鬼佬大哥大
  • / 40
  • 下載費用:30 金幣  

一組替諾福韋酯化合物、制備方法及其在抗病毒方面的應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201310134160.0

申請日:

2013.04.17

公開號:

CN103224530B

公開日:

2014.10.29

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 專利權的轉移IPC(主分類):C07F 9/6561登記生效日:20160906變更事項:專利權人變更前權利人:洛陽聚慧醫藥科技有限公司變更后權利人:洛陽聚慧醫藥科技有限公司變更事項:地址變更前權利人:471000 河南省洛陽市西工區九都路58號香榭里陽光小區7號樓24層變更后權利人:471000 河南省洛陽市西工區九都路58號香榭里陽光小區7號樓24層變更事項:專利權人變更后權利人:游國戰 劉洪海|||著錄事項變更號牌文件類型代碼:1602號牌文件序號:101729534912IPC(主分類):C07F 9/6561專利申請號:2013101341600變更事項:發明人變更前:游國戰;劉洪海;楊松峰變更后:游國戰;劉洪海;楊松峰;楊學聰|||專利權的轉移IPC(主分類):C07F 9/6561變更事項:專利權人變更前權利人:洛陽聚慧集團股份有限公司變更后權利人:洛陽聚慧醫藥科技有限公司變更事項:地址變更前權利人:471000 河南省洛陽市西工區九都路58號變更后權利人:471000 河南省洛陽市西工區九都路58號香榭里陽光小區7號樓24層登記生效日:20150723|||專利權人的姓名或者名稱、地址的變更IPC(主分類):C07F 9/6561變更事項:專利權人變更前:洛陽聚慧投資股份有限公司變更后:洛陽聚慧集團股份有限公司變更事項:地址變更前:471000 河南省洛陽市西工區九都路58號變更后:471000 河南省洛陽市西工區九都路58號|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C07F 9/6561申請日:20130417|||公開
IPC分類號: C07F9/6561; A61K31/675; A61P31/18; A61P31/20 主分類號: C07F9/6561
申請人: 洛陽聚慧投資股份有限公司
發明人: 游國戰; 劉洪海; 楊松峰
地址: 471000 河南省洛陽市西工區九都路58號
優先權: 2012.08.13 CN 201210286411.2; 2013.02.06 CN 201310046588.X
專利代理機構: 鄭州科維專利代理有限公司 41102 代理人: 馬忠;王理君
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201310134160.0

授權公告號:

||||||||||||103224530B||||||

法律狀態公告日:

2016.09.28|||2016.03.23|||2015.08.12|||2015.04.29|||2014.10.29|||2013.08.28|||2013.07.31

法律狀態類型:

專利申請權、專利權的轉移|||著錄事項變更|||專利申請權、專利權的轉移|||專利權人的姓名或者名稱、地址的變更|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一組具有抑制HIV-1/HBV病毒復制活性的替諾福韋酯化合物及其藥學上可接受的鹽、制備方法及其藥物用途。該組化合物具有通式I,其中X=H,Y=H;R1=-CH2(CH2)mCH2OCH2(CH2)nCH3,m=0-4,n=10-20;R2,R3,R4分別如說明書中所定義,還公開了含有該組化合物的藥物組合物。實驗證明本發明化合物之一具有的抑制HIV-1病毒復制的活性是陽性對照藥齊多夫定(AZT)的20倍、是目前治療艾滋病最好的藥物:TDF的1000倍、約是處于臨床階段CMX157的9倍,且脂溶性又約是CMX157的2倍的優點,實驗還證明本發明化合物還具有抑制HBV病毒復制的活性,可用于治療艾滋病藥物或乙型肝炎藥物的開發。

權利要求書

權利要求書
1.   具有式I的替諾福韋酯化合物或其藥學上可接受的鹽:


其中:X=H,Y=H;
R1=?CH2(CH2)mCH2OCH2(CH2)nCH3,m=0?4,n=10?20;

R3是氫、C1?12烷基、C2?12烯基、C2?12炔基、C5?6芳基或C5?12芳烷基;
R4是任一天然或可藥用氨基酸的側鏈,并且,條件是當該側鏈含有羧基時,則任選該羧基選用烷基或芳基酯化;
其中:R3是異丙基、R4是甲基的化合物除外;
具有式I的替諾福韋酯化合物藥學上可接受的鹽為式Ⅰa所示:

Ⅰa
其中X,Y,R1,R2與式Ⅰ同;Acid為可與腺嘌呤氨基部分成鹽的藥學上可接受的無機酸或有機酸。

2.   如權利要求1所述的替諾福韋酯化合物或其藥學上可接受的鹽,其中,R3是氫或C1?12烷基,R4是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸或組氨酸的氨基酸側鏈。

3.   如權利要求2所述的替諾福韋酯化合物或其藥學上可接受的鹽,其中,R3是氫、乙基、異丁基、新戊基、正丁基、環己基、甲基、正丙基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、3?甲基己基、正己基、2,2?二甲基戊基、2,3?二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基或正十二烷基,R4是丙氨酸側鏈。

4.   如權利要求3所述的替諾福韋酯化合物或其藥學上可接受的鹽,其特征在于,其中m=0?4,n=10?20;R3為乙基、異丁基、新戊基、正丁基或環己基;或其藥學上可接受的鹽為Acid是硫酸、鹽酸或富馬酸時所成的鹽。

5.   如權利要求3所述的替諾福韋酯化合物或其藥學上可接受的鹽,其特征在于,其中m=1,n=14,R3為乙基、異丁基、新戊基、正丁基、環己基、甲基、正丙基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、3?甲基己基、正己基、2,2?二甲基戊基、2,3?二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基或正十二烷基,具體化合物為下列結構式所示:

或上列各結構式所示化合物分別與Acid為富馬酸時形成的藥學上可接受的鹽。

6.   如權利要求4所述的替諾福韋酯化合物或其藥學上可接受的鹽,其特征在于,其中m=0?4,n=12?16;R3為乙基、異丁基、新戊基、正丁基或環己基;其藥學上可接受的鹽為Acid是硫酸、鹽酸或富馬酸時所成的鹽。

7.   一種制備權利要求1至6所述的替諾福韋酯化合物其及藥學上可接受的鹽的方法,其特征在于,所述方法的合成路線如下:

該制備方法包括如下步驟:
a、用N?甲基吡咯烷酮為溶劑,三乙胺為脫水劑,2,2′?二硫二吡啶、三苯基膦為絡合劑,用替諾福韋與L?丙氨酸酯鹽酸鹽進行脫酸縮合反應,反應過程中反應溫度為65℃?85℃,反應時間為20?26個小時,即得到化合物Ⅱ;
b、用N?甲基吡咯烷酮為溶劑,三乙胺為脫水劑,N,N'?二環己基碳二亞胺為絡合劑,用上述反應中得到的化合物Ⅱ與烷氧烷醇進行脫水縮合反應,反應過程中反應溫為75℃?95℃,反應時間為7?9個小時,得到替諾福韋酯化合物Ⅰ;
c、將替諾福韋酯化合物Ⅰ與等量的Acid溶于乙腈中,回流攪拌1?3小時,室溫下冷卻析晶,濾出析出的固體并用乙醚洗滌即得到替諾福韋酯化合物藥學上可接受的鹽Ⅰa;
其中各符號的定義如權利要求1至6任一項所述。

8.   一種藥物組合物,其特征在于,所述藥物組合物含有治療有效量的權利要求1?6中任一項所述的替諾福韋酯化合物或其藥學上可接受的鹽和一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑。

9.   權利要求1?6中任一項所述的替諾福韋酯化合物或其藥學上可接受的鹽在制備用于預防或治療病毒疾病藥物中的應用。

10.   如權利要求9所述的應用,其特征在于,其中病毒疾病為HIV或HBV感染或HIV與HBV同時感染。

說明書

說明書一組替諾福韋酯化合物、制備方法及其在抗病毒方面的應用 
技術領域:
本發明涉及一組類核苷化合物,尤其涉及一組具有抑制HIV?1病毒復制活性的替諾福韋酯化合物、制備方法及其在抗病毒方面的應用。 
背景技術:
人類在病毒感染性疾病的治療中,病毒耐藥性問題日益突出。與環狀核苷類逆轉錄酶抑制劑相比,非環核苷化合物阿德福韋和替諾福韋在防止病毒耐藥性問題上具有明顯優勢,其對耐環狀核苷類藥物的病毒株有效,本身耐藥發生率低,且毒性相對較小,可用于治療同時感染HIV?1和HBV的患者。但是,由于磷酸酯基帶負電荷,極性太強,生物膜透過性差,導致生物利用度很低,使其不能成為藥物應用于臨床。其雙酯性前藥替諾福韋雙異丙酰氧基甲酯富馬酸鹽(TDF))〖商品名:韋瑞德(Viread),其IC50為1.6μM〗改善了藥物的生物利用度,于2001年被FDA批準上市,是迄今為止抗病毒活性較強、腎毒性又較低的HIV逆轉錄酶抑制劑類AIDS治療藥物。 
作為前藥,本身沒有抗病毒活性,進入體內后必須游離出原藥后才能發揮療效,而部分藥物在吸收進入血液前即被水解;另外,釋放出的原藥阿德福韋和替諾福韋同樣由于膜透過性差的問題,迅速被排出體外而難以在感染部分保持足夠的濃度,致使其人體生物利用度只有28%左右。因此,對阿德福韋和替諾福韋進行進一步的研究和改造具有重要價值。 
一份專利申請WO2012/041015A1中,其發明人論述道:“專利(CN1810816)在替諾福韋分子中磷酸基的一個羥基上引入脂溶性長鏈烷氧乙基長鏈,使分子結構中磷酸基團的一個羥基被酯化、一個仍處于游離狀態,得到阿德福韋和替諾福韋的磷酸長鏈烷氧乙/丙基單酯衍生物。該化合物在引入長鏈烷氧乙/丙基后,不僅改善了化合物的藥代動力學性質,而且磷酸基中另一個游離羥基仍可以被磷酸化、參與病毒復制過程,發揮抗病毒效果,因而保留了替諾福韋的抗病毒活性。即脂溶性長鏈的引入既改善了化合物的藥代動力學性質又保留了抗病毒活性。” 
專利CN1810816中的發明化合物的通式結構式為: 

其中,x=0?8,y=1?20. 
已完成了臨床前的各項檢測,不僅證明了該化合物有很高的活性和抗耐藥性,而且還發現其毒性也是很低的,不會抑制肝臟內代謝這些藥物的酶系。 
另一家外國公司研發的藥物CMX157(專利CN101977610A)也是對替諾福韋及其衍生物進行的改造。CMX157的結構式如下: 

尤其是CMX157,無論是體外細胞活性篩選還是動物實驗,都表現出了良好的前景。對HIV病毒無論野生型還是各種突變耐藥型,CMX157都顯示出了很高的活性、很低的毒性,而且與上市的治療HIV的藥物聯合使用時都有良好的協同作用。CMX157有著成為新的治療艾滋病藥物的前景。 
上述兩種化合物都是替諾福韋的前藥,其對替諾福韋加以改造的主要目的是提高其脂溶性,改善膜透過性,進而提高人體的生物利用度。然而上述兩種前藥的脂溶性仍有待進一步的提高,從而提高人體的生物利用度。 
發明內容:
本發明的目的是針對現有技術的不足,對替諾福韋及其衍生的結構進行更進一步的改造,得到具有更高的脂溶性和更高抑制病毒的活性的新的核苷類化合物。 
本發明提供了一組具有抑制HIV?1病毒復制的活性的替諾福韋酯化合物及其鹽,經國家權威部門檢測,本發明化合物之一的COP131?114的抑制HIV?1病毒復制活性、是齊多夫定(AZT)的20倍,是目前治療艾滋病最好的藥物:韋瑞德(TDF)的31倍,約是CMX157的約9倍且脂溶性又約是CMX157脂溶性2倍的優點,為今后深入研究與開發本發明化合物及其鹽的抗病毒應用奠定基礎。 
本發明采用的技術方案為具有通式I的替諾福韋酯化合物及其藥學上可接受的鹽: 

Ⅰ 
其中X=H,Y=H; 
R1=?CH2(CH2)mCH2OCH2(CH2)nCH3,m=0?4,n=10?20; 
R2=
R3是氫、C1?12烷基、C2?12烯基、C2?12炔基、C5?6芳基或C5?12芳烷基; 
R4是任一天然或可藥用氨基酸的側鏈,并且,條件是當該側鏈含有羧基時,則任選該羧基選用烷基或芳基酯化; 
其中:R3是異丙基、R4是甲基的化合物除外; 
具有式I的替諾福韋酯化合物藥學上可接受的鹽為式Ⅰa所示: 

Ⅰa
其中X,Y,R1,R2與式Ⅰ同;Acid為可與腺嘌呤氨基部分成鹽的藥學上可接受的無機酸或有機酸。 
本發明提供的上述的替諾福韋酯化合物或其藥學上可接受的鹽,優選其中,R3是氫或C1?12烷基,R4是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸或組氨酸的氨基酸側鏈。 
本發明提供的上述的替諾福韋酯化合物或其藥學上可接受的鹽,又優選其中,R3是氫、乙基、異丁基、新戊基、正丁基、環己基、甲基、正丙基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、3?甲基己基、正己基、2,2?二甲基戊基、2,3?二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基或正十二烷基,R4是丙氨酸側鏈。 
本發明提供替諾福韋酯化合物或其藥學上可接受的鹽,又優選當m=0?4,n=10?20;R3為乙基、異丁基、新戊基、正丁基或環己基時,為下列結構式所示的替諾福韋酯化合物: 













或該上列各結構式所示的化合物分別與硫酸、鹽酸或富馬酸形成的藥學上可接受的鹽。 
本發明提供替諾福韋酯化合物或其藥學上可接受的鹽,又優選當m=0?4,n=12?16;R3為乙基、異丁基、新戊基、正丁基或環己基時的化合物;或其藥學上可接受的鹽為Acid是硫酸、鹽酸或富馬酸時所成的鹽。 
本發明提供的替諾福韋酯化合物或其藥學上可接受的鹽,又優選當m=1,n=14,R3為乙基、異丁基、新戊基、正丁基、環己基、甲基、正丙基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、3?甲基己基、正己基、2,2?二甲基戊基、2,3?二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基或正十二烷基時,為下列結構式所示的替諾福韋酯化合物: 


或上列各結構式所示化合物分別與Acid為富馬酸時形成的藥學上可接受的鹽。 
本發明提供的替諾福韋酯化合物或其藥學上可接受的鹽,又優選下列化合物: 

或上列各結構式所示化合物分別與富馬酸形成的藥學上可接受的鹽。 
本發明提供替諾福韋酯化合物或其藥學上可接受的鹽的方法,所述方法的合成路線如下: 

該制備方法包括如下步驟: 
a、用N?甲基吡咯烷酮為溶劑,三乙胺為脫水劑,2,2′?二硫二吡啶、三苯基膦為絡合劑,用替諾福韋與L?丙氨酸酯鹽酸鹽進行脫酸縮合反應,反應過程中反應溫度為65℃?85℃,反應時間為20?26個小時,即得到化合物Ⅱ; 
b、用N?甲基吡咯烷酮為溶劑,三乙胺為脫水劑,N,N'?二環己基碳二亞胺為絡合劑,用上述反應中得到的化合物Ⅱ與烷氧烷醇進行脫水縮合反應,反應過程中反應溫為75℃?95℃,反應時間為7?9個小時,得到替諾福韋酯化合物Ⅰ; 
c、將替諾福韋酯化合物Ⅰ與等量的Acid溶于乙腈中,回流攪拌1?3小時,室溫下冷卻析晶,濾出析出的固體并用乙醚洗滌即得到替諾福韋酯化合物藥學上可接受的鹽Ⅰa; 
其中各符號的定義如上面所述,在上述的制備方法中,起始原料替諾福韋、氯甲基碳酸異丙酯由市售購得。 
本發明還提供一種藥物組合物,所述藥物組合物含有治療有效量的替諾福韋酯化合物其及藥學上可接受的鹽和一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑以及該藥物組合物在制備用于預防或治療病毒疾病藥物中的應用。 
本發明提還涉及替諾福韋酯化合物其及藥學上可接受的鹽在制備用于預防或治療病毒疾病藥物中的應用,尤其是在HIV病毒感染或HBV感染或HIV與HBV同時感染的疾病中的應用。 
發明效果: 
經過國家權威檢測機構測定,本發明化合物具有成為治療艾滋病的藥物所需的各種優良屬性,具體如下: 
(1)本發明的化合物COP131?114、COP132?114、COP133?114、COP134?114、COP135?114超越了目前治療艾滋病的首選藥物齊多夫定(AZT)以及正處于臨床實驗階段的藥物CMX157的抑制HIV?1野生型病毒復制的活性。從IC50這項指標看,COP131?114的IC50是CMX157的8.8倍、是AZT的20倍,是目前治療艾滋病的藥物:韋瑞德(TDF)的1000倍,COP132?114的IC50是CMX157的2.9倍、是AZT的9.7倍,COP133?114的IC50是CMX157的1.6倍、是AZT的5.4倍,COP134?114的IC50是CMX157的1.7倍、是AZT的5.5倍,COP135?114的IC50是CMX157的1.7倍、是AZT的3.3倍。 
(2)通常情況下,一種物質在具有很高的活性時往往也都具有很高的毒性。然而經權威檢測機構檢測,本發明化合物COP131?114、COP132?114、COP133?114、COP134?114、COP135?114在具有很高活性的同時,卻具有很低的細胞毒性:“在終濃度10μmol/L對細胞增殖無顯著性影響”。 
(3)經對比檢測本發明化合物代表性實例COP131?114的脂溶性CMX157脂溶性高出了許多,約是CMX157脂溶性2倍,表明本發明化合物的膜透過性比CMX157膜透過性要高出許多,改善了替諾福韋的生物利用度,從而顯著地提高了替諾福韋艾滋病的效果,相應也必將產生巨大的經濟效益和社會效益。 
(4)經對比檢測本發明化合物化合物C0P131?114、C0P132?114、C0P133?114、C0P134?114、C0P135?114可有效抑制HBV的復制,其半數有效濃度分別為:C0P131?114(35.3μM);C0P132?114((34.6μM);C0P133?114(6.05μM);C0P134?114(37.8μM);C0P135?114(14.5μM);在相同條件下平行測定的陽性對照TDF半數有效濃度為80.1μM。 
這充分表明:本發明化合物比目前銷售額最大的抗艾滋病藥物、同時又被專家譽為最好的抗乙肝藥物TDF抑制病毒復制的活性高出很多,有望成為治療HBV感染的藥物。 
總之,本發明化合物集很高的活性、很低的毒性,極好的脂溶性等各種良好屬性于一體,有著成為新一代治療艾滋病或治療乙型肝炎的藥物的前景。 
附圖說明
圖1為比較本發明化合物C0P131?114和CMX157脂溶性的高效液相色譜圖。 
具體實施方式:
以下實施例可以使本專業技術人員更全面地理解本發明,但不以任何方式限制本發明。所有化合物的結構均經1H NMR或MS所確定。 
實施例1:3?十六烷氧基?1?丙醇(L114)的制備 

在250ml三口圓底燒瓶中,依次加入1,3?丙二醇(9.13g,0.12mol)、叔丁醇鉀(6.8g,0.06mol)和叔戊醇(50ml),回流狀態下,慢慢滴加溴代十六烷(12.17g,12.2ml,0.04mol)和四氫呋喃(50ml)的混合液,3小時滴完。再回流攪拌50小時后,冷至室溫,將反應液傾入50ml水中,攪拌,用10%的鹽酸酸化至PH=7,加入正己烷(100ml),分出有機相,水相用正己烷萃取,合并有機相,有機相干燥濃縮后用正戊烷重結晶得到3?十六烷氧基?1?丙醇(L114)(7.8g,0.026mol),收率:65%。 
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.88(3H,t,CH3),1.14?1.37(26H,m,13×CH2),1.48?1.65(2H,m,CH2),1.71?1.94(2H,m,CH2),2.38?2.53(1H,br,OH),3.43(2H,t,OCH2),3.62(2H,t,OCH2),3.78(2H,t,OCH2)。ESI?MS:[M+H]+301.3,[M+Na]+323.2 
實施例2:2?十八烷氧基乙醇(L016)的制備 

以實施例1類似方法合成得到2?十八烷氧基乙醇(L016) 
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.88(3H,t,CH3),1.06?1.49(30H,m,15×CH2),1.53?1.654(2H,m,CH2),1.90?2.10(1H,br,OH),3.47(2H,t,OCH2),3.53(2H,t,OCH2),3.73(2H,t,OCH2)。ESI?MS:[M+H]+315.3,[M+Na]+337.3。 
實施例3:6?十二烷氧基?1?己醇(L410)的制備 

以實施例1類似方法合成得到6?十二烷氧基?1?己醇(L410)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.88(3H,t,CH3),1.14?1.34(18H,m,9×CH2),1.35?1.42(4H,m,2×CH2),1.48?1.64(6H,m,3×CH2),1.93?2.01(1H,br,OH),3.28?3.48(4H,m,2×OCH2),3.62(2H,t,OCH2)。ESI?MS:[M+H]+287.3,[M+Na]+309.3. 
實施例4:4?二十二烷氧基?1?丁醇(L220)的制備 

以實施例1類似方法合成得到:4?二十二烷氧基?1?丁醇(L220)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.88(3H,t,CH3),0.99?1.46(38H,m,19×CH2),1.52?1.61(2H,m,CH2),1.62?1.78(4H,m,2×CH2),1.95?2.67(1H,br,OH),3.30?3.51(4H,m,2×OCH2),3.64(2H,t,OCH2).ESI?MS:[M+H]+399.4 
實施例5:(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(乙氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P131?114)的制備 

在50ml圓底燒瓶中,依次加入替諾福韋(PMPA)(1.18g,4.13mmol)、L?丙氨酸乙酯鹽酸鹽(2.6g,17mmol)、2,2′?二硫二吡啶(1.82g,8.26mmol)、三乙胺(3.44g,4.8ml,34mmol)、三苯基膦(2.16g,8.24mmol)和N?甲基吡咯烷酮(10ml),在80℃下密閉攪拌10h后,蒸除溶劑,用乙酸乙酯:乙醇=10:1過柱,得到中間產品(R)?9?[2?[[[(S)?1?(乙氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤C0P031(1.04g,2.7mmol),收率65.3%。 
在250ml圓底燒瓶中,依次加入C0P031(9.7g,25mmol)、L114(15g,50mmol)混合溶于65ml N?甲基吡咯烷酮中,加熱到85℃攪拌30分鐘后,慢慢滴加三乙胺22ml,然后升溫至100℃,滴加二環己基碳二亞胺(DCC)11g(溶于16ml N?甲基吡咯烷酮中)。在100℃下攪拌反應10小時后,冷卻至50℃,旋干,加入500ml二氯甲烷:甲醇=1:1的混合溶劑,攪拌1小時后抽濾,多次沖洗濾餅,合并濾液后干燥濃縮,用二氯甲烷:甲醇=1:1硅膠柱層析,得到目標物:(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(乙氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P131?114)(7.35g,11mmol),產率44%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.88(3H,t,CH3),1.17?1.34(32H,m,13×CH2and2×CH3),1.37(3H,t,CH3),1.46?1.61(2H,m,CH2),1.75?1.98(2H,m,CH2),3.33?3.66(6H,m,3×OCH2),3.75?4.22(8H,m,OCH2P,NCH2,COOCH2,OCH and NH),4.27?4.47(1H,m,NCH),6.14(2H,s,NH2),7.93?8.06(1H,d,嘌呤環上的H),8.27?8.39(1H,d,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+669.3,[M+Na]+691.3 
實施例6:(R)?9?[2?[[十八烷氧乙基[(S)?1?(乙氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P131?016)的制備 

以實施例5類似方法合成得到:(R)?9?[2?[[十八烷氧乙基[(S)?1?(乙氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P131?016)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.88(3H,t,CH3),1.16?1.36(36H,m,15×CH2and2×CH3),1.37(3H,t,CH3),1.47?1.62(2H,m,CH2),3.35?3.68(6H,m,3×OCH2),3.76?4.20(8H,m,OCH2P,NCH2,COOCH2,OCH and NH),4.28?4.45(1H,m,NCH),6.15(2H,s,NH2),7.94?8.04(1H,d,嘌呤環上的H),8.28?8.37(1H,d,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+683.4,[M+Na]+705.4 
實施例7:(R)?9?[2?[[十二烷氧己基[(S)?1?(乙氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P131?410)的制備 

以實施例5類似方法合成得到:(R)?9?[2?[[十二烷氧己基[(S)?1?(乙氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P131?410)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.88(3H,t,CH3),1.16?1.35(28H,m,9×CH2,2×CH2and2×CH3),1.36(3H,t,CH3),1.45?1.62(4H,m,2×CH2),1.74?1.99(2H,m,CH2),3.32?3.67(6H,m,3×OCH2),3.74?4.23(8H,m,OCH2P,NCH2,COOCH2,OCH and NH),4.26?4.48(1H,m,NCH),6.13(2H,s,NH2),7.92?8.07(1H,d,嘌呤環上的H),8.26?8.40(1H,d,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+655.4,[M+Na]+677.4 
實施例8:(R)?9?[2?[[二十二烷氧丁基[(S)?1?(乙氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P131?220)的制備 

以實施例5類似方法合成得到:(R)?9?[2?[[二十二烷氧丁基[(S)?1?(乙氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P131?220)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.88(3H,t,CH3),1.15?1.33(44H,m,19×CH2and2×CH3),1.36(3H,t,CH3),1.44?1.60(4H,m,2×CH2),1.73?1.97(2H,m,CH2),3.31?3.65(6H,m,3×OCH2),3.73?4.21(8H,m,OCH2P,NCH2,COOCH2,OCH and NH),4.25?4.46(1H,m,NCH),6.12(2H,s,NH2),7.91?8.05(1H,d,嘌呤環上的H),8.25?8.38(1H,d,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+767.5,[M+Na]+789.5 
實施例9:(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(異丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P132?114)的制備 

在50ml圓底燒瓶中,依次加入替諾福韋(PMPA)(1.18g,4.13mmol)、L?丙氨酸異丁酯鹽酸鹽(3.08g,17mmol)、2,2′?二硫二吡啶(1.82g,8.26mmol)、三乙胺(3.44g,4.8ml,34mol)、三苯基膦(2.16g,8.24mmol)和N?甲基?2?吡咯烷酮(10ml),在75℃下攪拌12小時后,蒸除溶劑,用乙酸乙酯:乙醇=6:1硅膠柱層析,得到中間產品:(R)?9?[2?[[[(S)?1?(異丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P032)。(0.89g,2.16mmol),收率52.3%。 
在250ml圓底燒瓶中,依次加入C0P032(10.3g,25mmol)、L114(15g,50mmol)混合溶于65ml N?甲基吡咯烷酮中,加熱到85℃攪拌10分鐘,滴加三乙胺22ml后,升溫至100℃,滴加二環己基碳二亞胺(DCC)11g(溶于16ml N?甲基吡咯烷酮中),在105℃下攪拌反應14小時后,冷卻至45℃,旋干,加入二氯甲烷:甲醇=1:1(500ml)的混合溶劑,攪拌1小時后抽濾,多次沖洗濾餅,合并濾液后干燥濃縮,用二氯甲烷:甲醇=1:1硅膠柱層析,得到產品:(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(異丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P132?114)。(6.72g,9.65mmol),產率38.6%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.82?0.96(9H,m,3×CH3),1.15?1.44(32H,m,13×CH2and2×CH3),1.47?1.59(2H,m,CH2),1.79?1.99(3H,m,CH2and CH),3.30?3.74(6H,m,3×OCH2),3.76?4.18(8H,m,OCH2P,NCH2,COOCH2,OCH and NH),4.31?4.44(1H,m,NCH),6.57(2H,s,NH2),7.99?8.08(1H,d,嘌呤環上的H),8.28?8.36(1H,d,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+697.4,[M+Na]+719.3 
實施例10:(R)?9?[2?[[十八烷氧乙基[(S)?1?(異丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P132?016)的制備 

以實施例9類似方法合成得到:(R)?9?[2?[[十八烷氧乙基[(S)?1?(異丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P132?016)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.81?0.98(9H,m,3×CH3),1.14?1.46(36H,m,15×CH2and2×CH3),1.48?1.60(2H,m,CH2),1.80?1.97(1H,m,CH),3.32?3.72(6H,m,3×OCH2),3.77?4.16(8H,m,OCH2P,NCH2,COOCH2,OCH and NH),4.32?4.42(1H,m,NCH),6.58(2H,s,NH2),7.98?8.09(1H,d,嘌呤環上的H),8.27?8.38(1H,d,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+711.5,[M+Na]+733.5 
實施例11:(R)?9?[2?[[十二烷氧己基[(S)?1?(異丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P132?410)的制備 

以實施例9類似方法合成得到:(R)?9?[2?[[十二烷氧己基[(S)?1?(異丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P132?410)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.81?0.97(9H,m,3×CH3),1.14?1.45(28H,m,9×CH2,2×CH2and2×CH3),1.46?1.60(4H,m,2×CH2),1.78?1.97(3H,m,CH2and CH),3.29?3.75(6H,m,3×OCH2),3.75?4.19(8H,m,OCH2P,NCH2,COOCH2,OCH and NH),4.30?4.45(1H,m,NCH),6.56(2H,s,NH2),7.98?8.09(1H,d,嘌呤環上的H),8.27?8.37(1H,d,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+683.4,[M+Na]+705.4 
實施例12:(R)?9?[2?[[二十二烷氧丁基[(S)?1?(異丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P132?220)的制備。 

以實施例9類似方法合成得到:(R)?9?[2?[[二十二烷氧丁基[(S)?1?(異丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P132?220)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.80?0.95(9H,m,3×CH3),1.13?1.43(44H,m,19×CH2and2×CH3),1.45?1.58(4H,m,2×CH2),1.77?1.98(3H,m,CH2and CH),3.28?3.73(6H,m,3×OCH2),3.74?4.17(8H,m,OCH2P,NCH2,COOCH2,OCH and NH),4.29?4.43(1H,m,NCH),6.55(2H,s,NH2),7.97?8.07(1H,d,嘌呤環上的H),8.26?8.35(1H,d,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+795.6,[M+Na]+817.6 
實施例13:(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(新戊氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P133?114)的制備 

在50ml圓底燒瓶中,依次加入替諾福韋(PMPA)(1.18g,4.13mmol)、L?丙氨酸新戊酯鹽酸鹽(3.32g,17mmol)、2,2′?二硫二吡啶(1.82g,8.26mmol)、三乙胺(3.44g,4.8ml,34mol)、三苯基膦(2.16g,8.24mmol)和N?甲基吡咯烷酮(10ml),在72℃下攪拌10h后,蒸除溶劑,用乙酸乙酯:乙醇=8:1硅膠柱層析,得到中間產品(R)?9?[2?[[[(S)?1?(新戊氧羰基)]乙基] 氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P033)(0.99g,2.32mmol),收率56.2%。 
在250ml圓底燒瓶中,依次加入C0P033(10.7g,25mmol)、L114(15g,50mmol)混合溶于65ml N?甲基吡咯烷酮中,加熱到85℃攪拌25分鐘,滴加三乙胺22ml,然后升溫至100℃,滴加二環己基碳二亞胺(DCC)11g(溶于16ml N?甲基吡咯烷酮中),在110℃下攪拌反應12小時后,冷卻至室溫,旋干,加入二氯甲烷:甲醇=1:1(500ml)的混合溶劑,攪拌分散1小時后抽濾,多次沖洗濾餅,合并濾液后干燥濃縮,用二氯甲烷:甲醇=1:1硅膠柱層析,得到目標物:(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(新戊氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P133?114)。(6.52g,9.17mmol),產率36.7%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.78?1.00(12H,m,4×CH3),1.14?1.46(32H,m,13×CH2and2×CH3),1.47?1.60(2H,m,CH2),1.80?1.95(2H,m,CH2),3.25?3.52(4H,m,2×OCH2),3.54?3.64(1H,m,OCH),3.66?3.93(4H,m,OCH2and COOCH2),3.99?4.20(5H,m,OCH2P,NCH2,and NH),4.30?4.44(1H,m,NCH),6.67(2H,s,NH2),7.93?8.11(1H,d,嘌呤環上的H),8.32(1H,s,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+711.4,[M+Na]+733.4 
實施例14:(R)?9?[2?[[十八烷氧乙基[(S)?1?(新戊氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P133?016)的制備 

以實施例13類似方法合成得到(R)?9?[2?[[十八烷氧乙基[(S)?1?(新戊氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P133?016)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.77?1.02(12H,m,4×CH3),1.13?1.48(36H,m,15×CH2and2×CH3),1.48?1.61(2H,m,CH2),3.27?3.50(4H,m,2×OCH2),3.55?3.62(1H,m,OCH),3.67?3.91(4H,m,OCH2and COOCH2),3.97?4.19(5H,m,OCH2P,NCH2,and NH),4.31?4.42(1H,m,NCH),6.68(2H,s,NH2),7.94?8.10(1H,d,嘌呤環上的H),8.33(1H,s,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+725.5,[M+Na]+747.5 
實施例15:(R)?9?[2?[[十二烷氧己基[(S)?1?(新戊氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P133?410)的制備 

以實施例13類似方法合成得到(R)?9?[2?[[十二烷氧己基[(S)?1?(新戊氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P133?410)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.77?1.01(12H,m,4×CH3),1.13?1.47(28H,m,9×CH2,2×CH2and2×CH3),1.46?1.61(4H,m,2×CH2), 1.79?1.96(2H,m,CH2),3.24?3.53(4H,m,2×OCH2),3.53?3.65(1H,m,OCH),3.67?3.94(4H,m,OCH2and COOCH2),3.98?4.21(5H,m,OCH2P,NCH2,and NH),4.29?4.45(1H,m,NCH),6.66(2H,s,NH2),7.92?8.12(1H,d,嘌呤環上的H),8.31(1H,s,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+697.5,[M+Na]+719.5 
實施例16:(R)?9?[2?[[二十二烷氧丁基[(S)?1?(新戊氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P133?220)的制備 

以實施例13類似方法合成得到(R)?9?[2?[[二十二烷氧丁基[(S)?1?(新戊氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P133?220)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.76?0.99(12H,m,4×CH3),1.12?1.45(44H,m,19×CH2and2×CH3),1.45?1.59(4H,m,2×CH2),1.78?1.94(2H,m,CH2),3.23?3.51(4H,m,2×OCH2),3.52?3.63(1H,m,OCH),3.64?3.92(4H,m,OCH2and COOCH2),3.97?4.19(5H,m,OCH2P,NCH2,and NH),4.28?4.43(1H,m,NCH),6.65(2H,s,NH2),7.91?8.10(1H,d,嘌呤環上的H),8.31(1H,s,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+809.6,[M+Na]+831.6 
實施例17:(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(正丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P134?114)的制備 

在50ml圓底燒瓶中,依次加入替諾福韋(PMPA)(1.18g,4.13mmol)、L?丙氨酸正丁酯鹽酸鹽(3.08g,0.017mol)、2,2′?二硫二吡啶(1.82g,8.26mmol)、三乙胺(3.44g,4.8ml,34mol)、三苯基膦(2.16g,8.24mmol)和N?甲基吡咯烷酮(10ml),在80℃下攪拌12h后,蒸除溶劑,用乙酸乙酯:乙醇=10:1硅膠柱層析,得到中間產品:(R)?9?[2?[[[(S)?1?(正丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P034)(0.807g,1.95mmol),收率47.2%。 
在250ml圓底燒瓶中,依次加入C0P034(10.4g,25mmol)、L114(15g,50mmol)混合溶于65ml N?甲基吡咯烷酮中,加熱到85℃攪拌反應30分鐘,滴加三乙胺22ml,然后升溫至100℃,滴加二環己基碳二亞胺(DCC)11g(溶于16ml N?甲基吡咯烷酮中),在100℃下攪拌反應8小時后,冷卻至45℃,旋干,加入二氯甲烷:甲醇=1:1(500ml)的混合溶劑,攪拌分散1小時后抽濾,多次沖洗濾餅,合并濾液后干燥濃縮,用二氯甲烷:甲醇=1:1硅膠柱層析,得到產品(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(正丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P134?114)。(5.68g,8.15mmol),產率32.6%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.84?0.95 (6H,m,2×CH3),1.01?1.46(34H,m,13×CH2,CH2and2×CH3),1.48?1.66(4H,m,2×CH2),1.82?1.94(2H,m,CH2),3.31?3.70(6H,m,3×OCH2),3.77?4.20(8H,m,OCH2P,NCH2,COOCH2,OCH and NH),4.32?4.43(1H,m,NCH),6.65(2H,s,NH2),7.96?8.10(1H,d,嘌呤環上的H),8.23?8.40(1H,d,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+697.4,[M+Na]+719.3 
實施例18:(R)?9?[2?[[十八烷氧乙基[(S)?1?(正丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P134?016)的制備 

以實施例17類似方法合成得到:(R)?9?[2?[[十八烷氧乙基[(S)?1?(正丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P134?016)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.83?0.97(6H,m,2×CH3),1.00?1.48(38H,m,15×CH2,CH2and2×CH3),1.49?1.66(4H,m,2×CH2),3.33?3.67(6H,m,3×OCH2),3.78?4.18(8H,m,OCH2P,NCH2,COOCH2,OCH and NH),4.33?4.41(1H,m,NCH),6.67(2H,s,NH2),7.97?8.11(1H,d,嘌呤環上的H),8.24?8.41(1H,d,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+711.5,[M+Na]+733.5 
實施例19:(R)?9?[2?[[十二烷氧己基[(S)?1?(正丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P134?410)的制備 

以實施例17類似方法合成得到:(R)?9?[2?[[十二烷氧己基[(S)?1?(正丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P134?410)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.83?0.96(6H,m,2×CH3),1.02?1.47(30H,m,9×CH2,2×CH2,CH2and2×CH3),1.47?1.67(6H,m,3×CH2),1.83?1.95(2H,m,CH2),3.30?3.71(6H,m,3×OCH2),3.76?4.21(8H,m,OCH2P,NCH2,COOCH2,OCH and NH),4.31?4.44(1H,m,NCH),6.64(2H,s,NH2),7.95?8.11(1H,d,嘌呤環上的H),8.22?8.41(1H,d,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+683.4,[M+Na]+705.4 
實施例20:(R)?9?[2?[[二十二烷氧丁基[(S)?1?(正丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P134?220)的制備 

以實施例17類似方法合成得到:(R)?9?[2?[[二十二烷氧丁基[(S)?1?(正丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P134?220)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.82?0.94(6H,m,2×CH3),0.99?1.45(46H,m,19×CH2,CH2and2×CH3),1.46?1.65(6H,m,3×CH2),1.80?1.93(2H,m,CH2),3.29?3.69(6H,m,3×OCH2),3.75?4.19(8H,m,OCH2P,NCH2,COOCH2,OCH and NH),4.30?4.42(1H,m,NCH),6.63(2H,s,NH2),7.94?8.09(1H,d,嘌呤環上的H),8.21?8.39(1H,d,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+795.6,[M+Na]+817.6 
實施例21:(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(環己氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P135?114)的制備 

在50ml圓底燒瓶中,依次加入替諾福韋(PMPA)(1.18g,4.13mmol)、L?丙氨酸環己酯鹽酸鹽(3.52g,17mmol)、2,2′?二硫二吡啶(1.82g,8.26mmol)、三乙胺(3.44g,4.8ml,34mol)、三苯基膦(2.16g,8.24mmol)和N?甲基吡咯烷酮(10ml),在75℃下密閉攪拌14h后,蒸除溶劑,用乙酸乙酯:乙醇=20:1~6:1硅膠柱層析,得到中間產品:(R)?9?[2?[[[(S)?1?(環己氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤C0P035(0.82g,1.86mmol),收率45.1%。. 
在250ml圓底燒瓶中,依次加入C0P035(11g,25mmol)、L114(15g,50mmol)混合溶于65ml N?甲基吡咯烷酮中,加熱到85℃攪拌反應30分鐘,滴加三乙胺22ml,然后升溫至100℃,滴加二環己基碳二亞胺(DCC)11g(溶于16ml N?甲基吡咯烷酮中),在115℃下攪拌16小時后,冷卻至室溫,旋干,加入二氯甲烷:甲醇=1:1(500ml)的混合溶劑,攪拌分散1小時后抽濾,多次沖洗濾餅,合并濾液后干燥濃縮,用二氯甲烷:甲醇=1:1硅膠柱層析,得到目標物:(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(環己氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P135?114)。(7.69g,10.65mmol),產率42.6%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.88(3H,t,CH3),1.13?1.58(40H,m,13×CH2,CH2,2×CH3and環己基上的3×CH2),1.62?1.74(2H,m,CH2),1.75?1.95(4H,m,環己基上的2×CH2),3.30?3.50(4H,m,2×OCH2),3.53?3.65(1H,m,環己基上與氧相連的CH),3.69?4.23(7H,m,OCH2P,NCH2,OCH2and OCH),4.26?4.46(1H,m,NCH),4.62?4.84(1H,d,NH),6.50?6.87(2H,d,NH2),7.99?8.07(1H,d,嘌呤環上的H),8.26?8.37(1H,d,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+723.4,[M+Na]+745.4 
實施例22:(R)?9?[2?[[十八烷氧乙基[(S)?1?(環己氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P135?016)的制備 

以實施例21類似方法合成得到(R)?9?[2?[[十八烷氧乙基[(S)?1?(環己氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P135?016)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.88(3H,t,CH3),1.12?1.60(44H,m,15×CH2,CH2,2×CH3and環己基上的3×CH2),1.75?1.95(4H,m,環己基上的2×CH2),3.32?3.46(4H,m,2×OCH2),3.54?3.63(1H,m,環己基上與氧相連的CH),3.70?4.21(7H,m,OCH2P,NCH2,OCH2and OCH),4.27?4.44(1H,m,NCH),4.63?4.82(1H,d,NH),6.51?6.85(2H,d,NH2),7.98?8.08(1H,d,嘌呤環上的H),8.27?8.35(1H,d,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+737.5,[M+Na]+759.5 
實施例23:(R)?9?[2?[[十二烷氧己基[(S)?1?(環己氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P135?410)的制備 

以實施例21類似方法合成得到(R)?9?[2?[[十二烷氧己基[(S)?1?(環己氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P135?410)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.88(3H,t,CH3),1.12?1.59(36H,m,9×CH2,2×CH2,CH2,2×CH3and環己基上的3×CH2),1.61?1.75(4H,m,2×CH2),1.74?1.96(4H,m,環己基上的2×CH2),3.29?3.51(4H,m,2×OCH2),3.52?3.66(1H,m,環己基上與氧相連的CH),3.68?4.24(7H,m,OCH2P,NCH2,OCH2and OCH),4.25?4.47(1H,m,NCH),4.61?4.85(1H,d,NH),6.49?6.88(2H,d,NH2),7.98?8.08(1H,d,嘌呤環上的H),8.25?8.38(1H,d,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+709.5,[M+Na]+731.5 
實施例24:(R)?9?[2?[[二十二烷氧丁基[(S)?1?(環己氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P135?220)的制備 

以實施例21類似方法合成得到(R)?9?[2?[[二十二烷氧丁基[(S)?1?(環己氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P135?220)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.88(3H,t,CH3),1.11?1.57(54H,m,19×CH2,2×CH2,2×CH3and環己基上的3×CH2),1.60?1.73(2H,m,CH2),1.73?1.94(4H,m,環己基上的2×CH2),3.28?3.49(4H,m,2×OCH2),3.51?3.64(1H,m,環己基上與氧相連的CH),3.67?4.22(7H,m,OCH2P,NCH2,OCH2and OCH),4.24?4.45(1H,m,NCH),4.60?4.83(1H,d,NH),6.48?6.86(2H,d,NH2),7.97?8.06(1H,d,嘌呤環上的H),8.24?8.36(1H,d,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+821.6,[M+Na]+843.6 
實施例25:(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(乙氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤富馬酸鹽(FC0P131?114)的制備 

將等量的(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(乙氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P131?114)和富馬酸溶于熱的乙腈中,回流攪拌2小時,室溫下冷卻析晶,濾出析出的固體并用乙醚洗滌得白色固體:(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(乙氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤富馬酸鹽(FC0P131?114)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ,(ppm):0.85(3H,t,CH3),1.04(3H,t,CH3),1.10?1.33(32H,m,13×CH2and2×CH3),1.35?1.51(2H,m,CH2),1.66?1.79(2H,m,CH2),3.26?3.38(4H,m,2×OCH2),3.59?3.75(2H,m,OCH2),3.76?3.95(4H,m,OCH2P,NH,and OCH),4.01?4.29(4H,m,NCH2,COOCH2),5.01?5.19(2H,s,NCH),6.63(2H,s,富馬酸雙鍵上的氫),7.19(2H,s,NH2),8.04?8.10(1H,d,嘌呤環上的H),8.13(1H,s,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+669.3,[M+Na]+691.3 
實施例26:(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(異丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤富馬酸鹽(FC0P132?114)的制備 

以實施例25類似方法合成得到:(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(異丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤富馬酸鹽(FC0P132?114)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ,(ppm):0.78?0.96(9H,m,3×CH3),1.04(3H,t,CH3),1.14?1.38(29H,m,13×CH2and CH3),1.39?1.51(2H,m,CH2),1.67?1.79(2H,m,CH2),1.80?1.93(1H,m,CH),3.27?3.39(4H,m,2×OCH2),3.60?3.97(8H,m,OCH2P,NCH2,OCH2,OCH and NH),4.08?4.30(2H,m,COOCH2),5.06?5.21(2H,m,NCH),6.63(2H,s,富馬酸雙鍵上的氫),7.20(2H,s,NH2),8.06?8.11(1H,d,嘌呤環上的H),8.13(1H,s,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+697.4 
實施例27:(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(新戊氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤富馬酸鹽(FC0P133?114)的制備 

以實施例25類似方法合成得到:(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(新戊氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤富馬酸鹽(FC0P133?114)。1H NMR(400MHz,DMSO) δ,(ppm):0.75?0.94(12H,m,4×CH3),1.03(3H,t,CH3),1.11?1.34(29H,m,13×CH2andCH3),1.37?1.51(2H,m,CH2),1.66?1.79(2H,m,CH2),3.25?3.39(4H,m,2×OCH2),3.59?3.98(8H,m,OCH2P,NCH2,OCH2,OCH and NH),4.05?4.32(2H,m,COOCH2),5.06?5.24(2H,m,NCH),6.62(2H,s,富馬酸雙鍵上的氫),7.19(2H,s,NH2),8.05?8.09(1H,d,嘌呤環上的H),8.12(1H,s,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+711.4,[M+Na]+733.4 
實施例28:(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(正丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤富馬酸鹽(FC0P134?114)的制備 

以實施例25類似方法合成得到:(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(正丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤富馬酸鹽(FC0P134?114)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ,(ppm):0.77?0.95(6H,m,2×CH3),1.04(3H,t,CH3),1.11?1.39(31H,m,13×CH2,CH2and CH3),1.40?1.60(4H,m,2×CH2),1.67?1.79(2H,m,CH2),3.60?3.78(5H,m,OCH and2×OCH2),3.79?3.97(5H,m,OCH2P,NH and OCH2),3.98?4.29(4H,m,NCH2and COOCH2),5.04?5.18(1H,m,NCH),6.63(2H,s,富馬酸雙鍵上的氫),7.19(2H,s,NH2),8.05?8.10(1H,d,嘌呤環上的H),8.13(1H,s,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+697.4 
實施例29:(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(環己氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤富馬酸鹽(FC0P135?114)的制備 

以實施例25類似方法合成得到:(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(環己氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤富馬酸鹽(FC0P135?114)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ,(ppm):0.85(3H,t,CH3),1.04(3H,t,CH3),1.16?1.52(37H,m,13×CH2,CH2,CH3and環己基上的3×CH2),1.56?1.81(6H,m,CH2and環己基上的2×CH2),3.26?3.38(4H,m,2×OCH2),,3.60?3.96(6H,m,OCH2P,NH,OCH2and OCH),4.09?4.29(2H,m,NCH2),4.58?4.70(1H,m,環己基上與氧相連的CH),5.01?5.15(1H,m,NCH),6.62(2H,s,富馬酸雙鍵上的氫),7.18(2H,s,NH2),8.05?8.09(1H,d,嘌呤環上的H),8.12(1H,s,嘌呤環上的H).ESI?MS:[M+H]+723.4,[M+Na]+745.4 
實施例30:(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(環己氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤鹽酸鹽(YC0P135?114)的制備 

以實施例25類似方法合成得到:(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(環己氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤鹽酸鹽(YC0P135?114)。 
實施例31:(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(環己氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤硫酸鹽(SC0P135?114)的制備 

以實施例25類似方法合成得到:(R)?9?[2?[[十六烷氧丙基[(S)?1?(環己氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤硫酸鹽(SC0P135?114)。 
實施例32:本發明化合物抗HIV?1病毒活性的測定 
1.實驗材料 
1.1供試品:化合物C83P01。 
1.2對照品:陽性對照品齊多夫定由檢測單位提供。 
1.3細胞株 
名稱:293T    來源:ATCC 
保存條件:液氮 
1.4病毒株 
名稱:VSVG/HIV?1(NL4?3);     來源:實驗室 
                              自存 
保存條件:?80°C 
1.5培養基 
名稱:DMEM培養基  來源:美國Gibco公司 
RPMI?1640 
FBS 
配制方法:RPMI?1640/DMEM+10%FBS 
1.6實驗用介質 
二甲基亞砜(DMSO)美國Sigma。 
1.7主要儀器及試劑 
BS124S電子天平:德國Sartorius公司 
離心機:美國Beckman公司; 
CO2細胞培養箱:美國ShellAB公司; 
Sirius化學發光檢測儀:德國Berthold公司; 
胰蛋白酶:美國Invitrogen公司; 
青鏈霉素:美國Invitrogen公司; 
胎牛血清:美國Gibco公司; 
細胞裂解液及熒光素酶檢測試劑盒:美國Promega公司 
2.實驗方法 
2.1供試品、對照品配制 
受試樣品:稱重化合物并溶解于DMSO中,貯液濃度為10mmol/L; 
對照品:稱重齊多夫定溶解于DMSO,貯液濃度為10mmol/L. 
2.2實驗步驟 
2.2.1野生型HIV?1重組假病毒的制備: 
轉染前一天,按2.2×106個細胞的密度接種293T細胞到100mm培養皿中,用改良的磷酸鈣沉淀法共轉染3μg VSV?G質粒和8μg野生型HIV?1核心基因,轉染后16小時,用PBS沖洗細胞并換新鮮的培養基繼續培養32小時,收集上清并經0.45m的濾膜過濾,生成野生型HIV?1重組病毒顆粒VSVG/HIV?WT。 
2.2.2HIV?1重組假病毒的p24抗原測定: 
倍比稀釋病毒原液野生型后各取450μl,用50μl的裂解液進行裂解,按照p24抗原ELISA試劑盒說明書(ZeptoMetrix,Cat:0801111),測定并計算重組病毒原液的p24抗原濃度。 
2.2.3藥物對HIV?1抑制性檢測: 
感染前一天,將293T細胞按每孔6×104的密度接種到24孔板上,用DMSO溶解待測化合物,于感染前15分鐘加入細胞培養液中,DMSO溶劑作空白對照,再加入0.5ml病毒液(根據p24濃度將病毒原液稀釋至0.1–0.5ng p24/ml)。感染后48小時,去除上清,每孔中加入50 l細胞裂解液(Promega)裂解細胞,再將20l細胞裂解產物加入至30.l熒光素酶底物中(Promega),用FB15熒光檢測器(Sirius)儀器測定細胞熒光素酶的相對活性,以DMSO作對照,計算化合物對野生型HIV?1復制的半數抑制濃度,檢測數據見藥理篩選結果表1。 
表1:藥理篩選結果表 

續上藥理篩選結果表 
  表 
2:表1化合物編號與本發明化合物編號的對應關系 
表1化合物編號 對應本發明的化合物編號 備注 COP131 COP131?114   COP132 COP132?114   COP133 COP133?114   COP134 COP134?114   COP135 COP135?114   COP136   COP136對應CMX157
注:TDF〖商品名:韋瑞德(Viread),其IC50為1.6μM〗 
2.2.4應用MTS法檢測化合物對細胞存活的影響 
將對數生長期的293T細胞按8000~10000個/孔的細胞密度接種至96孔板中,每孔100ul,37℃,5%CO2培養箱中培養24h后,加入待測化合物,并以DMSO為空白對照(終濃度為0.1%),37℃,5%CO2培養箱中繼續培養44小時。向每孔中加入20μl MTS/PMS現配的混合液,37℃,5%CO2培養箱中繼續培養4h后顯色。在酶聯檢測儀上,波長490nm和650nm(本底)處檢測各孔的光吸收值(OD),并計算細胞的存活率。 
4、實驗結論 
化合物C0P131?114、C0P132?114、C0P133?114、C0P134?114、C0P135?114可有效抑制野生型HIV?1的復制,其半數有效濃度分別為:C0P131?114(1.6±0.6nmol/L);C0P132?114(2.7±0.2nmol/L);C0P133?114(4.9±0.6nmol/L);C0P134?114(4.6±0.2nmol/L);C0P135?114(7.5±0.4nmol/L);在相同條件下平行測定的陽性對照AZT半數有效濃度為24.3nM。所有化合物在終濃度10μmol/L時均無細胞毒性。 
上述本發明化合物抗HIV活性與細胞毒性的測定表明:本發明的化合物COP131?114、COP132?114、COP133?114、COP134?11或COP135?114比目前治療艾滋病的首選藥物齊多夫定(AZT)及正處于臨床實驗階段的藥物CMX157的抑制HIV?1野生型病毒復制的活性高得多。從IC50值看,COP131?114的IC50是CMX157的8.8倍、是AZT的20倍,是TDF的1000倍,COP132?114的IC50是CMX157的2.9倍、是AZT的9.7倍,COP133?114的IC50是CMX157的1.6倍、是AZT的5.4倍,COP134?114的IC50是CMX157的1.7倍、是AZT的5.5倍,COP135?114的IC50是CMX157的1.7倍、是AZT的3.3倍。本發明化合物COP131?114、COP132?114、COP133?114、COP134?114、COP135?114的細胞毒性也是很低的。 
這些檢測數據充分證明本發明化合物不僅具有超越CMX157抑制HIV?1病毒復制的活性、而且還具有很低的毒性。 
實施例33:本發明化合物COP131?114與CMX157脂溶性大小的測定 
比較兩種物質脂溶性大小的原理: 
物質的脂溶性與物質的極性大小相關,物質的極性越大,則該物質的脂溶性越小,物質的極性越小,則該物質的脂溶性越大。 
各種物質的脂溶性大小的比較,通常通過測定不同物質在一定的的條件下,在反向液相色譜圖上,保留時間的長短來表征。物質的脂溶性越高,則表現為該物質在反向液相色譜圖上,保留時間越長。 
本發明化合物COP131?114和CMX157脂溶性大小的比較就是根據上述的原理來進行的。 
在色譜條件:色譜柱,Agilent ZorBax SB?C18(250×4.6mm.id.5μm);流動相,甲醇/水=98:2(v:v);檢測波長:254nm;流速:1.0ml/min;柱溫:30℃下,CMX157的保留時間為2.962分鐘,化合物COP131?114的保留時間為5.610分鐘。化合物COP131?114的保留時間比CMX157的保留時間延長了2.648分鐘。 
根據上述檢測,本發明化合物COP131?114的脂溶性比CMX157的脂溶性高出了許多。這也就是說本發明化合物COP131?114的膜透過性比CMX157膜透過性的高出了許多,從而提高了藥物的治療疾病的效果。 
實施例34:本發明化合物抗HBV病毒活性的測定 
1.體外細胞模型:HepG2 2.215細胞 
2.藥物對HBV病毒DNA抑制作用檢測 
HepG2 2.2.15細胞在24孔細胞培養板中培養48小時后,加入所配不同濃度含藥培養液,繼續培養9天(每3天換液一次),收集上清液,用熒光探針法進行實時定量PCR檢測 
HBV引物:HBV上游引物:5’?TgT CCT ggT TAT CgC Tgg?3’ 
         HBV下游引物:5’?CAA ACg ggC AAC ATA CCT T?3’ 
HBV熒光探針序列:5’(FAM)?TgT gTC TgC ggC gTT TTA TCA T?(TAMRA)3’ 
PCR:95℃預變性5min;95℃變性10s,60℃退火和延伸共30s,40個循環。 
3.結果:見體外抗乙肝病毒活性篩選表 
4.實驗結論: 
化合物C0P131?114、C0P132?114、C0P133?114、C0P134?114、C0P135?114可有效抑制HBV的復制,其半數有效濃度分別為:C0P131?114(35.3μM);C0P132?114((34.6μM);C0P133?114(6.05μM);C0P134?114(37.8μM);C0P135?114(14.5μM);在相同條件下平行測定的陽性對照TDF半數有效濃度為80.1μM。 
這充分表明:本發明化合物比目前銷售額最大的抗艾滋病藥物、同時又被專家譽為最好的抗乙肝藥物抑制病毒復制的活性高出很多,有望成為治療HBV感染的藥物。 
表3:體外抗乙肝病毒活性篩選表 

表4:表3化合物編號與本發明化合物編號的對應關系 
表1化合物編號 對應本發明的化合物編號 COP131 COP131?114 COP132 COP132?114 COP133 COP133?114 COP134 COP134?114 COP135 COP135?114
實施例35:本發明的藥物組合物可按通用的口服藥物制劑制備方法制成片劑或膠囊,200mg劑量的本發明化合物片劑或膠囊單位含量如下(mg/片,mg/粒) 

關 鍵 詞:
一組 替諾福韋 酯化 制備 方法 及其 抗病毒 方面 應用
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
關于本文
本文標題:一組替諾福韋酯化合物、制備方法及其在抗病毒方面的應用.pdf
鏈接地址:http://www.wwszu.club/p-6418099.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
鬼佬大哥大