-30,37,67和74的整個氨基酸序列的20%或者更少,例如15%或10%或者更少,例如1-5%。與已鑒定序列的整體具有至少95%,96%,97%,98%,99%的氨基酸序列同一性的Foxp3肽也是本發明意圖的。序列同一性可以用本領域已知的任何算法來測算,例如可以可在美國國立生物信息中心訪問的BLAST(萬維網地址為ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)。

    對本發明肽的同源性(即序列同一性)分析

    Foxp3-A24-9-363(SEQ?ID?NO?3),

    Foxp3-A24-9-366(SEQ?ID?NO?7),

    Foxp3-A24-9-190(SEQ?ID?NO?9),

    Foxp3-A24-9-207(SEQ?ID?NO?4),

    Foxp3-A24-9-332(SEQ?ID?NO?5),

    Foxp3-A24-9-337(SEQ?ID?NO?8),

    Foxp3-A24-10-114(SEQ?ID?NO?12),

    Foxp3-A2-9-390(SEQ?ID?NO?15),

    Foxp3-A2-9-69(SEQ?ID?NO?16),

    Foxp3-A2-9-252(SEQ?ID?NO?17),

    Foxp3-A2-10-359(SEQ?ID?NO?22),

    Foxp3-A2-10-263(SEQ?ID?NO?24),

    Foxp3-A2-10-94(SEQ?ID?NO?27),

    Foxp3-A2-10-233(SEQ?ID?NO?28),

    Foxp3-A2-10-152(SEQ?ID?NO?29),

    Foxp3-A2-10-77(SEQ?ID?NO?30),

    Foxp3-A2-10-246(SEQ?ID?NO?37),

    Foxp3-A2-9-68(SEQ?ID?NO?18),

    Foxp3-A2-9-304(SEQ?ID?NO?19),

    Foxp3-A24-10-87(SEQ?ID?NO?67)和

    Foxp3-A24-10-60(SEQ?ID?NO?74)表明它們與來源于任何其他已知的人基因產物的肽都不具有顯著的同源性。這降低了在用于免疫治療時發生未知或不良的免疫應答的可能性。

    當用于免疫治療時,本發明的肽將作為與HLA抗原的復合物被呈遞在細胞或外來體的表面上。因此,選擇除了它們的CTL誘導能力之外,還具有高的HLA結合親和性的肽。而且,肽可以通過替換、添加氨基酸殘基等進行修飾,以實現更高的結合親和性。除了自然展示的肽之外,因為通過與HLA抗原結合展示的肽序列的規則性(即一致性)是已知的(J?Immunol?152:3913,1994;Immunogenetics?41:178,1995;J?Immunol?155:4307,1994),所以可以根據這種規則性對本發明的免疫原性肽進行修飾。例如,對于顯示高HLA-A24結合親和性的肽,可以將其自N端起第二個氨基酸替換為苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸,也可以使用C端氨基酸被苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸替換的肽。另一方面,自N端起第二個氨基酸被替換為亮氨酸或甲硫氨酸并且其中C端氨基酸被替換為纈氨酸或亮氨酸的肽,可以用作具有高HLA-A02結合親和性的肽。替換不僅可以在末端氨基酸進行,還可以在肽的潛在TCR識別位置進行。Zaremba等證明,CAP1肽中的氨基酸替換可等同于或者好于原始肽(Cancer?Res.57,4570-4577,1997)。例如,經過替換的肽包含SEQ?ID?NO:95,97或98的氨基酸序列。而且,也可以向肽的N和/或C端添加1-2個氨基酸。這種經過修飾并具有高HLA抗原結合親和性的肽也包含在本發明之內。

    然而,當肽序列與具有不同功能的內源或外源蛋白質的氨基酸序列的一部分相同時,可能會誘發副作用,例如自身免疫紊亂或針對特定物質的過敏癥狀。因此,可以用可獲得的數據庫進行同源性檢索,以避免、減少或最小化肽序列與另一種蛋白質的氨基酸序列匹配的情況。當通過同源性檢索明確了不存在與目標肽相差1個或2個氨基酸的其他肽時,即可對目標肽進行修飾,以增加與HLA抗原的結合親和性,和/或增加CTL誘導能力,而沒有任何副作用的危險。

    上文描述的與HLA抗原具有高結合親和性的肽將是非常有效的。還可以對以是否存在高結合親和性作為指標而選出的候選肽檢查其CTL誘導能力的實際存在。這里,短語“CTL誘導能力”表示肽在被呈遞到抗原呈遞細胞上時誘導CTL的能力。進一步,“CTL誘導能力”包括肽誘導CTL激活、CTL增殖和增加IFN-gamma產生的能力。

    CTL誘導能力的確認可以通過誘導攜帶人MHC抗原的抗原呈遞細胞(例如B淋巴細胞、巨噬細胞和樹突細胞),或者更具體地,來源于人外周血單核白細胞的樹突細胞,并且在用肽刺激后,與CD8陽性細胞混合,然后測量由針對靶細胞的CTL所產生和釋放的IFN-gamma。作為反應系統,可以使用已產生的可以表達人HLA抗原的轉基因動物(例如在下列文獻中介紹的:BenMohamed?L,Krishnan?R,Longmate?J,Auge?C,Low?L,Primus?J,Diamond?DJ,Hum?Immunol?61(8):764-79,2000?Aug,Related?Articles,Books,Linkout?Induction?of?CTL?response?by?a?minimal?epitope?vaccine?in?HLAA*0201/DR1?transgenic?mice:dependence?on?HLA?class?II?restricted?T(H)response)。例如,靶細胞可用51Cr等進行放射性標記,細胞毒活性可以由從靶細胞釋放的放射性計算出來。或者,可以通過測量在攜帶有固定化肽的抗原呈遞細胞的存在下由CTL產生和釋放的IFN-gamma,并使用抗IFN-gamma單克隆抗體對培養基上的抑制區進行可視化,來進行檢驗。

    作為檢驗如上所述的肽CTL誘導能力的結果,具有高HLA抗原結合親和性的肽不一定具有高誘導能力。而且,從包含如SEQ?ID?NO:3-5,7-9,12,15-19,22,24,27-30,37,67或74所示的氨基酸序列的肽中選出的九肽或十肽除了具有高的HLA抗原結合親和性,還顯示出特別高的CTL誘導能力。

    除了對本發明肽的上述修飾之外,本發明的肽可以進一步與其他物質連接,只要它們保留CTL誘導能力即可。可以使用的物質包括:肽、脂、糖和糖鏈、乙酰基、天然和合成聚合物等。肽可以含有修飾,例如糖基化、側鏈氧化、或磷酸化;只要該修飾不破壞本文所述的肽的生物活性即可。可以進行這些類型的修飾來提供額外的功能(例如靶向功能和遞送功能)或者使多肽穩定。

    例如,本領域已知,為了增加多肽的體內穩定性,可引入特別有用的各種D氨基酸、氨基酸模擬物或非天然氨基酸;本發明的多肽也可采用該構思。多肽的穩定性可以用多種方式來測試。例如,肽酶和各種生物介質,例如人血漿和血清,已被用于檢測穩定性(見例如Verhoef?et?al.,Eur?J?DrugMetab?Pharmacokin?11:291-302,1986)。

    III.肽的制備

    本發明的肽可以用眾所周知的技術加以制備。例如,可以通過合成方式,利用重組DNA技術或化學合成方法來制備肽。本發明的肽可以個別地合成,或者可以合成為包含兩個或更多個肽(例如兩個或更多個Foxp3肽或一個Foxp3肽與一個非Foxp3肽)的較長多肽。可以對肽加以分離,即純化,而使其基本上不含其他天然存在的宿主細胞蛋白質及其片段,例如至少大約70%、80%或90%純化。

    本發明的肽可以根據所選的氨基酸序列通過化學合成獲得。例如,可用于合成的傳統肽合成方法包括:

    (i)Peptide?Synthesis,Interscience,New?York,1966;

    (ii)The?Proteins,Vol.2,Academic?Press,New?York,1976;

    (iii)Peptide?Synthesis(日文),Maruzen?Co.,1975;

    (iv)Basics?and?Experiment?of?Peptide?Synthesis(日本),Maruzen?Co.,1985;

    (v)Development?of?Pharmaceuticals(second?volume)(日本),Vol.14(peptide?synthesis),Hirokawa,1991;

    (vi)WO99/67288;和

    (vii)Barany?G.&Merrifield?R.B.,Peptides?Vol.2,″Solid?Phase?PeptideSynthesis″,Academic?Press,New?York,1980,100-118。

    或者,本發明的肽可以用任何已知的用于產生肽的遺傳工程方法獲得(例如,Morrison?J.(1977)J.Bacteriology?132:349-51;Clark-Curtiss&Curtiss(1983)Methods?in?Enzymology(eds.Wu?et?al.)101:347-62)。例如,首先,制備合適的載體,其具有以可表達形式編碼目標肽的多核苷酸(例如,處于相應啟動子序列調節序列的下游),并將其轉移到合適的宿主細胞。然后培養宿主細胞,產生目的肽。肽還可以采用體外翻譯系統在體外產生。

    IV.多核苷酸

    本發明提供了多核苷酸,其編碼任何一種前述的本發明肽。這包括來自天然存在的Foxp3基因的多核苷酸,和具有其經過保守修飾的核苷酸序列的那些多核苷酸。在這里,短語“保守修飾的核苷酸序列”是指編碼相同或基本上相同氨基酸序列的序列。由于遺傳密碼的簡并性,任何給定的蛋白質被大量功能相同的核酸所編碼。例如,密碼子GCA,GCC,GCG和GCU均編碼氨基酸丙氨酸。因此,在每一個被密碼子規定為丙氨酸的位置,可以該密碼子改變成任何所述的相應密碼子,而不會改變所編碼的多肽。這樣的核酸變異是“沉默變異”,是保守修飾的變異中的一種。本文中,每一個編碼肽的核酸序列也說明了該核酸的每一種可能的沉默變異。技術人員會認識到,核酸中的每一個密碼子(除了下面二者以外:AUG,其一般僅是甲硫氨酸的密碼子;TGG,其一般僅是色氨酸的密碼子)均可被修飾,以產生功能相同的分子。因此,在每個公開的序列中默示地說明了編碼肽的核酸的每一種沉默變異。

    本發明的多核苷酸可以由DNA、RNA及其衍生物構成。DNA合適地由堿基,例如A、T、C和G構成。在RNA中,T被U替換。

    本發明的Foxp3多核苷酸可以編碼多個本發明的Foxp3肽,它們之間存在或者不存在間插的(intervening)氨基酸序列。例如,間插氨基酸序列可以提供該多核苷酸或所翻譯的肽的剪切位點(例如酶識別序列)。而且,多核苷酸可以包含編碼本發明肽的編碼序列之外的任何額外序列。例如,多核苷酸可以是重組多核苷酸,其包括表達肽所需的調節序列。一般地,這些重組多核苷酸可以通過傳統的重組技術,使用例如聚合酶和核酸內切酶,對多核苷酸進行操作,來加以制備。

    重組和化學合成技術均可用于產生本發明的多核苷酸。例如,可以通過插入到在轉染到感受態細胞中時可以表達的合適載體中來產生多核苷酸。或者,多核苷酸可以用PCR技術或者在合適的宿主中表達進行擴增(見例如Sambrook?et?al.,《分子克隆:實驗室手冊》(Molecular?Cloning:ALaboratory?Manual),Cold?Spring?Harbor?Laboratory,New?York,1989)。或者,多核苷酸可以用固相技術加以合成,例如在下列文獻中介紹的:BeaucageS.L.&Iyer?R.P.,Tetrahedron?48:2223-311,1992;Matthes?et?al.,EMBO?J?3:801-5,1984。

    V.藥劑

    因為Foxp3已經被鑒定是調節性T(T-reg)細胞(此類細胞執行維持免疫動態平衡的功能)的分子,所以本發明的Foxp3肽或編碼Foxp3肽的多核苷酸可以用于調節T-reg細胞。因此,本發明提供了一種用于調節T-reg細胞的藥劑,其包括一種或多種本發明的肽,或者編碼這些肽的多核苷酸,作為活性成分。

    本文中,“調節”(regulating)T-reg細胞表示體內修飾T-reg細胞的狀態,例如通過抑制T-reg細胞的增殖或阻遏其功能。T-reg細胞被認為是各類免疫應答的抑制的主要參與者,本文中“阻遏T-reg細胞的功能”是指降低T-reg細胞的阻遏免疫應答的能力。特別地,T-reg細胞在外周發揮作用,被稱作外周耐受(Miescher?S?et?al.,J?Immunol?136:1899-907,1986;Young?RC?et?al.,Am?J?Med?52:63-72,1972;Alexander?JP?et?al.,Cancer?Res?53:1380-7,1997;Horiguchi?S?et?al.,Cancer?Res?59:2950-6,1999;Kono?K?et?al.,Clin?Cancer?Res11:1825-8,1996;Kiessling?R?et?al.,Cancer?Immunol?Immunother?48:353-62,1999;Fontenot?JD?et?al.,Nat?Immunol?4:330-6,2003,Hori?S?et?al.,Science?299:1057-61,2003;Khattri?R?et?al.,Nat?Immunol?4:304-6,2003)。T-reg細胞在例如癌癥患者體內提供免疫抑制效果。因此,本發明Foxp3肽(其在T-reg細胞中過表達)或編碼該Foxp3肽的多核苷酸可以用作治療癌癥的藥劑(例如疫苗)。

    在本發明中,短語“疫苗”(也稱作免疫原性組合物)是指這樣的物質,其在被接種到動物體內時,具有誘導抗腫瘤免疫或調節T-reg的免疫的功能。

    本發明的藥劑可用于治療和/或預防受試者體內的癌癥,所述受試者例如人和任何其他哺乳動物,包括但不限于,小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、貓、狗、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴、狒狒和黑猩猩,特別是商業上重要的動物或家畜。

    根據本發明,包含SEQ?ID?NO:3-5,7-9,12,15-19,22,24,27-30,37,67或74的氨基酸序列的多肽是HLA-A24或HLA-A02限制性表位肽,能夠誘導針對Foxp3表達性T-reg細胞的強烈而特異的免疫應答。因此,本藥劑意圖施用于HLA抗原是HLA-A24或HLA-A02的受試者。

    有待于用本發明的藥劑治療的癌癥沒有限制,包括所有在受試者體內Foxp3表達的種類的癌癥。癌癥的實例包括乳腺癌、AML、膀胱癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結腸直腸癌、子宮內膜異位、食道癌、胃癌、彌散型胃癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、成神經細胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤。

    如果需要,由Foxp3肽或編碼Foxp3肽的多核苷酸構成的本發明的藥劑可選地包含其他治療性物質作為活性成分,只要該物質不抑制目的肽的T-reg細胞調節作用即可。例如,制劑可以包含抗炎劑、止痛劑、化療劑等。藥劑本身除了包含其他的治療性物質之外,本發明的藥劑還可以和一種或多種其他的藥理學作用劑順次地或同時地施用。藥物和藥理學作用劑的量取決于,例如,所用的藥理學作用劑類型,所治療的疾病,和給藥的日程方案和途徑。

    應當理解,除了本文中特別提到的成分之外,本發明的藥劑可以包括與所討論的制劑類型有關的在本領域中常規使用的其他作用劑。

    在本發明的一個實施方案中,本藥劑可以包含在產品和試劑盒中,所述產品和試劑盒含有對于要治療的疾病狀況(例如癌癥)的治療有用的材料。該產品可以包括具有標簽的任何本發明藥劑的容器。該容器可以用多種材料制成,例如玻璃或塑料。容器上的標簽應當指明該制劑是用于治療或預防疾病的一種或多種狀況。該標簽還應標明用藥說明等。

    除了上述的容器之外,包含本發明藥劑的試劑盒還可以任選地包含第二容器,其容納藥物可接受的稀釋劑。還可以進一步包括其他從商業和用戶角度看可取的材料,包括其他的緩沖劑、稀釋劑、過濾器、針頭、注射器和具有使用說明的包裝說明書。

    如果期望的話,藥物組合物可以置于包(pack)或配藥器(dispenser?device)中提供,所述包或配藥器可以包含一個或多個含有活性成分的單位劑型。所述包可以包括,例如,金屬或塑料箔(foil),例如發泡包。該包裝或配藥器可以通過給藥說明書實現。

    (1)含有肽作為活性成分的藥劑

    如果需要的話,本發明的肽可以作為經傳統制劑方法配制過的藥劑直接施用。在這些情況下,除了本發明的肽之外,還可以視情況包括載體、賦形劑和其他通常用于藥物的物質,沒有特殊的限制。這些載體的實例有滅菌水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、培養液等。而且,藥劑可以根據需要包含穩定劑、懸浮劑、防腐劑、表面活性劑等。本發明的藥劑可用于治療和/或預防癌癥,特別是調節T-reg細胞。

    本發明的肽可以制備為包含兩種或多種本發明的Foxp3肽的組合,用于在體內誘導CTL。這些Foxp3肽可以是雞尾酒混合物(cocktail)或者可以用標準技術將它們彼此偶聯。例如,可將這些Foxp3肽表達成單個多肽序列。組合中的肽可以是相同的也可以是不同的。通過施用該發明的Foxp3肽,這些肽以高密度呈遞在抗原呈遞細胞的HLA抗原上,然后誘導出特異性地對被展示肽與HLA抗原之間形成的復合物起反應的CTL。或者,從用本發明肽刺激的受試者體內取出樹突細胞,從而獲得在細胞表面上固定有本發明Foxp3肽的抗原呈遞細胞;通過將載有Foxp3肽的樹突細胞重新施用到受試者體內來誘導CTL,結果,可以增加針對靶細胞的攻擊性。

    包含本發明的Foxp3肽作為活性成分的用于調節T-reg細胞的藥劑任選地可以包含佐劑,以便有效地建立細胞免疫;或者可以將它們與其他活性成分一起施用,并且它們可以配制成顆粒來施用。佐劑是指這樣的化合物,其在和具有免疫原性的蛋白質一起(或順次)施用時,可以提高針對該蛋白質的免疫應答。可以使用的佐劑包括在文獻中介紹的佐劑(Clin?Microbiol?Rev?7:277-89,1994)。佐劑實例包括磷酸鋁、氫氧化鋁、明礬、霍亂毒素、沙門氏菌毒素等,但不僅限于此。

    而且,可以方便地使用脂質體劑型,Foxp3肽與幾mcm直徑的球珠結合的顆粒劑型,和脂質與肽結合的劑型。

    在一些實施方案中,本發明的藥劑包括可初始化(prime)細胞毒T淋巴細胞的成分。脂質已被確認為是能夠在體內針對病毒抗原初始化CTL的作用劑。例如,可以將棕櫚酸殘基附接到賴氨酸殘基的ε-和α-氨基,然后連接到本發明的肽上。脂質化的肽隨后或是直接在膠束或顆粒中施用,或者摻入到脂質體中施用,或者在佐劑中乳化后施用。作為CTL應答的脂質初始化的另一個實例,大腸桿菌脂蛋白,例如三棕櫚酰-S-甘油酰半胱氨酰絲氨酰-絲氨酸(P3CSS),在共價附接到合適的肽后,可以用來初始化CTL(見例如Deres?et?al.,Nature?342:561,1989)。

    給藥方法可以是口服、皮內、皮下、靜脈內注射等,并可以使用系統給藥或者在目標部位的附近局部給藥。給藥的執行可以是單次給藥或者通過多次給藥進行增強(boost)。本發明肽的劑量可以根據所治療的疾病、患者的年齡、體重、給藥方法等進行合適的調節,一般為0.001mg-1000mg,例如0.001mg-1000mg,例如0.1mg-10mg,并可以從每幾天給藥1次到每幾個月給藥1次。本領域的技術人員可以恰當地選擇合適的劑量。

    (2)含有多核苷酸作為活性成分的藥劑

    本發明的藥劑還可以包含處于可表達形式的編碼本文公開的Foxp3肽的核酸。本文中,短語“處于可表達的形式”是指多核苷酸在引入到細胞內后,將被體內表達成可誘導抗腫瘤免疫的多肽。在一個實施方案中,目標多核苷酸的核酸序列包括在靶細胞中表達該多核苷酸所必需的調節元件。多核苷酸可以被配備成可以穩定地插入到靶細胞的基因組內(關于同源重組盒式載體的介紹見例如Thomas?KR&Capecchi?MR,Cell?51:503-12,1987)。見例如Wolff?et?al.,Science?247:1465-8,1990;美國專利5,580,859;5,589,466;5,804,566;5,739,118;5,736,524;5,679,647;和WO?98/04720。基于DNA的遞送技術的實例包括“裸DNA”、輔助(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介導的)遞送、陽離子脂質復合物、和顆粒介導的(“基因槍”)或壓力介導的遞送(見例如美國專利No.5,922,687)。

    本發明的肽還可以用病毒或細菌載體表達。表達載體的實例包括減毒的病毒宿主,例如痘苗(vaccinia)或禽痘(fowlpox)。這種方法涉及使用例如牛痘病毒作為載體,表達編碼該肽的核苷酸序列。一旦引入到宿主內,重組的痘苗病毒表達免疫原性肽,借此引發免疫應答。免疫方案中有用的痘苗載體和方法在下列文獻中有介紹,例如美國專利4,722,848。另一種載體是BCG(卡介苗)。BCG載體在Stover?et?al.,Nature?351:456-60,1991中有介紹。很多其他的可用于治療性給藥或免疫的載體,例如腺病毒和腺伴隨病毒載體、逆轉錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella?typhi)載體、脫毒的炭疽毒素載體等,是容易想到的。見例如Shata?et?al.,Mol?Med?Today?6:66-71,2000;Shedlock?et?al.J?Leukoc?Biol?68:793-806,2000;Hipp?et?al.,In?Vivo?14:571-85,2000。

    將多核苷酸輸送到患者體內可以是直接的,在此情況下患者被直接暴露于攜帶多核苷酸的載體,或者是間接的,在此情況下首先在體外用目的多核苷酸對細胞進行轉化,然后將細胞移植到患者體內。這兩種方法被分別稱作體內或回體基因治療。

    關于基因治療方法的一般綜述,見Goldspiel?et?al.,Clinical?Pharmacy?12:488-505,1993;Wu?and?Wu,Biotherapy?3:87-95,1991;Tolstoshev,Ann?RevPharmacol?Toxicol?33:573-96,1993;Mulligan,Science?260:926-32,1993;Morgan&Anderson,Ann?Rev?Biochem?62:191-217,1993;Trends?inBiotechnology?11(5):155-215,1993。可以使用的在重組DNA技術中普遍知道的方法在下面文獻中有介紹:Ausubel等編輯的《Current?Protocols?inMolecular?Biology》,John?Wiley&Sons,NY,1993;和Krieger《Gene?Transferand?Expression,A?Laboratory?Manual》,Stockton?Press,NY,1990。

    給藥方法可以是口服、皮內、皮下、靜脈內注射等,還可以使用系統給藥或對目標部位附近局部給藥。給藥可以通過單次給藥來進行,或者通過多次給藥來加強。至于在合適載體內或者用編碼本發明肽的多核苷酸轉化的細胞內的多核苷酸的劑量,可以根據待治療的疾病、患者的年齡、體重、給藥方法等進行合適的調節,一般為0.001mg-1000mg,例如0.001mg-1000mg,例如0.1mg-10mg,并可以從每幾天給藥1次到每幾個月給藥1次。本領域的技術人員可以恰當地選擇合適的劑量。

    (3)外來體

    或者,本發明提供稱作外來體的細胞內囊泡,其在表面上呈遞在本發明肽與HLA抗原之間形成的復合物。外來體的制備可以通過,例如,使用在已公開的國際公告日文翻譯特表平11-510507和特表2000-512161中詳細描述的方法,并可以用從作為治療和/或預防的對象的受試者獲得的抗原呈遞細胞加以制備。與本發明的肽相似,本發明的外來體可以作為疫苗進行預防注射。

    所用的HLA抗原類型必須與需要治療和/或預防的受試者的HLA抗原類型相匹配。例如,對于日本人,HLA-A24,特別是HLA-A2402,通常是合適的。

    關于HLA抗原,使用在日本人和白人中高表達的A-24或A-02型有利于獲得有效的結果。且使用包括A-2402和A-0201在內的亞型是有用的。通常,在臨床上,預先對需要治療的患者的HLA抗原類型進行檢查,這樣可以合適地選擇對該抗原具有高水平結合親和性,或具有通過抗原呈遞誘導細胞毒T細胞(CTL)的能力的肽。而且,為了獲得顯示高結合親和性和CTL誘導能力的肽,可以在天然存在的Foxp3部分肽的氨基酸序列的基礎上進行1個、2個或數個氨基酸的替換或添加。

    (4)抗原呈遞細胞

    本發明還提供抗原呈遞細胞(APC),該細胞在其表面上呈遞在HLA抗原與本發明肽之間形成的復合物。通過與本發明的肽或編碼本發明的肽的核苷酸接觸獲得的APC可以從治療和/或預防的目標受試者制備,而且可以單獨或與其他藥物(包括本發明的肽、外來體或細胞毒T細胞)組合而作為疫苗施用。

    APC不僅限于任何類型的細胞,包括樹突細胞(DC)、朗格漢斯(Langerhas)細胞、巨噬細胞、B細胞、和激活的T細胞,所有這些都已知可以在細胞表面上呈遞蛋白質抗原,從而被淋巴細胞識別。因為DC是APC中具有最強CTL誘導作用的代表性APC,所以DC作為本發明的APC特別有用。

    例如,APC可以通過從外周血單核細胞誘導樹突細胞,然后使它們與本發明的肽在體外、回體或在體內進行接觸(刺激)來獲得。當將本發明的肽施用于受試者時,在受試者體內誘導出具有固定在其上面的本發明的肽的APC。“誘導APC”包括使細胞與本發明的肽或者編碼本發明肽的核苷酸接觸(刺激),從而在該細胞表面上呈遞在HLA抗原和本發明的肽之間形成的復合物。或者,在將本發明肽固定在APC之后,APC可以作為疫苗施用給受試者。例如,回體施用可以包括如下步驟:

    a:從受試者收集APC;和

    b:使步驟a的APC與肽接觸。

    通過步驟b獲得的APC可以作為疫苗施用給受試者。

    根據本發明的一個方面,APC具有高水平的CTL誘導能力。這些具有高水平細胞毒T細胞誘導能力的APC可以通過包括在體外將包含編碼本發明的肽的多核苷酸的基因轉移到APC的步驟的方法來制備。所導入的基因可以是DNA或RNA的形式。關于導入方法,沒有特殊限制,本領域常用的各種方法,包括脂質轉染、電穿孔和磷酸鈣方法,都可使用。更具體地,可以按照下列文獻中的描述來進行:Cancer?Res?56:5672-7,1996;J?Immunol161:5607-13,1998;J?Exp?Med?184:465-72,1996;已公開的國際公布日文翻譯特表2000-509281。通過將基因轉移到APC內,基因在細胞內經過轉錄、翻譯等,然后所得的蛋白質被MHC?I類分子或II類分子加工,并通過呈遞途徑呈遞部分肽。

    (5)細胞毒T細胞

    就針對任一種本發明的Foxp3肽被誘導的細胞毒T細胞而言,認為它們可以在體內強化靶向T-reg細胞的免疫系統,因此可以與肽類似地用作疫苗。因此,本發明提供被任何本發明的肽誘導的、分離的細胞毒T細胞。

    這些細胞毒T細胞可以通過(1)向受試者施用本發明的肽,或者(2)在體外使源自受試者的APC和CD8陽性細胞,或者外周血單核白細胞與本發明的肽接觸(刺激),來獲得。

    對于被呈遞本發明肽的APC的刺激所誘導的細胞毒T細胞,其可以來自治療和/或預防的目標受試者,并可以獨自或者與其他包括本發明肽的藥物或用于調節效果的外來體組合施用。所獲得的細胞毒T細胞特異地作用于呈遞本發明肽(例如與用于誘導肽的相同的肽)的靶細胞。靶細胞可以是內源表達Foxp3的細胞,或者是被Foxp3基因轉染的細胞,此外,由于這些肽的刺激而在細胞表面上呈遞本發明肽的細胞,也可以成為攻擊的靶標。

    (6)TCR

    本發明還提供了一種包括編碼能夠形成T細胞受體(TCR)的亞基的多肽的核酸的組合物,并提供了其使用方法。TCR亞基具有形成TCR的能力,TCR為T細胞提供針對呈遞本發明肽的細胞的特異性。通過使用本領域已知的技術,可以鑒定作為用本發明的一種或多種肽誘導的CTL的TCR亞基的α-和β-鏈的核酸(WO2007/032255和Morgan?et?al.,J?Immunol,171,3288(2003))。衍生的TCR優先以高親和性結合展示Foxp3肽的靶細胞,并任選地在體內和體外介導針對呈遞Foxp3肽的靶細胞的高效殺傷。

    可以將編碼TCR亞基的核酸摻入到合適的載體例如逆轉錄病毒載體內。這些載體是本領域眾所周知的。核酸或包含它們的載體可以被有用地轉移到T細胞內,該T細胞優選地來自患者。有利地,本發明提供了即時可用的(off-the-shelf)組合物,其允許快速地修飾患者自身的T細胞(或其他哺乳動物的T細胞),從而快速而容易地產生具有優異T-reg細胞殺傷性質的修飾T細胞。

    另外,本發明提供通過用編碼與本發明Foxp3肽結合的TCR亞基多肽的核酸進行轉化而制備的CTL。經轉化的CTL能夠在體內歸巢于(foming?to)T-reg細胞,并用眾所周知的體外培養方法進行擴增(例如Kawakami?et?al.,JImmunol.,142,3452-3461(1989))。可以使用本發明的T細胞形成免疫組合物,用于治療或預防需要治療或保護的患者的癌癥(WO2006/031221)。

    VI.使用Foxp3肽的方法

    本發明的Foxp3肽和編碼Foxp3肽的多核苷酸可用于誘導APC和CTL。Foxp3肽和多核苷酸可以和任何其他化合物組合使用,只要該化合物不抑制其CTL誘導能力即可。因此,任何前述的本發明的藥劑均可用于下文提到的本發明的方法。

    (1)誘導抗原呈遞細胞(APC)的方法

    因此本發明提供了使用本發明的肽或編碼這些肽的多核苷酸誘導APC的方法。APC的誘導可以如上文條目“V-(4)抗原呈遞細胞”中所述進行。本發明還提供了用于誘導具有高水平的細胞毒T細胞誘導能力的APC的方法,該誘導在上文條目“V-(4)抗原呈遞細胞”中有討論。或者,根據本發明,選自包含SEQ?ID?NO:3-5,7-9,12,15-19,22,24,27-30,37,67或74的氨基酸序列的肽中的Foxp3肽或編碼這些Foxp3肽的多核苷酸用于制造包含抗原呈遞細胞的藥物組合物的用途。進一步,本發明還提供了選自包含SEQID?NO:3-5,7-9,12,15-19,22,24,27-30,37,67或74的氨基酸序列的肽中的Foxp3肽或編碼這些Foxp3肽的多核苷酸,用于誘導抗原呈遞細胞。(0096)

    (2)誘導細胞毒T細胞的方法

    而且,本發明還提供了使用本發明的Foxp3肽或編碼這些Foxp3肽的多核苷酸誘導CTL的方法。當將本發明的Foxp3肽施用于受試者時,在受試者身體內誘導CTL,靶向T-reg細胞的免疫系統的強度被提高。或者,它們可以用于回體治療方法,其中將來自受試者的APC和CD8陽性細胞或者外周血單核白細胞在體外與本發明的肽接觸(刺激),誘導CTL之后,將細胞返回給受試者。例如,該方法可以包括如下步驟:

    a:從受試者收集APC,

    b:使步驟a的APC與肽接觸,

    c:將步驟b的APC與CD8+T細胞混合,并共培養以誘導細胞毒T細胞,和

    d:從步驟c的共培養物中收集CD8+T細胞。

    通過步驟d獲得的具有細胞毒活性的CD8+T細胞可以作為疫苗施用于受試者。在上面步驟c中與CD8+T細胞混合的APC還可以根據在上文條目“V-(4)抗原呈遞細胞”中詳細說明的方法加以制備,即通過將編碼本發明肽的基因轉移到APC中;但并不僅限于此,任何能夠有效地將本發明的肽呈遞給T細胞的APC或外來體均可用于本方法。或者,根據本發明,從包含SEQ?ID?NO:3-5,7-9,12,15-19,22,24,27-30,37,67或74的氨基酸序列的肽中選擇的Foxp3肽或編碼這些Foxp3肽的多核苷酸用于制造包含CTL的藥物組合物的用途。進一步,本發明還提供了從包含SEQ?ID?NO:3-5,7-9,12,15-19,22,24,27-30,37,67或74的氨基酸序列的肽中選擇的Foxp3肽或編碼這些Foxp3肽的多核苷酸,用于誘導CTL。

    (3)調節免疫抑制

    如上面討論的,本發明的肽、多核苷酸、外來體、APC和CTL可以用作疫苗來調節(即抑制)T-reg細胞。因為T-reg被認為是抑制各種類型的免疫應答,特別是CTL細胞毒活性的主要參與者之一,所以本發明肽、多核苷酸、外來體、APC和CTLs的能力提示它們還可以用于對抗免疫抑制,特別是對抗CTL細胞毒活性的免疫抑制。因此,本發明提供了調節T-reg細胞的方法,以及調節(即對抗)免疫抑制的方法,所述方法包括向需要的受試者施用本發明的肽、多核苷酸、外來體、APC和CTL的步驟。而且,本發明還提供了從包含SEQ?ID?NO:3-5,7-9,12,15-19,22,24,27-30,37,67或74的氨基酸序列的肽中選擇的Foxp3肽或編碼這些Foxp3肽的多核苷酸在制造用于調節免疫抑制的免疫原性組合物方面的用途。或者,本發明還涉及從包含SEQ?ID?NO:3-5,7-9,12,15-19,22,24,27-30,37,67或74的氨基酸序列的肽中選擇的Foxp3肽或編碼這些Foxp3肽的多核苷酸,用于調節免疫抑制。

    這里,“調節免疫抑制”意味著本發明的肽、多核苷酸、外來體、APC和CTL的施用在體內造成任何類型的變化。在一些實施方案中,由本發明的肽、多核苷酸、外來體、APC和CTL造成的變化是免疫抑制狀態水平的降低(免疫抑制的抑制或對抗),也就是說,抗免疫抑制(anti-immunosuppression)的誘導。因此,本發明還提供了誘導抗免疫抑制的方法,所述方法包括向需要的受試者施用本發明的肽、多核苷酸、外來體、APC或CTL的步驟。

    一般地,抗免疫抑制包括的免疫應答如下:

    -誘導針對表達Foxp3的T-regs的細胞毒性淋巴細胞,

    -誘導識別表達Foxp3的T-regs的抗體,和

    -誘導抗T-regs細胞因子的產生。

    因此,如果某種蛋白質在接種到動物體內時可誘導這些應答的任何一種,則判定該蛋白質具有誘導抗免疫抑制的效應。受蛋白質誘導的抗免疫抑制可以通過觀察宿主免疫系統針對該蛋白質的體內或體外應答來進行檢測。

    例如,用于檢測細胞毒性T淋巴細胞的誘導(即活化)的方法是眾所周知的。具體地,已知進入活體內的外來物質在抗原呈遞細胞(APC)的作用下被呈遞給T細胞和B細胞。以抗原特異方式應答被APC所呈遞的抗原的T細胞在抗原的刺激下分化成細胞毒T細胞(或細胞毒性T淋巴細胞;CTL),然后增殖(這稱作T細胞的活化)。因此,特定肽的CTL誘導可以這樣來加以評估:通過APC將該肽呈遞給T細胞,并檢測CTL的誘導(即,增殖、IFN-gamma產生和細胞毒活性)。而且,APC具有活化CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、嗜酸性細胞和NK細胞的作用。因為CD4+T細胞對于抗腫瘤免疫也是重要的,可以用這些細胞的活化效應作為指標來評估肽的抗腫瘤免疫誘導作用。

    使用樹突細胞(DC)作為APC來評估誘導CTL的作用的方法是本領域眾所周知的。根據本方法,最初使測試肽與DC接觸,然后使該DC與T細胞接觸。在與DC接觸后,若檢測到具有針對表達(即在HLA分子上呈遞)目標肽的細胞的細胞毒作用的T細胞,則顯示該測試肽具有誘導細胞毒T細胞的活性。CTL針對T-regs的活性可以用例如51Cr-標記的腫瘤細胞的裂解作為指標進行檢測。或者,使用3H-胸苷攝取活性或LDH(乳糖脫氫酶)釋放作為指標來評估T-regs破壞程度的方法也是眾所周知的,并可以在本發明中使用。

    除了DC之外,還可以使用外周血單個核細胞(PBMC)作為APC。有報道稱通過在GM-CSF和IL-4的存在下培養PBMC可提高CTL的誘導。類似地,已證明通過在鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)和IL-7的存在下培養PBMC可以誘導CTL。

    通過這些方法被確認具有CTL誘導活性的測試肽,是具有DC活化作用和隨后的CTL誘導活性的肽。因此,可誘導針對腫瘤細胞的CTL的Foxp3肽可以用作針對T-regs的疫苗。而且,通過與Foxp3肽接觸而獲得了誘導針對T-regs的CTL的能力的APC也可用作針對T-regs的疫苗。而且,藉由APC呈遞肽抗原而獲得了細胞毒性的CTL也可用作針對T-regs的疫苗。這些利用由APC和CTL介導的免疫來調節T-regs的方法被稱作細胞免疫治療,并且包含在本發明之內。

    一般地,當使用多肽進行細胞免疫治療時,已知可以通過組合多種具有不同結構的肽并使它們與DC接觸,可提高CTL誘導的功效。因此,在用蛋白質片段刺激DC時,使用多種類型的片段的混合物是有利的。

    或者,肽誘導的抗免疫抑制可以通過觀察針對T-regs的抗體產生的誘導來確認。例如,當在用某種肽免疫過的個體(例如人患者、實驗動物)體內誘導出針對該肽的抗體時,并且當T-reg細胞被那些抗體抑制時,就可以確定該肽具有誘導抗免疫抑制的能力。

    抗免疫抑制可以通過施用本發明的疫苗加以誘導,并且該誘導使得免疫抑制的消除成為可能。這些效果可以是統計上顯著的。例如,在觀察中,在5%或者更低的顯著度水平,其中將針對T-regs的疫苗的調節作用與沒有施用疫苗的對照相比較。例如,可以使用Student′s?t-test,Mann-Whitney?U-test或ANOVA進行統計分析。

    當使用APC或CTL作為本發明疫苗時,例如可以通過回體方法調節(即抑制)T-regs。更具體地,收集接受治療或預防的受試者的PBMC,使細胞以回體方式與多肽接觸,在APC或CTL誘導之后,可將細胞施用于受試者。APC的誘導還可以通過以回體方式將編碼多肽的載體引入到PBMC中來實現。在體外誘導的APC或CTL在施用前可以進行克隆。通過克隆和培養具有高的靶細胞破壞活性的細胞,可以更有效地執行細胞免疫治療。而且,以此方式分離的APC和CTL不僅可以用于針對該細胞所來源的個體的細胞免疫治療,還可以用于其他個體中相似類型疾病的的細胞免疫治療。

    除非另外定義,本文使用的所有技術和科學用語均具有本發明所屬領域內普通技術人員所普遍知曉的意思。盡管可以使用與在本文中介紹的相似或等價的方法和材料本發明的實施或測試,但在下文中介紹了合適的方法和材料。本文通過引用并入在本文提到的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻的全部內容。在出現矛盾的情況下,以本專利申請包括定義為準。此外,材料、方法和實施例只是例證性的,不含限制意義。

    下面的實施例是提供用于示例說明本發明,以及幫助技術人員制作和使用本發明。這些實施例沒有任何限制本發明范圍的意思。

    實施例

    材料和方法

    細胞系

    A24LCL細胞(HLA-A24/24)、T2細胞(HLA-A02/02)、人B類淋巴母細胞、293T和COS7購自于ATCC。

    Foxp3衍生肽的候選物篩選

    用結合預測軟件″BIMAS″(http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)預測從Foxp3衍生的可以和HLA-A*2402和HLA-A*0201分子結合的九聚體和十聚體肽,算法如Parker?KC,et?al.((1994)J?Immunol.;152(1):163-75.)和Kuzushima?K,et?al.((2001)Blood.;98(6):1872-81.)所述。這些肽由Sigma(Sapporo,Japan)根據標準固相合成方法合成,并通過反相HPLC純化。肽的純度(>90%)和身份分別用分析HPLC和質譜分析確定。肽以20mg/ml溶解在二甲基亞砜(DMSO)中,并保存于-80攝氏度。

    體外CTL誘導

    使用單核細胞衍生的樹突細胞(DC)作為抗原呈遞細胞來誘導針對呈遞在HLA上的肽的CTL應答。DC在體外產生,方法如別處所述(Horiguchi?S.et?al.Cancer?Res.59:2950-6)。具體地,用Ficoll-Plaque(Pharmacia)溶液從正常志愿者(HLA-A*2402和/或HLA-A*0201)分離外周血單個核細胞(PBMC),通過粘附到塑料組織培養盤(Becton?Dickinson)對其進行分離,從而富集其中的單核細胞組分。將富集了單核細胞的群體在1000U/ml?GM-CSF(R&DSystem)和1000U/ml?IL-4(R&D?System)的存在下在含有2%熱滅活的自體同源血清(AS)的AIM-V培養基(Invitrogen)中培養。培養7天后,在3mcg/mlbeta2-微球蛋白的存在下,在20攝氏度的AIM-V培養基中用20mcg/ml的合成肽沖擊4小時。然后用絲裂霉素C(MMC)(30mcg/ml?30mins)使這些經肽沖擊的DC失活,并以1∶20的比例與自體同源CD8+T細胞混合,這些CD8+T細胞是通過用CD8陽性分離試劑盒(Dynal)進行陽性篩選而獲得的。將這些培養物置于48孔培養板(Corning)中,每孔含有1.5x104個經過肽沖擊的DC,3x105個CD8+T細胞和10ng/mlIL-7(R&D?System),處于0.5mlAIM-V/2%AS中。3天后,向這些培養物添加IL-2(CHIRON)至終濃度為20IU/ml。在第7和14天,用經過肽沖擊的自體同源DC進一步對T細胞進行再刺激。每一次DC的制備均采用與上述相同的程序。在第21天,經過3輪肽刺激后,對針對經過肽沖擊的A24LCL細胞或T2細胞的CTL活性進行測試。

    CTL擴增程序

    使用與下列文獻中報道的相似的方法Riddell,et?al.(Walter?et?al.,N?EnglJ?Med?333(16):1038-44,1995;Riddell?et?al.,Nat?Med?2(2):216-23,1996Feb)在培養基中擴增CTL。將總共5x?104個CTL與兩種用MMC滅活的人B-類淋巴母細胞系一起在40ng/ml的抗-CD3單克隆抗體(Pharmingen)的存在下重新懸浮在25ml?AIM-V/5%AS中。開始培養1天之后,向培養物中添加120IU/ml?IL-2。在第5、8和11天,向培養物添加含有30IU/ml?IL-2的新鮮AIM-V/5%AS。

    特異CTL活性

    為了檢驗特異的CTL活性,進行了IFN-gamma?ELISPOT測定和IFN-gamma?ELISA。簡而言之,制備經肽沖擊的A24-LCL、T2細胞(1x104/孔)或內源表達Foxp3和HLA分子的細胞,作為刺激細胞。使用在48孔板中培養的CTL系作為應答細胞。IFN-gamma?ELISPOT測定和IFN-gammaELISA根據制造商的程序進行。

    表位肽在BALB/c小鼠體內的免疫原性

    為了初始化肽特異的CTL,使用100mcl疫苗混合物進行免疫,該疫苗混合物含有每只小鼠50mcl?HLA-A24限制性肽和50mcl?IFA。疫苗在第0天皮下注射到小鼠的右脅進行第一次免疫,在第7天注射到左脅進行第二次免疫。在第14天,使用來自接種的小鼠的脾細胞作為應答細胞,使用經過或者未經肽沖擊的RLmale1細胞作為刺激細胞,進行IFN-gammaELISPOT測定。

    體內抗腫瘤效應

    在第0天,將4T1細胞(1x105/小鼠)皮下注射到BALB/c小鼠的右脅。在第3和10天,用hFoxp3-252(KLSAMQAHL:SEQ?ID?NO:17)或mFoxp3-252(KLGAMQAHL:SEQ?ID?NO:88)IFA-偶聯的肽進行疫苗接種。

    Foxp3-9-252替換物對HLA分子的親和性的測定

    實施IFN-gamma?ELISA測定來檢查經替換的肽與HLA-A2分子的親和性。用Foxp3-9-252-WT(KLSAMQAHL:SEQ?ID?NO:17)肽誘導的CTL作為應答細胞,通過在37攝氏度與Foxp3-9-252-WT、Foxp3-9-252-9V(KLSAMQAHV:SEQ?ID?NO:95)和HIV-A02(SLYNTYATL)肽溫育2小時來制備T2細胞,作為刺激細胞。用寬濃度范圍(10-10-4mcg/ml)的每種肽對T2細胞進行肽沖擊。

    結果

    來源于Foxp3的HLA-A24和HLA-A2結合肽的預測

    表1、2和3按照預測高結合親和性的得分次序顯示了Foxp3蛋白的HLA-A*2402結合肽或HLA-A*0201結合肽。總共選擇了60種具有潛在HLA-A24結合活性的肽和26種具有潛在HLA-A2結合活性的肽。

    [表1]

    Foxp3衍生的HLA-A2402結合性9聚體肽

    ??起點位置??序列??得分SEQ?ID?NO??Foxp3-A24-9聚體??363??IYHWFTRMF??1003??207??VFEEPEDFL??364??332??KFHNMRPPF??205??323??EFLHNMDYF??156??366??WFTRMFAFF??127??337??RPPFTYATL??128??190??SYPLLANGV??10.89??27??RAAPKASDL??9.639??238??MVQSLEQQL??8.6440??87??GPLPHLQAL??8.6441??252??KLSAMQAHL??817??8??KPSAPSLAL??842??352??EAPEKQRTL??7.243??240??QSLEQQLVL??7.244??245??QLVLEKEKL??6.645??403??GAVWTVDEL??6.646??185??AVPQSSYPL??647??28??AAPKASDLL??648??141??FSLKARPGL??649??383??NAIRHNLSL??650??186??VPQSSYPLL??651??343??ATLIRWAIL??652??200??KWPGCEKVF??653??68??QLQLPTLPL??654??341??TYATLIRWA??655??115??TPVLQVHPL??656??61??LNPMPPSQL??657??159??EWVSREPAL??658??175??SAPRKDSTL??659??234??LQREMVQSL??5.7660??304??SLFAVRRHL??5.661??359??TLNEIYHWF??5.0462

    開始位置表示自Foxp3?N端起的氨基酸數目。結合得分源于在“材料和方法”中介紹的“BIMAS”。

    [表2]

    Foxp3衍生的HLA-A2402結合性10聚體肽

    ??起點位置??序列??得分SEQ?ID?NO??Foxp3-A24-10聚體??341??TYATLIRWAI??7010??140??VFSLKARPGL??2011??114??RTPVLQVHPL??1212??27??RAAPkASDLL??9.663??206??KVFEePEDFL??9.664??402??KGAVwTVDEL??8.865??237??EMVQsLEQQL??8.6466??87??GPLPhLQALL??8.6467??303??DSLFaVRRHL??8.468??358??RTLNeIYHWF??8.469??5??RPGKpSAPSL??870??382??KNAIrHNLSL??871??190??SYPLlANGVC??7.572??86??LGPLpHLQAL??7.273??60??SLNPmPPSQL??7.274??184??SAVPqSSYPL??7.275??62??NPMPpSQLQL??7.276??233??LLQReMVQSL??7.277??244??QQLVlEKEKL??6.678??185??AVPQsSYPLL??679??149??LPPGiNVASL??680??296??SGPReAPDSL??681??77??VMVApSGARL??682??159??EWVSrEPALL??683??67??SQLQlPTLPL??684??316??HGNStFPEFL??685??380??TWKNaIRHNL??5.686??363??IYHWfTRMFA??587

    開始位置表示自Foxp3?N端起的氨基酸數目。結合得分源于在“材料和方法”中介紹的“BIMAS”。

    [表3]

    Foxp3衍生的HLA-A0201結合性肽

    ??起點位置??序列??得分SEQ?ID?NOFoxp3-A2-9聚體??388??NLSLHKCFV??382.53613??95??LLQDRPHFM??190.44814??390??SLHKCFVRV??132.14915??69??LQLPTLPLV??102.01816??252??KLSAMQAHL??74.76817??68??QLQLPTLPL??21.36218??304??SLFAVRRHL??15.80819??239??VQSLEQQLV??11.98820??245??QLVLEKEKL??10.46821Foxp3-A2-10聚體??359??TLNEIYHWFT??1260.3222??206??KVFEEPEDFL??267.46723??263??KMALTKASSV??175.81224??70??QLPTLPLVMV??159.9725??68??QLQLPTLPLV??159.9726??94??ALLQDRPHFM??101.09927??233??LLQREMVQSL??83.52728??152??GINVASLEWV??59.27929??77??VMVAPSGARL??26.22830??60??SLNPMPPSQL??21.36231??299??REAPDSLFAV??18.04132??252??KLSAMQAHLA??17.38833??102??FMHQLSTVDA??16.50534??223??LLDEKGRAQC??13.85135??344??TLIRWAILEA??11.42636??246??LVLEKEKLSA??11.2137??238??MVQSLEQQLV??10.34638

    開始位置表示自Foxp3N端起的氨基酸數目。結合得分源于在“材料和方法”中介紹的“BIMAS”。

    使用預測的HLA-A2402限制性肽對T細胞進行刺激

    根據上文“材料和方法”中描述的方法生成針對來源于Foxp3蛋白的肽的CTL。在IFN-gamma?ELISPOT測定中顯示可檢測的特異CTL活性的所得CTL顯示在圖1A和圖1B中。在圖1A中,如下孔編號中的細胞:用Foxp3-A24-9-363刺激的孔編號2號和7號孔,用Foxp3-A24-9-366刺激的1號孔和6號孔,用Foxp3-A24-9-190刺激的5號孔,用Foxp3-A24-10-87刺激的7號孔,和用Foxp3-A24-10-60刺激的7號孔,與對照相比顯示了強烈的IFN-gamma產生。在圖1B中,如下孔編號中的細胞:用Foxp3-A24-9-207刺激的4號孔,用Foxp3-A24-9-332刺激的6號孔,用Foxp3-A24-9-337刺激的6號孔,和用Foxp3-A24-10-114刺激的1號孔,與對照相比顯示了強烈的IFN-gamma產生。

    使用預測的HLA-A0201限制性肽對T細胞進行刺激

    在進行IFN-gamma?ELISPOT測定時顯示可檢測的特異CTL活性的所得CTL顯示于圖2A、圖2B和圖2C中。在圖2A中,如下孔編號中的細胞:用Foxp3-A2-9-390刺激的2號孔,用Foxp3-A2-9-69刺激的2號孔,用Foxp3-A2-9-252刺激的6號孔,用Foxp3-A2-10-359刺激的4號孔,用Foxp3-A2-263刺激的7號孔,和用Foxp3-A2-10-94刺激的2號孔和5號孔,與對照相比顯示了強烈的IFN-gamma產生。在圖2B中,如下孔編號中的細胞:用Foxp3-A2-10-233刺激的所有孔,用Foxp3-A2-10-152刺激的6號和7號孔,用Foxp3-A2-10-77刺激的5號孔,用Foxp3-A2-10-246和用Foxp3-A2-10-94刺激的1號孔,與對照相比顯示了強烈的IFN-gamma產生。在圖2C中,如下孔編號中的細胞:用Foxp3-A2-9-390刺激的1、2、4、5、7、9、11和12號孔,用Foxp3-A2-9-304刺激的5號和11號孔,用Foxp3-A2-9-68刺激的7號孔,和用Foxp3-A2-9-252刺激的12號孔,與對照相比顯示了強烈的IFN-gamma產生。

    從Foxp3特異性肽建立CTL系

    對陽性孔中的這些細胞進行擴增,并進行IFN-gamma?ELISA測定。在圖3A、B、C中,用Foxp3-A02-9-390(SEQ?ID?NO:15)刺激的CTL系,與對照相比顯示了強烈的IFN-gamma產生。在圖3D中,用Foxp3-A02-9-252(SEQ?ID?NO:17)刺激的CTL系與對照相比顯示了強烈的IFN-gamma產生。在圖3E中,用Foxp3-A24-10-60(SEQ?ID?NO:75)刺激的CTL系,與對照相比顯示了強烈的IFN-gamma產生。在圖3F中,用Foxp3-A02-10-94(SEQ?IDNO:27)刺激的CTL系,與對照相比顯示了強烈的IFN-gamma產生。在圖3G中,用Foxp3-A24-10-87(SEQ?ID?NO:68)刺激的CTL系,與對照相比顯示了強烈的IFN-gamma產生。

    針對內源表達Foxp3和HLA-A*2402或HLA-A*0201的靶細胞的特異CTL活性

    對于所建立的從這些肽產生的CTL克隆,檢查其識別內源表達Foxp3和HLA-A*24或02的靶細胞的能力。使用對Foxp3-A02-9-390(SEQ?ID?NO:15)和Foxp3-A02-9-252(SEQ?ID?NO:17)生成的CTL系作為效應細胞,對針對同時轉染了全長Foxp3基因和HLA-A*24或02分子的293T(它是內源表達Foxp3和HLA-A*24或02的靶細胞的特異性模型)的特異性CTL活性進行了檢測。在圖4A和圖4B中,用Foxp3-A02-9-390(SEQ?ID?NO:15)和Foxp3-A02-9-252(SEQ?ID?NO:17)生成的CTL系針對同時被Foxp3和HLA-A02轉染的293T顯示出高度特異的CTL活性。另一方面,其對于對照則沒有顯示出顯著的特異性CTL活性。這清楚地表明,Foxp3-A02-9-390和Foxp3-A02-9-252與HLA-A02和/或24分子一起被自然地表達到靶細胞的表面,并識別CTL。而且,這些肽是表位肽,可用作靶定表達Foxp3的T-regs的疫苗。

    Foxp3-A24-9-252肽在BALB/c小鼠中的免疫原性

    為了評估Foxp3-9-252肽對BALB/c小鼠的免疫原性,分別用人Foxp3-9-252肽(Foxp3-252_h;KLSAMQAHL)和小鼠Foxp3-9-252肽(Foxp3-252_m;KLGAMQAHL)(SEQ?ID?NO:89)進行免疫。在第二次注射肽之后,通過IFN-gamma?ELISPOT測定來確定肽特異的CTL活性(圖5)。

    從收集自用肽接種的小鼠的脾細胞,在與用相應肽沖擊過的刺激細胞共培養的孔中檢測到了強烈的IFN-gamma產生,而在對照孔中則沒有顯示IFN-gamma產生。在圖6A中,在5只小鼠中的3只(M3,M4和M5)中檢測到Foxp3-252_h肽特異性的CTL應答,而在僅用IFA接種的對照小鼠(N1~N3)中則沒有。在圖6B中,在5只小鼠中的1只(M1)中檢測到Foxp3-252_m肽特異的CTL應答,而在僅用IFA接種的對照小鼠(N1~N3)中則沒有。這些數據表明,用Foxp3-252_h或Foxp3-252_m肽的每一種進行肽接種均可在體內誘導出針對經肽沖擊靶細胞的CTL。

    Foxp3表位肽疫苗接種的抗腫瘤效應

    為了檢驗靶向Foxp3的肽接種的抗腫瘤效應,嘗試了使用4T1腫瘤細胞和BALB/c小鼠的體內治療設定。在第0天,將4T1乳腺癌細胞皮下注射到BALB/c小鼠中,在腫瘤攻擊后的第3和第10天,對這些小鼠進行接種。結果,與對照小鼠相比,用Foxp3-252_h或Foxp3-252_m肽接種的BALB/c小鼠體內的腫瘤生長顯著降低(圖6)。考慮到統計分析,其顯示了用Foxp3表位肽進行接種的小鼠體內的腫瘤生長抑制的顯著性差異。

    Foxp3表位肽的氨基酸替換

    在前述結果中,Foxp3-9-252肽(SEQ?ID?NO?17)被鑒定為同時被HLA-A*2402和HLA-A*0201限制的表位肽。為了提高Foxp3-9-252肽的免疫原性,選擇單個或數個氨基酸替換,以獲得比天然Foxp3-9-252肽:Foxp3-9-252-WT(KLSAMQAHL)(SEQ?ID?NO?17)更高的對HLA-A*2402和HLA-A*0201分子的結合親和性;Foxp3-9-252(SEQ?ID?NO?17)中氨基酸替換的結合得分用BIMAS軟件產生。表4顯示了Foxp3-9-252來源的替換肽的氨基酸序列及其對HLA-A*2402和HLA-A*0201分子的結合得分。肽的結合得分用BIMAS軟件產生。合成了6或9種替換物,總共15種肽,其預測具有比野生型更高的對HLA-A24或HLA-A2分子的結合親和性(表4)。

    [表4]

    Foxp3-9-252(SEQ?ID?NO?17)中氨基酸替換對HLA-A*2402或

    0201分子的結合得分

    ??肽名稱??序列??結合得分??SEQ?ID?NO??A2402??Foxp3-9-252??KLSAMQAHL??8.0??17??2Y??KYSAMQAHL??400.0??89??2F??KFSAMQAHL??40.0??90??2Y9I??KYSAMQAHI??100.0??91??2Y9F??KYSAMQAHF??200.0??92??2F9I??KFSAMQAHI??10.0??93??2F9F??KFSAMQAHF??20.0??94??A0201??WT??KLSAMQAHL??74.8??17??9V??KLSAMQAHV??243.4??95??3Y??KLYAMQAHL??239.3??96??3M??KLMAMQAHL??276.6??97??3L??KLLAMQAHL??276.6??98??3F??KLFAMQAHL??276.6??99??3Y9V??KLYAMQAHV??779.0??100??3M9V??KLMAMQAHV??900.7??101??3L9V??KLLAMQAHV??900.7??102??3F9V??KLFAMQAHV??900.7??103

    然后,本發明人檢查了用這些替換物進行過肽沖擊的刺激細胞是否被用Foxp3-9-252-WT肽產生的CTL所識別。結果,被Foxp3-9-252-WT肽誘導的CTL產生了針對Foxp3-9-252-9V(KLSAMQAHV)(SEQ?ID?NO?95)沖擊過T2細胞的IFN-gamma,同樣也產生了針對經Foxp3-9-252-WT肽沖擊的T2細胞的IFN-gamma(圖7A)。因為從針對沒有用任何肽沖擊過的刺激細胞的CTL中沒有檢測到IFN-gamma的產生,所以表明,用Foxp3-9-252-WT肽產生的CTL不但可識別HLA-A2分子上呈遞的Foxp3-9-252-WT,還可識別HLA-A2分子上呈遞的Foxp3-9-252-9V肽。

    而且,為了評估Foxp3-9-252-9V肽是否具有比Foxp3-9-252-WT肽更高的對HLA-A2分子的親和性,用以寬泛濃度范圍(10-10-4mcg/ml)的這些肽沖擊過的刺激細胞確定CTL活性。結果,與分別用Foxp3-9-252-WT或Foxp3-9-252-9V肽沖擊過的刺激細胞共培養的CTL產生了相似的IFN-gamma(圖7B)。從這些數據顯示,呈遞在HLA-A*0201分子上的Foxp3-9-252-9V肽可以被用Foxp3-9-252-WT肽建立的CTL識別。

    另一方面,本發明人嘗試使用包括Foxp3-9-252-9V肽的所有HLA-A*0201限制性替換物來誘導CTL。結果,用Foxp3-9-252-3M(KLMAMQAHL)(SEQ?ID?NO?97),Foxp3-9-252-3L(KLLAMQAHL)(SEQ?IDNO?98)或Foxp3-9-252-9V肽刺激產生了CTL(圖7C)。如下孔編號中的細胞:用Foxp3-9-252-3M刺激的3號和7號孔,用Foxp3-9-252-3L刺激的7號孔,和用Foxp3-9-252-9V刺激的8號孔,與對照相比顯示了肽依賴的IFN-gamma產生。通過體外擴增建立了受Foxp3-9-252-9V刺激誘導的CTL系之后,使用經Foxp3-9-252-WT或Foxp3-9-252-9V沖擊過的刺激細胞確定了CTL活性。結果,通過Foxp3-9-252-9V刺激而誘導的CTL識別了用Foxp3-9-252-WT沖擊過的刺激細胞,與Foxp3-9-252-9V沖擊的相同的效果相同(圖7D)。這些結果強烈顯示,Foxp3-9-252-9V肽可以和Foxp3-9-252-WT肽同樣地誘導Foxp3特異性CTL。

    抗原肽的同源性分析

    用下列肽的刺激CTL:

    FOXp3-A24-9-363(SEQ?ID?NO?3),

    FOXp3-A24-9-366(SEQ?ID?NO?7),

    FOXp3-A24-9-190(SEQ?ID?NO?9),

    FOXp3-A24-9-207(SEQ?ID?NO?4),

    FOXp3-A24-9-332(SEQ?ID?NO?5),

    FOXp3-A24-9-337(SEQ?ID?NO?8),

    FOXp3-A24-10-114(SEQ?ID?NO?12),

    FOXp3-A2-9-390(SEQ?ID?NO?15),

    FOXp3-A2-9-69(SEQ?ID?NO?16),

    FOXp3-A2-9-252(SEQ?ID?NO?17),

    FOXp3-A2-10-359(SEQ?ID?NO?22),

    FOXp3-A2-10-263(SEQ?ID?NO?24),

    FOXp3-A2-10-94(SEQ?ID?NO?27),

    FOXp3-A2-10-233(SEQ?ID?NO?28),

    FOXp3-A2-10-152(SEQ?ID?NO?29),

    FOXp3-A2-10-77(SEQ?ID?NO?30),

    FOXp3-A2-10-246(SEQ?ID?NO?37),

    FOXp3-A2-9-68(SEQ?ID?NO?18),

    FOXp3-A2-9-304(SEQ?ID?NO?19)

    Foxp3-A24-10-87(SEQ?ID?NO?67)和

    Foxp3-A24-10-60(SEQ?ID?NO?74)顯示了顯著而特異的CTL活性。

    這可能意味著,如下的序列

    FOXp3-A24-9-363(SEQ?ID?NO?3),

    FOXp3-A24-9-366(SEQ?ID?NO?7),

    FOXp3-A24-9-190(SEQ?ID?NO?9),

    FOXp3-A24-9-207(SEQ?ID?NO?4),

    FOXp3-A24-9-332(SEQ?ID?NO?5),

    FOXp3-A24-9-337(SEQ?ID?NO?8),

    FOXp3-A24-10-114(SEQ?ID?NO?12),

    FOXp3-A2-9-390(SEQ?ID?NO?15),

    FOXp3-A2-9-69(SEQ?ID?NO?16),

    FOXp3-A2-9-252(SEQ?ID?NO?17),

    FOXp3-A2-10-359(SEQ?ID?NO?22),

    FOXp3-A2-10-263(SEQ?ID?NO?24),

    FOXp3-A2-10-94(SEQ?ID?NO?27),

    FOXp3-A2-10-233(SEQ?ID?NO?28),

    FOXp3-A2-10-152(SEQ?ID?NO?29),

    FOXp3-A2-10-77(SEQ?ID?NO?30),

    FOXp3-A2-10-246(SEQ?ID?NO?37),

    FOXp3-A2-9-68(SEQ?ID?NO?18),

    FOXp3-A2-9-304(SEQ?ID?NO?19)

    Foxp3-A24-10-87(SEQ?ID?NO?67)和

    Foxp3-A24-10-60(SEQ?ID?NO?74)與其他已知可以敏化人免疫系統的分子的衍生肽同源。為了排除這一可能性,以這些肽序列作為檢索子(queries)使用BLAST算法(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)進行同源性分析,結果顯示沒有具有顯著同源性的序列。

    這些結果表明,如下序列

    FOXp3-A24-9-363(SEQ?ID?NO?3),

    FOXp3-A24-9-366(SEQ?ID?NO?7),

    FOXp3-A24-9-190(SEQ?ID?NO?9),

    FOXp3-A24-9-207(SEQ?ID?NO?4),

    FOXp3-A24-9-332(SEQ?ID?NO?5),

    FOXp3-A24-9-337(SEQ?ID?NO?8),

    FOXp3-A24-10-114(SEQ?ID?NO?12),

    FOXp3-A2-9-390(SEQ?ID?NO?15),

    FOXp3-A2-9-69(SEQ?ID?NO?16),

    FOXp3-A2-9-252(SEQ?ID?NO?17),

    FOXp3-A2-10-359(SEQ?ID?NO?22),

    FOXp3-A2-10-263(SEQ?ID?NO?24),

    FOXp3-A2-10-94(SEQ?ID?NO?27),

    FOXp3-A2-10-233(SEQ?ID?NO?28),

    FOXp3-A2-10-152(SEQ?ID?NO?29),

    FOXp3-A2-10-77(SEQ?ID?NO?30),

    FOXp3-A2-10-246(SEQ?ID?NO?37),

    FOXp3-A2-9-68(SEQ?ID?NO?18),

    FOXp3-A2-9-304(SEQ?ID?NO?19)

    Foxp3-A24-10-87(SEQ?ID?NO?67)和

    Foxp3-A24-10-60(SEQ?ID?NO?74)是獨特的,據我們所知,它們引起針對任何非相關分子的不希望的免疫應答的可能性微乎其微。

    綜上所述,Foxp3是一種對于靶向T-reg細胞有用的抗原,使用這些表位肽的疫苗對于免疫治療可能是有用的。

    討論

    從圖6的數據,用每種hFoxp3-252和mFoxp3-252肽進行接種可以在體內誘導表位特異性的CTL。這表明這兩種Foxp3表位肽均可誘導針對表達Foxp3和相應主要組織相容性復合物分子的靶細胞的CTL。換言之,我們認為這些CTL可能能夠識別調節性T淋巴細胞(T-regs)。為了評價這一假說,利用BALB/c小鼠檢查了用這些Foxp3表位肽進行接種的體內抗腫瘤效應。在分別用hFoxp3-252和mFoxp3-252肽接種的小鼠體內顯示出明顯的抗腫瘤效應。這些結果強烈暗示,通過阻遏T-regs進入局部腫瘤微環境可以抑制腫瘤生長,甚至不需要用任何TAA表位肽進行疫苗接種。本發明人認為,當體內存在腫瘤時會誘導出針對腫瘤細胞的CTL,然而,來自腫瘤細胞的一些免疫抑制因子也會誘導T-reg,T-reg抑制抗腫瘤效應細胞的功能。用Foxp3表位肽進行接種可以通過殺死或抑制T-reg而消除免疫抑制狀肽,所以在沒有用TAA表位肽進行接種或者用強佐劑對整個免疫系統進行刺激的情況下,顯示出了抗腫瘤效應。

    另外,在圖5和圖6中,與mFoxp3-252肽(KLGAMQAHL)(SEQ?ID?NO88)相比,hFoxp3-252肽(KLSAMQAHL)(SEQ?ID?NO?17)的接種可以誘導更高的CTL和抗腫瘤效應。根據這些結果可以認為,與mFoxp3-252肽的接種相比,hFoxp3-252肽的接種可能有效避免了免疫耐受。換言之,因為hFoxp3-252的氨基酸序列與mFoxp3-252在第3位不同,所以hFoxp3-252肽在體內被看作“非自身抗原”,從而能有效地誘導針對T-reg的CTL。

    綜上所述,表明Foxp3可以作為癌癥免疫治療的新靶標。而且,這些結果強烈支持這樣的結論,即使用Foxp3表位肽進行接種可以抑制T-reg的功能,而且應當可用于多種類型癌細胞的癌癥免疫治療。

    【序列表】

    <110>腫瘤療法科學股份有限公司(ONCOTHERAPY?SCIENCE,INC.)

    <120>FOXP3肽疫苗

    <130>ONC-A0620P

    <150>US?60/878,615

    <151>2007-01-03

    <150>US?60/896,472

    <151>2007-03-22

    <160>103

    <170>PatentIn?version?3.4

    <210>1

    <211>1869

    <212>DNA

    <213>人(Homo?sapiens)

    <220>

    <221>CDS

    <222>(189)..(1484)

    <400>1

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    <220>

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    <210>16

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    <220>

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    <400>16

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    <400>19

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    <400>21

    Gln?Leu?Val?Leu?Glu?Lys?Glu?Lys?Leu

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    <210>22

    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>22

    Thr?Leu?Asn?Glu?Ile?Tyr?His?Trp?Phe?Thr

    1???????????????5???????????????????10

    <210>23

    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>23

    Lys?Val?Phe?Glu?Glu?Pro?Glu?Asp?Phe?Leu

    1???????????????5???????????????????10

    <210>24

    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>24

    Lys?Met?Ala?Leu?Thr?Lys?Ala?Ser?Ser?Val

    1???????????????5???????????????????10

    <210>25

    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>25

    Gln?Leu?Pro?Thr?Leu?Pro?Leu?Val?Met?Val

    1???????????????5???????????????????10

    <210>26

    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>26

    Gln?Leu?Gln?Leu?Pro?Thr?Leu?Pro?Leu?Val

    1???????????????5???????????????????10

    <210>27

    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>27

    Ala?Leu?Leu?Gln?Asp?Arg?Pro?His?Phe?Met

    1???????????????5???????????????????10

    <210>28

    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>28

    Leu?Leu?Gln?Arg?Glu?Met?Val?Gln?Ser?Leu

    1???????????????5???????????????????10

    <210>29

    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>29

    Gly?Ile?Asn?Val?Ala?Ser?Leu?Glu?Trp?Val

    1???????????????5???????????????????10

    <210>30

    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>30

    Val?Met?Val?Ala?Pro?Ser?Gly?Ala?Arg?Leu

    1???????????????5???????????????????10

    <210>31

    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>31

    Ser?Leu?Asn?Pro?Met?Pro?Pro?Ser?Gln?Leu

    1???????????????5???????????????????10

    <210>32

    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>32

    Arg?Glu?Ala?Pro?Asp?Ser?Leu?Phe?Ala?Val

    1???????????????5???????????????????10

    <210>33

    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>33

    Lys?Leu?Ser?Ala?Met?Gln?Ala?His?Leu?Ala

    1???????????????5???????????????????10

    <210>34

    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>34

    Phe?Met?His?Gln?Leu?Ser?Thr?Val?Asp?Ala

    1????????????????5???????????????????10

    <210>35

    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>35

    Leu?Leu?Asp?Glu?Lys?Gly?Arg?Ala?Gln?Cys

    1???????????????5???????????????????10

    <210>36

    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>36

    Thr?Leu?Ile?Arg?Trp?Ala?Ile?Leu?Glu?Ala

    1????????????????5???????????????????10

    <210>37

    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>37

    Leu?Val?Leu?Glu?Lys?Glu?Lys?Leu?Ser?Ala

    1???????????????5???????????????????10

    <210>38

    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>38

    Met?Val?Gln?Ser?Leu?Glu?Gln?Gln?Leu?Val

    1???????????????5???????????????????10

    <210>39

    <211>9

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽

    <400>39

    Arg?Ala?Ala?Pro?Lys?Ala?Ser?Asp?Leu

    1???????????????5

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    <211>9

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>40

    Met?Val?Gln?Ser?Leu?Glu?Gln?Gln?Leu

    1???????????????5

    <210>41

    <211>9

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>41

    Gly?Pro?Leu?Pro?His?Leu?Gln?Ala?Leu

    1???????????????5

    <210>42

    <211>9

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>42

    Lys?Pro?Ser?Ala?Pro?Ser?Leu?Ala?Leu

    1???????????????5

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    <211>9

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>43

    Glu?Ala?Pro?Glu?Lys?Gln?Arg?Thr?Leu

    1???????????????5

    <210>44

    <211>9

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>44

    Gln?Ser?Leu?Glu?Gln?Gln?Leu?Val?Leu

    1???????????????5

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    <211>9

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>45

    Gln?Leu?Val?Leu?Glu?Lys?Glu?Lys?Leu

    1???????????????5

    <210>46

    <211>9

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>46

    Gly?Ala?Val?Trp?Thr?Val?Asp?Glu?Leu

    1???????????????5

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    <211>9

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>47

    Ala?Val?Pro?Gln?Ser?Ser?Tyr?Pro?Leu

    1???????????????5

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    <211>9

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>48

    Ala?Ala?Pro?Lys?Ala?Ser?Asp?Leu?Leu

    1???????????????5

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    <211>9

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>49

    Phe?Ser?Leu?Lys?Ala?Arg?Pro?Gly?Leu

    1???????????????5

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    <211>9

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>50

    Asn?Ala?Ile?Arg?His?Asn?Leu?Ser?Leu

    1???????????????5

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    <211>9

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>51

    Val?Pro?Gln?Ser?Ser?Tyr?Pro?Leu?Leu

    1???????????????5

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    <211>9

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>52

    Ala?Thr?Leu?Ile?Arg?Trp?Ala?Ile?Leu

    1???????????????5

    <210>53

    <211>9

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>53

    Lys?Trp?Pro?Gly?Cys?Glu?Lys?Val?Phe

    1???????????????5

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    <211>9

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>54

    Gln?Leu?Gln?Leu?Pro?Thr?Leu?Pro?Leu

    1???????????????5

    <210>55

    <211>9

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>55

    Thr?Tyr?Ala?Thr?Leu?Ile?Arg?Trp?Ala

    1???????????????5

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    <211>9

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>56

    Thr?Pro?Val?Leu?Gln?Val?His?Pro?Leu

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    <211>9

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    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>57

    Leu?Asn?Pro?Met?Pro?Pro?Ser?Gln?Leu

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    <211>9

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>58

    Glu?Trp?Val?Ser?Arg?Glu?Pro?Ala?Leu

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    <211>9

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>59

    Ser?Ala?Pro?Arg?Lys?Asp?Ser?Thr?Leu

    1???????????????5

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    <211>9

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>60

    Leu?Gln?Arg?Glu?Met?Val?Gln?Ser?Leu

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    <211>9

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>61

    Ser?Leu?Phe?Ala?Val?Arg?Arg?His?Leu

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    <211>9

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>62

    Thr?Leu?Asn?Glu?Ile?Tyr?His?Trp?Phe

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    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>63

    Arg?Ala?Ala?Pro?Lys?Ala?Ser?Asp?Leu?Leu

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    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>64

    Lys?Val?Phe?Glu?Glu?Pro?Glu?Asp?Phe?Leu

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    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>65

    Lys?Gly?Ala?Val?Trp?Thr?Val?Asp?Glu?Leu

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    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>66

    Glu?Met?Val?Gln?Ser?Leu?Glu?Gln?Gln?Leu

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    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>67

    Gly?Pro?Leu?Pro?His?Leu?Gln?Ala?Leu?Leu

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    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>68

    Asp?Ser?Leu?Phe?Ala?Val?Arg?Arg?His?Leu

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    <211>10

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    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>69

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    <213>人工的

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    <223>肽疫苗

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    Arg?Pro?Gly?Lys?Pro?Ser?Ala?Pro?Ser?Leu

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    <213>人工的

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    <223>肽疫苗

    <400>71

    Lys?Asn?Ala?Ile?Arg?His?Asn?Leu?Ser?Leu

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    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>72

    Ser?Tyr?Pro?Leu?Leu?Ala?Asn?Gly?Val?Cys

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    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

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    <223>肽疫苗

    <400>73

    Leu?Gly?Pro?Leu?Pro?His?Leu?Gln?Ala?Leu

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    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>74

    Ser?Leu?Asn?Pro?Met?Pro?Pro?Ser?Gln?Leu

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    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>75

    Ser?Ala?Val?Pro?Gln?Ser?Ser?Tyr?Pro?Leu

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    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>76

    Asn?Pro?Met?Pro?Pro?Ser?Gln?Leu?Gln?Leu

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    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>77

    Leu?Leu?Gln?Arg?Glu?Met?Val?Gln?Ser?Leu

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    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>78

    Gln?Gln?Leu?Val?Leu?Glu?Lys?Glu?Lys?Leu

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    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>79

    Ala?Val?Pro?Gln?Ser?Ser?Tyr?Pro?Leu?Leu

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    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>80

    Leu?Pro?Pro?Gly?Ile?Asn?Val?Ala?Ser?Leu

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    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>81

    Ser?Gly?Pro?Arg?Glu?Ala?Pro?Asp?Ser?Leu

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    <210>82

    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>82

    Val?Met?Val?Ala?Pro?Ser?Gly?Ala?Arg?Leu

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    <210>83

    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>83

    Glu?Trp?Val?Ser?Arg?Glu?Pro?Ala?Leu?Leu

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    <210>84

    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>84

    Ser?Gln?Leu?Gln?Leu?Pro?Thr?Leu?Pro?Leu

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    <210>85

    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>85

    His?Gly?Asn?Ser?Thr?Phe?Pro?Glu?Phe?Leu

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    <210>86

    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>86

    Thr?Trp?Lys?Asn?Ala?Ile?Arg?His?Asn?Leu

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    <210>87

    <211>10

    <212>PRT

    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>87

    Ile?Tyr?His?Trp?Phe?Thr?Arg?Met?Phe?Ala

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    <223>肽疫苗

    <400>88

    Lys?Leu?Gly?Ala?Met?Gln?Ala?His?Leu

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    <213>人工的

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    <223>肽疫苗

    <400>89

    Lys?Tyr?Ser?Ala?Met?Gln?Ala?His?Leu

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    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

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    <223>肽疫苗

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    <213>人工的

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    <223>肽疫苗

    <400>92

    Lys?Tyr?Ser?Ala?Met?Gln?Ala?His?Phe

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    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>93

    Lys?Phe?Ser?Ala?Met?Gln?Ala?His?Ile

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    <213>人工的

    <220>

    <223>肽疫苗

    <400>94

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    <223>肽疫苗

    <400>95

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    <223>肽疫苗

    <400>96

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    <223>肽疫苗

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    <223>肽疫苗

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