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一種用于保存CIK細胞的凍存液及其應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201310159574.9

申請日:

2013.05.03

公開號:

CN103210903B

公開日:

2014.10.29

當前法律狀態:

終止

有效性:

無權

法律詳情: 未繳年費專利權終止IPC(主分類):A01N 1/02申請日:20130503授權公告日:20141029終止日期:20160503|||著錄事項變更IPC(主分類):A01N 1/02變更事項:發明人變更前:官立萍 姬明麗 千智斌 李振想 武文杰 李霞飛變更后:姬明麗 官立萍 王煜霞 李振想 秦朝 司艷莉 李霞飛|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A01N 1/02申請日:20130503|||公開
IPC分類號: A01N1/02 主分類號: A01N1/02
申請人: 新鄉醫學院
發明人: 官立萍; 姬明麗; 千智斌; 李振想; 武文杰; 李霞飛
地址: 453003 河南省新鄉市紅旗區金穗大道601號
優先權:
專利代理機構: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245 代理人: 關暢
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310159574.9

授權公告號:

||||||103210903B||||||

法律狀態公告日:

2017.06.20|||2015.05.20|||2014.10.29|||2013.08.21|||2013.07.24

法律狀態類型:

專利權的終止|||著錄事項變更|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種用于保存CIK細胞的凍存液及其應用。本發明提供的用于保存CIK細胞的凍存液,是按照如下方法制備得到的:在淋巴細胞無血清培養基中加入二甲基亞砜和右旋糖苷,使二甲基亞砜的體積百分含量為5-15%,使右旋糖苷的體積百分含量為5-15%。與凍存前的細胞相比,采用本發明提供的凍存液凍存后的細胞:(1)細胞形態無明顯差異;(2)免疫表型(CD3+CD56+和CD8+)無明顯差異;(3)細胞增殖活力、細胞殺傷活性無明顯差異。

權利要求書

權利要求書
1.   用于保存CIK細胞的凍存液,是按照如下方法制備得到的:在淋巴細胞無血清培養基中加入二甲基亞砜和右旋糖苷,使二甲基亞砜的體積百分含量為5?15%,使右旋糖苷的體積百分含量為5?15%。

2.   如權利要求1所述的凍存液,其特征在于:所述二甲基亞砜的體積百分含量為10%,所述右旋糖苷的體積百分含量為10%。

3.   權利要求1或2所述凍存液在保存CIK細胞中的應用。

4.   一種保存CIK細胞的方法,包括如下步驟:用權利要求1或2所述的凍存液懸浮所述CIK細胞,得到細胞懸液,然后冷凍保存所述細胞懸液。

說明書

說明書一種用于保存CIK細胞的凍存液及其應用
技術領域
本發明涉及一種用于保存CIK細胞的凍存液及其應用。
背景技術
CIK細胞,即細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine?induced killer cells),是一種非MHC限制性的高效溶腫瘤細胞毒性T淋巴細胞,在外周血淋巴細胞中的比例為1%?5%。1991年Schmidt?Wolf等首先報道了一類由多種細胞因子誘導的殺傷細胞,即CIK細胞。
目前,免疫細胞過繼療法已成為放、化療后對腫瘤患者進行輔助治療的重要手段之一,CIK細胞是過繼治療的主力軍。通常采用自體外周血制備CIK,一方面CIK細胞數量不足,另一方面會加重患者體質虛弱,使機體處于免疫系統薄弱時期,易引起感染。臍血來源豐富,細胞增殖能力強,是較為理想的CIK細胞來源。因此,CIK細胞的保存技術很值得研究。CIK細胞培養周期較長,易污染,不利于其臨床應用,因此尋找一種CIK細胞保存方法尤為重要。
人類的CIK細胞是一群異質性細胞群,已有研究證實CD3+CD56+細胞和CD8+殺傷T細胞是構成CIK細胞強大殺瘤活性的主要效應細胞。
發明內容
本發明的目的是提供一種用于保存CIK細胞的凍存液及其應用。
本發明提供的用于保存CIK細胞的凍存液,是按照如下方法制備得到的:在淋巴細胞無血清培養基中加入二甲基亞砜和右旋糖苷,使二甲基亞砜的體積百分含量為5?15%(如5?10%、10?15%、5%、10%或15%),使右旋糖苷的體積百分含量為5?15%(如5?10%、10?15%、5%、10%或15%)。
所述淋巴細胞無血清培養基具體可為GT?T551,具體可為購自日本TAKARA BIO INC貨號為GT?T551的GT?T551培養液。
本發明提供的凍存液中,添加了右旋糖苷作為細胞外的非滲透性保護物質,在冷凍過程中可減少細胞內冰晶的形成,復蘇時還可以減輕由于滲透壓的改變而引起的細胞腫脹。本發明發現,右旋糖苷與DMSO的聯合使用能發揮疊加或協調低溫保護作用。右旋糖苷輸注在臨床上原本就被用于擴充血容量,且目前未發現對人體有副作用。
本發明還保護所述凍存液在保存CIK細胞中的應用。
本發明還保護一種保存CIK細胞的方法,包括如下步驟:用所述凍存液懸浮CIK細胞,得到細胞懸液,然后冷凍保存所述細胞懸液。
所述方法中,所述細胞懸液中的細胞濃度可為108個細胞/ml的細胞懸液。
所述冷凍保存的步驟可為:將所述細胞懸液采用程控降溫儀降溫后置于液氮中保存。所述程控降溫儀的降溫參數可為:4℃~?40℃,1~2℃/每分鐘;?40℃~?80℃,10℃/每分鐘。在液氮中保存的時間具體可為180天以內。
與凍存前的細胞相比,采用本發明提供的凍存液凍存后的細胞:(1)細胞形態無明顯差異;(2)免疫表型(CD3+CD56+和CD8+)無明顯差異;(3)細胞增殖活力、細胞殺傷活性無明顯差異。結果表明,本發明提供的凍存液顯著優于傳統凍存液。
附圖說明
圖1為實施例2中凍存前的細胞和復蘇后的細胞在倒置顯微鏡下的照片(×200)。
圖2為實施例2中各組CIK細胞的一次流式檢測結果。
圖3為實施例2中各組細胞的生長曲線。
圖4為實施例2中各組CIK細胞的細胞毒性比較。
圖5為實施例3中凍存前的細胞和復蘇后的細胞在倒置顯微鏡下的照片(×200)。
圖6為實施例3中各組CIK細胞的一次流式檢測結果。
圖7為實施例3中各組細胞的生長曲線。
圖8為實施例3中各組CIK細胞的細胞毒性比較。
具體實施方式
以下的實施例便于更好地理解本發明,但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法,如無特殊說明,均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料,如無特殊說明,均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗,均設置三次重復實驗,結果取平均值。實施例中的統計學方法均為用SPSS10.0軟件進行t檢驗和方差分析。
K562細胞(人慢性髓系白血病細胞):購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心,資源編號:3111C0001CCC000039。
Ficoll淋巴細胞分離液:美國Sigma公司,貨號:10771。淋巴細胞無血清培養基,又稱GT?T551培養液:日本TAKARA BIO INC,貨號:GT?T551。細胞因子IFN?γ:Gibco公司,貨號:PHC4033。細胞因子IL?2:,Gibco公司,貨號:CTP0021。CD3單抗(CD3mAb):Gibco公司,貨號:MHCD0300。FITC標記的CD3抗體、PE標記的CD56抗體、PE標記的CD8抗體、FITC標記的IgG1抗體和PE標記的IgG1抗體均購自美國beckman coulter。
二甲基亞砜(DMSO):Gibco公司,貨號:C6295。右旋糖苷(Dextran;分子量為40000):山東齊都藥業有限公司,批號:1012030406。
實施例1、細胞凍存液的制備
細胞凍存液甲的制備方法:在GT?T551細胞培養液中加入二甲基亞砜和右旋糖苷,使二甲基亞砜的濃度為10%(體積比),使右旋糖苷的濃度為10%(體積比)。
細胞凍存液乙的制備方法:在GT?T551細胞培養液中加入二甲基亞砜和右旋糖苷,使二甲基亞砜的濃度為5%(體積比),使右旋糖苷的濃度為15%(體積比)。
細胞凍存液丙的制備方法:在GT?T551細胞培養液中加入二甲基亞砜和右旋糖苷,使二甲基亞砜的濃度為15%(體積比),使右旋糖苷的濃度為5%(體積比)。
細胞凍存液丁(傳統的細胞凍存液):在GT?T551細胞培養液中加入二甲基亞砜和人血白蛋白,使二甲基亞砜的濃度為15%(體積比),使人血白蛋白的濃度為10%(體積比)。
實施例2、CIK細胞的獲得和凍存
一、CIK細胞的獲得
臍帶血:獲自新鄉醫學院足月健康胎兒,征得家屬同意。
1、采用Ficoll淋巴細胞分離液(密度梯度離心法)從臍帶血中分離單個核細胞。
2、將步驟1得到的單個核細胞在100ml含有1000μg/ml IFN?γ和1%(體積比)自體血漿(即用于分離核細胞的臍帶血血漿)的GT?T551細胞培養液中37℃靜置培養24小時。
3、在完成步驟2的培養體系中加入CD3單抗和細胞因子IL?2,使CD3單抗的濃度為75ng/ml、細胞因子IL?2的濃度為1000U/ml,37℃靜置培養24小時。
4、在完成步驟3的培養體系中加入300ml含有1000U/ml細胞因子IL?2的GT?T551細胞培養液,之后每48小時加入200ml含有1000U/ml細胞因子IL?2的GT?T551細胞培養液,培養條件為37℃靜置培養。
二、CIK細胞的凍存
1、步驟一中,從步驟2接種單個核細胞開始計時,每24小時為1天,14天后收集CIK細胞(即凍存前的細胞)。
2、分組凍存處理
實驗組甲:用細胞凍存液甲懸浮步驟1得到的CIK細胞,得到108個細胞/ml的細胞懸液,每個凍存管加入1ml細胞懸液。
實驗組乙:用細胞凍存液乙懸浮步驟1得到的CIK細胞,得到108個細胞/ml的細胞懸液,每個凍存管加入1ml細胞懸液。
實驗組丙:用細胞凍存液丙懸浮步驟1得到的CIK細胞,得到108個細胞/ml的細胞懸液,每個凍存管加入1ml細胞懸液。
對照組:用細胞凍存液丁懸浮步驟1得到的CIK細胞,得到108個細胞/ml的細胞懸液,每個凍存管加入1ml細胞懸液。
3、將步驟2得到的各個凍存管放置于冷凍盒中進行冷凍(程控降溫儀降溫速率為:4℃~?40℃,1~2℃/每分鐘;?40℃~?80℃,10℃/每分鐘),然后從冷凍盒中取出冷凍管迅速置于液氮中。
三、CIK細胞的復蘇
1、迅速取出步驟二中在液氮中保存180天的凍存管,立即投入37℃?40℃水浴中,振蕩至完全溶解(20?40秒),用pH7.2、0.01M的PBS緩沖液洗滌凍存管中的CIK細胞。
2、將步驟1得到的CIK細胞接種至含有1000U/ml細胞因子IL?2和1%(體積比)自體血漿的GT?T551細胞培養液中,37℃靜置培養。
四、形態觀察
1、步驟三的2中,從接種CIK細胞開始計時,24小時后收集CIK細胞(即復蘇后細胞)。
2、將凍存前的細胞和復蘇后的細胞在倒置顯微鏡下進行觀察,照片見圖1。
圖1中,A為凍存前的細胞,B為實驗組甲復蘇后的細胞,C為對照組復蘇后的細胞。實驗組乙復蘇后的細胞、實驗組丙復蘇后的細胞的形態與實驗組甲復蘇后的細胞的形態一致。結果表明,實驗組復蘇后的細胞與凍存前的細胞在形態學上無明顯差異,呈懸浮狀、圓形、光澤較亮,有些呈克隆團。
五、免疫表型檢測
1、步驟三的2中,從接種CIK細胞開始計時,24小時后收集CIK細胞(即復蘇后細胞)。
2、將凍存前的細胞和復蘇后的細胞分別進行如下操作:用pH7.2、0.01M的PBS緩沖液懸浮細胞,得到細胞濃度為106個/ml的細胞懸液;在細胞懸液中加入FITC標記的CD3抗體和PE標記的CD56抗體,或在細胞懸液中加入FITC標記的CD3抗體和PE標記的CD8抗體,或在細胞懸液中加入FITC標記的IgG1抗體和PE標記的IgG1抗體,室溫避光孵育20min后用流式細胞儀檢測。
結果見圖2和表1。
表1各組CIK細胞的流式檢測結果?具有相應免疫表型的細胞的比例(%)
(三次重復實驗的平均值)
 CD3+CD56+CD3+CD8+凍存前的細胞19.1±0.2144.1±4.28實驗組甲復蘇后的細胞19.1±0.1041.1±2.08實驗組乙復蘇后的細胞19.2±0.7942.6±0.62實驗組丙復蘇后的細胞19.6±0.8542.9±2.45對照組復蘇后的細胞19.1±1.2443.6±3.95
結果表明,凍存前的細胞與凍存后復蘇的細胞的免疫表型無顯著差異,均具有CIK細胞的免疫表型。
六、細胞增殖力檢測
1、步驟三的2中,從接種CIK細胞開始計時,每24小時取樣計數細胞數量并繪制細胞生長曲線。
2、將凍存前的細胞接種至含有1000U/ml細胞因子IL?2和1%(體積比)自體血漿的GT?T551細胞培養液中,37℃靜置培養,每24小時取樣計數細胞數量并繪制細胞生長曲線。
細胞生長曲線見圖3(每24小時為1天)。
結果表明,實驗組甲的細胞的增殖活性、實驗組乙的細胞的增殖活性和實驗組丙的細胞的增殖活性均顯著優于對照組的細胞。凍存前的細胞在培養21天后進入平臺期。實驗組甲的細胞在培養8?9天后進行平臺期。對照組的細胞在培養5?6天后進入平臺期,即對照組細胞快速增殖的時期較實驗組短。
七、細胞殺傷活性檢測
1、步驟三的2中,從接種CIK細胞開始計時,24小時后收集CIK細胞(即復蘇后細胞)。
2、采用乳酸脫氫酶(LDH)分析法,以K562細胞為靶細胞,分別檢測效應細胞(凍存前的細胞或復蘇后的細胞)的殺傷活力。
效應細胞與靶細胞分別按照5:1、10:1、20:1和40:1的個數比加入96孔板,靶細胞數量為1×104個細胞/孔。每個比例設4個平行孔,每孔總體積為200ul。效應細胞與靶細胞采用的培養基均為RPMI1640培養基。37℃靜置培養4小時。采用LDH?Cytotoxicity Colorimetric Assay Kit‖(美國,BioVision,貨號:K313?500),按照試劑盒說明書進行檢測。用酶標儀檢測波長490nm時的光吸收值(A)。
結果見圖4。各組CIK細胞對K562細胞的殺傷活性隨效靶比的增高而增強,實驗組甲復蘇后的細胞組和凍存前的細胞無明顯統計學差異,對照組復蘇后的細胞在不同效靶比時均低于凍存前的細胞,差異有統計學意義。
實施例3、CIK細胞的獲得和凍存
本實施例中采用的CIK細胞購自上海拜力生物血清網。
一、CIK細胞的凍存
同實施例2的步驟二的2。
二、CIK細胞的復蘇
1、同實施例2的步驟三的1。
2、將步驟1得到的CIK細胞接種至含有1000U/ml細胞因子IL?2和1%(體積比)人血漿的GT?T551細胞培養液中,37℃靜置培養。
三、形態觀察
1、步驟二的2中,從接種CIK細胞開始計時,24小時后收集CIK細胞(即復蘇后細胞)。
2、將凍存前的CIK細胞和復蘇后的細胞在倒置顯微鏡下進行觀察,照片見圖5。
圖5中,D為凍存前的細胞,E為實驗組甲復蘇后的細胞,F為對照組復蘇后的細胞。實驗組乙復蘇后的細胞、實驗組丙復蘇后的細胞的形態與實驗組甲復蘇后的細胞的形態一致。結果表明,實驗組復蘇后的細胞與凍存前的細胞在形態學上無明顯差異,呈懸浮狀、細胞飽滿、折光性好,有些散在的集落。
四、免疫表型檢測
方法同實施例2的步驟五。
結果見圖6和表2。
表2各組CIK細胞的流式檢測結果(三次重復實驗的平均值)
具有相應免疫表型的細胞的比例(%)CD3+CD56+CD3+CD8+凍存前的細胞19.8±1.1543.23±0.33實驗組甲復蘇后的細胞19.4±0.8942.8±0.89實驗組乙復蘇后的細胞19.1±0.7043.3±0.92實驗組丙復蘇后的細胞19.1±0.9141.6±0.7對照組復蘇后的細胞19.5±0.9742.9±1.82
結果表明,凍存前的細胞與凍存后復蘇的細胞的免疫表型無顯著差異,均具有CIK細胞的免疫表型。
五、細胞增殖力檢測
方法同實施例2的步驟六。
細胞生長曲線見圖7(每24小時為1天)。
結果表明,實驗組甲的細胞的增殖活性、實驗組乙的細胞的增殖活性和實驗組丙的細胞的增殖活性均顯著優于對照組的細胞。凍存前的細胞在培養22天后進入平臺期。實驗組甲的細胞在培養9?10天后進行平臺期。對照組的細胞在培養6?7天后進入平臺期,即對照組細胞快速增殖的時期較實驗組短。
六、細胞殺傷活性檢測
方法同實施例2的步驟七。
結果見圖8。各組CIK細胞對K562細胞的殺傷活性隨效靶比的增高而增強,實驗組甲復蘇后的細胞組和凍存前的細胞無明顯統計學差異,對照組復蘇后的細胞在不同效靶比時均低于凍存前的細胞,差異有統計學意義。

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一種 用于 保存 CIK 細胞 凍存液 及其 應用
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