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一種海洋芽孢桿菌及其產生的具有抗腫瘤活性的多肽.pdf

摘要
申請專利號:

CN201310128152.5

申請日:

2013.04.12

公開號:

CN103224898B

公開日:

2014.10.29

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 1/20申請日:20130412|||公開
IPC分類號: C12N1/20; C07K7/06; C12P21/02; C07K1/36; C07K1/34; C07K1/18; C07K1/16; A61K38/08; A61P35/00; C12R1/07(2006.01)N 主分類號: C12N1/20
申請人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
發明人: 鄭蘭紅; 孫謐; 鄭媛; 王偉; 盛軍; 紀曉峰; 郝建華
地址: 266071 山東省青島市市南區南京路106號
優先權: 2013.03.05 CN 201310069395.6
專利代理機構: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350 代理人: 湯東鳳
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310128152.5

授權公告號:

103224898B||||||

法律狀態公告日:

2014.10.29|||2013.08.28|||2013.07.31

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及海洋芽孢桿菌及其產生的具有抗腫瘤活性的多肽,該菌株保藏在中國武漢典型培養物保藏中心,保藏號為CCTCC?M2013063,從該菌株發酵產物中獲得一種新型的具有抗腫瘤活性的海洋芽孢桿菌多肽;通過MTT法,發現該多肽對人肝癌細胞BEL-7402、人乳腺癌細胞MCF-7、人膠質瘤細胞U251、人非小細胞肺癌細胞A549等腫瘤細胞均具有顯著增殖抑制作用,對人成纖維細胞HFL1細胞毒相對較小,可以在治療人肝癌、膠質瘤、肺癌、乳腺癌的藥物中進行應用。

權利要求書

權利要求書
1.   一種海洋芽孢桿菌,其特征在于它是從海水中培養分離得到,能產新型抗腫瘤物質,該菌株命名為海洋芽孢桿菌N16(Bacillus sp.N16),該海洋芽孢桿菌N16于2013年3月4日保藏于中國武漢典型培養物保藏中心,保藏號為CCTCC M 2013063。

2.   本發明還提供一種具有抗腫瘤活性的海洋芽孢桿菌N16多肽,該多肽分子量為1015Da,由9個氨基酸組成,氨基酸序列為Arg?Cys?Phe?Ser?Ile?Met?Ser?Asp?Arg。

3.   本發明還提供一種海洋芽孢桿菌N16多肽的篩選方法,其步驟為:
(1)發酵培養
將海洋芽孢桿菌N16發酵,發酵條件:發酵液中各成分的終濃度為牛肉膏4?6g/L、蛋白胨8?12g/L、氯化鈉4?7g/L、pH7.0?7.6,滅菌1.05kg/cm2,20?35min,150?250r/min、25℃的條件下在旋轉搖床中培養20?33h;
(2)超濾分離
將海洋芽孢桿菌N16的發酵液,分批次離心,8000?10000g,5?10min,收集上清液,用分子量為0.3kDa、5kDa和50kDa的超濾膜超濾,獲得分子量0.3?5kDa和5?50kDa的不同組分,檢測各組分的抗腫瘤活性,結果表明分子量0.3?5kDa組分的抗腫瘤活性最佳;
(3)二乙氨乙基,簡稱DEAE,FF陰離子交換層析
將超濾獲得的具有最佳抗腫瘤活性的組分,過DEAE FF陰離子交換層析預裝柱,上樣緩沖液為3?6mmol/L pH8.0?9.5三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液,每次上樣量為5?20ml,洗脫液為含0.5?2mol/L NaCl的3?6mmol/L pH8.0?9.5 Tris?HCl,洗脫液以0?100%(v/v)的濃度進行梯度洗脫,流速為3?6mL/min,檢測波長為280nm,收集各峰,檢測各峰組分的抗腫瘤活性,將具有較好抗腫瘤活性峰的組分脫鹽后真空冷凍干燥保存;
(4)Superdex30凝膠過濾層析
取DEAE收集的具有較好抗腫瘤活性峰的組分,過Superdex30凝膠過濾預裝柱,每次上樣量為1?10ml,流動相為超純水,流速為1?5ml/min,收集各峰,檢測各峰組分的抗腫瘤活性,將具有較好抗腫瘤活性峰的組分脫鹽后真空冷凍干燥保存,即為海洋芽孢桿菌N16多肽。

4.   根據權利要求3所述的一種海洋芽孢桿菌N16多肽的篩選方法,其特征在于所述的抗腫瘤活性的檢測方法為以肝癌細胞BEL?7402為靶細胞,采用MTT法追蹤抗腫瘤活性組分。

5.   根據權利要求4所述的一種海洋芽孢桿菌N16多肽的篩選方法,其特征在于所述的MTT法:取對數生長期的肝癌細胞BEL?7402,用胰酶消化后,以4×104個/孔的密度接種于96孔板中,每孔180μL,在37℃,培養24h,然后加樣,樣品溶液應先經過微孔濾膜過濾除菌,用培養液將樣品稀釋成5個濃度梯度,每孔加入20μL,4個平行孔,置于細胞培養箱中繼續培養48h,然后,加入5mg/mL MTT 20μL,置CO2培養箱37℃培養4h;棄除孔中培養液,然后每孔加入DMSO 150μL,37℃恒溫振蕩30min以充分溶解甲瓚結晶,酶標儀檢測各孔在570nm波長處吸光度值,實驗至少重復3次;細胞抑制率=[(A對照?A樣品)/A對照]×100%,其中A為吸光度值;采用Excel分析軟件計算半數抑制濃度IC50。

6.   根據權利要求3所述的一種海洋芽孢桿菌N16多肽的篩選方法,其特征在于上述步驟(3)中的洗脫液中NaCl的濃度為1mol/L。

7.   根據權利要求3所述的一種海洋芽孢桿菌N16多肽的篩選方法,其特征在于上述步驟(3)中的洗脫液的流速為5.0mL/min,每次上樣量為10mL。

8.   根據權利要求3所述的一種海洋芽孢桿菌N16多肽的篩選方法,其特征在于上述步驟(4)中每次上樣量為5mL,流動相為超純水,流速為2.6mL/min。

9.   本發明還提供一種抗腫瘤藥物,該藥物包含海洋芽孢桿菌N16多肽。

10.   本發明還提供一種海洋芽孢桿菌N16多肽在腫瘤治療藥物中的應用。

說明書

說明書一種海洋芽孢桿菌及其產生的具有抗腫瘤活性的多肽 
技術領域
本發明屬于海洋微生物領域,具體地涉及一種生產抗腫瘤活性多肽的海洋芽孢桿菌及其產生的具有抗腫瘤活性的多肽。 
背景技術
當今社會,惡性腫瘤嚴重威脅著人類的生命和健康,是人類社會的第一殺手。臨床上惡性腫瘤治療手段多是采用綜合療法,以手術切除、放療、化療和免疫治療相結合。目前已使用的抗腫瘤藥物雖對大多數腫瘤有一定療效,但仍存在著治療有效率低、選擇性差、毒副作用明顯、易產生細胞耐藥等問題。因此,尋找高效、低毒、作用靶點明確的抗腫瘤藥物仍是生物、醫學科研領域的研究熱點。 
由于海洋獨特的地理、氣候及環境特點,海洋生物具有的新穎性與多樣性,在科學研究、應用開發等方面都具有重要價值。海洋因此被認為是個潛在、重要的生物資源庫,可能是產生新型生物活性物質和先導化合物的潛在種源地,將會給新型天然藥物的篩選與發現帶來新的機遇與突破。海洋微生物蘊含豐富的結構新穎的抗腫瘤代謝產物,它們多為生物堿類、萜類、大環內酯類化合物,主要來源于海洋放線菌和海洋真菌。但是來源于海洋細菌的抗腫瘤先導化合物研究的相對較少,有待于在這方面做深入的研究。 
發明內容
本發明的要解決的技術問題是提供一種產抗腫瘤活性物質的海洋芽孢桿菌N16(Bacillus sp.N16);該菌株能夠產生具有抗腫瘤活性的多肽。 
一種海洋芽孢桿菌,是從海水中培養分離得到產新型抗腫瘤物質的海洋芽孢桿菌,命名為海洋芽孢桿菌N16(Bacillus sp.N16),該海洋芽孢桿菌N16于2013年3月4日保藏于中國武漢典型培養物保藏中心,保藏號為CCTCC M 2013063。 
本發明還提供一種具有抗腫瘤活性的海洋芽孢桿菌N16多肽,該多肽分子量為1015Da,由9個氨基酸組成,氨基酸序列為Arg?Cys?Phe?Ser?Ile?Met?Ser?Asp?Arg。 
本發明還提供一種海洋芽孢桿菌N16多肽的篩選方法,其步驟為: 
(1)發酵培養 
將海洋芽孢桿菌N16發酵,發酵條件:發酵液中各成分的終濃度為牛肉膏4?6g/L、蛋白胨8?12g/L、氯化鈉4?7g/L、pH7.0?7.6,滅菌1.05kg/cm2,20?35min,150?250r/min、25℃的條件下在旋轉搖床中培養20?33h; 
(2)超濾分離 
將海洋芽孢桿菌N16的發酵液,分批次離心,8000?10000g,5?10min,收集上清液,用分子量為0.3kDa、5kDa和50kDa的超濾膜超濾,獲得分子量0.3?5kDa和5?50kDa的不同組分,檢測各組分的抗腫瘤活性,結果表明分子量0.3?5kDa組分的抗腫瘤活性最佳; 
(3)二乙氨乙基(DEAE)FF陰離子交換層析 
將超濾獲得的具有最佳抗腫瘤活性的組分,過DEAE FF陰離子交換層析預裝柱,上樣緩沖液為3?6mmol/L pH8.0?9.5三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris?HCl)緩沖液,每次上樣量為5?20ml,洗脫液為含0.5?2mol/L NaCl的3?6mmol/L pH8.0?9.5 Tris?HCl,洗脫液以0?100%(v/v)的濃度進行梯度洗脫,流速為3?6mL/min,檢測波長為280nm,收集各峰,檢測各峰組分的抗腫瘤活性,將具有較好抗腫瘤活性峰的組分脫鹽后真空冷凍干燥保存; 
(4)Superdex30凝膠過濾層析 
取DEAE收集的具有較好抗腫瘤活性峰的組分,過Superdex30凝膠過濾預裝柱,每次上樣量為1?10ml,流動相為超純水,流速為1?5ml/min,收集各峰,檢測各峰組分的抗腫瘤活性,將具有較好抗腫瘤活性峰的組分脫鹽后真空冷凍干燥保存,即為海洋芽孢桿菌N16多肽。 
進一步,所述的抗腫瘤活性的檢測方法為以肝癌細胞BEL?7402為靶細胞,采用MTT法追蹤抗腫瘤活性組分。 
進一步,所述的MTT法:取對數生長期的肝癌細胞BEL?7402,用胰酶消化后,以4×104個/孔的密度接種于96孔板中,每孔180μL,在37℃,培養24h,然后加樣,樣品溶液應先經過微孔濾膜過濾除菌,用培養液將樣品稀釋成5個濃度梯度,每孔加入20μL,4個平行孔,置于細胞培養箱中繼續培養48h,然后,加入5mg/mL MTT 20μL,置CO2培養箱37℃培養4h;棄除孔中培養液,然后每孔加入DMSO 150μL,37℃恒溫振蕩30min以充分溶解甲瓚結晶,酶標儀檢測各孔在570nm波長處吸光度值,實驗至少重復3次;細胞抑制率=[(A對照?A樣品)/A對照]×100%,其中A為吸光度值;采用Excel分析軟件計算半數抑制濃度IC50。 
進一步,上述步驟(3)中的洗脫液中NaCl的濃度優選為1mol/L。 
進一步,上述步驟(3)中的洗脫液的流速優選為5.0mL/min。 
進一步,上述步驟(3)中每次上樣量優選為10mL。 
進一步,上述步驟(4)中每次上樣量優選為5mL。 
進一步,上述步驟(4)中流動相為超純水,流速優選為2.6mL/min。 
本發明還提供一種抗腫瘤藥物,該藥物包含海洋芽孢桿菌N16多肽。 
本發明還提供一種海洋芽孢桿菌N16多肽在腫瘤治療藥物中的應用。 
本發明與現有技術相比的有益效果: 
該菌株能夠穩定的表達抗腫瘤活性的多肽,該多肽具有較好的酸堿和熱穩定性,對多種腫瘤細胞具有細胞毒性,對人正常細胞的細胞毒相對較小,具有較好的研究和應用價值。 
附圖說明
圖1菌株N16的掃描電子顯微鏡照片 
圖2粗提物的DEAE FF陰離子層析圖譜 
圖3離子交換活性組分的superdex30凝膠過濾層析圖譜 
圖4MALDI?TOF?TOF測定海洋芽孢桿菌多肽的氨基酸序列 
圖5海洋芽孢桿菌N16多肽的對人不同腫瘤細胞和正常細胞的細胞毒 
海洋芽孢桿菌N16,拉丁文名稱為Bacillus sp.N16,于2013年3月4日保藏于武漢市武昌珞珈山武漢大學中國武漢典型培養物保藏中心,保藏號為CCTCC M2013063。 
具體實施方式
下面通過實施例來進一步說明本發明的技術方案,但本發明的保護范圍不受實施例任何形式的限制。并不限于下列實施例: 
實施例1 
海洋芽孢桿菌N16的篩選分離過程 
(1)活性初篩 
分別采用海水基礎培養基2216E和牛肉膏蛋白胨培養基NRG等不同培養基對海水樣品進行選擇性的分離培養,共獲得47株單菌。對這47株微生物發酵產物進行抗腫瘤活性初步篩選,結果發現,對肝癌細胞BEL?7402的抑制率達到60%以上的有1株;抑制率達到50?60%以上的共有1株。 
(2)菌株復篩 
測定上述2種活性菌株發酵液對其他腫瘤細胞,包括人乳腺癌細胞MCF?7、人膠質瘤細胞U251和人非小細胞肺癌細胞A549的增值抑制作用。結果表明,其中有一菌株N16的發酵液對以上腫瘤細胞均具有較好的細胞增殖抑制作用,其中對人乳腺癌細胞MCF?7、人膠質瘤細胞U251和人非小細胞肺癌細胞A549人的抑制率分別為68.1%、59.8%、63.1%。 
實施例2 
海洋芽孢桿菌N16形態特征與生理生化特征 
(1)形態特征 
對菌株進行革蘭氏染色,為革蘭氏陽性菌。菌株N16具有桿菌形態和產芽孢能力這兩種芽孢桿菌屬的重要特征桿菌,采用平皿插片法培養,用掃描電鏡觀察菌株N16的菌體形態,0.8?2.0μm長,0.2?0.6μm寬(圖1)。25℃下,在海水基礎培養基2216E上培養24h后,菌落橢圓形、全緣、扁平,直徑0.5至1.5mm,光滑無光澤,粘液狀外觀,乳白色。 
該菌為好氧菌,在pH值為7.5,培養溫度為25℃,培養基中NaCl6%(w/v)時生長良好。 
(2)生理生化反應特征 
主要根據《普通細菌學方法手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》的方法,測定部分生理生化特征,陰性:氧化酶試驗、精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧、脲酶、明膠酶、色氨酸脫氫酶、吲哚實驗,陽性:硝酸還原、VP實驗、半乳糖式酶、β?半乳糖苷酶、檸檬酸利用、H2S產生;發酵利用:陰性結果,甘露醇、蔗糖、蜜二糖、肌醇、山梨醇,陽性結果,葡萄糖、阿拉伯糖;同化實驗為陰性:甘露糖、甘露醇、N?乙酰?葡萄糖胺、麥芽糖、葡萄糖酸鹽、蘋果酸、檸檬酸。 
實施例3 
制備小量的細菌基因組DNA,通過PCR擴增16S rDNA,采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物為單一條帶后直接送上海生工測序。測兩個反應,測通。序列全長為1542bp,16S rDNA序列見序列表。 
將該16SrDNA序列在NCBI網站進行BLAST比對,進行同源序列檢索,結果發現該菌為芽孢桿菌屬(Bacillus),命名為海洋芽孢桿菌N16(Bacillus sp.N16)。該海洋芽孢桿菌N16于2013年3月4日保藏于中國武漢典型培養物保藏中心,保藏號為CCTCC M 2013063。16S rDNA基因序列在某些位點發生突變的幾率有所不同,但在種、屬水平上表現出結構和功能的保守性,有“細菌化石”之譽,是生物進化史的計時器。采用16S rDNA作為分子指標,可以實現對微生物進行快速、準確、微量、簡便的分類鑒定。 
實施例4 
具有抗腫瘤活性的海洋芽孢桿菌N16多肽的制備 
(1)發酵培養 
取斜面保存的海洋芽孢桿菌N16菌株一環接種于種子發酵液,25℃,200r/min培養24h,發酵液4000r/min離心20min,所得上清液即為含抗腫瘤多肽的粗液。發酵液中各成分的終濃度為:牛肉膏5g/L,蛋白胨10g/L,NaCl5g/L, pH 7.5。 
(2)超濾分離 
將菌株發酵液,分批次離心,8000g,7min,共收集約5000mL上清液,用分子量為0.3kDa、5kDa和50kDa的超濾膜超濾,獲得分子量0.3?5kDa和5?50kDa的不同組分,檢測各組分的抗腫瘤活性,結果表明分子量0.3?5kDa的組分抗腫瘤活性最佳。 
(3)二乙氨乙基(DEAE)FF陰離子交換層析 
將超濾獲得的具有最佳抗腫瘤活性組分,過DEAE FF陰離子交換層析預裝柱,上樣緩沖液為4mmol/L pH8.5 Tris?HCl緩沖液,每次上樣量為10mL,洗脫液為含1mol/L NaCl的4mmol/L pH8.5 Tris?HCl,洗脫液先依次以3%(v/v)、6%(v/v)、9%(v/v)、12%(v/v)、24%(v/v)、100%(v/v)的濃度進行梯度洗脫,流速為5mL/min,檢測波長為280nm,層析圖譜(圖2),收集各峰,檢測各峰組分的抗腫瘤活性,結果表明峰2組分具有最佳抗腫瘤活性,把峰2組分脫鹽后真空冷凍干燥保存。 
(4)Superdex30凝膠過濾層析 
取上述步驟的最佳抗腫瘤活性組分,過Superdex30凝膠過濾預裝柱,每次上樣量為5mL,流動相為超純水,流速為2.6mL/min,收集各峰,層析圖譜(圖3),檢測各峰組分的抗腫瘤活性,結果表明峰8組分具有抗腫瘤活性,把峰8組分脫鹽后真空冷凍干燥保存,即為海洋芽孢桿菌N16多肽。 
所述的各峰組分抗腫瘤活性分析為以肝癌細胞BEL?7402為靶細胞,采用MTT法追蹤抗腫瘤活性組分。 
MTT法:取對數生長期的肝癌細胞BEL?7402,用胰酶消化后,以4×104個/孔的密度接種于96孔板中,每孔180μL,在37℃,培養24h。然后加樣,樣品溶液應先經過微孔濾膜過濾除菌,用培養液將樣品稀釋成5個濃度梯度,每孔加入20μL,4個平行孔,置于細胞培養箱中繼續培養48h。然后,加入MTT(5mg/mL)20μL,置CO2培養箱37℃培養4h。棄除孔中培養液,然后每孔加入DMSO 150μL,37℃恒溫振蕩30min以充分溶解甲瓚結晶。酶標儀檢 測各孔在570nm波長處吸光度(A)值,實驗至少重復3次。細胞抑制率=[(A對照?A樣品)/A對照]×100%。采用Excel分析軟件計算半數抑制濃度IC50。 
實施例5 
海洋芽孢桿菌N16多肽分子量測定及氨基酸分析: 
將通過以上流程制備的圖3中的峰8抗腫瘤活性組分進行高壓液相分析,結果為單一峰。用串聯飛行時間質譜儀(Proteomics Analyzer,TOF/TOF TM)進行質譜分析,采用正離子模式和自動獲取數據模式采集數據。進行質譜(Mass Specrometry,MS)分析,檢測到活性組分的分子量約為1015Da,由9個氨基酸組成。進一步經MS/MS分析,De Novo Explorer從頭測序,測序結果見圖4,得到海洋芽孢桿菌N16多肽的氨基酸序列為Arg?Cys?Phe?Ser?Ile?Met?Ser?Asp?Arg。在NCBI網站進行protein to protein BLAST比對,沒有檢測到與其相匹配的活性肽;由此說明,海洋芽孢桿菌N16產生的該多肽為一種新的抗腫瘤活性多肽,命名為海洋芽孢桿菌N16多肽。 
實施例6 
海洋芽孢桿菌N16多肽對不同腫瘤細胞和正常細胞的細胞毒。 
分別以人肝癌細胞BEL?7402、人膠質瘤細胞U251、人非小細胞肺癌細胞A549和人乳腺癌細胞MCF?7等腫瘤細胞為靶細胞,采用MTT法,檢測海洋芽孢桿菌N16多肽對各種腫瘤細胞具有增殖抑制作用,其中,對BEL?7402的IC50值為5.96μmol/L,對人肺成纖維細胞HFL1的細胞毒性相對較小,如圖5所示。因此,本發明的海洋芽孢桿菌N16多肽可以在治療人肝癌、膠質瘤、肺癌、乳腺癌的藥物中進行應用。 

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一種 海洋 芽孢 桿菌 及其 產生 具有 腫瘤 活性 多肽
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