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具有改進性質的重組表面活性劑.pdf

摘要
申請專利號:

CN201310053516.8

申請日:

2007.09.28

公開號:

CN103169947B

公開日:

2014.10.29

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 38/16申請日:20070928|||公開
IPC分類號: A61K38/16; A61K47/24; A61K9/08; A61K9/10; A61K9/14; A61P11/00; A61K31/685(2006.01)N 主分類號: A61K38/16
申請人: 奇斯藥制品公司
發明人: J·約翰松; T·庫斯泰德特; B·羅伯特松
地址: 意大利帕爾馬
優先權: 2006.10.13 EP 06021521.7
專利代理機構: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038 代理人: 李程達
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310053516.8

授權公告號:

103169947B||||||

法律狀態公告日:

2014.10.29|||2013.07.24|||2013.06.26

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及一種含有脂質載體、天然表面活性蛋白SP-C的多肽類似物和天然表面活性蛋白SP-B的多肽類似物的重組表面活性劑。本發明還涉及重組表面活性劑的藥物組合物及其用于治療或預防RDS和其他呼吸疾病的用途。

權利要求書

權利要求書
1.   一種含有磷脂混合物和天然表面活性蛋白SP?C的多肽類似物與天然表面活性蛋白SP?B的多肽類似物的組合的重組表面活性劑,
其中所述天然表面活性蛋白SP?C的多肽類似物是
IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL(If);并且
其中所述天然表面活性蛋白SP?B的多肽類似物是
CWLCRALIKRIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS(IIc)。

2.   根據權利要求1的重組表面活性劑,其中天然表面活性蛋白SP?C的類似物與天然表面活性蛋白SP?B的類似物以固定的組合存在。

3.   根據權利要求1?2中任一項的重組表面活性劑組合物,其中多肽(IIc)是二硫鍵連接的分子,分子內的二硫鍵是在位置4和位置27的兩個半胱氨酸殘基之間。

4.   根據權利要求1?2任一項的重組表面活性劑,其中磷脂混合物由二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)和選自棕櫚酰油酰磷脂酰甘油(POPG)或其與棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿(POPC)組成的混合物的棕櫚酰油酰磷脂以95:5到50:50的重量比構成。

5.   根據權利要求4的重組表面活性劑,其中磷脂混合物由DPPC和POPG以68:31的重量比構成。

6.   含有權利要求1?4任一項的重組表面活性劑的藥物組合物。

7.   根據權利要求6的藥物組合物,其以溶液、分散液、混懸液或干粉的形式存在。

8.   根據權利要求7的藥物組合物,其以含水混懸液的形式存在。

9.   根據權利要求8的藥物組合物,其含有濃度為2?160mg/ml的重組表面活性劑。

10.   根據權利要求9的藥物組合物,其中重組表面活性劑的濃度為20?80mg/ml。

11.   權利要求1?5任一項的重組表面活性劑在制備用于治療或預防早產兒的呼吸窘迫綜合征(RDS)或治療或預防成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、胎便吸入綜合征(MAS)或支氣管肺發育不良(BPD)的藥物中的用途。

說明書

說明書具有改進性質的重組表面活性劑
本申請是申請號為200780038276.7、申請日為2005年7月1日、發明名稱為“具有改進性質的重組表面活性劑”的中國發明專利申請的分案申請。
本發明涉及一種含有脂質載體和天然表面活性蛋白SP?C的特定多肽類似物與天然表面活性蛋白SP?B的特定多肽類似物的組合的重組表面活性劑。
本發明還涉及重組表面活性劑的藥物組合物及其用于治療或預防RDS和其他呼吸疾病的用途。
發明背景
人的肺由被稱為肺泡的大量小氣囊組成,在其中,氣體在血液和肺的氣室之間交換。在健康人體中,這種交換以含有蛋白質的表面活性物質復合物為媒介,這能防止肺在呼氣末期萎陷。
肺表面活性物質復合物主要由脂質組成,含少量各種蛋白質。缺少足夠水平的這種復合物會導致肺功能失常。這種癥狀被稱為呼吸窘迫綜合征,它經常侵襲早產兒。
上述綜合征可以使用經結構修飾的提取自動物肺的天然表面活性劑的制劑進行有效治療。
市售的修飾的天然表面活性劑的制劑有,例如,固爾蘇,來自豬肺,Infasurf,提取自小牛肺灌洗液和Survanta,牛肺天然提取物的化學修飾物。
這些表面活性劑制劑的主要成分是磷脂,例如1,2?二棕櫚酰?sn?甘油基?3?磷脂酰膽堿,一般稱為二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC),磷脂酰甘油酯(PG)和表面活性的疏水蛋白B和C(SP?B和SP?C)。
由于來自動物組織的表面活性劑制劑的缺點,例如生產和消毒過程的復雜性以及對免疫反應的可能的誘導效應,模擬修飾的天然表面活性劑組成的合成表面活性劑已被開發出來。所述合成表面活性劑被稱為重組表面活性劑。
然而開發臨床有效的重組表面活性劑已經被證實非常復雜,因為天然的疏水蛋白太大而不容易合成,結構復雜并且以高純度存在時不穩定。
為了代替所述天然的疏水蛋白,一些部分符合它們序列的合成多肽及其類似物在現有技術中已經被提出和公開,如WO89/06657,WO92/22315,WO98/49191,WO95/32992,US6,660,833,EP413,957和WO91/18015。
WO00/47623公開了作為天然蛋白SP?C類似物的合成多肽,其中:i)5位和6位的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基代替;ii)SP?C“中心區域”的纈氨酸殘基被選自含有亮氨酸、異亮氨酸和正亮氨酸(nL)的組的其他天然疏水殘基取代;iii)一些SP?C“中心區域”的中性氨基酸被選自含有賴氨酸、色氨酸(Try)、苯丙氨酸、酪氨酸和鳥氨酸的組的大的或極性的殘基代替。
所述的人工多肽特征是能夠像天然蛋白SP?C那樣折疊,并且,因此能夠與表面活性劑的脂質發生適當的相互作用并不會引起自寡聚。
WO00/76535一般的涉及了含有至少一個修飾的SP?B與至少一個修飾的SP?C蛋白的肺表面活性劑制劑。
在WaringAJ等人(摘要出現于2006年4月29日?5月2日于舊金山舉行的兒科學會年會)的文獻中,進行了一項檢驗由SP?C?模擬的SP?Cff和SP?B模擬的Mini?B組成的合成表面活性劑活性的研究,SP?C?模擬的SP?Cff是一種合成的34個殘基的SP?C,其中4位和5位的半胱氨酸被苯丙氨酸代替
然而,根據可獲取的文獻,在動物研究中,使用重組表面活性劑處理導致了不良肺氣體容積和呼氣末期肺泡開放程度,并且為了得到與修飾的天然表面活性劑取得的活性相當的體內活性,需要通過一個呼氣末期正壓(PEEP)來完成換氣(JohanssonJ等人J Appl Physiol2003,95,2055?2063;Davis AJ等人Am J Respir Crit Care Med1998;157,553?559)。現有的重組表面活性劑制劑實際上不能在呼氣末期的肺泡中形成穩定的磷脂膜。
所有上述的文獻都沒有提到呼氣末期肺泡開放的問題及其公開的制劑的效果。
因此,在肺順應性方面對于具有改進性能的重組表面活性劑始終還有未能滿足的需求。
特別的,對于能夠確保肺泡穩定性,并且因此保持呼氣末期肺泡開放性而不需要通過PEEP換氣的重組表面活性劑制劑有需求。
已經發現,也是本發明的目的所在的是,天然SP?C蛋白的特定類似物,優選是WO00/47623的多肽,與天然蛋白SP?B的特定類似物可以有利地組合起來,以得到在肺順應性方面具有改進性能的重組表面活性劑制劑,特別是其有效維持呼氣末期肺泡開放性而不需要通過PEEP換氣的能力。
特別的,已經發現,在RDS模型中,其中對未發育完全的新生兒使用外源性表面活性劑制劑治療并且不使用PEEP,上述SP?C和SP?B的特定類似物的組合對肺氣體容積起作用,而肺氣體容量是呼氣末期肺泡開放程度的指標。
發明概述
本發明涉及一種含有脂質載體和天然表面活性蛋白SP?C的特定多肽類似物與天然表面活性蛋白SP?B的特定多肽類似物的組合的重組表面活性劑。
特別的,本發明涉及一種重組表面活性劑,其含有:
a)一種脂質載體;
b)一種具有至少20個氨基酸殘基并且不多于40個氨基酸殘基的多肽,其具有通式(I)表示的序列
FeGeIfPfSgSPVHLKRXaBXb(BXc)nGALLnΩpGpLp  (I)
其中:
X是一個獨立選自由異亮氨酸、亮氨酸和正亮氨酸組成的組的氨基酸殘基;
B是一個獨立選自由賴氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和鳥氨酸組成的組的氨基酸殘基;
S任意被酰基取代,所述酰基含有12?22個碳原子,優選16個碳原子,并且通過酯鍵連接于側鏈;
Ω是一個選自含有蛋氨酸、硫原子被氧化的蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和正亮氨酸的組的氨基酸;
a是一個數值為1?8的整數;
b是一個數值為1?19的整數;
c是一個獨立選自3?8的整數;
e,f,g和p是數值為0或1的整數;
n是一個數值為0?3的整數;

XaBXb(BXc)n是含有最多22個氨基酸的序列;
c)一種具有通式(I I)序列的多肽
CfΔLCRALIKRIQAΩIPKGGRΩLPQLVCRLVLΦCSf(II)
其中:
Δ是一個獨立選自含有色氨酸和亮氨酸的組的氨基酸殘基;
Ω是一個獨立選自含有蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和正亮氨酸的組的氨基酸殘基;
Φ是一個獨立選自含有精氨酸和蘇氨酸,優選精氨酸的組的氨基酸殘基,;和
f是一個數值為0或1的整數。
本發明也包括所述多肽的藥學可接受的鹽和它們的例如通過乙酰化和酰胺化的N端和/或C端封閉的衍生物。
本發明還涉及藥物組合物及其用于預防和/或治療呼吸窘迫綜合征(RDS)和其他呼吸疾病的用途。
本發明進一步涉及通式(II)的多肽用于制備能在呼氣末期改善肺泡開放性的重組表面活性劑的用途。
最后,本發明提供了一種預防和/或治療呼吸窘迫綜合征(RDS)和其他呼吸疾病的方法,所述方法包括給予需要這種治療的患者治療有效量的重組表面活性劑,所述重組表面活性劑含有脂質載體、通式(I)多肽和通式(II)多肽。
附圖
圖1顯示了人SP?C蛋白的序列。在天然SP?C中半胱氨酸殘基被棕櫚酰化。
圖2顯示了人SP?B蛋白的序列。
圖3顯示了肺氣體容量(ml/kg)的結果。
圖4顯示了潮氣量(ml/kg)作為時間/壓力的函數的結果。
定義
使用外源性表面活性制劑體內進行治療后的呼吸功能通過測量以下兩個參數實現:
i)潮氣量,是肺順應性的指標和
ii)肺氣體容量,是呼氣末期肺泡空氣擴張或開放程度的指標,并且因此是呼氣末期在肺泡中形成穩定磷脂膜的能力的指標。
在本發明中,詞語“重組表面活性劑”指一種脂質載體,其中加入了通過重組技術或合成方法制備的表面活性蛋白的多肽類似物。
詞語“脂質載體”指磷脂和任選的其他脂質組分,例如中性脂質如三酰基甘油、游離脂肪酸和/或膽固醇的混合物.
詞語“天然表面活性蛋白SP?C的多肽類似物”包括含有如下氨基酸序列的多肽,其中與天然蛋白相比,一個或多個氨基酸丟失或被其他氨基酸取代,只要多肽和脂質載體的混合物顯示肺表面活性劑活性。
詞語“天然表面活性蛋白SP?B的多肽類似物”包括含有如下氨基酸序列的肽,其中與天然蛋白相比,一個或多個氨基酸丟失,只要多肽和脂質載體的混合物顯示肺表面活性劑活性。
詞語“mini?B”指基于天然SP?B蛋白的N?末端的殘基8?25和C?末端的殘基63?78的、具有34個殘基的多肽,它的結構在California NanoSystems Institute網站上的一個介紹中被第一次一般性的公開。然后它的全序列完全公開于RCSB蛋白數據庫。
在Waring AJ等人J Peptide Res2005,66,364?374的文獻中報道了更多有關它的結構和活性的信息。
詞語“變型”指mini?B肽的多肽類似物,它的氨基酸序列中有一個或多個氨基酸被其他氨基酸取代,只要肽和脂質載體的混合物保持mini?B的活性。
氨基酸序列依照氨基酸三個字母的代碼表示,其中游離氨基在左側末端(氨基末端)并且游離羧基在右側末端(羧基末端)。
詞語“協同”指在給定的測定下,兩個多肽的效果大于可以預期的它們分別單獨作用的效果之合。
本申請認定的所有的氨基酸殘基都具有天然的L?構型,并且本申請認定的序列根據下列對照表所示的氨基酸殘基的標準縮寫來表示。
對照表


發明詳述
本發明涉及一種含有脂質載體和天然表面活性蛋白SP?C的特定多肽類似物與包括Mini?B肽及其變型在內的天然表面活性蛋白SP?B的特定多肽類似物的組合的重組表面活性劑。
我們已經肯定的發現,在RDS模型中,其中使用外源性表面活性劑制劑治療未發育完全的新生兒并且不使用PEEP,通式(I)的多肽和通式(II)的多肽的組合對肺順應性確實起到作用。
特別的,兩種多肽的組合對肺氣體容量起到協同作用,而肺氣體容量是呼氣末期肺泡開放程度的指標。
上述結果證明本發明的重組表面活性劑能夠以比只含有一種SP?C蛋白類似物或一種SP?B蛋白類似物的重組表面活性劑更好的方式穩定呼氣末期肺泡中的磷脂膜。
此外,請求保護的重組表面活性劑制劑被證明將呼吸功能改善至與施用修飾的天然表面活性劑后取得的程度相當或甚至稍好的程度,以潮氣量表示所述呼吸功能。
有利的是,SP?C天然蛋白類似物是一種具有至少20個氨基酸殘基并且不多于40個的多肽,其具有通式(I)表示的序列
FeGeIfPfSgSPVHLKRXaBXb(BXc)nGALLΩpGpLp   (I)
其中:
X是一個獨立選自含有異亮氨酸、亮氨酸和正亮氨酸的組的氨基酸殘基;
B是一個獨立選自含有賴氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和鳥氨酸的組的氨基酸殘基;
S任意被酰基取代,所述酰基含有12?22個碳原子,優選16個碳原子,并且通過酯鍵連接于側鏈;
Ω是一個選自含有蛋氨酸、硫原子被氧化的蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和正亮氨酸的組的氨基酸殘基;
a是一個數值為1?8的整數;
b是一個數值為1?19的整數;
c是一個獨立選自3?8的整數;
e,f,g和p是數值為0或1的整數;
n是一個數值為0?3的整數;

XaBXb(BXc)n是含有最多22個氨基酸的序列,優選含有10?22個氨基酸。
優選的,通式(I)的多肽由至少30并且不多于35個氨基酸,更加優選不超過33個氨基酸組成。
在特定的實施例中,通式(I)的多肽由30或33或35個氨基酸組成。
優選的,SP?C蛋白的多肽類似物被通式(Ia)所表示,其中e和n是0,并且g是1
IfPfSSPVHLKRXaBXbGALLΩpGpLp    (Ia)
其中:
X、B和Ω具有如下定義:
a為1?8,優選1?3;更優選1;
b為1?19,優選5?15;更優選14;
f和p是0或1。
更優選的,SP?C蛋白的多肽類似物被通式(Ib)所表示,其中f是1
IPSSPVHLKRXaBXbGALLΩpGpLp    (Ib)
其中:
X、B、Ω、a和b具有如下定義:
p是0或1。
甚至更加優選的,SP?C蛋白的多肽類似物被通式(Ic)所表示
IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLΩpGpLp    (Ic)
其中:
Ω具有如下定義:
p是0或1。
通式(Ic)的多肽的例子如下所示:
IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLMGL(Id)(SEQ ID:1)
IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLIGL(Ie)(SEQ ID:2)
IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL(If)(SEQ ID:3)
IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLnLGL(Ig)(SEQ ID:4)
IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALL(Ih)(SEQ ID:5)
多肽(Id)在現有技術中也被稱為SP?C33。
最優選的,SP?C類似物是選自由具有式(Ie)、(If)、(Ig)和(Ih)的多肽組成的組的多肽。
在本發明的一個優選實施例中,通式(I)的多肽是下文中被稱為SP?C33(Leu)31的多肽(If)。
有利的是,SP?B天然蛋白的類似物由對應于天然SP?B蛋白的N?末端的殘基8?25和C?末端的殘基63?78(稱為Mini?B肽)或它的一個變型的兩部分組成。
更有利的是,SP?B天然蛋白的類似物是一種由下列通式(II)表示的多肽:
CfΔLCRALIKRIQAΩIPKGGRΩLPQLVCRLVLΦCSf    (II)
其中:
Δ是一個獨立選自含有色氨酸和亮氨酸的組的氨基酸殘基;
Ω是一個獨立選自含有蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和正亮氨酸的組的氨基酸殘基;
Φ是一個獨立選自含有精氨酸和蘇氨酸優選精氨酸的組的氨基酸殘基;和
f是一個數值為0或1的整數。
在本發明的一個特定的實施例中,SP?B類似物是一種具有通式(IIa)的多肽:
CWLCRALIKRIQAMIPKGGRMLPQLVCRLVLRCS(IIa)(SEQID:6)
在本發明的其他實施例中,SP?B類似物選自具有下列通式的多肽:
CLLCRALIKRIQAMIPKGGRMLPQLVCRLVLRCS(IIb)(SEQ ID:7)
CWLCRALIKRIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS(IIc)(SEQ ID:8)
CLLCRALIKRIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS(IId)(SEQ ID:9)
在一個優選的實施例中,多肽(IIa)、(IIb)、(IIc)和(IId)可以是二硫鍵連接的分子的形式,其中分子內的二硫鍵是在位置1和位置33的兩個半胱氨酸之間和/或在位置4和位置27的兩個半胱氨酸之間。
二硫鍵連接的多肽(IIa)在現有技術中被稱為氧化Mini?B(oxMini?B)。
多肽(IIc)在下文中被稱為Mini?B(LIeu),并且它的二硫鍵的連接形式被稱為ox Mini?B(Leu)。
通式(I)和(II)多肽可以通過本領域技術人員已知的合成方法或重組技術來制備。
固相肽合成的很多已知技術的很好的綜述可見于J.M.Steward和J.D.Young,"Solid Phase Peptide Synthesis",W.H.Freeman Co.,San Francisco,1969和J.Meienhofer,Hormonal Proteins and Peptides",Vo l.2,p.46,Academic Press(New York),1983,經典溶液合成的很多已知技術的很好的綜述可見E.Schroder和K.Kubke,"The Peptides",Vol.1,Academic Press(New York),1965。本發明的多肽可使用Merrifield在J.Am.Chem.Soc.85:2149?2154(1963)中最早描述的固相合成技術來制備。其他的多肽合成技術可以在例如M.Bodanszky等人,Peptide Synthesis,John Wiley&Sons,2d Ed.,(1976)中以及其他本領域技術人員熟知的參考文獻中找到。
用于這些合成的合適的保護基團可以在上述的文獻和J.F.W.McOmie,Protective Groups in Organic Chemistry,Plenum Press,New York,NY(1973)中找到。
例如,通式(I)多肽可以根據WO00/47623公開的方法制備,通式(II)多肽可以根據Waring AJ等人在J Peptide Res2005,66,364?374中報道的方法制備。
本發明也包括通式(I)和(II)多肽的藥學可接受的鹽和它們的例如通過乙酰化和酰胺化的N端和/或C端封閉的衍生物。
藥學可接受的鹽包括例如鹽酸、醋酸和三氟乙酸的鹽。
本發明的重組表面活性劑可以通過混合通式(I)和(II)多肽的溶液或混懸液和脂質,然后干燥混合物,或通過冷凍干燥或噴霧干燥來制備。
優選的,通式(I)多肽和通式(II)多肽以固定的量和定量比例作為固定的組合出現在本發明的重組表面活性劑中。
通式(I)和(II)多肽相對于重組表面活性劑的比例可以變化。有利的是,每種多肽占表面活性劑重量的0.5?10%(w/w),優選為1?5%,最優選為1?3%。
在一個優選的實施例中,重組表面活性劑含有1?3%重量比的多肽(If),1?3%重量比的多肽(IIa),優選被氧化的形式。
在另一個優選的實施例中,重組表面活性劑含有1?3%重量比的多肽(If),1?3%重量比的多肽(IIc),優選被氧化的形式。
有利的,脂質載體包括天然肺表面活性制劑含有的磷脂,如磷脂酰膽堿(PC),例如二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)和棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿(POPC),以及磷脂酰甘油(PG),例如棕櫚酰油酰磷脂酰甘油(POPG)和二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)。
其他可以被有利的應用的磷脂是磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸和鞘磷脂(SM)。
在一個特別的實施例中,脂質載體可以包括其它成分,如中性脂質例如三酰甘油、游離脂肪酸和/或膽固醇。
有利的,根據本發明的重組表面活性劑含有90?99%重量比的脂質載體,優選92?98%,更優選94?96%,并且兩種肽重量之和占1?10%重量比,優選選2?8%,更優選4?6%。
發明的一個實施例中,重組表面活性劑含有96%重量比的脂質載體,2%重量比的通式(I)多肽和2%重量比的通式(II)多肽。
在一個特別的實施例中,脂質載體只由磷脂構成,更優選由DPPC和選自POPG或其與POPC組成的混合物的棕櫚酰油酰磷脂以95:5到50:50的重量比構成,優選80:20到60:40。
DPPC和POPG的重量比優選75:25到65:35,更優選是68:31。在DPPC:POPG:POPC混合物中,優選使用的磷脂重量比是60:20:20或68:15:16。
在另一個實施例中,脂質載體由DPPC、DPPG和膽固醇構成。
在本發明的一個優選實施例中,重組表面活性劑含有1?5%重量比的通式(Ia)多肽的一種,1?5%重量比的通式(II)多肽的一種和DPPC與POPG以68:31的重量比組成的混合物。
本發明的重組表面活性劑以本領域技術人員已知的方式給藥,優選氣管內滴入(installation)(浸劑或大丸劑)或噴霧法。
本發明也涉及了含有本發明的重組表面活性劑的藥物組合物。所述組合物有利地通過溶液、分散液、混懸液或干粉的形式給藥。重組表面活性劑的所述組合物優選含有溶解或混懸于合適的溶劑或再懸浮介質中。
所述藥物組合物優選以在一次性使用的玻璃小瓶中的在緩沖生理鹽水溶液中的懸浮液形式供給使用。有利的是,重組表面活性劑的濃度(以磷脂含量表示)在每ml約2?約160mg活性劑的范圍,優選在10?100mg/ml,更優選20?80mg/ml。
所述組合物可以進一步含有電解質,例如鈣、鎂和/或鈉鹽,優選氯化鈣。
本發明的藥物組合物適合于預防和/或治療早產兒的呼吸窘迫綜合征(RDS)或其他與表面活性物質缺乏或機能障礙有關的疾病,其包括成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、胎便吸入綜合征(MAS)和支氣管肺發育不良(BPD)。
它們也可用于預防和/或治療其他呼吸疾病例如肺炎、支氣管炎、COPD(慢性阻塞性肺疾患)、哮喘和囊性纖維化病以及用于治療漿液性中耳炎(膠耳)。
下列實施例詳細地說明本發明。
實施例
實施例1?多肽SP?C33(Leu)31和SP?C33的合成與純化
多肽SP?C33(Leu)31通過基于Fmoc化學和連續TFA裂解的標準SPPS(固相肽合成)方法制備。
共得到186.0g的SP?C33(Leu)31粗品。
使物質經歷逆流分配法(CCD)純化多肽,以H2O/n?BuOH/AcOEt/AcOH4:1:4:1為雙相溶劑系統。
這次純化得到78.9g純度>60%的SP?C33(Leu)31。
最終的純化使用制備性HPLC實現,以在50mm×300mm鋼柱中的PLRP?S為固定相,在75分鐘內使用25%B到100%B的線性梯度。流動相由緩沖液A=含有0.1%TFA的ACN/H2O1:4和緩沖液B=含有0.1%TFA的IPA組成。
純化的多肽溶解于90%AcOH中,經過裝填Dowex離子交換樹脂(醋酸鹽形式)的柱子,經過冷凍干燥,得到5.8g(=5.4%)醋酸鹽形式的最終產品。
多肽SP?C33以類似的方式制備。
符號表

實施例2?多肽ox Mini?B(Leu)和ox Mini?B的合成與純化
多肽ox Mini?B(Leu)通過基于Fmoc化學和連續TFA裂解的標準SPPS(固相肽合成)方法制備。
多肽粗品通過使用TFA系統的制備性HPLC純化,通過冷凍干燥分離。
通過純化肽的空氣氧化得到在Cys1和Cys33之間形成二硫鍵的單環序列。單環肽通過使用TFA系統的制備性HPLC純化,通過冷凍干燥分離。
Cys4和Cys27之間的第二個二硫鍵通過使用碘來形成。
氧化以后,產品通過使用TFA系統的制備性HPLC純化,通過冷凍干燥分離。分離得到1.12g(=1.7%)純度>89%的最終化合物。
多肽ox Mini?B以類似的方式制備。
實施例3?基于ox Mini?B和SP?C33的重組表面活性劑的體內實驗
表面活性劑制劑的實驗以早產的新生家兔進行,其通過在妊娠期第27天的子宮切除術得到。實驗不使用呼氣末期正壓(PEEP)。
作為SP?C的類似物,使用根據實施例1制備的、被稱為SP?C33的多肽。
作為SP?B蛋白的類似物,使用根據實施例2制備的氧化Mini?B(ox Mini?B)。
動物在出生后就以包含脂質載體,DPPC:POPG的重量比為68:31w/w的磷脂混合物的重組表面活性制劑處理。磷脂與2或4%重量比的SPC?33,2%重量比的ox Mini?B或2%重量比的SPC?33加上2%重量比的ox Mini?B混合。
動物接受相同劑量的作為陽性對照,以未接受處理的同窩仔作為陰性對照。
所有的表面活性劑制劑都以80mg/ml的濃度和2.5ml/kg的標準劑量給藥。
未發育成熟的新生家兔使用標準化序列的峰值吹入壓力進行平行通氣。為了打開肺,初始壓力被設定為35cm水柱,持續1min,經過該募集操作后,壓力降至25cm水柱,持續15min,并且進一步為20和15cm水柱。最后,壓力再次升至25cm水柱,持續5min,之后肺再以氮氣額外通氣5min,然后進行氣體容量的測量。
以ml/kg表示的肺氣體容量和潮氣量都被測量,結果以中位數的形式分別記錄在圖3和圖4中。
通過圖3可以看出,使用含2%重量比的ox Mini?B的重組表面活性制劑治療的動物與接受2%重量比的SP?C33的動物相比(約2ml/kg vs約4ml/kg),具有更低的肺氣體容量。
將2%重量比的ox Mini?B加入SP?C33產生了比任何肽單用(約8ml/kg vs約6ml/kg)都明顯大得多的肺氣體容量的增加。
如圖4所示,發現了潮氣量相似的趨勢,給予肽的組合以后,觀察到了與給予取得的效果相當或甚至稍好的改善。
還發現,SP?C33含量從重量比2%到4%的增加沒有增加肺氣體容量,這說明呼氣末期肺泡中磷脂膜的穩定效果與ox Mini?B的加入有關。
上述結果證明本發明的重組表面活性劑能夠以比只含有一個SP?C蛋白類似物或一個SP?B蛋白類似物的重組表面活性劑更好的方式穩定呼氣末期肺泡中的磷脂膜。
此外,請求保護的重組表面活性劑制劑被證明將潮氣量表示的呼吸功能改善至與使用修飾的天然表面活性劑取得的效果相當或甚至稍好的程度。

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具有 改進 性質 重組 表面活性劑
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