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ASIA1型口蹄疫重組病毒及其制備方法和應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201310175323.X

申請日:

2013.05.14

公開號:

CN103266090B

公開日:

2014.10.29

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 7/01申請日:20130514|||公開
IPC分類號: C12N7/01; C12N15/63; A61K39/135; A61P31/14; C12R1/93(2006.01)N 主分類號: C12N7/01
申請人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
發明人: 鄭海學; 楊帆; 劉湘濤; 靳野; 郭建宏; 曹偉軍; 何繼軍; 張克山; 才學鵬
地址: 730046 甘肅省蘭州市城關區鹽場堡徐家坪1號
優先權: 2012.07.30 CN 201210266252.X
專利代理機構: 北京鑫浩聯德專利代理事務所(普通合伙) 11380 代理人: 呂愛萍
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310175323.X

授權公告號:

103266090B||||||

法律狀態公告日:

2014.10.29|||2013.09.25|||2013.08.28

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及一種對宿主無致病性的Asia1型口蹄疫重組病毒及其制備方法和應用,拯救系統為基因工程構建的能夠表達精確口蹄疫病毒基因組RNA的高效真核質粒,借此能夠構建和制備口蹄疫重組病毒,使用上述質粒可以制備出高滴度和抗原匹配性好的疫苗株,既可以做為活疫苗,也可以制備成滅活苗,免疫豬和牛后可有效刺激機體產生免疫應答,并提供豬和牛體免疫保護作用,能夠有效保護GV和GII流行毒株,免疫保護率能達100%,半數保護劑量(PD50)在6.34~13.59,具有效價高、與流行毒株的抗原匹配性高、抗原譜廣、免疫保護率高、對宿主豬和牛無致病力,且不形成血毒癥,不排毒的優點,可用于我國及其周邊國家Asia1型口蹄疫病毒的預防和控制。

權利要求書

權利要求書
1.   一種Asia1型口蹄疫重組病毒,其特征在于:該Asia1型口蹄疫重組病毒在BHK?21細胞上具有高滴度、與流行病毒的抗原匹配性高,對豬和牛均沒有致病性,并且不形成血毒癥,能夠產生較強的體液免疫應答和細胞免疫應答,具有免疫交叉保護性,該Asia1型口蹄疫重組病毒的抗原核苷酸序列為SEQ ID NO:1所示。

2.   一種如權利要求1所述的Asia1型口蹄疫重組病毒的制備方法,其特征在于:
(1)、Asia1型口蹄疫重組病毒感染性克隆的構建,以O型口蹄疫病毒的拯救系統為骨架,通過AflII和ClaI限制性內切酶,將含有部分L和P12A基因的序列用Asia1/HN/06毒株相應基因SEQ ID NO:2替換,得到prAsia1?FMDV的重組質粒;所用Asia1/HN/06毒株是2006年4月分離于河南周口,經BHK?21傳代培養10代,保藏于農業部獸醫局指定保存單位:國家口蹄疫參考實驗室;使用RNAeasy Mini Kit提取Asia1/HN/06毒株的總RNA,用引物oligNot I反轉錄合成病毒第一鏈cDNA,以合成的第一鏈cDNA為模板,用引物Asia1P12A?F和Asia1P12A?R擴增獲得Asia1/HN/06毒株部分L和P12A的基因片段,上述三條針對ASIA1/HN/06株的特異性引物分別是:
oligNot I:5'?ttttctagagcggccgct38?3'
Asia1P12A?F:5'?ttttccttaagggacaagaacatgctgtgtttgcctgtgt?3'
Asia1P12A?R:5'?actcacatcgatgtcaaagtgaaacctcc?3',
在以上的特異性引物中,擴增Asia1/HN/06毒株部分L和P12A基因,基因序列為SEQ ID NO:2,所用上游引物Asia1P12A?F中含AflII限制性酶切位點;下游引物Asia1P12A?R中含下劃線部分的ClaI限制性酶切位點,用上述特異性引物進行擴增,得到Asia1/HN/06毒株部分L和P12A基因片段,大小為3582 bp,構建50μL反應體系,擴增條件為:94℃ 5min,94℃ 30s,57℃ 30s,72℃ 3min30s,go to 2,35個循環,72℃ 10min,PCR擴增產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳核實后進行純化回收并送交測序,獲得上述基因片段的DNA;
prO/CHA/99是本實驗室前期構建的含有O/CHA/99毒株全長cDNA的質粒,其中,O/CHA/99毒株是O型口蹄疫毒株,1999年分離于中國香港,現保存于國家口蹄疫參考實驗室,prO/CHA/99質粒組成是在病毒基因組5'端上游含人巨細胞病毒RNA聚合酶II啟動子及編碼牛生長素多聚苷酸化信號的修飾剪切序列,在其兩者間含鼠源RNA聚合酶I啟動子;在病毒基因組3'端下游含鼠源聚合酶終止子I和聚合酶終止子II序列;及嵌合在O型口蹄疫病毒O/CHA/99全長cDNA基因組兩端的榔頭錘酶和丁型肝炎酶的核心序列,其中丁型肝炎酶共有88個核糖核酸,自我剪切修飾位點在5'末端G處;榔頭錘酶核心序列共有58個核糖核酸,自我剪切修飾位點在3'末端C處,將含O型口蹄疫病毒O/CHA/99基因組的感染性克隆轉染至受體細胞中,通過RNA聚合酶II啟動子和RNA聚合酶I啟動子調控元件分別轉錄包裝出病毒RNA前體,再經HamRz 和HdvRz的修飾剪切產生具有感染性的病毒RNA,將O型口蹄疫病毒O/CHA/99株拯救系統的質粒prO/CHA/99與上述得到的Asia1/HN/06毒株部分L和P12A片段,分別用AflII和ClaI雙酶切后,連接轉化至JM109感受態細胞中,測序鑒定陽性克隆,獲得含Asia1/HN/06毒株部分前導蛋白L和結構蛋白P12A的重組質粒,將重組質粒命名為prAsia1?FMDV;
對豬和牛無致病性的Asia1型口蹄疫重組病毒的感染性克隆構建方法,
①Asia1型口蹄疫重組病毒自然受體識別位點RGD突變成RSD,其感染性克隆構建過程是:將用引物Asia1P12A?F和Asia1P12A?R擴增獲得Asia1/HN/06毒株部分L和P12A的基因片段,基因序列為SEQ ID NO:2,與pMD20?T載體4℃連接過夜,連接產物轉化JM109感受態細胞,測序鑒定陽性克隆,獲得重組質粒命名為pMD20?Asia1P12A;以鑒定正確的重組質粒pMD20?Asia1P12A為模板,用磷酸化突變引物S?P和RSD?P進行PCR擴增,上述5'磷酸化的點突變引物分別是:
S?P:5'?cacgcagagtgagcaaccggctgcc?3'
RSD?P:5'?cgagggcggcaagatcgctacgccgcgagg?3',
在以上的磷酸化的點突變引物中,將Asia1/HN/06毒株部分L和P12A基因序列中受體結合位點RGD點突變為RSD,用該引物進行平末端擴增,純化回收PCR產物,經室溫連接5min后,轉化大腸桿菌JM109,測序鑒定點突變后的陽性克隆,將得到的定點突變重組質粒命名為pMD20?Asia1P12A?RSD;
將O型口蹄疫病毒O/CHA/99株拯救系統的質粒prO/CHA/99與上述得到的Asia1/HN/06毒株部分L和P12A片段上受體結合位點經過點突變后的pMD20?Asia1P12A?RSD,分別用AflII和ClaI雙酶切,基因序列為SEQ ID NO:1,連接轉化至JM109感受態細胞中,測序鑒定陽性克隆,獲得含Asia1/HN/06毒株受體結合位點突變為RSD后的部分L和P12A的重組質粒,將重組質粒命名為prAsia1?RSD?FMDV;
②Asia1型口蹄疫重組病毒L基因SAP區域(SAF?A/B, Acinus, and PIAS)突變,其感染性克隆構建過程是:將表達質粒pCDNA3.1(+)用特異性引物進行擴增,得到含有PacI和AflII酶切位點的基因片段,上述引物分別是:
pCD?AflII?ApaI?F:5'?ttttccttaaggggcccgtttaaacccgctgat?3'
pCD?PacI?NheI?R:5'?cttacttaattaagctagccagcttgggtctcccta?3'
同時將O型口蹄疫病毒O/CHA/99株拯救系統的質粒prO/CHA/99,經PacI和AflII雙酶切后,與上述得到的含有PacI和AflII酶切位點的pCDNA基因片段連接轉化至JM109感受態細胞中,測序鑒定陽性克隆,獲得含O/CHA/99株5’UTR和部分L基因的重組質粒,將重組質粒命名為pCD?OL;以鑒定正確的重組質粒pCD?OL為模板,用磷酸化突變引物F?P和SAP?P進行PCR擴增,上述5'磷酸化的點突變引物分別是:
F?P:5'?gacctcacagggcttgaactgcacga?3'
SAP?P:5'?ctccgcctgcttggcggctgcaagcgtg?3', 
在以上的磷酸化的點突變引物中,將O/CHA/99株L基因中SAP區域進行突變,用此對引物進行平末端擴增,純化回收PCR產物,經室溫連接5min后,轉化大腸桿菌JM109,測序鑒定點突變后的陽性克隆,將得到的定點突變重組質粒命名為pCD?OL?SAP;
將已獲得含Asia1/HN/06毒株受體結合位點突變為RSD的重組質粒prAsia1?RSD?FMDV與上述得到的O/CHA/99株L基因中SAP區域進行突變后的重組質粒pCD?OL?SAP,分別用PacI和AflII雙酶切后,連接轉化至JM109感受態細胞中,測序鑒定陽性克隆,獲得含Asia1/HN/06毒株受體結合位點突變為RSD并且L基因中SAP區域突變的重組質粒, 將重組質粒命名為prAsia?RSD?SAP?FMDV;
(2)、Asia1型口蹄疫重組質粒轉染敏感細胞,具體為 BHK?21細胞或IBRS?2細胞,拯救獲得所述Asia1型口蹄疫重組病毒。

3.   根據權利要求2所述的Asia1型口蹄疫重組病毒的制備方法,其特征在于: Asia1型口蹄疫重組病毒是用所述重組質粒prAsia1?FMDV,直接轉染口蹄疫病毒敏感的細胞,BHK?21細胞或IBRS?2細胞,得到與流行毒株抗原匹配的Asia1型口蹄疫重組病毒。

4.   根據權利要求2所述的Asia1型口蹄疫重組病毒的制備方法,其特征在于:(1)、把Asia1型口蹄疫病毒P12A基因上的自然受體識別位點RGD突變成RSD,將重組質粒prAsia1?RSD?FMDV直接轉染口蹄疫病毒敏感的細胞,BHK?21細胞或IBRS?2細胞,得到的重組毒株rAsia1?RSD?FMDV對豬沒有致病性;
(2)、在重組質粒prAsia1?RSD?FMDV的基礎上,進一步對L基因的SAP進行突變,將重組質粒prAsia?RSD?SAP?FMDV直接轉染口蹄疫病毒敏感的細胞,BHK?21細胞或IBRS?2細胞,得到重組病毒rAsia?RSD?SAP?FMDV對豬和牛都沒有致病性,并且不形成血毒癥,不排毒,能夠產生較強免疫應答。

5.   一種利用權利要求1所述的Asia1型口蹄疫病毒來制備消除致病性的Asia1型口蹄疫重組病毒的疫苗,其特征在于:
培養的Asia1型口蹄疫重組病毒用二乙烯亞胺(Binary ethylenimine, BEI)滅活,濃縮純化后與ISA206佐劑以1:1體積比混合制備疫苗,免疫豬和牛后可有效刺激機體產生強抗體應答,產生早期免疫應答,并提供豬和牛體免疫保護作用,能夠有效保護GV和GII流行毒株,免疫保護率能達100%,半數保護劑量(PD50)在6.34~13.59。

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ASIA1 口蹄疫 重組 病毒 及其 制備 方法 應用
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