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用于增強對流遞送到中樞神經中心的脂質體組合物.pdf

摘要
申請專利號:

CN200980151445.7

申請日:

2009.11.23

公開號:

CN102256596B

公開日:

2014.10.22

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 9/127申請日:20091123|||公開
IPC分類號: A61K9/127 主分類號: A61K9/127
申請人: 醫源治療公司
發明人: T·雷德梅爾; M·魯茲
地址: 加拿大不列顛哥倫比亞省
優先權: 2008.11.21 US 61/117,076
專利代理機構: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038 代理人: 吳宗頤
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200980151445.7

授權公告號:

102256596B||||||

法律狀態公告日:

2014.10.22|||2012.01.04|||2011.11.23

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

增強對流遞送(CED)作為一種將藥物制劑直接注入遞送到中樞神經系統,從而繞開血液-血液屏障的方法使用。非聚乙二醇化脂質體組合物包含至少一種飽和的中性磷脂和至少一種飽和的陰離子磷脂和包封在其中的治療劑或診斷劑,其用于克服與局部CED遞送產生的高峰值藥物濃度相關的毒性,同時增加用于改進持續藥物釋放的組織分布容積。在一個實施例中,脂質體組合物包括摩爾比為7∶2∶1的DSPC∶DSPG∶CHOL,和選自拓撲替康,芋螺毒素,釓雙胺或羅丹明的治療劑或診斷劑,并用于治療癲癇。

權利要求書

1.一種改進的非聚乙二醇化脂質體遞送載體,其用于通過增強對流遞
送將藥劑給藥到中樞神經系統,所述載體包含包封于脂質體制劑的治療劑
或診斷劑,所述脂質體制劑包含至少一種飽和的中性磷脂和至少一種飽和
的陰離子磷脂。
2.根據權利要求1所述的非聚乙二醇化脂質體遞送載體,其中,所述
載體基本上由至少一種飽和的中性磷脂和至少一種飽和的陰離子磷脂組
成。
3.根據權利要求1所述的非聚乙二醇化脂質體遞送載體,還包含甾醇。
4.根據權利要求3所述的非聚乙二醇化脂質體遞送載體,其中,所述
脂質體制劑包括或基本上由DSPC、DSPG和CHOL組成。
5.根據權利要求4所述的非聚乙二醇化脂質體遞送載體,其中,所述
脂質體遞送載體基本上由摩爾比為7∶2∶1的DSPC、DSPG和CHOL組成。
6.一種包括根據權利要求1到5任一項所述的非聚乙二醇化脂質體遞
送載體的治療組合物,其中,所述脂質體遞送載體包封拓撲異構酶抑制劑。
7.根據權利要求6所述的治療組合物,其中,拓撲異構酶抑制劑是拓
撲替康。
8.根據權利要求6所述的治療組合物,其中,所述拓撲異構酶抑制劑
初始藥物濃度至少約為500μg/mL。
9.一種包括根據權利要求1到5任一項所述的非聚乙二醇化脂質體遞
送載體的治療組合物,其中,所述脂質體遞送載體包封毒素。
10.根據權利要求9所述的治療組合物,其中,所述毒素選自以下物
質組成的組:ω-芋螺毒素、肉毒桿菌毒素、μ-芋螺毒素和σ-芋螺抑制肽。
11.根據權利要求10所述的治療組合物,其中,所述蛋白質毒素是芋
螺毒素。
12.一種改進的治療中樞神經系統疾病的方法,包括向所需病人給藥
根據權利要求1到5中任一項所述的非聚乙二醇化脂質體遞送載體或者根
據權利要求6到11中任一項所述的治療組合物。
13.根據權利要求12所述的方法,其中所述中樞神經系統疾病是中樞
神經系統腫瘤,并且其中所述治療劑是拓撲異構酶抑制劑。
14.根據權利要求12所述的方法,其中所述中樞神經系統疾病是癲癇,
并且其中所述治療劑是毒素。
15.根據權利要求14所述的方法,其中,所述毒素是芋螺毒素。
16.根據權利要求12所述的方法,還包括共同給藥至少一種包封于脂
質體的診斷劑,所述脂質體包括或基本上由飽和的中性磷脂和飽和的陰離
子磷脂組成。
17.一種根據權利要求6到8中任一項所述的治療組合物,其具有治
療需要患者中的中樞神經系統腫瘤的用途。
18.一種根據權利要求9到11中任一項所述的治療組合物,其具有治
療需要患者中的癲癇的用途。
19.一種包括根據權利要求1到5任一項所述的非聚乙二醇化脂質體
遞送載體的診斷組合物,其中,所述脂質體遞送載體包封磁共振成像磁體。
20.根據權利要求19所述的診斷組合物,其中,所述磁共振成像磁體
選自釓雙胺和羅丹明。

說明書

用于增強對流遞送到中樞神經中心的脂質體組合物

技術領域

本發明涉及一種脂質體制劑,其通過增強對流遞送系統遞送,并用于
治療中樞神經系統疾病。

背景技術

對于腦腫瘤患者,全身性遞送治療通常伴隨全身性的副作用,同時在
中樞神經系統(CNS)只能達到臨界治療濃度,從而全身性治療的效果受到
限制。可觀察到的缺乏療效的原因主要是由于治療劑穿過血腦屏障的滲透
性較差。雖然血腦屏障可能在腫瘤中心被破壞,允許全身性遞送化療藥物
大部分地進入腫瘤的非活性中心,但屏障在最需要藥物的增長腫瘤邊緣通
常保持完整。

繞過血腦屏障的一種方法是將治療藥物直接注入中樞神經系統。然而,
直接注入腦中的藥物的擴散性很差。即使從注射位點將小分子藥物移動幾
毫米就需要高濃度梯度,而且這種濃度通常是有神經毒性的。解決這個問
題的一個研發中的策略是腦內直接注射方法,被稱為增強對流遞送(CED)。
CED采用正壓在胞外空間產生分散劑,包括治療性大分子(Bobo,R.H.,et?al.
(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA?91:2076-80.;Chen,M.Y.,et?al.(1999)J.
Neurosurg.90:31520)的局部壓力梯度。CED在給定的靶組織內可重復分布,
并在整個分布容積(Vd)內產生均勻的藥物濃度(Croteau?et?al.,2005;Lonser?et?
al.,2002)。

通過CED局部遞送的化療藥物產生了良好的治療效果(Bruce?et?al.,
2000;Degen?et?al.,2003;Kaiser?et?al.2000)。然而,多數直接遞送到神經系
統的細胞毒性藥物具有損害健康細胞的能力。因此,用于CED給藥進入腦
腫瘤的好的候選藥物必須具備與健康神經細胞相比對于腫瘤細胞最高可
能的治療指數。然而脂質體藥物遞送提供了避免高峰藥物濃度的潛能,高
峰藥物濃度通常伴隨明顯的毒性,而且通過CED給予的脂質體包裹喜樹堿
藥物的臨床前研究已經示出了一些在藥物緩釋中的改善(Moog?et?al,2002;
Saito?et?al,2006;Nobel?et?al,2006),聚乙二醇化脂質體的使用被認為是掩蓋
組織結合位點相互作用必不可少的,且因此增加組織分布容積(Saito?et?al,
2006)。

雖然聚乙二醇化脂質體成功地克服了脂質體/組織的相互作用,但最近
已證明聚乙二醇化脂質體可能產生不必要的和潛在威脅生命的免疫應答
(Szebeni等.(2007)J.Liposome?Res.17:107-117;lshida和Kiwada(2008)lnt?J?
Phartn?354-56-62?Epub?Nov?9?2007)。當向相同實驗對象給藥兩次時,除了
加速血液清除,聚乙二醇化脂質體可能會導致非IgE介導的過敏反應,其
中包括心肺窘迫癥狀(例如呼吸困難、呼吸急促、心跳過速、胸痛、高血壓
和低血壓)(Ishida和Kiwada(2008),上文,Moghimi等(2006)FASEB?J?20
2591-3?Epub?Oct?25,2006)。

因此,所需要的是一種用于增強對流遞送的改進的脂質體藥物制劑,
其能提供增加的組織分布容積,且能避免與聚乙二醇相關的有問題的免疫
原性。

發明概述

本發明人令人驚訝地發現,當陰離子脂質組分用于聚乙二醇代替物制
劑中,脂質體在中樞神經系統組織中可高度對流,如本文所描述并要求的。
而且,該制劑顯示出相比較于本領域中使用的聚乙二醇化制劑的藥代動力
學特征,且同時避免與聚乙二醇相關的有問題的免疫原性。因此,本文提
供了通過陰離子脂質體制劑的增強對流遞送改進的組合物和將治療藥物
給藥到中樞神經系統的分散的組織中的方法,例如,局部CNS腫瘤。

一方面,本文描述了治療中樞神經系統疾病的方法,中樞神經系統疾
病如,在中樞神經系統中與死亡或特定神經元群功能障礙相關的疾病。這
些方法包括向患有中樞神經系統疾病的病人給藥治療上有效劑量的藥物
組合物,其中所述藥物組合物通過增強對流遞送系統局部地遞送到特定神
經元群,且其中所述藥物組合物包括至少一種包封于非聚乙二醇化脂質體
的治療劑和至少一種陰離子飽和脂質,治療劑包括中性飽和磷脂的混合物,
且其中所述藥物組合物的增強對流遞送治療患有中樞神經系統疾病的病
人。

本發明中發現有利的治療劑包括,例如,抗腫瘤藥、碘化合物、毒素
(包括蛋白質毒素)、包括抑制細胞生長或細胞溶解性藥物的細胞毒性劑、
基因和病毒載體、疫苗、合成載體、生長因子、神經營養因子、抗病毒、
抗生素、神經遞質、細胞因子、靶向特定位點損傷的酶和藥物。

通過本文提供的組合物和方法可能治療的中樞神經系統疾病包括,例
如,癌癥、傳染病、頭部外傷、脊髓損傷、多發性硬化癥、路易體癡呆、
ALS、溶酶體貯積癥、精神疾病、神經退行性疾病、中風、癲癇癥、以及
其他急性和慢性的中樞神經系統疾病。

在一個實施例中,本文提供了用于抑制中樞神經系統腫瘤生長,減少
中樞神經系統腫瘤,殺死一個或多個中樞神經系統腫瘤細胞,和/或治療患
有中樞神經系統腫瘤的病人的方法。這些方法包括向患有中樞神經系統腫
瘤的病人給藥治療上有效劑量的藥物組合物,其中所述藥物組合物通過增
強對流遞送系統局部地遞送到中樞神經系統腫瘤,且其中所述藥物組合物
包括至少一種包封于非聚乙二醇化脂質體的治療劑和至少一種陰離子飽
和脂質,治療劑包括中性飽和磷脂的混合物,且其中所述藥物組合物的增
強對流遞送抑制中樞神經系統腫瘤生長,減少中樞神經系統腫瘤,殺死一
個或多個中樞神經系統腫瘤細胞,和/或治療患有中樞神經系統腫瘤的病人。

在另一個實施例中,本文提供了抑制或減少癲癇病人的癲癇發作次數
或發作時間。這些方法包括向患有癲癇的病人給藥治療上有效劑量的藥物
組合物,其中所述藥物組合物通過增強對流遞送系統局部地遞送到顯示異
常或過度高滲透物排放的中樞神經系統神經元的集合,且其中所述藥物組
合物包括至少一種包封于非聚乙二醇化脂質體的治療劑和至少一種陰離
子飽和脂質,治療劑包括中性飽和磷脂的混合物,且其中所述藥物組合物
的增強對流遞送抑制或減少癲癇病人的癲癇發作次數或發作時間。在一個
實施例中,所述治療劑是毒素,例如肽毒素。在一個實施例中,所述肽毒
素是ω-芋螺毒素,如ω-芋螺毒素MVIIA或ω-芋螺毒素GVIA。在另一個
實施例中,所述毒素是肉毒桿菌毒素,例如,A型肉毒桿菌毒素如
或B型肉毒桿菌毒素如等。在另一個實施例中,
所述毒素是μ-芋螺毒素或α-芋螺抑制肽。

在一個實施例中,所述藥物組合物還包括至少一種包裹于非聚乙二醇
化陰離子脂質體的診斷劑(有時稱為“追蹤劑”或“示蹤劑”),其允許在增強對
流遞送期間或之后治療劑分布的可視化。在優選實施例中,所述包裹診斷
劑的非聚乙二醇化脂質體和包裹治療劑的非聚乙二醇化脂質體由相同的
脂質組成。因此,在一個實施例中,本文中描述的方法還包括檢測診斷劑
的步驟。

如本文所述,非聚乙二醇化脂質體可能包括一種治療劑。在一個實施
例中,所述治療劑是一種不可溶治療劑。在另一個實施例中,所述治療劑
是拓撲異構酶I抑制劑(如喜樹堿及其衍生物),其包括但不限于拓撲異構酶
I/II抑制劑。例如,在一個實施例中,所述治療劑是一種喜樹堿衍生物,選
自以下組:9-氨基喜樹堿、7-乙基喜樹堿、10-羥基喜樹堿、9-硝基喜樹堿、
10,11-甲基非飽和二羥基喜樹堿、9-氯-10,11-甲基非飽和二羥基喜樹堿、依
立替康、拓撲替康、7-(4-甲基哌嗪亞甲基)-10,11-亞乙二氧基-20(S)-喜樹堿、
7-(4-甲基哌嗪亞甲基)-10,11-亞甲二氧基-20(S)-喜樹堿和7-(2-(N-異丙基氨
基)乙基)(20S)-喜樹堿。在另一實施例中,喜樹堿衍生物選自以下組中:依
立替康、拓撲替康、7-(4-甲基哌嗪亞甲基)-10,11-亞乙二氧基-20(S)-喜樹堿、
7-(4-甲基哌嗪亞甲基)-10,11-亞甲二氧基-20(S)-喜樹堿和7-(2-(N-異丙基氨
基)乙基)(20S)-喜樹堿。在另一個實施例中,喜樹堿是拓撲替康。

在另一個實施例中,拓撲異構酶抑制劑是拓撲異構酶I/II抑制劑,例
如,6-[[2-(二甲氨基)-乙基]氨基]-3-羥基-7H-茚并[2,1-c]喹啉-7-單鹽酸鹽、
偶氮毒素、或3-甲氧基-11H-吡啶并[3′,4′-4,5]吡咯并[3,2-c]喹啉-1,4-二酮。

在另一個實施例中,所述治療藥物是一種毒素,例如,一種蛋白質毒
素,如ω-芋螺毒素(如,ω-芋螺毒素MVIIA或ω-芋螺毒素,GVIA),一種
肉毒桿菌毒素(例如,A型肉毒桿菌毒素如或B型
肉毒桿菌毒素如),μ-芋螺毒素,α-芋螺抑制肽等。

在一個實施例中,初始藥物濃度至少約為100μg/mL,優選至少約為
200μg/mL,更優選至少約為300μg/mL。在另一個實施例中,初始藥物濃
度約為2~5mg/ml。在一個實施例中,治療藥物和/或診斷劑與脂質的比例
約為0.1~0.5。在另一個實施例中,治療藥物和/或診斷劑與脂質的比例約
為0.1。在另一個實施例中,治療藥物和/或診斷劑與脂質的比例約為0.3。
在另一個實施例中,治療藥物和/或診斷劑與脂質的比例約為0.5。

在一方面,非聚乙二醇化脂質體包括診斷劑。在一個實施例中,所述
診斷劑是MRI(核磁共振成像)磁體。在另一實施例中,所述診斷劑是釓螯
合物。在另一個實施例,所述診斷劑選自釓雙胺和羅丹明。在另一個是實
施例,所述診斷劑是釓雙胺。

本文所述的方法包括脂質體制劑的對流增強遞送,脂質體制劑包括至
少一種治療劑和/或至少一種包封于非聚乙二醇化脂質體的診斷劑,非聚乙
二醇化脂質體由至少一種中性飽和磷脂和至少一種陰離子飽和磷脂的混
合物組成。在一個實施例中,所述中性飽和磷脂選自卵磷脂衍生物和其混
合物,例如,二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、
二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)及其混合物。還可能使用長鏈飽和脂肪,
如C20和C22。在一個實施例中,所述陰離子飽和磷脂從包括磷脂酰甘油
衍生物(如二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG))、二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)、磷
脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸及其混合物的組中選擇。

本文所述的脂質體制劑還可能包括其他脂質組分,如甾醇及其衍生物
(如膽固醇(CHOL))或鞘脂類(如鞘磷脂和鞘糖脂,特別是神經節糖脂)。在
優選實施例中,脂質體制劑將基本上包括或包括至少一種中性飽和磷脂,
至少一種陰離子飽和磷脂和穩定劑,如膽固醇。

在一個實施例中,非聚乙二醇化脂質體是由二硬脂酰磷脂酰膽堿
(DSPC)和二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)的組合物組成的。在一個實施例中,
非聚乙二醇化脂質體包括大約10~95摩爾百分比的DSPC。在一個實施例
中,非聚乙二醇化脂質體包括大約5~90摩爾百分比的DSPG。在一個實施
例中,非聚乙二醇化脂質體還包括膽固醇(CHOL),例如大約5~45摩爾百
分比的膽固醇。在一個優選實施例中,脂質體包括或主要包括大約60~90
摩爾百分比的DSPC,大約5~10摩爾百分比的膽固醇和大約5~30摩爾百
分比的DSPG。在一個優選實施例中,非聚乙二醇化脂質體包括或基本上
由摩爾比為7∶2∶1的DSPC、DSPG和CHOL組成。在另一個實施例中,非
聚乙二醇化脂質體包括或基本上由摩爾比為6∶2∶2的DSPC、DSPG和CHOL
組成。在另一個實施例中,非聚乙二醇化脂質體包括或基本上由摩爾比為
5∶2∶3的DSPC、DSPG和CHOL組成。

在一個實施例中,本文所述的非聚乙二醇化脂質體制劑的增強對流遞
送(CED)相比較于自由地給藥的治療藥物的組織分布、毒性和體內半衰期,
其增強了組織分布,減弱了毒性并延長了體內半衰期。

在一方面,本發明提供了套管,其包括本文所述的脂質體制劑,例如,
包括至少一種包封于非聚乙二醇化脂質體的治療劑的脂質體制劑,非聚乙
二醇化脂質體由至少一種中性飽和磷脂和至少一種陰離子飽和磷脂的混
合物組成,且其中所述制劑通過增強對流遞送系統(CED)遞送。在另一個
實施例中,所述套管還包括脂質體制劑,其包括包封于非聚乙二醇化脂質
體的診斷劑,非聚乙二醇化脂質體由?至少一種中性飽和磷脂和至少一種陰
離子飽和磷脂的混合物組成,且其中所述制劑可能通過增強對流遞送系統
(CED)遞送。在另一個實施例中,所述套管包括一脂質體制劑,其包括包
含治療劑的第一脂質體和包含診斷劑的第二脂質體,其中第一和第二脂質
體都是非聚乙二醇化的,其中第一和第二脂質體由至少一種中性飽和磷脂
和至少一種陰離子飽和磷脂的混合物組成,且其中所述制劑可能通過增強
對流遞送系統(CED)遞送。所述套管與到中樞神經系統的增強對流遞送相
兼容。在一個實施例中,所述套管是免回流設計的套管。

在一方面,本發明提供了生產本文所述脂質體制劑的方法。在一方面,
本發明提供了生產用于治療患有中樞神經系統腫瘤的病人的藥物的方法,
該藥物包括本文所述脂質體制劑。在一個實施例中,所述方法包括通過遠
程裝載將治療藥物或診斷劑包埋于脂質體中,例如,通過硫酸銨梯度。

本文所述儀器和方法的其他目的、特征和優勢將在下文的詳細描述和
相應的顯示本發明說明性實施例的附圖中變得更加清楚。

附圖說明

圖1A-1F比較了脂質組分、藥物濃度和藥物脂質比對聚乙二醇化和非
聚乙二醇化脂質體制劑的拓撲替康的釋放特征的影響。

圖2示出了Ls-TPT制劑和正常腦組織中游離的拓撲替康的藥代動力
學。

圖3示出了蔗糖對羅丹明脂質體對流遞送能力的影響。

圖4示出了向紋狀體注入20μl羅丹明裝載的脂質體后的分布容積(Vd)。

圖5示出了通過治療組的動物存活率。

圖6示出了通過聯合治療組和組2(0.5mg/mL雙劑量)的動物存活率。

圖7示出了通過U87細胞裝載在腫瘤移植的總存活率。

圖8示出了通過聯合治療組和組2(0.5mg/mL雙劑量)及低U87MG細
胞負荷(6.8×103)的動物存活率。

圖9示出了通過聯合治療組和組2(0.5mg/mL雙劑量)及高U87MG細
胞負荷(9.7×105)的動物存活率。

圖10示出了在幼鼠腦組織中Ls-TPT-碼頭藍色DHPE與Ls-Gd-羅丹明
-PE融合的分布容積。對于每種制劑,n=3且每個大腦半球注入20μL。

圖11示出了在U87MG異種移植鼠的腦組織中Ls-TPT-碼頭藍色
DHPE與Ls-Gd-羅丹明-PE融合的分布容積。對于每種制劑,n=4且每個大
腦半球注入20μL。

圖12示出了通過治療組的動物存活率(未計入安樂死動物)。

圖13示出了通過治療組的動物存活率(計入安樂死動物)。

詳細說明

定義

如本文中使用的,“脂質體”是指包含包埋水相體積的脂質雙分子層膜。
脂質體可能是具有單一的膜雙分子層的單層囊泡,或具有多個通過水分子
層相互分離的膜雙分子層的多層囊泡。通常地,脂質體雙分子層由兩個脂
質單分子層組成,其具有疏水性“尾巴”區域和親水性“頭部”區域。膜雙分
子層的結構是,脂質單分子層的疏水性(非極性)“尾巴”面向雙分子層的中
心,而親水性(極性)“頭部”面向包埋的水相體積或外脂質體的水環境。在
一個實施例中,本發明的脂質體包括靶部分,如抗體或其他配體。

“脂質體制劑”被理解為其中的部分或全部的治療藥物和/或診斷劑被
包埋于脂質體中。本文中使用的脂質體制劑是指只具有已列舉的脂質組分
的脂質體,其不含有其他脂質組分。

“磷脂”被理解為甘油的兩親性衍生物,其中的一個羥基被磷酸酯化,
另兩個羥基被長鏈脂肪酸酯化,其可能彼此相同或不同。

飽和磷脂是指其脂肪酸只有碳碳單鍵,而沒有碳碳多鍵。

中性磷脂是指極性基團(通常為羥基或胺類)取代乙醇將另一個磷酸羥
基酯化,且中性磷脂在生理pH下其凈電荷為零。

陰離子磷脂是指極性基團取代乙醇將另一個磷酸羥基酯化,且中性磷
脂在生理pH下其凈電荷為負值。

“帶電飽和磷脂”表達的意思,包括帶電飽和磷脂和其他凈電荷不為零
的兩親化合物。這種兩親化合物包括,但不限于,極性基團(如胺類)取代
的長鏈碳酸氫鹽衍生物和脂肪酸衍生物。

本文中所使用的,“活性劑”或“治療劑”是指以高分子量神經治療的方
式遞送到中樞神經系統靶組織的任何分子,且當其被遞送后,在靶中樞神
經系統組織引起有利響應。治療劑包括但不限于抗腫瘤藥、碘化合物、毒
素(包括蛋白質毒素)、包括抑制細胞生長或細胞溶解性藥物的細胞毒性藥
物、基因和病毒載體、疫苗、合成載體、生長因子、神經營養因子、抗病
毒、抗生素、神經遞質、細胞因子、靶向特定位點損傷的酶和藥物。治療
劑包括但不限于核酸(包括核酸類似物)、蛋白質(包括抗體和小分子化學組
合物)。活性劑包括全身性給藥時顯示毒性和不良影響的制劑。

本文中所使用的,“CNS疾病”是指受體的中樞神經系統疾病。該疾病
可能與中樞神經系統特定神經元群的死亡和/或功能障礙有關。該疾病可能
與中樞神經系統中細胞的異常生長有關。中樞神經系統異常生長的細胞可
能源于中樞神經系統也可能來源于其他組織。CNS疾病包括癌癥、感染、
頭部外傷、脊髓損傷、多發性硬化癥、路易體癡呆、ALS、溶酶體貯積癥、
精神疾病、神經退行性疾病、中風、癲癇癥、以及其他急性和慢性的中樞
神經系統疾病。

神經膠質瘤是最常見的中樞神經系統(CNS)原發瘤。多形性膠質母細
胞瘤(GBM)是最頻繁、最惡性的神經膠質瘤類型。成人GBM的發病率比
兒童高。根據美國統計報告的中心腦腫瘤登記,在美國GBM大約占所有
腦腫瘤的20%(CBTRUS,1998-2002)。其他的CNS腫瘤包括,但不限于,
其他的神經膠質瘤,包括星形細胞瘤(包括纖維(擴散)星形細胞瘤、毛細胞
型星形細胞瘤、多形性黃色星形細胞瘤)和腦干膠質瘤、少突神經膠質瘤、
和室管膜瘤及相關室旁腫塊、神經腫瘤,低分化腫瘤(包括成神經管細胞瘤)、
其他實質腫瘤(包括原發性腦淋巴瘤、生殖細胞腫瘤和松果體實質腫瘤)、
腦膜瘤、轉移性腫瘤,副腫瘤綜合癥、外周神經鞘瘤(包括神經鞘瘤、纖維
神經瘤和惡性外周神經鞘瘤(惡性神經鞘瘤))。

癲癇是與中樞神經系統中特定神經元群的功能障礙有關的最常見的
嚴重的CNS疾病(Shorvon,S,Epidemiology,classification,natural?history,and?
genetics?of?epilepsy,Lancet?1990?JuI?14,336(8707)93-6,McNamara?J,The?
neurobiological?basis?of?epilepsy,Trends?Neurosci?1992?October,15(10)357-9)。
嚴格地,穿透性頭部外傷與大于50%的引起癲癇的風險相關。其他癲癇的
原因包括中風、感染和遺傳敏感性。癲癇發作是一種由中樞神經系統神經
元群的異常、過度、高滲透排放引起的神經性功能障礙。癲癇發作可在行
為上體現(如果包含運動系統)或在電記錄器上體現。癲癇描述的是這樣一
種情況,其中病人由于慢性,潛在的過程最近有癲癇發作。盡管很多癲癇
綜合癥的臨床和病理特征不同,但是其普遍潛在的病因都是神經元的超興
奮性。因此,癲癇包括中樞神經系統(CNS)超興奮性紊亂,以神經功能的
慢性,周期性,突發性變化為特征,可根據腦電圖和臨床表現進行分類
(Dichter?M.,Basic?mechanisms?of?epilepsy:targets?for?therapeutic?intervention,
Epilepsia?1997;38?Suppl?9:S2-6)。

癲癇發作大致分為兩類:病灶(部分)發作或全身性發作。病灶性癲癇
發作是由于大腦皮質或皮質下區域的特定神經元群的異常活動引起的。潛
在的結構異常或損傷可能由于產傷、頭部創傷、腫瘤、膿腫、梗塞、血管
畸形或遺傳性疾病引起的(Dichter?1997,Ibid)。病灶活動的位置可通過臨床
癲癇發作表現識別或可能被隱藏。同樣地,活性病灶可能不涉及損傷本身,
但可能出現在鄰近的或較遠的(但相關的)神經元群,支持可塑突觸重組引
起病灶過度反應的假設(參見例如Prince?D.A.,Epileptogenic?neurons?and?
circuits.In:Jasper′s?Basic?Mechanisms?of?the?Epilepsies,Third?Edition(1999),
Delgado-Escueta?A.V.,et?al.,editors),Advances?in?Neurology?79:665-684)。

局灶性癲癇發作如果在意識上沒有明顯變化,則被認為是“簡單”的,
否則將被認為是“復雜”的。復雜的局灶性癲癇發作牽扯到顳葉和大腦邊緣
系統,是最普遍的成人癲癇病癥。局灶性癲癇發作時,若腦電圖成像變成
雙向,同時出現意識喪失,伴隨或不伴隨肌體痙攣現象,則被稱為是二次
發作。原發性的癲癇發作表現為單向電圖成像,意識喪失,伴隨或不伴隨
肌體痙攣現象。局灶性癲癇能夠牽扯到大腦的幾乎所有部分,通常由功能
異常的局部病灶引發。目前對局灶性癲癇的治療方法是,使用EEG將由器
質性腦疾病引發的異常峰值波局部化(器質性腦疾病更易誘導局灶性癲癇
發作),然后對病灶進行外科手術切除以防復發。

脂質體制劑

本文所述的脂質體制劑,例如,包括這種制劑的藥物組合物,可能以
多種方式形成,包括主動或被動的裝載方法。例如,可能使用跨膜pH梯
度裝載技術包封一種或多種治療劑和/或診斷劑。通過使用跨膜電位穿過脂
質體雙分子層將治療藥物裝載于脂質體的常用方法在本領域是眾所周知
的(例如美國專利No.5,171,578;5,077,056和5,192,549)。

簡短地,例如,可先將脂質體溶于有機溶劑,如乙醇、叔丁醇及其混
合物等,然后溫和地加熱(如60℃~70℃)。用于形成非聚乙二醇化脂質體
的紙質組合物可能從多種囊泡形成脂質中選擇,通常包括磷脂和甾醇(例如
美國專利No.5,059,421和5,100,662)。例如,來自于蛋黃、大豆或其他蔬
菜或動物組織的磷脂,如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰絲氨酸、
磷脂酰環己六醇、磷脂酰甘油、鞘磷脂等,其混合物,如蛋黃磷脂、大豆
磷脂等,其氫化物及合成磷脂,如二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰
膽堿、二硬脂酰磷脂酰甘油或可能使用的類似物。

如本文所述,本發明的非聚乙二醇化陰離子脂質體是兩種或多種非聚
乙二醇化脂質的混合物,例如,一中性磷脂和一陰離子磷脂。在一個實施
例中,所述中性磷脂選自卵磷脂衍生物和其混合物組成的組中,例如二棕
櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰
膽堿(DMPC)及其混合物。在一個實施例中,所述陰離子磷脂從由磷脂酰
甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰環己六醇、磷
脂酸的衍生物和其混合物組成的組中選擇,例如,二硬脂酰磷脂酰甘油
(DSPG)和磷脂酰絲氨酸和不同飽和脂肪酸形成的酯類的混合物。為了脂質
體穩定和其他目的,還可能添加固醇(如膽固醇)、α-生育酚、雙十六烷基
磷酸酯、硬脂胺或其類似物。

為了使脂質溶解,可能加入預熱的水溶液同時劇烈混合。例如,可能
添加含有150~300mM緩沖物的溶液。可能使用的緩沖物包括,但不限于,
硫酸銨、檸檬酸鹽、馬來酸鹽和谷氨酸鹽。混合后,將產生的多層囊泡(MLV)
加熱,并通過擠壓裝置的擠壓,將MLV轉換為單層脂質體囊泡。最初使
用的溶解脂質的有機溶劑和通過透析、滲濾等從脂質體制劑中移除。

一種或多種治療藥物和/或診斷劑可能使用跨膜pH梯度裝載技術被包
封于脂質體中。通過提高脂質體外溶液的pH,脂質體雙分子層間將存在
pH差異。因此,脂質體雙分子層間產生了跨膜電位,而且一種或多種治療
藥物和/或診斷劑通過跨膜電位被裝載于脂質體中。

通常地,治療藥物和/或診斷劑與脂質的比例約為0.01至約0.5(wt/wt)。
在一個實施例中,治療藥物和/或診斷劑與脂質的比例約為0.1。在另一個
實施例中,治療藥物和/或診斷劑與脂質的比例約為0.3。在一個實施例中,
囊泡通過跨膜離子濃度制備,且在能使治療藥物和/或診斷劑包封的條件下
與弱酸或堿性的治療藥物和/或診斷劑一起培育。在另一個實施例中,囊泡
在存在治療藥物和/或診斷劑時被制備,且非包封材料通過透析、離子交換
色譜、凝膠過濾色譜或滲濾移除。

用于裝載的優選實施例以美國專利No.5,192,549為基礎,且包括將氨
氮從外界環境中去除。該結果產生了跨膜氨氮濃度梯度,其引起pH梯度。
將藥物添加到囊泡中,并在高溫培育后“遠距離”裝載。

在一個優選實施例中,藥劑基本上是不透水的(例如,診斷劑如釓雙胺),
該藥劑存在于緩沖液中,其使脂質體在囊泡形成期間被動包封。這種優選
方法還可應用于其他兩性離子藥物,如氨甲蝶呤。相反地,弱堿(和酸)可
遠距離裝載于脂質體。

本文所述的脂質體制劑可能用于到中樞神經系統區的增強對流遞送,
而且CED在CNS內達到高組織分布容積。因此,該脂質體制劑可能用于
治療CNS疾病。這種CNS疾病包括但不限于CNS腫瘤,如惡性膠質瘤,
及與神經細胞的功能障礙相關的疾病,如癲癇。

因此,許多用于治療CNS疾病的藥物可能以本文所述方法包埋于本文
所述的脂質體制劑。這種治療藥物包括抗腫瘤藥、毒素、生物制劑(如多巴
胺、5-羥色胺)和神經營養性因子(如GDNF、CDNF、MANF)等。

在一個實施例中,本文所述脂質體制劑包括拓撲異構酶I抑制劑(包括
但不限于拓撲異構酶I/II抑制劑)。在一個實施例中,拓撲異構酶抑制劑是
喜樹堿及其衍生物。例如,治療劑是一種喜樹堿衍生物,選自以下組:9-
氨基喜樹堿、7-乙基喜樹堿、10-羥基喜樹堿、9-硝基喜樹堿、10,11-甲基
非飽和二羥基喜樹堿、9-氯-10,11-甲基非飽和二羥基喜樹堿、依立替康、
拓撲替康、7-(4-甲基哌嗪亞甲基)-10,11-亞乙二氧基-20(S)-喜樹堿、7-(4-甲
基哌嗪亞甲基)-10,11-亞甲二氧基-20(S)-喜樹堿和7-(2-(N-異丙基氨基)乙
基)(20S)-喜樹堿。在另一實施例中,喜樹堿衍生物選自以下組中:依立替
康、拓撲替康、7-(4-甲基哌嗪亞甲基)-10,11-亞乙二氧基-20(S)-喜樹堿、7-(4-
甲基哌嗪亞甲基)-10,11-亞甲二氧基-20(S)-喜樹堿和7-(2-(N-異丙基氨基)乙
基)(20S)-喜樹堿。在另一個實施例中,喜樹堿是拓撲替康。對于本領域的
通用技術這將是顯而易見的,雖然某些藥劑被說明性描述,但還有許多其
他藥劑也適合于本發明的脂質體組合物。

本文還考慮使用毒素,如蛋白質毒素,包括μ-芋螺毒素(如μ-芋螺毒
素GIIIA、μ-芋螺毒素GIIIB、μ-芋螺毒素GIIIC、μ-芋螺毒素PIIIA、μ-芋
螺毒素SmIIIA、μ-芋螺毒素KIIIA等)、ω-芋螺毒素(如ω-芋螺毒素GVIA(本
文中也稱為“ω-芋螺毒素G”和“ω-CTX-G”)、ω-芋螺毒素MVIIA(本文中也
稱為“ω-芋螺毒素M”和“ω-CTX-M”)、肉毒桿菌毒素(如肉毒桿菌毒素A(本
文中也稱為“BTX-A”)、肉毒桿菌毒素B(本文中也稱為“BTX-B”)、肉毒桿
菌毒素C1、肉毒桿菌毒素D、肉毒桿菌毒素E、肉毒桿菌毒素F等)、芋
螺抑制肽(如芋螺抑制肽G、芋螺抑制肽T、芋螺抑制肽L、芋螺抑制肽S1、
芋螺抑制肽Oc、芋螺抑制肽Gm、芋螺抑制肽Ca2、芋螺抑制肽Ca1和芋
螺抑制肽Qu)及其衍生物,和其藥學上可接受的鹽。

在一個實施例中,來源于芋螺毒液的芋螺毒素可使用實驗制劑遞送。
毒液的活性組分是短肽毒素,通常長度為10~30個氨基酸殘基,而且由于
其高密度的二硫鍵,基本上被高度抑制。毒液組分作用于電壓控制離子通
道、配體控制離子通道和G-蛋白偶聯受體。芋螺毒素的藥物選擇性至少部
分由特定的二硫鍵構架與氨基酸在二硫鍵環內結合決定。由于芋螺多肽的
高效能和強選擇性,多種已被評估用于治療人類疾病,且目前使用一種ω-
芋螺毒素MVIIA(齊考諾肽),一種N型鈣通道阻滯劑,通過可植入的、可
編程的泵與導管進入鞘內空間治療人類患者的疼痛。

在本發明的特定實施例中,抗癲癇藥物制劑包括ω-芋螺毒素(如ω-芋
螺毒素GVIA、ω-芋螺毒素MVIIA和ω-芋螺毒素CVID)(參見例如Gasior?et?
al?J?Pharmacol?Exp?Ther?323?458-68(2007))。在另一實施例中,抗癲癇藥物
制劑包括μ-芋螺毒素(如μ-芋螺毒素GIIIA、μ-芋螺毒素GIIIB、μ-芋螺毒
素GIIIC、μ-芋螺毒素PIIIA、μ-芋螺毒素SmIIIA、μ-芋螺毒素KIIIA
等)(Zhang等,J?Biol?Chem?282?30699-30706(2007)。其他實施例中使用本文
所述芋螺毒素的衍生物或藥學上可接受的鹽。

本文還考慮使用來源于肉毒梭菌的肉毒桿菌毒素。已經描述了7種不
同免疫性的肉毒桿菌神經毒素,這些肉毒桿菌神經毒素按血清型分類分別
為A、B、C1、D、E、F和G,每種毒素通過特異性抗體的中和作用識別。
肉毒桿菌毒素的不同血清類型在動物物種中變化,其影響所引起的癱瘓的
嚴重程度和持續時間。例如,已通過計算小鼠的癱瘓率確定,A型肉毒桿
菌毒素的效力比B型肉毒桿菌毒素高500倍。此外,已確定在靈長類動物
中480U/kg劑量的B型肉毒桿菌毒素是無毒的,其約為靈長類動物LD50
中A型肉毒桿菌毒素的12倍。因此,非A型肉毒桿菌毒素與A型肉毒桿
菌毒素相比可能具有低效力和/或短持續時間。

雖然所有血清型肉毒桿菌毒素都能明顯抑制神經肌肉交界處的神經
遞質釋放,但其通過影響不同的神經分泌蛋白質和/或在不同位點使這些蛋
白質分開作用。例如,A型和E型肉毒桿菌毒素都能使25千道爾頓(kD)
突觸相關的蛋白質(SNAP-25)分開,但他們在該蛋白質中靶定于不同的氨
基酸序列。B、D、F和G型肉毒桿菌毒素作用于囊泡相關的蛋白質(VAMP,
也稱為小突觸泡蛋白),每種血清型使蛋白質在不同位點分開。最后,示出
了C1型肉毒桿菌毒素能使突觸融合蛋白和SNAP-25都分開。這些作用原
理的不同可能影響各種血清型肉毒桿菌毒素的相對效力和/或持續時間。

體外研究表明,肉毒桿菌毒素抑制鉀離子引起的原代細胞培養和腦突
觸體制備的各種神經遞質釋放。谷氨酸是負責腦中大量突觸激發的神經遞
質,且已認為其在癲癇發作和蔓延中是必須的。據報道,肉毒桿菌毒素抑
制脊髓神經元原代培養中谷氨酸的誘發釋放,且在腦突觸體制備中肉毒桿
菌毒素抑制谷氨酸和其他神經遞質的釋放。

在本發明的一些實施例中,抗癲癇藥物是A型肉毒桿菌毒素或B型肉
毒桿菌毒素。在其他實施例中,毒素是A型肉毒桿菌毒素或B型肉毒桿菌
毒素的片段或類似物,其具備母體肉毒桿菌毒素的生物活性。在其他實施
例中,毒素被修飾以與大腦神經元的合適靶標特異性結合。在一些實施例
中,使用重組技術已生產梭菌神經毒素或其片段或類似物。

本發明還考慮使用芋螺抑制肽,包括美國專利No.6,172,041和
6,399,574所述的,其公開內容已納入本文做參考。

診斷劑也可能包埋于本文所述的脂質體。合適的藥劑包括用于MRI
的順磁離子,本文成為“MRI磁體”。合適的金屬離子包括那些原子數為
22-29(計算在內的)、42、44和58~70(計算在內的),且氧化價態為+2或+3
的離子。這種金屬離子的例子為鉻(III),錳(II),鐵(II),鐵(III),鈷(II),
鎳(II),銅(II),鐠(III),釹(III),釤(III),釓(III),鋱(III),鏑(III),鈥(III),
鉺(III)和鐿(III)。

在實施例中,X-射線成像(如CT)用于檢測CED,診斷劑可能包括一
種不透射線的物質。已知的合適的不透射線的物質包括碘化合物、鋇化合
物、鎵化合物、鉈化合物等。不透射線的物質的具體例子包括鋇、二乙酰
氨基三碘苯甲酸鹽、乙碘油、檸檬酸鎵、碘卡明酸、碘西他酸、碘達酸、
膽影酸、碘沙酸、iogulamide、碘苯六醇,碘帕醇、碘番酸、碘普西酸、碘
西法酸、碘絲酸、碘砜葡胺、碘琥酸、碘酞硫、碘替酸、異泛影酸、碘托
西酸、碘克沙酸、羥泛影酸、碘泊酸鹽、甲葡胺、甲泛葡胺、甲泛影鈉、
丙碘酮和氯化亞鉈。

如本文所述的脂質體制劑適合于增強對流遞送。

增強對流遞送

增強對流遞送(CED)是一種直接的顱內藥物遞送技術,其利用大流量
原理,使大分子遞送并分布到固體組織的臨床重要的容積中。CED比簡單
擴散提供更大的分布容積,旨在治療劑直接作用于特定靶位點(見美國專利
No.5,720,720),本文的參考文獻將其公開。簡言之,增強對流遞送(CED)
是一種能繞過血腦屏障,并使大分子量物質(如藥物裝載脂質體)在腦中指
定區域以控制的方式均勻地被給藥的方法(見USSN?11/740,548,包含于本
文參考文獻)。CED可用于通過組織間隙的直接對流注入將液體藥劑(如脂
質體制劑)給藥于固體組織,且將導管直接插入組織超過預定時間,并在壓
力下通過導管以預定流量進入組織間隙空間使用藥劑,如大約0.1至約12
μL/min。

如本文詳細敘述,申請人發現CED可能有效地用于治療藥物的遞送,
且非必須的,診斷劑包埋于非聚乙二醇化脂質體制劑中,其中該制劑包括
或主要包括至少一種中性飽和磷脂和至少一種陰離子飽和磷脂的混合物。
如實施例部分所述,CED組合物包括至少一種治療藥物(如拓撲替康)和/
或包埋于本文所述非聚乙二醇化脂質體制劑的診斷劑,增加分布容積,并
顯著提高治療藥物的血清半衰期。

用于給藥脂質體制劑(如藥物組合物)的合適器具可能包括泵裝置,其
包含裝滿脂質體制劑的蓄水池。該泵可置于體外或植入體內。該泵連接導
管,導管可植入CNS的離散組織。該泵在引起特定組織內溶解物對流的壓
力和流量下被激活,釋放脂質體制劑。

可調整注入的持續時間和其他參數,使遍及離散組織的脂質體制劑分
布于離散組織的相鄰區域,如,不進入腦脊液。根據離散組織的大小和形
狀不同,可能需要使用多個植入注射導管或使用帶有多個出液口的注射導
管。

使用CED,脂質體制劑可在正壓下通過細導管緩慢注入組織間隙空間
擴散。可使用泵靜水壓力產生的大流量將脂質體制劑擴散到CNS的胞外空
間。因為CED的使用運行脂質體制劑通過導管末端直接擴散到神經組織,
血腦屏障被越過,且可靶定于中樞神經系統的離散組織,包括制定的離散
組織,如癌組織或用于傳統手術評估的切除術,及多個病灶需要治療的不
同病灶。基于大流量的性質,CED可用于脂質體制劑可靠地、安全地、均
勻地分布整個體積范圍(參見例子USSN?11,/740,508)。而且,CED不會引
起注入組織的結構和功能損傷,且對脂質體制劑擴散提供更強的控制。此
外,不論包括于脂質體制劑中的脂質體的分子量,脂質體制劑都可均勻地
分布于整個分布容積內,其與注入體積是成比例的。

在一個實施例中,一個超細遞送導管(由聚氨酯構成并在新“步驟”設計
中與石英熔合)可被永久性地植入經皮口。新型導管設計可快速生物整合,
且內部密封,過濾阻止細菌侵入,并保證進一步的安全。脂質體制劑可根
據需要注入這個導管系統的端口。

在本文所述的一個實施例中,CED可適用于小直徑導管,其通過輸液
泵永久性地植入大腦區域。給藥的脂質體制劑可制備為水等滲溶液,或其
他合適制劑。在給藥(如注入)期間,脂質體溶液可在胞外空間流動,對腦
組織損傷很小甚至不損大腦組織。

在一個實施例中,可能使用專門為經皮CED遞送設計的超細(端口外
徑為0.2mm)、最低限度創傷的導管系統。該導管系統的一步設計可消除
沿導管兩側的溶液回流。這種溶液泄露是直邊導管的一個主要問題。該導
管系統可能由聚氨酯構成并與石英或Peek?Optima熔合,使其為高度生物
相容的并不干擾MRI信號。CNS疾病的治療可能需要在不同時間間隔重復
給藥脂質體制劑,如,每隔一周、每隔一月等。例如,參見USSN11/740,124,
其公開內容已納入本文做參考。經皮口在間隔期間可能保持封閉。多導管
設計是可行的,對于灑遍大面積離散組織,多導管比單一導管更可行。?已
發現,CED注入后脂質體的分布容積與注入的溶液體積線性相關。

特別優選的套管在以下三篇文獻中有詳述,Krauze等人發表于2005
年11月神經外科雜志上的文章103(5)923-9,在此附上引用文獻全文;發
表于L.J.S,專利申請公開號US2007/0088295?A1中的文章,在此附上引用文
獻全文;以及發表于美國專利申請公開號US?2006/0135945?A1中的文章,
在此附上引用文獻全文。

在一個實施例中,CED包括約為0.1~10μL/min的注入速率。在另一個
實施例中,CED包括大于0.1~0.3μL/min的注入速率,例如,約為0.2μL/min。
優選為大于0.7μL/min,更優選為大于1μL/min,更優選為大于1.2μL/min,
更優選為大于1.5μL/min,更優選為大于1.7μL/min,更優選為大于2μL/min,
更優選為大于2.2μL/min,更優選為大于2.5μL/min,更優選為大于
2.7μL/min,更優選為大于3μL/min,且優選為小于12μL/min,更優選為小
于10μL/min。

在一個優選實施例中,CED包括流量的增量,指在遞送期間“步進”或
向上滴定。優選地,進一步包括約為0.1~10μL/min的注入速率。

在一個優選實施例中,進一步包括大于0.5μL/min的注入速率,優選
為大于0.7μL/min,更優選為大于1μL/min,更優選為大于1.2μL/min,更
優選為大于1.5μL/min,更優選為大于1.7μL/min,更優選為大于2μL/min,
更優選為大于2.2μL/min,更優選為大于2.5μL/min,更優選為大于
2.7μL/min,更優選為大于3μL/min,且優選為小于12μL/min,更優選為小
于10μL/min。

本文的治療方法還優選地包括通過診斷劑的神經影像,優選為MRI,
用于目標定位并引導導管位置。優選的立體定向支架用于與診斷劑神經影
像的結合,以提供引導導管位置或靶定神經元群。通過磁共振成像(MRI)
或X射線計算機斷層掃描的示蹤劑優選為可檢測的。示蹤劑的擴散被監控
并用于間接測量高分子量神經治療物的擴散。這種監控用于檢測注入物到
非靶組織的多余遞送,并證明高分子量神經治療物到達靶組織且達到有效
濃度。

在一個實施例中,診斷劑獨立于治療劑。診斷劑以與治療劑相關的速
度擴散,因此其為治療劑擴散的間接指標。在一個優選實施例中,診斷劑
和治療劑是分開給藥的,但都被相同的非聚乙二醇陰離子脂質體制劑包埋,
使其具有高度相似的擴散特點。在另一個實施例中,診斷劑和治療劑是共
同給藥的。

本文的治療方法還優選地包括用于監控注入物擴散的神經影像。在一
個優選實施例中,治療方法包括MRI的使用,用于監控本發明的注入藥物
組合物的擴散,其中該藥物組合物包括MRI磁體。

實施例

實施例1用于CED的聚乙二醇化和非聚乙二醇化脂質體制劑的比較

實施例1.1材料和方法

實施例1.1.1?DSPC/CHOL(摩爾比60/40)

稱量26.1mg?DSPC(MW790,lot#C3L00,實際重量26.2mg)+8.5mg
膽固醇(MW387,lot#CH1S003,實際重量為8.8mg)。

溶解于0.5ml的氯仿中,在EtOH中加入75μl?5mg/ml?RhPE(0.2摩爾
百分比的磷脂)。

在氮氣中干燥樣品,同時渦流形成薄膜。在真空下完成干燥1小時。

使脂質在60℃下,在1.5ml?HBS(5mM?HEPES-145mM?NaCl?pH7.0,
0.1192g?HEPES[MW238.3]+0.8475g?NaCl[MW58.45],用NaOH調節pH
值,補充體積至100ml)中再次水合以形成MLV。

在60℃下通過2x100nm過濾器擠出以獲得LUV(靶標大小為
100-120nm)。

磷酸鹽測定-稀釋到20mM的磷脂。

放入2.0ml的血清瓶中(預先去熱源)。

實施例1.1.2:DSPC/CHOL/PEG2000DSPE(摩爾比59.5/40/0.5)

稱量25.8mg?DSPC(MW790,lot#C3L006,實際重量為25.6mg)+8.5
mg膽固醇(MW387,lot#CH1S003,實際重量為8.7mg)+0.75mg
PEG2000DSPE(MW2774,lot#PPE2011809,實際重量為50μl的15mg/ml
溶解于CHCl3,制備18mg[實際17.9mg]在1.2ml?CHCL3)。

溶解于0.5ml的氯仿中,加入75μl?5mg/ml?RhPE(0.2摩爾%的磷脂)。

在氮氣中干燥樣品,同時渦流形成薄膜。在真空下完成干燥1小時。

使脂質在60℃下,在1.5ml?HBS(5mM?HEPES-145mM?NaCl?pH7.0)
中再次水合以形成MLV。

在60℃下通過2x100nm過濾器擠出以獲得LUV(靶標大小為
100-120nm)。

磷酸鹽測定-稀釋到20mM的磷脂,放入2.0ml的血清瓶中(預先去熱
源)。

實施例1.1.3:DSPC/CHOL/PEG2000DSPE(摩爾比55/40/5)

稱量23.9mg?DSPC(MW790,lot#C3L006,實際重量為23.8mg)+8.5
mg膽固醇(MW387,lot#CH1S003,實際重量為8.6mg)+7.5mg
PEG2000DSPE(MW2774,lot#PPE2011809,實際重量為500μl的15mg/ml
溶于CHCl3)。

溶解于0.5ml的氯仿中,加入75μl?RhPE(0.2摩爾%的磷脂)。

在氮氣中干燥樣品,同時渦流形成薄膜。在真空下完成干燥1小時。

使脂質在60℃下,在2.0ml?HBS(5mM?HEPES-145mM?NaCl?pH7.0)
中再次水合以形成MLV。

在60℃下通過2x100nm過濾器擠出以獲得LUV(靶標大小為
100-120nm)。

磷酸鹽測定-稀釋到20mM的磷脂。

放入2.0ml的血清瓶中(預先去熱源)。

實施例1.1.4:DSPC/CHOL/NG-DOPE(摩爾比55/40/5)

稱量23.9mg?DSPC(MW790,lot#C3L006,實際重量為24.2mg)+8.5
mg膽固醇(MW387,lot#CH1S003,實際重量為8.9mg)+2.4mg
NG-DOPE(MW880.13,lot#050328L,實際重量為2.4mg)

溶解于0.5ml的氯仿中,加入75μl?RhPE(0.2摩爾%的磷脂)。

在氮氣中干燥樣品,同時渦流形成薄膜。在真空下完成干燥1小時。

使脂質在60℃下,在2.0ml?HBS(5mM?HEPES-145mM?NaCl?pH7.0)
中再次水合以形成MLV。

在60℃下通過2x100nm過濾器擠出以獲得LUV(靶標大小為
100-120nm)。

磷酸鹽測定-稀釋到20mM的磷脂。

放入2.0ml的血清瓶中(預先去熱源)。

實施例1.1.5:DSPC/PEG2000DSPE(99/1摩爾比)

稱量25.8mg?DSPC(MW790;lot#C3L006;實際重量為26.1mg)+0.9
mg?PEG2000DSPE(MW2774;lot#PPE2011809;實際重量為60μl的15
mg/ml溶于CHCl3)。

溶解于0.5ml的氯仿中;加入75μl?RhPE(0.2摩爾%的磷脂)。

在氮氣中干燥樣品,同時渦流形成薄膜。在真空下完成干燥1小時。

使脂質在60℃下,在1.5ml?HBS(5mM?HEPES-145mM?NaCl?pH7.0)
中再次水合以形成MLV。

在60℃下通過2x100nm過濾器擠出以獲得LUV(靶標大小為
100-120nm)。

磷酸鹽測定-稀釋到20mM的磷脂。

放入2.0ml的血清瓶中(預先去熱源)。

實施例1.1.6:DSPC/PEG2000DSPE(摩爾比95/5)

稱量24.8mg?DSPC(MW790;lot#C3L006;實際重量為24.6mg)+4.6
mg?PEG2000DSPE(MW2774;lot#PPE2011809;實際重量為307μl的15
mg/ml溶于CHCl3)。

溶解于0.5ml的氯仿中;加入75μl?RhPE(0.2摩爾%的磷脂)。

在氮氣中干燥樣品,同時渦流形成薄膜。在真空下完成干燥1小時。

使脂質在60℃下,在1.5ml?HBS(5mMHEPES-145mM?NaCl?pH7.0)
中再次水合以形成MLV。

在60℃下通過2x100nm過濾器擠出以獲得LUV(靶標大小為
100-120nm)。

磷酸鹽測定-稀釋到20mM的磷脂。

放入2.0ml的血清瓶中(預先去熱源)。

實施例1.1.7:DSPC/DSPG(摩爾比70/30)

稱量18.2mg?DSPC(MW790;lot#C3L006;實際重量為18.1mg)+7.4
mg?DSPG(MW745;lot#G3L006;實際重量為7.6mg)

溶解于0.5ml的氯仿/MeOH(9/1,v/v)中;加入75μl?RhPE(0.2摩爾%
的磷脂)。

在氮氣中干燥樣品,同時渦流形成薄膜。在真空下完成干燥1小時。

使脂質在60℃下,在2.0ml?HBS(5mM?HEPES-145mM?NaCl?pH6.5)
中再次水合以形成MLV。

在60℃下通過2x100nm過濾器擠出以獲得LUV(靶標大小為
100-120nm)。

磷酸鹽測定-稀釋到20mM的磷脂。

放入2.0ml的血清瓶中(預先去熱源)。

實施例1.1.8磷酸鹽測定

用水將樣品稀釋50倍(20μl至1.0ml),使濃度為0.4mM

將每份稀釋的樣品等分為3x200μl

根據ACM-010測定磷酸鹽。

實施例1.2結果

參見圖1A-1F

實施例2腦內遞送到嚙齒類動物大腦的納米脂質體化合物的藥物學
評估

實施例2.1材料和方法

實施例2.1.1試驗用品

在該實施例中的實驗,使用的是研究級材料-脂質體-拓撲替康(Ls-TPT)
和脂質體釓雙胺(Ls-GD)。用于游離拓撲替康制劑和Ls-TPT制備的拓撲替
康(TPT)是從海正藥業(中國浙江泰州)獲得的。Ls-TPT由北脂公司提供
(Burnaby,BC,Canada)。簡言之,脂質體由二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、
二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)和膽固醇以7∶2∶1的摩爾比組成,具有75~90nm
的靶尺寸。使用內部和外部緩沖液將拓撲替康遠距離載入(主動封裝)到脂
質體中,以響應跨膜pH梯度,所述緩沖液由250mM?pH5.5的硫酸銨和5
mM的組氨酸,145mM?pH6.0的NaCl組成。假設藥物包封率為90-95%,
濃度為2.0mg/mL和0.67mg/mL的拓撲替康分別對應的藥物脂質比例為
0.1和0.3(w/w)。在兩個制劑中維持恒定的總脂質濃度6.7mg/mL。制作過
程如實施例2.1.2詳細描述。

用于Ls-GD制劑的釓雙胺(GD)從北京SHLHT科學貿易(中國,北京)
獲得。Ls-GD與Ls-TPT的制備類似,除了釓雙胺是被動封裝在脂質體中。
內部緩沖溶液由520mM?pH3.5的釓雙胺代替250mM?pH5.5的硫酸銨。假
設4-6%的包封率,以釓雙胺與脂質的比例為0.3(w/w)并且粒經為
75~120nm為靶標。最終脂質體制劑和釓雙胺的濃度分別為51.1mg/mL和
17.0mg/mL。

除非另有說明,Ls-TPT試驗用品被冷凍保存(-20~-30℃)。給藥溶液
給藥時新鮮制備并在室溫保存。用5mM組氨酸,145mM?pH6.0?NaCI,
300mM的蔗糖貯備液(Ls-TPT和游離拓撲替康)進行適當稀釋,以達到所需
濃度。每天給藥時使用新鮮瓶子儲存試驗用品溶液。

實施例212脂質體的制作過程

計算用于批量所需的脂質的量并且將脂質粉末在稱量船上稱重。以叔
丁醇,乙醇和水(45∶45∶10vol/vol)的比例制備溶劑溶液并加熱到70℃。
同時攪拌,將脂質粉末加入到溶劑溶液中。溶劑維持在70℃并且攪拌直
到脂質溶解(1小時)。在這點上,溶液中脂質的濃度為320mg/mL。制備
250mM硫酸銨溶液(體積為脂質溶液的9倍)并加熱到70℃。當硫酸銨達
到所述溫度時,將脂質溶液傾倒入硫酸銨溶液中,同時攪拌產生多層囊泡
(MLV)。多層囊泡維持在70℃并且通過具有80nm孔徑的4層聚碳酸酯疊
過濾器擠出。需要兩個通道產生所需尺寸(平均直徑75~90nm)的大單層囊
泡(LUV)。通過QELS測量脂質體的尺寸,接著每個通道通過擠壓機。將
LUV維持在70℃直到其減少到所需尺寸,然后用pH6.0的組氨酸鹽緩沖
液將其稀釋到濃度為5%的溶劑,因為LUV在低于相變溫度-55℃,濃度
為10%的溶劑中不穩定。然后通過超過濾作用使LUV重新濃縮到總脂質
為50mg/mL,隨后用10倍洗滌體積的10mM組氨酸,145mM?Nacl緩沖液
滲濾以除去溶劑并使外部的緩沖液從硫酸銨更換為pH6.0的組氨酸緩沖液。
這種緩沖液的更換導致跨膜pH梯度的產生,其用于將拓撲替康載入到制
備好的脂質體中。然后通過磷酸分析測定總脂質濃度。在測定脂質總量后,
要求拓撲替康的量達到藥物脂質比例為0∶1∶1或0∶3∶1(w/w),通過分別乘以
0.1和0.3計算脂質總量。為了達到最終的藥物脂質比0∶1∶1或0∶3∶1(w/w),
假定裝載效率為90%。計算所需的拓撲替康的總量后,將粉末稱重加入到
一個干凈的瓶子中。將LUV懸浮液加熱到60℃并加入拓撲替康粉末。拓
撲替康裝載60分鐘后添加藥物以確保脂質體中的最佳裝載。在隨后的藥物
裝載中,未膠囊化的拓撲替康通過使用5倍洗滌體積的5mM組氨酸,300
mM?pH6.0的蔗糖緩沖液滲濾移除。該步驟也用于將外部緩沖液從NaCl
溶液更換為蔗糖溶液,所述蔗糖溶液作為冷凍保護劑使用并允許制劑在不
改變物理性質的情況下將其冷凍。該階段估計的脂質含量為8.3mg/mL(藥
物脂質比為0.3∶1)。將制劑加熱到50℃,用0.2μm注射器過濾后,將產物
裝瓶。最后將產物冷凍,完成該制作過程。

實施例2.1.3動物與分組

使用重250~350克的成年雄性Sprague-Dawley大鼠(Harlan,
Indianapolis,IN)(批次120806和120806)。

用于制劑篩選組分,此實施例根據Ls-TPT制劑或游離拓撲替康將實
驗動物分成四組,如表1所列。

表1制劑篩選的分組和劑量



F1:DSPC/Chol?0.1藥物脂質比,濃度為0.5mg/mL?Ls-TPT+濃度為1.15mg/mL?Ls-GD的混合液

F2:DSPC/DSPG/Chol?0.3藥物脂質比,濃度為0.5mg/mL?Ls-TPT+濃度為1.15mg/mL?Ls-GD的混
合液

F3:DSPC/DSPG/Chol?0.1藥物脂質比,濃度為0.5mg/mL?Ls-TPT+濃度為1.15mg/mL?Ls-GD的混
合液

F4:濃度為0.5mg/mL的游離拓撲替康

DSPC/DSPG=二硬脂酰磷脂酰膽堿/二硬脂酰磷脂酰甘油

Chol=膽固醇

DL比=藥物脂質比(w/w)

Ls-TPT=脂質體拓撲替康

Ls-GD=脂質體釓雙胺

將大鼠根據體重分配到各組,在某種意義上能夠達到對照組平均體重
和標準變差的目的。然后將各組隨機分配進行處理和時間點。

實施例2.1.4手術步驟

使大鼠吸入異氟烷(先用5%誘導,在手術過程中再用2.5~3%維持)或
腹膜內注射克他命(60mg/kg)與甲苯噻嗪(8mg/kg)的組合物進行麻醉。削去
其顱骨上皮,將其置入一個立體定位框架中,用耳棒和門牙棒將其頭部固
定。手術全程使用無菌技術。先后用70%的酒精和聚烯吡酮磺溶液對皮膚
進行消毒。將顱骨頂部皮膚縱切,使用鈍切將遍布在顱骨上的結締組織移
除。使用具有直徑1-mm的毛刺孔,前部0.5mm距前囟左右各3mm的小
型電牙鉆進行顱骨切除手術。將一個與自動泵(BASi,lnc,West?Lafayette,IN)
連結的熔融二氧化硅套管(外徑168μm,內徑102μm)(PolyMicro?
Technologies,Phoenix,AZ)用于CED,并將其降至適當的背腹坐標位置
(-4.5~-5mm,齒列-3.3mm)。背腹坐標根據軟膜表面來估算。將套管插入
27號針頭中,該針頭與10-μL漢密爾頓注射器相連,并用強力膠固定在管
壁上。將試驗用品從一側雙向注入到每個紋狀體中。在此過程中逐步增加
輸液速度,依次為0.2μL/分鐘(15mm)、0.5μL/分鐘(10mm)和0.8μL/分鐘
(15mm),最終使每個大腦半球的輸入劑量為20μL。輸液完畢后,將套管
保持原位5分鐘,盡可能減少輸液外流,之后再緩慢拔出。

程序完成后,接下來使大鼠處于不通風的環境中,并通過加熱燈或水
袋或其它合適的保溫方法進行保溫并在麻醉恢復期進行監視。根據需要皮
下給藥丁丙諾啡。允許大鼠在將其送回它們的籠子之前在程序室里進行恢
復。

實施例2.1.5組織收集和處理

在指定的時間點,使用異氟烷(2.5%)麻醉動物,接著心內灌注0.9%的
生理鹽水。

在尸體和肌肉/骨骼系統進行研究期間,對發現的死亡或處死(預期和
非預期的)的動物進行完整的總體尸檢,所有的外表面和開口,大腦的顱腔
和外表面,與頸部相關的器官和組織,胸部、腹部和盆腔及其相關的器官
和組織。

將大腦除去,置于冰上,使用背部途徑解剖紋狀體,并且將組織在液
氮中冷凍。隨后將組織用等體積的水(1∶1v/v)均勻化,然后用甲醇提取并
在-70℃下儲存,直到收集運送到受體的尾靜脈血(1.0mL),其用于該實
施例的配方組織和血漿動力學組分。

實施例2.1.6高效液相色譜法

Northern?Lipids公司(Burnaby,BC,Canada)使用等強度反相HPLC/UV
方法在大腦組織和血漿中進行總拓撲替康(游離的和脂質體包封的)的高效
液相色譜(HPLC)。方法的詳細說明如下所述。簡言之,將動物(n=3)分別在
1和6小時,2、4和7天進行處死。將大腦除去,置于冰上,使用背部途
徑解剖紋狀體,并且將組織在液氮中冷凍。隨后加入等體積冰水(1∶1?v/v),
并使解凍的組織機械地均勻化(Biospec)2分鐘并冷凍。將冷凍的勻漿運入
NLI中用于分析。將200μL解凍的樣品轉移到含有800μL冷甲醇的
Eppendorf管中,以12,000rpm離心2~5分鐘。將200μL上清液置于自動
進樣瓶中,用于即時分析(或直到分析前儲存在-70℃,至多3個月),Northern?
Lipids公司(Burnaby,BC,Canada)通過使用通過驗證的反相HPLC方法用于
高效液相色譜(HPLC)分析。對于TPT,標樣利用甲醇∶水∶三氟乙酸(40∶
60∶0.02)的比例新鮮制備內酯形式,20mM硼酸鹽緩沖液∶甲醇(60∶40)
的比例新鮮制備羧化物形式。在Waters2690/5分離模塊和授權軟件的HPLC
系統上使用C18反相硅膠柱[Phenomenex公司Luna?C-18(2)柱,內徑為250
mmx4.6mm,粒徑為5μm,室溫下],在C18保護管外管(Phenomenex公司,
4x3.0mm)下進行分析。在5±3℃下將樣品置于自動進樣托盤中,使用的
樣品注射體積為30~50μL,用移動相以1.0mL/min的流速洗脫柱體,所述
移動相包括移動相A:3%三乙酸乙胺緩沖溶液,pH5.5,(TEAA)和移動相
B:乙腈:3%TEAA(50∶50)。梯度洗脫最初在5分鐘內78∶22?A∶B到50∶50
A∶B,維持在分鐘,在0.5分鐘內返回初始,總運行時間為15分鐘。通
過Waters?2475多λ熒光檢測儀(380nm處激發,520nm處發射)測定拓撲
替康。拓撲替康羧化物形式和內酯形式的典型保留時間分別為5.5和7.5
分鐘。這個方法在0.8~240ng/mL范圍內具有很好的靈敏性和線性。TPT
提取方法的回收系數為0.9。

實施例2.1.7早期死亡/非預期處死

如果動物在研究中死亡,盡可能準確地估計其死亡時間并記錄,且盡
快進行尸檢。如果不能立即進行尸檢,將動物冷藏(不是冷凍)以減少組織
自溶。尸檢應在死亡后12小時內進行。

如果動物出現不良健康狀況或在瀕死之際,將其進行安樂死。如果情
況允許,可收集血液或其他樣本進行適當研究(如臨床病理學參數)來找出
不適/病態的原因。

實施例2.1.8統計方法

用于連續數據(氮,均值和標準差)和分類數據(N,%)的描述性統計數
字,在適當情況下同時以表格和圖表示出。利用WinNonlin5.0(Pharsight?
Corporation,Mountain?View,CA,USA)通過不間斷的藥物動力學數據測定
藥物動力學(PK)參數,所述參數包括組織藥物的半衰期(t1/2)、清除率(CL)、
腦中平均滯留時間(MRT)以及濃度-時間曲線下面積(AUC)。

實施例2.1.9動物護理

每只動物通過編號的耳標和籠卡進行分辨。一旦到達試驗裝置后,在
進行研究過程之前使研究動物適應它們的屋舍最少3天。在整個研究中,
每天至少對在籠子中,由飼養員常規飼養的動物觀察一次。觀察每只動物
一般外觀健康的改變。任何疾病跡象要立即向主治獸醫和研究負責人報告。

在注入藥物和在第2、4、7和10天計劃處死之前稱量體重。

飼養員對每只動物每日的進食量進行評估,從手術進行之前的那天開
始直到處死。進食量通過每日食物剩余量進行目測評估。將斷食或脫水的
跡象報告給主治獸醫和研究人員,并采取適當的行動。

實施例2.2結果

實施例2.2.1偏差

使用兩個批次的動物(批次120806和010507)進行研究。執行6小時、
2天、4天和7天時間點后動物被處死,在一些不同時間點處死的動物中,
在心內灌注時的總體尸檢觀察到心臟擴大癥。為了確定觀察到的心臟擴大
是與試驗用品還是與動物批次/品系有關,在1小時的時間點上,使用不同
批次(批次010507)的動物,并且將來自最初批次(批次120806)的15只動物
用作對照。對照組不進行任何手術或者不接受任何試驗用品。

實施例2.2.2制劑篩選藥物動力學

將用于該研究組分的計劃數量(60)的動物檢測。在基線和處死時間點
之間沒有觀察到顯著的重量減輕(≥10%),其中在處死之前(第2天、第4天
和第7天)進行重量評估。在1小時時間點上的4只動物被替換,兩只死于
麻醉,一只在試驗藥品灌注(制劑3)過程中蘇醒且必須使其安樂死,一只動
物在毛刺鉆孔期間呼吸停止。在進行總體尸檢時,沒有動物顯示了結果。
在6小時時間點沒有動物被替換。一只動物在第2天的時間點上死于麻醉
且必須使其安樂死。一只動物在第4天的時間點上被替換,因為其被作為
對照動物被錯誤地處死(注入制劑3后3天)。在第7天的時間點上有3只動
物被替換,因為他們被注入了沒有正確制備的制劑1并且因此不能包含在
分析中。除了在1小時時間點上接受制劑4注入的一只動物外,注入無重
大事故,在這次注入中,觀察到注入系統在27分到40分鐘期間泄露。如
實施例2.2.1所描述,總共15只動物作為對照,并且其不經受任何實驗。
在表3中可以找到動物的處置概況。

表3動物的處置概況


F1:DSPC/Chol?0.1藥物脂質比,濃度為0.5mg/mL?Ls-TPT+濃度為1.15mg/mL?Ls-GD的混合液

F2:DSPC/DSPG/Chol?0.3藥物脂質比,濃度為0.5mg/mL?Ls-TPT+濃度為1.15mg/mL?Ls-GD的混
合液

F3:DSPC/DSPG/Chol?0.1藥物脂質比,濃度為0.5mg/mL?Ls-TPT+濃度為1.15mg/mL?Ls-GD的混
合液

F4:濃度為0.5mg/mL的游離拓撲替康

DSPC/DSPG=二硬脂酰磷脂酰膽堿/二硬脂酰磷脂酰甘油

Chol=膽固醇

DL比=藥物脂質比(w/w)

Ls-TPT=脂質體拓撲替康

Ls-GD=脂質體釓雙胺

()表示被替換動物的數量

實施例2.2.3腦組織濃度

僅在游離拓撲替康的組中(制劑4),在第1和第6小時測定拓撲替康腦
組織濃度。相反地,在Ls-TPT組中,通過48小時(制劑1)甚至96小時(制
劑2和3)才能發現可測量的腦組織濃度。在第7天時,沒有制劑具有可檢
測的水平。在所有的時間點上,制劑2具有最高的組織濃度,除了第96
小時以外,在該點上,制劑2和3具有非常低和相似的濃度。可檢測的拓
撲替康水平被認為反映了用于脂質體制劑1、2和3中的包封的拓撲替康,
特別是超過6小時,考慮到游離的拓撲替康的短半衰期。表4總結了通過
制劑和時間點的拓撲替康的腦組織濃度。

表4通過制劑和時間點的拓撲替康的腦組織濃度。



F1:DSPC/Chol?0.1藥物脂質比,濃度為0.5mg/mL?Ls-TPT+濃度為1.15mg/mL?Ls-GD的混合液

F2:DSPC/DSPG/Chol?0.3藥物脂質比,濃度為0.5mg/mL?Ls-TPT+濃度為1.15mg/mL?Ls-GD的混
合液

F3:DSPC/DSPG/Chol?0.1藥物脂質比,濃度為0.5mg/mL?Ls-TPT+濃度為1.15mg/mL?Ls-GD的混
合液

F4:濃度為0.5mg/mL的游離拓撲替康

DSPC/DSPG=二硬脂酰磷脂酰膽堿/二硬脂酰磷脂酰甘油

Chol=膽固醇

DL比=藥物脂質比(w/w)

Ls-TPT=脂質體拓撲替康

Ls-GD=脂質體釓雙胺

實施例2.2.4濃度時間的變量

如圖2所示,DSPC/DSPG/Chol0.3藥物脂質比的拓撲替康的納米脂質
體制劑達到了最高的腦組織濃度,而另外的兩種制劑與游離的拓撲替康類
似。在起初96小時內,DSPC/DSPG/Chol0.3藥物脂質比的拓撲替康的納
米脂質體制劑的腦組織濃度測定為1.24-146.4μM。在表5中列出了藥物動
力學(PK)參數,包括組織中用于每種制劑的藥物半衰期、CL、腦中的MRT
和AUC。謹慎地對PK參數進行解釋,因為沒有足夠的濃度點(至少3個濃
度在終端)來充分計算回歸(WinNonlin分析,單獨的附件)。由于數量有限
的數據點(每個數據點需要處死3只動物),除了AUC以外,無法計算有意
義的PK變量。與DSPC/Chol?0.1和DSPC/DSPG/Chol?0.1(分別為38.27和
68.21μg·天/g)以及游離的拓撲替康(5.5μg·天/g)相比,DSPC/DSPG/Chol0.3
藥物脂質比制劑的AUC(0-末端)明顯較大。所有的納米脂質體制劑在一天
的時間范圍內出現半衰期,而游離拓撲替康的半衰期更短。基于這些結果,
選擇Ls-TPT制劑2(DSPC/DSPG/Chol?0.3?D.L比)用于進一步研究。

表5在正常的腦組織中Ls-TPT制劑和游離拓撲替康的藥物動力學。


實施例2.3:討論

在實施例2中的研究評估了在大鼠正常大腦組織中的藥物動力學特征,
組合藥物遞送方法比較了通過腦內CED的3種新型的Ls-TPT制劑和游離
拓撲替康。在評估的3種納米脂質體制劑中,制劑2,具有藥物脂質比0.3
的DSPC/DSPG/Chol和0.5mg/mL濃度的拓撲替康,被測定為具有最佳的
腦內藥物動力學特征,其AUC(0-末端)為153.8μg·天/g,并且半衰期大約為
1天。

Ls-TPT制劑2(具有藥物脂質比0.3的DSPC/DSPG/Chol)的AUC和半
衰期遠遠超過了游離的拓撲替康,這表明脂質體具有更長的藥物釋放動力
學,所述釋放動力學是CED遞送中必要的特征。Ls-TPT制劑2中觀察到
的更好的藥物動力學特征可能同樣與更好的藥物釋放特征與從脂質體中
緩慢釋放活性藥物有關。

為了使Ls-TPT制劑2的藥物動力學特征可見,將本實驗中發現的拓
撲替康濃度與之前體外研究的數據進行比較。在第6、48和96小時(分別
為108.8、31.25和1.24μM)的濃度遠高于50%的抑菌濃度(IC50)(各種惡性
膠質瘤細胞系,暴露超過1、24、72和120小時,濃度分別為2.4、0.038、
0.28、0.02μM)(Marchesini?1996,Pollina?1998,Schmidt?2001)。因此,有堅
實的基礎認為Ls-TPT制劑2在體內超過至少96小時提供了足夠的拓撲替
康細胞組織濃度。

實施例2.4:結論

具有藥物脂質比0.3的DSPC/DSPG/Chol和0.5mg/mL濃度的拓撲替
康的制劑2被測定為具有最佳的腦內藥物動力學特征。

實施例3:通過CED遞送到裸鼠紋狀體的羅丹明脂質體的對流能力

實施例3.1:材料和方法

在該研究中使用了9只大鼠。通過CED注入將羅丹明脂質體
(DSPC/DSPG/Chol,摩爾比70∶20∶10)和0.5摩爾百分比的羅丹明PE雙向
遞送到大鼠紋狀體中。使用組氨酸/生理鹽水緩沖液制備羅丹明脂質體的稀
釋液并加入蔗糖以使最終蔗糖濃度達到根據表7的3mM、15mM和75mM。

表7


對于CED,硅膠管連接到用于CED的自動泵上,并低于恰當的腹坐
標(AP=+0.5mm;ML=3.0mm;DV=-4.5至-5mm具有在-3.3mm的牙齒
棒)。試驗用品被雙側注入到每個紋狀體的一個位點。在該研究中使用的注
入速率達到20μL劑量每半球,0.2μL/min(15min)+0.5μL/min(10min)+
0.8μL/min(15min)。在CED遞送后,立即處死大鼠。移除大腦并且將大
腦分成左半球和右半球。大腦右半球冷凍在-60℃的干冰/異戊烷中并且在
進行組織學分析之前儲存在-80℃,24小時。將每只動物的大腦左半球儲
存在-80℃用于接下來由Northern?Lipids公司進行的分析。

每只大鼠的大腦右半球被切成20微米的切片,并且每10個通過紋狀
體的切片都放到載玻片上。對切片進行拍照并且使用NIH圖像計算在紋狀
體中的分布容積。在紋狀體外側出現的羅丹明熒光不包含在本次分析中。
將組織學切片送到加州大學舊金山分校用于Vd分析。從每只大鼠大腦左
半球獲得的組織將被送到Northern?Lipids以測定提取效率。

實施例3.2:結果

在所有接受CED注入的大鼠中都檢測到羅丹明熒光。在所有的大鼠中,
標記分布在紋狀體中。一些大鼠在腦胼胝體和內囊纖維痕跡中顯示了強烈
的標記(數據未示出)。表8示出了在蔗糖濃度為3mM,15mM和75mM時,
對于每只大鼠的分布容積(Vd)。由于CED管材的技術問題,三只大鼠被雙
側注入40uL的羅丹明脂質體到每個紋狀體中(陰影面積)而不是注入20uL
到每個紋狀體中。這些大鼠不包含在分析中。在75mM組中的一只動物死
于手術中(在第5分鐘)且也不包含在分析中。該動物進行連續注入,然而
脂質體從位點擠出,接著動物死亡,而且脂質體沒有分布在實質中。

表8


無論在40uL還是20uL注入體積的蔗糖濃度(表9),在所有接受CED
的大鼠中都檢測到羅丹明熒光。在所有組中的平均分布體積是
12.6~24.9mm3.

表9


相比于3mM的最終蔗糖濃度(圖3),15mM最終蔗糖濃度示出了大于
其2倍的分布容積。由于組的規模小,在本實驗中并沒有確定蔗糖濃度的
統計學對照組。

數據表明在脂質體制劑中改變蔗糖濃度不影響CED使脂質體分布在
大鼠實質中的能力。在本研究中樣品的數量并沒有充分進行不同蔗糖濃度
對分布容積,隨著羅丹明脂質體的CED遞送到大鼠紋狀體的統計學分析。

使用不同的脂質體組合物的羅丹明裝載的脂質體的以前的數據(圖4)
表明分布容積類似于本研究中所獲得的范圍。

在本研究中,在所有蔗糖濃度下,每個半球接受20μL脂質體的大鼠
中分布容積的范圍是11.7~26.6mm3。在圖4中示出的數據表明制劑1~6的
分布容積在相似的范圍內。盡管在圖4中沒有脂質體制劑與本研究使用的
制劑一致的,但是數據表明,在該過程中的高度的變異性可能與注入過程
中的技術方面有關。此外,脂質體分布到大鼠中的臨近結構和接近于紋狀
體的纖維束,可能解釋在兩個研究中出現的群組差異,因為在紋狀體區域
外的脂質體分布并不包含在Vd計算中。

表10各種制劑的分布容積(見圖4)

??制劑
??1
??2
??3
??4
??5
??6
??7
??左
??右
??左
??右
??左
??右
??左
??#1
??23.5
??19.7
??#2
??na
??21.3
?#8
??na
??11.6
?#7
??na
??#3
??16.4
??31.7
??#4
??23.9
??25.6
?#10
??na
??43.5
?#9
??na
??#5
??26.1
??29.6
??#6
??36.8
??37.9
?#12
??28.2
??31.2
?#11
??16.8
??平均值
??22.0
??27.0
??30.3
??28.3
??28.2
??28.8
??16.8
??Sd
??5.0
??6.5
??9.1
??8.6
??na
??16.1
??na
??Sem
??3.6
??4.6
??6.5
??6.1
??na
??11.5
??na

這些數據在圖4中示出。在頂行的數字分別對應于圖4中的棒1-7。
每個的動物用“#1-12”表示。用不同的制劑獲得分布容積的實際值。

實施例4納米脂質體復合物腦內遞送到幼鼠大腦的藥物評估和納米
脂質體復合物腦內遞送到成年無胸腺鼠的移植腫瘤的效率

實施例4.1材料

實施例4.1.1試驗用品

如實施例1.1和1.2所示制備Ls-TPT和Ls-GD動物實驗規范級材料。

實施例4.1.2動物與分組

使用6-8周、200-275g的成年雄性無胸腺鼠rnu/rnu((Charles?River?
Laboratories,Wilmington,MA,批次5226156/032607)。動物如表11所列分
為4組。

表11:分組與劑量


在研究開始時,根據體重將大鼠分配到制劑組和組織組,從而得到對
照組的平均體重和標準偏差。然后組隨機地分配治療方案。在腫瘤移植后
第8天進行單倍處理并在腫瘤移植后的8和12天進行雙倍處理。

實施例4.1.3:手術步驟和治療

實施例4.1.3.1顱內移植異種腫瘤

使用標準的立體定位程序在右側紋狀體單方面地移植U87MG腫瘤細
胞(人腦膠質瘤細胞;Perry?Scientific?Inc,San?Diego,CA,lot?
W5051507U87MC)。使用立體定位技術和異氟烷(2.5%)麻醉。大鼠被置入
一個立體定位框架中,使用耳棒和門牙棒將其頭部固定。手術全程使用無
菌技術。使用聚烯吡酮磺溶液對皮膚進行消毒。將顱骨頂部皮膚縱切,使
用鈍切將遍布在顱骨上的結締組織移除。鉆打了距離前頂前段0.5mm,兩
側30mm的毛刺孔。使用30規格25μL?Hamilton注射器將U87MG細胞立
體定位地注入紋狀體,使用適當的背腹坐標位置(-4.5~-5mm,齒列-3.3mm)。
在10分鐘內將含有大約5.0X105個細胞總量的總體積10μL注入到動物
的右側紋狀體中。在不同的2天內完成腫瘤移植,因為計劃的動物數量不
允許在單獨一天完成所有的實驗。因此,制備2個單獨的腫瘤懸浮液。

接種后,皮膚被固定。大鼠在麻醉恢復期間被監控。丁丙諾啡在程序
結束前被皮下(SC)給藥,然后根據需要皮下給藥丁丙諾啡。腫瘤細胞移植
后,每日監測大鼠兩次。期望的移植后的存活期為0~60天,其中動物被
麻醉并獲得大腦。

實施例4.1.3.2治療

用異氟烷(2.5%)進行麻醉。使用帶有鈍耳棒的立體定位框架通過之前
進行的鉆孔完成CED。只有血液凝塊被移除。通過CED使用位于右側紋
狀體中的腫瘤移植位點的套管進行給藥。將一個與自動泵(BASi,lnc,West?
Lafayette,IN)連結的熔融二氧化硅套管(外徑168μm,內徑102μm)
(PolyMicro?Technologies,Phoenix,AZ)用于CED,并將其降至適當的背腹坐
標位置(-4.5~-5mm,齒列-3.3mm)。根據軟膜表面來估算背腹坐標。將套管
插入27號針頭中,并用強力膠固定在管壁上。使用逐步增加的輸液速度注
射。本研究中使用的輸液速度為0.2μL/分鐘(15mm),05μL/分鐘(10mm),
08μL/分鐘(15mm),每次治療達到20μL的總輸液量(Vi)。輸液完成后,
將套管原位保持5分鐘以減少輸液流出,然后再緩慢拔出。

程序完成后,接下來使大鼠處于不通風的環境中,并通過加熱燈或水
袋或其它合適的保溫方法進行保溫并在麻醉恢復期進行監視。根據需要皮
下給藥丁丙諾啡。允許大鼠在將其送回它們的籠子之前在程序室里進行恢
復。

實施例4.1.4第60天之前的安樂死標準

如果觀察到下列癥狀(鼻/眼周出血、麻痹、駝背、遲鈍或不進食或修
飾或重量減輕>15%基線體重)的任何一個或其組合則將動物進行安樂死。
除了丁丙諾啡,同樣給出了例如美洛昔康或者酮咯酸的非甾體抗炎藥。如
果在48小時內動物并沒有顯示出改善的跡象,則它們將按照實施例4.1.5
所述進行安樂死。

實施例4.1.5組織收集和處理

在各自的存活期末端或在第60天,使動物吸入異氟烷(2.5%)麻醉,然
后心臟內灌注PBS,接著灌注4%仲甲醛。

在尸體和肌肉/骨骼系統進行研究期間,對發現的死亡或處死(預期和
非預期的)動物進行完整的總體尸檢,所有的外表面和開口,大腦的顱腔和
外表面,與頸部相關的器官和組織,胸部、腹部和盆腔及其相關的器官和
組織。

主要的器官收集并儲存在10%的福爾馬林中。移除大腦并置于4%仲
甲醛中過夜然后在30%的蔗糖中使相平衡。然后將大腦冷凍并保存在-70℃。

實施例4.1.6生命周期觀察和測量

在整個馴化和研究期間,每天至少進行一次臨床觀察和測量。臨床觀
察結果如表12所示。

表12?臨床觀察與測量


實施例4.1.7早期死亡/非預期處死

如果動物在研究中死亡,盡可能準確地估計其死亡時間并記錄,且盡
快進行尸檢。如果不能立即進行尸檢,將動物冷藏(不是冷凍)以減少組織
自溶。尸檢應在死亡后12小時內進行。

如果動物出現不良健康狀況或在瀕死之際,將其進行安樂死。如果情
況允許,可收集血液或其他樣本進行適當研究(如臨床病理學參數)來找出
不適/病態的原因。

實施例4.1.8統計方法

用于存活率分析的目的,動物通過治療臂進行分組。此外,在最高拓
撲替康總劑量組(組2)中的動物比較于所有其它治療臂的組,包括對照組。
如下所述,后者的分組過程同樣在近似U87MG細胞裝載的組內進行。由
于實驗動物在不同的兩天內被分別注入兩種腫瘤細胞懸浮液,但并未在植
入手術前進行細胞計數,因此植入的U87MG細胞量可能存在潛在變化。
考慮到這一點,應對治療組進行腫瘤細胞懸浮液分析,從而根據植入手術
后的細胞量,間接估算出手術時U87MG細胞裝載量的近似值(參見實施例
4.2.1)。在不同的組中使用數階測試比較存活率。

實施例4.1.9動物護理

每只動物都通過耳標編號確定。每個,每只動物的籠子都通過一個卡
片確定,卡片上列有動物識別號碼、研究號碼、組、來源、到達日期、品
種/品系、動物的出生日期和性別。

這些動物被單獨安置在隔離籠中以使它們不干擾彼此的傷口。在研究
報告中記錄動物所在房間。在相同的房間內沒有其它的物種。房間用100%
的新鮮空氣(沒有再循環的空氣)良好通風(每小時大于10次空氣交換)。保
持12小時光照/12小時黑暗的光照周期,除了必須打開房燈在暗周期采集
血液樣本或進行其它程序。房間的溫度維持在18~26℃。

除了禁食階段,動物可隨意地獲得Prolab?RMH?2500。已知在飲食水
平上沒有污染能夠干擾本研究的結果。通過水瓶,每只動物可以隨意的獲
得氯化的市政自來水。每年的水質量檢測報告保存在PSI檔案中。在開始
研究過程之前使所有研究動物適應它們指定的房間至少3天。

實施例4.2結果

實施例4.2.1協議偏差

植入后細胞計數顯示,植入的U87MG腫瘤細胞的實際數量明顯高于
協議規定的。此外,制備的兩種懸浮液中的腫瘤細胞密度差異明顯。具體
地,兩種懸浮液中的植入后細胞計數為每10μL中6.8X105和9.7X105
個細胞,相較于協議規定的5.0X105個。所觀察到的差異大概是由于懸浮
液制備和細胞計數間的細胞增長。可以想象,各自的植入后計數可能因此
被降低且差異變小,但似乎不太可能更接近協議規定的數字。為了解釋結
果分析中的差異,通過近似的植入腫瘤的U87MG細胞負荷分析治療組,
基于如實施例4.1.8所述的植入后細胞計數。

當被發現死于籠中時,4個腫瘤植入動物之有部分尸檢或無全部尸檢。
其中3只動物只進行大腦檢查,而一只動物不進行任何器官檢查。

實施例4.2.2臨床觀察和測量

4只動物,2個分配到組1,一只分配到組3,另一只分配到組4,在
腫瘤植入前死亡可能與程序中進行的麻醉有關。在腫瘤植入組中(29只動
物),發現4只動物在研究期間死于籠中。一只動物分配到組1,一只分配
到組2,兩只分配到組4。分配到組4的兩只動物具有高植入的腫瘤細胞負
荷,而其他動物具有低腫瘤細胞負荷。另外使25只動物安樂死因為其出現
不良健康狀況,最常見的癥狀是絕大多數動物體重下降>15%、嗜睡、駝背
姿勢、運動障礙、顫抖和呼吸困難。

實施例4.2.3療效

每組有8只動物被治療,除了對照組只有5只動物被治療,因為4只
動物死于麻醉,其余的動物被重新分配到各治療組以使每個活性治療組有
8只動物。表13列出了每只動物的個體存活期和每個治療組的平均存活率。

表13??個體、治療組和總存活期



圖5示出了治療組的存活期,顯示了第2組(0.5mg/mL雙劑量劑量)治
療的動物存活期較長,雖然統計學上的Log-rank檢驗(0.5mg/mL雙劑量劑
量與對照組,p=0.0724;0.5mg/mL雙劑量與0.1mg/mL雙劑量,p=0.0593;
0.5mg/mL雙劑量與0.5mg/mL單劑量,p=0.0742)不明顯。第2組的平均
存活期是21天。

圖6示出了與組2(0.5mg/mL雙劑量)相比較,組合治療組(1,3,4)的存
活期。觀察到與組合組相比,組2治療的動物在最高的Ls-TPT拓撲替康
總劑量的存活期更長,其統計學上的Log-rank檢驗(p=0.0112)明顯。觀察
到組2與組合組1、3和4的存活期分別為21天和17天。

表14示出了低U87MG細胞負荷(6.8?X?105個細胞)和高U87MG細胞
負荷(9.7X105個細胞)的存活期(所有治療組的組合),如每只動物的個體存
活期和植入細胞負荷組的平均存活期,及圖7中的總存活期。受到腫瘤植
入高細胞負荷的動物存活期較短,為16天,而受到低細胞負荷的動物存活
期為19天,盡管存活曲線趨向存活期末端(可能由于數字較小)。

表14?腫瘤植入U87MG細胞負荷的存活期



圖8示出了在低U87MG細胞負荷(6.8X105個細胞)的動物中組合組(1,
3,4)與組2(0.5mg/mL雙劑量)相比較的存活期。觀察到與組合組相比,組2
治療的動物在最高的Ls-TPT拓撲替康總劑量的存活期更長,雖然統計學
上的Log-rank檢驗(p=0.0646)不明顯。

圖9示出在高U87MG細胞負荷(9.7X105個細胞)的動物中組合組(1,3,
4)與組2(0.5mg/mL雙劑量)相比較的存活期。同樣,觀察到與組合組相比,
組2治療的動物在最高的Ls-TPT拓撲替康總劑量的存活期更長,雖然統
計學上的Log-rank檢驗(p=0.1176)不明顯。

實施例4.3討論

實施例4中公開的研究評估了使用新型Ls-TPT制劑的組合藥物遞送
方法的療效,Ls-TPT制劑通過腦內CED遞送到無胸腺大鼠的顱內膠質瘤
移植瘤模型。該實施例使用2個劑量水平,一個之前通過另一組被報道為
是安全的,0.5mg/mL(Saito?2006),另一個較低的為0.1mg/mL。此外,對
兩種給藥方式進行評估,由于目前只對單向給藥研究過,因此采取先單向
給藥0.5mg/mL,再雙向給藥,4天后,分別對兩種給藥劑量水平比較研究。

觀察到,與其他組相比較,在最高的Ls-TPT拓撲替康總劑量的總存
活期和平均存活期更長,單獨地(統計學上不明顯)或組合地(統計學上明顯)。
當比較總劑量占劑量水平和劑量數的比例時還觀察到劑量依賴效應。

實施例4.4結論

在使用U87MG的大鼠腦膠質瘤模型中的探素性療效研究的結果說明,
通過CED給藥的Ls-TPT在評估的最高劑量水平(0.5mg/mL雙劑量)產生存
活優勢。

實施例5拓撲替康和脂質體拓撲替康對U87MG細胞的毒性

實施例5.1材料和方法

實施例5.1.1試驗用品

從葛蘭素史克(Research?Triangle?Park,NC)和海正藥業(Taizhou?City,
Zhejiang,China)獲得游離的拓撲替康制劑。

從海正藥業(Taizhou?City,Zhejiang,China)獲得用于制備GLP級Ls-TPT
制劑的拓撲替康。簡言之,脂質體由摩爾比例為7∶2∶1的二硬脂酰磷脂酰
膽堿(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)和膽固醇組成,靶標大小為
75~90nm。拓撲替康被遠距離裝載(主動包封)于脂質體中,以通過內部和外
部緩沖溶液響應跨膜pH梯度,緩沖溶液由pH5.5的250mM硫酸銨和pH6.0
的10mM組氨酸/145mM氯化鈉組成。假設藥物包封率為90~95%,靶定
了濃度為2.0mg/mL的拓撲替康和0.3(w/w)的藥物脂質比例。

用于Ls-GD制備的釓雙胺從Estech?Pharma,Ansan-Si,Gyeonggi-Do,
Korea獲得。GLP級Ls-GD與topoCED制備方法相似,除了GD是被動包
封于納米脂質體通過滲濾移除非包封GD和溶劑后,GD的最終包封率大
于90%。目標GD含量為5.0mg/mL±10%且粒徑為75~120nm。

Ls-TPT和的Ls-GD的試驗用品分別被冷凍保存(-20~-30℃)和冷藏保
存(2~8℃),且避光保存。在給藥當天現制備給藥溶液,并在室溫下保存。
用5mM組氨酸、pH6.0?145mM?NaCl、300mM蔗糖或0.9%的生理鹽水
將試驗用品的貯備液進行適當稀釋以使試驗溶液在所需的試驗體積下獲
得適當濃度。

實施例5.1.2細胞系與培養

所有實驗都使用U87MG人腦膠質瘤細胞系(UCSF?culture?facility,San?
Francisco,CA)。細胞被置于T175?Falcon培養瓶(BD?Bioscience,San?Jose,
CA)。細胞被保存在完全基本成分培養基(CMEM),由伊格爾氏基本成分培
養基,并增補添加10%胎牛血清、非必需氨基酸和抗生素(100μg/mL鏈霉
素,100U/mL青霉素)組成。所有培養基組分都來自于UCSF細胞培養設施。
在37℃溫室及5%CO2進行培養。一旦完成95%的融合,細胞簡單地受
0.05%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四甲叉膦酸-乙酸(UCSF?culture?facility,San?
Francisco,CA)的胰蛋白酶作用,并將細胞500Xg離心10分鐘。吸出上清
液后,將細胞在5ml完全細胞生長培養基(具有抗生素和10%胎牛血清)中
重懸浮。在血細胞(Hausser?Scientific,Horsham,PA)中使用錐蟲藍進行細胞
計數。加入合適數量的完全細胞生長培養基以使細胞的最終濃度達到
100μL中含有10,000細胞,用于96-孔板的每孔中轉移,96-孔板被設計用
于熒光細胞活性檢測(CellTiter-GloTM,Promega,Madison,Wl)。在未暴露于
試驗用品前,允許細胞連接24小時。使用12管多通道移液器向96孔板加
入100μL試驗用品前,移除培養基。在暴露于試驗用品后,在24、48和
72小時進行細胞毒性試驗。每個試驗用品和對照組的所有時間點都試驗重
復3次。

實施例5.1.3實驗設計

表15列出了根據對照組評估的不同試驗用品和濃度。

表15?試驗用品和實驗設計


所有試驗用品的計算和稀釋都通過二次檢測被證實。試驗用品稀釋液
與用于U87MG培養的培養基一起執行本試驗。

實施例5.1.4存活力分析

該分析基于存在的ATP的量化,使用熒光素酶的耐熱形式作為細胞代
謝活躍細胞的指示物。熒光素酶使用熒光素、氧和ATP作為反應底物,產
生氧化熒光素,并以光的形式釋放能量。產生的光量與存在的ATP量成比
例,反應了存活細胞數。在預定的時間點前,在每孔加入20μL的
CellTiter-Glo發光的細胞活力檢測試劑(Promega,Madison,Wl)以用于該時
間點。在溫和攪拌平板后,將其放回培養箱中一小時。然后使用FLx800
多重檢測微酶標儀(Biotek,Winooski,VT)讀出平板的熒光數。基于標準曲線,
將從每孔中獲得的相對熒光單位(RLU)將換成活細胞數。細胞存活分數和
IC50值來自于圖形推斷(Gen?5?Data?Analysis?Software,Biotek,Winooski,VT)。

實施例5.1.5統計方法

所有的細胞毒性試驗都進行三次,并在所有的濃度和時間點劑量平均
值。不使用其他統計量。

實施例5.2結果

細胞毒性和不同來源的效力及游離拓撲替康制劑(GlaxoSmithKline?
and?Hisun?Pharmaceutical)和脂質體拓撲替康在可比較的濃度(0.01,0.1,1.0
和10μM)和時間點(24、48和72小時)表現相似,證實Ls-TPT制劑的潛在
藥效。即使200μM高濃度的Ls-GD單獨注入或與Ls-TPT共同注入未導致
細胞毒性,因此其可能為Ls-TPT成像示蹤劑的良好替代物(數據未示出)。
本研究中游離拓撲替康和脂質體拓撲替康間的差異普遍缺乏的原因可能
是體外環境特征使拓撲替康從脂質體中快速釋放,且體內脂質體制劑的藥
物動力學優勢更明顯。

實施例6:通過腦內對流增強遞送將脂質體拓撲替康和脂質體釓雙胺
的不同制劑給藥到成年無胸腺鼠的正常腦腫瘤和U87MG移植瘤中的對流
特征和組織分布

實施例6.1

實施例6.1.1試驗用品

如實施例2.1.1和2.1.2所述制備GLP級材料Ls-TPT和Ls-Gd。用于
制備Ls-GD的釓雙胺取自Estech?Pharma,Ansan-Si,Gyeonggi-Do,Korea。
Ls-GD與topoCED制備方法相似,除了GD被動地包封于納米脂質體。通
過滲濾移除非包封GD和溶劑后,GD的最終包封率大于90%。目標GD
含量為5.0mg/mL±10%且粒徑為75~120nm。

使用不同熒光標記Ls-TPT和Ls-GD以區別顯微熒光/發光:用碼頭藍
色-DHPE(1,2-去十六酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺)(Invitrogen,Carlsbad,
CA)標記Ls-TPT,羅丹明-PE(磷酸乙醇胺)(Invitrogen,Carlsbad,CA)標記
Ls-GD。碼頭藍色-DHPE和羅丹明-PE標記的脂質體與Ls-TPT和Ls-GD的
制備方法相似,在溶劑溶液基于DSPC∶DSPG∶膽固醇∶熒光基團的摩爾
比例為69.7∶20∶10∶0.3時向脂質粉末中加入各自的熒光基團。

Ls-TPT和的Ls-GD的試驗用品分別被冷凍保存(-20~-30℃)和冷藏保
存(2~8℃),且避光保存。在給藥當天現制備給藥溶液,并在室溫下保存。
用0.9%的生理鹽水將試驗用品的貯備液進行適當稀釋以達到所需的濃度。
每天給藥時使用新鮮瓶子儲存試驗用品溶液。這項研究沒有使用對照藥品。

實施例6.1.2動物與分組

使用6-8周、200~275g的成年雄性無胸腺鼠rnu/rnu(Taconic,
Germantown,NY)(批071007和073107)。動物如表16所列分為4組。

表16分組與劑量



在研究開始時,根據體重將大鼠分配到制劑組和組織組,從而得到對
照組的平均體重和標準偏差。制劑組中的動物如果其被分配在幼腦組織組
則在第1天接受CED注入,如果其被分配在腫瘤組織組則在第10天接受
CED注入。

實施例6.1.3手術步驟和治療

實施例6.1.3.1顱內移植異種腫瘤

分配到腫瘤組織組的鼠執行這個步驟。人腦膠質瘤細胞(U87MG)在預
定接種前兩周取自冷凍的細胞儲備庫(Perry?Scientific?Inc,San?Diego,CA)。
在腫瘤接種手術當天收集細胞并將其密度調整到50,000-100,000細胞/μL。
在接種當天(第0天),使用5~10μL懸浮液將總數為500,000的U87MG腫
瘤細胞單邊地移植到每只大鼠的右側紋狀體。使用立體定位技術和異氟烷
(2.5%)麻醉。大鼠被置入一個立體定位框架中,使用耳棒和門牙棒將其頭
部固定。手術全程使用無菌技術。先后用70%的酒精和聚烯吡酮磺溶液對
皮膚進行消毒。將顱骨頂部皮膚縱切,使用鈍切將遍布在顱骨上的結締組
織移除。鉆打了距離前頂前段0.5mm,兩側3.0mm的毛刺孔。使用30規
格25μL?Hamilton注射器將U87MG細胞立體定位地注入紋狀體,使用適
當的背腹坐標位置(-4.5~-5mm,齒列-3.3mm)。根據U87MG懸浮液的最終
細胞濃度,將注射體積調整到5-10μL,以確保總數為500,000±25,000的
細胞能在10min內被遞送。

接種后,皮膚被固定。大鼠在麻醉恢復期間被監控。丁丙諾啡在程序
結束前被皮下(SC)給藥,然后根據需要皮下給藥丁丙諾啡。

實施例6.1.3.2治療

在研究第1天通過CED注入將試驗用品給藥于分配到幼腦組織組的大
鼠,在第10天給藥于分配到腫瘤組織組的大鼠。藥劑通過CED雙向地給
藥于幼腦組織組大鼠的背側紋狀體,且使用相同的用于腫瘤移植的坐標位
置瘤內給藥于腫瘤組織組的大鼠。大鼠被全身性地給藥以使所有組的給藥
時間相似。通過腹膜內注射異氟烷(2.5%)或克他命(90mg/kg)與甲苯噻嗪
(12mg/kg)的組合物完成麻醉。使用帶有鈍耳棒的立體定位框架完成CED。
在分配到幼腦組織組的大鼠中,根據5.3.1部分所述制作雙邊毛刺孔。在分
配到腫瘤組織組的大鼠中,頭皮切口重新打開以使之前制備的毛刺孔可見。
只有血液凝塊被移除。將一個與自動泵(BASi,lnc,West?Lafayette,IN)連結
的熔融二氧化硅套管(OD?168μm,ID?102μm)(PolyMicro?Technologies,
Phoenix,AZ)用于CED,并將其降至適當的背腹坐標位置(-4.5~-5mm,齒列
-3.3mm)。根據軟膜表面來估算背腹坐標。將套管插入27號針頭中,并用
強力膠固定在管壁上。使用逐步增加的輸液速度注射。本研究中使用的輸
液速度為0.2μL/分鐘(15mm),05μL/分鐘(10mm),08μL/分鐘(15mm),
每次治療達到20μL的總輸液量(Vi)。輸液完成后,將套管原位保持5分鐘
以減少輸液流出,然后再緩慢拔出。程序完成后,使大鼠處于不通風的環
境中,并通過加熱燈或水袋或其它合適的保溫方法進行保溫,并在麻醉恢
復期進行監視。根據需要皮下給藥丁丙諾啡。

實施例6.1.3.3安樂死

所有組的大鼠在第一天(幼腦組織組)或第10天(腫瘤組織組)試驗用品
CED注射后1小時,全部被安樂死并移除大腦用于組織學分析。至于安樂
死,動物被異氟烷(2.5%)深度麻醉,然后心臟內灌注0.9%生理鹽水,接著
灌注4%仲甲醛(300mL)。

實施例6.1.3.4組織收集和處理

在尸體和肌肉/骨骼系統進行研究期間,對發現的死亡或處死(預期和
非預期的)動物進行完整的總體尸檢,所有的外表面和開口,大腦的顱腔和
外表面,與頸部相關的器官和組織,胸部、腹部和盆腔及其相關的器官和
組織。

移除大腦,將其在4%仲甲醛中培養24小時,然后使其在30%蔗糖中
平衡。在蔗糖平衡后,組織在-60℃?下干冰和異戊烷混合物中冷凍,并保
存于-70℃用于后續處理。如存在心、肺、肝、腎、脾(或部分),也將其收
集并保存。這些組織被固定于10%福爾馬林中性緩沖液中。如果需要,福
爾馬林固定的組織將用石蠟密封處理用于后續組織病理分析。

實施例6.1.3.5組織病理學分析和分布容積估算

大腦在20微米下被冷凍切片,且每4個切片收集在玻璃載片上,并覆
蓋Fluoromount-G。Ls-TPT和Ls-GD的對流特征和組織分布都通過熒光顯
微鏡測定,通過Macintosh圖像分析系統獲得SPOT照相、SPOT軟件和
Macintosh?G4電腦獲得的圖像,及碼頭藍色-DHPE和羅丹明-PE熒光基團
的分布容積(Vd)[ImageJ,National?Institute?of?Health(NIH),Bethesda,MD]。
使用NIH圖像軟件繪制目標區域(ROI)并將分布數據轉移到一個Excel電
子表格。通過將ROI平均面積(mm2)和分布距離(mm)相乘計算分布容積
(mm3)。余下的切片保存在4℃,可能用于其它免疫組織化學分析。

實施例6.1.3.6生命觀察和測量

在整個馴化和研究期間,每天至少進行一次臨床觀察和測量。至少在
給藥前3天開始籠邊觀察記錄并持續到終止。通常觀察每只動物的外觀和
行為變化。

實施例6.1.3.7早期死亡/非預期處死

受到腦內注射U87MG腫瘤細胞的大鼠的壽命通常為17-25天,且直
到死亡前都保持無癥狀。雖然在本研究的第10天不可能進行早期處死,但
如果觀察到下列癥狀(鼻/眼周出血、麻痹、駝背、遲鈍或不進食或修飾或
重量減輕>15%基線體重)的任何一個和其組合能將動物進行安樂死。如果
可能,收集血液或其他標本并進行適當分析(如用于臨床病理參數)以幫助
顯示不適/病態的原因。

如果動物在研究中死亡,盡可能準確地估計其死亡時間并記錄,且盡
快進行尸檢。如果不能立即進行尸檢,將動物冷藏(不是冷凍)以減少組織
自溶。尸檢應在死亡后12小時內進行。

實施例6.1.3.8統計方法

使用描述性統計(均值和標準偏差)匯總數據并用圖表體現。

實施例6.1.4動物護理

每只動物都通過耳標編號確定。每個,每只動物的籠子都通過一個籠
子卡片確定,卡片上列有動物識別號碼、研究號碼、組、來源、到達日期、
品種/品系、動物的出生日期和性別。

這些動物被單獨安置在隔離籠中。床具材料是修剪的硬木片(Sanichips,
Harlan,CA)且每周更換。室溫保持在18~26℃(64-79°F),且相對濕度為
30-70%。連續監控溫度和濕度并每天記錄最低值和最高值。保持12小時
光照/12小時黑暗的光照周期,除了必須打開房燈(在暗周期)以調節研究程
序。

在研究期間,大鼠可隨意地獲得照射的Teklad?Global?18%蛋白質嚙齒
動物飲食(Harlan,San?Diego,CA,USA)和市政自來水。目前在飲食和水中
還未發現對研究結果有不利影響的污染物。每年的水質量檢測報告保存在
PSI檔案中。

到達指定住處后,所有收到初步健康檢查合格的大鼠被允許在居住環
境(原始圍墻和房間)中至少馴化3天,在開始任何動物相關的研究程序之
前。在馴化期間,每天監控大鼠的一般健康。只有視覺評價處于良好臨床
條件(如體重)大鼠才能參與本研究。任何顯示異常或不健康跡象(如起皺的
表皮、顯著低體重)的大鼠都被排除在本研究外。

實施例6.2結果

實施例6.2.1協議偏差

雖然分配到腫瘤組織組的動物具有單邊腫瘤移植,但雙邊(左半球的幼
腦組織和右半球的腫瘤組織)進行試驗用品的CED。對于所有動物,大腦
標本切片厚度更改為20-30μm,每5個切片收集代替了每4個切片收集以
增強熒光信號。

實施例6.2.2臨床觀察和測量

沒有動物在本研究中被取代。未發現動物死亡且所有動物都被預期處
死。幼腦組織組和腫瘤組織組的所有動物的顱處死檢查均正常。

實施例6.2.3對流特征和組織分布

在每組中對治療時間和計劃治療動物數目一致的14只動物進行治療。

對于組1和組2(幼腦組織)的各自的分布容積(Vd)及均值和標準偏差,以及
Ls-TPT-碼頭藍色DHPE和Ls-Gd-羅丹明-PE的Vd的相關系數在表17中
示出并在圖10中以圖表顯示,組3和組4(腫瘤組織)的在表18中示出并在
圖11中以圖表顯示。使用統計分析系統(SAS)中的CORR程序計算Pearson
相關系數。

表17幼腦組織中Ls-TPT-碼頭藍色DHPE和Ls-Gd-羅丹明-PE的分布容積


#對于動物7643的右腦半球,Ls-TPT和Ls-Gd都未看到熒光信號或熒光信號很弱,可能由于注入
障礙或操作錯誤。

組1:幼腦組織-DSPC/DSPG/Chol?D∶L?0.1?0.38mg/mL的Ls-TPT+1.15mg/mL的Ls-GD

組2:幼腦組織-DSPC/DSPG/Chol?D∶L?0.3?1.02mg/mL的Ls-TPT+1.15mg/mL的Ls-GD

表18腫瘤組織中Ls-TPT-碼頭藍色DHPE和Ls-Gd-羅丹明-PE的分布容積



在幼腦組織組中對于兩種制劑的Ls-TPT-碼頭藍色DHPE的Vd值窄幅
波動(對于D∶L?0.1∶1和0.3∶1的各自的均值為39.0±3.0和38.5±5.6mm3),
相應的Vd∶Vi比例為1.9-2.0。相反地,在腫瘤組織組中Vd值明顯變小且
變化更大,在幼腦組織中兩種Ls-TPT制劑的均值為25.8±10.6和21.4±11.9
mm3,在腫瘤組織中均值為26.8±2.5和31.2±8.0mm3。相應的Vd∶Vi比例
在幼腦組織中為1.1~1.3,在腫瘤組織中為1.3~1.6。雖然在腫瘤組織組中,
兩種Ls-TPT制劑差別較小,但這些不一致(在幼腦組織中D∶L?0.1∶1的Vd
值表面上高于D∶L?0.3∶1,但在腫瘤組織中較低)且統計學上不明顯。

Ls-Gd-羅丹明-PE的結果與Ls-TPT-碼頭藍色DHPE的結果顯著一致。
具體地,在幼腦組織組中Vd值均值為39.0±4.2和39.3±5.3mm3,相應
的Vd∶Vi比例為1.9-2.0。在腫瘤組織組中,Vd值均值為在幼腦組織中24.0
±11.2和22.3±9.2mm3和在腫瘤組織中241±45和322±81mm3。相
應的Vd∶Vi比例在幼腦組織為1.1-1.2,在腫瘤組織為1.2-1.6。

與各自的分布結果相一致,在所有治療組中Ls-TPT-碼頭藍色DHPE
和Ls-Gd-羅丹明-PE的Vd值均值具有良好相關性(范圍為0.95-0.99),且組
織類型(幼腦組織和腫瘤組織)間的相關性無明顯差異。

在都接受DSPC/DSPG/Chol?D∶L?0.1制劑的三只動物中,在一個腦半球
中Ls-TPT-碼頭藍色DHPE和Ls-Gd-羅丹明-PE都觀察到較弱的熒光信號
或無信號。一只動物為幼腦組織組(大鼠#7643),另外兩只動物植入U87移
植瘤(腫瘤組織組),且一個實例發生在移植瘤側(大鼠#7607),然而另一個
實例發生在非移植側(大鼠#7633)。所有的實例都可能有注射障礙或操作錯
誤。

實施例6.3討論

實施例6估算了治療性納米脂質體復合物的兩種制劑的對流特征和分
布容積。

該實施例6評估了兩種治療納米級脂質體復合物制劑、Ls-TPT和用于
Ls-TPT,Ls-Gd的成像顯示劑的對流特征和分布容積,該實施例使用不同的
熒光基團去共同標記這些脂質體以顯示出任何不同的組織分布。

包埋于非聚乙二醇化DSPC/DSPG/Chol脂質體(摩爾比例為7∶2∶1)
的拓撲替康和釓雙胺在大鼠幼腦組織中可靠地并一致地對流。觀察到的
Vd∶Vi比例為1.9-2.0,與基于先前公布的聚乙二醇化脂質體制劑的數據的
預期相一致(Saito?2004)。重要地,Ls-TPT和Ls-Gd的分布密切相關,而
且受Ls-TPT脂質體中藥物脂質的比例的影響不明顯。這似乎表明,脂質
體載體獨立于其裝載藥物,決定復合物的分布特征。

Ls-TPT和Ls-Gd在腫瘤組織中與在幼腦組織中的分布密切相關,但是
在腫瘤組織中的實際分布容積和相應的Vd∶Vi比例明顯較小。這可能通過
CED動力學的改變部分地解釋,CED動力學的改變是由于瘤內壓力和腫瘤
組織的顯微解剖。然而,與無腫瘤動物相比,負荷腫瘤大鼠的非移植腦半
球的幼腦組織中的Ls-TPT和Ls-GD的分布也被損害。因此,有人提出,
由于腫瘤過度生長引起的顱內壓增加和組織壓縮可能是腫瘤移植動物的
腫瘤組織和幼腦組織中降低藥物分布的最重要因子。在前面的實驗中,由
于伴隨同側半球擴大到腫瘤移植和腫瘤凸出通過套管軌道伴隨質量效應
的大量腫瘤生長這一點得到證明(參見實施例4)。

通常地,在腫瘤組織組中的藥物分布比在幼腦組織組中更具變化性。
同樣,這可通過變化的流體動力學和增加的顱內壓解釋。在腫瘤移植動物
中兩種Ls-TPT制劑間的微小分布差異是不一致的(在幼腦組織中D∶L?0.1∶1
的Vd值表面上高于D∶L?0.3∶1,但在腫瘤組織中較低)且通過兩個腫瘤組織
組間Ls-GD觀察到的相似差異反映。值是的差異與脂質體制劑不可能相關。

3只動物的幼腦組織或腫瘤組織中無熒光或極少熒光可能由于泵故障
或通過導管的次優位置進入蛛網膜下隙的輸液滲漏。

實施例6.4結論

本發明證明了在大鼠幼腦組織和腫瘤組織中Ls-TPT和Ls-GD的CED
能引起可靠的和一致的藥物分布。CED流體動力學被顱內壓影響,由于腫
瘤過度生長引起的高顱內壓導致藥物分布受損。Ls-TPT試驗的兩種制劑
(D∶L?0.1∶1和D∶L?0.3∶1)間無相關差異,且兩種制劑通過共同給藥的Ls-GD
良好地共對流,確定Ls-GD作為CED后Ls-TPT藥物分布的脂質體示蹤劑
的適合性。

實施例7通過腦內增強對流遞送對成年無胸腺鼠給藥的脂質體拓撲
替康和脂質體釓雙胺的試驗性毒理學評價

實施例7.1材料和方法

實施例7.1.1試驗用品

如實施例6.1.1所述制備GLP級Ls-TPT和Ls-GD材料。

實施例7.1.2動物和分組

使用體重200~270g的成年無胸腺鼠(rnu/rnu)(Taconic,Germantown,
NY)(batch?061207)。基于表19所列的納米脂質體拓撲替康濃度將動物分
為兩組。

表19?組的分配和劑量


根據體重將大鼠分配到各組,從而得到對照組的平均體重和標準偏差。

實施例7.1.3手術步驟

在本研究的第1天和第4天使用CED將試驗用品立體定位地給藥于大
鼠的每個腦半球的紋狀體。在重復給藥方案中兩個治療使用相同的坐標位
置。大鼠被全身性地給藥以使兩組的給藥時間相似。通過腹膜內注射異氟
烷(2.5%)或克他命(90mg/kg)與甲苯噻嗪(12mg/kg)的組合物完成麻醉。削去
顱骨上皮,將動物置入一個立體定位框架中,用耳棒和門牙棒將其頭部固
定。手術全程使用無菌技術。先后用70%的酒精和聚烯吡酮磺溶液對皮膚
進行消毒。將顱骨頂部皮膚縱切,使用鈍切將遍布在顱骨上的結締組織移
除。使用具有1mm直徑的毛刺孔,前部0.5mm距前囟左右各3.0mm的小
型電牙鉆進行顱骨切除手術。將一個與自動泵(BASi,lnc,West?Lafayette,IN)
連結的熔融二氧化硅套管(OD?168μm,ID?102μm)(PolyMicro?Technologies,
Phoenix,AZ)用于CED,并將其降至適當的背腹坐標位置(-4.5~-5mm,齒列
-3.3mm)。根據軟膜表面來估算背腹坐標。將套管插入27號針頭中,并用
強力膠固定在管壁上。使用逐步增加的輸液速度注射。本研究中使用的輸
液速度為0.2μL/分鐘(15mm),05μL/分鐘(10?mm),08μL/分鐘(15mm),
每次治療達到20μL的總輸液量(Vi)。輸液完成后,將套管原位保持5分鐘
以減少輸液流出,然后再緩慢拔出。

程序完成后,使大鼠處于不通風的環境中,并通過加熱燈或水袋或其
它合適的保溫方法進行保溫,并在麻醉恢復期進行監視。根據需要皮下給
藥丁丙諾啡。允許大鼠在將其送回它們的籠子之前在程序室里進行恢復。

實施例7.1.4組織收集和處理

在第11天采取安樂死。動物通過異氟烷(25%)或吸入CO2麻醉。動物
將被采集跨心臟血液樣品用于拓撲替康血漿水平的測定和其他合適的試
驗。接著,動物被跨心臟灌注100ml肝素化生理鹽水,然后灌注300ml?4%
仲甲醛,并立即進行尸檢。

在尸體和肌肉/骨骼系統進行試驗期間,對發現的死亡或處死(預期和
非預期的)動物進行完整的總體尸檢,所有的外表面和開口,大腦的顱腔和
外表面,與頸部相關的器官和組織,胸部、腹部和盆腔及其相關的器官和
組織。

移除大腦,將其在30%蔗糖中平衡。在蔗糖平衡后,組織在-60℃下
干冰和異戊烷混合物中冷凍。大腦被保存于-70℃用于后續處理。如存在
任何死亡或被處死的動物的心、肺、肝、腎、脾(或部分),也將其收集并
保存。這些組織被固定于10%福爾馬林中性緩沖液中。

如果需要,福爾馬林固定的組織將用石蠟密封處理用于后續組織病理
分析。本研究中兩組的所有大腦被切成30μm厚,并在磷酸鹽緩沖液(PBS)
和0.2%疊氮化鈉溶液中收集懸浮切片。每4個切片收集在玻璃載片上,固
定在4%仲甲醛中,并進行蘇木精/伊紅染色。余下的切片保存在4℃,可
能用于其它免疫組織化學分析。

將用于拓撲替康和釓雙胺血漿提前與測量的血液樣本進行離心以分
離血漿。每只動物獲取400μl血漿。將具有1.6ml冷甲醇的2.0ml的Eppendorf
管于冰上保存,并向管中加入血漿,然后渦旋。樣品一直在冰上保存,直
到所有動物都被處理完成。管被石蠟膜密封以防止頂部意外打開,并冷凍
保存。用干冰將樣品運到Northern?Lipids公司(Burbany,BC,Canada)。通過
高效液相色譜(HPLC)和熒光檢測測定拓撲替康血漿水平,通過電感耦合等
離子體質譜法(ICP-MS)測定釓雙胺血漿水平。

實施例7.1.5早期死亡/非預期處死

如果動物在研究中死亡,盡可能準確地估計其死亡時間并記錄,且盡
快進行尸檢。如果不能立即進行尸檢,將動物冷藏(不是冷凍)以減少組織
自溶。尸檢應在死亡后12小時內進行。

如果動物出現不良健康狀況或在瀕死之際,將其進行安樂死。酌情進
行血液或其他標本的采集并進行適當分析(如臨床病理參數),有助于揭示
不適/病態的原因。

實施例7.1.6動物護理

每只動物都通過耳標編號和籠子卡片確定,卡片上列有動物識別號碼、
研究號碼、品種/品系、性別、出生日期、來源和到達日期。

這些動物被單獨安置在隔離籠中。床具材料是修剪的硬木片(Sanichips,
Harlan,CA)且每周更換。室溫保持在18~26℃(64-79°F),且相對濕度為
30-70%。連續監控溫度和濕度并每天記錄最低值和最高值。保持12小時
光照/12小時黑暗的光照周期,除了必須打開房燈(在暗周期)以調節研究程
序。在研究期間,大鼠可隨意地獲得照射的Teklad?Global?18%蛋白質嚙齒
動物飲食(Harlan,San?Diego,CA,USA)和市政自來水。目前在飲食和水中
還未發現對研究結果有不利影響的污染物。每年的水質量檢測報告保存在
PSI檔案中。

到達指定住處后,所有收到初步健康檢查合格的大鼠被允許在居住環
境(原始圍墻和房間)中至少馴化3天,在開始任何動物相關的研究程序之
前。在馴化期間,每天監控大鼠的一般健康。只有視覺評價處于良好臨床
條件(如體重)大鼠才能參與本研究。任何顯示異常或不健康跡象(如起皺的
表皮、顯著低體重)的大鼠都被排除在本研究外。

在整個馴化和研究期間,每天至少進行一次臨床觀察和測量。至少在
給藥前3天開始籠邊觀察記錄并持續到終止。通常觀察每只動物的外觀和
行為變化。在大鼠到達后、給藥試驗用品前和尸檢當天進行稱重并記錄體
重。

實施例7.2結果

實施例7.2.1臨床觀察和測量

沒有動物在本研究中被取代。未發現動物死亡且所有動物都被預期處
死。所有動物的預處死檢查均正常。

實施例7.2.2拓撲替康血漿水平測量

第11天(最后一次治療的7天后)的血漿提取物測量發現了拓撲替康(只
檢測內酯形式)和釓雙胺水平都不存在或低于量化的下限,如表20所示。
為觀察到拓撲替康羧化物形式或其很低,與血漿的干擾峰重疊。每個樣品
都可觀察到拓撲替康內酯形式的保留時間的峰,且在編號7214動物發現最
高峰。這個峰是拓撲替康還是血漿空白還未確定。

表20在血漿中物中的提取拓撲替康與釓雙胺

?動物研究數
治療分配
拓撲替康(g/mL)
釓雙胺(μg/mL)
?7201
組1
<0.0007
<0.04
?7203
組1
<0.0007
<0.04
?7205
組1
<0.0007
<0.04
?7207
組2
<0.0007
<0.04
?7211
組2
<0.0007
<0.04
?7214
組2
<0.0007
<0?04

實施例7.3討論

本研究評估了通過腦內CED遞送的大鼠正常腦組織中兩個濃度的
Ls-TPT與固定濃度的Ls-GD共注入的安全性和毒性。濃度為1.0和1.6
mg/mL的Ls-TPT介于之前證實的Ls-TPT的安全濃度(0.5mg/mL)和毒性濃
度(5.0mg/mL)之間。

兩個濃度顯示同樣安全,無試驗用品引起的顯著的或微小的變化。急
性出血區域大多位于沿導管道,且據推測與實驗過程和藥物運輸系統相關。
之前已描述與遞送技術相關的嚴重的的微小的變化,遞送技術包括導管插
入和CED,且本研究中觀察到的變化與采用的遞送技術相一致(Lieberman
1995,Lonser?2002)。一個不明顯的不利作用水平在本研究中未證實,因為
無評價濃度引起試驗用品導致的毒性。

最后一次治療的7天后的血漿提取物測量發現了拓撲替康和釓雙胺水
平都不存在或低于量化的下限。所有樣品都存在的拓撲替康內酯形式的保
留時間的小峰還不能清楚地歸于拓撲替康或血漿。然而,考慮到區域遞送
方法繞過血腦屏障且在最后一次處理和樣品收集期間,可能意外地出現顯
著的血漿水平。本研究中未測量大腦組織濃度,因為大腦被切片用于組織
病理學分析。因此,無法斷定血漿中的上面的峰與腦實質水平是否呈正相
關。在另一項研究中,在兩個腦半球在拓撲替康濃度為0.5μg/mL下Ls-TPT
單獨處理的7天后,未檢測到腦內拓撲替康(實施例2)。

實施例7.4結論

在大鼠幼腦組織中共同注入1.0和1.6mg/mL濃度的Ls-TPT及Ls-GD
顯示是安全的,且無試驗用品導致變化的證據。拓撲替康和釓雙胺血漿水
平都低于用于分析量化的下限,與遞送方法和藥物性質相一致。

實施例8:脂質體拓撲替康和脂質體釓雙胺對成年無胸腺鼠內的顱內
異種移植U87MG腫瘤的增強對流遞送

實施例8.1:材料和方法

實施例8.1.1:試驗用品

制備如實施例6.1.1所述的脂質體GLP級材料脂質體拓撲替康和脂質
體釓雙胺。

實施例8.1.2:動物和分組

使用6~8周、體重200~275g的成年無胸腺雄鼠rnu/rnu(泰克尼克,日
耳曼敦,紐約,批次04/30/2007-150501)。將實驗動物按表21所示分成三
組。

表21:分組與劑量


腫瘤接種手術要進行兩天以上(n=15只/每天)。在連續幾天內,對每個
治療組中的五只大鼠進行U87MG腫瘤細胞接種手術。真正的治療任務是
在腫瘤植入手術后兩天中的任意一天,目的是比較各組大鼠的平均體重和
標準偏差。

實施例8.1.3:手術步驟與治療

實施例8.1.3.1:顱骨內腫瘤異種移植手術

將人體成膠質細胞瘤細胞(U87MG)從冷凍細胞庫(佩里科學公司,圣地
亞哥,加拿大)中取出2周后,再按計劃進行接種。細胞在腫瘤接種手術當
天獲得并調成50,000~100,000細胞/μL的濃度水平。在接種手術當天(第0
天),使用5-10μL懸浮液,對每只大鼠的右腦紋狀體單方面植入總量為
500,000的U87MG腫瘤細胞。采用立體定位技術和2.5%濃度的異氟烷麻
醉措施。將大鼠置入一個立體定位框架中,用耳棒和門牙棒將其頭部固定。
手術全程使用無菌技術。先后用70%的酒精和聚烯吡酮磺溶液對皮膚進行
消毒。將顱骨頂部皮膚縱切,使用鈍切將遍布在顱骨上的結締組織移除。
從前囪鉆一個前部0.5mm側面3.0mm毛刺孔。使用30號容量25μL的漢
密爾頓注射器,將U87MG腫瘤細胞用適當的背腹坐標立體定位技術注入
大腦紋狀體中,背腹坐標根據軟膜表面來計算(-4.5~-5mm,齒列-3.3mm)。
根據U87MG細胞懸浮液的最終細胞濃度,將注射劑量在5~10μL范圍內調
整,以確保在10分鐘內對實驗動物注入總量為500,000±25,000的腫瘤細
胞。

在接種手術中,將皮膚固定。監測在麻醉恢復期的大鼠狀態。根據需
要對其進行皮下給藥丁丙諾啡。在腫瘤細胞植入手術后每天監測大鼠兩次。
植入手術后的存活期預計為0~60天左右,在此期間大鼠被實施安樂死,
而其大腦被保存。

實施例8.1.3.2:治療

在第5天和第8天,積極治療的大鼠(第1組和第2組)將接受通過CED
遞送到腦內腫瘤的實驗用品,該CED與大腦紋狀體內的腫瘤植入具有相同
的坐標。對照組的大鼠維持在不治療狀態,不對其進行假手術。將大鼠按
各組相同的注射時間排列的系統化順序進行給藥。通過腹膜內注射2.5%濃
度的異氟烷或克他命(90mg/kg)與甲苯噻嗪(12mg/kg)的混合物進行麻醉。
使用帶有鈍耳棒的立體框架通過先前鉆打的毛刺孔來進行CED。僅將凝固
血塊移除。將一個與自動泵(BASi,lnc,West?Lafayette,IN)連結的熔融二氧
化硅套管(外徑168μm,內徑102μm)(PolyMicro?Technologies,Phoenix,AZ)
用于CED,并將其降至合適的背腹坐標位置(-4.5~-5mm,齒列-3.3mm)。
背腹坐標根據軟膜表面來計算。將套管插入27號針頭中,并將其用強力膠
固定在管壁上。在此過程中逐步增加輸液速度,依次為0.2μL/分鐘持續15
分鐘,0.5μL/分鐘持續10分鐘,0.8μL/分鐘持續15分鐘,0.5μL/分鐘(10mm),
最終使每個大腦半球輸入20μL劑量液體。輸液完畢后,將套管保持原位
5分鐘,盡可能減少輸液外流,之后再緩慢拔出。

程序完成后,接下來使大鼠處于自由通風的環境中,并通過加熱燈或
水瓶或其它合適的保溫方法進行保溫并在麻醉恢復期進行監視。根據需要
對其進行皮下給藥丁丙諾啡。允許大鼠在將其送回它們的籠子之前在程序
室里進行恢復。

實施例8.1.3.3:第60天之前的安樂死標準

如果觀察到下列癥狀(鼻/眼周出血、麻痹、駝背、遲鈍或不進食或修
飾或重量減輕>15%基線體重)的任何一個或其組合則將動物進行安樂死。
如果情況允許,可收集血液或其他樣本進行適當研究(如臨床病理學參數)
來找出不適或病態的原因。實施安樂死:將實驗動物用2.5%濃度的異氟醚
深度麻醉,然后先后用0.9%濃度的鹽溶液(100mL)和4%濃度的仲甲醛溶液
(300mL)進行心內灌流。

實施例8.1.3.4:組織收集和處理

在尸體和肌肉/骨骼系統進行研究期間,對發現的死亡或處死(預期和
非預期的)的動物進行完整的總體尸檢,所有的外表面和開口,大腦的顱腔
和外表面,與頸部相關的器官和組織,胸部、腹部和盆腔及其相關的器官
和組織。

將尸檢動物大腦移除,置入4%濃度的仲甲醛溶液中培養24小時,然
后放入30%的蔗糖溶液中平衡。在蔗糖平衡后,將組織放入-70℃環境中
冷凍儲存,而后凍干切片。如有心臟,肺,肝,腎,脾(整體或部分)等器
官,也一并收集并儲存。將這些器官的組織與10%濃度的福爾馬林溶液混
合。而后將混有福爾馬林溶液的器官處理成石蠟塊以便日后有需要時做組
織病理研究分析。

實施例8.1.3.5:組織病理學分析

在60天,從三個治療組中分別隨機選取至少三只存活動物和死亡動物
的大腦,進行20μm厚的切片取樣,將每四個切片收集到玻璃片上,與4%
濃度的仲甲醛溶液混合,經過蘇木精/曙紅處理,來評估腫塊的大小和組織。
剩余切片保存在4℃環境下,用于其它免疫組織化學研究分析。

實施例8.1.3.6:生命周期觀察和測量

在適應環境和實驗研究期間,每日至少進行一次臨床觀察和測量。至
少要連續三天對籠邊觀察作記錄后,才能給動物首次注射藥劑,直到死亡。
觀察每只動物整體外觀和行為的變化。臨床觀察和測量數據在表22中列出。

表22:臨床觀察和監測參數


實施例8.1.3.7:早期死亡/非預期處死

如果動物在研究中死亡,盡可能準確地估計其死亡時間并記錄,且盡
快進行尸檢。如果不能立即進行尸檢,將動物冷藏(不是冷凍)以減少組織
自溶。尸檢應在死亡后12小時內進行。

如果動物出現不良健康狀況或在瀕死之際,將其進行安樂死。如果情
況允許,可收集血液或其他樣本進行適當研究(如臨床病理學參數)來找出
不適/病態的原因。

實施例8.1.3.8:統計方法

將動物分成不同治療組以便進行存活期分析。通過使用對數秩統計的
Kaplan-Meier存活期分析方法來進行各組比較研究。從凱普蘭-邁耶曲線中
可以看出各組的平均存活期。將實施安樂死的動物看成未通過審查的(死亡)
和通過審查的(存活)兩部分來對存活期進行單獨分析。

實施例8.1.4動物護理

將有編號的耳標套在每只動物身上以便識別。此外,每只動物的籠子
也掛有籠卡,列明動物識別編號,研究編號,組別,出處,到達日期,物
種/品種,出生日期和性別以便識別。

將大鼠分別放置在單獨的籠子中。用削好的硬木片(撒尼片,哈倫,加
拿大)鋪床并每周更換。室溫控制在18~26℃(64-79°F),相對濕度在30~70%
范圍內。連續監控溫度和濕度,每天記錄最大值和最小值。保持12小時亮
/12小時暗的周期光照時間,必要時在暗周期時段打開室燈以配合研究過程。

將大鼠置入明亮的特克萊德實驗室里,允許自由出入,在研究過程中
為其提供總共占嚙齒類動物飲食18%的蛋白質(哈倫,圣地亞哥,加拿大,
美國)和城市自來水。飲食和水都沒有任何程度的污染,也不會對研究結果
產生任何有害影響。每年的水質量檢測記錄保存在保羅謝勒研究所的檔案
中。

到達指定居室后,讓所有即將接受最初健康檢查的大鼠用至少三天的
時間適應室內環境(主要外部圍場和房間),然后再開始其他與動物相關的
研究步驟。在適應期間,每天監測大鼠的總體健康狀況。只有在目測評斷
中具有良好臨床狀況(比如體重規格)的大鼠才能進行實驗研究。任何在目
測評斷中出現不健康異常現象(比如皮毛皺起,體重驟減)的大鼠都將被排
除。

實施例8.2結果

實施例8.2.1:臨床觀察和測量

不必替換任何實驗大鼠。8只大鼠在籠子里死亡(第一組5只,第二組
1只,第三組3只)。20只大鼠由于健康狀況差而被實施安樂死(第一組5
只,第二組9只,第三組7只),健康狀況差的大鼠最普遍的現象是體重下
降≥45%,倦怠,駝背,喪失運動功能(比如出現變形的正位反射,向一側
躺倒的現象)。

實施例8.2.2效果

按計劃對每組十只大鼠進行治療。主要效果分析將實施安樂死的大鼠
看成是未通過審查(死亡)的實驗對象。結果,示出的存活期表明直到死亡
的時間。治療組中每只大鼠的個體存活期、中間值存活期及平均值存活期
在表23中顯示。治療組的存活曲線在圖12中顯示。

表23:實施安樂死被看成是未經審查的大鼠的個體,治療組,整體存活*數據


由數據可知,與對照組(第三組)相比較,使用總劑量和高濃度的拓撲
替康來治療大鼠的第二組以及使用總劑量和低濃度的拓撲替康來治療大
鼠中的第一組都具有較長的存活期,他們的平均值存活期分別為第二組:
33.0天(95%CL,31-40),第一組:29.5天(95%CL,27-33),第三組:20.0天
(95%CL,19-21)。與對照組相比較,這種差別都是統計上顯著的(1.0mg/mL
vs對照組,p<0.0001;0.5mg/mL?vs對照組,p<0.0001)。

積極的混合治療組(第一組和第二組)的中間值存活期為31.5天
(95%CL,30-36),與對照組相比較也是統計上顯著的,p<0.0001。盡管從劑
量/濃度反應曲線能觀察到一個危險的比例0.567(95%CL,0.23-1.38),但兩
個積極的治療組的差別并沒有達到統計上顯著水平(0.5mg/mL?vs?1.0
mg/mL,p=0.215)

第二效果分析則是將實施安樂死的大鼠看成是通過審查的實驗對象。
治療組的中間值存活期在表24中顯示,而存活期曲線在圖13中顯示。

表24:實施安樂死被看成是審查過的大鼠的治療組和整體存活數據


此項分析結論與將實施安樂死被看成是未通過審查的大鼠的效果分
析結論一致,并成為其有力依據。結論表明,與對照組(第三組)相比較,
使用總劑量和高濃度的拓撲替康來治療大鼠的第二組以及使用總劑量和
低濃度的拓撲替康來治療大鼠中的第一組都具有較長的存活期,他們的平
均值存活期分別為第一組:48.0天(95%CL,未確定),第二組:33.0天(95%CL,
30.0-48.0),第三組:23.0天(95%Cl,20.0-23.0)。與對照組相比較,這種
差別也是統計上顯著的(1.0mg/mL?vs對照組,p<0.0014;0.5mg/mL?vs對
照組,p<0.0014)。積極的混合治療組(第一組和第二組)的中間值存活期為
48.0天(95%Cl,36.0-48.0),與對照組相比較也是統計上顯著的,p<0.0001。

此項驗證效果研究是對一種混合藥物遞送方法進行評估,此方法為將
兩種濃度的新型拓撲替康制劑,通過腦內CED,遞送入無胸腺大鼠的顱內
神經膠質瘤異種移植模型中。裝載釓雙胺的脂質體作為脂質體拓撲替康的
潛在成像示蹤替代物共同給藥。此項研究所選拓撲替康的濃度有:0.5
mg/mL,在之前的探索效果研究(實施例4)中進行測試;和1.0mg/mL,在
之前的毒理學試驗研究(實施例7)中被確定為無毒范圍。根據實施例4的發
現,在此研究中使用雙劑量策略,而且在腫瘤異種移植術后第5天(實施例
4為第8天)開始進行治療,以避免腫瘤負擔過度,因此優化腫瘤覆蓋的分
布容積。而且,在異種移植手術中,U87MG腫瘤細胞裝載量5X105在所有
實驗組中都相同,以使得所有實驗大鼠都具有相同的腫瘤負擔(實施例4中
所示,腫瘤細胞裝載量變動范圍是6.8~9.7X105)。

結論顯示,兩個積極的治療組中大鼠具有較長的整體存活期和中間值
存活期。與對照組相比較,高濃度的脂質體拓撲替康(1.0mg/mL)在整體存
活期上統計顯著水平大幅增加(p<0.0001),而在中間值存活期和平均值存活
期上,統計顯著水平分別增加65%和76%。與對照組相比較,低濃度的脂
質體拓撲替康(0.5mg/mL)在整體存活期上統計顯著水平也同樣大幅增加
(p<0.0001),但其作用效果略低于高濃度的脂質體拓撲替康,因此暗示存在
劑量/濃度依賴效應。另外,低濃度的脂質體拓撲替康在中間值存活期和平
均值存活期上,統計顯著水平分別增加48%和56%。此項分析結論與將實
施安樂死被看成是通過審查的大鼠的存活期效果分析結論相同。而后者采
用較為保守的評估方法,避免對脂質體拓撲替康的真實作用效果出現任何
潛在的過度評估,但另一方面也可能低估這種效果。第二效果分析結論仍
然是統計上顯著的,并強有力的證實了最初的效果分析結論,即將實施安
樂死被看成是未通過審查的大鼠的效果分析。

在此項驗證效果研究中所得出的整體實驗結論與實施例4的研究報
告結論不同。接受濃度為0.5或1.0mg/mL的脂質體拓撲替康的大鼠具有
較長的中間值存活期和整體存活期,這與在腫瘤異種移植手術中使用較低
量,但數量相同的腫瘤細胞裝載方法,并采取術后早期和雙向治療(術后第
5天和術后第8天)所得出的結論一致。此項研究中,實驗大鼠的平均值存
活期(20天)較長暗示腫瘤細胞裝載對大鼠存活的重要性,這與賽托等人于
2006年發表的報告結論非常相似,而且該平均值存活期(20天)比實施例4
研究報告得出的17天還長。

實施例8.4:結論

在用U87MG腫瘤細胞形成一只大鼠神經膠質瘤模型中,使用通過
CED所獲得的脂質體拓撲替康,其作用效果與未經治療的對照組相比,具
有清楚一致的存活優勢和纈氨酸優勢。

實施例9:脂質體ω-芋螺毒素到點燃大鼠的增強對流遞送

從西格瑪奧德里奇公司(密蘇里州圣路易斯)獲得合成的ω-芋螺毒素
-G(27氨基酸;MW,3037),ω-芋螺毒素-M(25氨基酸;MW,2639),和卡
馬西平。每種都裝載入由二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘
油(DSPG)和膽固醇(見實施例2.1.2)組成的脂質體中。脂質體ω芋螺毒素
-G,脂質體ω-芋螺毒素-M,天然ω-芋螺毒素-G,天然ω-芋螺毒素-M,以
及天然卡馬西平在點燃大鼠上的作用效果通過使用增強對流遞送和與
Gasior等人發表于2007年的第323期《藥理學和實驗性治療學》雜志第
458-68頁中所述實質相同的原理來測定。

簡而言之,將套管-兩極的刺激電極裝配組件緩慢地植入每只大鼠中,
將電極尖端置于右扁桃體的基底核中。右扁桃體位于從前囟測算的立體定
位坐標上(AP:-2.8mm;ML:5.0mm;DV:-8.7mm),此測算方法由帕克西諾
斯·G和沃森·C于1998年在悉尼學術刊物第四版的《立體定位坐標中的大
鼠腦部》中發表。使用牙科用丙烯酸膠合劑(Lang齒,車輪狀,第三代)和
可固定的不銹鋼螺絲(塑料一號)將套管電極組件固定在顱骨上,術后至少
要有十天恢復期。點燃實驗包括三個階段:(1)點燃前對AD臨界值的測算
(2)點燃過程(3)點燃后對AD臨界值的重新測算(參見皮內爾·JP等人發表
于1976年的第17期《癲癇》第197~206頁;弗里曼·FG和賈維斯·MF發
表于1981年的第7期《腦部研究文集》第629-33頁,Gasior等人發表于
2007年的第323期《藥理學和實驗性治療學》第458-68頁)。點燃過程中,
將大鼠置入與定制刺激器相連的直徑為29cm的有機玻璃缸中單獨受激(國
家研究院健康研究服務分部,貝塞斯達,馬里蘭州)。這種玻璃缸帶有一個
可旋轉附件,使得大鼠能在缸室里自由活動。

增強對流遞送系統是由Gasior等人于2007年提出(如前所述)。為測定
增強對流遞送系統,將每只大鼠固定,將輸液套管通過引導套管緩慢植入
大腦中。輸液套管尖端在刺激電極導線尖端上方伸出0.5mm的深度,并通
過套管頂上的塑料制動裝置將其維持在合適的深度上。釋放大鼠將其置入
一個塑料圓筒內以便進行完全輸液。輸液全程是在有意識的,沒有行動限
制的大鼠身上進行。輸液套管植入后,讓大腦組織把套管整個包上幾分鐘,
然后再進行輸液。輸液采用逐步增加輸液速度的方法進行。輸液速度依次
為0.2μl/分鐘持續15分鐘,0.5μl/分鐘持續10分鐘,0.8μl/分鐘持續15
分鐘,最終使得每個大腦半球達到20μL劑量。輸液完畢后,將套管保持
原位5分鐘,盡可能減少輸液外流,之后再緩慢拔出。通過確定AD臨界
值,以及測定AD持續時間,癲癇發作階段,和行為性癲癇發作持續時間,
來評估對完全點燃大鼠體內癲癇敏感性的試驗物質效果。隨后,通過CED
注入試驗物質,刺激大鼠并在20分鐘的注入后階段以及之后的24小時,
48小時,72小時,96小時,一周,二周,四周和八周的時間段里進行點
燃數據測算。分別在試驗物質注入過程中,注入后至少一小時內,每次后
續的刺激階段開始前這三個時間段里,觀察大鼠出現顫抖(四肢,頭部和身
體有節奏的振動行為)或其他神經性癥狀的行為。

在通過點燃測算特征性毒素作用的研究實驗最后,隨機選擇幾只完全
點燃大鼠,將其置入連續波長酶標儀監控系統中(熱金屬探測儀,哥倫布型,
俄亥俄州)進行自主活動測試。簡而言之,將每只大鼠置入自主活動室內
(Gasior等人于2007年提出,如上所述)60分鐘,連續五天進行這種測試,
以使其適應環境。連續5天后,橫向和縱向活動線趨向于一個平穩的基線,
將在最后兩天的適應期測試時段統計的活動平均值作為輸液研究的基線。
在5天適應期結束的后一天,給每只大鼠注入試驗物質。輸液參數和其他
包括動物處理和外部線索的因子,與從進行點燃癲癇發作實驗的大鼠身上
獲得的一致。在20分鐘輸液后階段以及之后的24小時,48小時,72小時,
96小時,一周,二周,四周和八周時間段里進行橫向和縱向光線干擾,持
續60分鐘。

測試結束后,選擇幾只大鼠,用4%的仲甲醛進行心內灌注,將大腦
移除用于切片,用甲酚紫和銀染來測算套管放置位置和神經損傷程度。將
每種藥物治療的效果描述成基線的變化(以百分比計),用以下公式計算:
100X[(治療前數值)-(治療后數值)]/(治療前數值)。單獨計算每只大鼠基線
的治療效果,然后取一組的平均值。在使用反正弦根變換的數據變化百分
比變換后,運用單線(一組中)和雙線(不同組之間)重復測量方差分析,對點
燃試驗和自主活動試驗的數據進行統計。運用鄧尼特試驗或圖基試驗進行
適當的事后分析。將顫抖行為的數據描述成由費舍的精確可能性試驗分析
的頻率。

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所有的文獻在此都整體納入本文以供參考。

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