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應用于軟硬組織修復與再生的生物醫學材料.pdf

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應用于 軟硬 組織 修復 再生 生物醫學 材料
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摘要
申請專利號:

CN201110369350.1

申請日:

2011.11.18

公開號:

CN102973982B

公開日:

2014.12.10

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61L 27/54申請日:20111118|||公開
IPC分類號: A61L27/54; A61L27/10; A61L27/12; A61L27/18; A61L27/22; A61L27/24; A61L27/44; A61L27/50; A61K6/02; A61K6/033; A61K6/097 主分類號: A61L27/54
申請人: 財團法人工業技術研究院
發明人: 蔡佩宜; 溫奕泓; 黃志杰; 李佩珊; 沈欣欣; 林溢泓; 呂居勛
地址: 中國臺灣新竹縣
優先權: 2011.09.07 TW 100132196
專利代理機構: 北京市柳沈律師事務所 11105 代理人: 陳小雯
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201110369350.1

授權公告號:

102973982B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.10|||2013.04.17|||2013.03.20

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明的一實施例,提供一種生物醫學材料,包括:生物相容性材料;以及載體,分布于該生物相容性材料的表面,其中該生物相容性材料與該載體兩者均不帶電荷、其中之一帶電荷或兩者均帶電荷但為相異電性,其中該載體與該生物相容性材料的重量比為1∶100,000~1∶100,最優選為1∶10,000~1∶1,000。本發明的生物醫學材料可作為牙科、骨科、傷口愈合或醫學美容的用途及應用于各種軟硬組織的修復與再生。

權利要求書

權利要求書一種生物醫學材料,包括:
生物相容性材料;以及
載體,分布于該生物相容性材料的表面,其中該生物相容性材料與該載體兩者均不帶電荷、其中之一帶電荷或兩者均帶電荷但為相異電性,其中該載體與該生物相容性材料的重量比為1∶100,000~1∶100。
如權利要求1所述的生物醫學材料,其中該載體與該生物相容性材料的重量比為1∶10,000~1∶1,000。
如權利要求1所述的生物醫學材料,其中該生物相容性材料為多孔性生物相容性材料。
如權利要求3所述的生物醫學材料,其中該載體還包括分布于該多孔性生物相容性材料的孔隙中或包覆于該多孔性生物相容性材料中。
如權利要求1所述的生物醫學材料,其中該生物相容性材料包括羥基磷灰石?磷酸三鈣、β?磷酸三鈣、α?磷酸三鈣、生物活性玻璃陶瓷、硫酸鈣、骨水泥、明膠、膠原蛋白、聚乳酸?甘醇酸、聚己內酯多元醇或彈性蛋白。
如權利要求1所述的生物醫學材料,其中該載體由油脂所構成。
如權利要求6所述的生物醫學材料,其中該油脂包括磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、1,2?二油酰氧基?3?三甲基氨基丙烷、2,3?二油酰氧基丙基?三甲基氯化銨、磷脂酸、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、3β?[N?(N′,N′?二甲基胺乙基)胺基甲酰基]膽固醇、雙十六烷基磷酸鹽或其衍生物。
如權利要求6所述的生物醫學材料,其中該油脂的重量份為0.1~30,以該載體為100重量份計。
如權利要求6所述的生物醫學材料,其中該載體還包括維生素A、C、D、E、K、B1、B3、B6、B7、B12、葉酸、泛酸或其衍生物。
如權利要求6所述的生物醫學材料,其中該載體還包括鉀、鈣、鐵、鎂、鋅、銅、錳、鉬、鎳、硅、鉻、磷、硫或氯。
如權利要求1所述的生物醫學材料,還包括生物活性物質,該生物活性物質包覆于該載體內。
如權利要求11所述的生物醫學材料,其中該生物活性物質包括生長因子、蛋白質、勝肽、DNA或RNA。
如權利要求11所述的生物醫學材料,其中該生物活性物質包括細胞激素、細胞外基質或細胞附著分子。
如權利要求11所述的生物醫學材料,其中該生物活性物質包括富含血小板血漿、粒細胞或干細胞。
如權利要求1所述的生物醫學材料,還包括多糖體層,包覆該生物醫學材料。
如權利要求15所述的生物醫學材料,其中該多糖體層具有正電荷或負電荷。
一種應用于軟硬組織修復與再生的生物醫學材料,包括:
生物相容性材料;以及
載體,分布于該生物相容性材料的表面,其中該生物相容性材料與該載體兩者均不帶電荷、其中之一帶電荷或兩者均帶電荷但為相異電性,其中該載體與該生物相容性材料的重量比為1∶100,000~1∶100。
如權利要求1所述的生物醫學材料在制備用于軟硬組織修復與再生的醫學材料中的用途。

說明書

說明書應用于軟硬組織修復與再生的生物醫學材料
【技術領域】
本發明涉及一種生物醫學材料(biomedical material),特別是涉及一種長效釋放控制并可有效保護生物活性物質的生物醫學材料。
【背景技術】
目前,牙(骨)缺損修復醫材主要以Cotton?Gauze?based(第一代)及例如β?磷酸三鈣(β?TCP)、羥基磷灰石(hydroxyapatite)、生物活性玻璃(bioactive glass)或膠原蛋白(collagen?based)等的第二代材料為主流,而現階段牙缺損修復產品的國際大廠(例如Nobel Biocare、Straumann、Biomet 3i、Zimmer Dental、Dentsply Friadent)已進入第三代材料的研發,開發具有抗菌、抗發炎及活性治療(active therapy)功能的產品,但上述產品仍會有填補物逆流及牙骨再生不良的情況發生,因此,如何有效包覆生物活性物質及包覆材料如何產生有效成骨細胞結合生成反應(osteoblast migration and binding)是目前臨床治療上眾所期待解決的問題。
盡管目前已有開發生物醫學載體內包含生長因子(growth factor,GF)的活性治療技術,例如:Medtronic infuse;吸附rhBMP?2蛋白的第一型牛膠原蛋白載體(bovine collagen carrier)(包括海綿狀膠原蛋白(collagen sponge)與顆粒狀膠原蛋白(collagen particles)),但包覆效果不佳,臨床治療上無法確定海綿狀膠原蛋白實際吸附BMP?2(其價格非常昂貴:10μg/300US)的量,故實際使用量通常需高出理論用量,且海綿狀膠原蛋白吸附的BMP?2進入體內后極易在短時間內大量釋放,且保存期限(shelf life)太短。此外,生長因子(GF)本身即是一種蛋白質,在酸、堿及有機溶劑的作用下皆易變性(denature)與降解(degradation),在臨床使用上亦會快速流失。對此,許多市面上產品改以高濃度含量來避免流失,然而這種做法易造成諸多副作用。因此,開發一種適合且具生物相容性的包覆材料與傳輸材料是相當急迫的研究。
【發明內容】
本發明的一實施例,提供一種生物醫學材料,包括:生物相容性材料;以及分布于該生物相容性材料的表面的載體,其中該生物相容性材料與該載體兩者均不帶電荷、其中之一帶電荷或兩者均帶電荷但為相異電性,其中該載體與該生物相容性材料的重量比為1∶100,000~1∶100或1∶10,000~1∶1,000。本發明生物醫學材料可作為牙科、骨科、傷口愈合或醫學美容的用途及應用于各種軟硬組織的修復與再生。
本發明以不含電荷或含正/負電荷的納米載體(nanocarrier)作為包覆生物活性物質的材料,可通過調整載體本身的配方組成來提高生物活性物質的功效及包覆率,例如以磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)/維生素作為載體材料時,可進一步提高人類骨形成蛋白(BMP?2)所產生堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性。后續可利用正、負電荷吸引的方式,將載體吸附固定于生物醫學級材料(例如生物活性玻璃陶瓷(bioactive glass ceramic)、骨水泥(bone cement)等)的表面及孔隙內,或可使用造粒或壓錠等方式,使至少一種不帶電荷的生物相容性材料與納米載體兩者相結合。本發明的生物醫學材料(本發明稱之為Agglomer)外層進一步包覆生物醫學級醫材原料(例如同時帶有正電荷與負電荷的多糖體(polysaccharide)、膠原蛋白)(此技術稱為層?層包覆(layer by layer coating)),以達成長效釋放控制并可有效保護生物活性物質。本發明Agglomer的尺寸大小可通過上述作為核心結構的生物醫學級材料(例如生物活性玻璃陶瓷、骨水泥等)的大小加以控制,而Agglomer外層所包覆的厚度則可通過組裝層數與組裝條件加以控制。本發明生物醫學材料所形成的微粒(microsphere)在臨床上易操作使用,可作為廣效、即時性的骨再生填充修補物,彌補現階段的產品缺陷,有利于發展成新一代骨科(牙科)修復醫材產品。
本發明納米載體包覆技術,配合生物醫學材料(即Agglomer)的技術開發可達到骨傳導(osteoconduction)與骨誘發(osteoinduction)之間的整合,使骨生長獲得支撐,符合生物力學需求,并進一步達到長效釋放控制、準確定量生物活性物質濃度以及避免生物活性物質變性(denature)等功效。
本發明制備納米載體的過程中,以磷脂酰膽堿(PC)為主的脂質體(liposome)原料經減壓蒸餾后形成薄膜,再將例如富含血小板血漿(PRP)、人類骨形成蛋白(BMP?2)或欲包覆的生物活性物質,利用低溫超聲波震蕩進行包覆。可利用不同脂質體配方組成調控載體帶電性及界面穩定性,以利于后續與生物醫學材料(即Agglomer)的結合。
本發明以上述納米載體、微粒(microsphere)并結合各種生物醫學材料作為骨科/牙科的修復材料。各種生物醫學材料包括生物活性玻璃陶瓷、骨水泥、膠原蛋白等。實際應用方式應視使用目的及用途而加以選擇。本發明以具備便利、簡易使用的壓錠技術為例作說明,但實際應用方式并不以此壓錠技術為限。首先,將各種生物醫學骨材(例如生物活性玻璃陶瓷、羥基磷灰石?磷酸三鈣(HATCP)、β?磷酸三鈣(β?TCP)、硫酸鈣(Ca2SO4)、明膠(gelatin)、聚乳酸?甘醇酸(PLGA)等)的粉體或顆粒結合包覆例如BMP?2等活性因子的納米載體/微粒,接著,即直接、快速地以壓錠機壓錠制作骨材。此外,可使用不同形狀的模具以適應各部位需求,并可依據不同需求進行配方設計(例如加入粘合劑、崩解劑(disintegrant)、潤滑劑或崩解抑制劑等),以達緩釋、加強硬度等效果。壓錠技術的優點包括:1.可正確控制劑量,2.可依據配方設計控制藥物解離速率,3.易于大量生產,成本低廉,以及4.運輸保存及給藥方便。
為讓本發明的上述目的、特征及優點能更明顯易懂,下文特舉一優選實施例,作詳細說明如下:
【附圖說明】
圖1系根據本發明的一實施例,一種生物醫學材料;
圖2系根據本發明的一實施例,一種生物醫學材料;
圖3系根據本發明的一實施例,一種生物醫學材料;
圖4系根據本發明的一實施例,一種生物醫學材料膠囊;
圖5系根據本發明的一實施例,包覆生物活性物質(BMP?2)的納米載體(磷脂酰膽堿(PC)/膽固醇)對堿性磷酸酶(ALP)活性的影響;
圖6系根據本發明的一實施例,包覆生物活性物質(BMP?2)的納米載體(磷脂酰膽堿(PC)/維生素)對堿性磷酸酶(ALP)活性的影響;
圖7系根據本發明的一實施例,包覆生物活性物質(BMP?2)的納米載體(磷脂酰膽堿(PC)/維生素A)對堿性磷酸酶(ALP)活性的影響;
圖8系根據本發明的一實施例,富含血小板血漿(PRP)中TGF?β1含量隨時間的變化;
圖9系根據本發明的一實施例,富含血小板血漿(PRP)中PDGF?AB含量隨時間的變化;
圖10系根據本發明的一實施例,生物醫學材料(Agglomer)的釋放控制曲線;
圖11系根據本發明的一實施例,生物醫學材料(Agglomer)對堿性磷酸酶(ALP)活性的影響;
圖12A~12E系根據本發明的一實施例,生物醫學材料(Agglomer)與其他對照組對骨修復的效果;
圖13系根據本發明的一實施例,生物醫學材料(Agglomer)與其他對照組對骨體積增加的效果。
【主要附圖標記說明】
10~生物醫學材料;
12~多孔性生物相容性材料;
14~載體;
16~多糖體層;
18~膠原蛋白層;
20~膠囊;
22~抗微生物劑。
【具體實施方式】
根據本發明的一實施例,披露了一種生物醫學材料,如圖1所示。生物醫學材料10包括生物相容性材料12以及載體14。載體14分布于生物相容性材料12的表面。值得注意的是,生物相容性材料12與載體14可兩者均不帶電荷、其中之一帶電荷或兩者均帶電荷但為相異電性。載體14的電性可根據生物相容性材料12的電性加以調整,以使載體14與生物相容性材料12的電性相異。在一實施例中,可通過官能基化調整原中性載體的電性為負電性或正電性。在一實施例中,載體14與生物相容性材料12的重量比大體為1∶100,000~1∶100,亦可為1∶10,000~1∶1,000。
在一實施例中,生物相容性材料12可為多孔性生物相容性材料。在此實施例中,載體14可分布于多孔性生物相容性材料12的表面或孔隙中,如圖1所示,或包覆于多孔性生物相容性材料12中。生物相容性材料12可包括羥基磷灰石?磷酸三鈣(hydroxyapatite tricalcium phosphate,HATCP)、β?磷酸三鈣(β?tricalcium phosphate,β?TCP)、α?磷酸三鈣(α?tricalcium phosphate,α?TCP)、生物活性玻璃陶瓷(bioactive glass ceramic)、硫酸鈣、骨水泥(bone cement)、明膠(gelatin)、膠原蛋白(collagen)、聚乳酸?甘醇酸(poly(lactic?co?glycolic acid),PLGA)、聚己內酯多元醇(polycaprolactone,PCL)或彈性蛋白(elastin)。
載體14可由油脂所構成。構成載體14的油脂可包括例如雙亞麻酰基磷脂酰膽堿(dilinoleoyl phosphatidylcholine,DLPC)、二油酰基磷酯酰膽堿(dioleoyl phosphatidylcholine,DOPC)或二硬脂酰基磷脂酰膽堿(distearoyl phosphatidylcholine,DSPC)的磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)、例如二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(distearoyl phosphatidylethanolamine,DSPE)或二油酰基磷脂酰乙醇胺(dioleoyl phosphatidylethanolamine,DOPE)的磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)、1,2?二油酰氧基?3?三甲基氨基丙烷(1,2?dioleoyloxy?3?trimethylammonium propane,DOTAP)、2,3?二油酰氧基丙基?三甲基氯化銨(2,3?dioleoyloxypropyl?trimethylammonium chloride,DOTMA)、例如二油酰基磷脂酸(dioleoyl phosphatidic acid,DOPA)的磷脂酸(phosphatidic acid,PA)、磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)、例如二油酰基磷脂酰甘油(dioleoyl phosphatidylglycerol,DOPG)的磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG)、3β?[N?(N′,N′?二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]膽固醇(3β?[N?(N′,N′?dimethylaminoethane)?carbamoyl]cholesterol,DC?CHOL)、雙十六烷基磷酸鹽(dihexadecyl phosphate,DHDP)或其衍生物。載體14中,油脂的重量份大體為0.1~30重量份,優選為1~15重量份,均以載體14為100重量份計。載體14可還包括維生素A、C、D、E、K、B1、B3、B6、B7、B12、葉酸(folate)、泛酸(pantothenic acid)或其衍生物等各種生理必須維生素,或是鉀、鈣、鐵、鎂、鋅、銅、錳、鉬、鎳、硅、鉻、磷、硫或氯等各種生理必須元素或礦物質。
生物醫學材料10還可包括生物活性物質(未圖示),包覆于載體14內。生物活性物質可包括各種生長因子(growth factor,GF)、蛋白質、多肽(polypeptide)、DNA、RNA、細胞激素(cytokines)、細胞外基質(extracellular matrix,ECM)、細胞附著分子(cell adhesion molecules,CAM)、富含血小板血漿(platelets rich plasma,PRP)、粒細胞(granulocytes)或干細胞(stem cells)等。上述生物活性物質的尺寸大小大體為2~10,000nm。
生物醫學材料10外部還可包覆有多糖體層16,如圖2所示。多糖體層16可同時具有正電荷與負電荷。在一實施例中,多糖體層16可由例如負電荷的藻酸鹽(alginate)與例如正電荷的殼聚糖(chitosan)所構成。在一實施例中,在多糖體層16外層,還可包覆有膠原蛋白(collagen)層18,如圖3所示。
生物醫學材料10可為單一顆粒狀結構,其粒徑大體為10~500μm。在一實施例中,上述呈顆粒狀結構的生物醫學材料10亦可通過使用例如生物粘著劑的生物粘著技術使多個顆粒狀結構彼此聚集粘著而形成聚集體,該聚集體尺寸大小可大于50μm,或大于1,000μm。
生物醫學材料10與外層的多糖體層16及膠原蛋白(collagen)層18可進一步制備形成膠囊20,如圖4所示,例如軟殼膠囊或硬殼膠囊。圖中22所指為抗微生物劑。
生物醫學材料10與外層的多糖體層16及膠原蛋白(collagen)層18所共同形成的微粒(microsphere)結構可廣泛應用于牙科、骨科、傷口愈合或醫學美容及應用于各種軟硬組織的修復與再生,例如應用于牙缺損(dental defects)、植牙傷口(extraction wounds)、牙科復合式傷口(combined wounds)、全身骨缺損(small or large bone defects)、顱顏整形外科(craniofacial plastic surgery)、醫療美容(health beauty)或組織修復(tissue repair)等醫療領域。
根據本發明的一實施例,披露一種生物醫學材料的制備方法,仍請參閱圖1。首先,提供生物相容性材料12與載體14。之后,混合生物相容性材料12與載體14。值得注意的是,當生物相容性材料12與載體14兩者均不帶電荷或其中之一帶電荷時,可通過造粒或壓錠制程,使生物相容性材料12與載體14結合,而當生物相容性材料12與載體14兩者均帶電荷但為相異電性時,則通過生物相容性材料12與載體14的相異電性,使載體14吸附至生物相容性材料12的表面。
在一實施例中,生物相容性材料12可為多孔性生物相容性材料。在此實施例中,當多孔性生物相容性材料12與載體14兩者均不帶電荷或其中之一帶電荷時,可通過造粒或壓錠制程,使多孔性生物相容性材料12與載體14結合,而當多孔性生物相容性材料12與載體14兩者均帶電荷但為相異電性時,則通過多孔性生物相容性材料12與載體14的相異電性,使載體14吸附至多孔性生物相容性材料12的表面或孔隙中,如圖1所示。生物相容性材料12可包括羥基磷灰石?磷酸三鈣(hydroxyapatite tricalcium phosphate,HATCP)、β?磷酸三鈣(β?tricalcium phosphate,β?TCP)、α?磷酸三鈣(α?tricalcium phosphate,α?TCP)、生物活性玻璃陶瓷(bioactive glass ceramic)、硫酸鈣、骨水泥(bone cement)、明膠(gelatin)、膠原蛋白(collagen)、聚乳酸?甘醇酸(poly(lactic?co?glycolic acid),PLGA)、聚己內酯多元醇(polycaprolactone,PCL)或彈性蛋白(elastin)。
載體14可由油脂所構成。構成載體14的油脂可包括例如雙亞麻酰基磷脂酰膽堿(dilinoleoyl phosphatidylcholine,DLPC)、二油酰基磷酯酰膽堿(dioleoyl phosphatidylcholine,DOPC)或二硬脂酰基二硬脂酰基磷脂酰膽堿(distearoyl phosphatidylcholine,DSPC)的磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)、例如二硬脂酰基二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(distearoyl phosphatidylethanolamine,DSPE)或二油酰基磷脂酰乙醇胺(dioleoyl phosphatidylethanolamine,DOPE)的磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)、1,2?二油酰氧基?3?三甲基氨基丙烷(1,2?dioleoyloxy?3?trimethylammonium propane,DOTAP)、2,3?二油酰氧基丙基?三甲基氯化銨(2,3?dioleoyloxypropyl?trimethylammonium chloride,DOTMA)、例如二油酰基磷脂酸(dioleoyl phosphatidic acid,DOPA)的磷脂酸(phosphatidic acid,PA)、磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)、例如二油酰基磷脂酰甘油(dioleoyl phosphatidylglycerol,DOPG)的磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG)、3β?[N?(N′,N′?二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]膽固醇(3β?[N?(N′,N′?dimethylaminoethane)?carbamoyl]cholesterol,DC?CHOL)、雙十六烷基磷酸鹽(dihexadecyl phosphate,DHDP)或其衍生物。載體14中,油脂的重量份大體為0.1~30重量份,優選為1~15重量份,均以載體14為100重量份計。載體14可還包括維生素A、C、D、E、K、B1、B3、B6、B7、B12、葉酸(folate)、泛酸(pantothenic acid)或其衍生物等各種生理必須維生素,或是鉀、鈣、鐵、鎂、鋅、銅、錳、鉬、鎳、硅、鉻、磷、硫或氯等各種生理必須元素或礦物質。
本發明生物醫學材料的制備方法還包括包覆生物活性物質(未圖示)于載體14內。載體14所包覆的生物活性物質可包括各種生長因子(growth factor,GF)、蛋白質、多肽、DNA、RNA、細胞激素(cytokines)、細胞外基質(extracellular matrix,ECM)、細胞附著分子(cell adhesion molecules,CAM)、富含血小板血漿(platelets rich plasma,PRP)、粒細胞(granulocytes)或干細胞(stem cells)等。上述生物活性物質的尺寸大小大體為2~10,000nm。
在一實施例中,當生物醫學材料10保存于?70℃~26℃的環境時,生物活性物質的活性至少可維持35天。
于生物醫學材料10外部,可還包括形成多糖體層16,如圖2所示。多糖體層16可同時具有正電荷與負電荷。在一實施例中,多糖體層16可由例如負電荷的藻酸鹽(alginate)與例如正電荷的殼聚糖(chitosan)所構成。在一實施例中,在多糖體層16外層,可還包括形成膠原蛋白(collagen)層18,如圖3所示。
本發明以不含電荷或含正/負電荷的納米載體(nanocarrier)作為包覆生物活性物質的材料,可通過調整載體本身的配方組成來提高生物活性物質的功效及包覆率,例如以磷脂酰膽堿(PC)/維生素作為載體材料時,可進一步提高人類骨形成蛋白(BMP?2)所產生堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性。后續可利用正、負電荷吸引的方式,將載體吸附固定于生物醫學級材料(例如生物活性玻璃陶瓷(bioactive glass ceramic)、骨水泥(bone cement)等)的表面及孔隙內,或可使用造粒或壓錠等方式,使至少之一不帶電荷的生物相容性材料與納米載體兩者相結合。本發明的生物醫學材料(本發明稱之為Agglomer)外層進一步包覆生物醫學級醫材原料(例如同時帶有正電荷與負電荷的多糖體、膠原蛋白)(此技術稱為層?層包覆(layer by layer coating)),以達成長效釋放控制并可有效保護生物活性物質。本發明Agglomer的尺寸大小可通過上述作為核心結構的生物醫學級材料(例如生物活性玻璃陶瓷、骨水泥等)的大小加以控制,而Agglomer外層所包覆的厚度則可通過組裝層數與組裝條件加以控制。本發明生物醫學材料所形成的微粒(microsphere)于臨床上易操作使用,可作為廣效、即時性的骨再生填充修補物,彌補現階段的產品缺陷,有利發展成新一代骨科(牙科)修復醫材產品。
本發明納米載體包覆技術,配合生物醫學材料(即Agglomer)的技術開發可達到骨傳導(osteoconduction)與骨誘發(osteoinduction)之間的整合,使骨生長獲得支撐,符合生物力學需求,并進一步達到長效釋放控制、準確定量生物活性物質濃度以及避免生物活性物質變性等功效。
本發明制備納米載體的過程中,以磷脂酰膽堿(PC)為主的脂質體(liposome)原料經減壓蒸餾后形成薄膜,再將例如富含血小板血漿(PRP)、人類骨形成蛋白(BMP?2)或欲包覆的生物活性物質,利用低溫超聲波震蕩進行包覆。可利用不同脂質體配方組成調控載體帶電性及界面穩定性,以利后續與生物醫學材料(即Agglomer)的結合。
本發明以上述納米載體(nanocarrier)、微粒(microsphere)并結合各種生物醫學材料作為骨科/牙科的修復材料。各種生物醫學材料包括生物活性玻璃陶瓷、骨水泥、膠原蛋白等。實際應用方式應視使用目的及用途而加以選擇。本發明以具有便利、簡易使用性的壓錠技術為例作說明,但實際應用方式并不以此壓錠技術為限。首先,將各種生物醫學骨材(例如生物活性玻璃陶瓷、羥基磷灰石?磷酸三鈣(HATCP)、β?磷酸三鈣(β?TCP)、硫酸鈣(Ca2SO4)、明膠、聚乳酸?甘醇酸(PLGA)等)的粉體或顆粒結合包覆例如BMP?2等活性因子的納米載體/微粒,接著,即直接、快速地以壓錠機壓錠制作骨材。此外,可使用不同形狀的模具以適應各部位需求,并可依據不同需求進行配方設計(例如加入粘合劑、崩解劑、潤滑劑或崩解抑制劑等),以達緩釋、加強硬度等效果。壓錠技術的優點包括:1.可正確控制劑量,2.可依據配方設計控制藥物解離速率,3.易于大量生產,成本低廉,以及4.運輸保存及給藥方便。
【實施例1】
本發明維生素A衍生物的合成
(1)維生素A酯的制備
首先,將100mg維生素A醇溶于2ml三乙基胺。之后,加入等當量脂肪酸酰氯(fatty?acid chloride)如乙基酰氯(acetyl chloride)等或脂肪酸酐(fatty acid anhydride)如醋酸酐(acetic anhydride)等,于常溫避光下靜置。反應過程以薄層分析。待維生素A醇完全消失后,將反應液傾倒入水中并以乙酸乙酯萃取的。將乙酸乙酯分離并以無水硫酸鈉進行脫水、干燥,再經減壓抽干后,以管柱進行產物純化。
(2)烷基維生素A酯的制備
首先,將350mg維生素A酸溶于20ml乙酸乙酯。之后,加入等當量碳酸鉀及2當量烷基碘化物(alkyl iodide compound)如甲基碘(iodomethane)加熱回流2小時。將反應液冷卻加入水中并進行水洗三次。將乙酸乙酯分離并以無水硫酸鈉進行脫水、干燥,再經減壓濃縮后,以管柱進行產物純化。
將維生素A或維生素A衍生物以混摻形成離子鍵結的方式或利用接枝技術導入納米載體。
【實施例2】
本發明包覆生物活性物質(BMP?2)的納米載體(磷脂酰膽堿(PC)/膽固醇/維生素A)的制備
(1)本實施例采用薄膜水合/超聲波震蕩法(thin?film hydration/sonication method)進行納米載體對人類骨形成蛋白(human bone morphogenetic protein 2,BMP?2)的包覆。首先,將磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)為主的脂質體(liposome)原料(其余組成包含膽固醇、雙十六烷基磷酸鹽(DHDP)、1,2?二油酰氧基?3?三甲基氨基丙烷(DOTAP))進行減壓蒸餾以形成薄膜。之后,利用低溫(?10~4℃)超聲波震蕩,進行對人類骨形成蛋白(BMP?2)的包覆。包覆人類骨形成蛋白(BMP?2)后的納米載體粒徑大約小于200nm。不同納米載體的油脂重量比例組成如下表1所示。本實施例利用不同納米載體的配方組成以調控納米載體的帶電荷度與界面穩定性,以利后續與Agglomer的結合。
表1

(2)參考表1配方11的重量比例,進一步將磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)搭配其它油脂如磷脂酸(phosphatidic acid,PA)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)或1,2?二油酰氧基?3?三甲基氨基丙烷(1,2?dioleoyloxy?3?trimethylammonium propane,DOTAP)與維生素A形成脂質體來包覆生長因子,結果如表2所示,包覆人類骨形成蛋白(BMP?2)后的納米載體粒徑大部分小于100nm。
表2

【實施例3】
本發明包覆生物活性物質(BMP?2)的納米載體(磷脂酰膽堿(PC)/膽固醇)對堿性磷酸酶(ALP)活性的影響
C2C12細胞培養
C2C12細胞購自BCRC生物資源保存與研究中心,培養于5%CO2細胞培養箱中,并冷凍保存于液態氮桶中。細胞培養及繼代使用DMEM(10%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS))及1%盤尼西林/鏈霉素(streptomycin))的培養基,當細胞培養至90%聚滿(confluence)時以1∶10的稀釋比例繼代培養。
ALP測試方法
取C2C12細胞調整細胞濃度為4×104個細胞/ml,在24?井細胞培養盤中置入0.5ml,放入5%CO2細胞培養箱中靜置18小時,使細胞均勻貼附于細胞培養盤內。將貼附完成的細胞培養盤中的培養基更換成DMEM(2%FBS),并加入實施例2表2編號4的樣品。BMP?2的包覆量為10μg/mL~100μg/mL。在細胞培養箱中靜置72小時,以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline)(PBS Buffer)清洗細胞后,加入溶解緩沖液(lysis buffer)后,以離心取得上清液進行雙辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)測定檢測蛋白質濃度,及使用對?硝基苯基棕櫚酸鹽(p?nitrophenyl palmitate,pNPP)基質測試ALP活性。
請參閱圖5,結果顯示:經本實施例納米載體(磷脂酰膽堿(PC)/膽固醇)包覆后的人類骨形成蛋白(human bone morphogenetic protein 2,BMP?2)比未經納米載體包覆的人類骨形成蛋白(BMP?2)可提升堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性大約1.5~1.7倍。
【實施例4】
本發明包覆生物活性物質(BMP?2)的納米載體(磷脂酰膽堿(PC)/膽固醇/維生素)對堿性磷酸酶(ALP)活性的影響
ALP測試方法
取C2C12細胞調整細胞濃度為4×104個細胞/ml,在24?井細胞培養盤中置入0.5ml,放入5%CO2細胞培養箱中靜置18小時,使細胞均勻貼附于細胞培養盤內。將貼附完成的細胞培養盤中的培養基更換成DMEM(2%FBS),并加入實施例2表2編號3的樣品。其余加入的納米載體包覆不同維生素。在細胞培養箱中靜置72小時,以PBS清洗細胞后,加入溶解緩沖液(lysis buffer)后,以離心取得上清液進行雙辛可寧酸測定(BCA assay)檢測蛋白質濃度,及使用對?硝基苯基棕櫚酸鹽基質(pNPP substrate)測試ALP活性。
請參閱圖6,結果顯示:經本實施例納米載體(磷脂酰膽堿(PC)/膽固醇/維生素A)包覆后的人類骨形成蛋白(human bone morphogenetic protein 2,BMP?2)比未經納米載體包覆的人類骨形成蛋白(BMP?2)可大幅提升堿性磷酸酶的活性大約3倍之多(由3.1提升至9.9),且比未經納米載體包覆的2倍(100μg/ml)人類骨形成蛋白(BMP?2)所產生的堿性磷酸酶(ALP)活性(5.1)還高。
【實施例5】
本發明包覆生物活性物質(BMP?2)的納米載體(磷脂酰膽堿(PC)/膽固醇/維生素A)對堿性磷酸酶(ALP)活性的影響
ALP測試方法
取C2C12細胞調整細胞濃度為4×104個細胞/ml,在24?井細胞培養盤中置入0.5ml,放入5%CO2細胞培養箱中靜置18小時,使細胞均勻貼附于細胞培養盤內。將貼附完成的細胞培養盤中的培養基更換成DMEM(2%FBS),并加入實施例2表2編號3的樣品。樣品包覆0.03μmol/mL~0.3μmol/mL劑量維生素A。在細胞培養箱中靜置72小時,以PBS清洗細胞后,加入溶解緩沖液(lysis buffer)后,以離心取得上清液進行雙辛可寧酸測定(BCA assay)檢測蛋白質濃度,及使用對?硝基苯基棕櫚酸鹽基質(pNPP substrate)測試ALP活性。
請參閱圖7,結果顯示:經本實施例納米載體(磷脂酰膽堿(PC)/膽固醇/維生素A(高劑量0.26μmol/mL))包覆后的人類骨形成蛋白(human bone morphogenetic protein 2,BMP?2)比未經納米載體包覆的人類骨形成蛋白(BMP?2)可大幅提升堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性大約19倍之多(由0.65提升至11.3),且比未經納米載體包覆的4倍(200μg/ml)人類骨形成蛋白(BMP?2)所產生的堿性磷酸酶(ALP)活性(1.7)還高。顯而易見,當提高納米載體維生素A的劑量時,將使堿性磷酸酶(ALP)的活性顯著攀升。
【實施例6】
本發明納米載體(磷脂酰膽堿(PC)/膽固醇)包覆的生物活性物質(PRP)的活性隨時間的變化
將實施例2表2編號2的負電納米載體與編號4的正電納米載體包覆PRP后(如包覆BMP?2的方法),保存于4℃環境下,分別于8天與35天時取樣,利用ELISA kit分析TGF?β1、PDGF?AB含量,并比較和觀察含量變化。
富含血小板血漿(platelets rich plasma,PRP)含多種活性生長因子,例如VEGF、PDGF、TGF?β、FGF等,屬于自體(autologous)濃縮血小板,可利用離心機分離純化濃縮獲得。
請參閱圖8~9,圖8為經本發明負電與正電納米載體包覆的PRP,其TGF?β1含量隨時間的變化,圖9為經本發明負電與正電納米載體包覆的PRP,其PDGF?AB含量隨時間的變化。結果顯示:本實施例納米載體(磷脂酰膽堿(PC)/膽固醇)可有效保存富含血小板血漿(PRP),使其活性在4℃環境下仍可維持至少35天,傳統血庫的血液細胞保存只有7天,通常使用時間約3~5天,過期即拋棄,而本發明建立了長效保存PRP的方法。
【實施例7】
本發明生物醫學材料(Agglomer)的制備
首先,將生物醫學玻璃(bioglass)、HATCP或硫酸鈣等生物醫學材料以不同篩目(mesh)進行過篩,取100~600篩目的生物醫學材料。之后,將上述100~600篩目的生物醫學材料與實施例2表2編號1~4的納米載體進行混摻。納米載體與生物醫學材料的混摻比例為1∶20,000。
【實施例8】
本發明生物活性支架(殼聚糖/膠原蛋白)的制備
首先,將1%(w/w)的醋酸溶液配制成1%~3%的殼聚糖(chitosan)溶液。之后,將殼聚糖溶液與膠原蛋白(collagen)溶液以7∶1~1∶7的比例進行混合,以形成混合液,此階段操作于4℃的反應槽內進行。接著,在上述混合液中加入0.02%~3%濃度的戊二醛或梔子素(genipin)進行交聯反應。之后,將此混合液注入模具中,以慢速冷凍至?20℃達24小時凍干。最后,以酒精清洗數次,再以水清洗后凍干,即完成本實施例生物活性支架(殼聚糖/膠原蛋白)的制作。
【實施例9】
本發明微粒(microsphere)的制備
首先,取50mg多孔性HATCP作為核心結構,將1ml實施例2表2所制備帶正電荷的納米載體(nanocarrier)大量吸附于多孔生物醫學玻璃中,如實施例7混摻比例。之后,將此生物醫學材料涂布1%~5%正電荷的殼聚糖(chitosan),再涂布1%~5%負電荷的藻酸鹽(alginate),形成相斥電荷吸附的多糖體層(polysaccharide shell)。最后,再涂布1%~5%膠原蛋白(collagen)或明膠(gelatin),以完成本實施例多層微粒(microsphere)結構的制備。
【實施例10】
本發明生物醫學材料(Agglomer)的控制釋放
將實施例7所制備的Agglomer置于水溶性緩沖溶液中觀察其控制釋放情形。取樣時間分別為起始點、1小時、3小時、8小時、1天、2天、4天、8天、12天與14天。取樣后以ELISA進行分析,結果如圖10所示。
結果顯示:Agglomer置于水溶液時,就會有部份釋放,至4天后開始有較明顯釋出。而于12天后開始大量釋放。此即表示Agglomer對BMP?2的釋放可達14天以上。理論值OD450=1.48時,釋放率為100%。
【實施例11】
本發明生物醫學材料(Agglomer)對堿性磷酸酶(ALP)活性的影響
取C2C12細胞調整細胞濃度為4×104個細胞/ml,在12?井細胞培養盤中置入1.0ml,放入5%CO2細胞培養箱中靜置18小時,使細胞均勻貼附于細胞培養盤內。將貼附完成的細胞培養盤中的培養基更換成DMEM(2%FBS),放入8.0μm孔徑的transwell,將生物醫學材料(Agglomer)如實施例7樣品置放其中再加入培養基覆蓋樣品。在細胞培養箱中靜置72小時,以PBS清洗細胞后,加入溶解緩沖液(lysis buffer)后,以離心取得上清液進行雙辛可寧酸測定(BCA assay)檢測蛋白質濃度,及使用對?硝基苯基棕櫚酸鹽基質(pNPPsubstrate)測試ALP活性。
請參閱圖11,結果顯示:含實施例5所制備的納米載體(磷脂酰膽堿(PC)/膽固醇/維生素A(高劑量0.26μmol/mL))的Agglomer,其人類骨形成蛋白(human bone morphogenetic protein 2,BMP?2)比未經納米載體包覆的人類骨形成蛋白(BMP?2)可提升堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性大約5倍之多(由1.00提升至5.40)。
【實施例12】
本發明生物醫學材料(Agglomer)的骨修復效果
將實施例2所制備帶正電荷的納米載體與200μm大小帶負電的生物醫學玻璃(bioglass)進行混摻,以此Agglomer(如實施例7,但納米載體與生物醫學材料混摻比例調整為1∶7,000)進行動物實驗。以器具切除老鼠5mm*5mm大小的骨頭(如圖12A所示),觀察12周。進行測試的材料包括第一代修復材料,目的即是為驗證本發明納米載體的功效。本實施例納米載體結合帶負電且經FDA認可的生物醫學材料,與其它對照組比較骨修復的狀況。
12周后,利用X?Ray檢測修復情況,結果顯示:僅使用膠原蛋白(collagen)的對照組并無骨修復的情形(如圖12B所示),僅使用生物醫學玻璃(bioglass)的對照組略有看到骨修復(如圖12C所示),而加入納米載體的組別(如圖12E所示)則比其它組的修復效果好,尤其是裂隙連接(gap junction)的位置比含BMP?2(未包覆)的生物醫學玻璃組(如圖12D所示)來的好。因此,可證實利用生物醫學玻璃/納米載體的組裝對骨修復的效果確實較好。但是,骨修復密度可能與含BMP?2(未包覆)的生物醫學玻璃組相差不多。因此,可改用Agglomer/納米載體(磷脂酰膽堿(PC)/維生素/BMP?2),由于提高了BMP?2的功效與Agglomer的控制釋放效果,這將有助于骨修復密度的提升以及更佳的骨整合(osseointegration),并降低BMP?2的使用量。上述利用micro?CT影像分析,12周骨缺損愈合修復的結果如圖13所示,含有BMP?2的組別,其骨體積(bone volume=BV/TV)增加最多,其中以納米載體包覆生長因子(BMP?2)的組別最佳。
【實施例13】
本發明生物醫學材料(Agglomer)的壓錠
為實現本發明納米載體(nanocarrier)、微粒(microsphere)可順利與各式生物醫學材料結合,并可依據需求設計配方加入不同賦形劑以達到緩釋或增加硬度的效果,因此,本實施例將納米載體與不同生物醫學骨材(主材料)(生物醫學玻璃(bioglass)、羥基磷灰石?磷酸三鈣(HATCP)、β?磷酸三鈣(β?TCP))及賦形劑(如粘合劑(例如纖維素、羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose)、甲基纖維素、海藻酸鈉(sodium alginate)、明膠(gelatin))、潤滑劑(例如硬脂酸鎂、二氧化硅))依不同比例均勻混合(各配方的組成比例如下表3所示),進行壓錠。本發明所使用的生物醫學材料不以多孔性為限,如下表6的主材料為非多孔性β?磷酸三鈣。以下結果顯示本發明納米載體可與生物醫學材料結合并包覆于其中。壓錠后的測試重量及硬度結果如下表4~6所示。
表3

*主材料中含有5%的納米載體
表4(主材料為生物醫學玻璃)
  配方一  配方二  配方三  錠劑重量(mg)  581.1  490.8  329.9  錠劑硬度(kg)  1.56  2.08  2.24
表5(主材料為羥基磷灰石?磷酸三鈣)
  配方一  配方二  配方三  錠劑重量(mg)  558.1  399.5  342.0  錠劑硬度(kg)  1.32  1.21  4.55
表6(主材料為非多孔性β?磷酸三鈣)
  配方一  配方二  配方三  錠劑重量(mg)  731.3  443.6  407.6  錠劑硬度(kg)  4.30  1.73  5.84
根據上述測試結果顯示:本發明納米載體、微粒可順利與各式生物醫學材料結合,并可依據需求設計不同配方以控制硬度,必要時亦可加入崩解劑或抑制崩解劑等,以控制藥物釋出速率,甚至可搭配膜衣等表面改質技術,或是加入其他材料使用,以達到保護與控制釋放的效果。
雖然本發明已以優選實施例披露如上,然其并非用以限定本發明,任何本發明所屬技術領域中的技術人員,在不脫離本發明的精神和范圍內,應可作任意更改與潤飾。因此,本發明的保護范圍應以所附權利要求書限定的范圍為準。   內容來自專利網www.wwszu.club轉載請標明出處

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