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一種鎮痛肽FI及其基因和應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201310236447.4

申請日:

2013.06.14

公開號:

CN103275187B

公開日:

2014.10.29

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有效性:

有權

法律詳情: 授權|||著錄事項變更IPC(主分類):C07K 7/06變更事項:申請人變更前:四川科倫新光生物科技開發有限公司變更后:四川合泰新光生物科技有限公司變更事項:地址變更前:610017 四川省成都市高新區馮家灣工業園科園南路88號變更后:610017 四川省成都市高新區馮家灣工業園科園南路88號變更事項:申請人變更前:中國科學院昆明動物研究所變更后:中國科學院昆明動物研究所|||實質審查的生效IPC(主分類):C07K 7/06申請日:20130614|||公開
IPC分類號: C07K7/06; C12N15/12; A61K38/08; A61P29/00 主分類號: C07K7/06
申請人: 四川合泰新光生物科技有限公司; 中國科學院昆明動物研究所
發明人: 杜彥軍; 劉音; 賴仞; 容明強; 朱玉琴
地址: 610017 四川省成都市高新區馮家灣工業園科園南路88號
優先權:
專利代理機構: 成都金英專利代理事務所(普通合伙) 51218 代理人: 袁英
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310236447.4

授權公告號:

103275187B|||||||||

法律狀態公告日:

2014.10.29|||2014.07.09|||2013.10.09|||2013.09.04

法律狀態類型:

授權|||著錄事項變更|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種皮膚鎮痛肽FI及其基因和應用。它包含6個氨基酸殘基,分子量為717.87Da,等電點為5.52,其氨基酸序列如SEQID:1所示,編碼鎮痛肽FI的DNA序列如SEQID:2所示。本發明的鎮痛肽FI在小鼠醋酸扭體疼痛模型,福爾馬林疼痛模型、擺尾實驗以及熱板實驗中表現出良好的鎮痛效果,能夠在制備鎮痛藥物中的應用;且該鎮痛肽FI具有結構簡單、人工合成方便,生產成本低等優點,利用工業大量生產,具有重要的應用前景和實際意義。

權利要求書

權利要求書
1.   一種鎮痛肽FI,其特征在于,它包含6個氨基酸殘基,分子量為717.87 Da,等電點為5.52,其氨基酸序列如SEQ ID:1所示。

2.   編碼權利要求1所述一種鎮痛肽FI的DNA序列,其核苷酸序列如SEQ ID:2所示。

3.   如權利要求1所述一種鎮痛肽FI在制備鎮痛藥物中的應用。

說明書

說明書一種鎮痛肽FI及其基因和應用
技術領域
本發明屬于生物醫學技術領域,具體涉及一種鎮痛肽FI及其基因和應用。
背景技術
疼痛是人們一生中經常遇到的不愉快的感覺,它提供軀體受到威脅的警報信號,是生命不可缺少的一種特殊保護功能;另一方面,它又是各種疾病最常見的癥狀,也是當今困擾人類健康最嚴重的問題之一。從當今世界范圍來看,疼痛已經成為危害人類健康的主要“殺手”之一,也是造成人們勞動能力降低和出勤日減少的最普通、最直接的因素。鎮痛藥物是一類能夠減輕疾病痛苦的物質,不僅能夠選擇地減輕或緩解疼痛感覺,也可以緩解因劇烈疼痛而引起的恐懼、緊張及焦慮等不愉快的情緒。目前的鎮痛藥物可以分為解熱鎮痛藥和麻醉鎮痛藥物兩類,前者以阿司匹林為代表,通過對組織中前列腺素合成過程的抑制作用,減輕神經末梢對致痛物質的敏感性,主要用于解除炎癥性疼痛和其他鈍疼;后者以嗎啡為代表,其作用部位主要在丘腦和皮層,作用于中樞神經系統中的μ?型阿片受體,以緩解銳痛、鈍痛和內臟絞痛,從而產生鎮痛作用,主要用于各種疾病所引起的疼痛和手術后病人的嚴重疼痛,特別是晚期癌癥疼痛。但是目前這種以嗎啡為代表的麻醉性鎮痛藥物存在成癮性強,戒斷癥狀嚴重,病人必須不斷增加劑量才能維持鎮痛效果,而且最終導致對這類藥物失效,同時對神經損傷性疼痛無療效等主要缺點。
在中國的傳統中藥和民族醫藥中,許多兩棲類動物被作為藥材而被廣泛的應用,如中華蟾蜍Bufogargarizans,大蹼鈴蟾Bombinamaxima,黑斑蛙Pelophylaxnigromaculata,沼蛙hylaranaguentheri和澤蛙Euphlyctislimnocharis等,這些兩棲類動物的皮膚和內臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效,已報道藥理活性有:光譜抗菌作用、抗腫瘤、局部麻醉、鎮痛、免疫調節、對心血管系統的作用等;另一方面,傳統中藥藥物成分的復雜性及其炮制方法的局限性也是造成藥物活性成分不能更好發揮作用的中藥原因,因而從這些傳統藥物中尋找特定的活性單體化合物是中藥現代化的中藥內容之一。在國外,兩棲類皮膚特定藥理活性單體化合物的尋找已經成為新藥發明的熱點。近十幾年對170多種兩棲類皮膚活性肽和類似物進行了篩選,證明有40多種活性肽有較好的藥物開發前景。
我國對兩棲類藥物的應用有悠久的歷史,但對其活性成分和藥理性質的研究主要集中于生物堿等有機小分子,對其皮膚活性蛋白肽類物質的研究還較少。東北雨蛙為雨蛙科雨蛙屬的 兩棲動物,主要分布于日本北海道和屋久島,以及黑龍江、遼寧、吉林、內蒙等地,主要棲息于樹上生活,為了逃避多種生物天敵的侵襲和適應多變的自然環境以及避免受傷機體損傷,在長期的進化過程中,雨蛙的皮膚發展成為具有多種功能的器官,如:分泌大量抗菌肽抵御微生物侵襲;分泌神經毒素對抗各類天敵;分泌生長因子促進傷口愈合等。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的缺點,提供一種鎮痛肽FI;
本發明的另一個目的在于提供編碼鎮痛肽FI的氨基酸序列和基因序列;
本發明的又一目的在于提供一種鎮痛肽FI在制備鎮痛藥物中的應用。
本發明的目的通過以下技術方案來實現,鎮痛肽FI,它包含6個氨基酸殘基,分子量為717.87Da,等電點為5.52,其氨基酸序列如SEQ ID:1所示,為:苯丙氨酸?色氨酸?脯氨酸?纈氨酸?異亮氨酸?甘氨酸。
編碼一種鎮痛肽FI的DNA序列,其核苷酸序列如SEQID:2所示,為:
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本發明的鎮痛肽FI在制備鎮痛藥物中的應用。
本發明的有益效果是:實驗證明,本發明中的鎮痛肽FI具有良好的鎮痛效果,能夠作為制備鎮痛藥物中的應用。且該鎮痛肽FI具有結構簡單、人工合成方便,生產成本低等優點,利用工業大量生產,具有重要的應用前景和實際意義。
附圖說明
圖1為鎮痛肽FI對小鼠擺尾模型的鎮痛效果示意圖。
圖2為鎮痛肽FI對小鼠熱板模型的鎮痛效果示意圖。
圖3為鎮痛肽FI對小鼠扭體鎮痛模型的鎮痛效果示意圖。
圖4為鎮痛肽FI對小鼠福爾馬林鎮痛模型的鎮痛效果示意圖。
具體實施方式
下面結合附圖對本發明做進一步的描述,本發明的保護范圍不局限于以下所述:
實施例1:東北雨蛙皮膚鎮痛肽FI基因克隆
I.東北雨蛙皮膚總RNA的提取
A.活體東北雨蛙用水清洗干凈,液氮中速凍4h,取皮膚組織300mg,加入10mlTrizol提取緩沖液(美國GIBCOBRL公司產品),置于20ml玻璃勻漿器中勻漿30min;
B.加入等體積酚/氯仿溶液,劇烈振蕩混勻,室溫放置10min后,于4℃,12000rpm離心機中離心10min,取上清液;
C.上清液中加入等體積異丙醇,室溫放置10min后,于4℃,12000rpm離心機中離心10min,沉淀用75%乙醇洗一次,晾干,即為東北雨蛙皮膚總RNA。
D.將所獲皮膚總RNA用適量DEPC水溶解,于28OIun、260nm波長處檢測所提取的總RNA的濃度及純度。
II.東北雨蛙皮膚mRNA的純化
東北雨蛙皮膚mRNA分離純化采用美國PROMEGA公司的mRNAIsolation Systems試劑盒。
A.取東北雨蛙皮膚總RNA500μg溶于500μlDEPC水中,65℃水浴10min,加入3μl的Oligo(dT)探針和13μl20×SSC溶液,混合均勻,室溫冷卻,稱為A液。
B.磁珠(SA?PMP)的洗滌:將磁珠輕彈混勻,至磁力架吸附30s,棄上清,加0.5×SSC0.3ml,至磁力架吸附30s,再加0.1ml0.5×SSC懸液,稱為B液。
C.將A液加入B液中,置室溫10min,至磁力架吸附30s,棄上清,用0.1×SSC洗滌4次,再棄上清,加0.1mlDEPC水懸浮,至磁力架上吸附30s,將上清移至新的試管,再加入0.15mlDEPC水重新懸浮,至磁力架吸附30s,移上清至上述試管,上清液為純化的東北雨蛙皮膚mRNA。
D.加入1/10體積3M乙酸鈉,pH5.2,等體積異丙醇,于?70℃放置30min,4℃,12000rpm離心10min,棄上清,沉淀溶解于10μlDEPC水中。
III.東北雨蛙皮膚cDNA文庫構建
采用CLONTECH公司CreatorTMSMARTTMcDNA Library Construction Kit質粒cDNA文庫構建試劑盒。
A.cDNA第一鏈合成(mRNA反轉錄):
1.在0.5ml無菌的離心管中加入1μl華南雨蛙皮膚mRNA、1μlSMARTIV寡聚核苷酸、1μlCDSIII/3’PCR引物,加2μl去離子水使總體積達到5μl。
2.混勻離心管中的試劑并短暫離心,72℃保溫2min。
3.將離心管在冰上孵育2min。
4.在離心管中加入以下試劑:2.0μl5×第一鏈緩沖、1.0μl20mM二硫蘇糖醇、1.0μl10mM dNTP混合物、1.0μlPowerScript反轉錄酶。
5.混合離心管中試劑并短暫離心,在42℃保溫1h。
6.將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。
7.從離心管去2μl所合成的cDNA第一鏈備用。
B.采用長末端聚合酶鏈式反應(LD?PCR)方法擴增第二鏈
1.95℃預熱PCR儀。
2.將2μlcDNA第一鏈(mRNA反轉錄)、80μl去離子水、10μl10×Asvantage2PCR緩沖、2μl50×dNTP混合物、2μl5’PCR引物、2μlCDSIII/3’PCR引物以及2μl大腸桿菌聚合酶離心管進行反應。
3.在PCR儀中按以下程序擴增:
① 95℃ 20s
②22個循環
95℃ 5s;68℃ 6s
4.循環結束后,將離心管中合成的cDNA雙鏈進行抽提。
C.PCR產物用PROMEGA公司的SV Gel and PCR Clean?Up System試劑盒進行抽提回收,步驟如下:
1.將通過PCR得到的cDNA雙鏈加入等體積的膜結合緩沖顛倒混勻,然后將混和液轉入離心純化柱,室溫靜置5分鐘,使DNA充分與硅膠膜結合。16,000g離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液。
2.加入700μl的洗脫液(含乙醇)于離心純化柱中,16,000g離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液。
3.重復步驟2。
4.16,000g離心5分鐘。
5.將離心純化柱置于新的離心管中。
6.加入30μl超純水,在室溫下靜置5分鐘。
7.16,000g離心1分鐘,管底溶液即為所純化過的cDNA雙鏈。
D.大腸桿菌DH5α感受態細胞的制備:
1.挑取單個DH5α菌落,接種于3m1不含氨芐青霉素的LB培養基中,37℃培養過夜,次日取上述菌液按比例1:100再接種于50m1LB培養液中,37℃振蕩2小時。當OD600值達到0.35時,收獲細菌培養物。
2.將細菌轉移到一個無菌、一次性使用的、用冰預冷的50m1聚丙烯管中,在冰上方置10min,使培養物冷卻至0℃。
3.于4℃以4100r/min離心10min,以回收細胞。
4.倒出培養液,將管倒置lmin以使最后的痕量培養液流盡。
5.每50ml初始培養液且30ml預冷的0.1mol/LCaCl2?MgCl2溶液(80mmol/LMgCl2,20mmol/LCaCl2)重懸每份細胞沉淀。
6.于4℃以4100r/min離心10min,以回收細胞。
7.倒出培養液,將管倒置lmin以使最后的痕量培養液流盡。
8.每50m1初始培養物用2m1用冰預冷的0.1mol/LCaCl2重懸每份細胞沉淀,分裝后備用。
E.酶切、連接以及連接產物的轉化:
1.在微量離心管中加入1μlTakarapMD19?T載體、4μl東北雨蛙cDNA雙鏈溶液,全量為5μl。
2.加入5μl(等量)的連接酶緩沖混合物。
3.16℃反應2小時。
4.全量(10μl)加入至100μlDH5α感受態細胞中,冰中放置30分鐘。
5.42℃加熱90秒鐘后,再在冰中放置1分鐘。
6.加入37℃溫浴過的LB培養基890μl,37℃緩慢振蕩培養60分鐘。
7.取200μl涂布于含有X?Gal、IPTG、Amp的LB培養基上37℃培養16小時,形成單菌落。
8.每個LB平皿用5m1LB液體培養基洗滌菌落,加30%甘油凍存,構建的cDNA大約含1×106個單獨克隆。
IV.東北雨蛙皮膚FI基因克隆篩選
擴增引物長度為17個核苷酸其序列為5’TACCGAAAGAACTCAATTTA3’,PCR另一擴增引物為CLONTECH公司SMARTTMcDNALibraryConstructionKit中的3’PCRPrimer引物,其序列為5'ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG3'。
PCR反應在如下條件下進行:94℃30秒鐘,56℃30秒鐘和72℃45秒鐘,30個循環。
將擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,切取目的條帶,用DNA純化試劑盒進行純化。將純化的目的片段連接到pMD19?T載體中,即得連接產物。將連接產物轉化預先制備好的大腸桿菌DH5α感受態細胞。最后,取適量轉化產物涂布至含Amp的LB平板上,經37℃培養16h形成的單菌落即為含目的片段的陽性克隆。
V.東北雨蛙皮膚FI基因測定
挑取單菌落用M13引物檢測插入片段的大小。挑選含目的片段的陽性克隆送DNA測序公司測序。
東北雨蛙皮膚FI包含6個氨基酸殘基,分子量為717.87Da,等電點為5.52,其氨基酸序列如SEQID:1所示,為:苯丙氨酸?色氨酸?脯氨酸?纈氨酸?異亮氨酸?甘氨酸。
編碼東北雨蛙皮膚鎮痛肽FI的DNA序列,其核苷酸序列如SEQ ID:2所示,為:
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實施例2:制備鎮痛肽FI
A.稱取樹脂0.2g放置于干燥潔凈的反應管中,加入適量的N,N?二甲基酰胺(DMF),活化30分鐘作用,將稱取第一氨基酸殘基1mmol,DMAP150mg加入到反應管中,DMF做為溶劑反應3小時。反應完畢后用DMF洗3?6次,加入適當的吡啶和乙酸酐,體積比為1:1,反應30min。反應完畢后DMF洗3?6次。然后用哌啶洗脫氨基酸的保護基團Fmoc,洗脫兩次每次15min,再用DMF洗4次,甲醇洗2次。
B.稱第二個氨基酸3mmol,HBTU3mmol于反應管中,加入DIEA0.5ml,反應40分鐘,用DMF洗3?6次,加入哌啶溶液兩次洗脫氨基酸的保護基團Fmoc,每次10分鐘,再用DMF洗4次,甲醇洗2次。
C.重復第二個步驟直到最后一個氨基酸殘基。
D.最后一個氨基酸反應完畢后,用三氟乙酸切割2小時,反應抽濾,得到多肽的三氟乙酸溶液,用乙醚沉淀,離心,再用乙醚洗3?5遍,得到白色固體,經過HPLC脫鹽凍干得到多肽樣本。
實施例3:鎮痛肽FI對小鼠擺尾模型的鎮痛實驗
取重量為18~22g昆明小鼠,用鼠尾測痛儀篩選出基礎痛閾在3~7s的小鼠50只用于試驗,測定方法為:鼠尾測痛儀的紅外光束照在距離小鼠尾巴根部的1/3處,痛閾時間是指從小鼠接受紅外光束照射到小鼠發生擺尾動作之間的時間間隔,并記錄小鼠的基礎痛閾值。將小鼠分為5組,每組10只,分別為陰性對照組、陽性對照組組、治療組1、治療組2、治療組3,將鎮痛肽FI凍干粉溶解于無菌生理鹽水中,制備1.25mg/kg、2.5mg/kg、5.0mg/kg的鎮痛肽FI,采用腹腔注射方式給藥,陽性對照組注射100μL5mg/kg嗎啡,治療組1注射100μL1.25mg/kg鎮痛肽FI,治療組2注射100μL2.5mg/kg鎮痛肽FI,治療組3注射100μL5.0mg/kg鎮痛肽FI,陰性對照組注射無菌生理鹽水,體積為100μL,在注射給藥后10min、30min、60min、180min、360min測定小鼠的痛閾值。為了避免造成小鼠的組織傷害,如果小鼠給藥后痛閾值大于10s,該小鼠的痛閾值就記為10s,結果見圖1。
如圖1所示:與對照組相比,小鼠注射鎮痛肽FI后,能夠明顯減輕小鼠的疼痛。
實施例4:鎮痛肽FI對小鼠熱板模型的鎮痛實驗
取雌性小鼠,昆明種,重量為18~22g,用鼠尾測痛儀篩選出基礎痛閾在5~30s的小鼠50只用于試驗,測試方法為:將小鼠置于熱板上,熱板溫度保持在55±0.5℃,小鼠在熱板上的反應時間是指從小鼠放到熱板上到小鼠發生添后足行為或者直接跳出熱板之間的時間間隔,并記錄小鼠的基礎痛閾值。將小鼠分為5組,每組10只,分別為陰性對照組、陽性對照組、治療組1、治療組2、治療組3,將鎮痛肽FI凍干粉溶解于無菌生理鹽水中,制備1.25mg/kg、2.5mg/kg、5.0mg/kg的鎮痛肽FI,采用腹腔注射方式給藥,陽性對照組注射100μL5mg/kg嗎啡,治療組1注射100μL1.25mg/kg鎮痛肽FI,治療組2注射100μL2.5mg/kg鎮痛肽FI,治療組3注射100μL5.0mg/kg鎮痛肽FI,陰性對照組注射無菌生理鹽水,體積為100μL,在注射給藥后10min、30min、60min、180min、360min測定小鼠的痛閾值,為了避免造成小鼠的組織傷害,如果小鼠給藥后痛閾值大于60s,該小鼠的痛閾值就記為60s,結果見圖2。
如圖2所示:與對照組相比,小鼠注射鎮痛肽FI后,能夠明顯減輕熱板造成的疼痛。
實施例5:鎮痛肽FI對小鼠扭體鎮痛模型的鎮痛實驗
取重量為18~22g昆明小鼠50只,分為5組,每組10只,分別為陰性對照組、陽性對照組、治療組1、治療組2、治療組3,將鎮痛肽FI凍干粉溶解于無菌生理鹽水中,制備1.25mg/kg、2.5mg/kg、5.0mg/kg的鎮痛肽FI,采用腹腔注射方式給藥,陽性對照組注射100μL5mg/kg嗎啡,治療組1注射100μL1.25mg/kg鎮痛肽FI,治療組2注射100μL2.5mg/kg鎮痛肽FI,治療組3注射100μL5.0mg/kg鎮痛肽FI,陰性對照組注射無菌生理鹽水,體積為100μL,30min后,腹腔注射0.6%的乙酸(10ml/kg體重),計數小鼠注射乙酸后30min的扭體次數,結果見圖3。
如圖3所示:小鼠注射生理鹽水、5mg/kg嗎啡、1.25mg/kgFI、2.5mg/kgFI、5.0mg/kgFI,小鼠扭體次數分別為:62、27.9、48.1、32.5和26.9次,實驗表明:鎮痛肽FI能夠明顯減輕乙酸造成的疼痛。
實施例6:鎮痛肽FI對小鼠福爾馬林鎮痛模型的鎮痛實驗
取重量為18~22g昆明小鼠50只,分為5組,每組10只,分別為陰性對照組、陽性對照組、治療組1、治療組2、治療組3,將鎮痛肽FI凍干粉溶解于無菌生理鹽水中,制備1.25mg/kg、2.5mg/kg、5.0mg/kg的鎮痛肽FI,采用腹腔注射方式給藥,陽性對照組注射100μL5mg/kg嗎啡,治療組1注射100μL1.25mg/kg鎮痛肽FI,治療組2注射100μL2.5mg/kg鎮痛肽FI,治療組3注射100μL5.0mg/kg鎮痛肽FI,陰性對照組注射無菌生理鹽水,體積為100μL,30min后,在小鼠的腳掌處注射20mL濃度為0.92%福爾馬林,采用攝像記錄小鼠總舔腳時間,結果見圖4。
如圖4所示:小鼠注射生理鹽水、5mg/kg嗎啡、1.25mg/kgFI、2.5mg/kgFI、5.0mg/kgFI,0~5min小鼠舔趾時間分別為:142.2、57.6、108.4、83.1和71.9次;15~30min小鼠舔趾時間分別為:372.1、258.7、287.6、247.7和216.6次,實驗表明:鎮痛肽FI能夠明顯減輕福爾馬林造成的疼痛。

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