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中和抗甲型流感病毒抗體及其用途.pdf

摘要
申請專利號:

CN200980132989.9

申請日:

2009.07.27

公開號:

CN102164613B

公開日:

2014.11.26

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 39/395申請日:20090727|||公開
IPC分類號: A61K39/395; A61P31/16 主分類號: A61K39/395
申請人: 生物醫學研究所
發明人: A·蘭扎韋基亞
地址: 瑞士貝林佐納
優先權: 2008.07.25 US 61/083,838; 2009.05.27 US 61/181,582
專利代理機構: 永新專利商標代理有限公司 72002 代理人: 林曉紅
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200980132989.9

授權公告號:

102164613B||||||

法律狀態公告日:

2014.11.26|||2011.10.05|||2011.08.24

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及結合到血凝素并中和甲型流感病毒的組1亞型和組2亞型的抗體和其抗原結合片段。本發明還涉及編碼永生B細胞和培養的單漿細胞的核酸并涉及表位,其中所述永生B細胞和培養的單漿細胞產生這樣的抗體和抗體片段,所述表位結合這樣的抗體和抗體片段。此外,本發明涉及抗體、抗體片段和表位在篩選方法中以及在甲型流感病毒感染的診斷、治療和預防中的用途。

權利要求書

1.一種中和甲型流感病毒的組1亞型和組2亞型的感染的抗體或其抗原結合片段。2.如權利要求1所述的抗體或其抗原結合片段,其中所述抗體特異性地結合血凝素的莖區中的表位,并且其中所述表位在兩種或更多種選自組1和組2的甲型流感病毒亞型之中是保守的。3.如權利要求1或2所述的抗體或其抗原結合片段,其中所述抗體或抗體片段結合包含SEQ?ID?NO:37、38、39或40任一個的氨基酸序列的多肽。4.如權利要求1、2或3所述的抗體,其中中和50%甲型流感病毒所需的所述抗體濃度是20μg/ml或更低。5.如權利要求1、2或3所述的抗體,其中中和50%甲型流感病毒所需的所述抗體濃度是4μg/ml或更低。6.如權利要求1、2或3所述的抗體或其抗原結合片段,其中所述組1亞型是H1、H2、H5或H9。7.如權利要求1、2或3所述的抗體或其抗原結合片段,其中所述組2亞型是H3或H7。8.如權利要求1、2或3所述的抗體或其抗原結合片段,其中所述抗體或抗體片段中和三種、四種、五種或更多種甲型流感病毒亞型的感染。9.如權利要求1至7中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其中所述抗體中和以下甲型流感病毒亞型的感染:(i)H1和H3;(ii)H1和H7;(iii)H3和H5;(iv)H3和H9;(v)H5和H7;(vi)H7和H9;(vii)H1、H3、H5和H7;或(viii)H1、H3、H5、H7和H9。10.一種抗體或其抗原結合片段,其包含至少一個互補決定區(CDR)序列,所述互補決定區序列與SEQ?ID?NO:1-6或17-22中的任一個均有至少95%的序列同一性,其中所述抗體中和甲型流感病毒。11.一種抗體或其抗原結合片段,其包含具有SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:17的氨基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ?ID?NO:2或SEQ?ID?NO:18的氨基酸序列的重鏈CDR2、以及具有SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:19的氨基酸序列的重鏈CDR3,其中所述抗體中和甲型流感病毒。12.一種抗體或其抗原結合片段,其包含具有SEQ?ID?NO:4或SEQ?ID?NO:20的氨基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ?ID?NO:5或SEQ?ID?NO:21的氨基酸序列的輕鏈CDR2、以及具有SEQ?ID?NO:6或SEQ?ID?NO:22的氨基酸序列的輕鏈CDR3,其中所述抗體中和甲型流感病毒。13.如權利要求11或12所述的抗體或其抗原結合片段,其包含具有以下氨基酸序列的重鏈:CDRH1為SEQ?ID?NO:1、CDRH2為SEQ?ID?NO:2和CDRH3為SEQ?ID?NO:3;或CDRH1為SEQ?ID?NO:17、CDRH2為SEQ?ID?NO:18和CDRH3為SEQ?ID?NO:19。14.如權利要求11、12或13所述的抗體或其抗原結合片段,其包含具有以下氨基酸序列的輕鏈:CDRL1為SEQ?ID?NO:4、CDRL2為SEQ?ID?NO:5和CDRL3為SEQ?ID?NO:6;或CDRL1為SEQ?ID?NO:20、CDRL2為SEQ?ID?NO:21和CDRL3為SEQ?ID?NO:22。15.如權利要求1至14中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其包含與SEQ?ID?NO:13、33、29或35中的任一個的氨基酸序列具有至少80%的序列同一性的重鏈可變區。16.如權利要求1至15中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其包含與SEQ?ID?NO:14或SEQ?ID?NO:30的氨基酸序列具有至少80%的序列同一性的輕鏈可變區。17.一種抗體或其抗原結合片段,其中所述抗體包含含有SEQ?ID?NO:13的氨基酸序列的重鏈可變區和含有SEQ?ID?NO:14的氨基酸序列的輕鏈可變區;或含有SEQ?ID?NO:33的氨基酸序列的重鏈可變區和含有SEQ?ID?NO:14的氨基酸序列的輕鏈可變區;或含有SEQ?ID?NO:29的氨基酸序列的重鏈可變區和含有SEQ?ID?NO:30的氨基酸序列的輕鏈可變區;或含有SEQ?ID?NO:35的氨基酸序列的重鏈可變區和含有SEQ?ID?NO:30的氨基酸序列的輕鏈可變區,并且其中所述抗體中和甲型流感病毒。18.如前述權利要求中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其中所述抗體是FI6變體1或FI6變體2。19.如前述權利要求中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其中所述抗體是人抗體、單克隆抗體、純化的抗體、分離的抗體、單鏈抗體、Fab、Fab’、F(ab′)2、Fv或scFv。20.一種抗體或其抗原結合片段,其與如前述的權利要求中任一項所述抗體結合相同的表位,其中所述抗體或其抗原結合片段中和甲型流感病毒。21.如前述權利要求中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其用于治療甲型流感病毒感染。22.包含編碼前述權利要求中任一項所述的核酸分子其抗原結合片段的多核苷酸的核酸分子。23.如權利要求22所述的核酸分子,其中所述多核苷酸序列與SEQ?ID?NO:7-12、15、16、34、23-28、31、32或36中的任一個的核酸序列至少75%相同。24.一種包含如權利要求22或23中所述的核酸分子的載體。25.一種細胞,其表達如權利要求1至21中任一項所述的抗體或其抗原結合片段或包含如權利要求24所述的載體。26.一種分離的或純化的免疫原性多肽,其包含結合權利要求1至21中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的表位。27.一種藥物組合物,其包含權利要求1至21中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、權利要求22或權利要求23所述的核酸、權利要求24所述的載體、權利要求25所述的細胞、或權利要求26所述的免疫原性多肽以及藥學可接受的稀釋劑或載體。28.一種藥物組合物,其包含第一抗體或其抗原結合片段和第二抗體或其抗原結合片段,其中所述第一抗體是如權利要求1至21中任一項所述的抗體,并且所述第二抗體中和甲型流感病毒感染。29.如權利要求1至21中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、如權利要求22或權利要求23所述的核酸、如權利要求24所述的載體、如權利要求25所述的細胞、如權利要求26所述的免疫原性多肽、或如權利要求27或權利要求28所述的藥物組合物(i)在制備治療甲型流感病毒感染的藥物中的用途;(ii)在疫苗中的用途;或(iii)在甲型流感病毒感染的診斷中的用途。30.如權利要求1至21中任一項所述的抗體或其抗原結合片段在通過檢測抗甲型流感病毒疫苗的抗原是否含有正確構象的特異性表位來監測所述疫苗的質量中的用途。31.一種減少甲型流感病毒感染或降低甲型流感病毒感染的風險的方法,所述方法包括給對其有需要的受試者施用治療有效量的如權利要求1至21中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。32.一種特異性地結合如權利要求1至21中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的表位,其用于(i)治療中;(ii)制備治療甲型流感病毒感染的藥物中;(iii)作為疫苗;或(iv)能中和甲型流感病毒感染的配體的篩選中。

說明書

中和抗甲型流感病毒抗體及其用途

本專利申請要求分別于2008年7月25日和2009年5月27日提交的美國臨時專利申請第61/083,838號和61/181,582號的優先權,上述專利申請公開的全文援引加入本文,如同在本文中記載一樣。

背景技術

據認為,對甲型流感病毒的中和抗體應答對于給定的病毒亞型是特異性的。有16種通過血凝素(HA)定義的甲型流感亞型。16種HA(H1-H16)可被分為兩組。組1由H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13和H16亞型組成,組2包括H3、H4、H7、H10、H14和H15亞型。盡管所有的亞型病毒都存在于鳥類,但主要是H1、H2和H3在人類中引發疾病。H5、H7和H9亞型在人類中引起偶發性嚴重感染并可能引起新的大流行。H1和H3病毒不斷地進化形成新的變體,這種現象被稱為抗原漂移。由此,應答過去的病毒而產生的抗體對于新的漂移病毒保護性很差或沒有保護性。其結果是每年必須要制備新疫苗用于抵抗預計要出現的H1和H3病毒,這個過程很昂貴且并不總是奏效。這同樣適用于H5流感疫苗的制備。還不清楚基于越南和印度尼西亞甲型流感病毒分離體的現有H5疫苗是否能抵抗未來的流行性H5病毒。

由于這些原因,非常希望擁有誘導能夠中和所有甲型流感病毒亞型及其每年的變體(2006年,由Gerhard等人進行了綜述)的廣譜中和抗體的疫苗。此外,廣譜中和異亞型抗體也可用在預防和治療中。

已經表征了識別甲型流感病毒的抗體。M2的抗體(只在被感染細胞上表達而不在感染性病毒上表達的一種不變的小蛋白)已經顯示出一些體內保護效果,這些保護效果可能是通過用NK細胞或胞毒性T細胞靶向感染的細胞加以破壞來實現的。但是,HA是中和抗體的首要目標。它包括約500個氨基酸的大胞外域,該胞外域被源自宿主的酶裂解以產生通過二硫鍵連接的兩個多肽。較大的N-末端片段(HA1,320至330個氨基酸)形成包含受體結合位點和大部分被病毒中和抗體識別的決定簇的膜遠端球狀域。較小的C-末端部分(HA2,約180個氨基酸)形成將球狀域錨定在細胞或病毒膜的莖狀結構。亞型之間的序列同源性的程度,在HA1多肽(亞型之間34%至59%的同源性)中比在HA2多肽(51%至80%的同源性)中小。最保守的區是裂解位點周圍的序列,特別是HA2N-末端的11個氨基酸,被命名為融合肽,它在所有的甲型流感病毒亞型中均是保守的。這個區的一部分以表面環暴露在HA前體分子(HA0)中,但是當HA0裂解為HA1/HA2時,則變得不可接近。總之,在不同的HA亞型之中,特別是在HA1-HA2連接區和在HA2區中都有保守區。但是,這些區對于中和抗體可能是不易接近的。

在確認中和一種以上甲型流感病毒的亞型的抗體中只取得了有限的成功,并且其中和寬度窄和其效力低。Okuno等人用流感病毒A/Okuda/57(H2N2)免疫小鼠并分離了單克隆抗體(C179),該單克隆抗體(C179)結合HA2中的保守構象表位并在動物模型中在體外和體內中和組1的H2、H1和H5亞型甲型流感病毒(Okuno等人,1993;Smirnov等人,1999;Smirnov等人,2000)。

最近,Gioia等人描述了在接種了傳統季節性流感疫苗的某些個體的血清中有H5N1病毒中和抗體的存在(Gioia等人,2008)。作者認為中和活性可能是來自神經氨酸酶(N1)的抗體。可是沒有分離出單克隆抗體,也沒有表征靶表位。目前尚不清楚血清抗體是否中和其它的甲流病毒亞型。

盡管經過了數十年的研究,但是還沒有投入市場的廣譜中和或抑制甲型流感病毒感染或緩解由甲型流感病毒引發的疾病的抗體。因此,需要鑒定新的抵御多種甲型流感病毒亞型的抗體。

發明內容

本發明部分地基于從接種了季節性流感疫苗的個體中分離出結合至HA并中和一種以上甲型流感病毒亞型感染的自然產生的人單克隆抗體以及本發明的抗體結合的新型表位。因此,在本發明的一個方面中,本發明包括一種中和一種以上選自組1和組2亞型的甲型流感病毒亞型的感染的抗體及其抗原結合片段。

在本發明的一個實施方案中,本發明包括中和甲型流感病毒的組1亞型和組2亞型感染的抗體或其抗原結合片段。在本發明的另一個實施方案中,本發明包括一種抗體或其抗原結合片段,其包含至少一個互補決定區(CDR)序列,該序列與SEQ?ID?NO:1-6或17-22中的任一個有至少95%的序列同一性,其中所述抗體中和甲型流感病毒。

在本發明的又一個實施方案中,本發明包括具有SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:17的氨基酸序列的重鏈CDR1;具有SEQ?ID?NO:2或SEQ?ID?NO:18的氨基酸序列的重鏈CDR2;和具有SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:19的氨基酸序列的重鏈CDR3,其中所述抗體中和甲型流感病毒。在本發明的另一個實施方案中,本發明包括抗體或其抗原結合片段,其包含具有SEQ?ID?NO:4或SEQ?ID?NO:20的氨基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ?ID?NO:5或SEQ?ID?NO:21的氨基酸序列的輕鏈CDR2和具有SEQ?ID?NO:6或SEQ?ID?NO:22的氨基酸序列的輕鏈CDR3,其中所述抗體中和甲型流感病毒。

在本發明的又一個實施方案中,本發明包括一種抗體或其抗原結合片段,其中所述抗體包含含SEQ?ID?NO:13的氨基酸序列的重鏈可變區和含SEQ?ID?NO:14的氨基酸序列的輕鏈可變區;或包含含SEQ?ID?NO:33的氨基酸序列的重鏈可變區和含SEQ?ID?NO:14的氨基酸序列的輕鏈可變區;或包含含SEQ?ID?NO:29的氨基酸序列的重鏈可變區和含SEQ?ID?NO:30的氨基酸序列的輕鏈可變區;或包含含SEQ?ID?NO:35的氨基酸序列的重鏈可變區和含SEQ?ID?NO:30的氨基酸序列的輕鏈可變區,并且其中所述抗體中和甲型流感病毒。本發明進一步包括一種抗體或其抗原結合片段,其中所述抗體是FI6變體1或FI6變體2。

在本發明的另一個實施方案中,本發明包括一種抗體或其抗原結合片段,其中和甲型流感病毒的組1亞型和組2亞型的感染,其中所述抗體或其片段被永生B細胞克隆表達。

在另一個方面,本發明包括一種含有編碼本發明的抗體或抗體片段的多核苷酸的核酸分子。在另一個方面,本發明包括一種含有本發明的核酸分子的載體或表達本發明的抗體或其抗原結合片段的細胞。在又一個方面,本發明包括含有結合本發明的抗體或其抗原結合片段的表位的分離的或純化的免疫原性多肽。

本發明進一步包括一種藥物組合物,其包含本發明的抗體或其抗原結合片段、本發明的核酸分子、含有本發明的核酸分子的載體、表達本發明的抗體或抗體片段的細胞、或本發明的免疫原性多肽以及藥學可接受的稀釋劑或載體(carrier)。本發明還包括一種藥物組合物,其含有第一抗體或其抗原結合片段以及第二抗體或其抗原結合片段,其中所述第一抗體是本發明的抗體,第二抗體是能中和甲型流感病毒感染的抗體或其抗原結合片段。

本發明的抗體或其抗原結合片段、本發明的核酸、含本發明的核酸的載體、表達本發明的載體的細胞、包含結合本發明的抗體或抗體片段的表位的分離的或純化的免疫原性多肽、或本發明的藥物組合物(i)在制備治療甲型流感病毒感染的藥物中;(ii)在疫苗中;或(iii)在甲型流感病毒感染的診斷中的用途也預期包括在本發明的范圍之內。進一步,本發明的抗體或其抗原結合片段在通過檢測抗甲型流感病毒疫苗的抗原是否含有正確構象的特異表位來監測所述疫苗的質量中的用途也預期包括在本發明的范圍之內。

在另一方面,本發明包括一種減少甲型流感病毒感染或降低甲型流感病毒感染風險的方法,其包括向有需要的對象施用治療有效量的本發明的抗體或其抗原結合抗體片段。

在另一方面,本發明包括一種特異性地結合本發明的抗體或其抗原結合片段的表位,其用于:(i)治療中;(ii)制備治療甲型流感病毒感染的藥物;(iii)作為疫苗;或(iv)篩選能中和甲型流感病毒感染的配體。

發明詳述

本發明部分地基于從接種了季節性甲型流感疫苗的個體中發現和分離能廣譜中和不同甲型流感病毒亞型的自然產生的人抗體以及本發明的抗體結合的新型表位。希望得到這些抗體,因為只要一種或少數幾種抗體就可以中和不同的甲型流感病毒亞型。此外,被這些抗體識別的表位可以是能夠誘導廣譜抗不同亞型的季節性和候選流行分離體的疫苗的一部分。

因此,在一方面,本發明提供了一種能中和至少兩種組1和組2亞型中的甲型流感病毒的抗體和其抗原結合片段。在一個實施方案中,本發明提供了一種中和甲型流感病毒的組1亞型和組2亞型的感染的抗體或其抗原結合片段。

在本發明的另一方面,本發明提供了一種對不同的甲型流感病毒亞型的HA具有廣譜特異性的中和抗體和其抗原結合片段。在一個實施方案中,本發明的抗體或抗原結合片段特異性地結合在兩種或兩種以上選自組1和組2的甲型流感病毒亞型之中是保守的HA的莖區的表位。在另一個實施方案中,本發明的抗體或抗原結合片段特異性地結合包含SEQ?ID?NO:37、38、39或40的任一個的氨基酸序列的多肽。

人單克隆抗體、分泌本發明的抗體的永生B細胞克隆或轉染的宿主細胞、以及編碼本發明的抗體的核酸也包括在本發明的范圍之內。

如本文所用,術語“抗原結合片段”、“片段”和“抗體片段”可以互換地使用,是指本發明的保持抗體的抗原結合活性的抗體的任何片段。示例性的抗體片段包括但不限于單鏈抗體、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv。如本文所用,術語“抗體”包括抗體和其抗原結合片段。

如本文所用,術語“廣譜特異性”用來指能結合和/或中和甲型流感病毒的一或多種組1亞型和一或多種組2亞型的本發明的抗體或抗原結合片段。

如本文所用,“中和抗體”是指一種能中和,即防止、抑制、減少、阻礙或干擾病原體引發和/或持續宿主內的感染的能力的抗體。術語“中和抗體”和“中和…抗體”在本文中可以互換地使用。如本文所述,這些抗體可單獨使用,或作為預防劑或治療劑在合適的制劑中結合使用,作為診斷工具或制備工具與活性接種疫苗配合使用。

本發明的抗體或抗原結合片段中和一或多種組1(H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、和H16以及它們的變體)的甲型流感病毒和一或多種組2(H3、H4、H7、H10、H14和H15以及它們的變體)的甲型流感病毒。在一個實施方案中,示例性的組1亞型包括H1、H2、H5、H6和H9,示例性的組2亞型包括H3和H7。

本發明的抗體和抗體片段能夠中和甲型流感病毒亞型的各種組合。在一個實施方案中,抗體能中和甲型流感病毒H1和H3亞型、或H2和H3亞型、或H3和H5亞型、或H3和H9亞型、或H1和H7亞型、或H2和H7亞型,或H5和H7亞型、或H7和H9亞型。

在另一個實施方案中,本發明的抗體和抗體片段能中和甲型流感病毒H1、H2和H3亞型、或H1、H3和H5亞型、或H1、H3和H9亞型、或H2、H3和H5亞型、或H2、H3和H9亞型、或H3、H5和H9亞型,或H1、H2和H7亞型、或H1、H5和H7亞型,或H1、H7和H9亞型、或H2、H5和H7亞型、或H2、H7和H9亞型、或H5、H7和H9亞型、或H1、H3和H7亞型、或H2、H3和H7亞型、或H3、H5和H7亞型、或H3、H7和H9亞型。

在又一個實施方案中,抗體能中和甲型流感病毒H1、H2、H3和H7亞型、或H1、H3、H5和H7亞型、或H1、H3、H7和H9亞型、或H2、H3、H5和H7亞型、和H2、H3、H7和H9亞型、或H3、H5、H7和H9亞型或H1、H2、H3和H5亞型、或H1、H2、H3和H9亞型、或H1、H3、H5和H9亞型、或H2、H3、H5和H9亞型、或H1、H2、H5和H7亞型、或H1、H2、H7和H9亞型、或H1、H5、H7和H9亞型、或H2、H5、H7和H9亞型。

在又一實施方案中,本發明的抗體可以中和甲型流感病毒H1、H2、H3、H5和H7亞型、或H1、H2、H3、H7和H9亞型、或H1、H3、H5、H7和H9亞型、或H2、H3、H5、H7和H9亞型、或H1、H2、H3、H5和H9亞型、或H1、H2、H5、H7和H9亞型、或H1、H2、H3、H5、H7和H9亞型。在另一個實施方案中,除了中和甲型流感病毒H6亞型外,本發明的抗體和抗原結合片段還中和一或多種上述組合。

本發明的抗體和抗原結合片段具有高中和能力。中和50%甲型流感病毒所需要的本發明的抗體濃度可例如為約50μg/ml或更低。在一個實施方案中,中和50%甲型流感病毒所需要的本發明的抗體濃度是約50、45、40、35、30、25、20、17.5、15、12.5、11、10、9、8、7、6、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5或約1μg/ml或更低。在另一個實施方案中,中和50%甲型流感病毒所需要的本發明的抗體濃度是約0.9、0.8、0.75、0.7、0.65、0.6、0.55、0.5、0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.075、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.008、0.006、0.004、0.003、0.002或約0.001μg/ml或更低。這意味著僅需低濃度的抗體來中和50%的甲型流感病毒。可使用本領域技術人員已知的標準中和試驗來測定特異性和中和能力。

本發明的抗體

本發明提供了一種對于HA具有特定廣譜特異性且中和一或多種組1的甲型流感病毒亞型或一或多種組2的甲型流感病毒亞型的抗體。本發明的抗體結合在選自組1和組2的兩或多種甲型流感病毒亞型之中是保守的HA的區中的表位。

在一個實施方案中,本發明提供了一種抗體如分離的抗體或純化的抗體,其特異性地結合組1和組2的甲型流感病毒亞型的在HA的莖區中的保守表位并干擾病毒的復制和擴散。本發明還提供了一種抗體如分離的抗體或純化的抗體,其特異性地結合組1和組2的亞型的在HA的莖區的保守表位并抑制病毒進入細胞。不受任何理論的約束,在一個示例性實施方案中,本發明的抗體或抗原結合片段結合到在甲型流感病毒的莖區中的保守表位并通過干擾融合步驟來抑制病毒進入細胞。蛋白的表位或抗原決定簇對應于由抗體的結合位點(或互補位)特異性地識別的分子的那些部分。因此,表位是需要互補性互補位來進行操作性識別的相關實體。在蛋白的不同變體中保守的表位是指相同的互補位能通過接觸這些分子的相同部分而特異性地識別這些不同的變體。

本發明的抗體可以是單克隆的諸如人單克隆抗體或重組抗體。本發明還提供了本發明的抗體片段,尤其是保留了抗體抗原結合活性的片段。盡管在某些地方,說明書包括權利要求書明確指出是抗原結合片段、抗體片段、抗體的變體和/或衍生物,但是應當理解,術語“抗體”或“本發明的抗體”包括所有的抗體類別,即抗原結合片段、抗體片段、抗體的變體和衍生物。

在一個實施方案中,本發明的抗體和抗體片段中和組1和組2的兩或更多種甲型流感病毒亞型的組合。示例性甲型流感病毒亞型包括但不限于H5N1(A/Vietnam/1203/04)、H1N1(A/New?Caledonia/20/99)、H1N1(A/Salomon?Island/3/2006)、H3N2(A/Wyoming/3/03)以及H9N2(A/chicken/Hong?Kong/G9/97)。在另一個實施方案中,抗體中和和/或特異于3、4、5、6、7或更多的組1和組2甲型流感病毒亞型的組合。

在示例性實施方案中,本發明包括一種對甲型流感病毒亞型H1和H3(例如H1N1和H3N2)或H1、H3、H5和H9(例如H1N1、H3N2、H5N1和H9N2)是特異性的抗體或其抗體片段。在另一個實施方案中,抗體或其抗體片段對H1、H3、H5、H7和H9(例如H1N1、H3N2、H5N1、H7N1、H7N7、H9N2)是特異性的。在本申請的前面部分提供了其它的甲型流感病毒的亞型的示例性組合。

本發明的示例性抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的氨基酸序列的SEQ?ID序列號以及編碼它們的核酸序列的SEQ?ID序列號列于表1。

表1.示例性甲型流感病毒中和抗體的VH和VL多肽和多核苷酸的SEQ?ID序列號

在一個實施方案中,本發明的抗體或抗體片段含有重鏈可變區,其具有與SEQ?ID?NO:13、33、29或35中任一所述的序列約70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在另一個實施方案中,本發明的抗體或抗體片段含有輕鏈可變區,其具有與SEQ?ID?NO:14或30中所述的序列約70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。

在另一個實施方案中,本發明的抗體的重鏈可變區可以被核酸編碼,該核酸具有與SEQ?ID?NO:15、34、31或36中任一所述的序列約70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%相同的序列。在另一個實施方案中,本發明的抗體的輕鏈可變區可以被核酸編碼,該核酸具有與SEQ?ID?NO:16或32中所述的序列約70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%相同的序列。

抗體重鏈的CDR分別指CDRH1、CDRH2和CDRH3。相似地,抗體輕鏈的CDR分別指CDRL1、CDRL2和CDRL3。CDR氨基酸的位置根據IMGT編號系統被定義為CDR1-IMGT位置27到38、CDR2-IMGT位置56到65以及CDR3-IMGT位置105到117。

表2分別提供了本發明的示例性抗體的重鏈和輕鏈的六個CDR的氨基酸序列的SEQ?ID序列號。

表2.示例性甲型流感病毒中和抗體的CDR多肽的SEQ?ID序列號

在一個實施方案中,本發明的抗體或抗體片段包含至少一個具有與SEQ?ID?NO:1-6或17-22中的任一個有至少95%序列同一性的序列的CDR。

在另一個實施方案中,本發明提供了含有重鏈的抗體,所述重鏈包含一或多種(即一種、兩種或所有三種)FI6變體1、FI6變體2、FI28變體1或FI28變體2的重鏈CDR。在示例性實施方案中,本發明的抗體或抗原結合片段包括具有SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:17的氨基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ?ID?NO:2或SEQ?ID?NO:18的氨基酸序列的重鏈CDR2和具有SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:19的氨基酸序列的重鏈CDR3。在某些實施方案中,如本發明提供的抗體或抗體片段包括重鏈,該重鏈包含CDRH1的SEQ?ID?NO:1、CDRH2的SEQ?ID?NO:2和CDRH3的SEQ?ID?NO:3,或(ii)CDRH1的SEQ?ID?NO:17、CDRH2的SEQ?ID?NO:18和CDRH3的SEQ?ID?NO:19。

本發明還提供了一種含有輕鏈的抗體,所述輕鏈包含一或多種(即一種、兩種或所有三種)FI6變體1、FI6變體2、FI28變體1或FI28變體2的輕鏈CDR。在示例性實施方案中,本發明的抗體或抗原結合片段包括具有SEQ?ID?NO:4或SEQ?ID?NO:20的氨基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ?ID?NO:5或SEQ?ID?NO:21的氨基酸序列的輕鏈CDR2和具有SEQ?ID?NO:6或SEQ?ID?NO:22的氨基酸序列的輕鏈CDR3。在某些實施方案中,如本發明提供的抗體包括輕鏈,該輕鏈包含(i)CDRL1的SEQ?ID?NO:4、CDRL2的SEQ?ID?NO:5和CDRL3的SEQ?ID?NO:6;或(ii)CDRL1的SEQ?ID?NO:20、CDRL2的SEQ?ID?NO:21和CDRL3的SEQ?ID?NO:22。

在一個實施方案中,本發明的抗體或其抗原結合片段含有表2中列出的抗體FI6變體1的所有CDR,并中和甲型流感病毒感染。在另一個實施方案中,本發明的抗體或其抗原結合片段含有表2中列出的抗體FI6變體2的所有CDR,并中和甲型流感病毒感染。在又一實施方案中,本發明的抗體或其抗原結合片段含有表2中列出的抗體FI28變體1的所有CDR,并中和甲型流感病毒感染。在另一個實施方案中,本發明的抗體或其抗原結合片段含有表2中列出的抗體FI28變體2的所有CDR,并中和甲型流感病毒感染。

本發明的示例性抗體包括但不限于FI6變體1、FI6變體2、FI28變體1或FI28變體2。

本發明進一步包括一種抗體或其片段,其與本發明的抗體或與本發明的抗體或抗原結合片段競爭的抗體結合相同的表位。

本發明的抗體還包括雜合抗體分子,其含有本發明的抗體的一或多種CDR和針對相同表位的另一抗體的一或多種CDR。在一個實施方案中,這樣的雜合抗體含有三種本發明的抗體的CDR和三種針對相同表位的另一抗體的CDR。示例性雜合抗體包括i)三種本發明抗體的輕鏈CDR和三種針對相同表位的另一抗體的重鏈CDR;或ii)三種本發明抗體的重鏈CDR和三種針對相同表位的另一抗體的輕鏈CDR。

變體抗體也包括在本發明的范圍之內。因此,在本申請中列舉的序列的變體也包括在本發明的范圍之內。這樣的變體包括通過在免疫應答中體內體細胞突變或通過培養永生B細胞克隆時在體外產生的自然變體。或者,也可能因為遺傳密碼簡并性而產生變體,如上所述,或由于轉錄和翻譯錯誤而生成變體。

進一步地,具有改進的親合力和/或效能的抗體序列的變體可以通過采用在本領域已知的方法來獲得,并包括在本發明的范圍之內。例如,氨基酸取代可以用于獲得具有進一步改善親合力的抗體。或者,核苷酸序列的密碼子優化也可以被用來提高用于抗體產生的表達系統中的翻譯效率。此外,包含通過對本發明的任何核酸序列應用定向進化法優化抗體特異性或中和活性的序列的多核苷酸也屬于本發明的范圍之內。

在一個實施方案中,變體抗體的序列可與在本申請中引用的序列有70%或更多的(即75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或更多)氨基酸序列同一性。在一些實施方案中,這樣的序列同一性是相對于參考序列(即本發明中引用的序列)的全長來計算的。在另外一些實施方案中,如在本文中使用的百分比同一性是通過使用BLAST版本2.1.3使用由NCBI(the?National?Center?for?Biotechnology?Information;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)指定的默認參數[Blosum?62matrix;gap?open?penalty=11和gap?extension?penalty=1]來測定的。

在另一方面,本發明還包括編碼本發明的抗體的輕鏈和重鏈以及CDR的部分或全部的核酸序列。本文提供了編碼本發明的示例性抗體的輕鏈和重鏈以及CDR的部分或全部的核酸序列。表1提供了編碼本發明的示例性抗體的重鏈和輕鏈可變區的核酸序列。例如,本文提供的核酸序列包括SEQ?ID?NO:15(編碼FI6變體1重鏈可變區)、SEQ?ID?NO:34(編碼FI6變體2重鏈可變區)、SEQ?ID?NO:16(編碼FI6變體1和FI6變體2輕鏈可變區)、SEQ?ID?NO:31(編碼FI28變體1重鏈可變區)、SEQ?ID?NO:36(編碼FI28變體2重鏈可變區)和SEQ?ID?NO:32(編碼FI28變體1和變體2輕鏈可變區)。

表3提供了編碼本發明的示例性抗體的CDR的核酸序列的SEQ?ID序列號。由于遺傳密碼的冗余,存在編碼相同氨基酸序列的這些序列的變體。

表3.示例性甲型流感病毒中和抗體的CDR多核苷酸的SEQ?ID序列號

在一個實施方案中,根據本發明的核酸序列包括與編碼本發明的抗體的重鏈或輕鏈的核酸具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的核酸序列。在另一個實施方案中,本發明的核酸序列具有編碼本發明的抗體的重鏈或輕鏈CDR的核酸的序列。例如,根據本發明的核酸序列包含與SEQ?ID?NO:7-12、15、16、34、23-28、31、32或36的核酸序列至少75%相同的序列。

在本發明的范圍內,進一步包括包含根據本發明的核酸序列的載體,如表達載體。用這樣的載體轉化的細胞也包括在本發明的范圍之內。這些細胞的例子包括但不限于真核細胞諸如酵母細胞、動物細胞或植物細胞。在一個實施方案中,所述細胞是哺乳動物細胞,諸如人細胞、CHO、HEK293T、PERC6、NS0、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞。

本發明還涉及結合能夠結合本發明的抗體的表位的單克隆抗體,包括但不限于選自由FI6變體1、FI6變體2、FI28變體1和FI28變體2組成的組的單克隆抗體。

單克隆和重組抗體對于其針對的個別多肽或其它抗原的鑒定和純化特別有用。本發明的抗體還有其它效用,其中它們可用作免疫測定、放射性免疫測定(RIA)或酶聯免疫吸附法(ELISA)測定中的試劑。在這些應用中,可以用諸如放射性同位素、熒光分子或酶的分析上可檢測的試劑來標記抗體。這些抗體還可用于抗原的分子鑒定和表征(表位作圖)。

本發明的抗體可被偶聯到用于遞送到治療位點的藥物或偶聯到可檢測標記以有助于含有諸如感染有甲型流感病毒的細胞的所關注細胞的位點的成像。將抗體偶聯到藥物或可檢測標記的方法在本領域中是已知的,同樣采用可檢測標記進行成像的方法在本領域中也是已知的。標記的抗體可以通過使用各種標記應用于各種測定中。在本發明的抗體和所關注的表位(甲型流感病毒表位)之間形成的抗體-抗原復合物的檢測可以通過將可檢測物質附著到抗體來便利地實現。合適的檢測方法包括諸如放射性核素、酶、輔酶、熒光劑、化學發光劑、色原體、酶底物或輔因子、酶抑制劑、酶活動基(prosthetic)復合物、自由基、粒子、染料等的標記的使用。合適的酶的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰膽堿酯酶;合適的酶活動基復合物的例子包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素;合適的熒光材料的例子包括傘形酮、熒光素、熒光素異硫氰酸酯、羅丹明、二氯三嗪基氨熒光素、丹酰氯或藻紅素;發光材料的例子是魯米諾;生物發光材料的例子包括螢光素酶、螢光素和水母發光蛋白;以及合適的放射性材料的例子包括125I、131I、35S或3H。這樣標記的試劑可用于各種已知的測定中,諸如放射性免疫測定、酶免疫測定如ELISA、熒光免疫測定等。(參見如美國專利第3,766,162號、3,791,932號、3,817,837號和4,233,402號)。

根據本發明的抗體可以被偶聯到諸如細胞毒素、治療劑、或放射性金屬離子或放射性同位素的治療部分。放射性同位素的例子包括但不限于I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212、Bi-213、Pd-109、Tc-99、In-111等。這樣的抗體偶聯物可被用于修飾給定生物應答,不應將藥物部分解釋為僅限于傳統的化學治療劑。例如,藥物部分可以是具有所希望的生物學活性的蛋白或多肽。這樣的蛋白可以包括如相思豆毒蛋白、蓖麻蛋白A、假單胞菌外毒素、或白喉毒素的毒素。

將這樣的治療部分偶聯到抗體的技術是眾所周知的。參見例如Arnon等人.(1985)″Monoclonal?Antibodies?for?Immunotargeting?of?Drugs?in?Cancer?Therapy,″in?Monoclonal?Antibodies?and?Cancer?Therapy,ed.;Reisfeld等人.(Alan?R.Liss,Inc.),pp.243-256;ed.;Hellstrom等人.(1987)″Antibodies?for?Drug?Delivery,″in?Controlled?Drug?Delivery,ed.;Robinson等人.(2d?ed;Marcel?Dekker,Inc.),pp.623-653;Thorpe(1985)″Antibody?Carriers?of?Cytotoxic?Agents?in?Cancer?Therapy:A?Review,″in?Monoclonal?Antibodies′84:Biological?and?Clinical?Applications,ed.;Pinchera等人.pp.475-506(Editrice?Kurtis,Milano,Italy,1985);“Analysis,Results,and?Future?Prospective?of?the?Therapeutic?Use?of?Radiolabeled?Antibody?in?Cancer?Therapy,”in?Monoclonal?Antibodies?for?Cancer?Detection?and?Therapy,ed.;Baldwin?等人.(Academic?Press,New?York,1985),pp.303-316;和Thorpe等人.(1982)Immunol.Rev.62:119-158。

或者,抗體或其抗體片段可以被偶聯到第二抗體或其抗體片段以形成在美國專利第4,676,980號描述的抗體異偶聯物(heteroconjugate)。此外,在本發明的抗體和標記之間可以使用接頭(如美國專利第4,831,175號)。抗體或其抗原結合片段可以直接地用放射性碘、銦、釔或其它本領域中已知的其它放射性粒子標記(例如美國專利第5,595,721號)。治療由同時或相繼地施用偶聯的和非偶聯的抗體治療組合組成(例如WO00/52031;WO00/52473)。

本發明的抗體還可以被附著到固體支持物。另外,本發明的抗體或其功能性抗體片段可以通過共價偶聯到聚合物被化學修飾以例如增加其循環半衰期。聚合物的例子以及將它們附著到肽的方法在美國專利第4,766,106號、4,179,337號、4,495,285號和4,609,546號中給出。在一些實施方案中,這些聚合物可以選自多元醇聚氧乙烯醚和聚乙二醇(PEG)。PEG在室溫下溶于水并具有下列通式:R(O--CH2--CH2)nO--R,其中R可以是氫、或諸如烷基或烷醇基的保護基團。在一個實施方案中,保護基團可以有1到8個碳原子。在另一個實施方案中,保護基團是甲基。符號n是正整數。在一個實施方案中,n為1至1,000。在另一個實施方案中,n為2至500。在一個實施方案中,PEG具有1,000至40,000的平均分子量。在另一個實施方案中,PEG具有2,000至20,000的平均分子量。在另一個實施方案中,PEG具有3,000至12,000的平均分子量。在一個實施方案中,PEG具有至少一個羥基基團。在另一個實施方案中,PEG具有末端羥基基團。在另一個實施方案中,末端羥基基團被活化來與抑制劑上的自由氨基反應。然而,應當理解,可以調節反應性基團的種類和數量來獲得本發明中的共價偶聯的PEG/抗體。

水溶性的多元醇聚氧乙烯醚在本發明中也有用。它們包括山梨醇聚氧乙烯醚、葡萄糖聚氧乙烯醚、聚氧乙烯醚丙三醇(POG)等。在一個實施方案中,使用了POG。不受任何理論的約束,由于聚氧乙烯醚丙三醇的甘油主鏈與天然產生在諸如動物和人中的甘油單酯、二酯和三酯的主鏈相同,所以這種支化不一定在體內被看作為外來物質。在一些實施方案中,POG具有與PEG相同范圍內的分子量。另一種用于延長循環半衰期的藥物遞送系統是脂質體。制備脂質體遞送系統的方法在Gabizon等人(1982),Cafiso(1981)和Szoka(1980)中有所討論。其它的藥物遞送系統在本領域中是已知的,并在諸如引用的Poznansky等(1980)和Poznansky(1984)中有所描述。

本發明中的抗體可以是以純化的形式提供。典型地,抗體將存在于基本上不含其它多肽的組合物中,例如其中少于90重量%、通常少于60重量%以及更常見地少于50重量%的組合物是由其它多肽構成的。

本發明的抗體在諸如小鼠的非人(或異種)宿主中可以是免疫原性的。特別是抗體可以具有在非人宿主中是免疫原性的、而在人宿主中是非免疫原性的獨特位。用于人的本發明的抗體包括那些不容易從諸如小鼠、山羊、兔、大鼠、非靈長類哺乳動物等的宿主中分離、并通常不能通過人源化或從異種鼠獲得的抗體。

本發明的抗體可以是任何的同種型(如IgA、IgG、IgM,也就是α、γ、或μ重鏈),但一般為IgG。在IgG同種型中,抗體可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞類。本發明的抗體可以有κ或λ輕鏈。

抗體的制備

根據本發明的抗體可以用本領域中已知的任何方法來制備。例如采用雜交瘤技術制備單克隆抗體的常用方法是已知的(Kohler,G.和Milstein,C,.1975;Kozbar等人1983)。在一個實施方案中,使用了可選的在WO2004/076677中描述的EBV永生方法。

使用在WO2004/076677中描述的方法,產生本發明的抗體的B細胞可在多克隆B細胞激活劑存在的情況下用EBV轉化。用EBV轉化是標準技術,并可以容易地加以調節來包括多克隆B細胞激活劑。

任選地,在轉化步驟中可以加入另外的細胞生長和細胞分化的刺激物以進一步提高效率。這些刺激物可以是諸如IL-2和IL-15的細胞因子。在一方面,在永生步驟中加入IL-2以進一步提高永生的效率,但是其使用并不是必需的。然后,使用這些方法制備的永生B細胞可采用本領域中已知的方法來培養,并將抗體從其中分離。

使用在英國專利申請第0819376.5號中描述的方法,可以在微孔培養板中培養單漿細胞。可以從單漿細胞培養物中分離抗體。進一步,從單漿細胞培養物中可以提取RNA,并且采用本領域中已知的方法實施單細胞PCR。抗體的VH和VL區可以通過RT-PCR擴增、測序并克隆到隨后被轉染進HEK293T細胞或其它宿主細胞的表達載體中。可以采用本領域技術人員已知的任何方法來完成核酸在表達載體中的克隆、宿主細胞的轉染、轉染的宿主細胞的培養以及產生的抗體的分離。

如果需要,也可以采用過濾、離心和各種色譜法諸如HPLC或親和色譜法進一步純化抗體。如單克隆抗體的抗體純化技術,包括制備藥物級抗體的技術,在本領域中是已知的。

本發明的抗體的片段可以通過包括利用諸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的酶消化、和/或通過化學還原二硫鍵的裂解的方法從抗體中獲得。或者,抗體的片段可以通過克隆或表達部分的重鏈或輕鏈的序列來獲得。抗體“片段”可以包括Fab、Fab’F(ab′)2和Fv片段。本發明還包含源自本發明的抗體的重鏈和輕鏈的單鏈Fv片段(scFv),例如本發明包括含有本發明的抗體的CDR的scFv。本發明還包括重鏈或輕鏈的單體和二聚體、單結構域重鏈抗體、單結構域輕鏈抗體、以及單鏈抗體,例如重鏈和輕鏈可變域被肽接頭連接的單鏈Fv。

本發明的抗體片段可以被賦予單價或多價相互作用并可以包含在上述的多種結構中。例如,可以合成scFv分子來產生三價的“三鏈抗體”和四價的“四鏈抗體”。scFv分子可以包含形成二價微型體(minibody)的Fc區的結構域。此外,本發明的序列可以是多特異性分子的組分,其中本發明的序列靶向本發明的表位并且分子的其它區結合到其它靶。示例性分子包括但不限于雙特異性Fab2、三特異性Fab3、雙特異性scFv和雙抗體(Holliger和Hudson,2005,Nature?Biotechnology?9:1126-1136)。

分子生物學的標準技術可以用于制備編碼本發明的抗體或抗體片段的DNA序列。可以采用寡核苷酸合成技術部分地或全部地合成所需的DNA序列。也可以適當地使用定點誘變和聚合酶鏈反應(PCR)技術。

任何合適的宿主細胞/載體系統都可被用于編碼本發明的抗體分子或其片段的DNA序列的表達。諸如大腸桿菌的細菌和其它微生物系統可以部分地用于抗體片段諸如Fab和F(ab’)2片段、和特別是Fv片段和諸如單鏈Fv的單鏈抗體片段的表達。如哺乳動物的真核細胞宿主細胞表達系統可以用于包括完整抗體分子在內的較大抗體分子的制備。合適的哺乳動物宿主細胞包括但不限于CHO、HEK293T、PER.C6、NS0、骨髓瘤或雜交瘤細胞。

本發明還提供了一種用于制備根據本發明的抗體分子的方法,其包括在適用于導致從編碼本發明的抗體分子的DNA表達蛋白的條件下培養包含編碼本發明的核酸的載體的宿主細胞并分離抗體分子。

抗體分子可以僅包含重鏈或輕鏈多肽,在這種情況下,僅需要重鏈或輕鏈多肽編碼序列來轉染宿主細胞。要制備既含有重鏈又含有輕鏈的產物時,可以用兩種載體轉染細胞系,其中第一載體編碼輕鏈多肽而第二載體編碼重鏈多肽。或者,可以使用單個載體,該載體包含編碼輕鏈和重鏈多肽的序列。

或者,本發明的抗體可以通過以下步驟制備:i)在宿主細胞中表達根據本發明的核酸序列,和ii)分離被表達的抗體產物。此外,該方法還可包括iii)純化抗體。

轉化的B細胞、培養的單漿細胞和轉染的HEK293T細胞的篩選

可對轉化的B細胞和培養的單漿細胞進行篩選以用于制備那些具有所需的特異性或功能的抗體。

篩選步驟可以通過如下方法來完成:諸如ELISA的任何免疫測定、對組織或細胞(包括轉染的細胞)染色、中和測定或在本領域中已知的用于鑒定所需的特異性或功能的多種其它方法中的一種。測定可以基于一種或多種抗原的簡單識別來選取;或還可以基于所需的功能來選取,例如選擇中和抗體而不僅僅是抗原結合抗體,選擇能改變被靶向細胞的特性的抗體,該特性為諸如它們的信號轉導級聯放大、它們的形狀、它們的生長速度、它們影響其它細胞的能力、它們對來自其它細胞或其它試劑或條件改變的應答、它們的分化狀態等。

個別轉化的B細胞克隆可以通過陽性轉化的B細胞培養來制備。用于從陽性細胞的混合物中分離單獨的克隆的克隆步驟可以通過使用有限稀釋、顯微操作術、通過細胞分選的單一細胞沉積以及在本領域中其它已知的方法來完成。

采用本領域中已知的方法將來自培養的單漿細胞的核酸進行分離、克隆并在HEK293T細胞或其它宿主細胞中表達。

本發明的永生B細胞克隆或轉染的HEK293T細胞可以用于多種用途:如作為單克隆抗體的來源、作為編碼所關注的單克隆抗體的核酸(DNA或mRNA)的來源,以用于科研等。

本發明提供了一種組合物,其包含產生中和至少兩種選自組1和組2亞型的甲型流感病毒的不同亞型的抗體的永生B記憶細胞或轉染的宿主細胞。

表位

如上所述,本發明的抗體可以用于對所述抗體結合的表位進行作圖。本發明人已經發現中和甲型流感病毒感染的抗體針對在HA上發現的表位。在一個實施方案中,抗體針對在一或多種甲型流感病毒的組1和組2亞型之中是保守的HA的莖區的一或多個表位。本發明的抗體結合的表位可以是線性的(連續的)或構象的(不連續的)。在一個實施方案中,如本文中所討論,本發明的抗體和抗體片段結合包含SEQ?ID?NO:37、38、39或40的多肽區。

由本發明中的抗體識別的表位可以有多種用途。純化或合成形式的表位及其模擬表位可以用于提高免疫應答(即作為疫苗、或用于其它用途的抗體的制備)、或用于篩選與表位或其模擬表位發生免疫應答的抗體的血清。在一個實施方案中,這樣的表位或模擬表位、或含有這樣的表位或模擬表位的抗原可以被用作疫苗以提高免疫應答。本發明的抗體或抗體片段還可以在監測疫苗質量的方法中使用。具體地,抗體可用于檢測疫苗中的抗原是否包含在正確構象的正確的免疫原性表位。

表位還可以用于篩選結合所述表位的配體。這樣的配體包括但不限于抗體(包括來自駱駝、鯊魚和其它物種的那些)、抗體片段、肽、噬菌體展示技術產物、適配體、adnectin或其它病毒或細胞蛋白的片段,可以阻斷表位并因此預防感染。這些配體包括在本發明的范圍之內。

重組表達

本發明的永生B細胞克隆或培養的漿細胞還可以用作克隆隨后重組表達的抗體基因的核酸的來源。用于藥物目的時,重組源的表達比B細胞或雜交瘤的表達更常見,這是基于諸如穩定性、再現性、培養容易度等的原因。

因此,本發明提供了一種制備重組細胞的方法,其包括如下步驟:(i)從B細胞克隆或培養的單漿細胞獲得一種或多種編碼所關注的抗體的核酸(如重鏈和/或輕鏈mRNA);(ii)將核酸插入表達載體以及(iii)將載體轉染入宿主細胞以允許所關注的抗體在該宿主細胞中表達。

相似地,本發明提供了一種制備重組細胞的方法,其包括如下步驟:(i)對來自B細胞克隆或培養的單漿細胞的編碼所關注的抗體的核酸測序;和(ii)用從步驟(i)中獲得的序列信息制備用于插入宿主細胞以允許所關注的抗體在該宿主細胞中表達的核酸。核酸可以(但不是必需)在步驟(i)和步驟(ii)之間操作以引入限制位點、修改密碼子使用、和/或優化轉錄和/或翻譯調節序列。

本發明還提供了一種制備轉染的宿主細胞的方法,其包括用一種或多種編碼所關注的抗體的核酸轉染宿主細胞的步驟,其中所述的核酸是源自本發明的永生B細胞克隆或培養的單漿細胞的核酸。因此,首先制備核酸、然后用其轉染宿主細胞的步驟可以在不同的時間、由不同的人員、在不同的地點(例如,在不同的國家)來進行。

然后,本發明的這些重組細胞可用于表達和培養目的。它們對于用于大規模藥物制備的抗體的表達特別地有用。它們還可以用作藥物組合物的活性成分。可以使用任何合適的培養技術,包括但不限于靜置培養、轉瓶培養、腹水、中空纖維型生物反應器盒、模式微型發酵器、攪拌槽、微載體培養、陶瓷芯灌注等。

從B細胞或漿細胞中獲得和測序免疫球蛋白基因的方法在本領域中是已知的(如參見Chapter?4?of?Kuby?Immunology,4th?edition,2000)。

轉染的宿主細胞可以是真核細胞,包括酵母和動物細胞、特別是哺乳動物細胞(例如CHO細胞、NS0細胞、諸如PER.C6(Jones等人2003)或HKB-11(Cho等人2001;Cho等人2003)的人細胞、骨髓瘤細胞(美國專利第5,807,715號和6,300,104號等))以及植物細胞。優選的表達宿主能夠使本發明的抗體糖基化,特別是用在人體內其本身不是免疫原性的碳水化合物結構進行糖基化。在一個實施方案中,轉染的宿主細胞可以在沒有血清的培養基中生長。在另一個實施方案中,轉染的宿主細胞可以在沒有任何來自動物的產物的培養物中生長。可培養轉染的宿主細胞以產生細胞系。

本發明提供了一種制備一種或多種編碼所關注的抗體的核酸分子(例如重鏈和輕鏈基因)的方法,其包括如下步驟:(i)制備本發明永生B細胞克隆或培養本發明的漿細胞;(ii)從B細胞克隆或培養的單漿細胞中獲得編碼所關注的抗體的核酸。本發明還提供了一種獲得編碼所關注的抗體的核酸序列的方法,其包括如下步驟:(i)制備本發明的永生B細胞克隆或培養本發明的單漿細胞;(ii)對來自B細胞克隆或培養的漿細胞的編碼所關注的抗體的核酸進行測序。

本發明還提供了一種制備編碼所關注的抗體的核酸分子的方法,其包括獲得從本發明的轉化的B細胞克隆或培養的漿細胞中獲得的核酸的步驟。因此,首先獲得B細胞克隆或培養的漿細胞、然后從B細胞克隆或培養的漿細胞獲得核酸的步驟可以在不同的時間、由不同的人員、在不同的地點(例如在不同的國家)來進行。

本發明提供了一種制備抗體(如用于藥物用途)的方法,其包括如下步驟:(i)從表達所關注的抗體的所選B細胞克隆或培養的漿細胞獲得一種或多種核酸(如重鏈和輕鏈基因)和/或對來自表達所關注的抗體的所選B細胞克隆或培養的漿細胞一種或多種核酸(如重鏈和輕鏈基因)進行測序;(ii)將核酸插入表達載體或用核酸序列制備表達載體;(iii)轉染能表達所關注的抗體的宿主細胞;(iv)在所關注的抗體被表達的條件下培養或傳代培養轉染的宿主細胞;和任選地,(v)純化所關注的抗體。

本發明還提供了一種制備抗體的方法,其包括如下步驟:在所關注的抗體被表達的條件下培養或傳代培養轉染的宿主細胞群;和任選地,純化所關注的抗體,其中所述的轉染的宿主細胞群通過以下步驟制備:(i)提供編碼所選的所關注的所選抗體的核酸,所述核酸如上所述由B細胞克隆或培養的漿細胞產生,(ii)將核酸插入表達載體,(iii)將載體轉染能表達所關注的抗體的宿主細胞,以及(iv)培養或傳代培養含有插入的核酸的轉染的宿主細胞以制備所關注的抗體。因此,首先制備重組宿主細胞、然后培養重組宿主細胞以表達抗體的步驟可以在不同的時間、由不同的人員、在不同的地點(例如在不同的國家)來進行。

藥物組合物

本發明提供了一種藥物組合物,其包含本發明的抗體和/或抗體片段和/或編碼這樣的抗體的核酸和/或由本發明的抗體所識別的表位。藥物組合物還可以包含藥學可接受的載體以進行施用。載體本身不應該誘導對接受組合物的個體有害的抗體的產生且不應有毒。合適的載體可以是大的、緩慢代謝的大分子,諸如蛋白、多肽、脂質體、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物和非活性病毒粒子。

可以使用藥學可接受的鹽,例如諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽和硫酸鹽的礦物酸鹽,或諸如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽和苯甲酸鹽的有機酸鹽。

治療組合物中藥學可接受的載體還可以另外包含諸如水、鹽水、甘油和乙醇的液體。此外,諸如潤濕劑或乳化劑或pH值緩沖物質的輔助物質也可以存在于這樣的組合物中。這樣的載體允許藥物組合物被制成由受試者攝取的片劑、丸劑、錠劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑和懸浮液的形式。

在本發明的范圍內,施用的方式可包括那些適用于非腸道施用的形式,如通過諸如彈丸注射或持續輸液的注射或輸液方式。當產物用于注射或輸液時,其可以采用在油性或水性介質中的懸浮液、溶液或乳狀液的形式,并且其可以含有諸如懸浮劑、防腐劑、穩定劑和/或分散劑的配方劑。或者,抗體分子可以是干粉形式,在使用前與適當的消毒液體復配。

一旦配制好,本發明的組合物可以直接施用給受試者。在一個實施方案中,使組合物適合于施用給人受試者。

本發明的藥物組合物可以通過多種途徑施用,包括但不限于口服、靜脈內、肌內、動脈內、髓內、腹腔內、鞘內、心室內、透皮、經皮、局部、皮下、鼻內、腸道、舌下、陰道內或直腸途徑。無針注射也可以用來施用本發明的藥物組合物。典型地,治療組合物可被制成諸如液體溶液或懸浮液的可注射劑。在注射前,還可以制備適用于液體媒介物中的溶液或懸浮液的固體形式。

組合物的直接遞送一般通過皮下、腹腔內、靜脈內或肌肉注射、或通過遞送至組織細胞間隙來完成。還可以將組合物施用到病變部位。治療劑量可以是單劑量或多劑量用藥療程。已知的基于抗體的藥物提供了關于例如是否應該每天、每周、每月等遞送藥物的施用頻率的指導。頻率和劑量還依據癥狀的嚴重程度而定。

可以將本發明的組合物制成各種形式。例如,可將組合物制成或是液體溶液或是懸浮液的可注射劑。在注射前,還可以制備適用于液體媒介物中的溶液或懸浮液的固體形式(例如如SynagisTM和HerceptinTM的凍干的組合物,與含有防腐劑的消毒水復配)。可以將組合物制成諸如軟膏劑、乳劑或粉末以用于局部施用。可以將組合物制成諸如片劑或膠囊、噴劑、或糖漿(任選地調味的)以用于口服施用。使用細粉末或噴劑,可以將組合物制成諸如吸入劑以用于肺部施用。可以將組合物制成栓劑或陰道栓劑。可以將組合物制成諸如滴劑以用于鼻腔、耳部、或眼睛施用。組合物可以采用試劑盒的形式,對其進行設計從而使得在向受試者施用前復配組合的組合物。例如,可以將凍干的抗體與消毒水或消毒緩沖液一起以試劑盒的形式提供。

應當理解,組合物中的活性成分會是抗體分子、抗體片段或其變體和衍生物。因此,組合物易于在胃腸道中降解。因此,如果組合物是通過使用胃腸道途徑施用的話,則組合物將需要包含保護抗體免于降解、但一旦抗體從腸胃道中被吸收就釋放抗體的物質。

藥學可接受的載體的深入討論參見Gennaro(2000)Remington:The?Science?and?Practice?of?Pharmacy,20th?edition,ISBN:0683306472。

本發明的藥物組合物一般具有5.5至8.5的pH值,在一些實施方案中,該pH值可以6至8,并且在另一個實施方案中,pH值約為7。可以通過使用緩沖液來維持pH值。組合物可以是無菌的和/或不含熱原的。對于人,組合物可以是等滲的。在一個實施方案中,本發明的藥物組合物在密閉的容器中提供。

藥物組合物將包含有效量的本發明的一種或多種抗體和/或含有結合本發明的抗體的表位的多肽,即足以治療、改善或預防希望的疾病或病癥或顯示出可檢測的療效的量。療效還包括身體癥狀的緩解。對于任何特定的受試者的精確有效量將取決于他們的體重與健康狀況、癥狀的性質和嚴重程度以及選擇施用的治療劑或治療劑組合。對于給定情形下,有效量由常規實驗來確定并且由臨床醫生決定。為本發明的目的,對個體所施用的本發明的組合物的有效劑量一般是從約0.01mg/kg至約50mg/kg或約0.05mg/kg至約10mg/kg。已知的基于抗體的藥物提供了這方面的指導,例如HerceptinTM是通過靜脈輸液21mg/ml的溶液來施用,初始給藥劑量為4mg/kg體重,每周維持劑量為2mg/kg體重;RituxanTM每周以375mg/m2施用等。

在一個實施方案中,組合物可以包括一種以上(如兩種、三種等)本發明的抗體以提供加合或協同療效。在另一個實施方案中,組合物可以包括一種或多種(如兩種、三種等)本發明的抗體和一種或多種(如兩種、三種等)抵抗甲型流感病毒的額外抗體。例如,一種抗體可以結合HA表位,而另一種可以結合HA上不同的表位,或者結合神經氨酸酶和/或基質蛋白上的表位。進一步,本發明的抗體與甲型流感疫苗或與對除甲型流感病毒之外的有特異性的抗體一起施用都在本發明的范圍內。本發明的抗體可以與流感疫苗或與對除甲型流感病毒之外的有特異性的抗體組合/同時或者在不同時間施用。

在另一個實施方案中,本發明提供了一種包括兩種或更多種抗體的藥物組合物,其中第一抗體是本發明的抗體且對HA表位具有特異性,而第二抗體對于神經氨酸酶表位、第二HA表位和/或基質表位具有特異性。例如,本發明提供了一種包含兩種或更多種抗體的藥物組合物,其中第一抗體對于甲型流感病毒HA的莖中的表位具有特異性,而第二抗體對于神經氨酸酶表位、第二HA表位(例如,HA的球狀頭部中的表位、HA的莖中的第二表位)和/或基質表位具有特異性。甲型流感病毒HA的莖中的第二表位或球狀頭部中的表位可以(但不必需)在一種以上的甲型流感病毒亞型之中是保守的。

在另一個實施方案中,本發明提供了一種包括兩種或更多種抗體的藥物組合物,其中第一抗體對于神經氨酸酶表位具有特異性,而第二抗體對于第二神經氨酸酶表位、HA表位和/或基質表位具有特異性。

在又一個實施方案中,本發明提供了一種包括兩種或更多種抗體的藥物組合物,其中第一抗體對于基質表位具有特異性,而第二抗體對于第二基質表位、HA上的表位和/或神經氨酸酶上的表位具有特異性。

對于甲型流感病毒靶蛋白具有特異性的本發明的示例性抗體包括但不限于FI6變體1、FI6變體2、FI28變體1或FI28變體2。

在一個實施方案中,本發明提供了一種藥物組合物,其包含抗體FI6變體1或其抗原結合片段、以及藥學可接受的載體。在另一個實施方案中,本發明提供了一種藥物組合物,其包含抗體FI6變體2或其抗原結合片段、以及藥學可接受的載體。在另一個實施方案中,本發明提供了一種藥物組合物,其包含抗體FI28變體1或其抗原結合片段、以及藥學可接受的載體。在另一個實施方案中,本發明提供了一種藥物組合物,其包含抗體FI28變體2或其抗原結合片段、以及藥學可接受的載體。

本發明的抗體可以與如化療化合物、放療等的其它治療劑一起施用(組合地或單獨地)。在一個實施方案中,治療化合物包括諸如TamifluTM的抗病毒化合物。相對于單獨施用的單一治療劑,這樣的組合治療提供了加合或協同改善的療效。術語“協同”是用來描述兩種或兩種以上活性劑的組合效果比每種各自活性劑的單獨療效的加合要大。因此,如果兩種或兩種以上制劑的組合效果引起活性或過程的“協同抑制”,則是指活性或過程的抑制要比每種各自的活性劑的抑制效果的加合要大。術語“協同療效”是指在用兩種或兩種以上治療組合時所觀察到的療效,其中療效(如通過若干參數中的任一個所測量的)要比用各自單獨的治療時所觀察到的療效的加合要大。

抗體可以施用給那些先前對于甲型流感病毒感染的治療沒有應答(即對于抗流感治療顯示是耐受的)的受試者。這種治療可以包括先前用抗病毒劑進行的治療。這可能是因為例如感染了甲型流感病毒的抗病毒抗性株。

在一個實施方案中,本發明的組合物可以包括本發明的抗體,其中抗體可以構成組合物中總蛋白的至少50重量%(如60重量%、70重量%、75重量%、80重量%、85重量%、90重量%、95重量%、97重量%、98重量%、99重量%或更多)。在這樣的組合物中,抗體是純化的形式。

本發明提供了一種制備藥物的方法,其包括以下步驟:(i)制備本發明的抗體;和(ii)將純化的抗體與一種或多種藥學可接受的載體混合。

本發明還提供了一種制備藥物的方法,其包括將抗體與一種或多種藥學可接受的載體混合的步驟,其中抗體是從本發明的轉化的B細胞或培養的漿細胞獲得的單克隆抗體。因此,首先獲得單克隆抗體、然后制備藥物的步驟可以在不同的時間、由不同的人員、在不同的地點(如在不同的國家)來進行。

作為一種可選的遞送抗體或B細胞以用于治療目的的方法,可以向受試者遞送編碼源自B細胞或培養的漿細胞的所關注的單克隆抗體(或其活性片段)的核酸(典型地為DNA),使得核酸就可以在受試者的原位進行表達以獲得理想的療效。合適的基因治療和核酸遞送載體在現有技術中是已知的。

本發明的組合物可以是免疫原性組合物,并且在一些實施方案中可以是包含含有由本發明的抗體所識別的表位的抗原的疫苗組合物。根據本發明的疫苗可以是預防性的(即預防感染)或者是治療性的(即治療感染)。在一個實施方案中,本發明提供了包含含SEQ?ID?NO:37、38、39或40的氨基酸序列的多肽的疫苗。

組合物可以包含抗微生物劑,特別是在多劑量形式包裝時。組合物可以包含諸如Tween?80的Tween(聚山梨醇酯)去垢劑。去垢劑一般是以低水平存在,如<0.01%。組合物還可以含有鈉鹽(如氯化鈉)以提供張度。典型地,NaCl的濃度為10±2mg/ml。

進一步,組合物可以包含在諸如15-30mg/ml左右(例如25mg/ml)的糖醇(如甘露醇)或二糖(如蔗糖或海藻糖),特別是這些組合物要被凍干或者包含已經與凍干的材料復配的材料。用于凍干的組合物的pH值可以在凍干之前調節至約6.1。

本發明的組合物也可包含一種或多種免疫調節劑。在一個實施方案中,一種或多種免疫調節劑包括佐劑。

本發明的表位組合物可以誘發細胞介導的免疫應答以及體液免疫應答以有效地抗甲型流感病毒感染。這種免疫應答可以誘導持久的(如中和)抗體和在暴露于甲型流感病毒時可以迅速應答的細胞介導的免疫性。

醫學治療和用途

本發明的抗體和抗體片段或其衍生物和變體可用于甲型流感病毒感染的治療、甲型流感病毒感染的預防或甲型流感病毒感染的診斷。

診斷方法可以包括使抗體或抗體片段與樣本接觸。這些樣本可能是從諸如鼻腔通道、鼻竇腔、唾液腺、肺、肝、胰腺、腎、耳、眼、胎盤、消化道、心臟、卵巢、垂體、腎上腺、甲狀腺、大腦或皮膚提取的組織樣本。診斷的方法還可以包括抗原/抗體復合物的檢測。

因此,本發明提供了(i)根據本發明的抗體、抗體片段、或其變體以及衍生物;(ii)根據本發明的永生B細胞克隆;(iii)能夠結合本發明的抗體的表位或(iv)配體,優選為能夠結合表位的抗體,該表位結合本發明的抗體以用于治療中。

本發明還提供了治療受試者的方法,其包括向受試者施用根據本發明的抗體、抗體片段、或其變體和衍生物,或配體,優選地為能夠結合表位的抗體,所述表位結合本發明的抗體。在一個實施方案中,該方法使得受試者中甲型流感病毒的感染減少。在另一個實施方案中,該方法預防、減少受試者中的甲型流感病毒感染的風險或延遲受試者中的甲型流感病毒感染。

本發明還提供了(i)根據本發明的抗體、抗體片段、或其變體和衍生物;(ii)根據本發明的永生B細胞克隆;(iii)能夠結合本發明的抗體的表位;或(iv)配體,優選地為結合表位的抗體,該表位結合本發明的抗體,在制備預防或治療甲型流感病毒感染的藥物中的用途。

本發明提供了用作預防或治療甲型流感病毒感染的藥物的本發明的組合物。本發明還提供了本發明的抗體和/或包含該抗體結合的表位的蛋白在制備治療和/或診斷受試者的藥物中的用途。本發明還提供了治療受試者疾病的方法,其包括向受試者施用本發明的組合物的步驟。在一些實施方案中,受試者可以是人。一種檢查療效的方法包括在施用本發明的組合物后監測疾病癥狀。治療可以采用單劑量或多劑量用藥療程。

在一個實施方案中,向需要這樣的治療的受試者施用根據本發明的抗體、抗體片段、永生B細胞克隆、表位或組合物。這樣的受試者包括但不限于、尤其是處于甲型流感病毒感染危險下或易于被該病毒感染的受試者,包括例如免疫功能低下的受試者。本發明的抗體或抗體片段也可用于被動免疫或主動免疫。

本發明中所述的抗體及其片段也可以用于診斷甲型流感病毒感染的試劑盒中。此外,能夠結合本發明的抗體的表位可以用在試劑盒中,以通過檢測保護性抗甲型流感病毒抗體的存在來監測疫苗接種程序的功效。如本發明所述的抗體、抗體片段、或其變體及衍生物也可以用在試劑盒中,以監測具有所需的免疫原性的疫苗的生產。

本發明還提供一種制備藥物的方法,其包括將單克隆抗體與一種或多種藥學可接受的載體混合的步驟,其中所述單克隆抗體是從本發明的轉染宿主細胞中獲得的單克隆抗體。因此,首先獲得(如通過表達和/或純化)單克隆抗體、然后將單克隆抗體與藥物載體混合的步驟可以在不同的時間、由不同的人、在不同的地點(如在不同的國家)來進行。

從本發明的轉化的B細胞或培養的漿細胞開始,可進行以下各種步驟使由轉化的B細胞或培養的漿細胞表達的抗體永存:培養、傳代培養、克隆、亞克隆、測序、核酸制備等,對每一步驟可任選地優化。在優選的實施方案中,上述方法進一步包括應用于編碼抗體的核酸的優化技術(如親和力成熟或優化)。本發明涵蓋了在這樣的步驟中使用和制備的所有細胞、核酸、載體、序列、抗體等。

在所有這些方法中,可操作表達宿主中所用的核酸以插入、缺失或修飾某些核酸序列。這種操作的變化包括但不限于引入限制位點、修改密碼子使用、增加或優化轉錄和/或翻譯調控序列等的變化。也有可能改變核酸以改變編碼的氨基酸。例如,其可能在抗體的氨基酸酸序列引入一個或多個(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)氨基酸取代、缺失和/或插入是有用的。這樣的點突變可以修改效應物功能、抗原結合親和力、翻譯后修飾、免疫原性等;還可以引入氨基酸以附著共價基團(如標記)或可以引入標簽(如用于純化目的)。突變可以被引入特異位點或可以隨機引入,隨后進行選擇(如分子進化)。例如,一個或多個編碼本發明的CDR區、重鏈可變區或輕鏈可變區中的任一個的核酸都可被隨機地或定向地突變以在被編碼的氨基酸中引入不同的特性。這種改變可能是迭代過程的結果,其中初始的改變被保留了下來且在其它核苷酸位置引入新改變。此外,可以合并在單獨步驟中完成的變化。引入編碼的氨基酸中的不同特性可以包括但不限于增強的親和力。

一般概念

術語“包含”涵蓋“包括”以及“由…組成”,如“包含”X的組合物可以全部由X組成或可以包括額外成分如X+Y。

詞“基本上”不排除“完全”,如“基本上不含”Y的組合物可以是完全不含Y。根據需要,可將詞“基本上”從本發明的定義中略去。

關于數值x的術語“約”是指例如x±10%。

如本文所用的術語“疾病”是一般意義上同義的,并可與術語“失調”和“病癥”(如在醫學狀況中)可互換地使用,且其中所有都反映了損害正常功能的人或動物身體或其一個部位的異常狀況,通常通過區分病征和癥狀來表現,并使人或動物的壽命縮短或生存質量下降。

如本文所用,對于受試者或患者的“治療”旨在包括預防、防治和治療。術語“受試者”或“患者”在本文中互換地使用來指包括人在內的所有哺乳動物。受試者的例子包括人、牛、狗、貓、馬、山羊、綿羊、豬和兔。在一個實施方案中,患者是人。

實施例

在以下的實施例中提供了本發明的示例性實施方案。以下的實施例僅通過示例的方式給出并用來幫助普通技術人員使用本發明。所述實施例并非旨在以任何方式來另外限制本發明的范圍。

實施例1.漿細胞的甲型流感病毒廣譜中和抗體的生成與表征

為了確定可以產生響應季節性流感疫苗(含H1和H3HA)的異亞型抗體的個體,我們通過ELISPOT篩選了在增強其分泌結合疫苗或無關的H5HA(A/VN/1203/04)的抗體的能力之后的第7天收集的循環漿細胞。然而令人驚訝的是,在受測的5個供體中的4個中沒有檢測到H5-特異性漿細胞,在一個供體中14%的IgG分泌漿細胞產生了對抗H5的抗體,而57%產生了對疫苗的抗體。通過磁微珠及隨后的利用FACSAria儀的細胞分選,在接種疫苗7天后收集的外周血單個核細胞(PBMC)中分離了CD138+漿細胞。數量有限的漿細胞接種在微孔培養板中。利用重組H5或H9HA和不相關的抗原破傷風類毒素作為抗原用三個平行的ELISA測試培養上清液。在4,928種被篩選的培養上清液中,有12種結合H5而不結合H9HA、25種結合H9而不結合H5HA以及54種既結合H5又結合H9。將一些具有最高OD信號的54種培養物進行RT-PCR,得到了兩個配對的VH和VL基因。

VH和VL基因被克隆到表達載體,通過轉染HEK293T細胞產生重組抗體。兩個單克隆抗體FI6和FI28共享大部分的V、D和J基因片段(IGHV3-30*01、IGHD3-9*01、IGHJ4*02和IGKV4-1*01),但有不同的N區、不同的IGKJ使用以及不同的體細胞突變模式,因此在克隆上是不相關的。

采用屬于不同亞型的HA的組,通過ELISA來研究重組抗體的特異性。明顯地,FI6結合了包括組1(H1、H5和H9)和組2(H3和H7)的所有的被測試的甲型流感病毒HA亞型,而不結合乙型流感病毒的HA。相反,FI28僅結合3個組1的HA(H1、H5和H9)。

表4

考慮到兩種抗體的VH和VL序列的同源性,利用FI6、FI28和7I13的H和L鏈來進行改組實驗,hCMV特異性抗體使用H鏈的同樣的V、D和J元件。盡管結合H7需要FI6的H鏈和L鏈配對,但當FI6和FI28的L鏈改組時,保留了與H5的結合。此外,當FI6的H鏈配對到不相關的7I13的L鏈時也觀察到H5結合。相反,當同源的7I13的H鏈與FI6的L鏈配對時沒有觀察到H5結合。不受任何特定理論的約束,這些結果表明H5結合的主要貢獻來自H鏈,而H7結合則需要FI6的H鏈和L鏈之間的精確配對。

然后利用假型病毒(表5)以及感染性病毒(表6)來測試FI6和FI28中和組1和組2甲型流感病毒亞型的能力。明顯地,FI6中和了所有被測試的假型病毒,包括6個屬于抗原性不同分支0、1、2.1、2.2和2.3的H5分離體和2個H7禽分離體。此外,FI6中和了所有被測試的傳染性病毒,包括兩個已存在數十年的H3N2病毒和四種H1N1病毒和最近的H1N1大流行分離體A/CA/04/09(表6)。FI28中和了所有的H5假型病毒,但卻沒有中和H7假型病毒以及所有被測試的傳染性病毒。對假型病毒的中和滴度比對傳染性病毒的滴度高。

表5

表6

nd:未進行

實施例2.FI6和FI28的抗原結合位點

為了確定抗體FI6和FI28結合的抗原位點,我們首先測試了其抑制C179的結合的能力,C179是被作圖到HA莖區的保守區的小鼠單克隆抗體(Y.Okuno,等人,J?Virol?67,2552(1993))。FI6和FI28均完全抑制了C179與重組H5VN/1203/04HA的結合,表明它們可識別重疊表位。相反,FI6和FI28不與從H5N1免疫供體中分離的、識別HA的球狀頭部中不同表位的H5特異性抗體組競爭(C.P.Simmons等人,PLoS?Med?4,e178(2007);S.Khurana等人,PLoS?Med?6,e?1000049(2009))。通過選擇逃逸突變株(escape?mutant)來作圖FI6表位的嘗試失敗了,表明在不危害病毒適應性的情況下,其表位不會輕易突變。

隨后,我們利用HA?A/VN/1194/04(HA)的線形和環化肽的文庫進行基于肽的作圖以及利用Pepscan?Presto?BV(Lelystad,The?Netherlands)的系統進行螺旋掃描。這種分析確定了如下的F16結合區:其包括HA2融合肽FGAIAG(根據H3編號為SEQ?ID?NO:37的氨基酸3-8)、HA2的A螺旋肽DGVTNKVNS(SEQ?ID?NO:38的氨基酸46-54),HA2的B-螺旋肽MENERTLDFHDSNVK(SEQ?ID?NO:39的氨基酸102-116)和HA1的C-末端肽LVLATGLRNSP(SEQ?ID?NO:40的氨基酸315-325)。由于FI28不與HA1的C-末端肽和HA2的B-螺旋肽反應,所以FI28的結合區與FI6的不同。

參考文獻

Okuno?et?al.,(1993)Journal?of?Virology?67:2552-2558.

Gerhard?et?al.,(2006)Emerging?Infectious?Diseases?12:569-574.

Gioia?et?al.,(2008)Emerging?Infectious?Diseases?14:121-128.

US?3,766,162

US?3,791,932

US?3,817,837

US?4,233,402

US?4,676,980

US?4,831,175

US?5,595,721

WO00/52031

WO00/52473

US?4,766,106

US?4,179,337

US?4,495,285

US?4,609,546

Gabizon?et?al.,(1982)Cancer?Research?42:4734

Cafiso(1981)Biochem?Biophys?Acta?649:129

Szoka(1980)Ann.Rev.Biophys.Eng.9:467

Poznansky?et?al.,(1980)Drug?Delivery?Systems(R.L.Juliano,ed.,Oxford,N.Y.)pp.253-315

Poznansky(1984)Pharm?Revs?36:277

Kohler,G.and?Milstein,C,.1975,Nature?256:495-497.

Kozbar?et?al.,1983,Immunology?Today?4:72.

WO2004/076677

Chapter?4?of?Kuby?Immunology(4th?edition,2000;ASIN:0716733315

Jones?et?al.,Biotechnol?Prog?2003,19(1):163-8

Cho?et?al.,Cytotechnology?2001,37:23-30

Cho?et?al.,Biotechnol?Prog?2003,19:229-32

US?5,807,715

US?6,300,104

Rowe?et?al.,(1999)J?Clin?Microbiol?37(4):937-43.

Temperton,et?al.,(2005).Emerg?Infect?Dis?11,411-416.

Smirnov?et?al.,(2000).Arch?Virol?145,1733-1741.

Smirnov?et?al.,(1999).Acta?Virol?43,237-244.

Simmons?et?al.,(2007).PLoS?Med?4,e178.

Traggiai?et?al.,(2004).Nat?Med?10,871-875.

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