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在氮限制條件下具有改變的農學特性的植物和涉及編碼包含SNF2結構域多肽的基因的相關構建體和方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201080013984.7

申請日:

2010.03.26

公開號:

CN102365365B

公開日:

2014.11.26

當前法律狀態:

終止

有效性:

無權

法律詳情: 未繳年費專利權終止號牌文件類型代碼:1605號牌文件序號:101660484438IPC(主分類):C12N 15/82專利號:ZL2010800139847申請日:20100326授權公告日:20141126終止日期:20150326|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 15/82申請日:20100326|||公開
IPC分類號: C12N15/82; C07K14/415; A01H5/00; A01H5/10 主分類號: C12N15/82
申請人: 納幕爾杜邦公司; 先鋒國際良種公司
發明人: M·奧克曼; C·R·西蒙斯; S·M·艾倫; D·盧塞爾; S·拉克; H·薩凱; S·V·廷蓋
地址: 美國特拉華州
優先權: 2009.03.27 US 61/163887
專利代理機構: 中國專利代理(香港)有限公司 72001 代理人: 李波;李炳愛
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201080013984.7

授權公告號:

|||102365365B||||||

法律狀態公告日:

2016.05.11|||2014.11.26|||2012.04.11|||2012.02.29

法律狀態類型:

專利權的終止|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了尤其可用于在氮限制條件下改變植物農學特性的分離的多核苷酸和多肽以及重組DNA構建體、包含這些重組DNA構建體的組合物(如植物或種子)、以及利用這些重組DNA構建體的方法。所述重組DNA構建體包含可操作地連接至在植物中有功能的啟動子的多核苷酸,其中所述多核苷酸編碼包含SNF2結構域的多肽。

權利要求書

1: 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接到 至少一種調控元件的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽, 所述 氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%的序列同一性, 并且其中所述植物在 與不包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出提高的氮脅迫耐受性。
2: 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接到 至少一種調控元件的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽, 所述 氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%的序列同一性, 并且其中所述植物在 與不包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出產量或生物量的提高或二者 皆提高。
3: 權利要求 2 的植物, 其中在氮限制條件下與不包含所述重組 DNA 構建體的所述對照 植物進行比較時, 所述植物表現出所述產量或生物量的提高或二者皆提高。
4: 權利要求 1 至 3 中任一項的植物, 其中所述植物選自 : 玉米、 大豆、 向日葵、 高粱、 低 芥酸菜籽、 小麥、 苜蓿、 棉花、 稻、 大麥、 小米、 甘蔗、 和柳枝稷。
5: 權利要求 1 至 4 中任一項的植物的種子, 其中所述種子在其基因組中包含重組 DNA 構建體, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接到至少一種調控元件的多核苷酸, 其中所 述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在 與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具 有至少 50%的序列同一性, 并且其中從所述種子產生的植物在與不包含所述重組 DNA 構建 體的對照植物進行比較時表現出至少一種性狀的提高, 所述性狀選自 : 氮脅迫耐受性、 產量 和生物量。
6: 增加植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 將重組 DNA 構建體導入到可再生的植物細胞中, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地 連接至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%的序列同一性 ; 以及 (b) 在步驟 (a) 之后, 從所述可再生的植物細胞再生出轉基因植物, 其中所述轉基因植 物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體 ; 以及 (c) 獲得源自所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述 重組 DNA 構建體并且在與不包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出增加的 氮脅迫耐受性。
7: 評價植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉基因植物在其基因組中包含重組 DNA 構建體, 所述重 組 DNA 構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼 具有一種氨基酸序列的多肽, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50 %的序 列同一性 ; (b) 獲得源自所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述 2 重組 DNA 構建體 ; 以及 (c) 評價所述子代植物與不包含所述重組 DNA 構建體的對照植物相比的氮脅迫耐受 性。
8: 測定植物中產量、 生物量或二者的改變的方法, 所述方法包括 : (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉基因植物在其基因組中包含重組 DNA 構建體, 所述重 組 DNA 構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼 具有一種氨基酸序列的多肽, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50 %的序 列同一性 ; (b) 獲得源自所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述 重組 DNA 構建體 ; 以及 (c) 測定所述子代植物在與不包含所述重組 DNA 構建體的對照植物比較時是否表現出 產量或生物量或二者的改變。
9: 權利要求 8 的方法, 其中所述測定步驟 (c) 包括 : 測定所述轉基因植物在氮限制條 件下與不包含所述重組 DNA 構建體的對照植物相比是否表現出產量或生物量或二者的改 變。
10: 權利要求 8 或 9 的方法, 其中所述改變為提高。
11: 權利要求 6 至 10 中任一項的方法, 其中所述植物選自 : 玉米、 大豆、 向日葵、 高粱、 低芥酸菜籽、 小麥、 苜蓿、 棉花、 稻、 大麥、 小米、 甘蔗和柳枝稷。
12: 分離的多核苷酸, 所述多核苷酸包含 : (a) 編碼包含 SNF2 結構域的多肽的核苷酸序列, 其中所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 36、 38、 或 46 進行比較時, 具有至少 50%的 序列同一性, 其中所述 Clustal V 比對方法采用以下逐對比對默認參數 : KTUPLE = 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5, 和 DIAGONALS SAVED = 5, 或 (b)(a) 的核苷酸序列的全長互補序列。
13: 權利要求 12 的多核苷酸, 其中所述多肽的氨基酸序列包括 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 36、 38 或 46。
14: 權利要求 12 的多核苷酸, 其中所述核苷酸序列包括 SEQ ID NO : 18、 20、 22、 35、 37 或 45。
15: 包含重組 DNA 構建體的植物或種子, 其中所述重組 DNA 構建體包含權利要求 12 至 14 中任一項的多核苷酸。

說明書


在氮限制條件下具有改變的農學特性的植物和涉及編碼包 含 SNF2 結構域多肽的基因的相關構建體和方法

    相關申請的交叉引用
     本專利申請要求提交于 2009 年 3 月 27 日的美國臨時申請 61/163,887 的權益, 其 全部內容以引用方式并入本文。
     發明領域
     本發明領域涉及植物育種和遺傳學, 具體地講涉及植物中可用的賦予氮利用效率 和 / 或氮限制條件耐受性的重組 DNA 構建體。
     發明背景
     世界范圍內非生物脅迫顯著地限制了作物產量。據評估, 這些因素累積地造成平 均 70%的農業產量減少。植物是固著的, 必須適應它們周邊的主要環境條件。這已經導致 它們發展出基因調控、 形態發生和代謝的高可塑性。適應和防御機制策略涉及激活編碼對 適應或防御不同脅迫具有重要作用的蛋白。 植物氮吸收在它們的生長中起到重要作用 (Gallais 等人, J.Exp.Bot.55(396) : 295-306(2004))。 植物從環境中的無機氮合成氨基酸。 因此, 氮肥已經成為提高栽培植物如 玉米和大豆的產量有力工具。為了避免硝酸鹽污染并保持足夠的利潤率, 如今農民期望減 少氮肥的使用。如果能提高植物的氮同化能力, 然后就能期望植物生長和產量的提高。概 括地說, 具有更好的氮利用效率 (NUE) 的植物品種是所期望的。
     可利用激活標記來鑒定能影響性狀的基因。 已經在模型植物擬南芥屬中使用該方 法 (Weigel 等人, Plant Physiol.122 : 1003-1013(2000))。插入轉錄增強子元件能夠顯著 激活和 / 或提高附近內源基因的表達。這種方法可以用于鑒定特定性狀 ( 例如植物的氮利 用效率 ) 的受關注的基因, 當所述基因經轉基因進入生物中時可改變該性狀。
     發明概述
     本發明包括 :
     在一個實施方案中, 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物, 所述重組 DNA 構建體 包含可操作地連接到至少一種調控元件的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基 酸序列的多肽, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%的序列同一性, 并且 其中所述植物在與不包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出提高的氮脅 迫耐受性。
     在另一個實施方案中, 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物, 所述重組 DNA 構建 體包含可操作地連接到至少一種調控元件的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種氨 基酸序列的多肽, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%的序列同一性, 并且其中所述植物在與不包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出至少一 種農學特性的改變。任選地, 在氮限制條件下與未包含所述重組 DNA 構建體的所述對照植
     物比較時, 所述植物表現出所述至少一種農學特性的所述改變。所述至少一種農學特性可 以是產量、 生物量、 或它們二者, 并且所述改變可以是提高。
     在另一個實施方案中, 本發明包括本發明的任何植物, 其中所述植物選自玉米、 大 豆、 向日葵、 高粱、 低芥酸菜籽 (canola)、 小麥、 苜蓿、 棉花、 稻、 大麥、 小米、 甘蔗和柳枝稷。 。
     在另一個實施方案中, 本發明包括本發明的任何植物的種子, 其中所述種子在其 基因組中包含重組 DNA 構建體, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少一種調控元 件的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%的序列同一性, 并且其中所述種子產生的植物在與不包 含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出提高的氮脅迫耐受性或至少一種農 學特性的改變, 或者兩者皆有。 所述至少一種農學特性可以是產量、 生物量、 或二者, 并且所 述改變可以是提高。
     在另一個實施方案中, 提高植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 將重組 DNA 構建體引入到可再生的植物細胞中, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接到至少一 種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽, 所述氨基酸 序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%的序列同一性 ; (b) 在步驟 (a) 之后, 從所 述可再生的植物細胞再生出轉基因植物, 其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體 ; 以及 (c) 獲取來源于步驟 (b) 的轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在 其基因組中包含所述重組 DNA 構建體并且在與不包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行 比較時表現出提高的氮脅迫耐受性。
     在另一個實施方案中, 評價植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 獲取轉 基因植物, 其中所述轉基因植物在其基因組中包含重組 DNA 構建體, 所述重組 DNA 構建體包 含可操作地連接至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序 列的多肽, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%的序列同一性 ; (b) 獲取 來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構 建體 ; 以及 (c) 評價所述子代植物在與不包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時 的氮脅迫耐受性。
     在另一個實施方案中, 測定植物農學特性的改變的方法, 所述方法包括 (a) 獲取 轉基因植物, 其中所述轉基因植物在其基因組中包含重組 DNA 構建體, 所述重組 DNA 構建體 包含可操作地連接至至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基 酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%的序列同一性, 其中所 述轉基因植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體 ; (b) 獲取來源于所述轉基因植物的 子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體 ; 以及 (c) 測定所述子 代植物在與不包含所述重組 DNA 構建體的對照植物比較時是否表現出至少一種農學特性 的改變。任選地, 所述測定步驟 (c) 包括測定所述轉基因植物在氮限制條件下與不包含所 述重組 DNA 構建體的對照植物比較時是否表現出至少一種農學特性的改變。所述至少一種農學特性可以是產量、 生物量、 或二者, 并且所述改變可以是提高。
     在另一個實施方案中, 本發明包括本發明的任何方法, 其中所述植物選自玉米、 大 豆、 向日葵、 高粱、 低芥酸菜籽、 小麥、 苜蓿、 棉花、 稻、 大麥、 小米、 甘蔗和柳枝稷。
     在另一個實施方案中, 本發明包括分離的多核苷酸, 所述分離的多核苷酸包含 : (a) 編碼包含 SNF2 結構域的多肽的核苷酸序列, 其中所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 36、 38、 或 46 進行比較時, 具有至少 50%, 55%, 60%, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 或 95 %的序列同一性, 或者 (b) 所述核苷酸序列的全 長互補序列, 其中所述全長互補序列和所述核苷酸序列由相同數目的核苷酸組成并且是 100%互補的。所述多肽可包含氨基酸序列 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 36、 38、 或 46。所述核苷 酸序列可包含核苷酸序列 SEQ ID NO : 18、 20、 22、 35、 37、 或 45。
     在另一個實施方案中, 本發明涉及包含本發明任何分離的多核苷酸的重組 DNA 構 建體, 所述分離的多核苷酸可操作地連接到至少一種調控序列, 并且本發明涉及包含所述 重組 DNA 構建體的細胞、 植物和種子。所述細胞可以是真核細胞, 例如酵母、 昆蟲或植物細 胞, 或者是原核細胞, 例如細菌細胞。
     附圖簡述和序列表 根據以下的詳細描述和附圖以及序列表, 可更全面地理解本發明, 以下的詳細描 述和附圖以及序列表形成本申請的一部分。
     圖 1 示出 pHSbarENDs2 激活標記構建體的圖譜, 該構建體用于制備擬南芥屬種群 (SEQ ID NO : 1)。
     圖 2 示出載體 pDONRTMZeo(SEQ ID NO : 2), GATEWAY 供體載體的圖譜。attP1 位點
     位于核苷酸 570-801 ; attP2 位點位于核苷酸 2754-2985( 互補鏈 )。
     圖 3 示出載體 pDONRTM221(SEQ ID NO : 3), GATEWAY 供體載體的圖譜。attP1 位點 位于核苷酸 570-801 ; attP2 位點位于核苷酸 2754-2985( 互補鏈 )。 圖 4 示出載體 pBC-yellow(SEQ ID NO : 4) 的圖譜, 該載體是用于構建擬南芥屬表 達載體的目的載體。attR1 位點位于核苷酸 11276-11399( 互補鏈 ) ; attR2 位點位于核苷 酸 9695-9819( 互補鏈 )。
     圖 5 示出載體 PHP27840(SEQ ID NO : 5) 的圖譜, 該載體是用于構建大豆表達載體 的目的載體。attR1 位點位于核苷酸 7310-7434 ; attR2 位點位于核苷酸 8890-9014。
     圖 6 示出載體 PHP23236(SEQ ID NO : 6) 的圖譜, 它是用于構建 Gaspe Flint 來源 的玉米品系的表達載體的目的載體。attR1 位點位于核苷酸 2006-2130 ; attR2 位點位于核 苷酸 2899-3023。
     圖 7 示 出 載 體 PHP10523(SEQ ID NO : 7) 的 圖 譜, 該載體是存在于農桿菌菌 株 LBA4404 中 的 質 粒 DNA(Komari 等 人, Plant J.10 : 165-174(1996) ; NCBI 通 用 標 識 號 59797027)。
     圖 8 示出載體 PHP23235(SEQ ID NO : 8) 的圖譜, 它是用于構建目的載體 PHP23236 的載體。
     圖 9 示出載體 PHP20234(SEQ ID NO : 9) 的圖譜。
     圖 10 示出目的載體 PHP22655(SEQ ID NO : 10) 的圖譜。
     圖 11 示出目的載體 PHP29634(SEQ ID NO : 15) 的圖譜, 該載體用于構建用于 Gaspe
     Flint 來源的玉米品系的表達載體。
     圖 12 示出用于篩選的五個品系 ( 標記為 1 至 5- 每個品系有十一個個體 ), 加上野 生型對照品系 C1( 九個個體 ) 的典型網格圖案。
     圖 13 示出通過圖像分析測定的若干個不同硝酸鉀濃度對植物顏色的效應。綠色 區 ( 色調 50 至 66) 對氮劑量的響應證明該區可被用于指示氮同化作用。
     圖 14 顯示實施例 18 中用于半水耕玉米生長的生長培養基。
     圖 15 是列出不同硝酸鹽濃度對實施例 18 中 Gaspe Flint 衍生的玉米系生長和發 育的影響相關的數據的圖表。
     圖 16A-AM 示出擬南芥 (Arabidopsis thaliana) 包含 SNF2 結構域的多肽 (SEQ ID NO : 25、 27、 和 29) 以及它們的同源物 (SEQ ID NO : 19、 21、 23、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 和 49) 的全長氨基酸序列的多重比對。
     圖 17 示出圖 16A-AM 中顯示的每對氨基酸序列的序列同一性百分比和趨異值的圖 表。
     序列描述以及所附序列表遵循如 37C.F.R.§1.821-1.825 所列出的關于專利申 請中核苷酸和 / 或氨基酸序列公開的規定。此序列表中以單個字母表示核苷酸, 以三字 母表示氨基酸, 如 Nucleic Acids Res.13 : 3021-3030(1985) 和 Biochemical J.219(2) : 345-373(1984) 中, 它們引入本文以供參考。 用于核苷酸和氨基酸序列數據的符號和格式遵 循在 37C.F.R.§1.822 中所列出的規定。 表 1 列出了本文所述的某些多肽、 包含編碼多肽全部或其主要部分的核酸片段的 cDNA 克隆的命名、 以及在所附序列表中使用的對應標識符 (SEQ ID NO : )。
     表1
     包含 SNF2 結構域的多肽
     SEQ ID NO : 1 是 pHSbarENDs2 激活標記載體的核苷酸序列 ( 圖 1)。
     SEQ ID NO : 2 是 pDONRTMZeo 構建體的核苷酸序列 ( 圖 2)。
     SEQ ID NO : 3 是 pDONRTM221 構建體的核苷酸序列 ( 圖 3)。
     SEQ ID NO : 4 是 pBC-yellow 載體的核苷酸序列 ( 圖 4)。
     SEQ ID NO : 5 是 PHP27840 載體的核苷酸序列 ( 圖 5)。
     SEQ ID NO : 6 是目的載體 PHP23236 的核苷酸序列 ( 圖 6)。
     SEQ ID NO : 7 是 PHP10523 載體的核苷酸序列 ( 圖 7)。
     SEQ ID NO : 8 是 PHP23235 載體的核苷酸序列 ( 圖 8)。
     SEQ ID NO : 9 是 PHP20234 載體的核苷酸序列 ( 圖 9)。
     SEQ ID NO : 10 是目的載體 PHP22655 的核苷酸序列 ( 圖 10)。
     SEQ ID NO : 11 是用于替代在 pHSbarENDs2 的位點 5775 處的 PacI 限制性位點的 多接頭核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 12 是 attB1 序列的核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 13 是 attB2 序列的核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 14 是入門克隆 PHP23112 的核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 15 是 PHP29634 載體的核苷酸序列 ( 圖 11)。
     SEQ ID NO : 16 是正向引物 VC062。
     SEQ ID NO : 17 是反向引物 VC063。
     SEQ ID NO : 18-23( 參見表 1)。
     SEQ ID NO : 24 是 編 碼 包 含 擬 南 芥 SNF 結 構 域 的 蛋 白 突 變 體 1(SNF2.1) (At1g61140.1 ; NCBI 通用標識號 186492169) 的基因核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 25 是 包 含 擬 南 芥 SNF 結 構 域 的 蛋 白 突 變 體 1( 本 文 稱 為 SNF2.1)
     (At1g61140.1 ; NCBI 通用標識號 186492170) 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 26 是 編 碼 包 含 擬 南 芥 SNF 結 構 域 的 蛋 白 突 變 體 2(SNF2.2) (At1g61140.2 ; NCBI 通用標識號 186492171) 的基因的核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 27 是 包 含 擬 南 芥 SNF 結 構 域 的 蛋 白 突 變 體 2( 本 文 稱 為 SNF2.2) (At1g61140.2 ; NCBI 通用標識號 186492172) 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 28 是 編 碼 包 含 擬 南 芥 SNF 結 構 域 的 蛋 白 突 變 體 3(SNF2.3) (At1g61140.3 ; NCBI 通用標識號 186492174) 的基因的核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 29 是 包 含 擬 南 芥 SNF 結 構 域 的 蛋 白 突 變 體 3( 本 文 稱 為 SNF2.3) (At1g61140.3 ; NCBI 通用標識號 186492175) 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 30 是 水 稻 (Oryza sativa) 推 定 ATP 酶 蛋 白 (NCBI 通 用 標 識 號 53792213) 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 31 是水稻 (Oryza sativa) 假定蛋白 OsI_28047(NCBI 通用標識號 218200575) 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 32 是水稻 (Oryza sativa) 蛋白 ( 通用標識號 90399293) 的氨基酸序 列。
     SEQ ID NO : 33 是 At1g61140.1-5’ attB 正向引物的核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 34 是 At1g61140.1-3′ attB 反向引物的核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 35-38( 參見表 1)。
     SEQ ID NO : 39 是來自琴葉擬南芥 (Arabidopsis lyrata) 的 At1g61140.1 基因 ( 在 phytozome 網站上的轉錄物標識號 47522) 的核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 40 是由 SEQ ID NO : 39 編碼的蛋白的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 41 是來自琴葉擬南芥 (Arabidopsis lyrata) 的 At1g11100.1 基因 ( 在 phytozome 網站上的轉錄物標識號 471244) 的核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 42 是由 SEQ ID NO : 41 編碼的蛋白的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 43 是 在 公 共 BAC c0566n04 上 的 包 含 SNF2 結 構 域 的 玉 米 基 因 的 FGENESH 預測序列。
     SEQ ID NO : 44 是由 SEQ ID NO : 43 編碼的蛋白的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 45 是 SEQ ID NO : 43 的人工編輯版本, 其中 SEQ ID NO : 43 與來自其他 物種的序列進行比對并進行人工編輯以除去推定內含子。
     SEQ ID NO : 46 是由 SEQ ID NO : 45 編碼的蛋白的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 47 是水稻 (Oryza sativa) 基因座 Os01g57110.2( 包含 SNF2 家族 N- 末 端結構域的蛋白 ) 的核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 48 是由 SEQ ID NO : 49 編碼的蛋白的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 49 是高粱 (Sorghum bicolor) 假定蛋白 ( 基因座 Sb03g036380 ; NCBI 通用標識號 242058897) 的氨基酸序列。
     發明詳述
     本文中所列出的每篇參考文獻的公開內容的全文以引用的方式并入本文。
     本文以及所附權利要求書中所用的單數形式 “一個” 、 “一種” 和 “所述” 包括復數指 代, 除非上下文中清楚地另有指明。因此, 例如, “一株植物” 的涵義包括多株此類植物, “一個細胞” 的涵義包括一個或多個細胞及本領域的技術人員已知的等同物, 等等。
     如本文所用 :
     術語 “單子葉植物” 和 “單子葉的” 植物本文互換使用。本發明的單子葉植物包括 禾本科植物。
     術語 “雙子葉植物” 和 “雙子葉的植物” 本文互換使用。本發明的雙子葉植物包括 以下家族 : 十字花科植物、 豆科植物、 和茄科植物。
     術語 “全長互補序列” 和 “全長的互補序列” 本文互換使用, 指給定核苷酸序列的 互補序列, 其中所述互補序列和核苷酸序列由相同數目的核苷酸組成并且是 100%互補的。
     “性狀” 指植物或特定植物材料或細胞的生理學、 形態學、 生物化學、 或物理學特 征。在某些情況下, 這種特征是人眼可見的, 例如種子或植物大小, 或者能夠通過生物化學 技術測量, 例如檢測種子或葉片的蛋白質、 淀粉、 或油含量, 或者通過觀察代謝或生理過程, 如通過測量缺水耐受性或特定鹽或糖濃度的耐受性, 或者通過觀察一個或多個基因的表達 水平, 或者通過農學觀察如滲透脅迫耐受性或產量。
     “氮限制條件” 指其中可用氮總量 ( 例如來自硝酸鹽、 氨、 或其他已知氮源的氮 ) 不 足以維持植物的最佳生長和發育的條件。 本領域的技術人員將會識別其中總可用氮足以維 持植物最佳生長和發育的條件。本領域的技術人員將會識別什么組成足夠量的總可用氮, 什么組成用于向植物提供氮的土壤、 培養基和肥料輸入。 取決于許多因素, 氮限制條件將發 生變化, 包括但不限于特定的植物和環境條件。 “農學特性” 是可測量的參數, 包括但不限于綠度、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時 的鮮重、 成熟時的干重、 果實產量、 種子產量、 總植物含氮量、 果實含氮量、 種子含氮量、 營養 組織含氮量、 總植物游離氨基酸含量、 營養組織游離氨基酸含量、 果實游離氨基酸含量、 種 子游離氨基酸含量、 總植物蛋白質含量、 果實蛋白質含量、 種子蛋白質含量、 營養組織蛋白 質含量、 耐旱性、 氮攝取、 根倒伏抗性、 收獲指數、 莖倒伏、 植株高度、 穗高、 穗長、 鹽耐受性、 早期幼苗活力和低溫脅迫下的出苗
     能夠測量增加的生物量, 例如測量植株高度、 植物總葉片面積、 植物鮮重、 植物干 重或植物種子產量與對照植物相比的增加。
     提高植物生物量或植物尺寸的能力將具有若干個重要的商業應用。 可生成產量較 高的作物品種, 產生較高的產量, 例如在其中營養組織部分用作食物、 生物燃料或以上兩種 用途的植物中。
     增大的葉片尺寸可受到特別的關注。 增加的葉片生物量能夠用于提高植物來源的 制藥或工業產品的產量。總植物光合作用的提高通常通過增加植物葉片面積來完成。附加 的光合作用容量可用于提高特定植物組織來源的產量, 包括葉片、 根、 果實或種子、 或者允 許植物在較低光強度下或高光強度下生長。
     另一種組織 ( 例如根組織 ) 的生物量的改變可用于改善植物在嚴酷環境條件下生 長的能力, 包括干旱或營養缺乏條件, 因為較大的根系可較好的獲取水或營養物質或吸收 水或營養物質。
     就一些觀賞植物而言, 將高度期望提供較大品種的能力。就包括果樹、 產木材樹 木、 或者觀賞或防風樹木和灌木在內的多種植物而言, 尺寸增加以產量提高或防護效果改 善的形式提供改善的有益效果。
     “收獲指數” 指粒重除以總株重。
     “SNF2 結構域” 存在于涉及轉錄控制、 DNA 修復、 和重組的 ATP 依賴型染色質重塑 蛋白中。它們包含存在于 DNA/RNA 解旋酶超家族 II 中的七個保守序列基序。
     編碼包含 SNF2 結構域的蛋白的基因無限制地包括擬南芥基因座 At1g61140 的三 個突變體 (SEQ ID NO : 24、 26、 和 28), 本文分別稱為 snf2.1、 snf2.2、 和 snf2.3, 以及來自 其他植物物種的核苷酸同源物, 包括但不限于玉米 (Zea mays)、 琴葉擬南芥 (Arabidopsis lyrata)、 畫 眉 草 (Eragrostis nindensis)(Resurrection grass)、 百 喜 草 (Paspalum notatum)(Bahiagrass)、 和水稻 (Oryza sativa)(SEQ ID NO : 18、 20、 22、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 和 47)。
     編碼包含 SNF2 結構域的蛋白無限制地包括由 SEQ ID NO : 24、 26、 和 28 編碼的蛋 白 ( 并且本文分別稱為 SNF2.1、 SNF2.2、 和 SNF2.3), 以及來自其他植物物種的蛋白同源物, 包括但不限于玉米 (Zea mays)、 琴葉擬南芥 (Arabidopsis lyrata)、 畫眉草 (Eragrostis nindensis)(Resurrection grass)、百 喜 草 (Paspalum notatum)(Bahiagrass)、水 稻 (Oryza sativa) 和高粱 (Sorghum bicolor)(SEQ ID NO : 19、 21、 23、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 和 49)。 本文所用的 “剪接變體” 指由基因轉錄的 RNA 的供選擇的替代形式。剪接變體作 為供選擇的位點在單個轉錄 RNA 分子內或在分開轉錄的 RNA 分子之間被剪接的結果天然發 生, 并且可導致從相同基因轉錄的 mRNA 的若干個不同形式。因此, 剪接不同可編碼具有不 同氨基酸序列的多肽, 它們在生物體內可具有相似功能也可不具有相似功能。
     “氮脅迫耐受性” 是植物的性狀, 指植物在氮限制條件下存活的能力。
     植物 “提高的氮脅迫耐受性” 相對于參照或對照植物進行測量, 并意指植物的氮脅 迫耐受性在與參照或對照植物進行比較時提高的任何量或量度。
     “氮脅迫耐受性植物” 是指表現出氮脅迫耐受性的植物。氮脅迫耐受性植物可為在 氮限制條件下相對于對照植物至少在一種農學特性上表現出提高的植物。
     “環境條件” 指植物生長的條件, 例如水的可用性、 營養物質 ( 例如氮 ) 的可用性或 者昆蟲或病害的存在。
     “轉基因” 指其基因組因異源核酸 ( 如重組 DNA 構建體 ) 的存在而發生改變的任何 細胞、 細胞系、 愈傷組織、 組織、 植物部分或植物, 包括那些最初的轉基因事件以及從最初的 轉基因事件通過有性雜交或無性生殖而產生的那些。如本文所用的術語 “轉基因” 不涵蓋 通過常規植物育種方法或通過諸如隨機異花受精、 非重組病毒感染、 非重組細菌轉化、 非重 組轉座或自發突變之類的自然發生事件導致的基因組 ( 染色體基因組或染色體外基因組 ) 改變。
     “基因組” 在用于植物細胞時不僅涵蓋存在于細胞核中的染色體 DNA, 而且還包括 存在于細胞的亞細胞組分 ( 如線粒體、 質粒 ) 中的細胞器 DNA。
     “植物” 包括整個植株、 植物器官、 植物組織、 種子和植物細胞以及同一植株的子 代。植物細胞包括但不限于得自下列物質的細胞 : 種子、 懸浮培養物、 胚、 分生區域、 愈傷組 織、 葉、 根、 芽、 配子體、 孢子體、 花粉和小孢子。
     “子代” 包括植物的任何后續世代。
     “轉基因植物” 包括在其基因組內包含異源多核苷酸的植物。例如異源多核苷酸被
     穩定地整合進基因組中, 使得該多核苷酸傳遞至連續的世代。異源多核苷酸可單獨地或作 為重組 DNA 構建體的部分整合進基因組中。
     針對序列而言的 “異源” 意指來自外來物種的序列, 或者如果來自相同物種, 則指 通過蓄意的人為干預而從其天然形式發生了組成和 / 或基因座的顯著改變的序列。
     “多核苷酸” 、 “核酸序列” 、 “核苷酸序列” 或 “核酸片段” 可互換使用, 并且指作為 單鏈或雙鏈的 RNA 或 DNA 聚合物, 任選含有合成的、 非天然的或改變的核苷酸堿基。核苷酸 ( 通常以它們的 5′ - 單磷酸形式存在 ) 通過它們的單字母命名指代如下 : “A” 指腺苷酸或 脫氧腺苷酸 ( 分別用于 RNA 或 DNA), “C” 指胞苷酸或脫氧胞苷酸, “G” 指鳥苷酸或脫氧鳥苷 酸, “U” 指尿苷酸, “T” 指脫氧胸苷酸, “R” 指嘌呤 (A 或 G), “Y” 指嘧啶 (C 或 T), “K” 指G或 T, “H” 指 A 或 C 或 T, “I” 指肌苷, “N” 指任何核苷酸。
     “多肽” 、 “肽” 、 “氨基酸序列” 和 “蛋白質” 在本文中可互換使用, 指氨基酸殘基的聚 合物。 該術語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是相應的天然存在的氨基酸的人工化學類 似物的氨基酸聚合物, 以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。術語 “多肽” 、 “肽” 、 “氨基酸 序列” 和 “蛋白質” 還可包括修飾, 包括但不限于糖基化、 脂質連接、 硫酸鹽化、 谷氨酸殘基的 γ 羧化、 羥化和 ADP- 核糖基化。 “信使 RNA(mRNA)” 指無內含子并且可通過細胞翻譯成蛋白質的 RNA。
     “cDNA” 指與 mRNA 模板互補并且利用逆轉錄酶從 mRNA 模板合成的 DNA。cDNA 可為 單鏈的或者可用 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段轉化成雙鏈形式。
     “表達序列標簽” (“EST” ) 是得自 cDNA 文庫的 DNA 序列, 并且因此是已經被轉錄 的序列。EST 通常通過 cDNA 插入序列單程測序獲取。將完整的 cDNA 插入序列稱為 “全長 插入序列” (“FIS” )。 “重疊群” 序列是由選自, 但不限于 EST、 FIS 和 PCR 序列的兩個或更 多個序列裝配成的序列。將編碼完整或功能性蛋白的序列稱為 “完全基因序列” (“CGS” ), 該序列能得自 FIS 或重疊群。
     “成熟” 蛋白指經翻譯后加工的多肽, 即已經去除了存在于初始翻譯產物中的任何 前肽或肽原的多肽。
     “前體” 蛋白質指 mRNA 的初級翻譯產物, 即前肽和肽原仍然存在。前肽和原肽可為 并且不限于細胞內定位信號。
     “分離的” 指物質, 例如核酸和 / 或蛋白質, 該物質基本上不含在天然存在的環境中 通常伴隨該物質或與其反應的組分, 或者說是該物質被從所述組分移出。分離的多核苷酸 可從它們天然存在于其中的宿主細胞純化。 技術人員已知的常規核酸純化方法可用于獲取 分離的多核苷酸。該術語也涵蓋重組多核苷酸和化學合成的多核苷酸。
     “重組” 指兩個分離的不同序列片段的人工組合, 例如通過基因工程技術化學合成 或通過操縱分離的核酸片段合成。 “重組體” 也包括細胞或載體, 它們已經通過引入異源核 酸進行了修改, 或者來源于進行如此修改的細胞, 但是不涵蓋由自然發生事件 ( 例如自發 突變、 自然轉化 / 轉導 / 轉座 ) 改變的細胞或載體, 例如那些無蓄意的人為干預產生的細胞 或載體。
     “重組 DNA 構建體” 指在自然界中通常不會一起存在的核酸片段的組合。因此, 重 組 DNA 構建體可包含源于不同來源的調控序列和編碼序列, 或源于相同來源但以不同于通 常天然存在的方式排列的調控序列和編碼序列。
     術語 “入門克隆” 和 “入門載體” 本文可互換使用。
     “調控序列” 和 “調控元件” 可互換使用, 并且指位于編碼序列的上游 (5′非編碼 序列 )、 中間或下游 (3′非編碼序列 ), 并且影響相關編碼序列的轉錄、 RNA 加工或穩定性或 者翻譯的核苷酸序列。 調控序列可包括但不限于啟動子、 翻譯前導序列、 內含子和多腺苷酸 化識別序列。
     “啟動子” 指能夠控制另一核酸片段轉錄的核酸片段。
     “在植物中有功能的啟動子” 指能夠控制植物細胞中的轉錄的啟動子, 無論其是否 來源于植物細胞。
     “組織特異性啟動子” 和 “組織優選啟動子” 可以互換使用, 并且指主要但非必須專 一地在一種組織或器官中表達, 但是也可以在一種特定細胞中表達的啟動子。
     “發育調控啟動子” 指其活性由發育事件決定的啟動子。
     術語 “可操作地連接” 指核酸片段連接成單一片段, 使得其中一個核酸片段的功能 受到另一個核酸片段的調控。 例如, 在啟動子能夠調節核酸片段的轉錄時, 該啟動子與該核 酸片段進行了可操作地連接。
     “表達” 指功能產物的產生。因此, 核酸片段的表達可指核酸片段的轉錄 ( 如生成 mRNA 或功能 RNA 的轉錄 ) 和 / 或 mRNA 翻譯成前體或成熟蛋白質。
     “表型” 意指細胞或生物體的可檢測的特征。
     有關將核酸片段 ( 例如重組 DNA 構建體 ) 插入細胞內的 “引入” 意指 “轉染” 或 “轉 化” 或 “轉導” , 并且包括指將核酸片段整合進真核或原核細胞中, 在該細胞中核酸片段可整 合進細胞的基因組 ( 如染色體、 質粒、 質體或線粒體 DNA) 內, 轉變成自主的復制子或瞬時表 達 ( 如轉染的 mRNA)。
     “轉化細胞” 是將核酸片段 ( 如重組 DNA 構建體 ) 引入其中的任何細胞。
     在此所用的 “轉化” 指穩定轉化和瞬時轉化兩者。
     “穩定轉化” 指將核酸片段引入宿主生物體的基因組中, 導致基因穩定遺傳。一旦 穩定轉化, 核酸片段穩定地整合進宿主生物體和任何連續世代的基因組中。
     “瞬時轉化” 指將核酸片段引入宿主生物體的核中或包含 DNA 的細胞器中, 引起基 因表達而沒有基因穩定遺傳。
     “等位基因” 是占據染色體上給定位點的基因的幾種供選擇替代形式的其中一種。 當二倍體植物中一對同源染色體上給定基因座上存在的等位基因相同時, 該植物在該基因 座處是純合的。如果二倍體植物中一對同源染色體上給定基因座上存在的等位基因不同, 則該植物在該基因座處是雜合的。 如果轉基因存在于二倍體植物中一對同源染色體中的其 中之一上, 則該植物在該基因座處是半合子的。
     “葉綠體轉運肽” 是與蛋白質共同被翻譯, 并將該蛋白質導向葉綠體或導向該蛋白 質在其中被生成的細胞中的其他質體類型的氨基酸序列。 “葉綠體轉運序列” 是指編碼葉 綠體轉運肽的核苷酸序列。 “信號肽” 是一種與蛋白質共同被翻譯并將蛋白導向分泌系統 的氨基酸序列 (Chrispeels, (1991)Ann.Rev.Plant Phys.Plant Mol.Biol.42 : 21-53)。如 果將所述蛋白導向液泡, 可另外加上液泡靶向信號 ( 同上 ), 或者如果將所述蛋白導向內質 網, 可加上內質網駐留信號 ( 同上 )。如果將蛋白導向細胞核, 將移除任何存在的信號肽并 用以核定位信號替代 (Raikhel, (1992)Plant Phys.100 : 1627-1632)。 “線粒體信號肽” 是指導前體蛋白質導進入線粒體中的氨基酸序列 (Zhang 和 Glaser(2002)Trends Plant Sci 7: 14-21)。
     序列比對和同一性百分比可用設計用于檢測同源序列的多種比較方法來測定, 這些方法包括但不限于 LASERGENE 生物信息計算包 (DNASTAR Inc., Madison, WI) 的 MEGALIGN 程序。除非另外說明, 本文提供的序列的多重比對用 Clustal V 比對方法 (Higgins 和 Sharp, CABIOS. : 5: 151-153(1989)) 采用默認參數 ( 空位罰分= 10, 空位長度 罰分= 10) 執行。用 Clustal V 方法進行成對比對和蛋白質序列的百分比同一性計算的默 認參數為 KTUPLE = 1、 缺口罰分= 3、 窗口 (WINDOW) = 5 和 DIAGONALS SAVED = 5。對于核 酸, 這些參數為 KTUPLE = 2, 缺口罰分= 5, 窗口= 4 和 DIAGONALS SAVED = 4。在序列比對 后, 使用 Clustal V 程序, 通過參閱相同程序上的 “序列距離” 表可能獲得 “百分比同一性” 和 “趨異度” 值; 除非另外說明, 本文提供的和申明的同一性百分比和趨異度是以該方式計 算。
     本文使用的標準重組 DNA 和分子克隆技術是本領域所熟知的并且在如下文獻 中有更全面的描述 : Sambrook, J., Fritsch, E.F. 和 Maniatis, T.Molecular Cloning : A Laboratory Manual ; Cold Spring Harbor Laboratory Press : Cold Spring Harbor, 1989( 下文稱為 “Sambrook” )。現在來看實施方案 :
     實施方案包括分離的多核苷酸和多肽、 重組 DNA 構建體、 包含這些重組 DNA 構建體 的組合物 ( 例如植株或種子 ) 以及利用這些重組 DNA 構建體的方法。
     分離的多核苷酸和多肽
     本發明包括下列分離的多核苷酸和多肽 :
     分離的多核苷酸包含 : (i) 編碼多肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 36、 38、 或 46 進行比較時具有至少 50%、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96%、 97%、 98%、 99%、 或 100%的序列同一性 ; 或 (ii)(i) 的核酸序列的全長互補序列, 其 中 (i) 的核酸序列的全長互補序列由相同數目的核苷酸組成并且是 100%互補的。任一上 述分離的多核苷酸可用于本發明的任何重組 DNA 構建體 ( 包括抑制 DNA 構建體 )。所述多 肽是包含 SNF2 結構域的蛋白。
     分離的多肽, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 36、 38、 或 46 進行比較時具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%、 或 100%的序列同一 性。所述多肽是包含 SNF2 結構域的蛋白。
     分離的多核苷酸, 包括 : (i) 基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 18、 20、 22、 35、 37、 或 45 進行比較時具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、
     74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%、 或 100%的序列同一性的 核酸序列 ; 或 (ii)(i) 的核酸序列的全長互補序列。任一上述分離的多核苷酸可用于本發 明的任何重組 DNA 構建體 ( 包括抑制 DNA 構建體 )。所述分離的多核苷酸編碼包含 SNF2 結 構域的蛋白。
     重組 DNA 構建體和抑制 DNA 構建體
     在一個方面, 本發明包括重組 DNA 構建體 ( 包括抑制 DNA 構建體 )。
     在一個實施方案中, 重組 DNA 構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列 ( 如, 在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸包括 : (i) 核酸序列, 所述核酸 序列編碼的氨基酸序列基于 ClustalV 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或 100%的序列同一性 ; 或 (ii)(i) 的核酸序列的全長互補序列。 在另一個實施方案中, 重組 DNA 構建體包含可操作地連接至至少一種調控序列 ( 如, 在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸包括 : (i) 核酸序列, 所述 核酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 18、 20、 22、 24、 26、 28、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 或 47 進行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57%、 58%、 59%、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%序列同一性 ; 或 (ii)(i) 的核酸序列的全長互補序列。
     在另一個實施方案中, 重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少一種調控序列 ( 如, 在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼包含 SNF2 結構域的蛋白。
     在另一方面, 本發明包括抑制 DNA 構建體。
     抑制 DNA 構建體可包含至少一種調控序列 ( 例如植物中有功能的啟動子 ), 該調 控序列可操作地連接至 (a) 以下序列的全部或部分 : (i) 編碼多肽的核酸序列, 所述多肽的 氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%的序列 同一性, 或 (ii)(a)(i) 的核酸序列的全長互補序列 ; 或者 (b) 源自受關注靶基因的有義鏈 或反義鏈的全部或部分的區域, 當與所述區域所來源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較 時, 基于 Clustal V 比對方法, 所述區域的核酸序列具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或
     100%的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的蛋白 ; 或 (c) 以 下序列的全部或部分 : (i) 核酸序列, 基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 18、 20、 22、 24、 26、 28、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 或 47 進行比較時, 所述多肽的氨基酸序列具有至少 50%、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或 100 %的序列同一性, 或 (ii)(c)(i) 核酸序列的全長互補序列。 抑制 DNA 構建體可包含共抑制構建體、 反義構建體、 病毒抑制構建體、 發夾抑制構建體、 莖 環抑制構建體、 產生雙鏈 RNA 的構建體、 RNAi 構建體或小 RNA 構建體 ( 如, siRNA 構建體或 miRNA 構建體 )。
     應當理解 ( 正如本領域技術人員將會理解的 ), 本發明不僅僅涵蓋這些具體的示 例性序列。 導致給定位點處產生化學上等價的氨基酸但不影響所編碼多肽的功能特性的核 酸片段中的改變是本領域眾所周知的。因此, 氨基酸丙氨酸 ( 一種疏水性氨基酸 ) 的密碼 子可被編碼另一個疏水性較弱的殘基 ( 例如甘氨酸 ) 或疏水性較強的殘基 ( 例如纈氨酸、 亮氨酸或異亮氨酸 ) 的密碼子取代。類似地, 導致一個帶負電荷的殘基替換為另一個帶負 電荷的殘基 ( 例如, 天冬氨酸替代谷氨酸 ) 或者一個帶正電荷的殘基替換為另一個帶正電 荷的殘基 ( 例如, 賴氨酸替換精氨酸 ) 的改變也可預期產生功能上等價的產物。導致多肽 分子的 N 末端和 C 末端部分改變的核苷酸變化也將預計不會改變多肽的活性。所提出的修 飾中的每一種均完全在本領域常規技術內, 如測定編碼產物生物活性的保留情況。
     “抑制 DNA 構建體” 是在轉化或穩定整合進植物基因組時, 導致該植物中的靶基因 “沉默” 的重組 DNA 構建體。靶基因可為植物內源基因或植物轉基因。如本文針對靶基因所 使用的, “沉默” 通常指在由靶基因表達的 mRNA 或蛋白質 / 酶的水平上的抑制, 和 / 或在酶 活性或蛋白質功能性的水平上的抑制。術語 “抑制” 和 “沉默” 本文互換使用, 包括降低、 減 少、 下降、 減小、 抑制、 除去或阻止。 “沉默” 或 “基因沉默” 不指具體機制, 它包括但不限于反 義、 共抑制、 病毒抑制、 發夾抑制、 莖 - 環抑制、 基于 RNAi 的方法、 以及基于小 RNA 的方法。
     抑制 DNA 構建體可包含源自受關注的靶基因的區域并且可包含受關注的靶基因 的有義鏈 ( 或反義鏈 ) 的核酸序列的全部或部分。取決于所要采用的方法, 該區域可與 受關注基因的有義鏈 ( 或反義鏈 ) 的全部或部分 100 %相同或者具有少于 100 %的同一 性 ( 如, 具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 或 99%同一性 )。
     抑制 DNA 構建體是本領域所熟知的, 一旦選定受關注的靶基因就很容易構建, 并 且包括但不限于共抑制構建體、 反義構建體、 病毒抑制構建體、 發夾抑制構建體、 莖環抑制 構建體、 產生雙鏈 RNA 的構建體, 以及更通常的是, RNAi(RNA 干擾 ) 構建體和小 RNA 構建體, 例如 siRNA( 短干擾 RNA) 構建體和 miRNA( 微 RNA) 構建體。
     “反義抑制” 指產生能夠抑制靶基因或基因產物表達的反義 RNA 轉錄物。 “反義 RNA” 指與靶初級轉錄物或 mRNA 的全部或部分互補, 并阻斷分離的靶核酸片段表達的 RNA 轉錄物 ( 美國專利 5,107,065)。 反義 RNA 可與特定基因轉錄物的任何部分, 即 5′非編碼序列、 3′非編碼序列、 內含子或編碼序列互補。
     “共抑制” 指產生能夠抑制靶基因或基因產物表達的有義 RNA 轉錄物。 “有義” RNA 指包括 mRNA 的 RNA 轉錄物, 它能夠在細胞內或體外被翻譯成蛋白。此前, 已通過著眼于以 有義方向過表達與內源 mRNA 具有同源性的核酸序列 ( 其導致與過表達的序列具有同源性 的所有 RNA 減少 ) 設計出了植物中的共抑制構建體 ( 參見 Vaucheret 等人, Plant J.16 : 651-659(1998) ; 和 Gura, Nature 404 : 804-808(2000))。
     另一種變型描述了將植物病毒序列用于引導對近端 mRNA 編碼序列的抑制 ( 于 1998 年 8 月 20 日公開的 PCT 公開 WO 98/36083)。
     RNA 干擾是指由短干擾性 RNA(siRNA) 介導的動物中序列特異性轉錄后基因沉默 的過程 (Fire 等人, Nature 391 : 806(1998))。 在植物中的對應過程通常稱為轉錄后基因沉 默 (PTGS) 或 RNA 沉默, 并且在真菌中也稱為阻抑作用 (quelling)。 據信轉錄后基因沉默過 程是用于防止外來基因表達的進化保守性細胞防御機制, 并且通常由不同植物區系和門所 共有 (Fire 等人, Trends Genet.15 : 358(1999))。
     小 RNA 在控制基因表達中起重要作用。很多發育過程 ( 包括開花 ) 的調節是由小 RNA 控制的。現在有可能通過使用在植物中產生小 RNA 的轉基因構建體來以工程手段改變 植物基因的基因表達。
     小 RNA 似乎是通過與互補 RNA 或 DNA 靶序列堿基配對來行使功能的。當與 RNA 結 合時, 小 RNA 或者引發靶序列的 RNA 裂解或者引發翻譯抑制。當與 DNA 靶序列結合時, 據信 小 RNA 可介導靶序列的 DNA 甲基化。無論具體機制是什么, 這些事件的后果是基因表達受 到抑制。
     微 RNA(miRNA) 是長度為約 19 至約 24 個核苷酸 (nt) 的已經在動物和植物中鑒 定出的非編碼 RNA(Lagos-Quintana 等人, Science 294 : 853-858(2001), Lagos-Quintana 等 人, Curr.Biol.12 : 735-739(2002) ; Lau 等 人, Science 294 : 858-862(2001) ; Lee 和 Ambros, Science 294 : 862-864(2001) ; Llave 等 人, Plant Cell 14 : 1605-1619(2002) ; Mourelatos 等 人, Genes. 偏 差 16 : 720-728(2002) ; Park 等 人, Curr.Biol.12 : 1484-1495(2002) ; Reinhart 等人, Genes. 偏差 16 : 1616-1626(2002))。它們是由大小為大 約 70 至 200nt 的較長的前體轉錄物加工生成的, 并且這些前體轉錄物能夠形成穩定的發夾 結構。
     微 RNA(miRNA) 看起來通過與位于由這些基因產生的轉錄物中的互補序列結合來 調節靶基因。看來似乎 miRNA 可能以至少兩種途徑進入靶基因調控 : (1) 翻譯抑制 ; 和 (2) RNA 裂解。進入 RNA 裂解途徑的微 RNA 與在動物中 RNA 干擾 (RNAi) 期間以及在植物中轉 錄后基因沉默 (PTGS) 期間產生的 21-25nt 短干擾 RNA(siRNA) 類似, 并且可能整合進與在 RNAi 情況中觀察到的復合物類似或相同的 RNA- 誘導的沉默復合物 (RISC) 內。
     調控序列 :
     本發明的重組 DNA 構建體 ( 包括抑制 DNA 構建體 ) 可包含至少一種調控序列。
     調控序列可為啟動子。
     多種啟動子可用于本發明的重組 DNA 構建體 ( 及抑制 DNA 構建體 ) 中。可根據所 需結果來選擇啟動子, 并且可包括用于在宿主生物體中表達的組成型啟動子、 組織特異性 啟動子、 誘導型啟動子或其他啟動子。在多數情況下引起基因在大多數細胞型中表達的啟動子通常稱為 “組成型啟動子” 。 雖然候選基因當通過組成型啟動子驅動表達時可預測其效應, 但候選基因在 35S 或 UBI 啟動子控制下的高水平、 組成型表達可以 ( 或可以不 ) 具有多重效應。使用組織特 異和 / 或脅迫特異啟動子可消除不需要的效應但保留氮耐受性的能力。在擬南芥屬中已經 觀察到了對干旱和寒冷耐受性的這種類型的效應 (Kasuga 等人, Nature Biotechnol.17 : 287-91(1999))。
     適用于植物宿主細胞的組成型啟動子包括 ( 例如 )Rsyn7 啟動子的核心啟動子 和在 WO 99/43838 和美國專利 6,072,050 中公開的其他組成型啟動子 ; CaMV 35S 核心 啟動子 (Odell 等人, Nature 313 : 810-812(1985)) ; 稻肌動蛋白啟動子 (McElroy 等人, Plant Cell 2 : 163-171(1990)) ; 泛 素 啟 動 子 (Christensen 等 人, Plant Mol.Biol.12 : 619-632(1989) 和 Christensen 等 人, Plant Mol.Biol.18 : 675-689(1992)) ; pEMU 啟 動 子 (Last 等 人, Theor.Appl.Genet.81 : 581-588(1991)) ; MAS 啟 動 子 (Velten 等 人, EMBO J.3 : 2723-2730(1984)) ; ALS 啟動子 ( 美國專利 5,659,026) 等。其他組成型啟動子包括 例 如 在 美 國 專 利 5,608,149、 5,608,144、 5,604,121、 5,569,597、 5,466,785、 5,399,680、 5,268,463、 5,608,142 和 6,177,611 中公開的那些啟動子。
     在選擇啟動子用于本發明方法時, 可能有利的是使用組織特異性啟動子或發育調 控啟動子。
     組織特異性啟動子或發育調節啟動子是這樣的 DNA 序列 : 該序列調節 DNA 序列選 擇性地在對雄穗發育、 結籽或兩者重要的植物細胞 / 組織中表達, 并限制這種 DNA 序列只在 植物的雄穗發育或種子成熟期間表達。 任何引起所需時空表達的可鑒定啟動子均可用于本 發明的方法中。
     可用于本發明的種子或胚芽特異性啟動子包括大豆 Kunitz 胰蛋白酶抑制劑啟動 子 (Kti3, Jofuku 和 Goldberg, Plant Cell 1 : 1079-1093(1989))、 馬鈴薯塊莖特異蛋白啟 動子 (patatin 啟動子 )( 馬鈴薯塊莖 )(Rocha-Sosa, M. 等人, EMBO J.8 : 23-29(1989))、 convicilin 啟動子、 豌豆球蛋白啟動子、 豆球蛋白啟動子 ( 豌豆子葉 )(Rerie, W.G. 等人, Mol.Gen.Genet.259 : 149-157(1991) ; Newbigin, E.J. 等人, Planta 180 : 461-470(1990) ; Higgins, T.J.V. 等人, Plant.Mol.Biol.11 : 683-695(1988))、 玉米蛋白啟動子 ( 玉米胚 乳 )(Schemthaner, J.P. 等人, EMBO J.7 : 1249-1255(1988))、 菜豆蛋白啟動子 ( 菜豆子葉 ) (Segupta-Gopalan, C. 等人, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82 : 3320-3324(1995))、 植物血 球凝集素啟動子 ( 菜豆子葉 )(Voelker, T. 等人, EMBO J.6 : 3571-3577(1987))、 B- 伴球蛋 白啟動子和大豆球蛋白啟動子 ( 大豆子葉 )(Chen, Z-L 等人, EMBO J.7 : 297-302(1988))、 谷 蛋白啟動子 ( 大米胚乳 )、 大麥醇溶蛋白啟動子 ( 大麥胚乳 )(Marris, C. 等人, Plant Mol. Biol.10 : 359-366(1988))、 麥谷蛋白啟動子和麥醇溶蛋白啟動子 ( 小麥胚乳 )(Colot, V. 等 人, EMBO J.6 : 3559-3564(1987))、 和甘薯貯藏蛋白啟動子 ( 甘薯塊根 )(Hattori, T. 等人, Plant Mol.Biol.14 : 595-604(1990))。 可操作地連接至嵌合基因構建體異源編碼區的種子 特異性基因的啟動子在轉基因植物中保持它們的時空表達模式。 這樣的實施例包括在擬南 芥屬和甘藍型油菜 (Brassica napus) 種子中表達腦啡肽的擬南芥 2S 種子儲藏蛋白基因啟 動子 (Vanderkerckhove 等人, Bio/Technology 7 : L929-932(1989))、 表達熒光素酶的菜豆
     凝集素和 β- 菜豆蛋白啟動子 (Riggs 等人, Plant Sci.63 : 47-57(1989)), 以及表達氯霉素 乙酰轉移酶的小麥谷蛋白啟動子 (Colot 等人, EMBO J.6 : 3559-3564(1987))。
     可誘導啟動子響應內源性或外源性刺激的存在, 例如, 通過化合物 ( 化學誘導 劑 ), 或響應環境、 激素、 化學信號和 / 或發育信號而選擇性表達可操作地連接的 DNA 序列。 可誘導的或受調控的啟動子包括 ( 例如 ) 受光、 熱、 脅迫、 水澇或干旱、 植物激素、 創傷或諸 如乙醇、 茉莉酮酸酯、 水楊酸或安全劑之類的化學品調控的啟動子。
     本發明使用的啟動子包括以下啟動子 : 1) 脅迫誘導型 RD29A 啟動子 (Kasuga 等 人, Nature Biotechnol.17 : 287-91(1999)) ; 2) 大 麥 啟 動 子 B22E ; B22E 的 表 達 是 發 育中的玉米籽粒中的柄所特異性的 (“Primary Structure of a Novel Barley Gene Differentially Expressed in Immature Aleurone Layers( 在未成熟糊粉層中差異表 達的新大麥基因的一級結構” , Klemsdal 等人, Mol.Gen.Genet.228(1/2) : 9-16(1991)) ; 以 及 3) 玉米啟動子 Zag2(“Identification and molecular characterization of ZAG1, the maize homolog of the Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUS(ZAG1- 擬南 芥屬花同源異形基因 AGAMOUS 的玉米同系物的鑒定和分子表征 )” , Schmidt 等人, Plant Cell 5(7) : 729-737(1993) “ ;Structural characterization, chromosomal localization and phylogenetic evaluation of two pairs of AGAMOUS-like MADS-box genes from maize” (“兩對來自玉米的 AGAMOUS 樣 MADS-box 基因的結構表征、 染色體定位及系統發育 評價 )” , Theissen 等人, Gene 156(2) : 155-166(1995) ; NCBI GenBank 登錄號 X80206))。 Zag2 轉錄物可在授粉前五天至授粉后天數 (“DAP” ) 七至八天被檢測到, 并且引導 Ciml 在 發育中的雌花序心皮中表達, Ciml 對發育中的玉米籽粒的籽仁而言是特異性的。Ciml 轉錄 物在授粉前四到五天至六到八 DAP 被檢測到。其他可用的啟動子包括可源自其表達與發育 中的雌小花母系相關的基因的任何啟動子。
     用于調控本發明的核苷酸序列在植物中表達的啟動子是莖特異性啟動子。這種 莖特異性啟動子包括苜蓿 S2A 啟動子 (GenBank 登錄號 : EF030816 ; Abrahams 等人, Plant Mol.Biol.27 : 513-528(1995)) 和 S2B 啟動子 (GenBank 登錄號 : EF030817) 等等, 將這些文 獻以引用的方式并入本文。
     啟動子可整體源于天然基因, 或者由源于天然存在的不同啟動子的不同元件構 成, 或者甚至可包含合成的 DNA 片段。
     用于本發明的啟動子可包括 : RIP2、 mLIP15、 ZmCOR1、 Rab17、 CaMV 35S、 RD29A、 B22E、 Zag2、 SAM 合成酶啟動子、 泛素啟動子、 CaMV 19S、 nos、 Adh、 蔗糖合成酶啟動子、 R- 等 位基因啟動子、 維管組織的其他啟動子 S2A(Genbank 登陸號 EF030816) 和 S2B(Genbank 登錄號 EF030817) 及來自玉米的組成型啟動子 GOS2。其他啟動子包括根啟動子, 例如玉 米 NAS2 啟動子、 玉米 Cyclo 啟動子 (US 公布 2006/0156439, 公開于 2006 年 7 月 13 日 )、 玉米 ROOTMET2 啟動子 (WO 2005/063998, 公開于 2005 年 7 月 14 日 )、 CR1BIO 啟動子 (WO 2006/055487, 公開于 2006 年 5 月 26 日 )、 CRWAQ81(WO 2005/035770, 公開于 2005 年 4 月 21 日 ) 和玉米 ZRP2.47 啟動子 (NCBI 登錄號 U38790 ; NCBI GI No.1063664)。
     本發明的重組 DNA 構建體 ( 及抑制 DNA 構建體 ) 也可包括其他調控序列, 包括但 不限于翻譯前導序列、 內含子和多腺苷酸化識別序列。 在本發明的另一個實施方案中, 本發 明的重組 DNA 構建體還包括增強子或沉默子。內含子序列可加至 5’ 非翻譯區、 蛋白編碼區或 3’ 非翻譯區以增加積聚在胞漿中 的成熟信息的量。已經顯示, 在植物和動物兩者的表達構建體的轉錄單位中包含可剪接內 含子可使基因表達在 mRNA 和蛋白質水平上均增強高達 1000 倍 (Buchman 和 Berg, Mol.Cell Biol.8 : 4395-4405(1988) ; Callis 等人, Genes Dev.1 : 1183-1200(1987))。
     任何植物都可以選擇用來鑒定將用于本發明重組 DNA 構建體的調控序列和基因。 適用于分離基因和調控序列的靶植物的實例應該包括但不限于苜蓿、 蘋果、 杏、 擬南芥屬植 物、 洋薊、 芝麻菜、 蘆筍、 鱷梨、 香蕉、 大麥、 豆類、 甜菜、 黑莓、 藍莓、 西蘭花、 抱子甘藍、 卷心 菜、 低芥酸菜籽、 香瓜、 胡蘿卜、 木薯、 蓖麻、 菜花、 芹菜、 櫻桃、 菊苣、 芫荽、 柑桔類、 克萊門氏 小柑橘類、 三葉草、 椰子、 咖啡、 玉米、 棉、 蔓越莓、 黃瓜、 花旗松、 茄子、 菊苣、 茅菜、 桉樹、 茴 香、 無花果、 大蒜、 葫蘆、 葡萄、 柚子樹、 白蘭瓜、 豆薯、 獼猴桃、 生菜、 韭蔥、 檸檬、 酸橙、 火炬 松、 亞麻子、 玉米、 芒果、 甜瓜、 蘑菇、 油桃、 堅果、 燕麥、 油棕、 油菜、 秋葵、 橄欖樹、 洋蔥、 橙、 觀 賞植物、 棕櫚、 木瓜樹、 歐芹、 歐洲防風草、 豌豆、 桃樹、 花生、 梨樹、 胡椒、 柿樹、 松樹、 菠蘿、 大 蕉、 李樹、 石榴樹、 白楊、 馬鈴薯、 南瓜、 溫柏、 輻射松、 紅菊苣、 蘿卜、 油菜、 樹莓、 稻、 黑麥、 高 粱、 南方松、 大豆、 菠菜、 南瓜、 草莓、 甜菜、 甘蔗、 向日葵、 甘薯、 楓香樹、 柑橘、 茶、 煙草、 蕃茄、 黑小麥、 草皮草、 蕪菁、 葡萄樹、 西瓜、 小麥、 薯蕷和西葫蘆。
     組合物
     本發明的組合物是其基因組中包含本發明的任何重組 DNA 構建體 ( 包括任何抑制 DNA 構建體 )( 例如上面所討論的任何一種其他構建體 ) 的植物。 組合物也包括任何植物的 子代, 以及獲取自植物或其子代的任何種子, 其中所述子代或種子在其基因組中包含重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 )。子代包括通過植物的自花授粉或異型雜交而獲得的連 續世代。子代也包括雜交種和近交系。
     在雜交種子繁殖的農作物中, 成熟的轉基因植物可自花授粉而產生純合的自交系 植物。該近交系植物產生含有新引入的重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的種子。這 些種子可以生長而產生將會表現出改變的農學特性 ( 如, 在氮限制條件下農學特性增加 ) 的植物, 或者可以用于育種程序以產生雜交種子, 這些雜交種子可以生長而產生將會表現 出如改變的農學特性的植物。所述種子可為玉米種子。
     植物可為單子葉植物或雙子葉植物, 例如玉米或大豆植物, 如玉米雜種植物或玉 米自交系植物。植物還可以是向日葵、 高梁、 低芥酸菜籽、 小麥、 苜蓿、 棉、 稻、 大麥、 小米、 甘 蔗、 或柳枝稷。
     重組 DNA 構建體可穩定地整合進植物的基因組中。
     具體實施方案包括但不限于下列的 :
     1. 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有 一種氨基酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%、 51%、 52%、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98%、 99%、 或 100%的序列同一性, 并且其中所述植物在與未包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出增加的氮脅迫耐受性。在與該對照植物比較時, 該植物還可表 現出至少一種農學特性的改變。
     2. 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 該重組 DNA 構 建體包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼包含 SNF2 結構域的多肽, 并且其中在與未包含所述重組 DNA 構建體的對照植物比較時, 所述植物表 現出增加的氮脅迫耐受性。在與該對照植物比較時, 該植物還可表現出至少一種農學特性 的改變。
     3. 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 該重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼包含 SNF2 結構域的多肽, 并且其中在與未包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時, 所述植 物表現出在氮限制條件下至少一種農學特性的改變。
     4. 在因組中包含重組 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 所述重組 DNA 構 建體包含可操作地連接到至少一種調控元件的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種 氨基酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99%、 或 100%的序列同一性, 并且其中所述植物在與未包含所述重組 DNA 構建體的對照植 物進行比較時表現出在氮限制條件下至少一種農學特性的改變。
     5. 在基因組中包含抑制 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 該抑制 DNA 構建體包含至少一種可操作地連接至源自受關注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部 分的區域的調控元件, 當與所述區域所來源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時, 基于 Clustal V 比對方法, 所述區域的核酸序列具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86%、 87%、 88 %、 89%、 90 %、 91%、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或 100 % 的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的多肽, 并且其中在與 未包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時, 所述植物表現出在氮限制條件下至少 一種農學特性的改變。
     6. 在基因組中包含抑制 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控元件, 該調控元件可操作地連接至以下序列的全部或部分 : (a) 編碼多肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%序列同一性 ; 或 (b)(a) 的核酸序列的全長互補序列, 并且其 中所述植物在氮限制條件下在與不包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出至少一種農學特性的改變。
     7. 上述實施方案 1-6 中的植物的任何子代、 上述實施方案 1-6 中的植物的任何種 子、 上述實施方案 1-6 中的植物的子代的任何種子以及來自上述實施方案 1-6 中的任何植 物以及它們的子代的細胞。
     在前述實施方案 1-7 的任一項中或本發明的任何其他實施方案中, 包含 SNF2 結構 域的多肽可來自擬南芥 (Arabidopsis thaliana)、 玉米 (Zea mays)、 大豆 (Glycine max)、 煙豆 (Glycine tabacina)、 野大豆 (Glycine soja) 或短絨野大豆 (Glycine tomentella)。
     在上述實施方案 1-7 或本發明的任一其他實施方案中的任一項中, 重組 DNA 構建 體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 可包含至少一種在植物中有功能的啟動子作為調控序列。
     在前述實施方案 1-7 中任一項或本發明的任何其他實施方案中, 所述至少一種農 學特性的改變是增加或減少。
     在前述實施方案 1-7 中任一項或本發明的任何其他實施方案中, 所述至少一種農 學特性可選自 : 綠度、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時的鮮重、 成熟時的干重、 果實產量、 種 子產量、 總植物含氮量、 果實含氮量、 種子含氮量、 營養組織含氮量、 總植物氨基酸含量、 營 養組織游離氨基酸含量、 果實游離氨基酸含量、 種子游離氨基酸含量、 總植物蛋白質含量、 果實蛋白質含量、 種子蛋白質含量、 營養組織蛋白質含量、 耐旱性、 氮攝取、 根倒伏抗性、 收 獲指數、 莖倒伏、 植株高度、 穗高、 穗長、 鹽耐受性、 早期幼苗活力、 和在低溫脅迫下的出苗。 例如, 至少一種農學特性的改變可為產量、 綠度或生物量的增加。 在前述實施方案 1-7 中任一項或本發明的任何其他實施方案中, 所述植物在與不 包含所述重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的對照植物在氮脅迫條件下進行比較時, 可表現出至少一種農學特性的改變。
     本領域的普通技術人員熟悉模擬氮條件 ( 限制性的或非限制性的 ) 的規程, 以及 用于評價已經經受過模擬的或天然存在的氮條件 ( 限制性的或非限制性的 ) 的植物的規 程。例如, 技術人員可通過向植物提供比正常需求更少的氮或在一定時期內不提供氮來模 擬氮條件, 并且技術人員可通過尋找農學特性的差異來評價此類植物, 例如在生理學和 / 或物理條件上的變化, 包括 ( 但不限于 ) 活力、 生長、 大小、 或根長、 或具體地講葉片顏色或 葉片面積大小。 用于評價此類植物的其他技術包括測量葉綠素熒光、 光合作用速率、 根生長 或換氣速率。
     下面的實施例描述了一些用于模擬氮限制條件和 / 或在此類條件下評價植物的 代表性規程和技術。
     技術人員也可通過植物在大田測試中, 在模擬的或天然存在的低氮或高氮條件 下保持足夠產量 ( 例如, 至少 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85%、 86%、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%、 或 100%的產量 ) 的能力 ( 例如通過測量在低氮或高氮條件下, 與標準氮條件下相比基本上等 同的產量, 或通過測量在低氮或高氮條件下與對照或參照植物相比更少的產量損失 ) 來評 價氮脅迫耐受性。
     在評估或測量其中利用了對照或參照植物的本發明任何實施方案 ( 例如, 如本文 描述的組合物或方法 ) 中的轉基因植物的農學特性或表型時, 本領域的普通技術人員將很 容易認識到要利用的合適對照植物。例如, 通過如下非限制性示例來說明 :
     1. 轉化過的植物的子代, 該轉化過的植物對于重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建 體 ) 來說是半合子的, 使得該子代分離成包含或不包含該 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的植株 : 包含該重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的子代將通常相對于不包含該重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的子代來進行測量 ( 即, 不包含該重組 DNA 構建體 ( 或抑 制 DNA 構建體 ) 的子代是對照或參照植株 )。
     2. 重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 基因滲入至近交系中, 例如在玉米中, 或 基因滲入進變種中, 例如在大豆中 : 基因滲入品系將通常相對于親本近交系或變種品系進 行測量 ( 即, 親本近交系或品種品系是對照或參照植物 )。
     3. 雙雜交系, 其中第一雜交系由兩個親本近交系產生, 而第二雜交系由相同的兩 個親本近交系產生, 不同的是其中一個親本近交系含有重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建 體): 第二雜交系通常將相對于第一雜交系進行測量 ( 即第一雜交系為對照植物或參照植 物 )。
     4. 包含重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的植株 : 該植株可以相對于這樣 的對照植株進行評估或測量, 該對照植株不包含重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ), 但具有與該植株相當的遺傳背景 ( 例如, 與包含重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的 植株相比較, 核遺傳物質具有至少 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99%或 100%的序列同一性 )。存在許多可用于分析、 比較和表征植物遺傳背景的基于實 驗室的技術 ; 其中這些技術是同工酶電泳、 限制性片段長度多態性 (RFLP)、 隨機擴增多態 性 DNA(RAPD)、 任何引物聚合成酶鏈反應 (AP-PCR)、 DNA 擴增指紋 (DAF)、 序列特異擴增區域 (SCAR)、 擴增片段長度多態性 (AFLP ) 和也稱為微衛星的簡單序列重復 (SSR)。 此外, 本領域的普通技術人員將容易認識到, 評估或測量轉基因植物的農學特性 或表型時合適的對照或參照植物將不包括先前已經針對所需的農學特性或表型, 通過誘變 或轉化而選擇的植物。
     方法
     方法包括但不限于用于提高植物氮脅迫耐受性的方法、 用于評價植物氮脅迫耐受 性的方法、 用于改變植物農學特性的方法、 用于測定植物農學特性改變的方法、 和用于制備 種子的方法。所述植物可為單子葉或雙子葉植物, 例如玉米或大豆植物。植物還可以是向 日葵、 高梁、 低芥酸菜籽、 小麥、 苜蓿、 棉、 稻、 大麥、 小米、 或甘蔗。所述種子可為玉米或大豆 種子, 例如玉米雜交種子或玉米自交系種子。
     方法包括但不限于如下方法 :
     轉化細胞的方法包括用本發明的任何分離的多核苷酸轉化細胞。 也包括通過這種 方法轉化的細胞。 在具體實施方案中, 所述細胞是真核細胞, 例如酵母、 昆蟲或植物細胞, 或 原核細胞, 例如細菌細胞。
     生產轉基因植物的方法, 所述方法包括用本發明的任何分離的多核苷酸或重組 DNA 構建體 ( 包括抑制 DNA 構建體 ) 來轉化植物細胞并從轉化的植物細胞中再生轉基因植 物。 本發明也涉及由該方法制備的轉基因植物, 以及從該轉基因植物中獲取的轉基因種子。 通過該方法獲取的轉基因植物可被用于本發明的其他方法中。
     用于從細胞或細胞培養基中分離本發明多肽的方法, 其中所述細胞包含具有本發 明多核苷酸的重組 DNA 構建體, 所述多核苷酸可操作地連接到至少一個調控序列, 并且其
     中轉化的宿主細胞在適于重組 DNA 構建體表達的條件下生長。
     改變宿主細胞中本發明多肽表達水平的方法, 所述方法包括 : (a) 用本發明的重 組 DNA 構建體轉化宿主細胞 ; 以及 (b) 在適于表達所述重組 DNA 構建體的條件下培養轉化 過的細胞, 其中重組 DNA 構建體的表達導致轉化過的宿主細胞中的本發明多肽含量改變。
     提高植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 將重組 DNA 構建體引入到可再 生的植物細胞中, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列 ( 例如在植 物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的, 所述 氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%的序列 同一性 ; 和 (b) 在步驟 (a) 之后, 從所述可再生的植物細胞再生出轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體并且在與不包含該重組 DNA 構建體的對照 植物進行比較時表現出提高的氮脅迫耐受性。所述方法可進一步包括 (c) 獲取源自該轉基 因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體并且在與未包含 該重組 DNA 構建體的對照植物比較時表現出增加的氮脅迫耐受性。
     提高植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 將抑制 DNA 構建體引入到可再 生的植物細胞中, 該抑制 DNA 構建體包含可操作地連接至少一種調控序列 ( 例如在植物中 有功能的啟動子 ) 的以下序列的全部或部分 : (i) 編碼多肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸 序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57%、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%的序列同一 性, 或 (ii)(a)(i) 的核酸序列的全長互補序列 ; 以及 (b) 在步驟 (a) 之后, 從該可再生的植 物細胞再生出轉基因植物, 其中該轉基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 并且在 與不包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出增加的氮脅迫耐受性。所述方 法可進一步包括 (c) 獲取源自該轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中 包含抑制 DNA 構建體并且在與未包含該抑制 DNA 構建體的對照植物比較時表現出增加的氮 脅迫耐受性。
     提高植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 將抑制 DNA 構建體引入到可再 生的植物細胞中, 該抑制 DNA 構建體包含可操作地連接源自受關注靶基因有義鏈或反義鏈 的全部或部分區域的至少一種調控序列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 所述區域的核 酸序列基于 Clustal V 比對方法在與所述區域所來源的有義鏈或反義鏈的全部或部分進 行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57%、 58%、 59%、 60%、 61%、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的多肽 ; 以及 (b) 在步驟 (a) 之后, 從所述可再生的植物細 胞再生出轉基因植物, 其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構建體并且在 與不包含該抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出增加的氮脅迫耐受性。所述方法 可進一步包括 (c) 獲取源自該轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包 含抑制 DNA 構建體并且在與未包含該抑制 DNA 構建體的對照植物比較時表現出增加的氮脅 迫耐受性。
     評價植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含重組 DNA 構建體, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少 一種調控序列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有 一種氨基酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%、 51%、 52%、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98%、 99%或 100%的序列同一性 ; (b) 獲取來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述 子代植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體 ; 以及 (c) 評價所述子代植物在與不包含 所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時的氮脅迫耐受性。
     評價植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控序 列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 其可操作地連接以下序列的全部或部分 : (i) 編碼多 肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或 100 %的序列同一性 ; 或 (ii)(a)(i) 的核酸序列的全長互補序列 ; (b) 獲取來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構建體 ; 以及 (c) 評價所述子代植物在與不包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行 比較時的氮脅迫耐受性。
     評價植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控序 列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 其可操作地連接源自受關注靶基因有義鏈或反義鏈 的全部或部分區域, 所述區域的核酸序列基于 Clustal V 比對方法在與所述區域所來源的 有義鏈或反義鏈的全部或部分進行比較時, 具有至少 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 或 100% 的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的多肽 ; (b) 獲取來源 于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構建體; 以及 (c) 評價所述子代植物在與不包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時的 氮脅迫耐受性。
     測定植物農學特性改變的方法, 所述方法包括 (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含重組 DNA 構建體, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少 一種調控序列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有 一種氨基酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%、 51%、 52%、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98%、 99%或 100%的序列同一性 ; (b) 獲取來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述 子代植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體 ; 以及 (c) 測定所述子代植物任選地在氮 限制條件下與不包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時是否表現出至少一種農 學特性的改變。
     測定植物農學特性改變的方法, 所述方法包括 (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控序 列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 其可操作地連接以下序列的全部或部分 : (i) 編碼多 肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97%、 98%、 99%或 100%的序列同一性 ; 或 (ii)(i) 的核酸序列的全長互補序列 ; (b) 獲取 來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構 建體 ; 以及 (c) 測定所述子代植物任選地在氮限制條件下與不包含所述抑制 DNA 構建體的 對照植物進行比較時是否表現出至少一種農學特性的改變。
     測定植物農學特性改變的方法, 所述方法包括 (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控序列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 其可操作地連接源自受關注靶基因有義鏈或反義鏈的 全部或部分的區域, 所述區域的核酸序列基于 Clustal V 比對方法在與所述區域所來源的 有義鏈或反義鏈的全部或部分進行比較時, 具有至少 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 或 100% 的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的多肽 ; (b) 獲取來源 于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構建 體; 以及 (c) 測定所述子代植物任選地在氮限制條件下與不包含所述抑制 DNA 構建體的對 照植物進行比較時是否表現出至少一種農學特性的改變。
     產生種子 ( 例如可作為提供氮脅迫耐受性的產品銷售的種子 ) 的方法, 該方法包括任一上述的方法, 并且還包括從所述子代植物獲取種子, 其中所述種子在其基因組中包 含所述重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 )。
     在任何前述方法或本發明的方法的任何其他實施方案中, 在所述導入步驟中所述 可再生的植物細胞可包括愈傷組織細胞、 胚胎愈傷組織細胞、 配子細胞、 分生細胞或未成熟 胚芽細胞。可再生的植物細胞可來自近交系玉米植物。
     在任一前述方法或本發明方法的任一其他實施方案中, 所述再生步驟可包括 : (i) 在包含促胚發生激素的培養基中培養所述轉化的植物細胞, 直至觀察到愈傷組織 ; (ii) 將 步驟 (i) 的所述轉化植物細胞轉移到第一培養基中, 所述培養基包括促組織形成激素 ; 以 及 (iii) 在第二培養基上傳代培養步驟 (ii) 后的所述轉化的植物細胞, 以允許嫩芽伸長、 根發育或這兩者同時發生。
     在任何前述方法或本發明的方法的任何其他實施方案中, 所述至少一種農學特性 可選自 : 綠度、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時的鮮重、 成熟時的干重、 果實產量、 種子產量、 總植物含氮量、 果實含氮量、 種子含氮量、 營養組織含氮量、 總植物氨基酸含量、 營養組織游 離氨基酸含量、 果實游離氨基酸含量、 種子游離氨基酸含量、 總植物蛋白質含量、 果實蛋白 質含量、 種子蛋白質含量、 營養組織蛋白質含量、 耐旱性、 氮攝取、 根倒伏抗性、 收獲指數、 莖 倒伏、 植株高度、 穗高、 穗長、 鹽耐受性、 早期幼苗活力、 和在低溫脅迫下的出苗。 至少一種農 學特性的改變可為產量、 綠度或生物量的增加。 在任一上述方法或本發明的任一方法中, 在與不包含所述重組 DNA 構建體 ( 或抑 制 DNA 構建體 ) 的對照植物在氮限制條件下進行比較時, 植物可表現出至少一種農學特性 的改變。
     在任一前述方法或本發明方法的任何其他實施方案中, 存在供選擇的替代方案用 于將包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸的重組 DNA 構建體導入可再生的 植物細胞中。例如, 可將調控序列 ( 例如一種或多種增強子, 例如, 作為轉座因子的部件 ) 導入可再生的植物細胞, 然后篩選其中將所述調控序列可操作地連接至編碼本發明的多肽 的內源基因的事件。
     將本發明的重組 DNA 構建體引入植物可通過任何合適的技術來進行, 這些技 術包括但不限于 DNA 直接攝取、 化學處理、 電穿孔、 顯微注射、 細胞融合、 感染、 載體介導 的 DNA 轉移、 轟擊或農桿菌屬介導的轉化。植物轉化和再生技術已經在國際專利公布 WO 2009/006276 中進行了描述, 其內容以引用方式并入本文。
     含有編碼受關注蛋白質的外來的外源性分離核酸片段的植物的發育或再生是本 領域所熟知的。可將再生的植物進行自花授粉以產生純合的轉基因植物。或者, 將得自再 生植物的花粉與農學上重要的品系的產生種子的植株進行雜交。相反, 將來自這些重要品 系植物的花粉用于給再生植物授粉。 利用本領域技術人員所熟知的方法培育含有所需多肽 的本發明的轉基因植物。
     實施例 本發明將在下面的實施例中進一步說明, 其中份數和百分比是以重量計并且度數 是攝氏度, 除非另外說明。應該理解, 盡管這些實施例說明了本發明的實施方案, 但僅是以 例證的方式給出的。根據上面的論述和這些實施例, 本領域的技術人員可以確定本發明的
     基本特征, 并在不脫離本發明的精神和范圍的情況下, 可對本發明做出多種改變和修改, 以 使其適用于多種用法和條件。此外, 除了那些本文所示和描述的那些之外, 根據前文所述, 本發明的各種修改形式對本領域的技術人員來說將是顯而易見的。 這些修改形式也旨在涵 蓋于所附權利要求書的范圍內。
     實施例 1
     制備具有激活標記基因的擬南芥種群
     構建 18.49kb 的 T-DNA 基二元構建體, pHSbarENDs2(SEQ ID NO : 1; 圖 1) 包含四 個來源于花椰菜花葉病毒 35S 啟動子的四個多聚增強子元件 ( 對應于序列 -341 至 -64, 如 Odell 等人 Nature 313 : 810-812 所述 (1985))。該構建體也包含允許質粒救援的載體序列 (pUC9) 和多接頭 (SEQ ID NO : 11)、 再動員 T-DNA 的轉座子序列 (Ds)、 以及允許草胺磷選擇 轉基因植物的 bar 基因。原則上, 僅將從右邊界 (RB) 至左邊界 (LB) 包含的 10.8kb 片段轉 移到寄主植物基因組中。因為增強子元件位于靠近 RB 處, 它們可誘導 T-DNA 整合后的基因 組位點順式激活。
     通過整個植株的農桿菌屬轉化制備擬南芥屬激活標記種群。將 pHSbarENDs2 構建 體轉化到根癌農桿菌菌株 C58 中, 在 25℃下在溶菌肉湯培養基中培養至 OD600 ~ 1.0。然 后離心沉淀細胞, 并重懸在相等體積的 5%蔗糖 /0.05% Silwet L-77(OSI Specialties, Inc) 中。在早期抽薹時, 培育擬南芥生態型 Col-0 的土壤使用農桿菌屬懸浮液進行頂部灌 溉。 一周后, 相同植株再次用在蔗糖 /Silwet 中的相同農桿菌屬菌株進行頂部灌溉。 然后將 該植物的種子設為標準。所得 T1 種子在土壤中播種, 通過噴灑草胺磷 (FINALE ; AgrEvo ; Bayer Environmental Science) 選擇轉基因幼苗。選擇了總計 100,000 個草胺磷抗性 T1 幼苗。分開保存來自每個品系的 T2 種子。
     實施例 2
     篩選以鑒定具有低氮耐受性的品系
     來 自 每 個 100,000 個 分 離 T1 激 活 標 記 品 系 的 十 一 個 T2 植 物 可 種 植 在 方 板 (15mm×15mm) 上, 方板包含 0.5x N-Free Hoagland’ s, 0.4mM 硝酸鉀, 0.1%蔗糖, 1mM MES TM 和 0.25% Phyytagel ( 低氮培養基 )。 每個板種植五個品系, 并且每個板包括 9 個野生型個 體以使總計 64 個個體排列成 8×8 的網格圖案 ( 參見圖 12)。在暗處、 4℃條件下保持平板 三天以使種子分層, 然后在 22℃光照和 20℃黑暗交替條件下水平放置九天。光周期為十六 小時光照和八小時黑暗, 平均光照強度為~ 200mmol/m2/s。每天旋轉并振動每個架子中的 平板。在第十二天 ( 生長九天 ), 對整個板拍照以評價幼苗狀態。
     在掩蔽該平板圖像以去除背景顏色后, 每個個體收集兩個不同的測量數據 : 總羅 賽塔面積和進入綠色區的顏色百分比。使用色調、 飽和度和強度數據 (HSI), 綠色區由色調 50 至 66 組成。 總羅賽塔面積用作植物生物量的量度, 而綠色區通過劑量 - 響應研究已經顯 示指示氮同化作用 ( 參見圖 13)。
     將在與野生型對照植物進行比較時具有顯著的總羅賽塔面積和 / 或綠色區增加 的品系命名為 Phase 1 hits。在相同分析條件下進行 Phase 1hits 的重復試樣再篩選 (Phase 2 篩選 )。還通過 Phase 3 篩選以進一步驗證通過 Phases 1 和 2 的突變體。在 Phase 3 中, 將每個品系分開種植在低氮培養基中, 使得 32 個 T2 個體緊鄰著 32 個野生型個 體生長, 為分析提供更高的統計學嚴謹性。如果一個品系顯示與 Phase 3 中對照的顯著差異, 然后可認為該品系是經驗證的氮缺乏抗性品系。
     實施例 3
     鑒定激活標記基因
     在氮耐受性品系中側接 T-DNA 插入序列的基因使用以下兩個標準程序中的一個 或兩個進行鑒定 : (1) 熱不對稱交錯 (TAIL)PCR(Liu 等人, Plant J.8 : 457-63(1995)) ; 以及 (2)SAIFF PCR(Siebert 等人, Nucleic Acids Res.23 : 1087-1088(1995))。至于復雜的多 聚 T-DNA 插入序列, TAIL PCR 和 SAIFF PCR 可能均不足以鑒定候選基因。在這些情況下, 可使用包括反式 PCR、 質粒拯救和 / 或基因組文庫構建在內的其他程序。
     成功的結果是其中單個 TAIL 或 SAIFF PCR 片段包含 T-DNA 邊界序列和擬南芥屬 基因組序列。一旦獲取側接 T-DNA 插入序列的基因組序列標記, 通過與公開可用的擬南芥 屬基因組的序列比對來鑒定候選基因。具體地講, 最靠近 35S 增強子元件 /T-DNA RB 的注 釋基因是激活的基因的候選基因。
     為了驗證鑒定的基因真的靠近 T-DNA 并排除 TAIL/SAIFF 片段是嵌合偽克隆的可 能性, 用一個 T-DNA 中的寡核苷酸和一個候選基因特異性的寡核苷酸進行對基因組 DNA 的 診斷 PCR。將提供 PCR 產品的基因組 DNA 樣本理解為表示 T-DNA 插入序列。該分析也驗證 了其中一種以上的插入事件發生在相同品系中的情況, 例如, 在 TAIL 和 / 或 SAIFF PCR 分 析中鑒定是否有多個不同基因組片段。
     實施例 4
     鑒定編碼包含 SNF2 結構域的多肽的激活標記基因
     進一步分析了顯示出氮缺乏耐受性的激活標記品系 ( 品系 112579)。提取來自該 品系的 DNA, 并且在突變品系中側接 T-DNA 插入序列的基因通過連接介導 PCR(Siebert 等 人, Nucleic Acids Res.23 : 1087-1088(1995)) 進行鑒定。鑒定一個單獨擴增的片段, 它包 含 T-DNA 邊界序列和擬南芥屬基因組序列。一旦獲取側接 T-DNA 插入序列的基因組序列標 記, 通過與完全擬南芥屬基因組的序列比對鑒定候選基因。具體地講, 最靠近 35S 增強子元 件 /T-DNA RB 的注釋基因是品系中激活的基因的候選基因。就品系 112579 而言, 最靠近 35S 增強子的基因是 At1g61140, 它編碼擬南芥包含 SNF2 結構域的多肽。
     實施例 5
     通過轉化擬南芥屬驗證候選的擬南芥基因 (At1g61140)
     可將候選基因轉化到擬南芥屬中并在 35S 啟動子作用下過表達。如果在轉基因品 系中觀察到與親本激活標記品系相同或相似的表型, 則將該候選基因認為是擬南芥屬中驗 證過的 “前導基因” 。
     候選擬南芥屬基因 (At1g61140) 編碼包含 SNF2 結構域的多肽, 用以下方法測試其 賦予氮缺乏耐受性的能力。設計引物以擴增突變體 At1g61140.1。
     通過 RT-PCR, 用以下引物擴增 At1g61140.1cDNA(SEQ ID NO : 24) :
     1.At1g61140-5’ attB 正向引物 (SEQ ID NO : 33)
     正向引物包含 attB1 序列 (ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT ; SEQ ID NO : 12) 和共有 的 Kozak 序列 (CAACA) 蛋白編碼區上游的前 21 個核苷酸 ( 以所述 cDNA 的 ATG 起始密碼子 開頭 )。
     2.At1g61140-3’ attB 反向引物 (SEQ ID NO : 34)。反向引物包含 attB2 序列 (ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT ; SEQ ID NO : 13), 該序列 鄰近蛋白編碼區的反向互補序列的后 21 個核苷酸 ( 以所述 cDNA 的終止密碼子的反向互補 序列開頭 )。
     使用 INVITROGENTM GATEWAY CLONASETM 技術, 用 pDONRTMZeo(SEQ ID NO : 2; 圖 2) 對每個 RT-PCR 產物進行了 BP 重組反應。這種方法將細菌致死 ccdB 基因以及氯霉素抗性 基因 (CAM) 從 pDONRTMZeo 移除并定向地克隆了該在旁側具有 attB1 和 attB2 位點的 PCR 產 物而得到入門克隆 (entry clone)。鑒定為陽性的入門克隆與一個目的載體一起被用于隨 后的 LR 重組反應, 如下所述。
     用緊接 INVITROGENTMGATEWAY C1 轉化插入序列上游的 1.3-kb35S 啟動子構建 稱為 pBC-yellow(SEQ ID NO : 4; 圖 4) 的基于 16.8-kbT-DNA 的二元載體 ( 目的載體 ), 所述插入序列包含 ccdB 細菌致死基因以及側接 attR1 和 attR2 序列的氯霉素抗性基因 (CAM)。該載體還包含 RD29a 啟動子, 該啟動子驅動基因表達 ZS-Yellow(INVITROGENTM), 它 TM 賦予轉化過的種子黃色熒光。使用 INVITROGEN GATEWAY 技術, 對包含核苷酸編碼序列 At1g61140.1(SEQ ID NO : 24) 和 pBC-yellow 載體的入門克隆進行 LR 重組反應 ; 然而, 也可 使用任一種其他突變體 (SEQ ID NO : 26 和 28)。該擴增允許迅速地定向克隆在 pBC-yellow 中的 35S 啟動子之后的 At1g61140.1(SNF2.1 ; SEQ ID NO : 24)。 申請人然后使用如實施例 1 所述的相同農桿菌介導的轉化程序將 35S 啟動子 : At1g61140 表達構建體導入野生型擬南芥屬生態型 Col-0 中。 轉基因 T1 種子通過黃色熒光 進行選擇, 并且將 32 個這些 T1 種子緊鄰著 32 個野生型擬南芥屬生態型 Col-0 種子種植在 低氮培養基上。所有隨后的生長和拍照條件均如實施例 1 所述。發現來自激活標記的、 對 氮限制條件具有耐受性的初始表型, 可在用其中 At1g61140 基因通過 35S 啟動子直接表達 的構建體轉化過的野生型擬南芥屬植物中重現。
     實施例 6a
     cDNA 文庫的制備和 cDNA 克隆的分離和測序
     cDNA 文庫可通過許多可用的方法中的任一種制備。例如, 通過首先根據生產商的 說明書 (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) 制備 Uni-ZAPTMXR 載體中的 cDNA 文 庫, 可將 cDNA 引入質粒載體中。 根據 Stratagene 提供的說明書, 將 Uni-ZAPTMXR 文庫轉換成 質粒文庫。當轉換的時候, 將把 cDNA 插入序列包含于質粒載體 pBLUESCRIPT 中。此外, 可
     使用 T4 連接酶 (New England Biolabs) 將 cDNA 直接導入預切過的 BLUESCRIPT II SK(+) 載體 (Stratagene) 中, 隨后按照制造商規程 (GIBCO BRL Products) 轉染 DH10B 細胞。一 旦 cDNA 插入序列處于質粒載體中, 從隨機選取的含重組 pBLUESCRIPT 質粒的細菌菌落制 備質粒 DNA, 或者用對插入的 cDNA 序列旁側的載體序列特異性的引物, 通過聚合酶鏈式反 應擴增插入的 cDNA 序列。將擴增的 DNA 插入序列或質粒 DNA 在染料 - 引物標記法測序反 應 (dye-primer sequencing reaction) 中進行測序, 以產生部分 cDNA 序列 ( 表達序列標 記或 “EST” ; 參見 Adams 等人, Science 252 : 1651-1656(1991))。用 Perkin Elmer Model 377 熒光測序儀分析所得的 EST。
     用改進的轉座規程產生全長插入序列 (FIS) 數據。從歸檔的甘油原種作為單一菌 落回收確定了 FIS 的克隆, 并通過堿性裂解分離質粒 DNA。將分離的 DNA 模板在基于 PCR 的 測序反應中與載體引物 M13 正向和反向寡核苷酸反應并上樣至自動化的測序儀上。通過與對其進行 FIS 查詢的初始 EST 序列進行序列比對來確認克隆鑒定。
     將確認的模板通過基于釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)Ty1 轉座因子 (Devine 和 Boeke, Nucleic Acids Res.22 : 3765-3772(1994)) 的 Primer Island 轉座試劑 盒 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) 進行轉座。該體外轉座系統在整個一組大 DNA 分子中隨機地放入獨特的結合位點。隨后將轉座的 DNA 用于通過電穿孔轉化 DH10B 電 感受態細胞 (GIBCO BRL/Life Technologies, Rockville, MD)。轉座因子含有另外的可選 標記 ( 稱為 DHFR ; Fling 和 Richards, Nucleic Acids Res.11 : 5147-5158(1983)), 使得能 在瓊脂平板上僅雙重篩選含有整合的轉座子的那些亞克隆。 從每次轉座反應隨機地選擇多 個亞克隆, 通過堿性裂解制備質粒 DNA, 并用對轉座子內的結合位點特異性的獨特引物從轉 座事件位點向外進行測序 (ABI PRISM dyeterminator ReadyReaction mix)。
     收 集 序 列 數 據 (ABI PRISM Collections) 并 用 Phred 和 Phrap(Ewing 等 人, Genome Res.8 : 175-185(1998) ; Ewing 等人, Genome Res.8 : 186-194(1998)) 組裝。Phred 是一種公用軟件程序, 該程序再次讀取 ABI 序列數據, 再次調出 (recall) 堿基, 賦質量值, 并將堿基序列 (base call) 和質量值寫入可編輯的輸出文件中。Phrap 序列組裝程序使用 這些質量值來增加組裝的序列重疊群的準確度。通過 Consed 序列編輯器 (Gordon 等人, Genome Res.8 : 195-202(1998))。
     在一些克隆中, cDNA 片段對應基因的 3’ 端的一部分并且不會涵蓋整個開放閱讀 框。為了獲取上游信息, 使用兩種不同規程中的一種。這兩種方法中的第一種方法導致產 生含有所需基因序列的部分的 DNA 片段, 而第二種方法導致產生含有整個開放閱讀框的片 段。這兩種方法均使用兩輪 PCR 擴增以從一個或多個文庫獲取片段。有時基于以前的知識 ( 特定的基因應該存在于某些組織中 ) 選擇文庫, 有時則進行隨機地選擇。 獲取相同基因的 反應可平行地在若干文庫中進行, 或者在文庫池中進行。文庫池通常用 3 至 5 個不同的文 庫制備并且使其歸一化而成為一致的稀釋度。在第一輪擴增中, 兩種方法均使用載體特異 性的 ( 正向 ) 引物, 同時還使用基因特異性的 ( 反向 ) 引物, 該正向引物對應位于克隆 5’ 端處的載體的一部分。第一種方法使用與已知基因序列的一部分互補的序列, 而第二種方 法使用與 3’ 非翻譯區 ( 也稱為 UTR) 的一部分互補的基因特異性引物。在第二輪擴增中, 兩種方法均使用套式引物組。按照生產商的說明書, 用市售試劑盒將所得 DNA 片段連接進 pBLUESCRIPT 載體中。該試劑盒選自可得自包括 INVITROGENTM(Carlsbad, CA)、 Promega Biotech(Madison, WI) 和 Gibco-BRL(Gaithersburg, MD) 在內的一些供應商的許多試劑盒。 如上所述, 將質粒 DNA 通過堿性裂解方法分離并進行測序和用 Phred/Phrap 進行裝配。
     實施例 6B
     制備 cDNA 文庫并獲取序列
     可利用用于總 RNA 分離的 Qiagen RNA 分離試劑盒分離 mRNA, 然后通過吸附到 Invitrogen(Life Technologies, Carlsbad, CA) 的 oligo(dT)Dynabeads 上分離 mRNA, 并且 測序文庫能夠使用 Illumina, Inc.(SanDiego, CA) 的標準 mRNA-Seq 試劑盒和規程進行制 備。在這一方法中, 使用 ZnCl2 溶液破壞 mRNA, 使用隨機引物將其反轉錄成 cDNA, 進行末端 修復以制備鈍末端片段, 3’ A- 尾化, 并且用 Illumina 雙末端文庫接頭進行連接。然后可使 用 Illumina 雙末端文庫引物對連接好的 cDNA 片段進行 PCR 擴增, 并且能夠在用配有雙末 端模塊的 Genome Analyzer II 測序前使用 Agilent Bioanalyzer DNA 1000 芯片檢查純化PCR 產物的質量和數量。
     測序運行中的讀數可在組合之前進行軟修剪以使觀察到具有低于 15 的 FASTQ 質 量評分的每個讀數的首個堿基對和后面所有堿基對通過 Python Script 進行修剪。Velvet 裝 配 器 (Zerbino 等 人, Genome Research18 : 821-9(2008)) 能 在 不 同 kmer 和 覆 蓋 截 斷 (coverage cutoff) 參數下運行以制備某一嚴格性范圍內的若干個推定裝配物。能夠使用 Vmatch 軟件 ( 在 Vmatch 網站上可用 ) 將在那些裝配物內的鄰接序列 ( 重疊群 ) 組合成組 使得被鑒定為較長重疊群亞組的重疊群分組并被排除, 留下最長 “sentinel” 重疊群的非冗 余組。這些非冗余組能用于與來自已知模型植物種類的同源序列進行比對。
     如果重疊群不提供完整基因, 能夠經由 Blast 或 Perl Script, 使用在第一次搜索 中發現的序列對非冗余組進行再查詢。如果發現了延伸所述重疊群末端的序列, 它們能夠 用桌面裝配器如 DNAStar′ s SeqMan 或 GeneCode′ s Sequencher 與初始序列一起進行裝 配。可重復這些步驟直至不再發現更多的延伸序列。就仍不完整的轉錄物而言, 理論上屬 于一類 ( 基于與其他草本植物的同源性 ) 的基因片段能用來自另一種草本植物的連接序列 進行人工連接。
     實施例 7 鑒定 cDNA 序列
     編碼包含 SNF2 結構域的多肽的 cDNA 序列通過 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool ; Altschul 等人, J.Mol.Biol.215 : 403-410(1993) ; 還可參見國立衛生研究院 國家醫學圖書館的國家生物技術信息中心的萬維網址上對 BLAST 算法的解釋 ) 進行鑒定, 尋找與 BLAST“nr” 數據庫中所包含氨基酸序列 ( 包括所有非冗余 GenBank CDS 翻譯序列、 源自 3 維結構 Brookhaven 蛋白質數據庫 (Protein Data Bank)、 SWISSPROT 蛋白質序列數 據庫的最新的主要版本、 EMBL 和 DDBJ 數據庫的序列 ) 的相似性。在所有的閱讀框中翻譯 DNA 序列并用 NCBI 提供的 BLASTX 算法 (Gish 和 States, Nat.Genet.3 : 266-272(1993)) 比 較與包含在 “nr” 數據庫中的所有可公開獲取的氨基酸序列的相似性。采用國家生物技術 信息中心 (NCBI) 提供的 BLASTP 算法, 分析 cDNA 序列編碼的多肽與包含在 “nr” 數據庫中 的所有可公開獲取的氨基酸序列的相似性。為方便起見, 通過 BLAST 計算僅僅偶然觀察到 cDNA 序列與所搜索的數據庫中所包含序列的匹配的 P 值 ( 概率 ) 或 E 值 ( 期望值 ), 在本 文報導為 “pLog” 值, 它代表所報導的 P 值或 E 值的負對數。因此, pLog 值越大, cDNA 編碼 的序列和 BLAST 的 “匹配” 代表同源蛋白的可能性就越大。
     EST 序 列 可 與 如 上 所 述 的 Genbank 數 據 庫 進 行 比 較。 通 過 使 用 BLASTN 算 法 (Altschul 等人, Nucleic Acids Res.25 : 3389-3402(1997)) 對杜邦專利數據庫比較具有序 列同源共有區域或重疊區域的核苷酸序列, 可找到含更 5′端或 3′端序列的 EST。在兩個 或更多個核酸片段之間存在共有或重疊序列時, 該序列可裝配成單一的連續核苷酸序列, 從而使最初的片段在 5′或 3′初始方向上延伸。一旦確定了最 5′的 EST, 即能通過全長 插入序列來確定其完整的序列。
     可用 tBLASTn 算法, 通過將已知基因 ( 來自專有來源或公開數據庫的已知基因 ) 的氨基酸序列對 EST 數據庫進行比較, 可找到屬于不同物種的同源基因。 tBLASTn 算法對所 有 6 個閱讀框都翻譯了的核苷酸數據庫進行氨基酸查詢的搜索。該搜索允許不同物種之間 的核苷酸密碼子使用的差異, 并且允許密碼子簡并。
     實施例 8a
     表征編碼編碼包含 SNF2 結構域的多肽的 cDNA 序列
     制備提供來自玉米 (Zea mays)、 畫眉草 (Eragrostis nindensis)(Resurrection grass)、 和百喜草 (Paspalum notatum)(Bahiagrass) 不同組織的 mRNA 的 cDNA 文庫。下面 描述了該文庫的特征。
     表2
     來自玉米的 cDNA 文庫
     如 表 3、 圖 16A-AM 和 圖 17 所 示, 表 2 中 鑒 定 的 cDNA 編 碼 類 似 于 以 下 多 肽 的 多肽: 來 自 擬 南 芥 (At1g61140.1(GI No.186492170 ; SEQ ID NO : 25) ; At1g61140.2(GI No.186492172 ; SEQ ID NO : 27) ; 和 At1g61140.3(GI No.186492175 ; SEQ ID NO : 29)) 的 包 含 SNF2 結 構 域 的 多 肽、 和 來 自 水 稻 (GI No.53792213, 對 應 于 SEQ ID NO : 30, GI No.218200575, 對應于 SEQ ID NO : 31, 以及 GI No.90399293, 對應于 SEQ ID NO : 32) 以及高 粱 (GI No.242058897, 對應于 SEQ ID NO : 49) 的包含 SNF2 結構域的多肽。
     表 3( 非專利文獻 ) 和表 4( 專利文獻 ) 中所示的分別是單獨的 EST( “EST” )BLASTP 結果、 包含標明的 cDNA 克隆的整個 cDNA 插入物的序列 ( “FIS” )、 由兩個或更多個 EST、 FIS 或 PCR 序列裝配而成的重疊群序列 (“Contig” )、 或編碼源自 FIS 或重疊群的完整蛋白或 功能性蛋白的序列 (“CGS” )。表 3 和表 4 也顯示了使用 Clustal V 比對方法、 使用默認參 數計算的每對氨基酸序列的序列同一性百分比值 ( 如下所述 )。
     表3
     多肽的 BLASTP 結果
     包含 SNF2 結構域的多肽的同源物
     表4 多肽的 BLASTP 結果 包含 SNF2 結構域的多肽的同源物實施例 8b
     鑒定其他包含 SNF2 結構域的多肽
     與 編 碼 包 含 SNF2 結 構 域 的 蛋 白 的 前 導 基 因 同 源 的 序 列 可 使 用 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool ; Altschul 等 人, J.Mol.Biol.215 : 403-410(1993) ; 也參 見美國國家衛生研究院 (National Institutes of Health) 國立醫學圖書館 (National Library of Medicine) 的國家生物技術信息中心 (National Center for Biotechnology Information) 的萬維網網址上對 BLAST 算法的解釋 ) 之類的序列比較算法進行鑒定。例 如, 由 At1g61140 編碼的蛋白的氨基酸序列用作查詢序列, 使用 BlastP 查詢公共數據庫, 并 且隨后將如 SEQ ID NO : 40、 42、 和 48 所示的多肽序列鑒定為同源物 ( 對應的核苷酸序列分 別是 SEQ ID NO : 39、 41、 和 47)。 對公共 BAC 序列進行的 TblastN 搜索也鑒定了 SEQ ID NO : 44( 對應的核苷酸序列是 SEQ ID NO : 43) 所示的玉米同源物。
     實施例 8c
     包含 SNF2 結構域的多肽的序列比對和同一性百分比計算
     圖 16A-AM 給 出 如 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、
     46、 48、 和 49 所示的氨基酸序列比對結果。圖 17 示出圖 16A-AM 中顯示的每對氨基酸序列 的序列同一性百分比和趨異值的圖表。
     用 LASERGENE 生物信息計算包 (DNASTAR Inc., Madison, WI) 的 MEGALIGN 程 序進行序列比對和同一性百分比計算。用 Clustal 比對方法 (Higgins 和 Sharp(1989), CABIOS.5 : 151-153) 進行序列的多重比對, 默認參數 ( 空位罰分= 10, 空位長度罰分= 10)。使用 Clustal 方法采用以下逐對比對的默認參數 : KTUPLE 1, 空位罰分= 3, 窗口= 5, DIAGONALS SAVED = 5。 實施例 9
     包含擬南芥屬前導基因的同源物的植物表達載體的制備
     與 編 碼 包 含 SNF2 結 構 域 的 蛋 白 的 前 導 基 因 同 源 的 序 列 可 使 用 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool ; Altschul 等 人, J.Mol.Biol.215 : 403-410(1993) ; 也參 見美國國家衛生研究院 (National Institutes of Health) 國立醫學圖書館 (National Library of Medicine) 的國家生物技術信息中心 (National Center for Biotechnology Information) 的萬維網網址上對 BLAST 算法的解釋 ) 之類的序列比較算法進行鑒定。 與編 碼包含 SNF2 結構域的蛋白的基因類似的核苷酸序列, 如實施例 8A-C 所述的序列, 可通過任 何一種以下方法進行 PCR 擴增。
     方法 1( 基于 RNA 的方法 ) : 如果蛋白編碼區域的 5’ 和 3’ 序列信息是可用的, 可 如實施例 5 所述設計基因特異性引物。可將 RT-PCR 用于植物 RNA 來獲取含有蛋白編碼區 的核酸片段, 該 EXST 蛋白編碼區旁側為 attB1(SEQ ID NO : 12) 和 attB2(SEQ ID NO : 13) 序 列。引物可含有起始密碼子上游的共有 Kozak 序列 (CAACA)。
     方法 2( 基于 DNA 的方法 ) : 作為另外一種選擇, 如果 cDNA 克隆是可用的, 可以 PCR 擴增完整 cDNA 插入序列 ( 含有 5′和 3′非編碼區 )。可設計正向引物和反向引物, 使它們 分別或者含有 attB1 序列和在該 cDNA 插入序列前面的載體特異性序列或者含有 attB2 序 列和在該 cDNA 插入序列后面的載體特異性序列。對于克隆進載體 pBLUESCRIPT SK+ 中的 cDNA 插入序列, 可使用正向引物 VC062(SEQ ID NO : 16) 和反向引物 VC063(SEQ ID NO : 17)。
     方 法 3( 基 于 基 因 組 DNA 的 方 法 ) : 能 夠 使 用 長 程 基 因 組 PCR 捕 集 獲 取 基 因 組 序 列。 能 夠 基 于 基 因 座 序 列 設 計 引 物, 并 且 能 夠 對 所 得 PCR 產 物 測 序。 能 夠 使 用 FGENESH(Salamov, A.and Solovyev, V.(2000)Genome Res., 10 : 516-522) 程序進行序列分 析, 并且任選地能夠與來自其他物種的同源序列進行比對以輔助鑒定推定的內含子和外顯 子。
     方法 1、 2 和 3 可根據本領域技術人員已知的步驟進行修改。例如, 方法 1 的引物 可含有限制性酶切位點而不是 attB1 和 attB2 位點, 用于后來將 PCR 產物克隆進含有 attB1 和 attB2 位點的載體內。另外, 方法 2 可涉及從 cDNA 克隆、 λ 克隆、 BAC 克隆或基因組 DNA 擴增。
     可利用 BP 重組反應將通過任一種上述方法獲取的 PCR 產物與 GATEWAY 供體載
     體 ( 例如 pDONRTMZeo(SEQ ID NO : 2; 圖 2) 或 pDONRTM221(SEQ ID NO : 3; 圖 3) 組合。這種方 TM 法將細菌致死 ccdB 基因以及氯霉素抗性基因 (CAM) 從 pDONR Zeo 或 pDONRTM221 移除并定 向地克隆了在旁側具有 attB1 和 attB2 位點的 PCR 產物而得到入門克隆 (entry clone)。 使用 INVITROGENTM GATEWAY CLONASETM 技術, 然后可將來自入門克隆的編碼同源包含 SNF2結構域的多肽的序列轉移到合適的目的載體中, 例如 pBC-Yellow(SEQ ID NO : 4; 圖 4)、 PHP27840(SEQ ID NO : 5; 圖 5)、 或 PHP23236(SEQ ID NO : 6; 圖 6), 以獲取植物表達載體, 所 述載體分別用于擬南芥屬、 大豆、 和玉米。 TM
     供體載體 pDONR /Zeo 或 pDONRTM221 的 attP1 和 attP2 位點分別顯示于圖 2 和圖 3 中。目的載體 pBC-Yellow、 PHP27840 和 PHP23236 的 attR1 和 attR2 位點分別顯示于圖 4、 5 和 6 中。
     作為另外一種選擇, 可進行多個入門克隆和合適的目的載體之間的 MultiSite Gateway LR 重組反應以產生表達載體。 實施例 10
     用驗證過的擬南芥屬前導基因制備大豆表達載體并轉化大豆
     為了檢查所得表型, 可將大豆植株轉化以過表達每個驗證過的擬南芥屬基因或來 自不同物種的對應同源物。
     可將實施例 5 中所述的相同 GATEWAY 入門克隆用于將每個基因定向克隆進
     PHP27840 載體 (SEQ ID NO : 5; 圖 5) 中, 使得該基因的表達處于 SCP1 啟動子的控制下。
     然后可用包含編碼本多肽的序列的表達載體轉化大豆胚。 大豆轉化和再生技術已 經在國際專利公布 WO 2009/006276 中進行了描述, 其內容以引用方式并入本文。 可在氮限制條件下 ( 例如 1mM 硝酸鹽 ) 栽培 T1 植株并分析表型變化。利用圖像 分析可定量下面的參數 : 可收集并定量植株面積、 體積、 生長速率以及顏色分析。超表達構 建體與合適的對照植物比較導致綠度 ( 綠色區 )、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時的鮮重或 干重、 果實或種子產量、 總植物氮含量、 果實或種子氮含量、 營養組織的氮含量、 總植物游離 氨基酸含量、 營養組織中的游離氨基酸含量、 果實或種子中的游離氨基酸含量、 果實或種子 中的蛋白質含量、 營養組織中的蛋白質含量發生變化, 可認為它是擬南芥屬前導基因在大 豆中發揮功能提高對氮缺乏耐受性 ( 增加的氮耐受性 ) 的證據。
     可分析用驗證過的基因轉化大豆植株以研究相對于對照或參照植株的農學特性。 例如, 可分析在低氮和高氮條件 ( 如氮限制條件和氮充分條件 ) 下的產量增加和 / 或穩定 性。
     實施例 11
     使用粒子轟擊法用驗證過的擬南芥屬前導基因轉化玉米
     為了檢查所得表型, 可將玉米植株轉化以過表達驗證過的擬南芥屬前導基因或來 自不同物種的對應同源物。
     可以將實施例 5 中所述的相同 GATEWAY 入門克隆用于將每種相應的基因定向
     克隆進玉米轉化載體中。在玉米轉化載體中的基因的表達可以處于組成型啟動子的控 制下, 例如玉米泛素啟動子 (Christensen 等人, Plant Mol.Biol.12 : 619-632(1989) 和 Christensen 等人, Plant Mol.Biol.18 : 675-689(1992)) 然后可通過粒子轟擊將上述重組 DNA 構建體引入玉米細胞中。通過粒子轟擊進行 玉米轉化的技術已經在國際專利公布 WO 2009/006276 中進行了描述, 其內容以引用方式 并入本文。
     可在氮限制條件下 ( 例如 1mM 硝酸鹽 ) 栽培 T1 植株并分析表型變化。利用圖像 分析可定量下面的參數 : 可收集并定量植株面積、 體積、 生長速率以及顏色分析。超表達構
     建體與合適的對照植物比較導致綠度 ( 綠色區 )、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時的鮮重或 干重、 果實或種子產量、 總植物氮含量、 果實或種子氮含量、 營養組織的氮含量、 總植物游離 氨基酸含量、 營養組織中的游離氨基酸含量、 果實或種子中的游離氨基酸含量、 果實或種子 中的蛋白質含量、 營養組織中的蛋白質含量發生變化, 可認為它是擬南芥屬前導基因在玉 米中發揮功能提高對氮缺乏耐受性 ( 增加的氮耐受性 ) 的證據。
     實施例 12
     電穿孔根癌農桿菌 LBA4404
     將電穿孔感受態細胞 (40μl), 例如根癌農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens) LBA4404( 含有 PHP10523) 在冰上解凍 (20-30 分鐘 )。 PHP10523 含有用于 T-DNA 轉移的 VIR 基因、 農桿菌屬的低拷貝數質粒復制起始區、 四環素抗性基因以及用于體內 DNA 生物分子 重組的 cos 位點。同時, 將電穿孔管 (electroporation cuvette) 在冰上冷卻。將該電穿 孔儀的設置調節至 2.1kV。將 DNA 等分試樣 (0.5μL 親代 DNA, 在低鹽緩沖液或雙蒸 H2O 中 的濃度為 0.2μg-1.0μg) 與解凍的根癌農桿菌 LBA4404 細胞混合, 同時仍然保持在冰上。 將混合物轉移至電穿孔管的底部并靜止保持在冰上 1-2 分鐘。按下 “pulse( 脈沖 )” 鍵兩 次 ( 理想的是獲取 4.0 毫秒的脈沖 ) 對細胞進行電穿孔 (Eppendorf 電穿孔儀 2510)。隨 后, 將 0.5mL 室溫下的 2xYT 培養基 ( 或 SOC 培養基 ) 加入到電穿孔管并轉移至 15mL 按壓 蓋管 ( 例如 FALCONTM 管 ) 中。將細胞在 28-30℃、 200-250rpm 下培養 3 小時。 將 250μL 的等分試樣散布在包含 YM 培養基和 50μg/mL 奇放線菌素的板上并在 28-30℃下培養三天。為了增加轉化體的數目, 可進行如下兩個可選步驟中的其中一個 :
     選擇 1 : 用 30μL 15mg/mL 的利福平覆蓋平板。LBA4404 具有針對利福平的染色體 抗性基因。這種附加的選擇消除了在使用較差的 LBA4404 感受態細胞制備物時觀察到的一 些污染克隆。
     選擇 2 : 進行兩次重復的電穿孔以補償較差的電感受態細胞。
     轉化體的鑒定 :
     選取四個獨立的克隆并劃痕接種在包含 AB 基本培養基和 50μg/mL 奇放線菌素的 平板上用于分離單個克隆。 將平板在 28℃下孵育二至三天。 對于每個推定的共整合體選取 單個克隆并將其接種在 4mL 的 10g/L 細菌蛋白胨, 10g/L 酵母提取物, 5g/L 氯化鈉, 和 50mg/ L 奇放線菌素中。將該混合物在 28℃下搖動培養 24 小時。采用 QIAGEN Miniprep 和可選 的 PB 緩沖液洗滌, 從 4mL 培養物分離出質粒 DNA。DNA 在 30μl 中洗提。如上所述, 將 2μL 可將 15μl 等分試樣用于 的等分試樣用于電穿孔 20μL DH10b+20μL 雙蒸 H2O。可任選地, TM 轉化 75-100μl 的 INVITROGEN Library Efficiency DH5α。將細胞散布在包含 LB 培養 基和 50μg/mL 奇放線菌素的平板上并將其在 37℃下培養過夜。
     對于每個推定的共整合體選取三至四個獨立克隆并將其接種在 4mL 的 2xYT 培養 基 (10g/L 細菌蛋白胨, 10g/L 酵母提取物, 5g/L 氯化鈉 ) 和 50μg/mL 奇放線菌素中。將 細胞在 37℃下搖晃培養過夜。接下來, 使用 QIAprep Miniprep, 用任選 PB 緩沖液洗滌液
     ( 稀釋成 50μL) 從 4mL 培養物中分離質粒 DNA。8μL 質粒 DNA 用 SalI( 使用親本 DNA 和 PHP10523 作對照物 ) 進行消化。對于 4 個質粒利用限制性內切酶 BamHI、 EcoRI 和 HindIII 再進行三次消化 ( 使用親本 DNA 和 PHP10523 作為對照 ), 這 4 個質粒代表 2 種具有正確 SalI 消化模式的推定共整合體。推薦電凝膠 (Electronic gel) 用于比較。實施例 13
     使用農桿菌屬 (Agrobacterium) 細菌轉化玉米
     為了檢查所得表型, 可將玉米植株轉化以過表達驗證過的擬南芥屬前導基因或來 自不同物種的對應同源物。
     農 桿 菌 介 導 的 玉 米 轉 化 基 本 上 按 照 Zhao 等 人, Meth.Mol.Biol.318 : 315-323(2006) 中描述的方法進行 ( 還可參見 Zhao 等人, Mol.Breed.8 : 323-333(2001) 和 1999 年 11 月 9 日公布的美國專利 5,981,840, 所述文獻以引用方式并入本文 )。該轉化過 程涉及細菌接種、 共培養、 靜息、 選擇和植物再生。
     1. 未成熟胚芽制備 :
     將未成熟胚芽從穎果上切下來, 并且放置在含有 2mL PHI-A 培養基的 2mL 微管中。
     2. 未成熟胚芽的農桿菌屬細菌感染和其培養 :
     2.1 感染步驟 :
     用 1mL 微吸移管將 (1) 的 PHI-A 培養基取出, 并且加入 1mL 農桿菌屬懸浮液。將 該管輕輕地倒置以混合。將該混合物在室溫下培養 5 分鐘。
     2.2 共培養步驟 :
     用 1mL 微量吸移管將農桿菌屬懸浮液從感染步驟中移出。使用無菌刮刀將胚從管 中刮出并轉移到 100×15mm 培養皿中的 PHI-B 培養基的平板中。測定胚的朝向, 使得胚軸 在培養基表面上朝下。將具有胚芽的平板在 20℃下于黑暗中培養三天。L- 半胱氨酸可用 于共培養階段。采用標準二元載體, 補充有 100-400mg/L L- 半胱氨酸的共培養培養基對于 回收穩定的轉基因事件是至關重要的。
     3. 選擇推定的轉基因事件 :
     向在 100×15mm 培養皿中的 PHI-D 培養基的平板中轉移 10 個胚芽, 保持朝向, 并 且用 parafilm 將培養皿密封。將平板在黑暗中于 28℃下培養。預計在六至八周將看見作 為黃色胚芽組織的主動生長推定事件。不產生事件的胚可能是棕色和壞死的, 并且幾乎看 不見脆性組織生長。以二 - 三周的間隔將推定的轉基因胚芽組織轉移到新鮮的 PHI-D 平板 上進行傳代培養, 時間間隔取決于生長速度。記錄事件。
     4.T0 植株的再生 :
     將在 PHI-D 培養基上繁殖的胚芽組織轉移到在 100×25mm 培養皿中的 PHI-E 培 養基 ( 體細胞胚芽成熟培養基 ) 中進行傳代培養, 在 28℃于黑暗中培養直至體細胞胚芽成 熟, 培養大約十至十八天。將具有良好限定的盾片和胚芽鞘的個體成熟體細胞胚芽轉移到 PHI-F 胚芽發芽培養基中, 并且在 28℃下于光中 ( 約 80μE, 來自冷光燈或同等熒光燈 ) 培 養。在七至十天, 將約 10cm 高的再生的植株置于盆中的園藝混合物中, 并且使用標準園藝 方法進行耐寒鍛煉 (hardened-off)。
     用于植物轉化的培養基 :
     1.PHI-A : 4g/L CHU 基礎鹽, 1.0mL/L 1000×Eriksson′ s 維生素混合物, 0.5mg/L 鹽酸硫胺, 1.5mg/L 2, 4-D, 0.69g/L L- 脯氨酸, 68.5g/L 蔗糖, 36g/L 葡萄糖, pH5.2。加入 100μM 乙酰丁香酮 ( 過濾滅菌的 )。
     2.PHI-B : PHI-A, 不含有葡萄糖, 將 2, 4-D 增加至 2mg/L, 將蔗糖降低至 30g/L, 并 且補充 0.85mg/L 硝酸銀 ( 過濾滅菌的 ), 3.0g/LGELRITE , 100μM 乙酰丁香酮 ( 過濾滅菌的 ), pH5.8。
     3.PHI-C : PHI-B, 不含 GELRITE 和乙酰丁香酮, 將 2, 4-D 降低至 1.5mg/L, 并且補 充 8.0g/L 瓊脂, 0.5g/L 2-[N- 嗎啉代 ] 乙烷 - 磺酸 (MES) 緩沖液, 100mg/L 羧芐西林 ( 過 濾滅菌的 )。
     4.PHI-D : PHI-C 補充 3mg/L 雙丙氨磷 ( 過濾滅菌的 )。
     5.PHI-E : 4.3g/L Murashige and Skoog(MS) 鹽 (Gibco, BRL 11117-074), 0.5mg/L 煙酸, 0.1mg/L 鹽酸硫胺, 0.5mg/L 鹽酸吡哆醇, 2.0mg/L 甘氨酸, 0.1g/L 肌醇, 0.5mg/L 玉米 素 (Sigma, 目錄 No.Z-0164), 1mg/L 吲哚乙酸 (IAA), 26.4μg/L 脫落酸 (ABA), 60g/L 蔗糖, 3mg/Lbialaphos( 過濾滅菌的 ), 100mg/L 羧芐西林 ( 過濾滅菌的 ), 8g/L 瓊脂, pH5.6。
     6.PHI-F : PHI-E, 不 含 有 玉 米 素、 IAA、 ABA ; 將 蔗 糖 降 低 至 40g/L ; 用 1.5g/L GELRITE 替代瓊脂 ; pH 5.6。 通過首先將組織簇轉移到補充有 0.2mg 每升的 2, 4-D 的 N6 培養基中, 可從該 轉基因愈傷組織再生出植物。兩周后, 可將組織轉移到再生培養基中 (Fromm 等人, Bio/ Technology 8 : 833-839(1990))。
     轉基因 T0 植株可以再生, 并且可以確定其表型。可收集 T1 種子。
     此外, 可通過直接轉化或者從單獨轉化的品系基因滲入而將含有證實的擬南芥屬 基因的重組 DNA 構建體導入玉米自交系內。
     自交或雜交的轉基因植物可通過更嚴苛的大田試驗來研究在氮限制條件下和非 氮限制條件下的產量增加和 / 或穩定性。
     隨后可進行產量分析以測定包含驗證過的擬南芥屬前導基因的植物在與不包含 驗證過的擬南芥屬前導基因的對照植物 ( 或參比植物 ) 進行比較時是否具有產量改善 ( 在 氮限制條件下和非氮限制條件下 )。包含驗證過的擬南芥前導基因的植物在氮限制條件下 將具有比對照植物更少的產量損失, 例如至少 25%更少的產量損失, 或者在非氮限制條件 下將具有比對照植物更高的產量。
     實施例 14A
     用于用經過驗證的候選擬南芥屬基因 (At1g61140) 通過農桿菌屬轉化玉米品系 的表達載體的制備
     使用 INVITROGENTM GATEWAY 技術, 用 GATEWAY 入門克隆進行 LR 重組反應, 所述
     入門克隆具有編碼擬南芥屬包含 SNF2 結構域的蛋白的序列 ( 如實施例 5 所述, 并且在該 實施例和隨后的實施例中稱為 AT-SNF2.1)、 入門克隆 PHP23112(SEQ ID NO : 14)、 入門克隆 PHP20234(SEQ ID NO : 9; 圖 9) 和目的載體 PHP22655(SEQ ID NO : 10) 的序列以生成前體質 粒 PHP29872。PHP29872 包含以下表達盒 :
     1. 表達 PAT 抗除草劑性基因的泛素啟動子 ::moPAT::PinII 終止子盒, 該基因用于 轉化過程期間的選擇。
     2. 表達 DS-RED 顏色標記的 LTP2 啟動子 ::DS-RED2::PinII 終止子盒, 該標記用于 分選種子。 3. 泛素啟動子 ::AT-SNF2.1::PinII 終止子盒過表達擬南芥屬包含 SNF2.1 結構域 的蛋白質 (At1g61140.1)。
     實施例 14B
     用經驗證的候選擬南芥屬基因 (At1g61140) 通過農桿菌屬轉化玉米品系
     使用如實施例 12 和 13 所述的農桿菌介導轉化, 能將存在于載體 PHP29872( 如 14A 所述 ) 中、 或包含其他兩種 At1g61140 突變體中的任一種的載體中的 SNF2.1 表達盒導入玉 米自交系、 或來源于優良玉米自交系的可轉化玉米品系。
     可將表達載體 PHP29872 通過電穿孔導入包含載體 PHP10523(SEQ ID NO : 7, 圖 7) 的 LBA4404 農桿菌屬菌株以制備共整合載體 PHP29875, 該載體包含 SNF2.1 表達盒。共整 合載體通過每個載體上包含的 COS 重組位點重組兩個質粒 PHP29872 和 PHP10523 形成, 并 且除了農桿菌菌株以及農桿菌介導轉化需要的其他基因 (TET、 TET、 TRFA、 ORI 終止子、 CTL、 ORI V、 VIR C1、 VIR C2、 VIR G、 VIR B) 之外, 還包含上述相同的三個表達盒 ( 實施例 14A)。 可使用 ( 但不限于 ) 實施例 12 中的電穿孔規程。
     實施例 15
     用于轉入 Gaspe Flint 衍生的玉米品系的目的載體 PHP23236 的制備
     目的載體 PHP23236( 圖 6, SEQ ID NO : 6) 通過用載體 PHP23235( 圖 8, SEQ ID NO : 8) 轉化農桿菌屬菌株 LBA4404 并分離所得共整合產物而獲取, 所述菌株包含質粒 PHP10523( 圖 7, SEQ ID NO : 7)。
     目的載體 PHP23236 可被用于如實施例 16 所述的與入門克隆的重組反應, 以產生 用于轉化 Gaspe Flint 衍生的玉米品系的玉米表達載體。
     實施例 16
     用于轉入 Gaspe Flint 衍生的玉米品系的表達構建體的制備
     使用 INVITROGENTM GATEWAY LR 重組技術, 可將如實施例 5 所述的相同入門克 隆定向克隆到目的載體 PHP29634(SEQ ID NO : 15 ; 圖 11) 中以形成表達載體。目的載體 PHP29634 與目的載體 PHP23236 是相似的, 但是, 目的載體 PHP29634 具有位點特異性的重 組位點 FRT1 和 FRT87, 并且還編碼用于利用草甘膦對轉化體進行選擇的 GAT4602 選擇性標 記蛋白。該表達載體將包含所述受關注的 cDNA, 其在 UBI 啟動子的控制下編碼 At-SNF2.1、 At-SNF2.2、 或 AtSNF2.3, 并且是農桿菌介導轉化到玉米中的 T-DNA 二元載體, 該載體如本 文所述實施例所述但不受其限制。 實施例 17A
     用驗證過的候選擬南芥屬基因 (At1g61140) 轉化 Gaspe Flint 來源的玉米品系
     為了檢查所得表型, 可轉化玉米植株以過表達擬南芥屬 At1g61140 基因 ( 和來自 其他物種的對應同源物 )。可使用如實施例 16 所述的表達構建體。
     受體植株
     受體植株細胞可來自具有短的生活周期 ( “快速循環” )、 小的個體尺寸以及轉化潛 能高的單一玉米品系。對玉米典型的這些植株細胞是來自可公開獲得的 Gaspe Flint(GF) 品 系 變 種 的 植 株 細 胞。 一 種 可 能 的 候 選 植 株 品 系 變 種 是 GF×QTM(Quick Turnaround Maize( 快速周轉玉米 ), 選擇用于在溫室條件下生長的 Gaspe Flint 的可公開獲得形式 ) 的 F1 雜交種, 其在 Tomes 等人 ( 美國專利申請 10/367,416, 提交于 2003 年 2 月 13 日 ; 美 國專利公開 2003/0221212 A1, 公布于 2003 年 11 月 27 日 ) 中公開。從該品系獲得的轉基 因植株具有如此小的尺寸使得它們可在四英寸的盆中生長 ( 是正常大小的玉米植株所需 空間的 1/4) 并且它們在少于 2.5 個月時間內成熟。( 傳統上, 一旦轉基因植株適應溫室后
     需要 3.5 個月來獲得轉基因 T0 種子。) 另一合適的品系包括但不限于 GS3( 高度可轉化的 品系 )X Gaspe Flint 的雙單倍體品系。還有另一種合適的品系是攜帶引起較早開花、 高度 減小或這兩者的轉基因的可轉化的優良玉米自交系。
     轉化規程
     任何合適的方法可用于將轉基因引入玉米細胞中, 包括但不限于利用基于農桿菌 屬載體的接種類型的步驟 ( 參見例如實施例 12 和 13)。轉化可在受體 ( 靶標 ) 植株的未成 熟胚上進行。
     精確的生長和植株跟蹤
     將由轉化的玉米胚產生的轉基因 (T0) 植株的事件群體在受控的溫室環境中栽 培, 該溫室使用改良的隨機分塊 (block) 設計以降低或消除環境誤差。隨機分塊設計是這 樣一種植株布局, 在該布局中, 實驗植株被分成組 ( 如, 每組三十株植株 ), 稱為塊, 而每株 植株隨塊被隨機分配一個位置。
     對于一組三十株植株, 二十四株轉化的實驗植株和六株對照植株 ( 具有設定好的 表型的植株 )( 總起來說稱為 “重復組” ) 被置于盆中, 這些盆在位于溫室內的桌子上布置成 陣列 ( 也叫做重復組或塊 )。每株植株 ( 對照植株或實驗植株 ) 隨塊被隨機分配一個位置, 所述的塊映射一個唯一的、 溫室物理位置以及映射該重復組。在單次實驗中多個三十株植 株的重復組中的每一個可栽培在相同的溫室中。應該測定重復組的布局 ( 布置方式 ) 以使 對空間的要求最小以及溫室內的環境影響最小。這樣一種布局可稱為壓縮的溫室布局。
     對于加入特定的對照組的一種替代方法是鑒定不表達受關注基因的那些轉基因 植株。可將諸如 RT-PCR 之類的多種技術應用于定量評估引入基因的表達水平。可將不表 達轉基因的 T0 植株與表達轉基因的那些植株進行比較。
     在整個評價過程中鑒定和跟蹤事件群體中的每株植株, 并且從那些植株收集的數 據自動與那些植株相關聯, 使得所搜集的數據可與由該植株攜帶的轉基因關聯。 例如, 每個 植株容器具有機器可讀的標簽 ( 例如通用貨單代碼 (UPC) 條形碼 ), 該標簽包含了關于植物 身份的信息, 身份信息繼而又與溫室位置相關, 使得從植物獲得的數據可自動與該植物相 關聯。
     作為另外一種選擇, 可使用任何有效的、 機器可讀的植物識別系統, 例如二維矩陣 代碼或甚至是射頻識別標簽 (RFID), 其中數據被接收并由射頻接收器 / 處理器進行翻譯。 參見美國專利申請 10/324,288, 提交于 2002 年 12 月 19 日 ( 美國專利公布 2004/0122592 A1, 公布于 2004 年 6 月 24 日 ), 以引用方式并入本文。
     利用三維成像進行表型分析
     對 T0 事件群體中的每株溫室植株 ( 包括任何對照植株 ) 分析所關注的農學特性, 并且以這樣一種方式記錄或存儲每株植株的農學數據, 該方式使得數據與該植株的辨識數 據 ( 見上面 ) 相關聯。可利用與上述類似的實驗設計, 可在 T1 代中完成對表型 ( 基因效 應 ) 的確認。
     在植物的整個溫室生活周期中, 利用定量的非破壞性成像技術在表型水平上來分 析 T0 植株以評估所關注的性狀。任選地, 將數字成像分析儀用于整株植物的自動多維分 析。成像可在溫室內進行。將兩個攝像系統 ( 位于頂部和側面 ) 和用于旋轉植物的裝置用 于從所有側面觀察植物和成像。從每株植物的頂部、 前面和側面采集圖像。所有的三個圖像一起提供了足夠的信息用于評價例如每株植物的生物量、 大小和形態。
     由于植物在第一片葉片從土壤顯現出來時到植物處于它們發育的末期時大小的 改變, 從頂部以較高的放大倍率任選地記錄植物發育的早期。這攝像可通過利用完全由成 像軟件控制的自動變焦鏡頭系統來完成。
     在單次成像分析操縱中, 進行如下事件 : (1) 將植株傳送至分析儀區域內, 旋轉 360 度以便其機器可讀標簽可被讀取, 并且讓其保持靜止直至其葉片停止移動 ; (2) 獲取側 面圖像并將其輸入數據庫 ; (3) 將植株旋轉 90 度并再次讓其保持靜止直至其葉片停止移 動, 以及 (4) 將該植株傳送出分析儀。
     每二十四小時的周期讓植物至少六個小時處于黑暗以便具有正常的白天 / 黑夜 周期。
     成像儀器
     可 使 用 任 何 合 適 的 成 像 儀 器, 包 括 但 不 限 于 可 從 LemnaTec GmbH(Wurselen, Germany) 商購獲得的光譜數字成像儀。 獲取圖像并用具有 1/2″ IT Progressive Scan IEE CCD 成像設備的 LemnaTec Scanalyzer HTS LT-0001-2 進行分析。該成像照相機可配備有 自動變焦、 自動調節光圈和自動聚焦。可利用 LemnaTec 軟件設定所有的照相機設置。任選 地, 對于主要組成成像分析儀的儀器差異小于約 5%, 對于次要組成成像分析儀的儀器差異 小于約 10%。 軟件
     成像分析系統包括用于顏色和構造分析的 LemnaTec HTS Bonit 軟件程序和用于 存儲約 500,000 次分析的數據 ( 包括分析數據 ) 的服務器數據庫。原始圖像和分析過的圖 像儲存在一起以允許用戶根據需要進行再次分析。 可將數據庫連接至成像硬件用于自動的 數據收集和存儲。多種可商購獲得的軟件系統 ( 例如 Matlab, 其他軟件 ) 可用于定量解釋 圖像數據, 并且可將這些軟件體系中的任何一種應用于所述圖像數據集。
     傳送系統
     具有植物旋轉裝置的傳送系統可用于將植物傳送至成像區域并在成像過程中選 擇植物。例如, 將最多四株植物 ( 每株最高高度為 1.5m) 裝上汽車, 該汽車在循環的傳送系 統上行進并通過成像測量區域。在這種情況下, 該單位 ( 成像分析儀和傳送環線 ) 的總占 有面積為約 5m×5m。
     可擴大傳送系統以同時容納更多植物。 將植物沿傳送環線傳送至成像區域并對每 株植物分析最多 50 秒。獲取植物的三個視圖。傳送系統以及成像設備應該能夠用于溫室 環境條件。
     照明
     任何合適的照明模式可用于圖像采集。例如, 可在暗背景上使用頂部照明。作為 另外一種選擇, 可采用使用白色背景的頂部照明和背部照明的組合。應該將被照亮的區域 圍起來以確保恒定的照明條件。 遮蔽物應該長于測量區域使得能保持恒定的光條件而不需 要打開和關閉門。 作為另一種選擇, 可變化照明以引起轉基因 ( 如, 綠色熒光蛋白 (GFP)、 紅 色熒光蛋白 (RFP)) 的激發或者引起內源性 ( 如葉綠素 ) 熒光基團的激發。
     基于三維成像的生物量評價 為了更好地評價生物量, 應該從至少三個軸 ( 任選地, 頂部視圖和兩個側面 ( 側面1 和側面 2) 視圖 ) 獲取植物圖像。然后分析這些圖像以將植物從背景 ( 盆和花粉控制袋 ( 如果適用的話 )) 分離。可通過如下計算評價植物的體積 :
     體積 ( 體素 ) = - √頂部面積 ( 像素 )× √側面 1 面積 ( 像素 )× √側面 2 面積 ( 像素 )
     在上面的等式中, 體積和面積的單位是 “任意單位” 。 在該系統中, 任意單位完全足 以檢測基因對植物大小和生長影響, 因為所需的是檢測與實驗平均值或對照平均值的差值 ( 正較大和負較小兩者 )。大小 ( 如面積 ) 的任意單位可通過將物理參照加入到成像過程 而輕易地轉化成物理量度。例如, 可在頂部成像過程和側面成像過程兩者中均包括已知面 積的物理參照。 基于這些物理參照的面積, 可測定轉換因子以允許從像素轉換為面積單位, 2 例如平方厘米 (cm )。物理參照可以是或可以不是獨立的樣本。例如, 具有已知直徑和高度 的盆足可用作物理參照。
     顏色分類
     成像技術還可用于測定植物顏色以及用于將植物顏色歸為各種衍生類型。 將圖像 顏色歸屬于顏色類型是 LemnaTec 軟件的固有特色。使用其他圖像分析軟件系統, 可通過多 種計算方法測定顏色分類。
     對于植物大小和生長參數的測定, 一種有用的分類方案是定義一種單一顏色方 案, 包括綠色的兩種或三種色調 ( 例如色調是 50-66, 參見圖 13), 此外, 還有關于缺綠病、 壞 死和漂白 ( 在這些條件出現時 ) 的顏色類型。還使用了背景顏色類型, 其包括圖像中的非 植物顏色 ( 例如盆和土壤顏色 ), 并將這些像素特別地從測定大小中排除。 在受控的恒定照 明下分析植物, 使得可以定量一株植物內隨時間推移的任何改變, 或者植物之間或植物不 同分枝之間的任何改變 ( 如季節差異 )。
     除了其在測定植物的大小、 生長中的有效性以外, 顏色分類還可用于評估其他產 量構成性狀。對于這些其他產量構成性狀, 可使用另外的顏色分離方案。例如, 稱為 “保綠 度 (staygreen)” 的性狀 ( 已經將其與產量的提高相關聯 ) 可通過顏色分類來評估, 該顏色 分類將綠色色調與黃色和棕色色調 ( 其指示老化的組織 ) 相分離。通過將這種顏色分類應 用于在 T0 或 T1 植物生活周期末獲取的圖像, 可鑒定綠色的量相對于黃色和棕色 ( 例如, 可 表示為綠色 / 黃色比率 ) 增加的植物。這種綠色 / 黃色比率具有顯著差異的植物可被鑒定 為攜帶影響這種重要農學性狀的轉基因。
     熟練的植物學家將認識到可指示植物健康或應激反應的其他植物顏色 ( 花青素 ) 的出現, 以及認識到其他顏色分類方案可提供對基因在與這些響應相關的性狀方面的作用 的進一步度量。
     植物結構分析
     改變植物結構參數的轉基因也可以用本發明鑒定, 包括諸如最大高度和寬度、 節 間距離、 葉與莖之間的角度、 在節處開始的葉片數以及葉片長度。 LemnaTec 系統軟件可如下 用于測定植物構造。在第一成像步驟中將植物簡化至其主要的幾何構造, 并且隨后基于該 圖像可進行不同構造參數的參數化鑒定。 或者是單獨地或者是組合地修改任何這些構造參 數的轉基因可通過應用此前所述的統計方法來鑒定。
     花粉脫落日期
     花粉脫落日期是轉基因植物中要分析的一個重要參數, 并且可通過活性雄花第一次出現在植物上來測定。為了找到雄花目標, 通過顏色對莖的上端進行分類以檢測黃色或 紫色花藥。然后將這種顏色分類分析用于定義活性花, 活性花繼而可用于計算花粉脫落日 期。
     作為另外一種選擇, 花粉脫落日期和其他易于在視覺上檢測到的植物屬性 ( 如授 粉日期、 第一穗絲日期 ) 可以由負責進行植物看護的工作人員來記錄。為了使數據完整性 和過程效率最大化, 通過利用相同的由 LemnaTec 光譜數字分析設備利用的條形碼來跟蹤 該數據。 可將具有條形碼閱讀器的電腦、 掌上設備或筆記本電腦用于使記錄觀察時間、 植物 標識符的數據捕捉變得容易, 以及使捕捉數據的操作者感覺舒適。
     植物的取向
     以接近商業栽培的密度種植的成熟玉米植物通常具有平面的構造。也就是說, 植 物具有一可清晰分辨的寬的側面和窄的側面。對來自植物寬側的圖像進行測定。對于每株 植物, 給其賦予一個明確界定的基本取向以獲得寬側圖像與窄側 (edgewise) 圖像之間的 最大差別。將頂部圖像用于測定植物的主軸, 而將額外的旋轉裝置用于在開始主圖像采集 前將植物轉至合適的取向。
     實施例 17B
     用玉米同源物轉化 Gaspe Flint 衍生的玉米品系
     使用 INVITROGENTM GATEWAY LR 重組技術, 可制備入門克隆用于任何玉米同源物 (SEQ ID NO : 18/19、 20/21、 22/23、 43/44、 或 45/46)( 入門克隆的制備參見實施例 5), 并能 夠將入門克隆定向克隆到 GATEWAY 目的載體 29634(SEQ ID NO : 15 ; 圖 11) 中以制備對應 的表達載體。每個表達載體將包含處于 UBI 啟動子控制下的所關注的 cDNA, 并且將是用 于農桿菌屬介導的向玉米內的轉化的 T-DNA 二元載體, 所述玉米如但不限于本文所述的實 例。 實施例 18
     在氮限制條件下對玉米品系的篩選
     Gaspe Flint 來源的玉米品系
     轉基因植物可含有兩個或三個劑量的 Gaspe Flint-3 與一個劑量的 GS3(GS3/ (Gaspe-3)2X 或 GS3/(Gaspe-3)3X), 并且對于顯性轉基因會以 1 ∶ 1 分離。將轉基因植物 在 100% Turface( 一種商業栽培培養基 ) 中栽培, 每天用 1mM KNO3 生長培養基和 2mM KNO3 或更高的生長培養基澆灑四次 ( 參見圖 14)。 在 1mM KNO3 培養基中培養的對照植物的綠度 較小, 產生較少的生物量并且在開花期具有較小的穗 ( 關于樣本數據的示例請參見圖 15)。 Gaspe 來源的品系將生長至開花期。
     將用統計學確定處理株之間所觀察到的差異是否真有差異。圖 15 示出了一種方 法, 該方法將字母放在數值后面。同一列中其后具有相同字母 ( 不是字母組 ) 的那些值不 具有顯著的差異。 使用該方法, 如果在一列中的值的后面沒有字母, 則該列中的這些值的任 何之間不存在顯著的差異, 換句話講, 該列中的所有這些值是均等的。
     與無效轉基因相比較, 轉基因的表達將導致植物在 1mM KNO3 中具有改善的植物生 長。因此生物量和綠度 ( 如實施例 2 和 17A 所述 ) 將在生長期間進行監控, 并與無效轉基 因植物比較。生長、 綠度、 開花期穗的大小的改善將表明氮耐受性增強。
     幼苗測定
     還可采用幼苗測定對轉基因玉米植物進行評估, 所述測定對植物在氮限制條件 下的表現進行評估。例如, 在 18 天幼苗測定中, 轉基因植物被種植于商品化盆栽培養基 Turface 中, 然后用包含下列營養物質的溶液每天澆四次 : 1mM CaCl2、 2mM MgSO4、 0.5mM KH2PO4、 83ppmSprint330、 3mM KCl、 1mM KNO3、 1μM ZnSO4、 1μM MnCl2、 3μM H3BO4、 0.1μM CuSO4 和 0.1μM NaMoO4。植物在種植后 18 天收獲, 并且評價多個性狀, 包括但不限于 : SPAD( 綠度 )、 莖直徑、 根干重、 苗干重、 總干重、 mg 氮每克干重 (mg N/g dwt)、 以及植物氮濃 度。采用 Studentt 檢驗, 以 0.1 的最小值 (P < t) 比較平均值和無效轉基因平均值參數。
     實施例 19
     氮利用效率幼苗檢測分析法
     利用種子顏色標記將轉基因事件的種子分成了轉基因的 ( 處理 1 ; 包含構建體 PHP29875) 和無效的 ( 處理 2) 種子。
     每一處理 ( 轉基因的或批無效的 ) 被隨機分配至 54 個盆 ( 實驗單位 ) 組成的區 塊中, 所述盆按 6 行 9 列排列。重復每個處理 ( 轉基因或批無效的 )9 次。
     將所有種子種在 4 英寸的方盆中, 盆中包含在 8 英寸交錯中心上的 Turface, 每天 用包含以下營養物質的溶液澆灌四次 :
     1mM CaCl2 2mM MgSO4 0.5mM KH2PO4 83ppm Sprint330
     3mM KCl 1mM KNO3 1μM ZnSO4 1μM MnCl2
     3μM H3BO4 1μM MnCl2 0.1μM CuSO4 0.1μM NaMoO4
     植物出苗后, 將其間苗至每盆一個種子。 在收獲時從盆中移除植物, 并且將蒙脫石 從根部洗脫。使根與苗分開, 把根置于紙袋中并且在 70℃干燥 70 小時。將干燥后的植物部 分 ( 根和苗 ) 稱重并置于 50mL 的圓錐管中, 管中有大約 20 5/32 英寸的鋼球, 在涂料振蕩 器中進行振蕩研磨。
     The Nitrogen/Protein Analyzer 來自 Thermo Electron Corporation 的氮 / 蛋 白質分析器 ( 型號 FlashEA 1112N) 使用約 30mg 的基本組織。樣品從自動取樣機被點樣至 氧化反應室內部的坩堝內。在 900℃和純氧條件下, 樣品被強烈的放熱反應氧化, 產生 N2、 CO2、 H2O 和 SO2 的混合氣體。燃燒結束后, 打開載氣氦, 使氣體混合物流入還原反應室。在 680℃, 使氣體混合物流過還原銅, 其中可能形成的氮氧化物被轉化為氮元素而過量的氧氣 被保留。所述氣體混合物從還原反應器流出, 依次經過兩個吸收過濾器。第一個過濾器包 含堿石灰, 留住了二氧化碳和二氧化硫。 第二個過濾器包含分子篩和顆粒狀的硅膠, 以阻止 水通過。 然后, 氮被洗脫進色譜柱, 并被轉至熱導率檢測器, 熱導率檢測器生成電子信號, 所 述電子信號經 Eager 300 軟件的適當處理, 提供了氮 - 蛋白質百分比。
     利用這些數據, 測量了下列參數, 并且采用 Student t 檢驗將轉基因組的參數的平 均值與無效組的參數的平均值進行了比較。
     利用方差分析 (ANOVA) 計算和完全隨機設計 (CRD) 模型, 計算了每一區塊內的方 差。使用 F 統計, 通過將總區塊處理平均面積除以總區塊誤差平均面積對每個區塊計算了 總處理效應。計算了更大的 Student′ s t 檢驗的概率用于比較每個轉基因平均值與合適 的無效轉基因平均值。顯示顯著差異的變量 (*) 具有最小值 (P < t)0.1。
     表 5 示出原始數據和包含構建體 PHP29875 的植物的雙尾 Student’ s t 概率。p 值的數學符號反映所述事件對相應的無效組的相對表現, 即 ‘+’ =提高的表現, ‘-’ =降低 的表現。比較轉基因事件和構建體無效轉基因。無效的構建體是陰性的入門構建體, 其由 來自陰性分離子的果仁的抽樣組成, 并因此是全部陰性的代表性樣本。
     表5: PHP29875 的溫室幼苗測定數據
     實施例 20A
     具有擬南芥屬前導基因或玉米同源物的玉米品系的產量分析
     自交或頂交雜交體的轉基因植物可通過更嚴苛的大田試驗來研究在氮限制條件 下和無氮限制條件下的產量增加和 / 或穩定性。標準化的產量試驗將通常包括 4 至 6 次重 復, 以及至少 4 個位置。
     可進行產量分析以測定與構建體無效的或野生型的對照 ( 或參考 ) 植物相比, 包 含編碼包含 SNF2 結構域的蛋白的經驗證擬南芥屬基因或相關玉米基因的植物是否具有產 量表現方面的提高 ( 在氮限制或非氮限制條件下 )。具體地講, 對于包含經驗證的擬南芥 前導基因或 lnt6 的玉米同源物的植物和對照植物, 可于開花和 / 或灌漿時期施加氮限制條 件。可以測得這兩種植物的產量都有所減少。包含驗證過的擬南芥屬前導基因或其玉米同 源物的植物在氮限制條件下將具有比對照植物更少的產量損失, 或者在非氮限制條件下將 具有比對照植物更高的產量。
     實施例 20B
     用 PHP29875 轉化的玉米品系的產量分析
     玉米測交雜種包含存在于載體 PHP29875 中的擬南芥前導基因 ( 編碼包含 SNF2 結 構域的多肽 ) 的表達盒, 并且它們的對照植物于 2008 年和 2009 年在多個位置的低氮 (LN) 和標準氮 (NN) 環境下生長。基于由 Federal and State Extension 服務對特定生長區域 確定的土壤測試標準, 低氮 (LN) 環境指氮量少于在早春或夏季施加的標準氮肥的量, 而標
     準氮 (NN) 環境指加入正常產量所需的充足的氮。與 NN 條件中獲得的產量相比, 在 LN 條件 中觀察到了產量的降低。就該分析而言, 構建體無效組是由來自一種構建體的全部事件的 陰性分離子組成的負輸入, 批無效組是由來自一次實驗的全部構建體的全部陰性分離子組 成的負輸入。
     2008 年在 York, NE(YK) 和 Woodland, CA(WO) 兩個地點對九個轉基因事件進行了 大田試驗, 并評估了產量。玉米測交雜交體被用于與構建體無效的 (CN) 相比較。2008 年大 田試驗的結果顯示于表 6 中。
     表6
     用 PHP29875 轉化的玉米的 2008 年大田試驗
     測量單位為蒲式耳 / 英畝。
     陰影代表與構建體無效 (CN) 相比較顯著性較高的 (P < 0.1) 結果。
     粗體代表與構建體無效 (CN) 相比較顯著性較低的 (P < 0.1) 結果。
     九個以前測試的轉基因事件中有八個是 2009 年在以下位置進行的大田測試 : York, NE(YK) ; Marion, IA(MR)Woodland, CA(WO) ; Dallas Center, IA(DS) ; 和 Princeton, IN(PR)。然而, 在 2009 年玉米測交雜種與批無效 (BN) 進行比較。2009 年大田試驗的結果 顯示于表 7 中。 在 York, 在低氮條件下三個事件顯示產量比批無效顯著提高, 在標準氮條件 下一個事件顯示產量比批無效顯著提高。在 Woodland, 在低氮條件下一個事件具有比批無 效顯著更高的產量。在 Marion, 在低氮條件下三個事件的產量比批無效顯著更高。
     表7
     用 PHP29875 轉化的玉米的 2009 年大田試驗
     測量單位為蒲式耳 / 英畝。
     陰影代表與批無效 (BN) 相比較顯著性較高的 (P < 0.1) 結果。
     黑體代表與批無效 (BN) 相比較顯著性較低的 (P < 0.1) 結果。
     實施例 21
     用經驗證的前導基因的大豆同源物對大豆進行的轉化和評估
     基于同源性搜索, 可鑒定驗證過的擬南芥屬前導基因的一個或若干個候選大豆同 源物, 并且還可評估它們增加大豆氮限制條件耐受性的能力。 載體構建、 植物轉化和表型分 析將類似于上文實施例所述的規程。
     實施例 22
     用經驗證的前導基因的玉米同源物對玉米進行的轉化和評估
     基于同源性搜索, 可鑒定經驗證的擬南芥屬前導基因的一個或若干個候選的玉米 同源物 ( 例如 SEQ ID NO : 18/19、 20/21、 22/23、 43/44 或 45/46), 并且還評估它們增加玉米 氮限制條件耐受性的能力。載體構建、 植物轉化和表型分析可類似于上文實施例所述的規 程。
     實施例 23
     用驗證過的前導基因的玉米和大豆同源物轉化擬南芥屬
     可將驗證過的擬南芥屬前導基因的大豆和玉米同源物在 35S 啟動子的控制下轉 化到擬南芥屬中, 并且當在低氮培養基中生長時分析其葉片面積和綠色區積聚。可如本文 實施例所述進行載體構建和植物轉化。檢測分析的條件、 數據采集和數據分析可類似于上 文實施例所述的規程。
     本專利申請要求提交于 2009 年 3 月 27 日的美國臨時申請 61/163,887 的權益, 其 全部內容以引用方式并入本文。
    【發明領域】
     本發明領域涉及植物育種和遺傳學, 具體地講涉及植物中可用的賦予氮利用效率 和 / 或氮限制條件耐受性的重組 DNA 構建體。
     發明背景
     世界范圍內非生物脅迫顯著地限制了作物產量。據評估, 這些因素累積地造成平 均 70%的農業產量減少。植物是固著的, 必須適應它們周邊的主要環境條件。這已經導致 它們發展出基因調控、 形態發生和代謝的高可塑性。適應和防御機制策略涉及激活編碼對 適應或防御不同脅迫具有重要作用的蛋白。 植物氮吸收在它們的生長中起到重要作用 (Gallais 等人, J.Exp.Bot.55(396) : 295-306(2004))。 植物從環境中的無機氮合成氨基酸。 因此, 氮肥已經成為提高栽培植物如 玉米和大豆的產量有力工具。為了避免硝酸鹽污染并保持足夠的利潤率, 如今農民期望減 少氮肥的使用。如果能提高植物的氮同化能力, 然后就能期望植物生長和產量的提高。概 括地說, 具有更好的氮利用效率 (NUE) 的植物品種是所期望的。
     可利用激活標記來鑒定能影響性狀的基因。 已經在模型植物擬南芥屬中使用該方 法 (Weigel 等人, Plant Physiol.122 : 1003-1013(2000))。插入轉錄增強子元件能夠顯著 激活和 / 或提高附近內源基因的表達。這種方法可以用于鑒定特定性狀 ( 例如植物的氮利 用效率 ) 的受關注的基因, 當所述基因經轉基因進入生物中時可改變該性狀。
     發明概述
     本發明包括 :
     在一個實施方案中, 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物, 所述重組 DNA 構建體 包含可操作地連接到至少一種調控元件的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基 酸序列的多肽, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%的序列同一性, 并且 其中所述植物在與不包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出提高的氮脅 迫耐受性。
     在另一個實施方案中, 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物, 所述重組 DNA 構建 體包含可操作地連接到至少一種調控元件的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種氨 基酸序列的多肽, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%的序列同一性, 并且其中所述植物在與不包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出至少一 種農學特性的改變。任選地, 在氮限制條件下與未包含所述重組 DNA 構建體的所述對照植
     可利用激活標記來鑒定能影響性狀的基因。 已經在模型植物擬南芥屬中使用該方 法 (Weigel 等人, Plant Physiol.122 : 1003-1013(2000))。插入轉錄增強子元件能夠顯著 激活和 / 或提高附近內源基因的表達。這種方法可以用于鑒定特定性狀 ( 例如植物的氮利 用效率 ) 的受關注的基因, 當所述基因經轉基因進入生物中時可改變該性狀。
     發明概述
     本發明包括 :
     在一個實施方案中, 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物, 所述重組 DNA 構建體 包含可操作地連接到至少一種調控元件的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基 酸序列的多肽, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%的序列同一性, 并且 其中所述植物在與不包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出提高的氮脅 迫耐受性。
     在另一個實施方案中, 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物, 所述重組 DNA 構建 體包含可操作地連接到至少一種調控元件的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種氨 基酸序列的多肽, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%的序列同一性, 并且其中所述植物在與不包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出至少一 種農學特性的改變。任選地, 在氮限制條件下與未包含所述重組 DNA 構建體的所述對照植
     物比較時, 所述植物表現出所述至少一種農學特性的所述改變。所述至少一種農學特性可 以是產量、 生物量、 或它們二者, 并且所述改變可以是提高。
     在另一個實施方案中, 本發明包括本發明的任何植物, 其中所述植物選自玉米、 大 豆、 向日葵、 高粱、 低芥酸菜籽 (canola)、 小麥、 苜蓿、 棉花、 稻、 大麥、 小米、 甘蔗和柳枝稷。 。
     在另一個實施方案中, 本發明包括本發明的任何植物的種子, 其中所述種子在其 基因組中包含重組 DNA 構建體, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少一種調控元 件的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%的序列同一性, 并且其中所述種子產生的植物在與不包 含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出提高的氮脅迫耐受性或至少一種農 學特性的改變, 或者兩者皆有。 所述至少一種農學特性可以是產量、 生物量、 或二者, 并且所 述改變可以是提高。
     在另一個實施方案中, 提高植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 將重組 DNA 構建體引入到可再生的植物細胞中, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接到至少一 種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽, 所述氨基酸 序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%的序列同一性 ; (b) 在步驟 (a) 之后, 從所 述可再生的植物細胞再生出轉基因植物, 其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體 ; 以及 (c) 獲取來源于步驟 (b) 的轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在 其基因組中包含所述重組 DNA 構建體并且在與不包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行 比較時表現出提高的氮脅迫耐受性。
     在另一個實施方案中, 評價植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 獲取轉 基因植物, 其中所述轉基因植物在其基因組中包含重組 DNA 構建體, 所述重組 DNA 構建體包 含可操作地連接至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序 列的多肽, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%的序列同一性 ; (b) 獲取 來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構 建體 ; 以及 (c) 評價所述子代植物在與不包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時 的氮脅迫耐受性。
     在另一個實施方案中, 測定植物農學特性的改變的方法, 所述方法包括 (a) 獲取 轉基因植物, 其中所述轉基因植物在其基因組中包含重組 DNA 構建體, 所述重組 DNA 構建體 包含可操作地連接至至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基 酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%的序列同一性, 其中所 述轉基因植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體 ; (b) 獲取來源于所述轉基因植物的 子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體 ; 以及 (c) 測定所述子 代植物在與不包含所述重組 DNA 構建體的對照植物比較時是否表現出至少一種農學特性 的改變。任選地, 所述測定步驟 (c) 包括測定所述轉基因植物在氮限制條件下與不包含所 述重組 DNA 構建體的對照植物比較時是否表現出至少一種農學特性的改變。所述至少一種農學特性可以是產量、 生物量、 或二者, 并且所述改變可以是提高。
     在另一個實施方案中, 本發明包括本發明的任何方法, 其中所述植物選自玉米、 大 豆、 向日葵、 高粱、 低芥酸菜籽、 小麥、 苜蓿、 棉花、 稻、 大麥、 小米、 甘蔗和柳枝稷。
     在另一個實施方案中, 本發明包括分離的多核苷酸, 所述分離的多核苷酸包含 : (a) 編碼包含 SNF2 結構域的多肽的核苷酸序列, 其中所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 36、 38、 或 46 進行比較時, 具有至少 50%, 55%, 60%, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 或 95 %的序列同一性, 或者 (b) 所述核苷酸序列的全 長互補序列, 其中所述全長互補序列和所述核苷酸序列由相同數目的核苷酸組成并且是 100%互補的。所述多肽可包含氨基酸序列 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 36、 38、 或 46。所述核苷 酸序列可包含核苷酸序列 SEQ ID NO : 18、 20、 22、 35、 37、 或 45。
     在另一個實施方案中, 本發明涉及包含本發明任何分離的多核苷酸的重組 DNA 構 建體, 所述分離的多核苷酸可操作地連接到至少一種調控序列, 并且本發明涉及包含所述 重組 DNA 構建體的細胞、 植物和種子。所述細胞可以是真核細胞, 例如酵母、 昆蟲或植物細 胞, 或者是原核細胞, 例如細菌細胞。
     附圖簡述和序列表 根據以下的詳細描述和附圖以及序列表, 可更全面地理解本發明, 以下的詳細描 述和附圖以及序列表形成本申請的一部分。
     圖 1 示出 pHSbarENDs2 激活標記構建體的圖譜, 該構建體用于制備擬南芥屬種群 (SEQ ID NO : 1)。
     圖 2 示出載體 pDONRTMZeo(SEQ ID NO : 2), GATEWAY 供體載體的圖譜。attP1 位點
     圖 1 示出 pHSbarENDs2 激活標記構建體的圖譜, 該構建體用于制備擬南芥屬種群 (SEQ ID NO : 1)。
     圖 2 示出載體 pDONRTMZeo(SEQ ID NO : 2), GATEWAY 供體載體的圖譜。attP1 位點
    位于核苷酸 570-801 ; attP2 位點位于核苷酸 2754-2985( 互補鏈 )。
     圖 3 示出載體 pDONRTM221(SEQ ID NO : 3), GATEWAY 供體載體的圖譜。attP1 位點 位于核苷酸 570-801 ; attP2 位點位于核苷酸 2754-2985( 互補鏈 )。 圖 4 示出載體 pBC-yellow(SEQ ID NO : 4) 的圖譜, 該載體是用于構建擬南芥屬表 達載體的目的載體。attR1 位點位于核苷酸 11276-11399( 互補鏈 ) ; attR2 位點位于核苷 酸 9695-9819( 互補鏈 )。
     圖 5 示出載體 PHP27840(SEQ ID NO : 5) 的圖譜, 該載體是用于構建大豆表達載體 的目的載體。attR1 位點位于核苷酸 7310-7434 ; attR2 位點位于核苷酸 8890-9014。
     圖 6 示出載體 PHP23236(SEQ ID NO : 6) 的圖譜, 它是用于構建 Gaspe Flint 來源 的玉米品系的表達載體的目的載體。attR1 位點位于核苷酸 2006-2130 ; attR2 位點位于核 苷酸 2899-3023。
     圖 7 示 出 載 體 PHP10523(SEQ ID NO : 7) 的 圖 譜, 該載體是存在于農桿菌菌 株 LBA4404 中 的 質 粒 DNA(Komari 等 人, Plant J.10 : 165-174(1996) ; NCBI 通 用 標 識 號 59797027)。
     圖 8 示出載體 PHP23235(SEQ ID NO : 8) 的圖譜, 它是用于構建目的載體 PHP23236 的載體。
     圖 9 示出載體 PHP20234(SEQ ID NO : 9) 的圖譜。
     圖 10 示出目的載體 PHP22655(SEQ ID NO : 10) 的圖譜。
     圖 11 示出目的載體 PHP29634(SEQ ID NO : 15) 的圖譜, 該載體用于構建用于 Gaspe
     圖 5 示出載體 PHP27840(SEQ ID NO : 5) 的圖譜, 該載體是用于構建大豆表達載體 的目的載體。attR1 位點位于核苷酸 7310-7434 ; attR2 位點位于核苷酸 8890-9014。
     圖 6 示出載體 PHP23236(SEQ ID NO : 6) 的圖譜, 它是用于構建 Gaspe Flint 來源 的玉米品系的表達載體的目的載體。attR1 位點位于核苷酸 2006-2130 ; attR2 位點位于核 苷酸 2899-3023。
     圖 7 示 出 載 體 PHP10523(SEQ ID NO : 7) 的 圖 譜, 該載體是存在于農桿菌菌 株 LBA4404 中 的 質 粒 DNA(Komari 等 人, Plant J.10 : 165-174(1996) ; NCBI 通 用 標 識 號 59797027)。
     圖 8 示出載體 PHP23235(SEQ ID NO : 8) 的圖譜, 它是用于構建目的載體 PHP23236 的載體。
     圖 9 示出載體 PHP20234(SEQ ID NO : 9) 的圖譜。
     圖 10 示出目的載體 PHP22655(SEQ ID NO : 10) 的圖譜。
     圖 11 示出目的載體 PHP29634(SEQ ID NO : 15) 的圖譜, 該載體用于構建用于 Gaspe
     Flint 來源的玉米品系的表達載體。
     圖 12 示出用于篩選的五個品系 ( 標記為 1 至 5- 每個品系有十一個個體 ), 加上野 生型對照品系 C1( 九個個體 ) 的典型網格圖案。
     圖 13 示出通過圖像分析測定的若干個不同硝酸鉀濃度對植物顏色的效應。綠色 區 ( 色調 50 至 66) 對氮劑量的響應證明該區可被用于指示氮同化作用。
     圖 14 顯示實施例 18 中用于半水耕玉米生長的生長培養基。
     圖 15 是列出不同硝酸鹽濃度對實施例 18 中 Gaspe Flint 衍生的玉米系生長和發 育的影響相關的數據的圖表。
     圖 16A-AM 示出擬南芥 (Arabidopsis thaliana) 包含 SNF2 結構域的多肽 (SEQ ID NO : 25、 27、 和 29) 以及它們的同源物 (SEQ ID NO : 19、 21、 23、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 和 49) 的全長氨基酸序列的多重比對。
     圖 17 示出圖 16A-AM 中顯示的每對氨基酸序列的序列同一性百分比和趨異值的圖 表。
     序列描述以及所附序列表遵循如 37C.F.R.§1.821-1.825 所列出的關于專利申 請中核苷酸和 / 或氨基酸序列公開的規定。此序列表中以單個字母表示核苷酸, 以三字 母表示氨基酸, 如 Nucleic Acids Res.13 : 3021-3030(1985) 和 Biochemical J.219(2) : 345-373(1984) 中, 它們引入本文以供參考。 用于核苷酸和氨基酸序列數據的符號和格式遵 循在 37C.F.R.§1.822 中所列出的規定。 表 1 列出了本文所述的某些多肽、 包含編碼多肽全部或其主要部分的核酸片段的 cDNA 克隆的命名、 以及在所附序列表中使用的對應標識符 (SEQ ID NO : )。
     表1
     包含 SNF2 結構域的多肽
     表1
     包含 SNF2 結構域的多肽
    
     SEQ ID NO : 1 是 pHSbarENDs2 激活標記載體的核苷酸序列 ( 圖 1)。
     SEQ ID NO : 2 是 pDONRTMZeo 構建體的核苷酸序列 ( 圖 2)。
     SEQ ID NO : 3 是 pDONRTM221 構建體的核苷酸序列 ( 圖 3)。
     SEQ ID NO : 4 是 pBC-yellow 載體的核苷酸序列 ( 圖 4)。
     SEQ ID NO : 5 是 PHP27840 載體的核苷酸序列 ( 圖 5)。
     SEQ ID NO : 6 是目的載體 PHP23236 的核苷酸序列 ( 圖 6)。
     SEQ ID NO : 7 是 PHP10523 載體的核苷酸序列 ( 圖 7)。
     SEQ ID NO : 8 是 PHP23235 載體的核苷酸序列 ( 圖 8)。
     SEQ ID NO : 9 是 PHP20234 載體的核苷酸序列 ( 圖 9)。
     SEQ ID NO : 10 是目的載體 PHP22655 的核苷酸序列 ( 圖 10)。
     SEQ ID NO : 11 是用于替代在 pHSbarENDs2 的位點 5775 處的 PacI 限制性位點的 多接頭核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 12 是 attB1 序列的核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 13 是 attB2 序列的核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 14 是入門克隆 PHP23112 的核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 15 是 PHP29634 載體的核苷酸序列 ( 圖 11)。
     SEQ ID NO : 16 是正向引物 VC062。
     SEQ ID NO : 17 是反向引物 VC063。
     SEQ ID NO : 18-23( 參見表 1)。
     SEQ ID NO : 24 是 編 碼 包 含 擬 南 芥 SNF 結 構 域 的 蛋 白 突 變 體 1(SNF2.1) (At1g61140.1 ; NCBI 通用標識號 186492169) 的基因核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 25 是 包 含 擬 南 芥 SNF 結 構 域 的 蛋 白 突 變 體 1( 本 文 稱 為 SNF2.1)
     SEQ ID NO : 2 是 pDONRTMZeo 構建體的核苷酸序列 ( 圖 2)。
     SEQ ID NO : 3 是 pDONRTM221 構建體的核苷酸序列 ( 圖 3)。
     SEQ ID NO : 4 是 pBC-yellow 載體的核苷酸序列 ( 圖 4)。
     SEQ ID NO : 5 是 PHP27840 載體的核苷酸序列 ( 圖 5)。
     SEQ ID NO : 6 是目的載體 PHP23236 的核苷酸序列 ( 圖 6)。
     SEQ ID NO : 7 是 PHP10523 載體的核苷酸序列 ( 圖 7)。
     SEQ ID NO : 8 是 PHP23235 載體的核苷酸序列 ( 圖 8)。
     SEQ ID NO : 9 是 PHP20234 載體的核苷酸序列 ( 圖 9)。
     SEQ ID NO : 10 是目的載體 PHP22655 的核苷酸序列 ( 圖 10)。
     SEQ ID NO : 11 是用于替代在 pHSbarENDs2 的位點 5775 處的 PacI 限制性位點的 多接頭核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 12 是 attB1 序列的核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 13 是 attB2 序列的核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 14 是入門克隆 PHP23112 的核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 15 是 PHP29634 載體的核苷酸序列 ( 圖 11)。
     SEQ ID NO : 16 是正向引物 VC062。
     SEQ ID NO : 17 是反向引物 VC063。
     SEQ ID NO : 18-23( 參見表 1)。
     SEQ ID NO : 24 是 編 碼 包 含 擬 南 芥 SNF 結 構 域 的 蛋 白 突 變 體 1(SNF2.1) (At1g61140.1 ; NCBI 通用標識號 186492169) 的基因核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 25 是 包 含 擬 南 芥 SNF 結 構 域 的 蛋 白 突 變 體 1( 本 文 稱 為 SNF2.1)
     (At1g61140.1 ; NCBI 通用標識號 186492170) 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 26 是 編 碼 包 含 擬 南 芥 SNF 結 構 域 的 蛋 白 突 變 體 2(SNF2.2) (At1g61140.2 ; NCBI 通用標識號 186492171) 的基因的核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 27 是 包 含 擬 南 芥 SNF 結 構 域 的 蛋 白 突 變 體 2( 本 文 稱 為 SNF2.2) (At1g61140.2 ; NCBI 通用標識號 186492172) 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 28 是 編 碼 包 含 擬 南 芥 SNF 結 構 域 的 蛋 白 突 變 體 3(SNF2.3) (At1g61140.3 ; NCBI 通用標識號 186492174) 的基因的核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 29 是 包 含 擬 南 芥 SNF 結 構 域 的 蛋 白 突 變 體 3( 本 文 稱 為 SNF2.3) (At1g61140.3 ; NCBI 通用標識號 186492175) 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 30 是 水 稻 (Oryza sativa) 推 定 ATP 酶 蛋 白 (NCBI 通 用 標 識 號 53792213) 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 31 是水稻 (Oryza sativa) 假定蛋白 OsI_28047(NCBI 通用標識號 218200575) 的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 32 是水稻 (Oryza sativa) 蛋白 ( 通用標識號 90399293) 的氨基酸序 列。
     SEQ ID NO : 33 是 At1g61140.1-5’ attB 正向引物的核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 34 是 At1g61140.1-3′ attB 反向引物的核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 35-38( 參見表 1)。
     SEQ ID NO : 39 是來自琴葉擬南芥 (Arabidopsis lyrata) 的 At1g61140.1 基因 ( 在 phytozome 網站上的轉錄物標識號 47522) 的核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 40 是由 SEQ ID NO : 39 編碼的蛋白的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 41 是來自琴葉擬南芥 (Arabidopsis lyrata) 的 At1g11100.1 基因 ( 在 phytozome 網站上的轉錄物標識號 471244) 的核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 42 是由 SEQ ID NO : 41 編碼的蛋白的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 43 是 在 公 共 BAC c0566n04 上 的 包 含 SNF2 結 構 域 的 玉 米 基 因 的 FGENESH 預測序列。
     SEQ ID NO : 44 是由 SEQ ID NO : 43 編碼的蛋白的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 45 是 SEQ ID NO : 43 的人工編輯版本, 其中 SEQ ID NO : 43 與來自其他 物種的序列進行比對并進行人工編輯以除去推定內含子。
     SEQ ID NO : 46 是由 SEQ ID NO : 45 編碼的蛋白的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 47 是水稻 (Oryza sativa) 基因座 Os01g57110.2( 包含 SNF2 家族 N- 末 端結構域的蛋白 ) 的核苷酸序列。
     SEQ ID NO : 48 是由 SEQ ID NO : 49 編碼的蛋白的氨基酸序列。
     SEQ ID NO : 49 是高粱 (Sorghum bicolor) 假定蛋白 ( 基因座 Sb03g036380 ; NCBI 通用標識號 242058897) 的氨基酸序列。
     發明詳述
     本文中所列出的每篇參考文獻的公開內容的全文以引用的方式并入本文。
     本文以及所附權利要求書中所用的單數形式 “一個” 、 “一種” 和 “所述” 包括復數指 代, 除非上下文中清楚地另有指明。因此, 例如, “一株植物” 的涵義包括多株此類植物, “一個細胞” 的涵義包括一個或多個細胞及本領域的技術人員已知的等同物, 等等。
     如本文所用 :
     術語 “單子葉植物” 和 “單子葉的” 植物本文互換使用。本發明的單子葉植物包括 禾本科植物。
     術語 “雙子葉植物” 和 “雙子葉的植物” 本文互換使用。本發明的雙子葉植物包括 以下家族 : 十字花科植物、 豆科植物、 和茄科植物。
     術語 “全長互補序列” 和 “全長的互補序列” 本文互換使用, 指給定核苷酸序列的 互補序列, 其中所述互補序列和核苷酸序列由相同數目的核苷酸組成并且是 100%互補的。
     “性狀” 指植物或特定植物材料或細胞的生理學、 形態學、 生物化學、 或物理學特 征。在某些情況下, 這種特征是人眼可見的, 例如種子或植物大小, 或者能夠通過生物化學 技術測量, 例如檢測種子或葉片的蛋白質、 淀粉、 或油含量, 或者通過觀察代謝或生理過程, 如通過測量缺水耐受性或特定鹽或糖濃度的耐受性, 或者通過觀察一個或多個基因的表達 水平, 或者通過農學觀察如滲透脅迫耐受性或產量。
     “氮限制條件” 指其中可用氮總量 ( 例如來自硝酸鹽、 氨、 或其他已知氮源的氮 ) 不 足以維持植物的最佳生長和發育的條件。 本領域的技術人員將會識別其中總可用氮足以維 持植物最佳生長和發育的條件。本領域的技術人員將會識別什么組成足夠量的總可用氮, 什么組成用于向植物提供氮的土壤、 培養基和肥料輸入。 取決于許多因素, 氮限制條件將發 生變化, 包括但不限于特定的植物和環境條件。 “農學特性” 是可測量的參數, 包括但不限于綠度、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時 的鮮重、 成熟時的干重、 果實產量、 種子產量、 總植物含氮量、 果實含氮量、 種子含氮量、 營養 組織含氮量、 總植物游離氨基酸含量、 營養組織游離氨基酸含量、 果實游離氨基酸含量、 種 子游離氨基酸含量、 總植物蛋白質含量、 果實蛋白質含量、 種子蛋白質含量、 營養組織蛋白 質含量、 耐旱性、 氮攝取、 根倒伏抗性、 收獲指數、 莖倒伏、 植株高度、 穗高、 穗長、 鹽耐受性、 早期幼苗活力和低溫脅迫下的出苗
     能夠測量增加的生物量, 例如測量植株高度、 植物總葉片面積、 植物鮮重、 植物干 重或植物種子產量與對照植物相比的增加。
     提高植物生物量或植物尺寸的能力將具有若干個重要的商業應用。 可生成產量較 高的作物品種, 產生較高的產量, 例如在其中營養組織部分用作食物、 生物燃料或以上兩種 用途的植物中。
     增大的葉片尺寸可受到特別的關注。 增加的葉片生物量能夠用于提高植物來源的 制藥或工業產品的產量。總植物光合作用的提高通常通過增加植物葉片面積來完成。附加 的光合作用容量可用于提高特定植物組織來源的產量, 包括葉片、 根、 果實或種子、 或者允 許植物在較低光強度下或高光強度下生長。
     另一種組織 ( 例如根組織 ) 的生物量的改變可用于改善植物在嚴酷環境條件下生 長的能力, 包括干旱或營養缺乏條件, 因為較大的根系可較好的獲取水或營養物質或吸收 水或營養物質。
     就一些觀賞植物而言, 將高度期望提供較大品種的能力。就包括果樹、 產木材樹 木、 或者觀賞或防風樹木和灌木在內的多種植物而言, 尺寸增加以產量提高或防護效果改 善的形式提供改善的有益效果。
     能夠測量增加的生物量, 例如測量植株高度、 植物總葉片面積、 植物鮮重、 植物干 重或植物種子產量與對照植物相比的增加。
     提高植物生物量或植物尺寸的能力將具有若干個重要的商業應用。 可生成產量較 高的作物品種, 產生較高的產量, 例如在其中營養組織部分用作食物、 生物燃料或以上兩種 用途的植物中。
     增大的葉片尺寸可受到特別的關注。 增加的葉片生物量能夠用于提高植物來源的 制藥或工業產品的產量。總植物光合作用的提高通常通過增加植物葉片面積來完成。附加 的光合作用容量可用于提高特定植物組織來源的產量, 包括葉片、 根、 果實或種子、 或者允 許植物在較低光強度下或高光強度下生長。
     另一種組織 ( 例如根組織 ) 的生物量的改變可用于改善植物在嚴酷環境條件下生 長的能力, 包括干旱或營養缺乏條件, 因為較大的根系可較好的獲取水或營養物質或吸收 水或營養物質。
     就一些觀賞植物而言, 將高度期望提供較大品種的能力。就包括果樹、 產木材樹 木、 或者觀賞或防風樹木和灌木在內的多種植物而言, 尺寸增加以產量提高或防護效果改 善的形式提供改善的有益效果。
     “收獲指數” 指粒重除以總株重。
     “SNF2 結構域” 存在于涉及轉錄控制、 DNA 修復、 和重組的 ATP 依賴型染色質重塑 蛋白中。它們包含存在于 DNA/RNA 解旋酶超家族 II 中的七個保守序列基序。
     編碼包含 SNF2 結構域的蛋白的基因無限制地包括擬南芥基因座 At1g61140 的三 個突變體 (SEQ ID NO : 24、 26、 和 28), 本文分別稱為 snf2.1、 snf2.2、 和 snf2.3, 以及來自 其他植物物種的核苷酸同源物, 包括但不限于玉米 (Zea mays)、 琴葉擬南芥 (Arabidopsis lyrata)、 畫 眉 草 (Eragrostis nindensis)(Resurrection grass)、 百 喜 草 (Paspalum notatum)(Bahiagrass)、 和水稻 (Oryza sativa)(SEQ ID NO : 18、 20、 22、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 和 47)。
     編碼包含 SNF2 結構域的蛋白無限制地包括由 SEQ ID NO : 24、 26、 和 28 編碼的蛋 白 ( 并且本文分別稱為 SNF2.1、 SNF2.2、 和 SNF2.3), 以及來自其他植物物種的蛋白同源物, 包括但不限于玉米 (Zea mays)、 琴葉擬南芥 (Arabidopsis lyrata)、 畫眉草 (Eragrostis nindensis)(Resurrection grass)、百 喜 草 (Paspalum notatum)(Bahiagrass)、水 稻 (Oryza sativa) 和高粱 (Sorghum bicolor)(SEQ ID NO : 19、 21、 23、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 和 49)。 本文所用的 “剪接變體” 指由基因轉錄的 RNA 的供選擇的替代形式。剪接變體作 為供選擇的位點在單個轉錄 RNA 分子內或在分開轉錄的 RNA 分子之間被剪接的結果天然發 生, 并且可導致從相同基因轉錄的 mRNA 的若干個不同形式。因此, 剪接不同可編碼具有不 同氨基酸序列的多肽, 它們在生物體內可具有相似功能也可不具有相似功能。
     “氮脅迫耐受性” 是植物的性狀, 指植物在氮限制條件下存活的能力。
     植物 “提高的氮脅迫耐受性” 相對于參照或對照植物進行測量, 并意指植物的氮脅 迫耐受性在與參照或對照植物進行比較時提高的任何量或量度。
     “氮脅迫耐受性植物” 是指表現出氮脅迫耐受性的植物。氮脅迫耐受性植物可為在 氮限制條件下相對于對照植物至少在一種農學特性上表現出提高的植物。
     “環境條件” 指植物生長的條件, 例如水的可用性、 營養物質 ( 例如氮 ) 的可用性或 者昆蟲或病害的存在。
     “轉基因” 指其基因組因異源核酸 ( 如重組 DNA 構建體 ) 的存在而發生改變的任何 細胞、 細胞系、 愈傷組織、 組織、 植物部分或植物, 包括那些最初的轉基因事件以及從最初的 轉基因事件通過有性雜交或無性生殖而產生的那些。如本文所用的術語 “轉基因” 不涵蓋 通過常規植物育種方法或通過諸如隨機異花受精、 非重組病毒感染、 非重組細菌轉化、 非重 組轉座或自發突變之類的自然發生事件導致的基因組 ( 染色體基因組或染色體外基因組 ) 改變。
     “基因組” 在用于植物細胞時不僅涵蓋存在于細胞核中的染色體 DNA, 而且還包括 存在于細胞的亞細胞組分 ( 如線粒體、 質粒 ) 中的細胞器 DNA。
     “植物” 包括整個植株、 植物器官、 植物組織、 種子和植物細胞以及同一植株的子 代。植物細胞包括但不限于得自下列物質的細胞 : 種子、 懸浮培養物、 胚、 分生區域、 愈傷組 織、 葉、 根、 芽、 配子體、 孢子體、 花粉和小孢子。
     “子代” 包括植物的任何后續世代。
     “轉基因植物” 包括在其基因組內包含異源多核苷酸的植物。例如異源多核苷酸被
     穩定地整合進基因組中, 使得該多核苷酸傳遞至連續的世代。異源多核苷酸可單獨地或作 為重組 DNA 構建體的部分整合進基因組中。
     針對序列而言的 “異源” 意指來自外來物種的序列, 或者如果來自相同物種, 則指 通過蓄意的人為干預而從其天然形式發生了組成和 / 或基因座的顯著改變的序列。
     “多核苷酸” 、 “核酸序列” 、 “核苷酸序列” 或 “核酸片段” 可互換使用, 并且指作為 單鏈或雙鏈的 RNA 或 DNA 聚合物, 任選含有合成的、 非天然的或改變的核苷酸堿基。核苷酸 ( 通常以它們的 5′ - 單磷酸形式存在 ) 通過它們的單字母命名指代如下 : “A” 指腺苷酸或 脫氧腺苷酸 ( 分別用于 RNA 或 DNA), “C” 指胞苷酸或脫氧胞苷酸, “G” 指鳥苷酸或脫氧鳥苷 酸, “U” 指尿苷酸, “T” 指脫氧胸苷酸, “R” 指嘌呤 (A 或 G), “Y” 指嘧啶 (C 或 T), “K” 指G或 T, “H” 指 A 或 C 或 T, “I” 指肌苷, “N” 指任何核苷酸。
     “多肽” 、 “肽” 、 “氨基酸序列” 和 “蛋白質” 在本文中可互換使用, 指氨基酸殘基的聚 合物。 該術語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是相應的天然存在的氨基酸的人工化學類 似物的氨基酸聚合物, 以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。術語 “多肽” 、 “肽” 、 “氨基酸 序列” 和 “蛋白質” 還可包括修飾, 包括但不限于糖基化、 脂質連接、 硫酸鹽化、 谷氨酸殘基的 γ 羧化、 羥化和 ADP- 核糖基化。 “信使 RNA(mRNA)” 指無內含子并且可通過細胞翻譯成蛋白質的 RNA。
     “cDNA” 指與 mRNA 模板互補并且利用逆轉錄酶從 mRNA 模板合成的 DNA。cDNA 可為 單鏈的或者可用 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段轉化成雙鏈形式。
     “表達序列標簽” (“EST” ) 是得自 cDNA 文庫的 DNA 序列, 并且因此是已經被轉錄 的序列。EST 通常通過 cDNA 插入序列單程測序獲取。將完整的 cDNA 插入序列稱為 “全長 插入序列” (“FIS” )。 “重疊群” 序列是由選自, 但不限于 EST、 FIS 和 PCR 序列的兩個或更 多個序列裝配成的序列。將編碼完整或功能性蛋白的序列稱為 “完全基因序列” (“CGS” ), 該序列能得自 FIS 或重疊群。
     “成熟” 蛋白指經翻譯后加工的多肽, 即已經去除了存在于初始翻譯產物中的任何 前肽或肽原的多肽。
     “前體” 蛋白質指 mRNA 的初級翻譯產物, 即前肽和肽原仍然存在。前肽和原肽可為 并且不限于細胞內定位信號。
     “分離的” 指物質, 例如核酸和 / 或蛋白質, 該物質基本上不含在天然存在的環境中 通常伴隨該物質或與其反應的組分, 或者說是該物質被從所述組分移出。分離的多核苷酸 可從它們天然存在于其中的宿主細胞純化。 技術人員已知的常規核酸純化方法可用于獲取 分離的多核苷酸。該術語也涵蓋重組多核苷酸和化學合成的多核苷酸。
     “重組” 指兩個分離的不同序列片段的人工組合, 例如通過基因工程技術化學合成 或通過操縱分離的核酸片段合成。 “重組體” 也包括細胞或載體, 它們已經通過引入異源核 酸進行了修改, 或者來源于進行如此修改的細胞, 但是不涵蓋由自然發生事件 ( 例如自發 突變、 自然轉化 / 轉導 / 轉座 ) 改變的細胞或載體, 例如那些無蓄意的人為干預產生的細胞 或載體。
     “重組 DNA 構建體” 指在自然界中通常不會一起存在的核酸片段的組合。因此, 重 組 DNA 構建體可包含源于不同來源的調控序列和編碼序列, 或源于相同來源但以不同于通 常天然存在的方式排列的調控序列和編碼序列。
     術語 “入門克隆” 和 “入門載體” 本文可互換使用。
     “調控序列” 和 “調控元件” 可互換使用, 并且指位于編碼序列的上游 (5′非編碼 序列 )、 中間或下游 (3′非編碼序列 ), 并且影響相關編碼序列的轉錄、 RNA 加工或穩定性或 者翻譯的核苷酸序列。 調控序列可包括但不限于啟動子、 翻譯前導序列、 內含子和多腺苷酸 化識別序列。
     “啟動子” 指能夠控制另一核酸片段轉錄的核酸片段。
     “在植物中有功能的啟動子” 指能夠控制植物細胞中的轉錄的啟動子, 無論其是否 來源于植物細胞。
     “組織特異性啟動子” 和 “組織優選啟動子” 可以互換使用, 并且指主要但非必須專 一地在一種組織或器官中表達, 但是也可以在一種特定細胞中表達的啟動子。
     “發育調控啟動子” 指其活性由發育事件決定的啟動子。
     術語 “可操作地連接” 指核酸片段連接成單一片段, 使得其中一個核酸片段的功能 受到另一個核酸片段的調控。 例如, 在啟動子能夠調節核酸片段的轉錄時, 該啟動子與該核 酸片段進行了可操作地連接。
     “表達” 指功能產物的產生。因此, 核酸片段的表達可指核酸片段的轉錄 ( 如生成 mRNA 或功能 RNA 的轉錄 ) 和 / 或 mRNA 翻譯成前體或成熟蛋白質。
     “表型” 意指細胞或生物體的可檢測的特征。
     有關將核酸片段 ( 例如重組 DNA 構建體 ) 插入細胞內的 “引入” 意指 “轉染” 或 “轉 化” 或 “轉導” , 并且包括指將核酸片段整合進真核或原核細胞中, 在該細胞中核酸片段可整 合進細胞的基因組 ( 如染色體、 質粒、 質體或線粒體 DNA) 內, 轉變成自主的復制子或瞬時表 達 ( 如轉染的 mRNA)。
     “轉化細胞” 是將核酸片段 ( 如重組 DNA 構建體 ) 引入其中的任何細胞。
     在此所用的 “轉化” 指穩定轉化和瞬時轉化兩者。
     “穩定轉化” 指將核酸片段引入宿主生物體的基因組中, 導致基因穩定遺傳。一旦 穩定轉化, 核酸片段穩定地整合進宿主生物體和任何連續世代的基因組中。
     “瞬時轉化” 指將核酸片段引入宿主生物體的核中或包含 DNA 的細胞器中, 引起基 因表達而沒有基因穩定遺傳。
     “等位基因” 是占據染色體上給定位點的基因的幾種供選擇替代形式的其中一種。 當二倍體植物中一對同源染色體上給定基因座上存在的等位基因相同時, 該植物在該基因 座處是純合的。如果二倍體植物中一對同源染色體上給定基因座上存在的等位基因不同, 則該植物在該基因座處是雜合的。 如果轉基因存在于二倍體植物中一對同源染色體中的其 中之一上, 則該植物在該基因座處是半合子的。
     “葉綠體轉運肽” 是與蛋白質共同被翻譯, 并將該蛋白質導向葉綠體或導向該蛋白 質在其中被生成的細胞中的其他質體類型的氨基酸序列。 “葉綠體轉運序列” 是指編碼葉 綠體轉運肽的核苷酸序列。 “信號肽” 是一種與蛋白質共同被翻譯并將蛋白導向分泌系統 的氨基酸序列 (Chrispeels, (1991)Ann.Rev.Plant Phys.Plant Mol.Biol.42 : 21-53)。如 果將所述蛋白導向液泡, 可另外加上液泡靶向信號 ( 同上 ), 或者如果將所述蛋白導向內質 網, 可加上內質網駐留信號 ( 同上 )。如果將蛋白導向細胞核, 將移除任何存在的信號肽并 用以核定位信號替代 (Raikhel, (1992)Plant Phys.100 : 1627-1632)。 “線粒體信號肽” 是指導前體蛋白質導進入線粒體中的氨基酸序列 (Zhang 和 Glaser(2002)Trends Plant Sci 7: 14-21)。
     序列比對和同一性百分比可用設計用于檢測同源序列的多種比較方法來測定, 這些方法包括但不限于 LASERGENE 生物信息計算包 (DNASTAR Inc., Madison, WI) 的 MEGALIGN 程序。除非另外說明, 本文提供的序列的多重比對用 Clustal V 比對方法 (Higgins 和 Sharp, CABIOS. : 5: 151-153(1989)) 采用默認參數 ( 空位罰分= 10, 空位長度 罰分= 10) 執行。用 Clustal V 方法進行成對比對和蛋白質序列的百分比同一性計算的默 認參數為 KTUPLE = 1、 缺口罰分= 3、 窗口 (WINDOW) = 5 和 DIAGONALS SAVED = 5。對于核 酸, 這些參數為 KTUPLE = 2, 缺口罰分= 5, 窗口= 4 和 DIAGONALS SAVED = 4。在序列比對 后, 使用 Clustal V 程序, 通過參閱相同程序上的 “序列距離” 表可能獲得 “百分比同一性” 和 “趨異度” 值; 除非另外說明, 本文提供的和申明的同一性百分比和趨異度是以該方式計 算。
    本文使用的標準重組 DNA 和分子克隆技術是本領域所熟知的并且在如下文獻 中有更全面的描述 : Sambrook, J., Fritsch, E.F. 和 Maniatis, T.Molecular Cloning : A Laboratory Manual ; Cold Spring Harbor Laboratory Press : Cold Spring Harbor, 1989( 下文稱為 “Sambrook” )。現在來看實施方案 :
     實施方案包括分離的多核苷酸和多肽、 重組 DNA 構建體、 包含這些重組 DNA 構建體 的組合物 ( 例如植株或種子 ) 以及利用這些重組 DNA 構建體的方法。
     分離的多核苷酸和多肽
     本發明包括下列分離的多核苷酸和多肽 :
     分離的多核苷酸包含 : (i) 編碼多肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 36、 38、 或 46 進行比較時具有至少 50%、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96%、 97%、 98%、 99%、 或 100%的序列同一性 ; 或 (ii)(i) 的核酸序列的全長互補序列, 其 中 (i) 的核酸序列的全長互補序列由相同數目的核苷酸組成并且是 100%互補的。任一上 述分離的多核苷酸可用于本發明的任何重組 DNA 構建體 ( 包括抑制 DNA 構建體 )。所述多 肽是包含 SNF2 結構域的蛋白。
     分離的多肽, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 36、 38、 或 46 進行比較時具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%、 或 100%的序列同一 性。所述多肽是包含 SNF2 結構域的蛋白。
     分離的多核苷酸, 包括 : (i) 基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 18、 20、 22、 35、 37、 或 45 進行比較時具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、
     74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%、 或 100%的序列同一性的 核酸序列 ; 或 (ii)(i) 的核酸序列的全長互補序列。任一上述分離的多核苷酸可用于本發 明的任何重組 DNA 構建體 ( 包括抑制 DNA 構建體 )。所述分離的多核苷酸編碼包含 SNF2 結 構域的蛋白。
     重組 DNA 構建體和抑制 DNA 構建體
     在一個方面, 本發明包括重組 DNA 構建體 ( 包括抑制 DNA 構建體 )。
     在一個實施方案中, 重組 DNA 構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列 ( 如, 在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸包括 : (i) 核酸序列, 所述核酸 序列編碼的氨基酸序列基于 ClustalV 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或 100%的序列同一性 ; 或 (ii)(i) 的核酸序列的全長互補序列。 在另一個實施方案中, 重組 DNA 構建體包含可操作地連接至至少一種調控序列 ( 如, 在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸包括 : (i) 核酸序列, 所述 核酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 18、 20、 22、 24、 26、 28、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 或 47 進行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57%、 58%、 59%、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%序列同一性 ; 或 (ii)(i) 的核酸序列的全長互補序列。
     在另一個實施方案中, 重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少一種調控序列 ( 如, 在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼包含 SNF2 結構域的蛋白。
     在另一方面, 本發明包括抑制 DNA 構建體。
     抑制 DNA 構建體可包含至少一種調控序列 ( 例如植物中有功能的啟動子 ), 該調 控序列可操作地連接至 (a) 以下序列的全部或部分 : (i) 編碼多肽的核酸序列, 所述多肽的 氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%的序列 同一性, 或 (ii)(a)(i) 的核酸序列的全長互補序列 ; 或者 (b) 源自受關注靶基因的有義鏈 或反義鏈的全部或部分的區域, 當與所述區域所來源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較 時, 基于 Clustal V 比對方法, 所述區域的核酸序列具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或
     100%的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的蛋白 ; 或 (c) 以 下序列的全部或部分 : (i) 核酸序列, 基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 18、 20、 22、 24、 26、 28、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 或 47 進行比較時, 所述多肽的氨基酸序列具有至少 50%、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或 100 %的序列同一性, 或 (ii)(c)(i) 核酸序列的全長互補序列。 抑制 DNA 構建體可包含共抑制構建體、 反義構建體、 病毒抑制構建體、 發夾抑制構建體、 莖 環抑制構建體、 產生雙鏈 RNA 的構建體、 RNAi 構建體或小 RNA 構建體 ( 如, siRNA 構建體或 miRNA 構建體 )。
     應當理解 ( 正如本領域技術人員將會理解的 ), 本發明不僅僅涵蓋這些具體的示 例性序列。 導致給定位點處產生化學上等價的氨基酸但不影響所編碼多肽的功能特性的核 酸片段中的改變是本領域眾所周知的。因此, 氨基酸丙氨酸 ( 一種疏水性氨基酸 ) 的密碼 子可被編碼另一個疏水性較弱的殘基 ( 例如甘氨酸 ) 或疏水性較強的殘基 ( 例如纈氨酸、 亮氨酸或異亮氨酸 ) 的密碼子取代。類似地, 導致一個帶負電荷的殘基替換為另一個帶負 電荷的殘基 ( 例如, 天冬氨酸替代谷氨酸 ) 或者一個帶正電荷的殘基替換為另一個帶正電 荷的殘基 ( 例如, 賴氨酸替換精氨酸 ) 的改變也可預期產生功能上等價的產物。導致多肽 分子的 N 末端和 C 末端部分改變的核苷酸變化也將預計不會改變多肽的活性。所提出的修 飾中的每一種均完全在本領域常規技術內, 如測定編碼產物生物活性的保留情況。
     “抑制 DNA 構建體” 是在轉化或穩定整合進植物基因組時, 導致該植物中的靶基因 “沉默” 的重組 DNA 構建體。靶基因可為植物內源基因或植物轉基因。如本文針對靶基因所 使用的, “沉默” 通常指在由靶基因表達的 mRNA 或蛋白質 / 酶的水平上的抑制, 和 / 或在酶 活性或蛋白質功能性的水平上的抑制。術語 “抑制” 和 “沉默” 本文互換使用, 包括降低、 減 少、 下降、 減小、 抑制、 除去或阻止。 “沉默” 或 “基因沉默” 不指具體機制, 它包括但不限于反 義、 共抑制、 病毒抑制、 發夾抑制、 莖 - 環抑制、 基于 RNAi 的方法、 以及基于小 RNA 的方法。
     抑制 DNA 構建體可包含源自受關注的靶基因的區域并且可包含受關注的靶基因 的有義鏈 ( 或反義鏈 ) 的核酸序列的全部或部分。取決于所要采用的方法, 該區域可與 受關注基因的有義鏈 ( 或反義鏈 ) 的全部或部分 100 %相同或者具有少于 100 %的同一 性 ( 如, 具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 或 99%同一性 )。
     抑制 DNA 構建體是本領域所熟知的, 一旦選定受關注的靶基因就很容易構建, 并 且包括但不限于共抑制構建體、 反義構建體、 病毒抑制構建體、 發夾抑制構建體、 莖環抑制 構建體、 產生雙鏈 RNA 的構建體, 以及更通常的是, RNAi(RNA 干擾 ) 構建體和小 RNA 構建體, 例如 siRNA( 短干擾 RNA) 構建體和 miRNA( 微 RNA) 構建體。
     “反義抑制” 指產生能夠抑制靶基因或基因產物表達的反義 RNA 轉錄物。 “反義 RNA” 指與靶初級轉錄物或 mRNA 的全部或部分互補, 并阻斷分離的靶核酸片段表達的 RNA 轉錄物 ( 美國專利 5,107,065)。 反義 RNA 可與特定基因轉錄物的任何部分, 即 5′非編碼序列、 3′非編碼序列、 內含子或編碼序列互補。
     “共抑制” 指產生能夠抑制靶基因或基因產物表達的有義 RNA 轉錄物。 “有義” RNA 指包括 mRNA 的 RNA 轉錄物, 它能夠在細胞內或體外被翻譯成蛋白。此前, 已通過著眼于以 有義方向過表達與內源 mRNA 具有同源性的核酸序列 ( 其導致與過表達的序列具有同源性 的所有 RNA 減少 ) 設計出了植物中的共抑制構建體 ( 參見 Vaucheret 等人, Plant J.16 : 651-659(1998) ; 和 Gura, Nature 404 : 804-808(2000))。
     另一種變型描述了將植物病毒序列用于引導對近端 mRNA 編碼序列的抑制 ( 于 1998 年 8 月 20 日公開的 PCT 公開 WO 98/36083)。
     RNA 干擾是指由短干擾性 RNA(siRNA) 介導的動物中序列特異性轉錄后基因沉默 的過程 (Fire 等人, Nature 391 : 806(1998))。 在植物中的對應過程通常稱為轉錄后基因沉 默 (PTGS) 或 RNA 沉默, 并且在真菌中也稱為阻抑作用 (quelling)。 據信轉錄后基因沉默過 程是用于防止外來基因表達的進化保守性細胞防御機制, 并且通常由不同植物區系和門所 共有 (Fire 等人, Trends Genet.15 : 358(1999))。
     小 RNA 在控制基因表達中起重要作用。很多發育過程 ( 包括開花 ) 的調節是由小 RNA 控制的。現在有可能通過使用在植物中產生小 RNA 的轉基因構建體來以工程手段改變 植物基因的基因表達。
     小 RNA 似乎是通過與互補 RNA 或 DNA 靶序列堿基配對來行使功能的。當與 RNA 結 合時, 小 RNA 或者引發靶序列的 RNA 裂解或者引發翻譯抑制。當與 DNA 靶序列結合時, 據信 小 RNA 可介導靶序列的 DNA 甲基化。無論具體機制是什么, 這些事件的后果是基因表達受 到抑制。
     微 RNA(miRNA) 是長度為約 19 至約 24 個核苷酸 (nt) 的已經在動物和植物中鑒 定出的非編碼 RNA(Lagos-Quintana 等人, Science 294 : 853-858(2001), Lagos-Quintana 等 人, Curr.Biol.12 : 735-739(2002) ; Lau 等 人, Science 294 : 858-862(2001) ; Lee 和 Ambros, Science 294 : 862-864(2001) ; Llave 等 人, Plant Cell 14 : 1605-1619(2002) ; Mourelatos 等 人, Genes. 偏 差 16 : 720-728(2002) ; Park 等 人, Curr.Biol.12 : 1484-1495(2002) ; Reinhart 等人, Genes. 偏差 16 : 1616-1626(2002))。它們是由大小為大 約 70 至 200nt 的較長的前體轉錄物加工生成的, 并且這些前體轉錄物能夠形成穩定的發夾 結構。
     微 RNA(miRNA) 看起來通過與位于由這些基因產生的轉錄物中的互補序列結合來 調節靶基因。看來似乎 miRNA 可能以至少兩種途徑進入靶基因調控 : (1) 翻譯抑制 ; 和 (2) RNA 裂解。進入 RNA 裂解途徑的微 RNA 與在動物中 RNA 干擾 (RNAi) 期間以及在植物中轉 錄后基因沉默 (PTGS) 期間產生的 21-25nt 短干擾 RNA(siRNA) 類似, 并且可能整合進與在 RNAi 情況中觀察到的復合物類似或相同的 RNA- 誘導的沉默復合物 (RISC) 內。
     調控序列 :
     本發明的重組 DNA 構建體 ( 包括抑制 DNA 構建體 ) 可包含至少一種調控序列。
     調控序列可為啟動子。
     多種啟動子可用于本發明的重組 DNA 構建體 ( 及抑制 DNA 構建體 ) 中。可根據所 需結果來選擇啟動子, 并且可包括用于在宿主生物體中表達的組成型啟動子、 組織特異性 啟動子、 誘導型啟動子或其他啟動子。在多數情況下引起基因在大多數細胞型中表達的啟動子通常稱為 “組成型啟動子” 。 雖然候選基因當通過組成型啟動子驅動表達時可預測其效應, 但候選基因在 35S 或 UBI 啟動子控制下的高水平、 組成型表達可以 ( 或可以不 ) 具有多重效應。使用組織特 異和 / 或脅迫特異啟動子可消除不需要的效應但保留氮耐受性的能力。在擬南芥屬中已經 觀察到了對干旱和寒冷耐受性的這種類型的效應 (Kasuga 等人, Nature Biotechnol.17 : 287-91(1999))。
     適用于植物宿主細胞的組成型啟動子包括 ( 例如 )Rsyn7 啟動子的核心啟動子 和在 WO 99/43838 和美國專利 6,072,050 中公開的其他組成型啟動子 ; CaMV 35S 核心 啟動子 (Odell 等人, Nature 313 : 810-812(1985)) ; 稻肌動蛋白啟動子 (McElroy 等人, Plant Cell 2 : 163-171(1990)) ; 泛 素 啟 動 子 (Christensen 等 人, Plant Mol.Biol.12 : 619-632(1989) 和 Christensen 等 人, Plant Mol.Biol.18 : 675-689(1992)) ; pEMU 啟 動 子 (Last 等 人, Theor.Appl.Genet.81 : 581-588(1991)) ; MAS 啟 動 子 (Velten 等 人, EMBO J.3 : 2723-2730(1984)) ; ALS 啟動子 ( 美國專利 5,659,026) 等。其他組成型啟動子包括 例 如 在 美 國 專 利 5,608,149、 5,608,144、 5,604,121、 5,569,597、 5,466,785、 5,399,680、 5,268,463、 5,608,142 和 6,177,611 中公開的那些啟動子。
     在選擇啟動子用于本發明方法時, 可能有利的是使用組織特異性啟動子或發育調 控啟動子。
     組織特異性啟動子或發育調節啟動子是這樣的 DNA 序列 : 該序列調節 DNA 序列選 擇性地在對雄穗發育、 結籽或兩者重要的植物細胞 / 組織中表達, 并限制這種 DNA 序列只在 植物的雄穗發育或種子成熟期間表達。 任何引起所需時空表達的可鑒定啟動子均可用于本 發明的方法中。
     可用于本發明的種子或胚芽特異性啟動子包括大豆 Kunitz 胰蛋白酶抑制劑啟動 子 (Kti3, Jofuku 和 Goldberg, Plant Cell 1 : 1079-1093(1989))、 馬鈴薯塊莖特異蛋白啟 動子 (patatin 啟動子 )( 馬鈴薯塊莖 )(Rocha-Sosa, M. 等人, EMBO J.8 : 23-29(1989))、 convicilin 啟動子、 豌豆球蛋白啟動子、 豆球蛋白啟動子 ( 豌豆子葉 )(Rerie, W.G. 等人, Mol.Gen.Genet.259 : 149-157(1991) ; Newbigin, E.J. 等人, Planta 180 : 461-470(1990) ; Higgins, T.J.V. 等人, Plant.Mol.Biol.11 : 683-695(1988))、 玉米蛋白啟動子 ( 玉米胚 乳 )(Schemthaner, J.P. 等人, EMBO J.7 : 1249-1255(1988))、 菜豆蛋白啟動子 ( 菜豆子葉 ) (Segupta-Gopalan, C. 等人, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82 : 3320-3324(1995))、 植物血 球凝集素啟動子 ( 菜豆子葉 )(Voelker, T. 等人, EMBO J.6 : 3571-3577(1987))、 B- 伴球蛋 白啟動子和大豆球蛋白啟動子 ( 大豆子葉 )(Chen, Z-L 等人, EMBO J.7 : 297-302(1988))、 谷 蛋白啟動子 ( 大米胚乳 )、 大麥醇溶蛋白啟動子 ( 大麥胚乳 )(Marris, C. 等人, Plant Mol. Biol.10 : 359-366(1988))、 麥谷蛋白啟動子和麥醇溶蛋白啟動子 ( 小麥胚乳 )(Colot, V. 等 人, EMBO J.6 : 3559-3564(1987))、 和甘薯貯藏蛋白啟動子 ( 甘薯塊根 )(Hattori, T. 等人, Plant Mol.Biol.14 : 595-604(1990))。 可操作地連接至嵌合基因構建體異源編碼區的種子 特異性基因的啟動子在轉基因植物中保持它們的時空表達模式。 這樣的實施例包括在擬南 芥屬和甘藍型油菜 (Brassica napus) 種子中表達腦啡肽的擬南芥 2S 種子儲藏蛋白基因啟 動子 (Vanderkerckhove 等人, Bio/Technology 7 : L929-932(1989))、 表達熒光素酶的菜豆
     凝集素和 β- 菜豆蛋白啟動子 (Riggs 等人, Plant Sci.63 : 47-57(1989)), 以及表達氯霉素 乙酰轉移酶的小麥谷蛋白啟動子 (Colot 等人, EMBO J.6 : 3559-3564(1987))。
     可誘導啟動子響應內源性或外源性刺激的存在, 例如, 通過化合物 ( 化學誘導 劑 ), 或響應環境、 激素、 化學信號和 / 或發育信號而選擇性表達可操作地連接的 DNA 序列。 可誘導的或受調控的啟動子包括 ( 例如 ) 受光、 熱、 脅迫、 水澇或干旱、 植物激素、 創傷或諸 如乙醇、 茉莉酮酸酯、 水楊酸或安全劑之類的化學品調控的啟動子。
     本發明使用的啟動子包括以下啟動子 : 1) 脅迫誘導型 RD29A 啟動子 (Kasuga 等 人, Nature Biotechnol.17 : 287-91(1999)) ; 2) 大 麥 啟 動 子 B22E ; B22E 的 表 達 是 發 育中的玉米籽粒中的柄所特異性的 (“Primary Structure of a Novel Barley Gene Differentially Expressed in Immature Aleurone Layers( 在未成熟糊粉層中差異表 達的新大麥基因的一級結構” , Klemsdal 等人, Mol.Gen.Genet.228(1/2) : 9-16(1991)) ; 以 及 3) 玉米啟動子 Zag2(“Identification and molecular characterization of ZAG1, the maize homolog of the Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUS(ZAG1- 擬南 芥屬花同源異形基因 AGAMOUS 的玉米同系物的鑒定和分子表征 )” , Schmidt 等人, Plant Cell 5(7) : 729-737(1993) “ ;Structural characterization, chromosomal localization and phylogenetic evaluation of two pairs of AGAMOUS-like MADS-box genes from maize” (“兩對來自玉米的 AGAMOUS 樣 MADS-box 基因的結構表征、 染色體定位及系統發育 評價 )” , Theissen 等人, Gene 156(2) : 155-166(1995) ; NCBI GenBank 登錄號 X80206))。 Zag2 轉錄物可在授粉前五天至授粉后天數 (“DAP” ) 七至八天被檢測到, 并且引導 Ciml 在 發育中的雌花序心皮中表達, Ciml 對發育中的玉米籽粒的籽仁而言是特異性的。Ciml 轉錄 物在授粉前四到五天至六到八 DAP 被檢測到。其他可用的啟動子包括可源自其表達與發育 中的雌小花母系相關的基因的任何啟動子。
     用于調控本發明的核苷酸序列在植物中表達的啟動子是莖特異性啟動子。這種 莖特異性啟動子包括苜蓿 S2A 啟動子 (GenBank 登錄號 : EF030816 ; Abrahams 等人, Plant Mol.Biol.27 : 513-528(1995)) 和 S2B 啟動子 (GenBank 登錄號 : EF030817) 等等, 將這些文 獻以引用的方式并入本文。
     啟動子可整體源于天然基因, 或者由源于天然存在的不同啟動子的不同元件構 成, 或者甚至可包含合成的 DNA 片段。
     用于本發明的啟動子可包括 : RIP2、 mLIP15、 ZmCOR1、 Rab17、 CaMV 35S、 RD29A、 B22E、 Zag2、 SAM 合成酶啟動子、 泛素啟動子、 CaMV 19S、 nos、 Adh、 蔗糖合成酶啟動子、 R- 等 位基因啟動子、 維管組織的其他啟動子 S2A(Genbank 登陸號 EF030816) 和 S2B(Genbank 登錄號 EF030817) 及來自玉米的組成型啟動子 GOS2。其他啟動子包括根啟動子, 例如玉 米 NAS2 啟動子、 玉米 Cyclo 啟動子 (US 公布 2006/0156439, 公開于 2006 年 7 月 13 日 )、 玉米 ROOTMET2 啟動子 (WO 2005/063998, 公開于 2005 年 7 月 14 日 )、 CR1BIO 啟動子 (WO 2006/055487, 公開于 2006 年 5 月 26 日 )、 CRWAQ81(WO 2005/035770, 公開于 2005 年 4 月 21 日 ) 和玉米 ZRP2.47 啟動子 (NCBI 登錄號 U38790 ; NCBI GI No.1063664)。
     本發明的重組 DNA 構建體 ( 及抑制 DNA 構建體 ) 也可包括其他調控序列, 包括但 不限于翻譯前導序列、 內含子和多腺苷酸化識別序列。 在本發明的另一個實施方案中, 本發 明的重組 DNA 構建體還包括增強子或沉默子。內含子序列可加至 5’ 非翻譯區、 蛋白編碼區或 3’ 非翻譯區以增加積聚在胞漿中 的成熟信息的量。已經顯示, 在植物和動物兩者的表達構建體的轉錄單位中包含可剪接內 含子可使基因表達在 mRNA 和蛋白質水平上均增強高達 1000 倍 (Buchman 和 Berg, Mol.Cell Biol.8 : 4395-4405(1988) ; Callis 等人, Genes Dev.1 : 1183-1200(1987))。
     任何植物都可以選擇用來鑒定將用于本發明重組 DNA 構建體的調控序列和基因。 適用于分離基因和調控序列的靶植物的實例應該包括但不限于苜蓿、 蘋果、 杏、 擬南芥屬植 物、 洋薊、 芝麻菜、 蘆筍、 鱷梨、 香蕉、 大麥、 豆類、 甜菜、 黑莓、 藍莓、 西蘭花、 抱子甘藍、 卷心 菜、 低芥酸菜籽、 香瓜、 胡蘿卜、 木薯、 蓖麻、 菜花、 芹菜、 櫻桃、 菊苣、 芫荽、 柑桔類、 克萊門氏 小柑橘類、 三葉草、 椰子、 咖啡、 玉米、 棉、 蔓越莓、 黃瓜、 花旗松、 茄子、 菊苣、 茅菜、 桉樹、 茴 香、 無花果、 大蒜、 葫蘆、 葡萄、 柚子樹、 白蘭瓜、 豆薯、 獼猴桃、 生菜、 韭蔥、 檸檬、 酸橙、 火炬 松、 亞麻子、 玉米、 芒果、 甜瓜、 蘑菇、 油桃、 堅果、 燕麥、 油棕、 油菜、 秋葵、 橄欖樹、 洋蔥、 橙、 觀 賞植物、 棕櫚、 木瓜樹、 歐芹、 歐洲防風草、 豌豆、 桃樹、 花生、 梨樹、 胡椒、 柿樹、 松樹、 菠蘿、 大 蕉、 李樹、 石榴樹、 白楊、 馬鈴薯、 南瓜、 溫柏、 輻射松、 紅菊苣、 蘿卜、 油菜、 樹莓、 稻、 黑麥、 高 粱、 南方松、 大豆、 菠菜、 南瓜、 草莓、 甜菜、 甘蔗、 向日葵、 甘薯、 楓香樹、 柑橘、 茶、 煙草、 蕃茄、 黑小麥、 草皮草、 蕪菁、 葡萄樹、 西瓜、 小麥、 薯蕷和西葫蘆。
     組合物
     本發明的組合物是其基因組中包含本發明的任何重組 DNA 構建體 ( 包括任何抑制 DNA 構建體 )( 例如上面所討論的任何一種其他構建體 ) 的植物。 組合物也包括任何植物的 子代, 以及獲取自植物或其子代的任何種子, 其中所述子代或種子在其基因組中包含重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 )。子代包括通過植物的自花授粉或異型雜交而獲得的連 續世代。子代也包括雜交種和近交系。
     在雜交種子繁殖的農作物中, 成熟的轉基因植物可自花授粉而產生純合的自交系 植物。該近交系植物產生含有新引入的重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的種子。這 些種子可以生長而產生將會表現出改變的農學特性 ( 如, 在氮限制條件下農學特性增加 ) 的植物, 或者可以用于育種程序以產生雜交種子, 這些雜交種子可以生長而產生將會表現 出如改變的農學特性的植物。所述種子可為玉米種子。
     植物可為單子葉植物或雙子葉植物, 例如玉米或大豆植物, 如玉米雜種植物或玉 米自交系植物。植物還可以是向日葵、 高梁、 低芥酸菜籽、 小麥、 苜蓿、 棉、 稻、 大麥、 小米、 甘 蔗、 或柳枝稷。
     重組 DNA 構建體可穩定地整合進植物的基因組中。
     具體實施方案包括但不限于下列的 :
     1. 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有 一種氨基酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%、 51%、 52%、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98%、 99%、 或 100%的序列同一性, 并且其中所述植物在與未包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出增加的氮脅迫耐受性。在與該對照植物比較時, 該植物還可表 現出至少一種農學特性的改變。
     2. 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 該重組 DNA 構 建體包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼包含 SNF2 結構域的多肽, 并且其中在與未包含所述重組 DNA 構建體的對照植物比較時, 所述植物表 現出增加的氮脅迫耐受性。在與該對照植物比較時, 該植物還可表現出至少一種農學特性 的改變。
     3. 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 該重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼包含 SNF2 結構域的多肽, 并且其中在與未包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時, 所述植 物表現出在氮限制條件下至少一種農學特性的改變。
     4. 在因組中包含重組 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 所述重組 DNA 構 建體包含可操作地連接到至少一種調控元件的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種 氨基酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99%、 或 100%的序列同一性, 并且其中所述植物在與未包含所述重組 DNA 構建體的對照植 物進行比較時表現出在氮限制條件下至少一種農學特性的改變。
     5. 在基因組中包含抑制 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 該抑制 DNA 構建體包含至少一種可操作地連接至源自受關注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部 分的區域的調控元件, 當與所述區域所來源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時, 基于 Clustal V 比對方法, 所述區域的核酸序列具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86%、 87%、 88 %、 89%、 90 %、 91%、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或 100 % 的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的多肽, 并且其中在與 未包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時, 所述植物表現出在氮限制條件下至少 一種農學特性的改變。
     6. 在基因組中包含抑制 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控元件, 該調控元件可操作地連接至以下序列的全部或部分 : (a) 編碼多肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%序列同一性 ; 或 (b)(a) 的核酸序列的全長互補序列, 并且其 中所述植物在氮限制條件下在與不包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出至少一種農學特性的改變。
     7. 上述實施方案 1-6 中的植物的任何子代、 上述實施方案 1-6 中的植物的任何種 子、 上述實施方案 1-6 中的植物的子代的任何種子以及來自上述實施方案 1-6 中的任何植 物以及它們的子代的細胞。
     在前述實施方案 1-7 的任一項中或本發明的任何其他實施方案中, 包含 SNF2 結構 域的多肽可來自擬南芥 (Arabidopsis thaliana)、 玉米 (Zea mays)、 大豆 (Glycine max)、 煙豆 (Glycine tabacina)、 野大豆 (Glycine soja) 或短絨野大豆 (Glycine tomentella)。
     在上述實施方案 1-7 或本發明的任一其他實施方案中的任一項中, 重組 DNA 構建 體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 可包含至少一種在植物中有功能的啟動子作為調控序列。
     在前述實施方案 1-7 中任一項或本發明的任何其他實施方案中, 所述至少一種農 學特性的改變是增加或減少。
     在前述實施方案 1-7 中任一項或本發明的任何其他實施方案中, 所述至少一種農 學特性可選自 : 綠度、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時的鮮重、 成熟時的干重、 果實產量、 種 子產量、 總植物含氮量、 果實含氮量、 種子含氮量、 營養組織含氮量、 總植物氨基酸含量、 營 養組織游離氨基酸含量、 果實游離氨基酸含量、 種子游離氨基酸含量、 總植物蛋白質含量、 果實蛋白質含量、 種子蛋白質含量、 營養組織蛋白質含量、 耐旱性、 氮攝取、 根倒伏抗性、 收 獲指數、 莖倒伏、 植株高度、 穗高、 穗長、 鹽耐受性、 早期幼苗活力、 和在低溫脅迫下的出苗。 例如, 至少一種農學特性的改變可為產量、 綠度或生物量的增加。 在前述實施方案 1-7 中任一項或本發明的任何其他實施方案中, 所述植物在與不 包含所述重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的對照植物在氮脅迫條件下進行比較時, 可表現出至少一種農學特性的改變。
     本領域的普通技術人員熟悉模擬氮條件 ( 限制性的或非限制性的 ) 的規程, 以及 用于評價已經經受過模擬的或天然存在的氮條件 ( 限制性的或非限制性的 ) 的植物的規 程。例如, 技術人員可通過向植物提供比正常需求更少的氮或在一定時期內不提供氮來模 擬氮條件, 并且技術人員可通過尋找農學特性的差異來評價此類植物, 例如在生理學和 / 或物理條件上的變化, 包括 ( 但不限于 ) 活力、 生長、 大小、 或根長、 或具體地講葉片顏色或 葉片面積大小。 用于評價此類植物的其他技術包括測量葉綠素熒光、 光合作用速率、 根生長 或換氣速率。
     下面的實施例描述了一些用于模擬氮限制條件和 / 或在此類條件下評價植物的 代表性規程和技術。
     技術人員也可通過植物在大田測試中, 在模擬的或天然存在的低氮或高氮條件 下保持足夠產量 ( 例如, 至少 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85%、 86%、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%、 或 100%的產量 ) 的能力 ( 例如通過測量在低氮或高氮條件下, 與標準氮條件下相比基本上等 同的產量, 或通過測量在低氮或高氮條件下與對照或參照植物相比更少的產量損失 ) 來評 價氮脅迫耐受性。
     在評估或測量其中利用了對照或參照植物的本發明任何實施方案 ( 例如, 如本文 描述的組合物或方法 ) 中的轉基因植物的農學特性或表型時, 本領域的普通技術人員將很 容易認識到要利用的合適對照植物。例如, 通過如下非限制性示例來說明 :
     1. 轉化過的植物的子代, 該轉化過的植物對于重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建 體 ) 來說是半合子的, 使得該子代分離成包含或不包含該 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的植株 : 包含該重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的子代將通常相對于不包含該重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的子代來進行測量 ( 即, 不包含該重組 DNA 構建體 ( 或抑 制 DNA 構建體 ) 的子代是對照或參照植株 )。
     2. 重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 基因滲入至近交系中, 例如在玉米中, 或 基因滲入進變種中, 例如在大豆中 : 基因滲入品系將通常相對于親本近交系或變種品系進 行測量 ( 即, 親本近交系或品種品系是對照或參照植物 )。
     3. 雙雜交系, 其中第一雜交系由兩個親本近交系產生, 而第二雜交系由相同的兩 個親本近交系產生, 不同的是其中一個親本近交系含有重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建 體): 第二雜交系通常將相對于第一雜交系進行測量 ( 即第一雜交系為對照植物或參照植 物 )。
     4. 包含重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的植株 : 該植株可以相對于這樣 的對照植株進行評估或測量, 該對照植株不包含重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ), 但具有與該植株相當的遺傳背景 ( 例如, 與包含重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的 植株相比較, 核遺傳物質具有至少 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99%或 100%的序列同一性 )。存在許多可用于分析、 比較和表征植物遺傳背景的基于實 驗室的技術 ; 其中這些技術是同工酶電泳、 限制性片段長度多態性 (RFLP)、 隨機擴增多態 性 DNA(RAPD)、 任何引物聚合成酶鏈反應 (AP-PCR)、 DNA 擴增指紋 (DAF)、 序列特異擴增區域 (SCAR)、 擴增片段長度多態性 (AFLP ) 和也稱為微衛星的簡單序列重復 (SSR)。 此外, 本領域的普通技術人員將容易認識到, 評估或測量轉基因植物的農學特性 或表型時合適的對照或參照植物將不包括先前已經針對所需的農學特性或表型, 通過誘變 或轉化而選擇的植物。
     方法
     方法包括但不限于用于提高植物氮脅迫耐受性的方法、 用于評價植物氮脅迫耐受 性的方法、 用于改變植物農學特性的方法、 用于測定植物農學特性改變的方法、 和用于制備 種子的方法。所述植物可為單子葉或雙子葉植物, 例如玉米或大豆植物。植物還可以是向 日葵、 高梁、 低芥酸菜籽、 小麥、 苜蓿、 棉、 稻、 大麥、 小米、 或甘蔗。所述種子可為玉米或大豆 種子, 例如玉米雜交種子或玉米自交系種子。
     方法包括但不限于如下方法 :
     轉化細胞的方法包括用本發明的任何分離的多核苷酸轉化細胞。 也包括通過這種 方法轉化的細胞。 在具體實施方案中, 所述細胞是真核細胞, 例如酵母、 昆蟲或植物細胞, 或 原核細胞, 例如細菌細胞。
     生產轉基因植物的方法, 所述方法包括用本發明的任何分離的多核苷酸或重組 DNA 構建體 ( 包括抑制 DNA 構建體 ) 來轉化植物細胞并從轉化的植物細胞中再生轉基因植 物。 本發明也涉及由該方法制備的轉基因植物, 以及從該轉基因植物中獲取的轉基因種子。 通過該方法獲取的轉基因植物可被用于本發明的其他方法中。
     用于從細胞或細胞培養基中分離本發明多肽的方法, 其中所述細胞包含具有本發 明多核苷酸的重組 DNA 構建體, 所述多核苷酸可操作地連接到至少一個調控序列, 并且其
     中轉化的宿主細胞在適于重組 DNA 構建體表達的條件下生長。
     改變宿主細胞中本發明多肽表達水平的方法, 所述方法包括 : (a) 用本發明的重 組 DNA 構建體轉化宿主細胞 ; 以及 (b) 在適于表達所述重組 DNA 構建體的條件下培養轉化 過的細胞, 其中重組 DNA 構建體的表達導致轉化過的宿主細胞中的本發明多肽含量改變。
     提高植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 將重組 DNA 構建體引入到可再 生的植物細胞中, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列 ( 例如在植 物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的, 所述 氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%的序列 同一性 ; 和 (b) 在步驟 (a) 之后, 從所述可再生的植物細胞再生出轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體并且在與不包含該重組 DNA 構建體的對照 植物進行比較時表現出提高的氮脅迫耐受性。所述方法可進一步包括 (c) 獲取源自該轉基 因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體并且在與未包含 該重組 DNA 構建體的對照植物比較時表現出增加的氮脅迫耐受性。
     提高植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 將抑制 DNA 構建體引入到可再 生的植物細胞中, 該抑制 DNA 構建體包含可操作地連接至少一種調控序列 ( 例如在植物中 有功能的啟動子 ) 的以下序列的全部或部分 : (i) 編碼多肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸 序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57%、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%的序列同一 性, 或 (ii)(a)(i) 的核酸序列的全長互補序列 ; 以及 (b) 在步驟 (a) 之后, 從該可再生的植 物細胞再生出轉基因植物, 其中該轉基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 并且在 與不包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出增加的氮脅迫耐受性。所述方 法可進一步包括 (c) 獲取源自該轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中 包含抑制 DNA 構建體并且在與未包含該抑制 DNA 構建體的對照植物比較時表現出增加的氮 脅迫耐受性。
     提高植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 將抑制 DNA 構建體引入到可再 生的植物細胞中, 該抑制 DNA 構建體包含可操作地連接源自受關注靶基因有義鏈或反義鏈 的全部或部分區域的至少一種調控序列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 所述區域的核 酸序列基于 Clustal V 比對方法在與所述區域所來源的有義鏈或反義鏈的全部或部分進 行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57%、 58%、 59%、 60%、 61%、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的多肽 ; 以及 (b) 在步驟 (a) 之后, 從所述可再生的植物細 胞再生出轉基因植物, 其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構建體并且在 與不包含該抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出增加的氮脅迫耐受性。所述方法 可進一步包括 (c) 獲取源自該轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包 含抑制 DNA 構建體并且在與未包含該抑制 DNA 構建體的對照植物比較時表現出增加的氮脅 迫耐受性。
     評價植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含重組 DNA 構建體, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少 一種調控序列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有 一種氨基酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%、 51%、 52%、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98%、 99%或 100%的序列同一性 ; (b) 獲取來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述 子代植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體 ; 以及 (c) 評價所述子代植物在與不包含 所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時的氮脅迫耐受性。
     評價植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控序 列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 其可操作地連接以下序列的全部或部分 : (i) 編碼多 肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或 100 %的序列同一性 ; 或 (ii)(a)(i) 的核酸序列的全長互補序列 ; (b) 獲取來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構建體 ; 以及 (c) 評價所述子代植物在與不包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行 比較時的氮脅迫耐受性。
     評價植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控序 列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 其可操作地連接源自受關注靶基因有義鏈或反義鏈 的全部或部分區域, 所述區域的核酸序列基于 Clustal V 比對方法在與所述區域所來源的 有義鏈或反義鏈的全部或部分進行比較時, 具有至少 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 或 100% 的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的多肽 ; (b) 獲取來源 于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構建體; 以及 (c) 評價所述子代植物在與不包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時的 氮脅迫耐受性。
     測定植物農學特性改變的方法, 所述方法包括 (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含重組 DNA 構建體, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少 一種調控序列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有 一種氨基酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%、 51%、 52%、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98%、 99%或 100%的序列同一性 ; (b) 獲取來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述 子代植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體 ; 以及 (c) 測定所述子代植物任選地在氮 限制條件下與不包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時是否表現出至少一種農 學特性的改變。
     測定植物農學特性改變的方法, 所述方法包括 (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控序 列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 其可操作地連接以下序列的全部或部分 : (i) 編碼多 肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97%、 98%、 99%或 100%的序列同一性 ; 或 (ii)(i) 的核酸序列的全長互補序列 ; (b) 獲取 來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構 建體 ; 以及 (c) 測定所述子代植物任選地在氮限制條件下與不包含所述抑制 DNA 構建體的 對照植物進行比較時是否表現出至少一種農學特性的改變。
     測定植物農學特性改變的方法, 所述方法包括 (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控序列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 其可操作地連接源自受關注靶基因有義鏈或反義鏈的 全部或部分的區域, 所述區域的核酸序列基于 Clustal V 比對方法在與所述區域所來源的 有義鏈或反義鏈的全部或部分進行比較時, 具有至少 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 或 100% 的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的多肽 ; (b) 獲取來源 于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構建 體; 以及 (c) 測定所述子代植物任選地在氮限制條件下與不包含所述抑制 DNA 構建體的對 照植物進行比較時是否表現出至少一種農學特性的改變。
     產生種子 ( 例如可作為提供氮脅迫耐受性的產品銷售的種子 ) 的方法, 該方法包括任一上述的方法, 并且還包括從所述子代植物獲取種子, 其中所述種子在其基因組中包 含所述重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 )。
     在任何前述方法或本發明的方法的任何其他實施方案中, 在所述導入步驟中所述 可再生的植物細胞可包括愈傷組織細胞、 胚胎愈傷組織細胞、 配子細胞、 分生細胞或未成熟 胚芽細胞。可再生的植物細胞可來自近交系玉米植物。
     在任一前述方法或本發明方法的任一其他實施方案中, 所述再生步驟可包括 : (i) 在包含促胚發生激素的培養基中培養所述轉化的植物細胞, 直至觀察到愈傷組織 ; (ii) 將 步驟 (i) 的所述轉化植物細胞轉移到第一培養基中, 所述培養基包括促組織形成激素 ; 以 及 (iii) 在第二培養基上傳代培養步驟 (ii) 后的所述轉化的植物細胞, 以允許嫩芽伸長、 根發育或這兩者同時發生。
     在任何前述方法或本發明的方法的任何其他實施方案中, 所述至少一種農學特性 可選自 : 綠度、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時的鮮重、 成熟時的干重、 果實產量、 種子產量、 總植物含氮量、 果實含氮量、 種子含氮量、 營養組織含氮量、 總植物氨基酸含量、 營養組織游 離氨基酸含量、 果實游離氨基酸含量、 種子游離氨基酸含量、 總植物蛋白質含量、 果實蛋白 質含量、 種子蛋白質含量、 營養組織蛋白質含量、 耐旱性、 氮攝取、 根倒伏抗性、 收獲指數、 莖 倒伏、 植株高度、 穗高、 穗長、 鹽耐受性、 早期幼苗活力、 和在低溫脅迫下的出苗。 至少一種農 學特性的改變可為產量、 綠度或生物量的增加。 在任一上述方法或本發明的任一方法中, 在與不包含所述重組 DNA 構建體 ( 或抑 制 DNA 構建體 ) 的對照植物在氮限制條件下進行比較時, 植物可表現出至少一種農學特性 的改變。
     在任一前述方法或本發明方法的任何其他實施方案中, 存在供選擇的替代方案用 于將包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸的重組 DNA 構建體導入可再生的 植物細胞中。例如, 可將調控序列 ( 例如一種或多種增強子, 例如, 作為轉座因子的部件 ) 導入可再生的植物細胞, 然后篩選其中將所述調控序列可操作地連接至編碼本發明的多肽 的內源基因的事件。
     將本發明的重組 DNA 構建體引入植物可通過任何合適的技術來進行, 這些技 術包括但不限于 DNA 直接攝取、 化學處理、 電穿孔、 顯微注射、 細胞融合、 感染、 載體介導 的 DNA 轉移、 轟擊或農桿菌屬介導的轉化。植物轉化和再生技術已經在國際專利公布 WO 2009/006276 中進行了描述, 其內容以引用方式并入本文。
     含有編碼受關注蛋白質的外來的外源性分離核酸片段的植物的發育或再生是本 領域所熟知的。可將再生的植物進行自花授粉以產生純合的轉基因植物。或者, 將得自再 生植物的花粉與農學上重要的品系的產生種子的植株進行雜交。相反, 將來自這些重要品 系植物的花粉用于給再生植物授粉。 利用本領域技術人員所熟知的方法培育含有所需多肽 的本發明的轉基因植物。
    實施例 本發明將在下面的實施例中進一步說明, 其中份數和百分比是以重量計并且度數 是攝氏度, 除非另外說明。應該理解, 盡管這些實施例說明了本發明的實施方案, 但僅是以 例證的方式給出的。根據上面的論述和這些實施例, 本領域的技術人員可以確定本發明的
     基本特征, 并在不脫離本發明的精神和范圍的情況下, 可對本發明做出多種改變和修改, 以 使其適用于多種用法和條件。此外, 除了那些本文所示和描述的那些之外, 根據前文所述, 本發明的各種修改形式對本領域的技術人員來說將是顯而易見的。 這些修改形式也旨在涵 蓋于所附權利要求書的范圍內。
     實施例 1
     制備具有激活標記基因的擬南芥種群
     構建 18.49kb 的 T-DNA 基二元構建體, pHSbarENDs2(SEQ ID NO : 1; 圖 1) 包含四 個來源于花椰菜花葉病毒 35S 啟動子的四個多聚增強子元件 ( 對應于序列 -341 至 -64, 如 Odell 等人 Nature 313 : 810-812 所述 (1985))。該構建體也包含允許質粒救援的載體序列 (pUC9) 和多接頭 (SEQ ID NO : 11)、 再動員 T-DNA 的轉座子序列 (Ds)、 以及允許草胺磷選擇 轉基因植物的 bar 基因。原則上, 僅將從右邊界 (RB) 至左邊界 (LB) 包含的 10.8kb 片段轉 移到寄主植物基因組中。因為增強子元件位于靠近 RB 處, 它們可誘導 T-DNA 整合后的基因 組位點順式激活。
     通過整個植株的農桿菌屬轉化制備擬南芥屬激活標記種群。將 pHSbarENDs2 構建 體轉化到根癌農桿菌菌株 C58 中, 在 25℃下在溶菌肉湯培養基中培養至 OD600 ~ 1.0。然 后離心沉淀細胞, 并重懸在相等體積的 5%蔗糖 /0.05% Silwet L-77(OSI Specialties, Inc) 中。在早期抽薹時, 培育擬南芥生態型 Col-0 的土壤使用農桿菌屬懸浮液進行頂部灌 溉。 一周后, 相同植株再次用在蔗糖 /Silwet 中的相同農桿菌屬菌株進行頂部灌溉。 然后將 該植物的種子設為標準。所得 T1 種子在土壤中播種, 通過噴灑草胺磷 (FINALE ; AgrEvo ; Bayer Environmental Science) 選擇轉基因幼苗。選擇了總計 100,000 個草胺磷抗性 T1 幼苗。分開保存來自每個品系的 T2 種子。
     實施例 2
     篩選以鑒定具有低氮耐受性的品系
     來 自 每 個 100,000 個 分 離 T1 激 活 標 記 品 系 的 十 一 個 T2 植 物 可 種 植 在 方 板 (15mm×15mm) 上, 方板包含 0.5x N-Free Hoagland’ s, 0.4mM 硝酸鉀, 0.1%蔗糖, 1mM MES TM 和 0.25% Phyytagel ( 低氮培養基 )。 每個板種植五個品系, 并且每個板包括 9 個野生型個 體以使總計 64 個個體排列成 8×8 的網格圖案 ( 參見圖 12)。在暗處、 4℃條件下保持平板 三天以使種子分層, 然后在 22℃光照和 20℃黑暗交替條件下水平放置九天。光周期為十六 小時光照和八小時黑暗, 平均光照強度為~ 200mmol/m2/s。每天旋轉并振動每個架子中的 平板。在第十二天 ( 生長九天 ), 對整個板拍照以評價幼苗狀態。
     在掩蔽該平板圖像以去除背景顏色后, 每個個體收集兩個不同的測量數據 : 總羅 賽塔面積和進入綠色區的顏色百分比。使用色調、 飽和度和強度數據 (HSI), 綠色區由色調 50 至 66 組成。 總羅賽塔面積用作植物生物量的量度, 而綠色區通過劑量 - 響應研究已經顯 示指示氮同化作用 ( 參見圖 13)。
     將在與野生型對照植物進行比較時具有顯著的總羅賽塔面積和 / 或綠色區增加 的品系命名為 Phase 1 hits。在相同分析條件下進行 Phase 1hits 的重復試樣再篩選 (Phase 2 篩選 )。還通過 Phase 3 篩選以進一步驗證通過 Phases 1 和 2 的突變體。在 Phase 3 中, 將每個品系分開種植在低氮培養基中, 使得 32 個 T2 個體緊鄰著 32 個野生型個 體生長, 為分析提供更高的統計學嚴謹性。如果一個品系顯示與 Phase 3 中對照的顯著差異, 然后可認為該品系是經驗證的氮缺乏抗性品系。
     實施例 3
     鑒定激活標記基因
     在氮耐受性品系中側接 T-DNA 插入序列的基因使用以下兩個標準程序中的一個 或兩個進行鑒定 : (1) 熱不對稱交錯 (TAIL)PCR(Liu 等人, Plant J.8 : 457-63(1995)) ; 以及 (2)SAIFF PCR(Siebert 等人, Nucleic Acids Res.23 : 1087-1088(1995))。至于復雜的多 聚 T-DNA 插入序列, TAIL PCR 和 SAIFF PCR 可能均不足以鑒定候選基因。在這些情況下, 可使用包括反式 PCR、 質粒拯救和 / 或基因組文庫構建在內的其他程序。
     成功的結果是其中單個 TAIL 或 SAIFF PCR 片段包含 T-DNA 邊界序列和擬南芥屬 基因組序列。一旦獲取側接 T-DNA 插入序列的基因組序列標記, 通過與公開可用的擬南芥 屬基因組的序列比對來鑒定候選基因。具體地講, 最靠近 35S 增強子元件 /T-DNA RB 的注 釋基因是激活的基因的候選基因。
     為了驗證鑒定的基因真的靠近 T-DNA 并排除 TAIL/SAIFF 片段是嵌合偽克隆的可 能性, 用一個 T-DNA 中的寡核苷酸和一個候選基因特異性的寡核苷酸進行對基因組 DNA 的 診斷 PCR。將提供 PCR 產品的基因組 DNA 樣本理解為表示 T-DNA 插入序列。該分析也驗證 了其中一種以上的插入事件發生在相同品系中的情況, 例如, 在 TAIL 和 / 或 SAIFF PCR 分 析中鑒定是否有多個不同基因組片段。
     實施例 4
     鑒定編碼包含 SNF2 結構域的多肽的激活標記基因
     進一步分析了顯示出氮缺乏耐受性的激活標記品系 ( 品系 112579)。提取來自該 品系的 DNA, 并且在突變品系中側接 T-DNA 插入序列的基因通過連接介導 PCR(Siebert 等 人, Nucleic Acids Res.23 : 1087-1088(1995)) 進行鑒定。鑒定一個單獨擴增的片段, 它包 含 T-DNA 邊界序列和擬南芥屬基因組序列。一旦獲取側接 T-DNA 插入序列的基因組序列標 記, 通過與完全擬南芥屬基因組的序列比對鑒定候選基因。具體地講, 最靠近 35S 增強子元 件 /T-DNA RB 的注釋基因是品系中激活的基因的候選基因。就品系 112579 而言, 最靠近 35S 增強子的基因是 At1g61140, 它編碼擬南芥包含 SNF2 結構域的多肽。
     實施例 5
     通過轉化擬南芥屬驗證候選的擬南芥基因 (At1g61140)
     可將候選基因轉化到擬南芥屬中并在 35S 啟動子作用下過表達。如果在轉基因品 系中觀察到與親本激活標記品系相同或相似的表型, 則將該候選基因認為是擬南芥屬中驗 證過的 “前導基因” 。
     候選擬南芥屬基因 (At1g61140) 編碼包含 SNF2 結構域的多肽, 用以下方法測試其 賦予氮缺乏耐受性的能力。設計引物以擴增突變體 At1g61140.1。
     通過 RT-PCR, 用以下引物擴增 At1g61140.1cDNA(SEQ ID NO : 24) :
     1.At1g61140-5’ attB 正向引物 (SEQ ID NO : 33)
     正向引物包含 attB1 序列 (ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT ; SEQ ID NO : 12) 和共有 的 Kozak 序列 (CAACA) 蛋白編碼區上游的前 21 個核苷酸 ( 以所述 cDNA 的 ATG 起始密碼子 開頭 )。
     2.At1g61140-3’ attB 反向引物 (SEQ ID NO : 34)。反向引物包含 attB2 序列 (ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT ; SEQ ID NO : 13), 該序列 鄰近蛋白編碼區的反向互補序列的后 21 個核苷酸 ( 以所述 cDNA 的終止密碼子的反向互補 序列開頭 )。
     使用 INVITROGENTM GATEWAY CLONASETM 技術, 用 pDONRTMZeo(SEQ ID NO : 2; 圖 2) 對每個 RT-PCR 產物進行了 BP 重組反應。這種方法將細菌致死 ccdB 基因以及氯霉素抗性 基因 (CAM) 從 pDONRTMZeo 移除并定向地克隆了該在旁側具有 attB1 和 attB2 位點的 PCR 產 物而得到入門克隆 (entry clone)。鑒定為陽性的入門克隆與一個目的載體一起被用于隨 后的 LR 重組反應, 如下所述。
     用緊接 INVITROGENTMGATEWAY C1 轉化插入序列上游的 1.3-kb35S 啟動子構建 稱為 pBC-yellow(SEQ ID NO : 4; 圖 4) 的基于 16.8-kbT-DNA 的二元載體 ( 目的載體 ), 所述插入序列包含 ccdB 細菌致死基因以及側接 attR1 和 attR2 序列的氯霉素抗性基因 (CAM)。該載體還包含 RD29a 啟動子, 該啟動子驅動基因表達 ZS-Yellow(INVITROGENTM), 它 TM 賦予轉化過的種子黃色熒光。使用 INVITROGEN GATEWAY 技術, 對包含核苷酸編碼序列 At1g61140.1(SEQ ID NO : 24) 和 pBC-yellow 載體的入門克隆進行 LR 重組反應 ; 然而, 也可 使用任一種其他突變體 (SEQ ID NO : 26 和 28)。該擴增允許迅速地定向克隆在 pBC-yellow 中的 35S 啟動子之后的 At1g61140.1(SNF2.1 ; SEQ ID NO : 24)。 申請人然后使用如實施例 1 所述的相同農桿菌介導的轉化程序將 35S 啟動子 : At1g61140 表達構建體導入野生型擬南芥屬生態型 Col-0 中。 轉基因 T1 種子通過黃色熒光 進行選擇, 并且將 32 個這些 T1 種子緊鄰著 32 個野生型擬南芥屬生態型 Col-0 種子種植在 低氮培養基上。所有隨后的生長和拍照條件均如實施例 1 所述。發現來自激活標記的、 對 氮限制條件具有耐受性的初始表型, 可在用其中 At1g61140 基因通過 35S 啟動子直接表達 的構建體轉化過的野生型擬南芥屬植物中重現。
     實施例 6a
     cDNA 文庫的制備和 cDNA 克隆的分離和測序
     cDNA 文庫可通過許多可用的方法中的任一種制備。例如, 通過首先根據生產商的 說明書 (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) 制備 Uni-ZAPTMXR 載體中的 cDNA 文 庫, 可將 cDNA 引入質粒載體中。 根據 Stratagene 提供的說明書, 將 Uni-ZAPTMXR 文庫轉換成 質粒文庫。當轉換的時候, 將把 cDNA 插入序列包含于質粒載體 pBLUESCRIPT 中。此外, 可
    使用 T4 連接酶 (New England Biolabs) 將 cDNA 直接導入預切過的 BLUESCRIPT II SK(+) 載體 (Stratagene) 中, 隨后按照制造商規程 (GIBCO BRL Products) 轉染 DH10B 細胞。一 旦 cDNA 插入序列處于質粒載體中, 從隨機選取的含重組 pBLUESCRIPT 質粒的細菌菌落制 備質粒 DNA, 或者用對插入的 cDNA 序列旁側的載體序列特異性的引物, 通過聚合酶鏈式反 應擴增插入的 cDNA 序列。將擴增的 DNA 插入序列或質粒 DNA 在染料 - 引物標記法測序反 應 (dye-primer sequencing reaction) 中進行測序, 以產生部分 cDNA 序列 ( 表達序列標 記或 “EST” ; 參見 Adams 等人, Science 252 : 1651-1656(1991))。用 Perkin Elmer Model 377 熒光測序儀分析所得的 EST。
     用改進的轉座規程產生全長插入序列 (FIS) 數據。從歸檔的甘油原種作為單一菌 落回收確定了 FIS 的克隆, 并通過堿性裂解分離質粒 DNA。將分離的 DNA 模板在基于 PCR 的 測序反應中與載體引物 M13 正向和反向寡核苷酸反應并上樣至自動化的測序儀上。通過與對其進行 FIS 查詢的初始 EST 序列進行序列比對來確認克隆鑒定。
     將確認的模板通過基于釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)Ty1 轉座因子 (Devine 和 Boeke, Nucleic Acids Res.22 : 3765-3772(1994)) 的 Primer Island 轉座試劑 盒 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) 進行轉座。該體外轉座系統在整個一組大 DNA 分子中隨機地放入獨特的結合位點。隨后將轉座的 DNA 用于通過電穿孔轉化 DH10B 電 感受態細胞 (GIBCO BRL/Life Technologies, Rockville, MD)。轉座因子含有另外的可選 標記 ( 稱為 DHFR ; Fling 和 Richards, Nucleic Acids Res.11 : 5147-5158(1983)), 使得能 在瓊脂平板上僅雙重篩選含有整合的轉座子的那些亞克隆。 從每次轉座反應隨機地選擇多 個亞克隆, 通過堿性裂解制備質粒 DNA, 并用對轉座子內的結合位點特異性的獨特引物從轉 座事件位點向外進行測序 (ABI PRISM dyeterminator ReadyReaction mix)。
     收 集 序 列 數 據 (ABI PRISM Collections) 并 用 Phred 和 Phrap(Ewing 等 人, Genome Res.8 : 175-185(1998) ; Ewing 等人, Genome Res.8 : 186-194(1998)) 組裝。Phred 是一種公用軟件程序, 該程序再次讀取 ABI 序列數據, 再次調出 (recall) 堿基, 賦質量值, 并將堿基序列 (base call) 和質量值寫入可編輯的輸出文件中。Phrap 序列組裝程序使用 這些質量值來增加組裝的序列重疊群的準確度。通過 Consed 序列編輯器 (Gordon 等人, Genome Res.8 : 195-202(1998))。
     在一些克隆中, cDNA 片段對應基因的 3’ 端的一部分并且不會涵蓋整個開放閱讀 框。為了獲取上游信息, 使用兩種不同規程中的一種。這兩種方法中的第一種方法導致產 生含有所需基因序列的部分的 DNA 片段, 而第二種方法導致產生含有整個開放閱讀框的片 段。這兩種方法均使用兩輪 PCR 擴增以從一個或多個文庫獲取片段。有時基于以前的知識 ( 特定的基因應該存在于某些組織中 ) 選擇文庫, 有時則進行隨機地選擇。 獲取相同基因的 反應可平行地在若干文庫中進行, 或者在文庫池中進行。文庫池通常用 3 至 5 個不同的文 庫制備并且使其歸一化而成為一致的稀釋度。在第一輪擴增中, 兩種方法均使用載體特異 性的 ( 正向 ) 引物, 同時還使用基因特異性的 ( 反向 ) 引物, 該正向引物對應位于克隆 5’ 端處的載體的一部分。第一種方法使用與已知基因序列的一部分互補的序列, 而第二種方 法使用與 3’ 非翻譯區 ( 也稱為 UTR) 的一部分互補的基因特異性引物。在第二輪擴增中, 兩種方法均使用套式引物組。按照生產商的說明書, 用市售試劑盒將所得 DNA 片段連接進 pBLUESCRIPT 載體中。該試劑盒選自可得自包括 INVITROGENTM(Carlsbad, CA)、 Promega Biotech(Madison, WI) 和 Gibco-BRL(Gaithersburg, MD) 在內的一些供應商的許多試劑盒。 如上所述, 將質粒 DNA 通過堿性裂解方法分離并進行測序和用 Phred/Phrap 進行裝配。
     實施例 6B
     制備 cDNA 文庫并獲取序列
     可利用用于總 RNA 分離的 Qiagen RNA 分離試劑盒分離 mRNA, 然后通過吸附到 Invitrogen(Life Technologies, Carlsbad, CA) 的 oligo(dT)Dynabeads 上分離 mRNA, 并且 測序文庫能夠使用 Illumina, Inc.(SanDiego, CA) 的標準 mRNA-Seq 試劑盒和規程進行制 備。在這一方法中, 使用 ZnCl2 溶液破壞 mRNA, 使用隨機引物將其反轉錄成 cDNA, 進行末端 修復以制備鈍末端片段, 3’ A- 尾化, 并且用 Illumina 雙末端文庫接頭進行連接。然后可使 用 Illumina 雙末端文庫引物對連接好的 cDNA 片段進行 PCR 擴增, 并且能夠在用配有雙末 端模塊的 Genome Analyzer II 測序前使用 Agilent Bioanalyzer DNA 1000 芯片檢查純化PCR 產物的質量和數量。
     測序運行中的讀數可在組合之前進行軟修剪以使觀察到具有低于 15 的 FASTQ 質 量評分的每個讀數的首個堿基對和后面所有堿基對通過 Python Script 進行修剪。Velvet 裝 配 器 (Zerbino 等 人, Genome Research18 : 821-9(2008)) 能 在 不 同 kmer 和 覆 蓋 截 斷 (coverage cutoff) 參數下運行以制備某一嚴格性范圍內的若干個推定裝配物。能夠使用 Vmatch 軟件 ( 在 Vmatch 網站上可用 ) 將在那些裝配物內的鄰接序列 ( 重疊群 ) 組合成組 使得被鑒定為較長重疊群亞組的重疊群分組并被排除, 留下最長 “sentinel” 重疊群的非冗 余組。這些非冗余組能用于與來自已知模型植物種類的同源序列進行比對。
     如果重疊群不提供完整基因, 能夠經由 Blast 或 Perl Script, 使用在第一次搜索 中發現的序列對非冗余組進行再查詢。如果發現了延伸所述重疊群末端的序列, 它們能夠 用桌面裝配器如 DNAStar′ s SeqMan 或 GeneCode′ s Sequencher 與初始序列一起進行裝 配。可重復這些步驟直至不再發現更多的延伸序列。就仍不完整的轉錄物而言, 理論上屬 于一類 ( 基于與其他草本植物的同源性 ) 的基因片段能用來自另一種草本植物的連接序列 進行人工連接。
     實施例 7 鑒定 cDNA 序列
     編碼包含 SNF2 結構域的多肽的 cDNA 序列通過 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool ; Altschul 等人, J.Mol.Biol.215 : 403-410(1993) ; 還可參見國立衛生研究院 國家醫學圖書館的國家生物技術信息中心的萬維網址上對 BLAST 算法的解釋 ) 進行鑒定, 尋找與 BLAST“nr” 數據庫中所包含氨基酸序列 ( 包括所有非冗余 GenBank CDS 翻譯序列、 源自 3 維結構 Brookhaven 蛋白質數據庫 (Protein Data Bank)、 SWISSPROT 蛋白質序列數 據庫的最新的主要版本、 EMBL 和 DDBJ 數據庫的序列 ) 的相似性。在所有的閱讀框中翻譯 DNA 序列并用 NCBI 提供的 BLASTX 算法 (Gish 和 States, Nat.Genet.3 : 266-272(1993)) 比 較與包含在 “nr” 數據庫中的所有可公開獲取的氨基酸序列的相似性。采用國家生物技術 信息中心 (NCBI) 提供的 BLASTP 算法, 分析 cDNA 序列編碼的多肽與包含在 “nr” 數據庫中 的所有可公開獲取的氨基酸序列的相似性。為方便起見, 通過 BLAST 計算僅僅偶然觀察到 cDNA 序列與所搜索的數據庫中所包含序列的匹配的 P 值 ( 概率 ) 或 E 值 ( 期望值 ), 在本 文報導為 “pLog” 值, 它代表所報導的 P 值或 E 值的負對數。因此, pLog 值越大, cDNA 編碼 的序列和 BLAST 的 “匹配” 代表同源蛋白的可能性就越大。
     EST 序 列 可 與 如 上 所 述 的 Genbank 數 據 庫 進 行 比 較。 通 過 使 用 BLASTN 算 法 (Altschul 等人, Nucleic Acids Res.25 : 3389-3402(1997)) 對杜邦專利數據庫比較具有序 列同源共有區域或重疊區域的核苷酸序列, 可找到含更 5′端或 3′端序列的 EST。在兩個 或更多個核酸片段之間存在共有或重疊序列時, 該序列可裝配成單一的連續核苷酸序列, 從而使最初的片段在 5′或 3′初始方向上延伸。一旦確定了最 5′的 EST, 即能通過全長 插入序列來確定其完整的序列。
     可用 tBLASTn 算法, 通過將已知基因 ( 來自專有來源或公開數據庫的已知基因 ) 的氨基酸序列對 EST 數據庫進行比較, 可找到屬于不同物種的同源基因。 tBLASTn 算法對所 有 6 個閱讀框都翻譯了的核苷酸數據庫進行氨基酸查詢的搜索。該搜索允許不同物種之間 的核苷酸密碼子使用的差異, 并且允許密碼子簡并。
     實施例 8a
     表征編碼編碼包含 SNF2 結構域的多肽的 cDNA 序列
     制備提供來自玉米 (Zea mays)、 畫眉草 (Eragrostis nindensis)(Resurrection grass)、 和百喜草 (Paspalum notatum)(Bahiagrass) 不同組織的 mRNA 的 cDNA 文庫。下面 描述了該文庫的特征。
     表2
     來自玉米的 cDNA 文庫
    如 表 3、 圖 16A-AM 和 圖 17 所 示, 表 2 中 鑒 定 的 cDNA 編 碼 類 似 于 以 下 多 肽 的 多肽: 來 自 擬 南 芥 (At1g61140.1(GI No.186492170 ; SEQ ID NO : 25) ; At1g61140.2(GI No.186492172 ; SEQ ID NO : 27) ; 和 At1g61140.3(GI No.186492175 ; SEQ ID NO : 29)) 的 包 含 SNF2 結 構 域 的 多 肽、 和 來 自 水 稻 (GI No.53792213, 對 應 于 SEQ ID NO : 30, GI No.218200575, 對應于 SEQ ID NO : 31, 以及 GI No.90399293, 對應于 SEQ ID NO : 32) 以及高 粱 (GI No.242058897, 對應于 SEQ ID NO : 49) 的包含 SNF2 結構域的多肽。
     表 3( 非專利文獻 ) 和表 4( 專利文獻 ) 中所示的分別是單獨的 EST( “EST” )BLASTP 結果、 包含標明的 cDNA 克隆的整個 cDNA 插入物的序列 ( “FIS” )、 由兩個或更多個 EST、 FIS 或 PCR 序列裝配而成的重疊群序列 (“Contig” )、 或編碼源自 FIS 或重疊群的完整蛋白或 功能性蛋白的序列 (“CGS” )。表 3 和表 4 也顯示了使用 Clustal V 比對方法、 使用默認參 數計算的每對氨基酸序列的序列同一性百分比值 ( 如下所述 )。
     表3
     多肽的 BLASTP 結果
     包含 SNF2 結構域的多肽的同源物
    
    
    
    
    表4 多肽的 BLASTP 結果 包含 SNF2 結構域的多肽的同源物實施例 8b
     鑒定其他包含 SNF2 結構域的多肽
     與 編 碼 包 含 SNF2 結 構 域 的 蛋 白 的 前 導 基 因 同 源 的 序 列 可 使 用 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool ; Altschul 等 人, J.Mol.Biol.215 : 403-410(1993) ; 也參 見美國國家衛生研究院 (National Institutes of Health) 國立醫學圖書館 (National Library of Medicine) 的國家生物技術信息中心 (National Center for Biotechnology Information) 的萬維網網址上對 BLAST 算法的解釋 ) 之類的序列比較算法進行鑒定。例 如, 由 At1g61140 編碼的蛋白的氨基酸序列用作查詢序列, 使用 BlastP 查詢公共數據庫, 并 且隨后將如 SEQ ID NO : 40、 42、 和 48 所示的多肽序列鑒定為同源物 ( 對應的核苷酸序列分 別是 SEQ ID NO : 39、 41、 和 47)。 對公共 BAC 序列進行的 TblastN 搜索也鑒定了 SEQ ID NO : 44( 對應的核苷酸序列是 SEQ ID NO : 43) 所示的玉米同源物。
     實施例 8c
     包含 SNF2 結構域的多肽的序列比對和同一性百分比計算
     圖 16A-AM 給 出 如 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、
     46、 48、 和 49 所示的氨基酸序列比對結果。圖 17 示出圖 16A-AM 中顯示的每對氨基酸序列 的序列同一性百分比和趨異值的圖表。
     用 LASERGENE 生物信息計算包 (DNASTAR Inc., Madison, WI) 的 MEGALIGN 程 序進行序列比對和同一性百分比計算。用 Clustal 比對方法 (Higgins 和 Sharp(1989), CABIOS.5 : 151-153) 進行序列的多重比對, 默認參數 ( 空位罰分= 10, 空位長度罰分= 10)。使用 Clustal 方法采用以下逐對比對的默認參數 : KTUPLE 1, 空位罰分= 3, 窗口= 5, DIAGONALS SAVED = 5。 實施例 9
     包含擬南芥屬前導基因的同源物的植物表達載體的制備
     與 編 碼 包 含 SNF2 結 構 域 的 蛋 白 的 前 導 基 因 同 源 的 序 列 可 使 用 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool ; Altschul 等 人, J.Mol.Biol.215 : 403-410(1993) ; 也參 見美國國家衛生研究院 (National Institutes of Health) 國立醫學圖書館 (National Library of Medicine) 的國家生物技術信息中心 (National Center for Biotechnology Information) 的萬維網網址上對 BLAST 算法的解釋 ) 之類的序列比較算法進行鑒定。 與編 碼包含 SNF2 結構域的蛋白的基因類似的核苷酸序列, 如實施例 8A-C 所述的序列, 可通過任 何一種以下方法進行 PCR 擴增。
     方法 1( 基于 RNA 的方法 ) : 如果蛋白編碼區域的 5’ 和 3’ 序列信息是可用的, 可 如實施例 5 所述設計基因特異性引物。可將 RT-PCR 用于植物 RNA 來獲取含有蛋白編碼區 的核酸片段, 該 EXST 蛋白編碼區旁側為 attB1(SEQ ID NO : 12) 和 attB2(SEQ ID NO : 13) 序 列。引物可含有起始密碼子上游的共有 Kozak 序列 (CAACA)。
     方法 2( 基于 DNA 的方法 ) : 作為另外一種選擇, 如果 cDNA 克隆是可用的, 可以 PCR 擴增完整 cDNA 插入序列 ( 含有 5′和 3′非編碼區 )。可設計正向引物和反向引物, 使它們 分別或者含有 attB1 序列和在該 cDNA 插入序列前面的載體特異性序列或者含有 attB2 序 列和在該 cDNA 插入序列后面的載體特異性序列。對于克隆進載體 pBLUESCRIPT SK+ 中的 cDNA 插入序列, 可使用正向引物 VC062(SEQ ID NO : 16) 和反向引物 VC063(SEQ ID NO : 17)。
     方 法 3( 基 于 基 因 組 DNA 的 方 法 ) : 能 夠 使 用 長 程 基 因 組 PCR 捕 集 獲 取 基 因 組 序 列。 能 夠 基 于 基 因 座 序 列 設 計 引 物, 并 且 能 夠 對 所 得 PCR 產 物 測 序。 能 夠 使 用 FGENESH(Salamov, A.and Solovyev, V.(2000)Genome Res., 10 : 516-522) 程序進行序列分 析, 并且任選地能夠與來自其他物種的同源序列進行比對以輔助鑒定推定的內含子和外顯 子。
     方法 1、 2 和 3 可根據本領域技術人員已知的步驟進行修改。例如, 方法 1 的引物 可含有限制性酶切位點而不是 attB1 和 attB2 位點, 用于后來將 PCR 產物克隆進含有 attB1 和 attB2 位點的載體內。另外, 方法 2 可涉及從 cDNA 克隆、 λ 克隆、 BAC 克隆或基因組 DNA 擴增。
     可利用 BP 重組反應將通過任一種上述方法獲取的 PCR 產物與 GATEWAY 供體載
    體 ( 例如 pDONRTMZeo(SEQ ID NO : 2; 圖 2) 或 pDONRTM221(SEQ ID NO : 3; 圖 3) 組合。這種方 TM 法將細菌致死 ccdB 基因以及氯霉素抗性基因 (CAM) 從 pDONR Zeo 或 pDONRTM221 移除并定 向地克隆了在旁側具有 attB1 和 attB2 位點的 PCR 產物而得到入門克隆 (entry clone)。 使用 INVITROGENTM GATEWAY CLONASETM 技術, 然后可將來自入門克隆的編碼同源包含 SNF2結構域的多肽的序列轉移到合適的目的載體中, 例如 pBC-Yellow(SEQ ID NO : 4; 圖 4)、 PHP27840(SEQ ID NO : 5; 圖 5)、 或 PHP23236(SEQ ID NO : 6; 圖 6), 以獲取植物表達載體, 所 述載體分別用于擬南芥屬、 大豆、 和玉米。 TM
     供體載體 pDONR /Zeo 或 pDONRTM221 的 attP1 和 attP2 位點分別顯示于圖 2 和圖 3 中。目的載體 pBC-Yellow、 PHP27840 和 PHP23236 的 attR1 和 attR2 位點分別顯示于圖 4、 5 和 6 中。
     作為另外一種選擇, 可進行多個入門克隆和合適的目的載體之間的 MultiSite Gateway LR 重組反應以產生表達載體。 實施例 10
     用驗證過的擬南芥屬前導基因制備大豆表達載體并轉化大豆
     為了檢查所得表型, 可將大豆植株轉化以過表達每個驗證過的擬南芥屬基因或來 自不同物種的對應同源物。
     可將實施例 5 中所述的相同 GATEWAY 入門克隆用于將每個基因定向克隆進
    PHP27840 載體 (SEQ ID NO : 5; 圖 5) 中, 使得該基因的表達處于 SCP1 啟動子的控制下。
     然后可用包含編碼本多肽的序列的表達載體轉化大豆胚。 大豆轉化和再生技術已 經在國際專利公布 WO 2009/006276 中進行了描述, 其內容以引用方式并入本文。 可在氮限制條件下 ( 例如 1mM 硝酸鹽 ) 栽培 T1 植株并分析表型變化。利用圖像 分析可定量下面的參數 : 可收集并定量植株面積、 體積、 生長速率以及顏色分析。超表達構 建體與合適的對照植物比較導致綠度 ( 綠色區 )、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時的鮮重或 干重、 果實或種子產量、 總植物氮含量、 果實或種子氮含量、 營養組織的氮含量、 總植物游離 氨基酸含量、 營養組織中的游離氨基酸含量、 果實或種子中的游離氨基酸含量、 果實或種子 中的蛋白質含量、 營養組織中的蛋白質含量發生變化, 可認為它是擬南芥屬前導基因在大 豆中發揮功能提高對氮缺乏耐受性 ( 增加的氮耐受性 ) 的證據。
     可分析用驗證過的基因轉化大豆植株以研究相對于對照或參照植株的農學特性。 例如, 可分析在低氮和高氮條件 ( 如氮限制條件和氮充分條件 ) 下的產量增加和 / 或穩定 性。
     實施例 11
     使用粒子轟擊法用驗證過的擬南芥屬前導基因轉化玉米
     為了檢查所得表型, 可將玉米植株轉化以過表達驗證過的擬南芥屬前導基因或來 自不同物種的對應同源物。
     可以將實施例 5 中所述的相同 GATEWAY 入門克隆用于將每種相應的基因定向
    克隆進玉米轉化載體中。在玉米轉化載體中的基因的表達可以處于組成型啟動子的控 制下, 例如玉米泛素啟動子 (Christensen 等人, Plant Mol.Biol.12 : 619-632(1989) 和 Christensen 等人, Plant Mol.Biol.18 : 675-689(1992)) 然后可通過粒子轟擊將上述重組 DNA 構建體引入玉米細胞中。通過粒子轟擊進行 玉米轉化的技術已經在國際專利公布 WO 2009/006276 中進行了描述, 其內容以引用方式 并入本文。
     可在氮限制條件下 ( 例如 1mM 硝酸鹽 ) 栽培 T1 植株并分析表型變化。利用圖像 分析可定量下面的參數 : 可收集并定量植株面積、 體積、 生長速率以及顏色分析。超表達構
     建體與合適的對照植物比較導致綠度 ( 綠色區 )、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時的鮮重或 干重、 果實或種子產量、 總植物氮含量、 果實或種子氮含量、 營養組織的氮含量、 總植物游離 氨基酸含量、 營養組織中的游離氨基酸含量、 果實或種子中的游離氨基酸含量、 果實或種子 中的蛋白質含量、 營養組織中的蛋白質含量發生變化, 可認為它是擬南芥屬前導基因在玉 米中發揮功能提高對氮缺乏耐受性 ( 增加的氮耐受性 ) 的證據。
     實施例 12
     電穿孔根癌農桿菌 LBA4404
     將電穿孔感受態細胞 (40μl), 例如根癌農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens) LBA4404( 含有 PHP10523) 在冰上解凍 (20-30 分鐘 )。 PHP10523 含有用于 T-DNA 轉移的 VIR 基因、 農桿菌屬的低拷貝數質粒復制起始區、 四環素抗性基因以及用于體內 DNA 生物分子 重組的 cos 位點。同時, 將電穿孔管 (electroporation cuvette) 在冰上冷卻。將該電穿 孔儀的設置調節至 2.1kV。將 DNA 等分試樣 (0.5μL 親代 DNA, 在低鹽緩沖液或雙蒸 H2O 中 的濃度為 0.2μg-1.0μg) 與解凍的根癌農桿菌 LBA4404 細胞混合, 同時仍然保持在冰上。 將混合物轉移至電穿孔管的底部并靜止保持在冰上 1-2 分鐘。按下 “pulse( 脈沖 )” 鍵兩 次 ( 理想的是獲取 4.0 毫秒的脈沖 ) 對細胞進行電穿孔 (Eppendorf 電穿孔儀 2510)。隨 后, 將 0.5mL 室溫下的 2xYT 培養基 ( 或 SOC 培養基 ) 加入到電穿孔管并轉移至 15mL 按壓 蓋管 ( 例如 FALCONTM 管 ) 中。將細胞在 28-30℃、 200-250rpm 下培養 3 小時。 將 250μL 的等分試樣散布在包含 YM 培養基和 50μg/mL 奇放線菌素的板上并在 28-30℃下培養三天。為了增加轉化體的數目, 可進行如下兩個可選步驟中的其中一個 :
     選擇 1 : 用 30μL 15mg/mL 的利福平覆蓋平板。LBA4404 具有針對利福平的染色體 抗性基因。這種附加的選擇消除了在使用較差的 LBA4404 感受態細胞制備物時觀察到的一 些污染克隆。
     選擇 2 : 進行兩次重復的電穿孔以補償較差的電感受態細胞。
     轉化體的鑒定 :
     選取四個獨立的克隆并劃痕接種在包含 AB 基本培養基和 50μg/mL 奇放線菌素的 平板上用于分離單個克隆。 將平板在 28℃下孵育二至三天。 對于每個推定的共整合體選取 單個克隆并將其接種在 4mL 的 10g/L 細菌蛋白胨, 10g/L 酵母提取物, 5g/L 氯化鈉, 和 50mg/ L 奇放線菌素中。將該混合物在 28℃下搖動培養 24 小時。采用 QIAGEN Miniprep 和可選 的 PB 緩沖液洗滌, 從 4mL 培養物分離出質粒 DNA。DNA 在 30μl 中洗提。如上所述, 將 2μL 可將 15μl 等分試樣用于 的等分試樣用于電穿孔 20μL DH10b+20μL 雙蒸 H2O。可任選地, TM 轉化 75-100μl 的 INVITROGEN Library Efficiency DH5α。將細胞散布在包含 LB 培養 基和 50μg/mL 奇放線菌素的平板上并將其在 37℃下培養過夜。
     對于每個推定的共整合體選取三至四個獨立克隆并將其接種在 4mL 的 2xYT 培養 基 (10g/L 細菌蛋白胨, 10g/L 酵母提取物, 5g/L 氯化鈉 ) 和 50μg/mL 奇放線菌素中。將 細胞在 37℃下搖晃培養過夜。接下來, 使用 QIAprep Miniprep, 用任選 PB 緩沖液洗滌液
    ( 稀釋成 50μL) 從 4mL 培養物中分離質粒 DNA。8μL 質粒 DNA 用 SalI( 使用親本 DNA 和 PHP10523 作對照物 ) 進行消化。對于 4 個質粒利用限制性內切酶 BamHI、 EcoRI 和 HindIII 再進行三次消化 ( 使用親本 DNA 和 PHP10523 作為對照 ), 這 4 個質粒代表 2 種具有正確 SalI 消化模式的推定共整合體。推薦電凝膠 (Electronic gel) 用于比較。實施例 13
     使用農桿菌屬 (Agrobacterium) 細菌轉化玉米
     為了檢查所得表型, 可將玉米植株轉化以過表達驗證過的擬南芥屬前導基因或來 自不同物種的對應同源物。
     農 桿 菌 介 導 的 玉 米 轉 化 基 本 上 按 照 Zhao 等 人, Meth.Mol.Biol.318 : 315-323(2006) 中描述的方法進行 ( 還可參見 Zhao 等人, Mol.Breed.8 : 323-333(2001) 和 1999 年 11 月 9 日公布的美國專利 5,981,840, 所述文獻以引用方式并入本文 )。該轉化過 程涉及細菌接種、 共培養、 靜息、 選擇和植物再生。
     1. 未成熟胚芽制備 :
     將未成熟胚芽從穎果上切下來, 并且放置在含有 2mL PHI-A 培養基的 2mL 微管中。
     2. 未成熟胚芽的農桿菌屬細菌感染和其培養 :
     2.1 感染步驟 :
     用 1mL 微吸移管將 (1) 的 PHI-A 培養基取出, 并且加入 1mL 農桿菌屬懸浮液。將 該管輕輕地倒置以混合。將該混合物在室溫下培養 5 分鐘。
     2.2 共培養步驟 :
     用 1mL 微量吸移管將農桿菌屬懸浮液從感染步驟中移出。使用無菌刮刀將胚從管 中刮出并轉移到 100×15mm 培養皿中的 PHI-B 培養基的平板中。測定胚的朝向, 使得胚軸 在培養基表面上朝下。將具有胚芽的平板在 20℃下于黑暗中培養三天。L- 半胱氨酸可用 于共培養階段。采用標準二元載體, 補充有 100-400mg/L L- 半胱氨酸的共培養培養基對于 回收穩定的轉基因事件是至關重要的。
     3. 選擇推定的轉基因事件 :
     向在 100×15mm 培養皿中的 PHI-D 培養基的平板中轉移 10 個胚芽, 保持朝向, 并 且用 parafilm 將培養皿密封。將平板在黑暗中于 28℃下培養。預計在六至八周將看見作 為黃色胚芽組織的主動生長推定事件。不產生事件的胚可能是棕色和壞死的, 并且幾乎看 不見脆性組織生長。以二 - 三周的間隔將推定的轉基因胚芽組織轉移到新鮮的 PHI-D 平板 上進行傳代培養, 時間間隔取決于生長速度。記錄事件。
     4.T0 植株的再生 :
     將在 PHI-D 培養基上繁殖的胚芽組織轉移到在 100×25mm 培養皿中的 PHI-E 培 養基 ( 體細胞胚芽成熟培養基 ) 中進行傳代培養, 在 28℃于黑暗中培養直至體細胞胚芽成 熟, 培養大約十至十八天。將具有良好限定的盾片和胚芽鞘的個體成熟體細胞胚芽轉移到 PHI-F 胚芽發芽培養基中, 并且在 28℃下于光中 ( 約 80μE, 來自冷光燈或同等熒光燈 ) 培 養。在七至十天, 將約 10cm 高的再生的植株置于盆中的園藝混合物中, 并且使用標準園藝 方法進行耐寒鍛煉 (hardened-off)。
     用于植物轉化的培養基 :
     1.PHI-A : 4g/L CHU 基礎鹽, 1.0mL/L 1000×Eriksson′ s 維生素混合物, 0.5mg/L 鹽酸硫胺, 1.5mg/L 2, 4-D, 0.69g/L L- 脯氨酸, 68.5g/L 蔗糖, 36g/L 葡萄糖, pH5.2。加入 100μM 乙酰丁香酮 ( 過濾滅菌的 )。
     2.PHI-B : PHI-A, 不含有葡萄糖, 將 2, 4-D 增加至 2mg/L, 將蔗糖降低至 30g/L, 并 且補充 0.85mg/L 硝酸銀 ( 過濾滅菌的 ), 3.0g/LGELRITE , 100μM 乙酰丁香酮 ( 過濾滅菌的 ), pH5.8。
     3.PHI-C : PHI-B, 不含 GELRITE 和乙酰丁香酮, 將 2, 4-D 降低至 1.5mg/L, 并且補 充 8.0g/L 瓊脂, 0.5g/L 2-[N- 嗎啉代 ] 乙烷 - 磺酸 (MES) 緩沖液, 100mg/L 羧芐西林 ( 過 濾滅菌的 )。
     4.PHI-D : PHI-C 補充 3mg/L 雙丙氨磷 ( 過濾滅菌的 )。
     5.PHI-E : 4.3g/L Murashige and Skoog(MS) 鹽 (Gibco, BRL 11117-074), 0.5mg/L 煙酸, 0.1mg/L 鹽酸硫胺, 0.5mg/L 鹽酸吡哆醇, 2.0mg/L 甘氨酸, 0.1g/L 肌醇, 0.5mg/L 玉米 素 (Sigma, 目錄 No.Z-0164), 1mg/L 吲哚乙酸 (IAA), 26.4μg/L 脫落酸 (ABA), 60g/L 蔗糖, 3mg/Lbialaphos( 過濾滅菌的 ), 100mg/L 羧芐西林 ( 過濾滅菌的 ), 8g/L 瓊脂, pH5.6。
     6.PHI-F : PHI-E, 不 含 有 玉 米 素、 IAA、 ABA ; 將 蔗 糖 降 低 至 40g/L ; 用 1.5g/L GELRITE 替代瓊脂 ; pH 5.6。 通過首先將組織簇轉移到補充有 0.2mg 每升的 2, 4-D 的 N6 培養基中, 可從該 轉基因愈傷組織再生出植物。兩周后, 可將組織轉移到再生培養基中 (Fromm 等人, Bio/ Technology 8 : 833-839(1990))。
     轉基因 T0 植株可以再生, 并且可以確定其表型。可收集 T1 種子。
    此外, 可通過直接轉化或者從單獨轉化的品系基因滲入而將含有證實的擬南芥屬 基因的重組 DNA 構建體導入玉米自交系內。
     自交或雜交的轉基因植物可通過更嚴苛的大田試驗來研究在氮限制條件下和非 氮限制條件下的產量增加和 / 或穩定性。
     隨后可進行產量分析以測定包含驗證過的擬南芥屬前導基因的植物在與不包含 驗證過的擬南芥屬前導基因的對照植物 ( 或參比植物 ) 進行比較時是否具有產量改善 ( 在 氮限制條件下和非氮限制條件下 )。包含驗證過的擬南芥前導基因的植物在氮限制條件下 將具有比對照植物更少的產量損失, 例如至少 25%更少的產量損失, 或者在非氮限制條件 下將具有比對照植物更高的產量。
     實施例 14A
     用于用經過驗證的候選擬南芥屬基因 (At1g61140) 通過農桿菌屬轉化玉米品系 的表達載體的制備
     使用 INVITROGENTM GATEWAY 技術, 用 GATEWAY 入門克隆進行 LR 重組反應, 所述
    入門克隆具有編碼擬南芥屬包含 SNF2 結構域的蛋白的序列 ( 如實施例 5 所述, 并且在該 實施例和隨后的實施例中稱為 AT-SNF2.1)、 入門克隆 PHP23112(SEQ ID NO : 14)、 入門克隆 PHP20234(SEQ ID NO : 9; 圖 9) 和目的載體 PHP22655(SEQ ID NO : 10) 的序列以生成前體質 粒 PHP29872。PHP29872 包含以下表達盒 :
     1. 表達 PAT 抗除草劑性基因的泛素啟動子 ::moPAT::PinII 終止子盒, 該基因用于 轉化過程期間的選擇。
     2. 表達 DS-RED 顏色標記的 LTP2 啟動子 ::DS-RED2::PinII 終止子盒, 該標記用于 分選種子。 3. 泛素啟動子 ::AT-SNF2.1::PinII 終止子盒過表達擬南芥屬包含 SNF2.1 結構域 的蛋白質 (At1g61140.1)。
     實施例 14B
     用經驗證的候選擬南芥屬基因 (At1g61140) 通過農桿菌屬轉化玉米品系
     使用如實施例 12 和 13 所述的農桿菌介導轉化, 能將存在于載體 PHP29872( 如 14A 所述 ) 中、 或包含其他兩種 At1g61140 突變體中的任一種的載體中的 SNF2.1 表達盒導入玉 米自交系、 或來源于優良玉米自交系的可轉化玉米品系。
     可將表達載體 PHP29872 通過電穿孔導入包含載體 PHP10523(SEQ ID NO : 7, 圖 7) 的 LBA4404 農桿菌屬菌株以制備共整合載體 PHP29875, 該載體包含 SNF2.1 表達盒。共整 合載體通過每個載體上包含的 COS 重組位點重組兩個質粒 PHP29872 和 PHP10523 形成, 并 且除了農桿菌菌株以及農桿菌介導轉化需要的其他基因 (TET、 TET、 TRFA、 ORI 終止子、 CTL、 ORI V、 VIR C1、 VIR C2、 VIR G、 VIR B) 之外, 還包含上述相同的三個表達盒 ( 實施例 14A)。 可使用 ( 但不限于 ) 實施例 12 中的電穿孔規程。
     實施例 15
     用于轉入 Gaspe Flint 衍生的玉米品系的目的載體 PHP23236 的制備
     目的載體 PHP23236( 圖 6, SEQ ID NO : 6) 通過用載體 PHP23235( 圖 8, SEQ ID NO : 8) 轉化農桿菌屬菌株 LBA4404 并分離所得共整合產物而獲取, 所述菌株包含質粒 PHP10523( 圖 7, SEQ ID NO : 7)。
     目的載體 PHP23236 可被用于如實施例 16 所述的與入門克隆的重組反應, 以產生 用于轉化 Gaspe Flint 衍生的玉米品系的玉米表達載體。
     實施例 16
     用于轉入 Gaspe Flint 衍生的玉米品系的表達構建體的制備
     使用 INVITROGENTM GATEWAY LR 重組技術, 可將如實施例 5 所述的相同入門克 隆定向克隆到目的載體 PHP29634(SEQ ID NO : 15 ; 圖 11) 中以形成表達載體。目的載體 PHP29634 與目的載體 PHP23236 是相似的, 但是, 目的載體 PHP29634 具有位點特異性的重 組位點 FRT1 和 FRT87, 并且還編碼用于利用草甘膦對轉化體進行選擇的 GAT4602 選擇性標 記蛋白。該表達載體將包含所述受關注的 cDNA, 其在 UBI 啟動子的控制下編碼 At-SNF2.1、 At-SNF2.2、 或 AtSNF2.3, 并且是農桿菌介導轉化到玉米中的 T-DNA 二元載體, 該載體如本 文所述實施例所述但不受其限制。 實施例 17A
     用驗證過的候選擬南芥屬基因 (At1g61140) 轉化 Gaspe Flint 來源的玉米品系
     為了檢查所得表型, 可轉化玉米植株以過表達擬南芥屬 At1g61140 基因 ( 和來自 其他物種的對應同源物 )。可使用如實施例 16 所述的表達構建體。
     受體植株
     受體植株細胞可來自具有短的生活周期 ( “快速循環” )、 小的個體尺寸以及轉化潛 能高的單一玉米品系。對玉米典型的這些植株細胞是來自可公開獲得的 Gaspe Flint(GF) 品 系 變 種 的 植 株 細 胞。 一 種 可 能 的 候 選 植 株 品 系 變 種 是 GF×QTM(Quick Turnaround Maize( 快速周轉玉米 ), 選擇用于在溫室條件下生長的 Gaspe Flint 的可公開獲得形式 ) 的 F1 雜交種, 其在 Tomes 等人 ( 美國專利申請 10/367,416, 提交于 2003 年 2 月 13 日 ; 美 國專利公開 2003/0221212 A1, 公布于 2003 年 11 月 27 日 ) 中公開。從該品系獲得的轉基 因植株具有如此小的尺寸使得它們可在四英寸的盆中生長 ( 是正常大小的玉米植株所需 空間的 1/4) 并且它們在少于 2.5 個月時間內成熟。( 傳統上, 一旦轉基因植株適應溫室后
     需要 3.5 個月來獲得轉基因 T0 種子。) 另一合適的品系包括但不限于 GS3( 高度可轉化的 品系 )X Gaspe Flint 的雙單倍體品系。還有另一種合適的品系是攜帶引起較早開花、 高度 減小或這兩者的轉基因的可轉化的優良玉米自交系。
     轉化規程
     任何合適的方法可用于將轉基因引入玉米細胞中, 包括但不限于利用基于農桿菌 屬載體的接種類型的步驟 ( 參見例如實施例 12 和 13)。轉化可在受體 ( 靶標 ) 植株的未成 熟胚上進行。
     精確的生長和植株跟蹤
     將由轉化的玉米胚產生的轉基因 (T0) 植株的事件群體在受控的溫室環境中栽 培, 該溫室使用改良的隨機分塊 (block) 設計以降低或消除環境誤差。隨機分塊設計是這 樣一種植株布局, 在該布局中, 實驗植株被分成組 ( 如, 每組三十株植株 ), 稱為塊, 而每株 植株隨塊被隨機分配一個位置。
     對于一組三十株植株, 二十四株轉化的實驗植株和六株對照植株 ( 具有設定好的 表型的植株 )( 總起來說稱為 “重復組” ) 被置于盆中, 這些盆在位于溫室內的桌子上布置成 陣列 ( 也叫做重復組或塊 )。每株植株 ( 對照植株或實驗植株 ) 隨塊被隨機分配一個位置, 所述的塊映射一個唯一的、 溫室物理位置以及映射該重復組。在單次實驗中多個三十株植 株的重復組中的每一個可栽培在相同的溫室中。應該測定重復組的布局 ( 布置方式 ) 以使 對空間的要求最小以及溫室內的環境影響最小。這樣一種布局可稱為壓縮的溫室布局。
     對于加入特定的對照組的一種替代方法是鑒定不表達受關注基因的那些轉基因 植株。可將諸如 RT-PCR 之類的多種技術應用于定量評估引入基因的表達水平。可將不表 達轉基因的 T0 植株與表達轉基因的那些植株進行比較。
     在整個評價過程中鑒定和跟蹤事件群體中的每株植株, 并且從那些植株收集的數 據自動與那些植株相關聯, 使得所搜集的數據可與由該植株攜帶的轉基因關聯。 例如, 每個 植株容器具有機器可讀的標簽 ( 例如通用貨單代碼 (UPC) 條形碼 ), 該標簽包含了關于植物 身份的信息, 身份信息繼而又與溫室位置相關, 使得從植物獲得的數據可自動與該植物相 關聯。
     作為另外一種選擇, 可使用任何有效的、 機器可讀的植物識別系統, 例如二維矩陣 代碼或甚至是射頻識別標簽 (RFID), 其中數據被接收并由射頻接收器 / 處理器進行翻譯。 參見美國專利申請 10/324,288, 提交于 2002 年 12 月 19 日 ( 美國專利公布 2004/0122592 A1, 公布于 2004 年 6 月 24 日 ), 以引用方式并入本文。
     利用三維成像進行表型分析
     對 T0 事件群體中的每株溫室植株 ( 包括任何對照植株 ) 分析所關注的農學特性, 并且以這樣一種方式記錄或存儲每株植株的農學數據, 該方式使得數據與該植株的辨識數 據 ( 見上面 ) 相關聯。可利用與上述類似的實驗設計, 可在 T1 代中完成對表型 ( 基因效 應 ) 的確認。
     在植物的整個溫室生活周期中, 利用定量的非破壞性成像技術在表型水平上來分 析 T0 植株以評估所關注的性狀。任選地, 將數字成像分析儀用于整株植物的自動多維分 析。成像可在溫室內進行。將兩個攝像系統 ( 位于頂部和側面 ) 和用于旋轉植物的裝置用 于從所有側面觀察植物和成像。從每株植物的頂部、 前面和側面采集圖像。所有的三個圖像一起提供了足夠的信息用于評價例如每株植物的生物量、 大小和形態。
     由于植物在第一片葉片從土壤顯現出來時到植物處于它們發育的末期時大小的 改變, 從頂部以較高的放大倍率任選地記錄植物發育的早期。這攝像可通過利用完全由成 像軟件控制的自動變焦鏡頭系統來完成。
     在單次成像分析操縱中, 進行如下事件 : (1) 將植株傳送至分析儀區域內, 旋轉 360 度以便其機器可讀標簽可被讀取, 并且讓其保持靜止直至其葉片停止移動 ; (2) 獲取側 面圖像并將其輸入數據庫 ; (3) 將植株旋轉 90 度并再次讓其保持靜止直至其葉片停止移 動, 以及 (4) 將該植株傳送出分析儀。
     每二十四小時的周期讓植物至少六個小時處于黑暗以便具有正常的白天 / 黑夜 周期。
     成像儀器
     可 使 用 任 何 合 適 的 成 像 儀 器, 包 括 但 不 限 于 可 從 LemnaTec GmbH(Wurselen, Germany) 商購獲得的光譜數字成像儀。 獲取圖像并用具有 1/2″ IT Progressive Scan IEE CCD 成像設備的 LemnaTec Scanalyzer HTS LT-0001-2 進行分析。該成像照相機可配備有 自動變焦、 自動調節光圈和自動聚焦。可利用 LemnaTec 軟件設定所有的照相機設置。任選 地, 對于主要組成成像分析儀的儀器差異小于約 5%, 對于次要組成成像分析儀的儀器差異 小于約 10%。 軟件
     成像分析系統包括用于顏色和構造分析的 LemnaTec HTS Bonit 軟件程序和用于 存儲約 500,000 次分析的數據 ( 包括分析數據 ) 的服務器數據庫。原始圖像和分析過的圖 像儲存在一起以允許用戶根據需要進行再次分析。 可將數據庫連接至成像硬件用于自動的 數據收集和存儲。多種可商購獲得的軟件系統 ( 例如 Matlab, 其他軟件 ) 可用于定量解釋 圖像數據, 并且可將這些軟件體系中的任何一種應用于所述圖像數據集。
     傳送系統
     具有植物旋轉裝置的傳送系統可用于將植物傳送至成像區域并在成像過程中選 擇植物。例如, 將最多四株植物 ( 每株最高高度為 1.5m) 裝上汽車, 該汽車在循環的傳送系 統上行進并通過成像測量區域。在這種情況下, 該單位 ( 成像分析儀和傳送環線 ) 的總占 有面積為約 5m×5m。
     可擴大傳送系統以同時容納更多植物。 將植物沿傳送環線傳送至成像區域并對每 株植物分析最多 50 秒。獲取植物的三個視圖。傳送系統以及成像設備應該能夠用于溫室 環境條件。
     照明
     任何合適的照明模式可用于圖像采集。例如, 可在暗背景上使用頂部照明。作為 另外一種選擇, 可采用使用白色背景的頂部照明和背部照明的組合。應該將被照亮的區域 圍起來以確保恒定的照明條件。 遮蔽物應該長于測量區域使得能保持恒定的光條件而不需 要打開和關閉門。 作為另一種選擇, 可變化照明以引起轉基因 ( 如, 綠色熒光蛋白 (GFP)、 紅 色熒光蛋白 (RFP)) 的激發或者引起內源性 ( 如葉綠素 ) 熒光基團的激發。
    
    
    基于三維成像的生物量評價 為了更好地評價生物量, 應該從至少三個軸 ( 任選地, 頂部視圖和兩個側面 ( 側面1 和側面 2) 視圖 ) 獲取植物圖像。然后分析這些圖像以將植物從背景 ( 盆和花粉控制袋 ( 如果適用的話 )) 分離。可通過如下計算評價植物的體積 :
     體積 ( 體素 ) = - √頂部面積 ( 像素 )× √側面 1 面積 ( 像素 )× √側面 2 面積 ( 像素 )
     在上面的等式中, 體積和面積的單位是 “任意單位” 。 在該系統中, 任意單位完全足 以檢測基因對植物大小和生長影響, 因為所需的是檢測與實驗平均值或對照平均值的差值 ( 正較大和負較小兩者 )。大小 ( 如面積 ) 的任意單位可通過將物理參照加入到成像過程 而輕易地轉化成物理量度。例如, 可在頂部成像過程和側面成像過程兩者中均包括已知面 積的物理參照。 基于這些物理參照的面積, 可測定轉換因子以允許從像素轉換為面積單位, 2 例如平方厘米 (cm )。物理參照可以是或可以不是獨立的樣本。例如, 具有已知直徑和高度 的盆足可用作物理參照。
     顏色分類
     成像技術還可用于測定植物顏色以及用于將植物顏色歸為各種衍生類型。 將圖像 顏色歸屬于顏色類型是 LemnaTec 軟件的固有特色。使用其他圖像分析軟件系統, 可通過多 種計算方法測定顏色分類。
     對于植物大小和生長參數的測定, 一種有用的分類方案是定義一種單一顏色方 案, 包括綠色的兩種或三種色調 ( 例如色調是 50-66, 參見圖 13), 此外, 還有關于缺綠病、 壞 死和漂白 ( 在這些條件出現時 ) 的顏色類型。還使用了背景顏色類型, 其包括圖像中的非 植物顏色 ( 例如盆和土壤顏色 ), 并將這些像素特別地從測定大小中排除。 在受控的恒定照 明下分析植物, 使得可以定量一株植物內隨時間推移的任何改變, 或者植物之間或植物不 同分枝之間的任何改變 ( 如季節差異 )。
     除了其在測定植物的大小、 生長中的有效性以外, 顏色分類還可用于評估其他產 量構成性狀。對于這些其他產量構成性狀, 可使用另外的顏色分離方案。例如, 稱為 “保綠 度 (staygreen)” 的性狀 ( 已經將其與產量的提高相關聯 ) 可通過顏色分類來評估, 該顏色 分類將綠色色調與黃色和棕色色調 ( 其指示老化的組織 ) 相分離。通過將這種顏色分類應 用于在 T0 或 T1 植物生活周期末獲取的圖像, 可鑒定綠色的量相對于黃色和棕色 ( 例如, 可 表示為綠色 / 黃色比率 ) 增加的植物。這種綠色 / 黃色比率具有顯著差異的植物可被鑒定 為攜帶影響這種重要農學性狀的轉基因。
     熟練的植物學家將認識到可指示植物健康或應激反應的其他植物顏色 ( 花青素 ) 的出現, 以及認識到其他顏色分類方案可提供對基因在與這些響應相關的性狀方面的作用 的進一步度量。
     植物結構分析
     改變植物結構參數的轉基因也可以用本發明鑒定, 包括諸如最大高度和寬度、 節 間距離、 葉與莖之間的角度、 在節處開始的葉片數以及葉片長度。 LemnaTec 系統軟件可如下 用于測定植物構造。在第一成像步驟中將植物簡化至其主要的幾何構造, 并且隨后基于該 圖像可進行不同構造參數的參數化鑒定。 或者是單獨地或者是組合地修改任何這些構造參 數的轉基因可通過應用此前所述的統計方法來鑒定。
     花粉脫落日期
     花粉脫落日期是轉基因植物中要分析的一個重要參數, 并且可通過活性雄花第一次出現在植物上來測定。為了找到雄花目標, 通過顏色對莖的上端進行分類以檢測黃色或 紫色花藥。然后將這種顏色分類分析用于定義活性花, 活性花繼而可用于計算花粉脫落日 期。
     作為另外一種選擇, 花粉脫落日期和其他易于在視覺上檢測到的植物屬性 ( 如授 粉日期、 第一穗絲日期 ) 可以由負責進行植物看護的工作人員來記錄。為了使數據完整性 和過程效率最大化, 通過利用相同的由 LemnaTec 光譜數字分析設備利用的條形碼來跟蹤 該數據。 可將具有條形碼閱讀器的電腦、 掌上設備或筆記本電腦用于使記錄觀察時間、 植物 標識符的數據捕捉變得容易, 以及使捕捉數據的操作者感覺舒適。
     植物的取向
     以接近商業栽培的密度種植的成熟玉米植物通常具有平面的構造。也就是說, 植 物具有一可清晰分辨的寬的側面和窄的側面。對來自植物寬側的圖像進行測定。對于每株 植物, 給其賦予一個明確界定的基本取向以獲得寬側圖像與窄側 (edgewise) 圖像之間的 最大差別。將頂部圖像用于測定植物的主軸, 而將額外的旋轉裝置用于在開始主圖像采集 前將植物轉至合適的取向。
     實施例 17B
     用玉米同源物轉化 Gaspe Flint 衍生的玉米品系
     使用 INVITROGENTM GATEWAY LR 重組技術, 可制備入門克隆用于任何玉米同源物 (SEQ ID NO : 18/19、 20/21、 22/23、 43/44、 或 45/46)( 入門克隆的制備參見實施例 5), 并能 夠將入門克隆定向克隆到 GATEWAY 目的載體 29634(SEQ ID NO : 15 ; 圖 11) 中以制備對應 的表達載體。每個表達載體將包含處于 UBI 啟動子控制下的所關注的 cDNA, 并且將是用 于農桿菌屬介導的向玉米內的轉化的 T-DNA 二元載體, 所述玉米如但不限于本文所述的實 例。 實施例 18
     在氮限制條件下對玉米品系的篩選
     Gaspe Flint 來源的玉米品系
     轉基因植物可含有兩個或三個劑量的 Gaspe Flint-3 與一個劑量的 GS3(GS3/ (Gaspe-3)2X 或 GS3/(Gaspe-3)3X), 并且對于顯性轉基因會以 1 ∶ 1 分離。將轉基因植物 在 100% Turface( 一種商業栽培培養基 ) 中栽培, 每天用 1mM KNO3 生長培養基和 2mM KNO3 或更高的生長培養基澆灑四次 ( 參見圖 14)。 在 1mM KNO3 培養基中培養的對照植物的綠度 較小, 產生較少的生物量并且在開花期具有較小的穗 ( 關于樣本數據的示例請參見圖 15)。 Gaspe 來源的品系將生長至開花期。
     將用統計學確定處理株之間所觀察到的差異是否真有差異。圖 15 示出了一種方 法, 該方法將字母放在數值后面。同一列中其后具有相同字母 ( 不是字母組 ) 的那些值不 具有顯著的差異。 使用該方法, 如果在一列中的值的后面沒有字母, 則該列中的這些值的任 何之間不存在顯著的差異, 換句話講, 該列中的所有這些值是均等的。
     與無效轉基因相比較, 轉基因的表達將導致植物在 1mM KNO3 中具有改善的植物生 長。因此生物量和綠度 ( 如實施例 2 和 17A 所述 ) 將在生長期間進行監控, 并與無效轉基 因植物比較。生長、 綠度、 開花期穗的大小的改善將表明氮耐受性增強。
     幼苗測定
     還可采用幼苗測定對轉基因玉米植物進行評估, 所述測定對植物在氮限制條件 下的表現進行評估。例如, 在 18 天幼苗測定中, 轉基因植物被種植于商品化盆栽培養基 Turface 中, 然后用包含下列營養物質的溶液每天澆四次 : 1mM CaCl2、 2mM MgSO4、 0.5mM KH2PO4、 83ppmSprint330、 3mM KCl、 1mM KNO3、 1μM ZnSO4、 1μM MnCl2、 3μM H3BO4、 0.1μM CuSO4 和 0.1μM NaMoO4。植物在種植后 18 天收獲, 并且評價多個性狀, 包括但不限于 : SPAD( 綠度 )、 莖直徑、 根干重、 苗干重、 總干重、 mg 氮每克干重 (mg N/g dwt)、 以及植物氮濃 度。采用 Studentt 檢驗, 以 0.1 的最小值 (P < t) 比較平均值和無效轉基因平均值參數。
     實施例 19
     氮利用效率幼苗檢測分析法
     利用種子顏色標記將轉基因事件的種子分成了轉基因的 ( 處理 1 ; 包含構建體 PHP29875) 和無效的 ( 處理 2) 種子。
     每一處理 ( 轉基因的或批無效的 ) 被隨機分配至 54 個盆 ( 實驗單位 ) 組成的區 塊中, 所述盆按 6 行 9 列排列。重復每個處理 ( 轉基因或批無效的 )9 次。
     將所有種子種在 4 英寸的方盆中, 盆中包含在 8 英寸交錯中心上的 Turface, 每天 用包含以下營養物質的溶液澆灌四次 :
     1mM CaCl2 2mM MgSO4 0.5mM KH2PO4 83ppm Sprint330
     3mM KCl 1mM KNO3 1μM ZnSO4 1μM MnCl2
     3μM H3BO4 1μM MnCl2 0.1μM CuSO4 0.1μM NaMoO4
     植物出苗后, 將其間苗至每盆一個種子。 在收獲時從盆中移除植物, 并且將蒙脫石 從根部洗脫。使根與苗分開, 把根置于紙袋中并且在 70℃干燥 70 小時。將干燥后的植物部 分 ( 根和苗 ) 稱重并置于 50mL 的圓錐管中, 管中有大約 20 5/32 英寸的鋼球, 在涂料振蕩 器中進行振蕩研磨。
     The Nitrogen/Protein Analyzer 來自 Thermo Electron Corporation 的氮 / 蛋 白質分析器 ( 型號 FlashEA 1112N) 使用約 30mg 的基本組織。樣品從自動取樣機被點樣至 氧化反應室內部的坩堝內。在 900℃和純氧條件下, 樣品被強烈的放熱反應氧化, 產生 N2、 CO2、 H2O 和 SO2 的混合氣體。燃燒結束后, 打開載氣氦, 使氣體混合物流入還原反應室。在 680℃, 使氣體混合物流過還原銅, 其中可能形成的氮氧化物被轉化為氮元素而過量的氧氣 被保留。所述氣體混合物從還原反應器流出, 依次經過兩個吸收過濾器。第一個過濾器包 含堿石灰, 留住了二氧化碳和二氧化硫。 第二個過濾器包含分子篩和顆粒狀的硅膠, 以阻止 水通過。 然后, 氮被洗脫進色譜柱, 并被轉至熱導率檢測器, 熱導率檢測器生成電子信號, 所 述電子信號經 Eager 300 軟件的適當處理, 提供了氮 - 蛋白質百分比。
     利用這些數據, 測量了下列參數, 并且采用 Student t 檢驗將轉基因組的參數的平 均值與無效組的參數的平均值進行了比較。
    利用方差分析 (ANOVA) 計算和完全隨機設計 (CRD) 模型, 計算了每一區塊內的方 差。使用 F 統計, 通過將總區塊處理平均面積除以總區塊誤差平均面積對每個區塊計算了 總處理效應。計算了更大的 Student′ s t 檢驗的概率用于比較每個轉基因平均值與合適 的無效轉基因平均值。顯示顯著差異的變量 (*) 具有最小值 (P < t)0.1。
     表 5 示出原始數據和包含構建體 PHP29875 的植物的雙尾 Student’ s t 概率。p 值的數學符號反映所述事件對相應的無效組的相對表現, 即 ‘+’ =提高的表現, ‘-’ =降低 的表現。比較轉基因事件和構建體無效轉基因。無效的構建體是陰性的入門構建體, 其由 來自陰性分離子的果仁的抽樣組成, 并因此是全部陰性的代表性樣本。
     表5: PHP29875 的溫室幼苗測定數據
    
    實施例 20A
     具有擬南芥屬前導基因或玉米同源物的玉米品系的產量分析
     自交或頂交雜交體的轉基因植物可通過更嚴苛的大田試驗來研究在氮限制條件 下和無氮限制條件下的產量增加和 / 或穩定性。標準化的產量試驗將通常包括 4 至 6 次重 復, 以及至少 4 個位置。
     可進行產量分析以測定與構建體無效的或野生型的對照 ( 或參考 ) 植物相比, 包 含編碼包含 SNF2 結構域的蛋白的經驗證擬南芥屬基因或相關玉米基因的植物是否具有產 量表現方面的提高 ( 在氮限制或非氮限制條件下 )。具體地講, 對于包含經驗證的擬南芥 前導基因或 lnt6 的玉米同源物的植物和對照植物, 可于開花和 / 或灌漿時期施加氮限制條 件。可以測得這兩種植物的產量都有所減少。包含驗證過的擬南芥屬前導基因或其玉米同 源物的植物在氮限制條件下將具有比對照植物更少的產量損失, 或者在非氮限制條件下將 具有比對照植物更高的產量。
     實施例 20B
     用 PHP29875 轉化的玉米品系的產量分析
     玉米測交雜種包含存在于載體 PHP29875 中的擬南芥前導基因 ( 編碼包含 SNF2 結 構域的多肽 ) 的表達盒, 并且它們的對照植物于 2008 年和 2009 年在多個位置的低氮 (LN) 和標準氮 (NN) 環境下生長。基于由 Federal and State Extension 服務對特定生長區域 確定的土壤測試標準, 低氮 (LN) 環境指氮量少于在早春或夏季施加的標準氮肥的量, 而標
     準氮 (NN) 環境指加入正常產量所需的充足的氮。與 NN 條件中獲得的產量相比, 在 LN 條件 中觀察到了產量的降低。就該分析而言, 構建體無效組是由來自一種構建體的全部事件的 陰性分離子組成的負輸入, 批無效組是由來自一次實驗的全部構建體的全部陰性分離子組 成的負輸入。
     2008 年在 York, NE(YK) 和 Woodland, CA(WO) 兩個地點對九個轉基因事件進行了 大田試驗, 并評估了產量。玉米測交雜交體被用于與構建體無效的 (CN) 相比較。2008 年大 田試驗的結果顯示于表 6 中。
     表6
     用 PHP29875 轉化的玉米的 2008 年大田試驗
    測量單位為蒲式耳 / 英畝。
     陰影代表與構建體無效 (CN) 相比較顯著性較高的 (P < 0.1) 結果。
     粗體代表與構建體無效 (CN) 相比較顯著性較低的 (P < 0.1) 結果。
     九個以前測試的轉基因事件中有八個是 2009 年在以下位置進行的大田測試 : York, NE(YK) ; Marion, IA(MR)Woodland, CA(WO) ; Dallas Center, IA(DS) ; 和 Princeton, IN(PR)。然而, 在 2009 年玉米測交雜種與批無效 (BN) 進行比較。2009 年大田試驗的結果 顯示于表 7 中。 在 York, 在低氮條件下三個事件顯示產量比批無效顯著提高, 在標準氮條件 下一個事件顯示產量比批無效顯著提高。在 Woodland, 在低氮條件下一個事件具有比批無 效顯著更高的產量。在 Marion, 在低氮條件下三個事件的產量比批無效顯著更高。
     表7
     用 PHP29875 轉化的玉米的 2009 年大田試驗
    
    測量單位為蒲式耳 / 英畝。
     陰影代表與批無效 (BN) 相比較顯著性較高的 (P < 0.1) 結果。
     黑體代表與批無效 (BN) 相比較顯著性較低的 (P < 0.1) 結果。
     實施例 21
     用經驗證的前導基因的大豆同源物對大豆進行的轉化和評估
     基于同源性搜索, 可鑒定驗證過的擬南芥屬前導基因的一個或若干個候選大豆同 源物, 并且還可評估它們增加大豆氮限制條件耐受性的能力。 載體構建、 植物轉化和表型分 析將類似于上文實施例所述的規程。
     實施例 22
     用經驗證的前導基因的玉米同源物對玉米進行的轉化和評估
     基于同源性搜索, 可鑒定經驗證的擬南芥屬前導基因的一個或若干個候選的玉米 同源物 ( 例如 SEQ ID NO : 18/19、 20/21、 22/23、 43/44 或 45/46), 并且還評估它們增加玉米 氮限制條件耐受性的能力。載體構建、 植物轉化和表型分析可類似于上文實施例所述的規 程。
     實施例 23
     用驗證過的前導基因的玉米和大豆同源物轉化擬南芥屬
     可將驗證過的擬南芥屬前導基因的大豆和玉米同源物在 35S 啟動子的控制下轉 化到擬南芥屬中, 并且當在低氮培養基中生長時分析其葉片面積和綠色區積聚。可如本文 實施例所述進行載體構建和植物轉化。檢測分析的條件、 數據采集和數據分析可類似于上 文實施例所述的規程。
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     “SNF2 結構域” 存在于涉及轉錄控制、 DNA 修復、 和重組的 ATP 依賴型染色質重塑 蛋白中。它們包含存在于 DNA/RNA 解旋酶超家族 II 中的七個保守序列基序。
     編碼包含 SNF2 結構域的蛋白的基因無限制地包括擬南芥基因座 At1g61140 的三 個突變體 (SEQ ID NO : 24、 26、 和 28), 本文分別稱為 snf2.1、 snf2.2、 和 snf2.3, 以及來自 其他植物物種的核苷酸同源物, 包括但不限于玉米 (Zea mays)、 琴葉擬南芥 (Arabidopsis lyrata)、 畫 眉 草 (Eragrostis nindensis)(Resurrection grass)、 百 喜 草 (Paspalum notatum)(Bahiagrass)、 和水稻 (Oryza sativa)(SEQ ID NO : 18、 20、 22、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 和 47)。
     編碼包含 SNF2 結構域的蛋白無限制地包括由 SEQ ID NO : 24、 26、 和 28 編碼的蛋 白 ( 并且本文分別稱為 SNF2.1、 SNF2.2、 和 SNF2.3), 以及來自其他植物物種的蛋白同源物, 包括但不限于玉米 (Zea mays)、 琴葉擬南芥 (Arabidopsis lyrata)、 畫眉草 (Eragrostis nindensis)(Resurrection grass)、百 喜 草 (Paspalum notatum)(Bahiagrass)、水 稻 (Oryza sativa) 和高粱 (Sorghum bicolor)(SEQ ID NO : 19、 21、 23、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 和 49)。 本文所用的 “剪接變體” 指由基因轉錄的 RNA 的供選擇的替代形式。剪接變體作 為供選擇的位點在單個轉錄 RNA 分子內或在分開轉錄的 RNA 分子之間被剪接的結果天然發 生, 并且可導致從相同基因轉錄的 mRNA 的若干個不同形式。因此, 剪接不同可編碼具有不 同氨基酸序列的多肽, 它們在生物體內可具有相似功能也可不具有相似功能。
     “氮脅迫耐受性” 是植物的性狀, 指植物在氮限制條件下存活的能力。
     植物 “提高的氮脅迫耐受性” 相對于參照或對照植物進行測量, 并意指植物的氮脅 迫耐受性在與參照或對照植物進行比較時提高的任何量或量度。
     “氮脅迫耐受性植物” 是指表現出氮脅迫耐受性的植物。氮脅迫耐受性植物可為在 氮限制條件下相對于對照植物至少在一種農學特性上表現出提高的植物。
     “環境條件” 指植物生長的條件, 例如水的可用性、 營養物質 ( 例如氮 ) 的可用性或 者昆蟲或病害的存在。
     “轉基因” 指其基因組因異源核酸 ( 如重組 DNA 構建體 ) 的存在而發生改變的任何 細胞、 細胞系、 愈傷組織、 組織、 植物部分或植物, 包括那些最初的轉基因事件以及從最初的 轉基因事件通過有性雜交或無性生殖而產生的那些。如本文所用的術語 “轉基因” 不涵蓋 通過常規植物育種方法或通過諸如隨機異花受精、 非重組病毒感染、 非重組細菌轉化、 非重 組轉座或自發突變之類的自然發生事件導致的基因組 ( 染色體基因組或染色體外基因組 ) 改變。
     “基因組” 在用于植物細胞時不僅涵蓋存在于細胞核中的染色體 DNA, 而且還包括 存在于細胞的亞細胞組分 ( 如線粒體、 質粒 ) 中的細胞器 DNA。
     “植物” 包括整個植株、 植物器官、 植物組織、 種子和植物細胞以及同一植株的子 代。植物細胞包括但不限于得自下列物質的細胞 : 種子、 懸浮培養物、 胚、 分生區域、 愈傷組 織、 葉、 根、 芽、 配子體、 孢子體、 花粉和小孢子。
     “子代” 包括植物的任何后續世代。
     “轉基因植物” 包括在其基因組內包含異源多核苷酸的植物。例如異源多核苷酸被
     “氮脅迫耐受性” 是植物的性狀, 指植物在氮限制條件下存活的能力。
     植物 “提高的氮脅迫耐受性” 相對于參照或對照植物進行測量, 并意指植物的氮脅 迫耐受性在與參照或對照植物進行比較時提高的任何量或量度。
     “氮脅迫耐受性植物” 是指表現出氮脅迫耐受性的植物。氮脅迫耐受性植物可為在 氮限制條件下相對于對照植物至少在一種農學特性上表現出提高的植物。
     “環境條件” 指植物生長的條件, 例如水的可用性、 營養物質 ( 例如氮 ) 的可用性或 者昆蟲或病害的存在。
     “轉基因” 指其基因組因異源核酸 ( 如重組 DNA 構建體 ) 的存在而發生改變的任何 細胞、 細胞系、 愈傷組織、 組織、 植物部分或植物, 包括那些最初的轉基因事件以及從最初的 轉基因事件通過有性雜交或無性生殖而產生的那些。如本文所用的術語 “轉基因” 不涵蓋 通過常規植物育種方法或通過諸如隨機異花受精、 非重組病毒感染、 非重組細菌轉化、 非重 組轉座或自發突變之類的自然發生事件導致的基因組 ( 染色體基因組或染色體外基因組 ) 改變。
     “基因組” 在用于植物細胞時不僅涵蓋存在于細胞核中的染色體 DNA, 而且還包括 存在于細胞的亞細胞組分 ( 如線粒體、 質粒 ) 中的細胞器 DNA。
     “植物” 包括整個植株、 植物器官、 植物組織、 種子和植物細胞以及同一植株的子 代。植物細胞包括但不限于得自下列物質的細胞 : 種子、 懸浮培養物、 胚、 分生區域、 愈傷組 織、 葉、 根、 芽、 配子體、 孢子體、 花粉和小孢子。
     “子代” 包括植物的任何后續世代。
     “轉基因植物” 包括在其基因組內包含異源多核苷酸的植物。例如異源多核苷酸被
     穩定地整合進基因組中, 使得該多核苷酸傳遞至連續的世代。異源多核苷酸可單獨地或作 為重組 DNA 構建體的部分整合進基因組中。
     針對序列而言的 “異源” 意指來自外來物種的序列, 或者如果來自相同物種, 則指 通過蓄意的人為干預而從其天然形式發生了組成和 / 或基因座的顯著改變的序列。
     “多核苷酸” 、 “核酸序列” 、 “核苷酸序列” 或 “核酸片段” 可互換使用, 并且指作為 單鏈或雙鏈的 RNA 或 DNA 聚合物, 任選含有合成的、 非天然的或改變的核苷酸堿基。核苷酸 ( 通常以它們的 5′ - 單磷酸形式存在 ) 通過它們的單字母命名指代如下 : “A” 指腺苷酸或 脫氧腺苷酸 ( 分別用于 RNA 或 DNA), “C” 指胞苷酸或脫氧胞苷酸, “G” 指鳥苷酸或脫氧鳥苷 酸, “U” 指尿苷酸, “T” 指脫氧胸苷酸, “R” 指嘌呤 (A 或 G), “Y” 指嘧啶 (C 或 T), “K” 指G或 T, “H” 指 A 或 C 或 T, “I” 指肌苷, “N” 指任何核苷酸。
     “多肽” 、 “肽” 、 “氨基酸序列” 和 “蛋白質” 在本文中可互換使用, 指氨基酸殘基的聚 合物。 該術語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是相應的天然存在的氨基酸的人工化學類 似物的氨基酸聚合物, 以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。術語 “多肽” 、 “肽” 、 “氨基酸 序列” 和 “蛋白質” 還可包括修飾, 包括但不限于糖基化、 脂質連接、 硫酸鹽化、 谷氨酸殘基的 γ 羧化、 羥化和 ADP- 核糖基化。 “信使 RNA(mRNA)” 指無內含子并且可通過細胞翻譯成蛋白質的 RNA。
     “cDNA” 指與 mRNA 模板互補并且利用逆轉錄酶從 mRNA 模板合成的 DNA。cDNA 可為 單鏈的或者可用 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段轉化成雙鏈形式。
     “表達序列標簽” (“EST” ) 是得自 cDNA 文庫的 DNA 序列, 并且因此是已經被轉錄 的序列。EST 通常通過 cDNA 插入序列單程測序獲取。將完整的 cDNA 插入序列稱為 “全長 插入序列” (“FIS” )。 “重疊群” 序列是由選自, 但不限于 EST、 FIS 和 PCR 序列的兩個或更 多個序列裝配成的序列。將編碼完整或功能性蛋白的序列稱為 “完全基因序列” (“CGS” ), 該序列能得自 FIS 或重疊群。
     “成熟” 蛋白指經翻譯后加工的多肽, 即已經去除了存在于初始翻譯產物中的任何 前肽或肽原的多肽。
     “前體” 蛋白質指 mRNA 的初級翻譯產物, 即前肽和肽原仍然存在。前肽和原肽可為 并且不限于細胞內定位信號。
     “分離的” 指物質, 例如核酸和 / 或蛋白質, 該物質基本上不含在天然存在的環境中 通常伴隨該物質或與其反應的組分, 或者說是該物質被從所述組分移出。分離的多核苷酸 可從它們天然存在于其中的宿主細胞純化。 技術人員已知的常規核酸純化方法可用于獲取 分離的多核苷酸。該術語也涵蓋重組多核苷酸和化學合成的多核苷酸。
     “重組” 指兩個分離的不同序列片段的人工組合, 例如通過基因工程技術化學合成 或通過操縱分離的核酸片段合成。 “重組體” 也包括細胞或載體, 它們已經通過引入異源核 酸進行了修改, 或者來源于進行如此修改的細胞, 但是不涵蓋由自然發生事件 ( 例如自發 突變、 自然轉化 / 轉導 / 轉座 ) 改變的細胞或載體, 例如那些無蓄意的人為干預產生的細胞 或載體。
     “重組 DNA 構建體” 指在自然界中通常不會一起存在的核酸片段的組合。因此, 重 組 DNA 構建體可包含源于不同來源的調控序列和編碼序列, 或源于相同來源但以不同于通 常天然存在的方式排列的調控序列和編碼序列。
     “cDNA” 指與 mRNA 模板互補并且利用逆轉錄酶從 mRNA 模板合成的 DNA。cDNA 可為 單鏈的或者可用 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段轉化成雙鏈形式。
     “表達序列標簽” (“EST” ) 是得自 cDNA 文庫的 DNA 序列, 并且因此是已經被轉錄 的序列。EST 通常通過 cDNA 插入序列單程測序獲取。將完整的 cDNA 插入序列稱為 “全長 插入序列” (“FIS” )。 “重疊群” 序列是由選自, 但不限于 EST、 FIS 和 PCR 序列的兩個或更 多個序列裝配成的序列。將編碼完整或功能性蛋白的序列稱為 “完全基因序列” (“CGS” ), 該序列能得自 FIS 或重疊群。
     “成熟” 蛋白指經翻譯后加工的多肽, 即已經去除了存在于初始翻譯產物中的任何 前肽或肽原的多肽。
     “前體” 蛋白質指 mRNA 的初級翻譯產物, 即前肽和肽原仍然存在。前肽和原肽可為 并且不限于細胞內定位信號。
     “分離的” 指物質, 例如核酸和 / 或蛋白質, 該物質基本上不含在天然存在的環境中 通常伴隨該物質或與其反應的組分, 或者說是該物質被從所述組分移出。分離的多核苷酸 可從它們天然存在于其中的宿主細胞純化。 技術人員已知的常規核酸純化方法可用于獲取 分離的多核苷酸。該術語也涵蓋重組多核苷酸和化學合成的多核苷酸。
     “重組” 指兩個分離的不同序列片段的人工組合, 例如通過基因工程技術化學合成 或通過操縱分離的核酸片段合成。 “重組體” 也包括細胞或載體, 它們已經通過引入異源核 酸進行了修改, 或者來源于進行如此修改的細胞, 但是不涵蓋由自然發生事件 ( 例如自發 突變、 自然轉化 / 轉導 / 轉座 ) 改變的細胞或載體, 例如那些無蓄意的人為干預產生的細胞 或載體。
     “重組 DNA 構建體” 指在自然界中通常不會一起存在的核酸片段的組合。因此, 重 組 DNA 構建體可包含源于不同來源的調控序列和編碼序列, 或源于相同來源但以不同于通 常天然存在的方式排列的調控序列和編碼序列。
     術語 “入門克隆” 和 “入門載體” 本文可互換使用。
     “調控序列” 和 “調控元件” 可互換使用, 并且指位于編碼序列的上游 (5′非編碼 序列 )、 中間或下游 (3′非編碼序列 ), 并且影響相關編碼序列的轉錄、 RNA 加工或穩定性或 者翻譯的核苷酸序列。 調控序列可包括但不限于啟動子、 翻譯前導序列、 內含子和多腺苷酸 化識別序列。
     “啟動子” 指能夠控制另一核酸片段轉錄的核酸片段。
     “在植物中有功能的啟動子” 指能夠控制植物細胞中的轉錄的啟動子, 無論其是否 來源于植物細胞。
     “組織特異性啟動子” 和 “組織優選啟動子” 可以互換使用, 并且指主要但非必須專 一地在一種組織或器官中表達, 但是也可以在一種特定細胞中表達的啟動子。
     “發育調控啟動子” 指其活性由發育事件決定的啟動子。
     術語 “可操作地連接” 指核酸片段連接成單一片段, 使得其中一個核酸片段的功能 受到另一個核酸片段的調控。 例如, 在啟動子能夠調節核酸片段的轉錄時, 該啟動子與該核 酸片段進行了可操作地連接。
     “表達” 指功能產物的產生。因此, 核酸片段的表達可指核酸片段的轉錄 ( 如生成 mRNA 或功能 RNA 的轉錄 ) 和 / 或 mRNA 翻譯成前體或成熟蛋白質。
     “表型” 意指細胞或生物體的可檢測的特征。
     有關將核酸片段 ( 例如重組 DNA 構建體 ) 插入細胞內的 “引入” 意指 “轉染” 或 “轉 化” 或 “轉導” , 并且包括指將核酸片段整合進真核或原核細胞中, 在該細胞中核酸片段可整 合進細胞的基因組 ( 如染色體、 質粒、 質體或線粒體 DNA) 內, 轉變成自主的復制子或瞬時表 達 ( 如轉染的 mRNA)。
     “轉化細胞” 是將核酸片段 ( 如重組 DNA 構建體 ) 引入其中的任何細胞。
     在此所用的 “轉化” 指穩定轉化和瞬時轉化兩者。
     “穩定轉化” 指將核酸片段引入宿主生物體的基因組中, 導致基因穩定遺傳。一旦 穩定轉化, 核酸片段穩定地整合進宿主生物體和任何連續世代的基因組中。
     “瞬時轉化” 指將核酸片段引入宿主生物體的核中或包含 DNA 的細胞器中, 引起基 因表達而沒有基因穩定遺傳。
     “等位基因” 是占據染色體上給定位點的基因的幾種供選擇替代形式的其中一種。 當二倍體植物中一對同源染色體上給定基因座上存在的等位基因相同時, 該植物在該基因 座處是純合的。如果二倍體植物中一對同源染色體上給定基因座上存在的等位基因不同, 則該植物在該基因座處是雜合的。 如果轉基因存在于二倍體植物中一對同源染色體中的其 中之一上, 則該植物在該基因座處是半合子的。
     “葉綠體轉運肽” 是與蛋白質共同被翻譯, 并將該蛋白質導向葉綠體或導向該蛋白 質在其中被生成的細胞中的其他質體類型的氨基酸序列。 “葉綠體轉運序列” 是指編碼葉 綠體轉運肽的核苷酸序列。 “信號肽” 是一種與蛋白質共同被翻譯并將蛋白導向分泌系統 的氨基酸序列 (Chrispeels, (1991)Ann.Rev.Plant Phys.Plant Mol.Biol.42 : 21-53)。如 果將所述蛋白導向液泡, 可另外加上液泡靶向信號 ( 同上 ), 或者如果將所述蛋白導向內質 網, 可加上內質網駐留信號 ( 同上 )。如果將蛋白導向細胞核, 將移除任何存在的信號肽并 用以核定位信號替代 (Raikhel, (1992)Plant Phys.100 : 1627-1632)。 “線粒體信號肽” 是指導前體蛋白質導進入線粒體中的氨基酸序列 (Zhang 和 Glaser(2002)Trends Plant Sci 7: 14-21)。
     序列比對和同一性百分比可用設計用于檢測同源序列的多種比較方法來測定, 這些方法包括但不限于 LASERGENE 生物信息計算包 (DNASTAR Inc., Madison, WI) 的 MEGALIGN 程序。除非另外說明, 本文提供的序列的多重比對用 Clustal V 比對方法 (Higgins 和 Sharp, CABIOS. : 5: 151-153(1989)) 采用默認參數 ( 空位罰分= 10, 空位長度 罰分= 10) 執行。用 Clustal V 方法進行成對比對和蛋白質序列的百分比同一性計算的默 認參數為 KTUPLE = 1、 缺口罰分= 3、 窗口 (WINDOW) = 5 和 DIAGONALS SAVED = 5。對于核 酸, 這些參數為 KTUPLE = 2, 缺口罰分= 5, 窗口= 4 和 DIAGONALS SAVED = 4。在序列比對 后, 使用 Clustal V 程序, 通過參閱相同程序上的 “序列距離” 表可能獲得 “百分比同一性” 和 “趨異度” 值; 除非另外說明, 本文提供的和申明的同一性百分比和趨異度是以該方式計 算。
    本文使用的標準重組 DNA 和分子克隆技術是本領域所熟知的并且在如下文獻 中有更全面的描述 : Sambrook, J., Fritsch, E.F. 和 Maniatis, T.Molecular Cloning : A Laboratory Manual ; Cold Spring Harbor Laboratory Press : Cold Spring Harbor, 1989( 下文稱為 “Sambrook” )。現在來看實施方案 :
     實施方案包括分離的多核苷酸和多肽、 重組 DNA 構建體、 包含這些重組 DNA 構建體 的組合物 ( 例如植株或種子 ) 以及利用這些重組 DNA 構建體的方法。
     分離的多核苷酸和多肽
     本發明包括下列分離的多核苷酸和多肽 :
     分離的多核苷酸包含 : (i) 編碼多肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 36、 38、 或 46 進行比較時具有至少 50%、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96%、 97%、 98%、 99%、 或 100%的序列同一性 ; 或 (ii)(i) 的核酸序列的全長互補序列, 其 中 (i) 的核酸序列的全長互補序列由相同數目的核苷酸組成并且是 100%互補的。任一上 述分離的多核苷酸可用于本發明的任何重組 DNA 構建體 ( 包括抑制 DNA 構建體 )。所述多 肽是包含 SNF2 結構域的蛋白。
     分離的多肽, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 36、 38、 或 46 進行比較時具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%、 或 100%的序列同一 性。所述多肽是包含 SNF2 結構域的蛋白。
     分離的多核苷酸, 包括 : (i) 基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 18、 20、 22、 35、 37、 或 45 進行比較時具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、
     74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%、 或 100%的序列同一性的 核酸序列 ; 或 (ii)(i) 的核酸序列的全長互補序列。任一上述分離的多核苷酸可用于本發 明的任何重組 DNA 構建體 ( 包括抑制 DNA 構建體 )。所述分離的多核苷酸編碼包含 SNF2 結 構域的蛋白。
     重組 DNA 構建體和抑制 DNA 構建體
     在一個方面, 本發明包括重組 DNA 構建體 ( 包括抑制 DNA 構建體 )。
     在一個實施方案中, 重組 DNA 構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列 ( 如, 在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸包括 : (i) 核酸序列, 所述核酸 序列編碼的氨基酸序列基于 ClustalV 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或 100%的序列同一性 ; 或 (ii)(i) 的核酸序列的全長互補序列。 在另一個實施方案中, 重組 DNA 構建體包含可操作地連接至至少一種調控序列 ( 如, 在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸包括 : (i) 核酸序列, 所述 核酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 18、 20、 22、 24、 26、 28、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 或 47 進行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57%、 58%、 59%、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%序列同一性 ; 或 (ii)(i) 的核酸序列的全長互補序列。
     在另一個實施方案中, 重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少一種調控序列 ( 如, 在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼包含 SNF2 結構域的蛋白。
     在另一方面, 本發明包括抑制 DNA 構建體。
     抑制 DNA 構建體可包含至少一種調控序列 ( 例如植物中有功能的啟動子 ), 該調 控序列可操作地連接至 (a) 以下序列的全部或部分 : (i) 編碼多肽的核酸序列, 所述多肽的 氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%的序列 同一性, 或 (ii)(a)(i) 的核酸序列的全長互補序列 ; 或者 (b) 源自受關注靶基因的有義鏈 或反義鏈的全部或部分的區域, 當與所述區域所來源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較 時, 基于 Clustal V 比對方法, 所述區域的核酸序列具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或
     100%的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的蛋白 ; 或 (c) 以 下序列的全部或部分 : (i) 核酸序列, 基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 18、 20、 22、 24、 26、 28、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 或 47 進行比較時, 所述多肽的氨基酸序列具有至少 50%、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或 100 %的序列同一性, 或 (ii)(c)(i) 核酸序列的全長互補序列。 抑制 DNA 構建體可包含共抑制構建體、 反義構建體、 病毒抑制構建體、 發夾抑制構建體、 莖 環抑制構建體、 產生雙鏈 RNA 的構建體、 RNAi 構建體或小 RNA 構建體 ( 如, siRNA 構建體或 miRNA 構建體 )。
     應當理解 ( 正如本領域技術人員將會理解的 ), 本發明不僅僅涵蓋這些具體的示 例性序列。 導致給定位點處產生化學上等價的氨基酸但不影響所編碼多肽的功能特性的核 酸片段中的改變是本領域眾所周知的。因此, 氨基酸丙氨酸 ( 一種疏水性氨基酸 ) 的密碼 子可被編碼另一個疏水性較弱的殘基 ( 例如甘氨酸 ) 或疏水性較強的殘基 ( 例如纈氨酸、 亮氨酸或異亮氨酸 ) 的密碼子取代。類似地, 導致一個帶負電荷的殘基替換為另一個帶負 電荷的殘基 ( 例如, 天冬氨酸替代谷氨酸 ) 或者一個帶正電荷的殘基替換為另一個帶正電 荷的殘基 ( 例如, 賴氨酸替換精氨酸 ) 的改變也可預期產生功能上等價的產物。導致多肽 分子的 N 末端和 C 末端部分改變的核苷酸變化也將預計不會改變多肽的活性。所提出的修 飾中的每一種均完全在本領域常規技術內, 如測定編碼產物生物活性的保留情況。
     “抑制 DNA 構建體” 是在轉化或穩定整合進植物基因組時, 導致該植物中的靶基因 “沉默” 的重組 DNA 構建體。靶基因可為植物內源基因或植物轉基因。如本文針對靶基因所 使用的, “沉默” 通常指在由靶基因表達的 mRNA 或蛋白質 / 酶的水平上的抑制, 和 / 或在酶 活性或蛋白質功能性的水平上的抑制。術語 “抑制” 和 “沉默” 本文互換使用, 包括降低、 減 少、 下降、 減小、 抑制、 除去或阻止。 “沉默” 或 “基因沉默” 不指具體機制, 它包括但不限于反 義、 共抑制、 病毒抑制、 發夾抑制、 莖 - 環抑制、 基于 RNAi 的方法、 以及基于小 RNA 的方法。
     抑制 DNA 構建體可包含源自受關注的靶基因的區域并且可包含受關注的靶基因 的有義鏈 ( 或反義鏈 ) 的核酸序列的全部或部分。取決于所要采用的方法, 該區域可與 受關注基因的有義鏈 ( 或反義鏈 ) 的全部或部分 100 %相同或者具有少于 100 %的同一 性 ( 如, 具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 或 99%同一性 )。
     抑制 DNA 構建體是本領域所熟知的, 一旦選定受關注的靶基因就很容易構建, 并 且包括但不限于共抑制構建體、 反義構建體、 病毒抑制構建體、 發夾抑制構建體、 莖環抑制 構建體、 產生雙鏈 RNA 的構建體, 以及更通常的是, RNAi(RNA 干擾 ) 構建體和小 RNA 構建體, 例如 siRNA( 短干擾 RNA) 構建體和 miRNA( 微 RNA) 構建體。
     “反義抑制” 指產生能夠抑制靶基因或基因產物表達的反義 RNA 轉錄物。 “反義 RNA” 指與靶初級轉錄物或 mRNA 的全部或部分互補, 并阻斷分離的靶核酸片段表達的 RNA 轉錄物 ( 美國專利 5,107,065)。 反義 RNA 可與特定基因轉錄物的任何部分, 即 5′非編碼序列、 3′非編碼序列、 內含子或編碼序列互補。
     “共抑制” 指產生能夠抑制靶基因或基因產物表達的有義 RNA 轉錄物。 “有義” RNA 指包括 mRNA 的 RNA 轉錄物, 它能夠在細胞內或體外被翻譯成蛋白。此前, 已通過著眼于以 有義方向過表達與內源 mRNA 具有同源性的核酸序列 ( 其導致與過表達的序列具有同源性 的所有 RNA 減少 ) 設計出了植物中的共抑制構建體 ( 參見 Vaucheret 等人, Plant J.16 : 651-659(1998) ; 和 Gura, Nature 404 : 804-808(2000))。
     另一種變型描述了將植物病毒序列用于引導對近端 mRNA 編碼序列的抑制 ( 于 1998 年 8 月 20 日公開的 PCT 公開 WO 98/36083)。
     RNA 干擾是指由短干擾性 RNA(siRNA) 介導的動物中序列特異性轉錄后基因沉默 的過程 (Fire 等人, Nature 391 : 806(1998))。 在植物中的對應過程通常稱為轉錄后基因沉 默 (PTGS) 或 RNA 沉默, 并且在真菌中也稱為阻抑作用 (quelling)。 據信轉錄后基因沉默過 程是用于防止外來基因表達的進化保守性細胞防御機制, 并且通常由不同植物區系和門所 共有 (Fire 等人, Trends Genet.15 : 358(1999))。
     小 RNA 在控制基因表達中起重要作用。很多發育過程 ( 包括開花 ) 的調節是由小 RNA 控制的。現在有可能通過使用在植物中產生小 RNA 的轉基因構建體來以工程手段改變 植物基因的基因表達。
     小 RNA 似乎是通過與互補 RNA 或 DNA 靶序列堿基配對來行使功能的。當與 RNA 結 合時, 小 RNA 或者引發靶序列的 RNA 裂解或者引發翻譯抑制。當與 DNA 靶序列結合時, 據信 小 RNA 可介導靶序列的 DNA 甲基化。無論具體機制是什么, 這些事件的后果是基因表達受 到抑制。
     微 RNA(miRNA) 是長度為約 19 至約 24 個核苷酸 (nt) 的已經在動物和植物中鑒 定出的非編碼 RNA(Lagos-Quintana 等人, Science 294 : 853-858(2001), Lagos-Quintana 等 人, Curr.Biol.12 : 735-739(2002) ; Lau 等 人, Science 294 : 858-862(2001) ; Lee 和 Ambros, Science 294 : 862-864(2001) ; Llave 等 人, Plant Cell 14 : 1605-1619(2002) ; Mourelatos 等 人, Genes. 偏 差 16 : 720-728(2002) ; Park 等 人, Curr.Biol.12 : 1484-1495(2002) ; Reinhart 等人, Genes. 偏差 16 : 1616-1626(2002))。它們是由大小為大 約 70 至 200nt 的較長的前體轉錄物加工生成的, 并且這些前體轉錄物能夠形成穩定的發夾 結構。
     微 RNA(miRNA) 看起來通過與位于由這些基因產生的轉錄物中的互補序列結合來 調節靶基因。看來似乎 miRNA 可能以至少兩種途徑進入靶基因調控 : (1) 翻譯抑制 ; 和 (2) RNA 裂解。進入 RNA 裂解途徑的微 RNA 與在動物中 RNA 干擾 (RNAi) 期間以及在植物中轉 錄后基因沉默 (PTGS) 期間產生的 21-25nt 短干擾 RNA(siRNA) 類似, 并且可能整合進與在 RNAi 情況中觀察到的復合物類似或相同的 RNA- 誘導的沉默復合物 (RISC) 內。
     調控序列 :
     本發明的重組 DNA 構建體 ( 包括抑制 DNA 構建體 ) 可包含至少一種調控序列。
     調控序列可為啟動子。
     多種啟動子可用于本發明的重組 DNA 構建體 ( 及抑制 DNA 構建體 ) 中。可根據所 需結果來選擇啟動子, 并且可包括用于在宿主生物體中表達的組成型啟動子、 組織特異性 啟動子、 誘導型啟動子或其他啟動子。在多數情況下引起基因在大多數細胞型中表達的啟動子通常稱為 “組成型啟動子” 。 雖然候選基因當通過組成型啟動子驅動表達時可預測其效應, 但候選基因在 35S 或 UBI 啟動子控制下的高水平、 組成型表達可以 ( 或可以不 ) 具有多重效應。使用組織特 異和 / 或脅迫特異啟動子可消除不需要的效應但保留氮耐受性的能力。在擬南芥屬中已經 觀察到了對干旱和寒冷耐受性的這種類型的效應 (Kasuga 等人, Nature Biotechnol.17 : 287-91(1999))。
     適用于植物宿主細胞的組成型啟動子包括 ( 例如 )Rsyn7 啟動子的核心啟動子 和在 WO 99/43838 和美國專利 6,072,050 中公開的其他組成型啟動子 ; CaMV 35S 核心 啟動子 (Odell 等人, Nature 313 : 810-812(1985)) ; 稻肌動蛋白啟動子 (McElroy 等人, Plant Cell 2 : 163-171(1990)) ; 泛 素 啟 動 子 (Christensen 等 人, Plant Mol.Biol.12 : 619-632(1989) 和 Christensen 等 人, Plant Mol.Biol.18 : 675-689(1992)) ; pEMU 啟 動 子 (Last 等 人, Theor.Appl.Genet.81 : 581-588(1991)) ; MAS 啟 動 子 (Velten 等 人, EMBO J.3 : 2723-2730(1984)) ; ALS 啟動子 ( 美國專利 5,659,026) 等。其他組成型啟動子包括 例 如 在 美 國 專 利 5,608,149、 5,608,144、 5,604,121、 5,569,597、 5,466,785、 5,399,680、 5,268,463、 5,608,142 和 6,177,611 中公開的那些啟動子。
     在選擇啟動子用于本發明方法時, 可能有利的是使用組織特異性啟動子或發育調 控啟動子。
     組織特異性啟動子或發育調節啟動子是這樣的 DNA 序列 : 該序列調節 DNA 序列選 擇性地在對雄穗發育、 結籽或兩者重要的植物細胞 / 組織中表達, 并限制這種 DNA 序列只在 植物的雄穗發育或種子成熟期間表達。 任何引起所需時空表達的可鑒定啟動子均可用于本 發明的方法中。
     可用于本發明的種子或胚芽特異性啟動子包括大豆 Kunitz 胰蛋白酶抑制劑啟動 子 (Kti3, Jofuku 和 Goldberg, Plant Cell 1 : 1079-1093(1989))、 馬鈴薯塊莖特異蛋白啟 動子 (patatin 啟動子 )( 馬鈴薯塊莖 )(Rocha-Sosa, M. 等人, EMBO J.8 : 23-29(1989))、 convicilin 啟動子、 豌豆球蛋白啟動子、 豆球蛋白啟動子 ( 豌豆子葉 )(Rerie, W.G. 等人, Mol.Gen.Genet.259 : 149-157(1991) ; Newbigin, E.J. 等人, Planta 180 : 461-470(1990) ; Higgins, T.J.V. 等人, Plant.Mol.Biol.11 : 683-695(1988))、 玉米蛋白啟動子 ( 玉米胚 乳 )(Schemthaner, J.P. 等人, EMBO J.7 : 1249-1255(1988))、 菜豆蛋白啟動子 ( 菜豆子葉 ) (Segupta-Gopalan, C. 等人, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82 : 3320-3324(1995))、 植物血 球凝集素啟動子 ( 菜豆子葉 )(Voelker, T. 等人, EMBO J.6 : 3571-3577(1987))、 B- 伴球蛋 白啟動子和大豆球蛋白啟動子 ( 大豆子葉 )(Chen, Z-L 等人, EMBO J.7 : 297-302(1988))、 谷 蛋白啟動子 ( 大米胚乳 )、 大麥醇溶蛋白啟動子 ( 大麥胚乳 )(Marris, C. 等人, Plant Mol. Biol.10 : 359-366(1988))、 麥谷蛋白啟動子和麥醇溶蛋白啟動子 ( 小麥胚乳 )(Colot, V. 等 人, EMBO J.6 : 3559-3564(1987))、 和甘薯貯藏蛋白啟動子 ( 甘薯塊根 )(Hattori, T. 等人, Plant Mol.Biol.14 : 595-604(1990))。 可操作地連接至嵌合基因構建體異源編碼區的種子 特異性基因的啟動子在轉基因植物中保持它們的時空表達模式。 這樣的實施例包括在擬南 芥屬和甘藍型油菜 (Brassica napus) 種子中表達腦啡肽的擬南芥 2S 種子儲藏蛋白基因啟 動子 (Vanderkerckhove 等人, Bio/Technology 7 : L929-932(1989))、 表達熒光素酶的菜豆
     凝集素和 β- 菜豆蛋白啟動子 (Riggs 等人, Plant Sci.63 : 47-57(1989)), 以及表達氯霉素 乙酰轉移酶的小麥谷蛋白啟動子 (Colot 等人, EMBO J.6 : 3559-3564(1987))。
     可誘導啟動子響應內源性或外源性刺激的存在, 例如, 通過化合物 ( 化學誘導 劑 ), 或響應環境、 激素、 化學信號和 / 或發育信號而選擇性表達可操作地連接的 DNA 序列。 可誘導的或受調控的啟動子包括 ( 例如 ) 受光、 熱、 脅迫、 水澇或干旱、 植物激素、 創傷或諸 如乙醇、 茉莉酮酸酯、 水楊酸或安全劑之類的化學品調控的啟動子。
     本發明使用的啟動子包括以下啟動子 : 1) 脅迫誘導型 RD29A 啟動子 (Kasuga 等 人, Nature Biotechnol.17 : 287-91(1999)) ; 2) 大 麥 啟 動 子 B22E ; B22E 的 表 達 是 發 育中的玉米籽粒中的柄所特異性的 (“Primary Structure of a Novel Barley Gene Differentially Expressed in Immature Aleurone Layers( 在未成熟糊粉層中差異表 達的新大麥基因的一級結構” , Klemsdal 等人, Mol.Gen.Genet.228(1/2) : 9-16(1991)) ; 以 及 3) 玉米啟動子 Zag2(“Identification and molecular characterization of ZAG1, the maize homolog of the Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUS(ZAG1- 擬南 芥屬花同源異形基因 AGAMOUS 的玉米同系物的鑒定和分子表征 )” , Schmidt 等人, Plant Cell 5(7) : 729-737(1993) “ ;Structural characterization, chromosomal localization and phylogenetic evaluation of two pairs of AGAMOUS-like MADS-box genes from maize” (“兩對來自玉米的 AGAMOUS 樣 MADS-box 基因的結構表征、 染色體定位及系統發育 評價 )” , Theissen 等人, Gene 156(2) : 155-166(1995) ; NCBI GenBank 登錄號 X80206))。 Zag2 轉錄物可在授粉前五天至授粉后天數 (“DAP” ) 七至八天被檢測到, 并且引導 Ciml 在 發育中的雌花序心皮中表達, Ciml 對發育中的玉米籽粒的籽仁而言是特異性的。Ciml 轉錄 物在授粉前四到五天至六到八 DAP 被檢測到。其他可用的啟動子包括可源自其表達與發育 中的雌小花母系相關的基因的任何啟動子。
     用于調控本發明的核苷酸序列在植物中表達的啟動子是莖特異性啟動子。這種 莖特異性啟動子包括苜蓿 S2A 啟動子 (GenBank 登錄號 : EF030816 ; Abrahams 等人, Plant Mol.Biol.27 : 513-528(1995)) 和 S2B 啟動子 (GenBank 登錄號 : EF030817) 等等, 將這些文 獻以引用的方式并入本文。
     啟動子可整體源于天然基因, 或者由源于天然存在的不同啟動子的不同元件構 成, 或者甚至可包含合成的 DNA 片段。
     用于本發明的啟動子可包括 : RIP2、 mLIP15、 ZmCOR1、 Rab17、 CaMV 35S、 RD29A、 B22E、 Zag2、 SAM 合成酶啟動子、 泛素啟動子、 CaMV 19S、 nos、 Adh、 蔗糖合成酶啟動子、 R- 等 位基因啟動子、 維管組織的其他啟動子 S2A(Genbank 登陸號 EF030816) 和 S2B(Genbank 登錄號 EF030817) 及來自玉米的組成型啟動子 GOS2。其他啟動子包括根啟動子, 例如玉 米 NAS2 啟動子、 玉米 Cyclo 啟動子 (US 公布 2006/0156439, 公開于 2006 年 7 月 13 日 )、 玉米 ROOTMET2 啟動子 (WO 2005/063998, 公開于 2005 年 7 月 14 日 )、 CR1BIO 啟動子 (WO 2006/055487, 公開于 2006 年 5 月 26 日 )、 CRWAQ81(WO 2005/035770, 公開于 2005 年 4 月 21 日 ) 和玉米 ZRP2.47 啟動子 (NCBI 登錄號 U38790 ; NCBI GI No.1063664)。
     本發明的重組 DNA 構建體 ( 及抑制 DNA 構建體 ) 也可包括其他調控序列, 包括但 不限于翻譯前導序列、 內含子和多腺苷酸化識別序列。 在本發明的另一個實施方案中, 本發 明的重組 DNA 構建體還包括增強子或沉默子。內含子序列可加至 5’ 非翻譯區、 蛋白編碼區或 3’ 非翻譯區以增加積聚在胞漿中 的成熟信息的量。已經顯示, 在植物和動物兩者的表達構建體的轉錄單位中包含可剪接內 含子可使基因表達在 mRNA 和蛋白質水平上均增強高達 1000 倍 (Buchman 和 Berg, Mol.Cell Biol.8 : 4395-4405(1988) ; Callis 等人, Genes Dev.1 : 1183-1200(1987))。
     任何植物都可以選擇用來鑒定將用于本發明重組 DNA 構建體的調控序列和基因。 適用于分離基因和調控序列的靶植物的實例應該包括但不限于苜蓿、 蘋果、 杏、 擬南芥屬植 物、 洋薊、 芝麻菜、 蘆筍、 鱷梨、 香蕉、 大麥、 豆類、 甜菜、 黑莓、 藍莓、 西蘭花、 抱子甘藍、 卷心 菜、 低芥酸菜籽、 香瓜、 胡蘿卜、 木薯、 蓖麻、 菜花、 芹菜、 櫻桃、 菊苣、 芫荽、 柑桔類、 克萊門氏 小柑橘類、 三葉草、 椰子、 咖啡、 玉米、 棉、 蔓越莓、 黃瓜、 花旗松、 茄子、 菊苣、 茅菜、 桉樹、 茴 香、 無花果、 大蒜、 葫蘆、 葡萄、 柚子樹、 白蘭瓜、 豆薯、 獼猴桃、 生菜、 韭蔥、 檸檬、 酸橙、 火炬 松、 亞麻子、 玉米、 芒果、 甜瓜、 蘑菇、 油桃、 堅果、 燕麥、 油棕、 油菜、 秋葵、 橄欖樹、 洋蔥、 橙、 觀 賞植物、 棕櫚、 木瓜樹、 歐芹、 歐洲防風草、 豌豆、 桃樹、 花生、 梨樹、 胡椒、 柿樹、 松樹、 菠蘿、 大 蕉、 李樹、 石榴樹、 白楊、 馬鈴薯、 南瓜、 溫柏、 輻射松、 紅菊苣、 蘿卜、 油菜、 樹莓、 稻、 黑麥、 高 粱、 南方松、 大豆、 菠菜、 南瓜、 草莓、 甜菜、 甘蔗、 向日葵、 甘薯、 楓香樹、 柑橘、 茶、 煙草、 蕃茄、 黑小麥、 草皮草、 蕪菁、 葡萄樹、 西瓜、 小麥、 薯蕷和西葫蘆。
     組合物
     本發明的組合物是其基因組中包含本發明的任何重組 DNA 構建體 ( 包括任何抑制 DNA 構建體 )( 例如上面所討論的任何一種其他構建體 ) 的植物。 組合物也包括任何植物的 子代, 以及獲取自植物或其子代的任何種子, 其中所述子代或種子在其基因組中包含重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 )。子代包括通過植物的自花授粉或異型雜交而獲得的連 續世代。子代也包括雜交種和近交系。
     在雜交種子繁殖的農作物中, 成熟的轉基因植物可自花授粉而產生純合的自交系 植物。該近交系植物產生含有新引入的重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的種子。這 些種子可以生長而產生將會表現出改變的農學特性 ( 如, 在氮限制條件下農學特性增加 ) 的植物, 或者可以用于育種程序以產生雜交種子, 這些雜交種子可以生長而產生將會表現 出如改變的農學特性的植物。所述種子可為玉米種子。
     植物可為單子葉植物或雙子葉植物, 例如玉米或大豆植物, 如玉米雜種植物或玉 米自交系植物。植物還可以是向日葵、 高梁、 低芥酸菜籽、 小麥、 苜蓿、 棉、 稻、 大麥、 小米、 甘 蔗、 或柳枝稷。
     重組 DNA 構建體可穩定地整合進植物的基因組中。
     具體實施方案包括但不限于下列的 :
     1. 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有 一種氨基酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%、 51%、 52%、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98%、 99%、 或 100%的序列同一性, 并且其中所述植物在與未包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出增加的氮脅迫耐受性。在與該對照植物比較時, 該植物還可表 現出至少一種農學特性的改變。
     2. 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 該重組 DNA 構 建體包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼包含 SNF2 結構域的多肽, 并且其中在與未包含所述重組 DNA 構建體的對照植物比較時, 所述植物表 現出增加的氮脅迫耐受性。在與該對照植物比較時, 該植物還可表現出至少一種農學特性 的改變。
     3. 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 該重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼包含 SNF2 結構域的多肽, 并且其中在與未包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時, 所述植 物表現出在氮限制條件下至少一種農學特性的改變。
     4. 在因組中包含重組 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 所述重組 DNA 構 建體包含可操作地連接到至少一種調控元件的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種 氨基酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99%、 或 100%的序列同一性, 并且其中所述植物在與未包含所述重組 DNA 構建體的對照植 物進行比較時表現出在氮限制條件下至少一種農學特性的改變。
     5. 在基因組中包含抑制 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 該抑制 DNA 構建體包含至少一種可操作地連接至源自受關注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部 分的區域的調控元件, 當與所述區域所來源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時, 基于 Clustal V 比對方法, 所述區域的核酸序列具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86%、 87%、 88 %、 89%、 90 %、 91%、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或 100 % 的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的多肽, 并且其中在與 未包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時, 所述植物表現出在氮限制條件下至少 一種農學特性的改變。
     6. 在基因組中包含抑制 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控元件, 該調控元件可操作地連接至以下序列的全部或部分 : (a) 編碼多肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%序列同一性 ; 或 (b)(a) 的核酸序列的全長互補序列, 并且其 中所述植物在氮限制條件下在與不包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出至少一種農學特性的改變。
     7. 上述實施方案 1-6 中的植物的任何子代、 上述實施方案 1-6 中的植物的任何種 子、 上述實施方案 1-6 中的植物的子代的任何種子以及來自上述實施方案 1-6 中的任何植 物以及它們的子代的細胞。
     在前述實施方案 1-7 的任一項中或本發明的任何其他實施方案中, 包含 SNF2 結構 域的多肽可來自擬南芥 (Arabidopsis thaliana)、 玉米 (Zea mays)、 大豆 (Glycine max)、 煙豆 (Glycine tabacina)、 野大豆 (Glycine soja) 或短絨野大豆 (Glycine tomentella)。
     在上述實施方案 1-7 或本發明的任一其他實施方案中的任一項中, 重組 DNA 構建 體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 可包含至少一種在植物中有功能的啟動子作為調控序列。
     在前述實施方案 1-7 中任一項或本發明的任何其他實施方案中, 所述至少一種農 學特性的改變是增加或減少。
     在前述實施方案 1-7 中任一項或本發明的任何其他實施方案中, 所述至少一種農 學特性可選自 : 綠度、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時的鮮重、 成熟時的干重、 果實產量、 種 子產量、 總植物含氮量、 果實含氮量、 種子含氮量、 營養組織含氮量、 總植物氨基酸含量、 營 養組織游離氨基酸含量、 果實游離氨基酸含量、 種子游離氨基酸含量、 總植物蛋白質含量、 果實蛋白質含量、 種子蛋白質含量、 營養組織蛋白質含量、 耐旱性、 氮攝取、 根倒伏抗性、 收 獲指數、 莖倒伏、 植株高度、 穗高、 穗長、 鹽耐受性、 早期幼苗活力、 和在低溫脅迫下的出苗。 例如, 至少一種農學特性的改變可為產量、 綠度或生物量的增加。 在前述實施方案 1-7 中任一項或本發明的任何其他實施方案中, 所述植物在與不 包含所述重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的對照植物在氮脅迫條件下進行比較時, 可表現出至少一種農學特性的改變。
     本領域的普通技術人員熟悉模擬氮條件 ( 限制性的或非限制性的 ) 的規程, 以及 用于評價已經經受過模擬的或天然存在的氮條件 ( 限制性的或非限制性的 ) 的植物的規 程。例如, 技術人員可通過向植物提供比正常需求更少的氮或在一定時期內不提供氮來模 擬氮條件, 并且技術人員可通過尋找農學特性的差異來評價此類植物, 例如在生理學和 / 或物理條件上的變化, 包括 ( 但不限于 ) 活力、 生長、 大小、 或根長、 或具體地講葉片顏色或 葉片面積大小。 用于評價此類植物的其他技術包括測量葉綠素熒光、 光合作用速率、 根生長 或換氣速率。
     下面的實施例描述了一些用于模擬氮限制條件和 / 或在此類條件下評價植物的 代表性規程和技術。
     技術人員也可通過植物在大田測試中, 在模擬的或天然存在的低氮或高氮條件 下保持足夠產量 ( 例如, 至少 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85%、 86%、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%、 或 100%的產量 ) 的能力 ( 例如通過測量在低氮或高氮條件下, 與標準氮條件下相比基本上等 同的產量, 或通過測量在低氮或高氮條件下與對照或參照植物相比更少的產量損失 ) 來評 價氮脅迫耐受性。
     在評估或測量其中利用了對照或參照植物的本發明任何實施方案 ( 例如, 如本文 描述的組合物或方法 ) 中的轉基因植物的農學特性或表型時, 本領域的普通技術人員將很 容易認識到要利用的合適對照植物。例如, 通過如下非限制性示例來說明 :
     1. 轉化過的植物的子代, 該轉化過的植物對于重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建 體 ) 來說是半合子的, 使得該子代分離成包含或不包含該 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的植株 : 包含該重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的子代將通常相對于不包含該重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的子代來進行測量 ( 即, 不包含該重組 DNA 構建體 ( 或抑 制 DNA 構建體 ) 的子代是對照或參照植株 )。
     2. 重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 基因滲入至近交系中, 例如在玉米中, 或 基因滲入進變種中, 例如在大豆中 : 基因滲入品系將通常相對于親本近交系或變種品系進 行測量 ( 即, 親本近交系或品種品系是對照或參照植物 )。
     3. 雙雜交系, 其中第一雜交系由兩個親本近交系產生, 而第二雜交系由相同的兩 個親本近交系產生, 不同的是其中一個親本近交系含有重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建 體): 第二雜交系通常將相對于第一雜交系進行測量 ( 即第一雜交系為對照植物或參照植 物 )。
     4. 包含重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的植株 : 該植株可以相對于這樣 的對照植株進行評估或測量, 該對照植株不包含重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ), 但具有與該植株相當的遺傳背景 ( 例如, 與包含重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的 植株相比較, 核遺傳物質具有至少 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99%或 100%的序列同一性 )。存在許多可用于分析、 比較和表征植物遺傳背景的基于實 驗室的技術 ; 其中這些技術是同工酶電泳、 限制性片段長度多態性 (RFLP)、 隨機擴增多態 性 DNA(RAPD)、 任何引物聚合成酶鏈反應 (AP-PCR)、 DNA 擴增指紋 (DAF)、 序列特異擴增區域 (SCAR)、 擴增片段長度多態性 (AFLP ) 和也稱為微衛星的簡單序列重復 (SSR)。 此外, 本領域的普通技術人員將容易認識到, 評估或測量轉基因植物的農學特性 或表型時合適的對照或參照植物將不包括先前已經針對所需的農學特性或表型, 通過誘變 或轉化而選擇的植物。
     方法
     方法包括但不限于用于提高植物氮脅迫耐受性的方法、 用于評價植物氮脅迫耐受 性的方法、 用于改變植物農學特性的方法、 用于測定植物農學特性改變的方法、 和用于制備 種子的方法。所述植物可為單子葉或雙子葉植物, 例如玉米或大豆植物。植物還可以是向 日葵、 高梁、 低芥酸菜籽、 小麥、 苜蓿、 棉、 稻、 大麥、 小米、 或甘蔗。所述種子可為玉米或大豆 種子, 例如玉米雜交種子或玉米自交系種子。
     方法包括但不限于如下方法 :
     轉化細胞的方法包括用本發明的任何分離的多核苷酸轉化細胞。 也包括通過這種 方法轉化的細胞。 在具體實施方案中, 所述細胞是真核細胞, 例如酵母、 昆蟲或植物細胞, 或 原核細胞, 例如細菌細胞。
     生產轉基因植物的方法, 所述方法包括用本發明的任何分離的多核苷酸或重組 DNA 構建體 ( 包括抑制 DNA 構建體 ) 來轉化植物細胞并從轉化的植物細胞中再生轉基因植 物。 本發明也涉及由該方法制備的轉基因植物, 以及從該轉基因植物中獲取的轉基因種子。 通過該方法獲取的轉基因植物可被用于本發明的其他方法中。
     用于從細胞或細胞培養基中分離本發明多肽的方法, 其中所述細胞包含具有本發 明多核苷酸的重組 DNA 構建體, 所述多核苷酸可操作地連接到至少一個調控序列, 并且其
     中轉化的宿主細胞在適于重組 DNA 構建體表達的條件下生長。
     改變宿主細胞中本發明多肽表達水平的方法, 所述方法包括 : (a) 用本發明的重 組 DNA 構建體轉化宿主細胞 ; 以及 (b) 在適于表達所述重組 DNA 構建體的條件下培養轉化 過的細胞, 其中重組 DNA 構建體的表達導致轉化過的宿主細胞中的本發明多肽含量改變。
     提高植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 將重組 DNA 構建體引入到可再 生的植物細胞中, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列 ( 例如在植 物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的, 所述 氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%的序列 同一性 ; 和 (b) 在步驟 (a) 之后, 從所述可再生的植物細胞再生出轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體并且在與不包含該重組 DNA 構建體的對照 植物進行比較時表現出提高的氮脅迫耐受性。所述方法可進一步包括 (c) 獲取源自該轉基 因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體并且在與未包含 該重組 DNA 構建體的對照植物比較時表現出增加的氮脅迫耐受性。
     提高植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 將抑制 DNA 構建體引入到可再 生的植物細胞中, 該抑制 DNA 構建體包含可操作地連接至少一種調控序列 ( 例如在植物中 有功能的啟動子 ) 的以下序列的全部或部分 : (i) 編碼多肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸 序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57%、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%的序列同一 性, 或 (ii)(a)(i) 的核酸序列的全長互補序列 ; 以及 (b) 在步驟 (a) 之后, 從該可再生的植 物細胞再生出轉基因植物, 其中該轉基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 并且在 與不包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出增加的氮脅迫耐受性。所述方 法可進一步包括 (c) 獲取源自該轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中 包含抑制 DNA 構建體并且在與未包含該抑制 DNA 構建體的對照植物比較時表現出增加的氮 脅迫耐受性。
     提高植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 將抑制 DNA 構建體引入到可再 生的植物細胞中, 該抑制 DNA 構建體包含可操作地連接源自受關注靶基因有義鏈或反義鏈 的全部或部分區域的至少一種調控序列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 所述區域的核 酸序列基于 Clustal V 比對方法在與所述區域所來源的有義鏈或反義鏈的全部或部分進 行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57%、 58%、 59%、 60%、 61%、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的多肽 ; 以及 (b) 在步驟 (a) 之后, 從所述可再生的植物細 胞再生出轉基因植物, 其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構建體并且在 與不包含該抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出增加的氮脅迫耐受性。所述方法 可進一步包括 (c) 獲取源自該轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包 含抑制 DNA 構建體并且在與未包含該抑制 DNA 構建體的對照植物比較時表現出增加的氮脅 迫耐受性。
     評價植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含重組 DNA 構建體, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少 一種調控序列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有 一種氨基酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%、 51%、 52%、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98%、 99%或 100%的序列同一性 ; (b) 獲取來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述 子代植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體 ; 以及 (c) 評價所述子代植物在與不包含 所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時的氮脅迫耐受性。
     評價植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控序 列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 其可操作地連接以下序列的全部或部分 : (i) 編碼多 肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或 100 %的序列同一性 ; 或 (ii)(a)(i) 的核酸序列的全長互補序列 ; (b) 獲取來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構建體 ; 以及 (c) 評價所述子代植物在與不包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行 比較時的氮脅迫耐受性。
     評價植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控序 列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 其可操作地連接源自受關注靶基因有義鏈或反義鏈 的全部或部分區域, 所述區域的核酸序列基于 Clustal V 比對方法在與所述區域所來源的 有義鏈或反義鏈的全部或部分進行比較時, 具有至少 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 或 100% 的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的多肽 ; (b) 獲取來源 于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構建體; 以及 (c) 評價所述子代植物在與不包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時的 氮脅迫耐受性。
     測定植物農學特性改變的方法, 所述方法包括 (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含重組 DNA 構建體, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少 一種調控序列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有 一種氨基酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%、 51%、 52%、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98%、 99%或 100%的序列同一性 ; (b) 獲取來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述 子代植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體 ; 以及 (c) 測定所述子代植物任選地在氮 限制條件下與不包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時是否表現出至少一種農 學特性的改變。
     測定植物農學特性改變的方法, 所述方法包括 (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控序 列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 其可操作地連接以下序列的全部或部分 : (i) 編碼多 肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97%、 98%、 99%或 100%的序列同一性 ; 或 (ii)(i) 的核酸序列的全長互補序列 ; (b) 獲取 來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構 建體 ; 以及 (c) 測定所述子代植物任選地在氮限制條件下與不包含所述抑制 DNA 構建體的 對照植物進行比較時是否表現出至少一種農學特性的改變。
     測定植物農學特性改變的方法, 所述方法包括 (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控序列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 其可操作地連接源自受關注靶基因有義鏈或反義鏈的 全部或部分的區域, 所述區域的核酸序列基于 Clustal V 比對方法在與所述區域所來源的 有義鏈或反義鏈的全部或部分進行比較時, 具有至少 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 或 100% 的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的多肽 ; (b) 獲取來源 于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構建 體; 以及 (c) 測定所述子代植物任選地在氮限制條件下與不包含所述抑制 DNA 構建體的對 照植物進行比較時是否表現出至少一種農學特性的改變。
     產生種子 ( 例如可作為提供氮脅迫耐受性的產品銷售的種子 ) 的方法, 該方法包括任一上述的方法, 并且還包括從所述子代植物獲取種子, 其中所述種子在其基因組中包 含所述重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 )。
     在任何前述方法或本發明的方法的任何其他實施方案中, 在所述導入步驟中所述 可再生的植物細胞可包括愈傷組織細胞、 胚胎愈傷組織細胞、 配子細胞、 分生細胞或未成熟 胚芽細胞。可再生的植物細胞可來自近交系玉米植物。
     在任一前述方法或本發明方法的任一其他實施方案中, 所述再生步驟可包括 : (i) 在包含促胚發生激素的培養基中培養所述轉化的植物細胞, 直至觀察到愈傷組織 ; (ii) 將 步驟 (i) 的所述轉化植物細胞轉移到第一培養基中, 所述培養基包括促組織形成激素 ; 以 及 (iii) 在第二培養基上傳代培養步驟 (ii) 后的所述轉化的植物細胞, 以允許嫩芽伸長、 根發育或這兩者同時發生。
     在任何前述方法或本發明的方法的任何其他實施方案中, 所述至少一種農學特性 可選自 : 綠度、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時的鮮重、 成熟時的干重、 果實產量、 種子產量、 總植物含氮量、 果實含氮量、 種子含氮量、 營養組織含氮量、 總植物氨基酸含量、 營養組織游 離氨基酸含量、 果實游離氨基酸含量、 種子游離氨基酸含量、 總植物蛋白質含量、 果實蛋白 質含量、 種子蛋白質含量、 營養組織蛋白質含量、 耐旱性、 氮攝取、 根倒伏抗性、 收獲指數、 莖 倒伏、 植株高度、 穗高、 穗長、 鹽耐受性、 早期幼苗活力、 和在低溫脅迫下的出苗。 至少一種農 學特性的改變可為產量、 綠度或生物量的增加。 在任一上述方法或本發明的任一方法中, 在與不包含所述重組 DNA 構建體 ( 或抑 制 DNA 構建體 ) 的對照植物在氮限制條件下進行比較時, 植物可表現出至少一種農學特性 的改變。
     在任一前述方法或本發明方法的任何其他實施方案中, 存在供選擇的替代方案用 于將包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸的重組 DNA 構建體導入可再生的 植物細胞中。例如, 可將調控序列 ( 例如一種或多種增強子, 例如, 作為轉座因子的部件 ) 導入可再生的植物細胞, 然后篩選其中將所述調控序列可操作地連接至編碼本發明的多肽 的內源基因的事件。
     將本發明的重組 DNA 構建體引入植物可通過任何合適的技術來進行, 這些技 術包括但不限于 DNA 直接攝取、 化學處理、 電穿孔、 顯微注射、 細胞融合、 感染、 載體介導 的 DNA 轉移、 轟擊或農桿菌屬介導的轉化。植物轉化和再生技術已經在國際專利公布 WO 2009/006276 中進行了描述, 其內容以引用方式并入本文。
     含有編碼受關注蛋白質的外來的外源性分離核酸片段的植物的發育或再生是本 領域所熟知的。可將再生的植物進行自花授粉以產生純合的轉基因植物。或者, 將得自再 生植物的花粉與農學上重要的品系的產生種子的植株進行雜交。相反, 將來自這些重要品 系植物的花粉用于給再生植物授粉。 利用本領域技術人員所熟知的方法培育含有所需多肽 的本發明的轉基因植物。
    實施例 本發明將在下面的實施例中進一步說明, 其中份數和百分比是以重量計并且度數 是攝氏度, 除非另外說明。應該理解, 盡管這些實施例說明了本發明的實施方案, 但僅是以 例證的方式給出的。根據上面的論述和這些實施例, 本領域的技術人員可以確定本發明的
     基本特征, 并在不脫離本發明的精神和范圍的情況下, 可對本發明做出多種改變和修改, 以 使其適用于多種用法和條件。此外, 除了那些本文所示和描述的那些之外, 根據前文所述, 本發明的各種修改形式對本領域的技術人員來說將是顯而易見的。 這些修改形式也旨在涵 蓋于所附權利要求書的范圍內。
     實施例 1
     制備具有激活標記基因的擬南芥種群
     構建 18.49kb 的 T-DNA 基二元構建體, pHSbarENDs2(SEQ ID NO : 1; 圖 1) 包含四 個來源于花椰菜花葉病毒 35S 啟動子的四個多聚增強子元件 ( 對應于序列 -341 至 -64, 如 Odell 等人 Nature 313 : 810-812 所述 (1985))。該構建體也包含允許質粒救援的載體序列 (pUC9) 和多接頭 (SEQ ID NO : 11)、 再動員 T-DNA 的轉座子序列 (Ds)、 以及允許草胺磷選擇 轉基因植物的 bar 基因。原則上, 僅將從右邊界 (RB) 至左邊界 (LB) 包含的 10.8kb 片段轉 移到寄主植物基因組中。因為增強子元件位于靠近 RB 處, 它們可誘導 T-DNA 整合后的基因 組位點順式激活。
     通過整個植株的農桿菌屬轉化制備擬南芥屬激活標記種群。將 pHSbarENDs2 構建 體轉化到根癌農桿菌菌株 C58 中, 在 25℃下在溶菌肉湯培養基中培養至 OD600 ~ 1.0。然 后離心沉淀細胞, 并重懸在相等體積的 5%蔗糖 /0.05% Silwet L-77(OSI Specialties, Inc) 中。在早期抽薹時, 培育擬南芥生態型 Col-0 的土壤使用農桿菌屬懸浮液進行頂部灌 溉。 一周后, 相同植株再次用在蔗糖 /Silwet 中的相同農桿菌屬菌株進行頂部灌溉。 然后將 該植物的種子設為標準。所得 T1 種子在土壤中播種, 通過噴灑草胺磷 (FINALE ; AgrEvo ; Bayer Environmental Science) 選擇轉基因幼苗。選擇了總計 100,000 個草胺磷抗性 T1 幼苗。分開保存來自每個品系的 T2 種子。
     實施例 2
     篩選以鑒定具有低氮耐受性的品系
     來 自 每 個 100,000 個 分 離 T1 激 活 標 記 品 系 的 十 一 個 T2 植 物 可 種 植 在 方 板 (15mm×15mm) 上, 方板包含 0.5x N-Free Hoagland’ s, 0.4mM 硝酸鉀, 0.1%蔗糖, 1mM MES TM 和 0.25% Phyytagel ( 低氮培養基 )。 每個板種植五個品系, 并且每個板包括 9 個野生型個 體以使總計 64 個個體排列成 8×8 的網格圖案 ( 參見圖 12)。在暗處、 4℃條件下保持平板 三天以使種子分層, 然后在 22℃光照和 20℃黑暗交替條件下水平放置九天。光周期為十六 小時光照和八小時黑暗, 平均光照強度為~ 200mmol/m2/s。每天旋轉并振動每個架子中的 平板。在第十二天 ( 生長九天 ), 對整個板拍照以評價幼苗狀態。
     在掩蔽該平板圖像以去除背景顏色后, 每個個體收集兩個不同的測量數據 : 總羅 賽塔面積和進入綠色區的顏色百分比。使用色調、 飽和度和強度數據 (HSI), 綠色區由色調 50 至 66 組成。 總羅賽塔面積用作植物生物量的量度, 而綠色區通過劑量 - 響應研究已經顯 示指示氮同化作用 ( 參見圖 13)。
     將在與野生型對照植物進行比較時具有顯著的總羅賽塔面積和 / 或綠色區增加 的品系命名為 Phase 1 hits。在相同分析條件下進行 Phase 1hits 的重復試樣再篩選 (Phase 2 篩選 )。還通過 Phase 3 篩選以進一步驗證通過 Phases 1 和 2 的突變體。在 Phase 3 中, 將每個品系分開種植在低氮培養基中, 使得 32 個 T2 個體緊鄰著 32 個野生型個 體生長, 為分析提供更高的統計學嚴謹性。如果一個品系顯示與 Phase 3 中對照的顯著差異, 然后可認為該品系是經驗證的氮缺乏抗性品系。
     實施例 3
     鑒定激活標記基因
     在氮耐受性品系中側接 T-DNA 插入序列的基因使用以下兩個標準程序中的一個 或兩個進行鑒定 : (1) 熱不對稱交錯 (TAIL)PCR(Liu 等人, Plant J.8 : 457-63(1995)) ; 以及 (2)SAIFF PCR(Siebert 等人, Nucleic Acids Res.23 : 1087-1088(1995))。至于復雜的多 聚 T-DNA 插入序列, TAIL PCR 和 SAIFF PCR 可能均不足以鑒定候選基因。在這些情況下, 可使用包括反式 PCR、 質粒拯救和 / 或基因組文庫構建在內的其他程序。
     成功的結果是其中單個 TAIL 或 SAIFF PCR 片段包含 T-DNA 邊界序列和擬南芥屬 基因組序列。一旦獲取側接 T-DNA 插入序列的基因組序列標記, 通過與公開可用的擬南芥 屬基因組的序列比對來鑒定候選基因。具體地講, 最靠近 35S 增強子元件 /T-DNA RB 的注 釋基因是激活的基因的候選基因。
     為了驗證鑒定的基因真的靠近 T-DNA 并排除 TAIL/SAIFF 片段是嵌合偽克隆的可 能性, 用一個 T-DNA 中的寡核苷酸和一個候選基因特異性的寡核苷酸進行對基因組 DNA 的 診斷 PCR。將提供 PCR 產品的基因組 DNA 樣本理解為表示 T-DNA 插入序列。該分析也驗證 了其中一種以上的插入事件發生在相同品系中的情況, 例如, 在 TAIL 和 / 或 SAIFF PCR 分 析中鑒定是否有多個不同基因組片段。
     實施例 4
     鑒定編碼包含 SNF2 結構域的多肽的激活標記基因
     進一步分析了顯示出氮缺乏耐受性的激活標記品系 ( 品系 112579)。提取來自該 品系的 DNA, 并且在突變品系中側接 T-DNA 插入序列的基因通過連接介導 PCR(Siebert 等 人, Nucleic Acids Res.23 : 1087-1088(1995)) 進行鑒定。鑒定一個單獨擴增的片段, 它包 含 T-DNA 邊界序列和擬南芥屬基因組序列。一旦獲取側接 T-DNA 插入序列的基因組序列標 記, 通過與完全擬南芥屬基因組的序列比對鑒定候選基因。具體地講, 最靠近 35S 增強子元 件 /T-DNA RB 的注釋基因是品系中激活的基因的候選基因。就品系 112579 而言, 最靠近 35S 增強子的基因是 At1g61140, 它編碼擬南芥包含 SNF2 結構域的多肽。
     實施例 5
     通過轉化擬南芥屬驗證候選的擬南芥基因 (At1g61140)
     可將候選基因轉化到擬南芥屬中并在 35S 啟動子作用下過表達。如果在轉基因品 系中觀察到與親本激活標記品系相同或相似的表型, 則將該候選基因認為是擬南芥屬中驗 證過的 “前導基因” 。
     候選擬南芥屬基因 (At1g61140) 編碼包含 SNF2 結構域的多肽, 用以下方法測試其 賦予氮缺乏耐受性的能力。設計引物以擴增突變體 At1g61140.1。
     通過 RT-PCR, 用以下引物擴增 At1g61140.1cDNA(SEQ ID NO : 24) :
     1.At1g61140-5’ attB 正向引物 (SEQ ID NO : 33)
     正向引物包含 attB1 序列 (ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT ; SEQ ID NO : 12) 和共有 的 Kozak 序列 (CAACA) 蛋白編碼區上游的前 21 個核苷酸 ( 以所述 cDNA 的 ATG 起始密碼子 開頭 )。
     2.At1g61140-3’ attB 反向引物 (SEQ ID NO : 34)。反向引物包含 attB2 序列 (ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT ; SEQ ID NO : 13), 該序列 鄰近蛋白編碼區的反向互補序列的后 21 個核苷酸 ( 以所述 cDNA 的終止密碼子的反向互補 序列開頭 )。
     使用 INVITROGENTM GATEWAY CLONASETM 技術, 用 pDONRTMZeo(SEQ ID NO : 2; 圖 2) 對每個 RT-PCR 產物進行了 BP 重組反應。這種方法將細菌致死 ccdB 基因以及氯霉素抗性 基因 (CAM) 從 pDONRTMZeo 移除并定向地克隆了該在旁側具有 attB1 和 attB2 位點的 PCR 產 物而得到入門克隆 (entry clone)。鑒定為陽性的入門克隆與一個目的載體一起被用于隨 后的 LR 重組反應, 如下所述。
     用緊接 INVITROGENTMGATEWAY C1 轉化插入序列上游的 1.3-kb35S 啟動子構建 稱為 pBC-yellow(SEQ ID NO : 4; 圖 4) 的基于 16.8-kbT-DNA 的二元載體 ( 目的載體 ), 所述插入序列包含 ccdB 細菌致死基因以及側接 attR1 和 attR2 序列的氯霉素抗性基因 (CAM)。該載體還包含 RD29a 啟動子, 該啟動子驅動基因表達 ZS-Yellow(INVITROGENTM), 它 TM 賦予轉化過的種子黃色熒光。使用 INVITROGEN GATEWAY 技術, 對包含核苷酸編碼序列 At1g61140.1(SEQ ID NO : 24) 和 pBC-yellow 載體的入門克隆進行 LR 重組反應 ; 然而, 也可 使用任一種其他突變體 (SEQ ID NO : 26 和 28)。該擴增允許迅速地定向克隆在 pBC-yellow 中的 35S 啟動子之后的 At1g61140.1(SNF2.1 ; SEQ ID NO : 24)。 申請人然后使用如實施例 1 所述的相同農桿菌介導的轉化程序將 35S 啟動子 : At1g61140 表達構建體導入野生型擬南芥屬生態型 Col-0 中。 轉基因 T1 種子通過黃色熒光 進行選擇, 并且將 32 個這些 T1 種子緊鄰著 32 個野生型擬南芥屬生態型 Col-0 種子種植在 低氮培養基上。所有隨后的生長和拍照條件均如實施例 1 所述。發現來自激活標記的、 對 氮限制條件具有耐受性的初始表型, 可在用其中 At1g61140 基因通過 35S 啟動子直接表達 的構建體轉化過的野生型擬南芥屬植物中重現。
     實施例 6a
     cDNA 文庫的制備和 cDNA 克隆的分離和測序
     cDNA 文庫可通過許多可用的方法中的任一種制備。例如, 通過首先根據生產商的 說明書 (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) 制備 Uni-ZAPTMXR 載體中的 cDNA 文 庫, 可將 cDNA 引入質粒載體中。 根據 Stratagene 提供的說明書, 將 Uni-ZAPTMXR 文庫轉換成 質粒文庫。當轉換的時候, 將把 cDNA 插入序列包含于質粒載體 pBLUESCRIPT 中。此外, 可
    使用 T4 連接酶 (New England Biolabs) 將 cDNA 直接導入預切過的 BLUESCRIPT II SK(+) 載體 (Stratagene) 中, 隨后按照制造商規程 (GIBCO BRL Products) 轉染 DH10B 細胞。一 旦 cDNA 插入序列處于質粒載體中, 從隨機選取的含重組 pBLUESCRIPT 質粒的細菌菌落制 備質粒 DNA, 或者用對插入的 cDNA 序列旁側的載體序列特異性的引物, 通過聚合酶鏈式反 應擴增插入的 cDNA 序列。將擴增的 DNA 插入序列或質粒 DNA 在染料 - 引物標記法測序反 應 (dye-primer sequencing reaction) 中進行測序, 以產生部分 cDNA 序列 ( 表達序列標 記或 “EST” ; 參見 Adams 等人, Science 252 : 1651-1656(1991))。用 Perkin Elmer Model 377 熒光測序儀分析所得的 EST。
     用改進的轉座規程產生全長插入序列 (FIS) 數據。從歸檔的甘油原種作為單一菌 落回收確定了 FIS 的克隆, 并通過堿性裂解分離質粒 DNA。將分離的 DNA 模板在基于 PCR 的 測序反應中與載體引物 M13 正向和反向寡核苷酸反應并上樣至自動化的測序儀上。通過與對其進行 FIS 查詢的初始 EST 序列進行序列比對來確認克隆鑒定。
     將確認的模板通過基于釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)Ty1 轉座因子 (Devine 和 Boeke, Nucleic Acids Res.22 : 3765-3772(1994)) 的 Primer Island 轉座試劑 盒 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) 進行轉座。該體外轉座系統在整個一組大 DNA 分子中隨機地放入獨特的結合位點。隨后將轉座的 DNA 用于通過電穿孔轉化 DH10B 電 感受態細胞 (GIBCO BRL/Life Technologies, Rockville, MD)。轉座因子含有另外的可選 標記 ( 稱為 DHFR ; Fling 和 Richards, Nucleic Acids Res.11 : 5147-5158(1983)), 使得能 在瓊脂平板上僅雙重篩選含有整合的轉座子的那些亞克隆。 從每次轉座反應隨機地選擇多 個亞克隆, 通過堿性裂解制備質粒 DNA, 并用對轉座子內的結合位點特異性的獨特引物從轉 座事件位點向外進行測序 (ABI PRISM dyeterminator ReadyReaction mix)。
     收 集 序 列 數 據 (ABI PRISM Collections) 并 用 Phred 和 Phrap(Ewing 等 人, Genome Res.8 : 175-185(1998) ; Ewing 等人, Genome Res.8 : 186-194(1998)) 組裝。Phred 是一種公用軟件程序, 該程序再次讀取 ABI 序列數據, 再次調出 (recall) 堿基, 賦質量值, 并將堿基序列 (base call) 和質量值寫入可編輯的輸出文件中。Phrap 序列組裝程序使用 這些質量值來增加組裝的序列重疊群的準確度。通過 Consed 序列編輯器 (Gordon 等人, Genome Res.8 : 195-202(1998))。
     在一些克隆中, cDNA 片段對應基因的 3’ 端的一部分并且不會涵蓋整個開放閱讀 框。為了獲取上游信息, 使用兩種不同規程中的一種。這兩種方法中的第一種方法導致產 生含有所需基因序列的部分的 DNA 片段, 而第二種方法導致產生含有整個開放閱讀框的片 段。這兩種方法均使用兩輪 PCR 擴增以從一個或多個文庫獲取片段。有時基于以前的知識 ( 特定的基因應該存在于某些組織中 ) 選擇文庫, 有時則進行隨機地選擇。 獲取相同基因的 反應可平行地在若干文庫中進行, 或者在文庫池中進行。文庫池通常用 3 至 5 個不同的文 庫制備并且使其歸一化而成為一致的稀釋度。在第一輪擴增中, 兩種方法均使用載體特異 性的 ( 正向 ) 引物, 同時還使用基因特異性的 ( 反向 ) 引物, 該正向引物對應位于克隆 5’ 端處的載體的一部分。第一種方法使用與已知基因序列的一部分互補的序列, 而第二種方 法使用與 3’ 非翻譯區 ( 也稱為 UTR) 的一部分互補的基因特異性引物。在第二輪擴增中, 兩種方法均使用套式引物組。按照生產商的說明書, 用市售試劑盒將所得 DNA 片段連接進 pBLUESCRIPT 載體中。該試劑盒選自可得自包括 INVITROGENTM(Carlsbad, CA)、 Promega Biotech(Madison, WI) 和 Gibco-BRL(Gaithersburg, MD) 在內的一些供應商的許多試劑盒。 如上所述, 將質粒 DNA 通過堿性裂解方法分離并進行測序和用 Phred/Phrap 進行裝配。
     實施例 6B
     制備 cDNA 文庫并獲取序列
     可利用用于總 RNA 分離的 Qiagen RNA 分離試劑盒分離 mRNA, 然后通過吸附到 Invitrogen(Life Technologies, Carlsbad, CA) 的 oligo(dT)Dynabeads 上分離 mRNA, 并且 測序文庫能夠使用 Illumina, Inc.(SanDiego, CA) 的標準 mRNA-Seq 試劑盒和規程進行制 備。在這一方法中, 使用 ZnCl2 溶液破壞 mRNA, 使用隨機引物將其反轉錄成 cDNA, 進行末端 修復以制備鈍末端片段, 3’ A- 尾化, 并且用 Illumina 雙末端文庫接頭進行連接。然后可使 用 Illumina 雙末端文庫引物對連接好的 cDNA 片段進行 PCR 擴增, 并且能夠在用配有雙末 端模塊的 Genome Analyzer II 測序前使用 Agilent Bioanalyzer DNA 1000 芯片檢查純化PCR 產物的質量和數量。
     測序運行中的讀數可在組合之前進行軟修剪以使觀察到具有低于 15 的 FASTQ 質 量評分的每個讀數的首個堿基對和后面所有堿基對通過 Python Script 進行修剪。Velvet 裝 配 器 (Zerbino 等 人, Genome Research18 : 821-9(2008)) 能 在 不 同 kmer 和 覆 蓋 截 斷 (coverage cutoff) 參數下運行以制備某一嚴格性范圍內的若干個推定裝配物。能夠使用 Vmatch 軟件 ( 在 Vmatch 網站上可用 ) 將在那些裝配物內的鄰接序列 ( 重疊群 ) 組合成組 使得被鑒定為較長重疊群亞組的重疊群分組并被排除, 留下最長 “sentinel” 重疊群的非冗 余組。這些非冗余組能用于與來自已知模型植物種類的同源序列進行比對。
     如果重疊群不提供完整基因, 能夠經由 Blast 或 Perl Script, 使用在第一次搜索 中發現的序列對非冗余組進行再查詢。如果發現了延伸所述重疊群末端的序列, 它們能夠 用桌面裝配器如 DNAStar′ s SeqMan 或 GeneCode′ s Sequencher 與初始序列一起進行裝 配。可重復這些步驟直至不再發現更多的延伸序列。就仍不完整的轉錄物而言, 理論上屬 于一類 ( 基于與其他草本植物的同源性 ) 的基因片段能用來自另一種草本植物的連接序列 進行人工連接。
     實施例 7 鑒定 cDNA 序列
     編碼包含 SNF2 結構域的多肽的 cDNA 序列通過 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool ; Altschul 等人, J.Mol.Biol.215 : 403-410(1993) ; 還可參見國立衛生研究院 國家醫學圖書館的國家生物技術信息中心的萬維網址上對 BLAST 算法的解釋 ) 進行鑒定, 尋找與 BLAST“nr” 數據庫中所包含氨基酸序列 ( 包括所有非冗余 GenBank CDS 翻譯序列、 源自 3 維結構 Brookhaven 蛋白質數據庫 (Protein Data Bank)、 SWISSPROT 蛋白質序列數 據庫的最新的主要版本、 EMBL 和 DDBJ 數據庫的序列 ) 的相似性。在所有的閱讀框中翻譯 DNA 序列并用 NCBI 提供的 BLASTX 算法 (Gish 和 States, Nat.Genet.3 : 266-272(1993)) 比 較與包含在 “nr” 數據庫中的所有可公開獲取的氨基酸序列的相似性。采用國家生物技術 信息中心 (NCBI) 提供的 BLASTP 算法, 分析 cDNA 序列編碼的多肽與包含在 “nr” 數據庫中 的所有可公開獲取的氨基酸序列的相似性。為方便起見, 通過 BLAST 計算僅僅偶然觀察到 cDNA 序列與所搜索的數據庫中所包含序列的匹配的 P 值 ( 概率 ) 或 E 值 ( 期望值 ), 在本 文報導為 “pLog” 值, 它代表所報導的 P 值或 E 值的負對數。因此, pLog 值越大, cDNA 編碼 的序列和 BLAST 的 “匹配” 代表同源蛋白的可能性就越大。
     EST 序 列 可 與 如 上 所 述 的 Genbank 數 據 庫 進 行 比 較。 通 過 使 用 BLASTN 算 法 (Altschul 等人, Nucleic Acids Res.25 : 3389-3402(1997)) 對杜邦專利數據庫比較具有序 列同源共有區域或重疊區域的核苷酸序列, 可找到含更 5′端或 3′端序列的 EST。在兩個 或更多個核酸片段之間存在共有或重疊序列時, 該序列可裝配成單一的連續核苷酸序列, 從而使最初的片段在 5′或 3′初始方向上延伸。一旦確定了最 5′的 EST, 即能通過全長 插入序列來確定其完整的序列。
     可用 tBLASTn 算法, 通過將已知基因 ( 來自專有來源或公開數據庫的已知基因 ) 的氨基酸序列對 EST 數據庫進行比較, 可找到屬于不同物種的同源基因。 tBLASTn 算法對所 有 6 個閱讀框都翻譯了的核苷酸數據庫進行氨基酸查詢的搜索。該搜索允許不同物種之間 的核苷酸密碼子使用的差異, 并且允許密碼子簡并。
     實施例 8a
     表征編碼編碼包含 SNF2 結構域的多肽的 cDNA 序列
     制備提供來自玉米 (Zea mays)、 畫眉草 (Eragrostis nindensis)(Resurrection grass)、 和百喜草 (Paspalum notatum)(Bahiagrass) 不同組織的 mRNA 的 cDNA 文庫。下面 描述了該文庫的特征。
     表2
     來自玉米的 cDNA 文庫
    如 表 3、 圖 16A-AM 和 圖 17 所 示, 表 2 中 鑒 定 的 cDNA 編 碼 類 似 于 以 下 多 肽 的 多肽: 來 自 擬 南 芥 (At1g61140.1(GI No.186492170 ; SEQ ID NO : 25) ; At1g61140.2(GI No.186492172 ; SEQ ID NO : 27) ; 和 At1g61140.3(GI No.186492175 ; SEQ ID NO : 29)) 的 包 含 SNF2 結 構 域 的 多 肽、 和 來 自 水 稻 (GI No.53792213, 對 應 于 SEQ ID NO : 30, GI No.218200575, 對應于 SEQ ID NO : 31, 以及 GI No.90399293, 對應于 SEQ ID NO : 32) 以及高 粱 (GI No.242058897, 對應于 SEQ ID NO : 49) 的包含 SNF2 結構域的多肽。
     表 3( 非專利文獻 ) 和表 4( 專利文獻 ) 中所示的分別是單獨的 EST( “EST” )BLASTP 結果、 包含標明的 cDNA 克隆的整個 cDNA 插入物的序列 ( “FIS” )、 由兩個或更多個 EST、 FIS 或 PCR 序列裝配而成的重疊群序列 (“Contig” )、 或編碼源自 FIS 或重疊群的完整蛋白或 功能性蛋白的序列 (“CGS” )。表 3 和表 4 也顯示了使用 Clustal V 比對方法、 使用默認參 數計算的每對氨基酸序列的序列同一性百分比值 ( 如下所述 )。
     表3
     多肽的 BLASTP 結果
     包含 SNF2 結構域的多肽的同源物
    
    
    
    
    表4 多肽的 BLASTP 結果 包含 SNF2 結構域的多肽的同源物實施例 8b
     鑒定其他包含 SNF2 結構域的多肽
     與 編 碼 包 含 SNF2 結 構 域 的 蛋 白 的 前 導 基 因 同 源 的 序 列 可 使 用 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool ; Altschul 等 人, J.Mol.Biol.215 : 403-410(1993) ; 也參 見美國國家衛生研究院 (National Institutes of Health) 國立醫學圖書館 (National Library of Medicine) 的國家生物技術信息中心 (National Center for Biotechnology Information) 的萬維網網址上對 BLAST 算法的解釋 ) 之類的序列比較算法進行鑒定。例 如, 由 At1g61140 編碼的蛋白的氨基酸序列用作查詢序列, 使用 BlastP 查詢公共數據庫, 并 且隨后將如 SEQ ID NO : 40、 42、 和 48 所示的多肽序列鑒定為同源物 ( 對應的核苷酸序列分 別是 SEQ ID NO : 39、 41、 和 47)。 對公共 BAC 序列進行的 TblastN 搜索也鑒定了 SEQ ID NO : 44( 對應的核苷酸序列是 SEQ ID NO : 43) 所示的玉米同源物。
     實施例 8c
     包含 SNF2 結構域的多肽的序列比對和同一性百分比計算
     圖 16A-AM 給 出 如 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、
     46、 48、 和 49 所示的氨基酸序列比對結果。圖 17 示出圖 16A-AM 中顯示的每對氨基酸序列 的序列同一性百分比和趨異值的圖表。
     用 LASERGENE 生物信息計算包 (DNASTAR Inc., Madison, WI) 的 MEGALIGN 程 序進行序列比對和同一性百分比計算。用 Clustal 比對方法 (Higgins 和 Sharp(1989), CABIOS.5 : 151-153) 進行序列的多重比對, 默認參數 ( 空位罰分= 10, 空位長度罰分= 10)。使用 Clustal 方法采用以下逐對比對的默認參數 : KTUPLE 1, 空位罰分= 3, 窗口= 5, DIAGONALS SAVED = 5。 實施例 9
     包含擬南芥屬前導基因的同源物的植物表達載體的制備
     與 編 碼 包 含 SNF2 結 構 域 的 蛋 白 的 前 導 基 因 同 源 的 序 列 可 使 用 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool ; Altschul 等 人, J.Mol.Biol.215 : 403-410(1993) ; 也參 見美國國家衛生研究院 (National Institutes of Health) 國立醫學圖書館 (National Library of Medicine) 的國家生物技術信息中心 (National Center for Biotechnology Information) 的萬維網網址上對 BLAST 算法的解釋 ) 之類的序列比較算法進行鑒定。 與編 碼包含 SNF2 結構域的蛋白的基因類似的核苷酸序列, 如實施例 8A-C 所述的序列, 可通過任 何一種以下方法進行 PCR 擴增。
     方法 1( 基于 RNA 的方法 ) : 如果蛋白編碼區域的 5’ 和 3’ 序列信息是可用的, 可 如實施例 5 所述設計基因特異性引物。可將 RT-PCR 用于植物 RNA 來獲取含有蛋白編碼區 的核酸片段, 該 EXST 蛋白編碼區旁側為 attB1(SEQ ID NO : 12) 和 attB2(SEQ ID NO : 13) 序 列。引物可含有起始密碼子上游的共有 Kozak 序列 (CAACA)。
     方法 2( 基于 DNA 的方法 ) : 作為另外一種選擇, 如果 cDNA 克隆是可用的, 可以 PCR 擴增完整 cDNA 插入序列 ( 含有 5′和 3′非編碼區 )。可設計正向引物和反向引物, 使它們 分別或者含有 attB1 序列和在該 cDNA 插入序列前面的載體特異性序列或者含有 attB2 序 列和在該 cDNA 插入序列后面的載體特異性序列。對于克隆進載體 pBLUESCRIPT SK+ 中的 cDNA 插入序列, 可使用正向引物 VC062(SEQ ID NO : 16) 和反向引物 VC063(SEQ ID NO : 17)。
     方 法 3( 基 于 基 因 組 DNA 的 方 法 ) : 能 夠 使 用 長 程 基 因 組 PCR 捕 集 獲 取 基 因 組 序 列。 能 夠 基 于 基 因 座 序 列 設 計 引 物, 并 且 能 夠 對 所 得 PCR 產 物 測 序。 能 夠 使 用 FGENESH(Salamov, A.and Solovyev, V.(2000)Genome Res., 10 : 516-522) 程序進行序列分 析, 并且任選地能夠與來自其他物種的同源序列進行比對以輔助鑒定推定的內含子和外顯 子。
     方法 1、 2 和 3 可根據本領域技術人員已知的步驟進行修改。例如, 方法 1 的引物 可含有限制性酶切位點而不是 attB1 和 attB2 位點, 用于后來將 PCR 產物克隆進含有 attB1 和 attB2 位點的載體內。另外, 方法 2 可涉及從 cDNA 克隆、 λ 克隆、 BAC 克隆或基因組 DNA 擴增。
     可利用 BP 重組反應將通過任一種上述方法獲取的 PCR 產物與 GATEWAY 供體載
    體 ( 例如 pDONRTMZeo(SEQ ID NO : 2; 圖 2) 或 pDONRTM221(SEQ ID NO : 3; 圖 3) 組合。這種方 TM 法將細菌致死 ccdB 基因以及氯霉素抗性基因 (CAM) 從 pDONR Zeo 或 pDONRTM221 移除并定 向地克隆了在旁側具有 attB1 和 attB2 位點的 PCR 產物而得到入門克隆 (entry clone)。 使用 INVITROGENTM GATEWAY CLONASETM 技術, 然后可將來自入門克隆的編碼同源包含 SNF2結構域的多肽的序列轉移到合適的目的載體中, 例如 pBC-Yellow(SEQ ID NO : 4; 圖 4)、 PHP27840(SEQ ID NO : 5; 圖 5)、 或 PHP23236(SEQ ID NO : 6; 圖 6), 以獲取植物表達載體, 所 述載體分別用于擬南芥屬、 大豆、 和玉米。 TM
     供體載體 pDONR /Zeo 或 pDONRTM221 的 attP1 和 attP2 位點分別顯示于圖 2 和圖 3 中。目的載體 pBC-Yellow、 PHP27840 和 PHP23236 的 attR1 和 attR2 位點分別顯示于圖 4、 5 和 6 中。
     作為另外一種選擇, 可進行多個入門克隆和合適的目的載體之間的 MultiSite Gateway LR 重組反應以產生表達載體。 實施例 10
     用驗證過的擬南芥屬前導基因制備大豆表達載體并轉化大豆
     為了檢查所得表型, 可將大豆植株轉化以過表達每個驗證過的擬南芥屬基因或來 自不同物種的對應同源物。
     可將實施例 5 中所述的相同 GATEWAY 入門克隆用于將每個基因定向克隆進
    PHP27840 載體 (SEQ ID NO : 5; 圖 5) 中, 使得該基因的表達處于 SCP1 啟動子的控制下。
     然后可用包含編碼本多肽的序列的表達載體轉化大豆胚。 大豆轉化和再生技術已 經在國際專利公布 WO 2009/006276 中進行了描述, 其內容以引用方式并入本文。 可在氮限制條件下 ( 例如 1mM 硝酸鹽 ) 栽培 T1 植株并分析表型變化。利用圖像 分析可定量下面的參數 : 可收集并定量植株面積、 體積、 生長速率以及顏色分析。超表達構 建體與合適的對照植物比較導致綠度 ( 綠色區 )、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時的鮮重或 干重、 果實或種子產量、 總植物氮含量、 果實或種子氮含量、 營養組織的氮含量、 總植物游離 氨基酸含量、 營養組織中的游離氨基酸含量、 果實或種子中的游離氨基酸含量、 果實或種子 中的蛋白質含量、 營養組織中的蛋白質含量發生變化, 可認為它是擬南芥屬前導基因在大 豆中發揮功能提高對氮缺乏耐受性 ( 增加的氮耐受性 ) 的證據。
     可分析用驗證過的基因轉化大豆植株以研究相對于對照或參照植株的農學特性。 例如, 可分析在低氮和高氮條件 ( 如氮限制條件和氮充分條件 ) 下的產量增加和 / 或穩定 性。
     實施例 11
     使用粒子轟擊法用驗證過的擬南芥屬前導基因轉化玉米
     為了檢查所得表型, 可將玉米植株轉化以過表達驗證過的擬南芥屬前導基因或來 自不同物種的對應同源物。
     可以將實施例 5 中所述的相同 GATEWAY 入門克隆用于將每種相應的基因定向
    克隆進玉米轉化載體中。在玉米轉化載體中的基因的表達可以處于組成型啟動子的控 制下, 例如玉米泛素啟動子 (Christensen 等人, Plant Mol.Biol.12 : 619-632(1989) 和 Christensen 等人, Plant Mol.Biol.18 : 675-689(1992)) 然后可通過粒子轟擊將上述重組 DNA 構建體引入玉米細胞中。通過粒子轟擊進行 玉米轉化的技術已經在國際專利公布 WO 2009/006276 中進行了描述, 其內容以引用方式 并入本文。
     可在氮限制條件下 ( 例如 1mM 硝酸鹽 ) 栽培 T1 植株并分析表型變化。利用圖像 分析可定量下面的參數 : 可收集并定量植株面積、 體積、 生長速率以及顏色分析。超表達構
     建體與合適的對照植物比較導致綠度 ( 綠色區 )、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時的鮮重或 干重、 果實或種子產量、 總植物氮含量、 果實或種子氮含量、 營養組織的氮含量、 總植物游離 氨基酸含量、 營養組織中的游離氨基酸含量、 果實或種子中的游離氨基酸含量、 果實或種子 中的蛋白質含量、 營養組織中的蛋白質含量發生變化, 可認為它是擬南芥屬前導基因在玉 米中發揮功能提高對氮缺乏耐受性 ( 增加的氮耐受性 ) 的證據。
     實施例 12
     電穿孔根癌農桿菌 LBA4404
     將電穿孔感受態細胞 (40μl), 例如根癌農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens) LBA4404( 含有 PHP10523) 在冰上解凍 (20-30 分鐘 )。 PHP10523 含有用于 T-DNA 轉移的 VIR 基因、 農桿菌屬的低拷貝數質粒復制起始區、 四環素抗性基因以及用于體內 DNA 生物分子 重組的 cos 位點。同時, 將電穿孔管 (electroporation cuvette) 在冰上冷卻。將該電穿 孔儀的設置調節至 2.1kV。將 DNA 等分試樣 (0.5μL 親代 DNA, 在低鹽緩沖液或雙蒸 H2O 中 的濃度為 0.2μg-1.0μg) 與解凍的根癌農桿菌 LBA4404 細胞混合, 同時仍然保持在冰上。 將混合物轉移至電穿孔管的底部并靜止保持在冰上 1-2 分鐘。按下 “pulse( 脈沖 )” 鍵兩 次 ( 理想的是獲取 4.0 毫秒的脈沖 ) 對細胞進行電穿孔 (Eppendorf 電穿孔儀 2510)。隨 后, 將 0.5mL 室溫下的 2xYT 培養基 ( 或 SOC 培養基 ) 加入到電穿孔管并轉移至 15mL 按壓 蓋管 ( 例如 FALCONTM 管 ) 中。將細胞在 28-30℃、 200-250rpm 下培養 3 小時。 將 250μL 的等分試樣散布在包含 YM 培養基和 50μg/mL 奇放線菌素的板上并在 28-30℃下培養三天。為了增加轉化體的數目, 可進行如下兩個可選步驟中的其中一個 :
     選擇 1 : 用 30μL 15mg/mL 的利福平覆蓋平板。LBA4404 具有針對利福平的染色體 抗性基因。這種附加的選擇消除了在使用較差的 LBA4404 感受態細胞制備物時觀察到的一 些污染克隆。
     選擇 2 : 進行兩次重復的電穿孔以補償較差的電感受態細胞。
     轉化體的鑒定 :
     選取四個獨立的克隆并劃痕接種在包含 AB 基本培養基和 50μg/mL 奇放線菌素的 平板上用于分離單個克隆。 將平板在 28℃下孵育二至三天。 對于每個推定的共整合體選取 單個克隆并將其接種在 4mL 的 10g/L 細菌蛋白胨, 10g/L 酵母提取物, 5g/L 氯化鈉, 和 50mg/ L 奇放線菌素中。將該混合物在 28℃下搖動培養 24 小時。采用 QIAGEN Miniprep 和可選 的 PB 緩沖液洗滌, 從 4mL 培養物分離出質粒 DNA。DNA 在 30μl 中洗提。如上所述, 將 2μL 可將 15μl 等分試樣用于 的等分試樣用于電穿孔 20μL DH10b+20μL 雙蒸 H2O。可任選地, TM 轉化 75-100μl 的 INVITROGEN Library Efficiency DH5α。將細胞散布在包含 LB 培養 基和 50μg/mL 奇放線菌素的平板上并將其在 37℃下培養過夜。
     對于每個推定的共整合體選取三至四個獨立克隆并將其接種在 4mL 的 2xYT 培養 基 (10g/L 細菌蛋白胨, 10g/L 酵母提取物, 5g/L 氯化鈉 ) 和 50μg/mL 奇放線菌素中。將 細胞在 37℃下搖晃培養過夜。接下來, 使用 QIAprep Miniprep, 用任選 PB 緩沖液洗滌液
    ( 稀釋成 50μL) 從 4mL 培養物中分離質粒 DNA。8μL 質粒 DNA 用 SalI( 使用親本 DNA 和 PHP10523 作對照物 ) 進行消化。對于 4 個質粒利用限制性內切酶 BamHI、 EcoRI 和 HindIII 再進行三次消化 ( 使用親本 DNA 和 PHP10523 作為對照 ), 這 4 個質粒代表 2 種具有正確 SalI 消化模式的推定共整合體。推薦電凝膠 (Electronic gel) 用于比較。實施例 13
     使用農桿菌屬 (Agrobacterium) 細菌轉化玉米
     為了檢查所得表型, 可將玉米植株轉化以過表達驗證過的擬南芥屬前導基因或來 自不同物種的對應同源物。
     農 桿 菌 介 導 的 玉 米 轉 化 基 本 上 按 照 Zhao 等 人, Meth.Mol.Biol.318 : 315-323(2006) 中描述的方法進行 ( 還可參見 Zhao 等人, Mol.Breed.8 : 323-333(2001) 和 1999 年 11 月 9 日公布的美國專利 5,981,840, 所述文獻以引用方式并入本文 )。該轉化過 程涉及細菌接種、 共培養、 靜息、 選擇和植物再生。
     1. 未成熟胚芽制備 :
     將未成熟胚芽從穎果上切下來, 并且放置在含有 2mL PHI-A 培養基的 2mL 微管中。
     2. 未成熟胚芽的農桿菌屬細菌感染和其培養 :
     2.1 感染步驟 :
     用 1mL 微吸移管將 (1) 的 PHI-A 培養基取出, 并且加入 1mL 農桿菌屬懸浮液。將 該管輕輕地倒置以混合。將該混合物在室溫下培養 5 分鐘。
     2.2 共培養步驟 :
     用 1mL 微量吸移管將農桿菌屬懸浮液從感染步驟中移出。使用無菌刮刀將胚從管 中刮出并轉移到 100×15mm 培養皿中的 PHI-B 培養基的平板中。測定胚的朝向, 使得胚軸 在培養基表面上朝下。將具有胚芽的平板在 20℃下于黑暗中培養三天。L- 半胱氨酸可用 于共培養階段。采用標準二元載體, 補充有 100-400mg/L L- 半胱氨酸的共培養培養基對于 回收穩定的轉基因事件是至關重要的。
     3. 選擇推定的轉基因事件 :
     向在 100×15mm 培養皿中的 PHI-D 培養基的平板中轉移 10 個胚芽, 保持朝向, 并 且用 parafilm 將培養皿密封。將平板在黑暗中于 28℃下培養。預計在六至八周將看見作 為黃色胚芽組織的主動生長推定事件。不產生事件的胚可能是棕色和壞死的, 并且幾乎看 不見脆性組織生長。以二 - 三周的間隔將推定的轉基因胚芽組織轉移到新鮮的 PHI-D 平板 上進行傳代培養, 時間間隔取決于生長速度。記錄事件。
     4.T0 植株的再生 :
     將在 PHI-D 培養基上繁殖的胚芽組織轉移到在 100×25mm 培養皿中的 PHI-E 培 養基 ( 體細胞胚芽成熟培養基 ) 中進行傳代培養, 在 28℃于黑暗中培養直至體細胞胚芽成 熟, 培養大約十至十八天。將具有良好限定的盾片和胚芽鞘的個體成熟體細胞胚芽轉移到 PHI-F 胚芽發芽培養基中, 并且在 28℃下于光中 ( 約 80μE, 來自冷光燈或同等熒光燈 ) 培 養。在七至十天, 將約 10cm 高的再生的植株置于盆中的園藝混合物中, 并且使用標準園藝 方法進行耐寒鍛煉 (hardened-off)。
     用于植物轉化的培養基 :
     1.PHI-A : 4g/L CHU 基礎鹽, 1.0mL/L 1000×Eriksson′ s 維生素混合物, 0.5mg/L 鹽酸硫胺, 1.5mg/L 2, 4-D, 0.69g/L L- 脯氨酸, 68.5g/L 蔗糖, 36g/L 葡萄糖, pH5.2。加入 100μM 乙酰丁香酮 ( 過濾滅菌的 )。
     2.PHI-B : PHI-A, 不含有葡萄糖, 將 2, 4-D 增加至 2mg/L, 將蔗糖降低至 30g/L, 并 且補充 0.85mg/L 硝酸銀 ( 過濾滅菌的 ), 3.0g/LGELRITE , 100μM 乙酰丁香酮 ( 過濾滅菌的 ), pH5.8。
     3.PHI-C : PHI-B, 不含 GELRITE 和乙酰丁香酮, 將 2, 4-D 降低至 1.5mg/L, 并且補 充 8.0g/L 瓊脂, 0.5g/L 2-[N- 嗎啉代 ] 乙烷 - 磺酸 (MES) 緩沖液, 100mg/L 羧芐西林 ( 過 濾滅菌的 )。
     4.PHI-D : PHI-C 補充 3mg/L 雙丙氨磷 ( 過濾滅菌的 )。
     5.PHI-E : 4.3g/L Murashige and Skoog(MS) 鹽 (Gibco, BRL 11117-074), 0.5mg/L 煙酸, 0.1mg/L 鹽酸硫胺, 0.5mg/L 鹽酸吡哆醇, 2.0mg/L 甘氨酸, 0.1g/L 肌醇, 0.5mg/L 玉米 素 (Sigma, 目錄 No.Z-0164), 1mg/L 吲哚乙酸 (IAA), 26.4μg/L 脫落酸 (ABA), 60g/L 蔗糖, 3mg/Lbialaphos( 過濾滅菌的 ), 100mg/L 羧芐西林 ( 過濾滅菌的 ), 8g/L 瓊脂, pH5.6。
     6.PHI-F : PHI-E, 不 含 有 玉 米 素、 IAA、 ABA ; 將 蔗 糖 降 低 至 40g/L ; 用 1.5g/L GELRITE 替代瓊脂 ; pH 5.6。 通過首先將組織簇轉移到補充有 0.2mg 每升的 2, 4-D 的 N6 培養基中, 可從該 轉基因愈傷組織再生出植物。兩周后, 可將組織轉移到再生培養基中 (Fromm 等人, Bio/ Technology 8 : 833-839(1990))。
     轉基因 T0 植株可以再生, 并且可以確定其表型。可收集 T1 種子。
    此外, 可通過直接轉化或者從單獨轉化的品系基因滲入而將含有證實的擬南芥屬 基因的重組 DNA 構建體導入玉米自交系內。
     自交或雜交的轉基因植物可通過更嚴苛的大田試驗來研究在氮限制條件下和非 氮限制條件下的產量增加和 / 或穩定性。
     隨后可進行產量分析以測定包含驗證過的擬南芥屬前導基因的植物在與不包含 驗證過的擬南芥屬前導基因的對照植物 ( 或參比植物 ) 進行比較時是否具有產量改善 ( 在 氮限制條件下和非氮限制條件下 )。包含驗證過的擬南芥前導基因的植物在氮限制條件下 將具有比對照植物更少的產量損失, 例如至少 25%更少的產量損失, 或者在非氮限制條件 下將具有比對照植物更高的產量。
     實施例 14A
     用于用經過驗證的候選擬南芥屬基因 (At1g61140) 通過農桿菌屬轉化玉米品系 的表達載體的制備
     使用 INVITROGENTM GATEWAY 技術, 用 GATEWAY 入門克隆進行 LR 重組反應, 所述
    入門克隆具有編碼擬南芥屬包含 SNF2 結構域的蛋白的序列 ( 如實施例 5 所述, 并且在該 實施例和隨后的實施例中稱為 AT-SNF2.1)、 入門克隆 PHP23112(SEQ ID NO : 14)、 入門克隆 PHP20234(SEQ ID NO : 9; 圖 9) 和目的載體 PHP22655(SEQ ID NO : 10) 的序列以生成前體質 粒 PHP29872。PHP29872 包含以下表達盒 :
     1. 表達 PAT 抗除草劑性基因的泛素啟動子 ::moPAT::PinII 終止子盒, 該基因用于 轉化過程期間的選擇。
     2. 表達 DS-RED 顏色標記的 LTP2 啟動子 ::DS-RED2::PinII 終止子盒, 該標記用于 分選種子。 3. 泛素啟動子 ::AT-SNF2.1::PinII 終止子盒過表達擬南芥屬包含 SNF2.1 結構域 的蛋白質 (At1g61140.1)。
     實施例 14B
     用經驗證的候選擬南芥屬基因 (At1g61140) 通過農桿菌屬轉化玉米品系
     使用如實施例 12 和 13 所述的農桿菌介導轉化, 能將存在于載體 PHP29872( 如 14A 所述 ) 中、 或包含其他兩種 At1g61140 突變體中的任一種的載體中的 SNF2.1 表達盒導入玉 米自交系、 或來源于優良玉米自交系的可轉化玉米品系。
     可將表達載體 PHP29872 通過電穿孔導入包含載體 PHP10523(SEQ ID NO : 7, 圖 7) 的 LBA4404 農桿菌屬菌株以制備共整合載體 PHP29875, 該載體包含 SNF2.1 表達盒。共整 合載體通過每個載體上包含的 COS 重組位點重組兩個質粒 PHP29872 和 PHP10523 形成, 并 且除了農桿菌菌株以及農桿菌介導轉化需要的其他基因 (TET、 TET、 TRFA、 ORI 終止子、 CTL、 ORI V、 VIR C1、 VIR C2、 VIR G、 VIR B) 之外, 還包含上述相同的三個表達盒 ( 實施例 14A)。 可使用 ( 但不限于 ) 實施例 12 中的電穿孔規程。
     實施例 15
     用于轉入 Gaspe Flint 衍生的玉米品系的目的載體 PHP23236 的制備
     目的載體 PHP23236( 圖 6, SEQ ID NO : 6) 通過用載體 PHP23235( 圖 8, SEQ ID NO : 8) 轉化農桿菌屬菌株 LBA4404 并分離所得共整合產物而獲取, 所述菌株包含質粒 PHP10523( 圖 7, SEQ ID NO : 7)。
     目的載體 PHP23236 可被用于如實施例 16 所述的與入門克隆的重組反應, 以產生 用于轉化 Gaspe Flint 衍生的玉米品系的玉米表達載體。
     實施例 16
     用于轉入 Gaspe Flint 衍生的玉米品系的表達構建體的制備
     使用 INVITROGENTM GATEWAY LR 重組技術, 可將如實施例 5 所述的相同入門克 隆定向克隆到目的載體 PHP29634(SEQ ID NO : 15 ; 圖 11) 中以形成表達載體。目的載體 PHP29634 與目的載體 PHP23236 是相似的, 但是, 目的載體 PHP29634 具有位點特異性的重 組位點 FRT1 和 FRT87, 并且還編碼用于利用草甘膦對轉化體進行選擇的 GAT4602 選擇性標 記蛋白。該表達載體將包含所述受關注的 cDNA, 其在 UBI 啟動子的控制下編碼 At-SNF2.1、 At-SNF2.2、 或 AtSNF2.3, 并且是農桿菌介導轉化到玉米中的 T-DNA 二元載體, 該載體如本 文所述實施例所述但不受其限制。 實施例 17A
     用驗證過的候選擬南芥屬基因 (At1g61140) 轉化 Gaspe Flint 來源的玉米品系
     為了檢查所得表型, 可轉化玉米植株以過表達擬南芥屬 At1g61140 基因 ( 和來自 其他物種的對應同源物 )。可使用如實施例 16 所述的表達構建體。
     受體植株
     受體植株細胞可來自具有短的生活周期 ( “快速循環” )、 小的個體尺寸以及轉化潛 能高的單一玉米品系。對玉米典型的這些植株細胞是來自可公開獲得的 Gaspe Flint(GF) 品 系 變 種 的 植 株 細 胞。 一 種 可 能 的 候 選 植 株 品 系 變 種 是 GF×QTM(Quick Turnaround Maize( 快速周轉玉米 ), 選擇用于在溫室條件下生長的 Gaspe Flint 的可公開獲得形式 ) 的 F1 雜交種, 其在 Tomes 等人 ( 美國專利申請 10/367,416, 提交于 2003 年 2 月 13 日 ; 美 國專利公開 2003/0221212 A1, 公布于 2003 年 11 月 27 日 ) 中公開。從該品系獲得的轉基 因植株具有如此小的尺寸使得它們可在四英寸的盆中生長 ( 是正常大小的玉米植株所需 空間的 1/4) 并且它們在少于 2.5 個月時間內成熟。( 傳統上, 一旦轉基因植株適應溫室后
     需要 3.5 個月來獲得轉基因 T0 種子。) 另一合適的品系包括但不限于 GS3( 高度可轉化的 品系 )X Gaspe Flint 的雙單倍體品系。還有另一種合適的品系是攜帶引起較早開花、 高度 減小或這兩者的轉基因的可轉化的優良玉米自交系。
     轉化規程
     任何合適的方法可用于將轉基因引入玉米細胞中, 包括但不限于利用基于農桿菌 屬載體的接種類型的步驟 ( 參見例如實施例 12 和 13)。轉化可在受體 ( 靶標 ) 植株的未成 熟胚上進行。
     精確的生長和植株跟蹤
     將由轉化的玉米胚產生的轉基因 (T0) 植株的事件群體在受控的溫室環境中栽 培, 該溫室使用改良的隨機分塊 (block) 設計以降低或消除環境誤差。隨機分塊設計是這 樣一種植株布局, 在該布局中, 實驗植株被分成組 ( 如, 每組三十株植株 ), 稱為塊, 而每株 植株隨塊被隨機分配一個位置。
     對于一組三十株植株, 二十四株轉化的實驗植株和六株對照植株 ( 具有設定好的 表型的植株 )( 總起來說稱為 “重復組” ) 被置于盆中, 這些盆在位于溫室內的桌子上布置成 陣列 ( 也叫做重復組或塊 )。每株植株 ( 對照植株或實驗植株 ) 隨塊被隨機分配一個位置, 所述的塊映射一個唯一的、 溫室物理位置以及映射該重復組。在單次實驗中多個三十株植 株的重復組中的每一個可栽培在相同的溫室中。應該測定重復組的布局 ( 布置方式 ) 以使 對空間的要求最小以及溫室內的環境影響最小。這樣一種布局可稱為壓縮的溫室布局。
     對于加入特定的對照組的一種替代方法是鑒定不表達受關注基因的那些轉基因 植株。可將諸如 RT-PCR 之類的多種技術應用于定量評估引入基因的表達水平。可將不表 達轉基因的 T0 植株與表達轉基因的那些植株進行比較。
     在整個評價過程中鑒定和跟蹤事件群體中的每株植株, 并且從那些植株收集的數 據自動與那些植株相關聯, 使得所搜集的數據可與由該植株攜帶的轉基因關聯。 例如, 每個 植株容器具有機器可讀的標簽 ( 例如通用貨單代碼 (UPC) 條形碼 ), 該標簽包含了關于植物 身份的信息, 身份信息繼而又與溫室位置相關, 使得從植物獲得的數據可自動與該植物相 關聯。
     作為另外一種選擇, 可使用任何有效的、 機器可讀的植物識別系統, 例如二維矩陣 代碼或甚至是射頻識別標簽 (RFID), 其中數據被接收并由射頻接收器 / 處理器進行翻譯。 參見美國專利申請 10/324,288, 提交于 2002 年 12 月 19 日 ( 美國專利公布 2004/0122592 A1, 公布于 2004 年 6 月 24 日 ), 以引用方式并入本文。
     利用三維成像進行表型分析
     對 T0 事件群體中的每株溫室植株 ( 包括任何對照植株 ) 分析所關注的農學特性, 并且以這樣一種方式記錄或存儲每株植株的農學數據, 該方式使得數據與該植株的辨識數 據 ( 見上面 ) 相關聯。可利用與上述類似的實驗設計, 可在 T1 代中完成對表型 ( 基因效 應 ) 的確認。
     在植物的整個溫室生活周期中, 利用定量的非破壞性成像技術在表型水平上來分 析 T0 植株以評估所關注的性狀。任選地, 將數字成像分析儀用于整株植物的自動多維分 析。成像可在溫室內進行。將兩個攝像系統 ( 位于頂部和側面 ) 和用于旋轉植物的裝置用 于從所有側面觀察植物和成像。從每株植物的頂部、 前面和側面采集圖像。所有的三個圖像一起提供了足夠的信息用于評價例如每株植物的生物量、 大小和形態。
     由于植物在第一片葉片從土壤顯現出來時到植物處于它們發育的末期時大小的 改變, 從頂部以較高的放大倍率任選地記錄植物發育的早期。這攝像可通過利用完全由成 像軟件控制的自動變焦鏡頭系統來完成。
     在單次成像分析操縱中, 進行如下事件 : (1) 將植株傳送至分析儀區域內, 旋轉 360 度以便其機器可讀標簽可被讀取, 并且讓其保持靜止直至其葉片停止移動 ; (2) 獲取側 面圖像并將其輸入數據庫 ; (3) 將植株旋轉 90 度并再次讓其保持靜止直至其葉片停止移 動, 以及 (4) 將該植株傳送出分析儀。
     每二十四小時的周期讓植物至少六個小時處于黑暗以便具有正常的白天 / 黑夜 周期。
     成像儀器
     可 使 用 任 何 合 適 的 成 像 儀 器, 包 括 但 不 限 于 可 從 LemnaTec GmbH(Wurselen, Germany) 商購獲得的光譜數字成像儀。 獲取圖像并用具有 1/2″ IT Progressive Scan IEE CCD 成像設備的 LemnaTec Scanalyzer HTS LT-0001-2 進行分析。該成像照相機可配備有 自動變焦、 自動調節光圈和自動聚焦。可利用 LemnaTec 軟件設定所有的照相機設置。任選 地, 對于主要組成成像分析儀的儀器差異小于約 5%, 對于次要組成成像分析儀的儀器差異 小于約 10%。 軟件
     成像分析系統包括用于顏色和構造分析的 LemnaTec HTS Bonit 軟件程序和用于 存儲約 500,000 次分析的數據 ( 包括分析數據 ) 的服務器數據庫。原始圖像和分析過的圖 像儲存在一起以允許用戶根據需要進行再次分析。 可將數據庫連接至成像硬件用于自動的 數據收集和存儲。多種可商購獲得的軟件系統 ( 例如 Matlab, 其他軟件 ) 可用于定量解釋 圖像數據, 并且可將這些軟件體系中的任何一種應用于所述圖像數據集。
     傳送系統
     具有植物旋轉裝置的傳送系統可用于將植物傳送至成像區域并在成像過程中選 擇植物。例如, 將最多四株植物 ( 每株最高高度為 1.5m) 裝上汽車, 該汽車在循環的傳送系 統上行進并通過成像測量區域。在這種情況下, 該單位 ( 成像分析儀和傳送環線 ) 的總占 有面積為約 5m×5m。
     可擴大傳送系統以同時容納更多植物。 將植物沿傳送環線傳送至成像區域并對每 株植物分析最多 50 秒。獲取植物的三個視圖。傳送系統以及成像設備應該能夠用于溫室 環境條件。
     照明
     任何合適的照明模式可用于圖像采集。例如, 可在暗背景上使用頂部照明。作為 另外一種選擇, 可采用使用白色背景的頂部照明和背部照明的組合。應該將被照亮的區域 圍起來以確保恒定的照明條件。 遮蔽物應該長于測量區域使得能保持恒定的光條件而不需 要打開和關閉門。 作為另一種選擇, 可變化照明以引起轉基因 ( 如, 綠色熒光蛋白 (GFP)、 紅 色熒光蛋白 (RFP)) 的激發或者引起內源性 ( 如葉綠素 ) 熒光基團的激發。
    
    
    基于三維成像的生物量評價 為了更好地評價生物量, 應該從至少三個軸 ( 任選地, 頂部視圖和兩個側面 ( 側面1 和側面 2) 視圖 ) 獲取植物圖像。然后分析這些圖像以將植物從背景 ( 盆和花粉控制袋 ( 如果適用的話 )) 分離。可通過如下計算評價植物的體積 :
     體積 ( 體素 ) = - √頂部面積 ( 像素 )× √側面 1 面積 ( 像素 )× √側面 2 面積 ( 像素 )
     在上面的等式中, 體積和面積的單位是 “任意單位” 。 在該系統中, 任意單位完全足 以檢測基因對植物大小和生長影響, 因為所需的是檢測與實驗平均值或對照平均值的差值 ( 正較大和負較小兩者 )。大小 ( 如面積 ) 的任意單位可通過將物理參照加入到成像過程 而輕易地轉化成物理量度。例如, 可在頂部成像過程和側面成像過程兩者中均包括已知面 積的物理參照。 基于這些物理參照的面積, 可測定轉換因子以允許從像素轉換為面積單位, 2 例如平方厘米 (cm )。物理參照可以是或可以不是獨立的樣本。例如, 具有已知直徑和高度 的盆足可用作物理參照。
     顏色分類
     成像技術還可用于測定植物顏色以及用于將植物顏色歸為各種衍生類型。 將圖像 顏色歸屬于顏色類型是 LemnaTec 軟件的固有特色。使用其他圖像分析軟件系統, 可通過多 種計算方法測定顏色分類。
     對于植物大小和生長參數的測定, 一種有用的分類方案是定義一種單一顏色方 案, 包括綠色的兩種或三種色調 ( 例如色調是 50-66, 參見圖 13), 此外, 還有關于缺綠病、 壞 死和漂白 ( 在這些條件出現時 ) 的顏色類型。還使用了背景顏色類型, 其包括圖像中的非 植物顏色 ( 例如盆和土壤顏色 ), 并將這些像素特別地從測定大小中排除。 在受控的恒定照 明下分析植物, 使得可以定量一株植物內隨時間推移的任何改變, 或者植物之間或植物不 同分枝之間的任何改變 ( 如季節差異 )。
     除了其在測定植物的大小、 生長中的有效性以外, 顏色分類還可用于評估其他產 量構成性狀。對于這些其他產量構成性狀, 可使用另外的顏色分離方案。例如, 稱為 “保綠 度 (staygreen)” 的性狀 ( 已經將其與產量的提高相關聯 ) 可通過顏色分類來評估, 該顏色 分類將綠色色調與黃色和棕色色調 ( 其指示老化的組織 ) 相分離。通過將這種顏色分類應 用于在 T0 或 T1 植物生活周期末獲取的圖像, 可鑒定綠色的量相對于黃色和棕色 ( 例如, 可 表示為綠色 / 黃色比率 ) 增加的植物。這種綠色 / 黃色比率具有顯著差異的植物可被鑒定 為攜帶影響這種重要農學性狀的轉基因。
     熟練的植物學家將認識到可指示植物健康或應激反應的其他植物顏色 ( 花青素 ) 的出現, 以及認識到其他顏色分類方案可提供對基因在與這些響應相關的性狀方面的作用 的進一步度量。
     植物結構分析
     改變植物結構參數的轉基因也可以用本發明鑒定, 包括諸如最大高度和寬度、 節 間距離、 葉與莖之間的角度、 在節處開始的葉片數以及葉片長度。 LemnaTec 系統軟件可如下 用于測定植物構造。在第一成像步驟中將植物簡化至其主要的幾何構造, 并且隨后基于該 圖像可進行不同構造參數的參數化鑒定。 或者是單獨地或者是組合地修改任何這些構造參 數的轉基因可通過應用此前所述的統計方法來鑒定。
     花粉脫落日期
     花粉脫落日期是轉基因植物中要分析的一個重要參數, 并且可通過活性雄花第一次出現在植物上來測定。為了找到雄花目標, 通過顏色對莖的上端進行分類以檢測黃色或 紫色花藥。然后將這種顏色分類分析用于定義活性花, 活性花繼而可用于計算花粉脫落日 期。
     作為另外一種選擇, 花粉脫落日期和其他易于在視覺上檢測到的植物屬性 ( 如授 粉日期、 第一穗絲日期 ) 可以由負責進行植物看護的工作人員來記錄。為了使數據完整性 和過程效率最大化, 通過利用相同的由 LemnaTec 光譜數字分析設備利用的條形碼來跟蹤 該數據。 可將具有條形碼閱讀器的電腦、 掌上設備或筆記本電腦用于使記錄觀察時間、 植物 標識符的數據捕捉變得容易, 以及使捕捉數據的操作者感覺舒適。
     植物的取向
     以接近商業栽培的密度種植的成熟玉米植物通常具有平面的構造。也就是說, 植 物具有一可清晰分辨的寬的側面和窄的側面。對來自植物寬側的圖像進行測定。對于每株 植物, 給其賦予一個明確界定的基本取向以獲得寬側圖像與窄側 (edgewise) 圖像之間的 最大差別。將頂部圖像用于測定植物的主軸, 而將額外的旋轉裝置用于在開始主圖像采集 前將植物轉至合適的取向。
     實施例 17B
     用玉米同源物轉化 Gaspe Flint 衍生的玉米品系
     使用 INVITROGENTM GATEWAY LR 重組技術, 可制備入門克隆用于任何玉米同源物 (SEQ ID NO : 18/19、 20/21、 22/23、 43/44、 或 45/46)( 入門克隆的制備參見實施例 5), 并能 夠將入門克隆定向克隆到 GATEWAY 目的載體 29634(SEQ ID NO : 15 ; 圖 11) 中以制備對應 的表達載體。每個表達載體將包含處于 UBI 啟動子控制下的所關注的 cDNA, 并且將是用 于農桿菌屬介導的向玉米內的轉化的 T-DNA 二元載體, 所述玉米如但不限于本文所述的實 例。 實施例 18
     在氮限制條件下對玉米品系的篩選
     Gaspe Flint 來源的玉米品系
     轉基因植物可含有兩個或三個劑量的 Gaspe Flint-3 與一個劑量的 GS3(GS3/ (Gaspe-3)2X 或 GS3/(Gaspe-3)3X), 并且對于顯性轉基因會以 1 ∶ 1 分離。將轉基因植物 在 100% Turface( 一種商業栽培培養基 ) 中栽培, 每天用 1mM KNO3 生長培養基和 2mM KNO3 或更高的生長培養基澆灑四次 ( 參見圖 14)。 在 1mM KNO3 培養基中培養的對照植物的綠度 較小, 產生較少的生物量并且在開花期具有較小的穗 ( 關于樣本數據的示例請參見圖 15)。 Gaspe 來源的品系將生長至開花期。
     將用統計學確定處理株之間所觀察到的差異是否真有差異。圖 15 示出了一種方 法, 該方法將字母放在數值后面。同一列中其后具有相同字母 ( 不是字母組 ) 的那些值不 具有顯著的差異。 使用該方法, 如果在一列中的值的后面沒有字母, 則該列中的這些值的任 何之間不存在顯著的差異, 換句話講, 該列中的所有這些值是均等的。
     與無效轉基因相比較, 轉基因的表達將導致植物在 1mM KNO3 中具有改善的植物生 長。因此生物量和綠度 ( 如實施例 2 和 17A 所述 ) 將在生長期間進行監控, 并與無效轉基 因植物比較。生長、 綠度、 開花期穗的大小的改善將表明氮耐受性增強。
     幼苗測定
     還可采用幼苗測定對轉基因玉米植物進行評估, 所述測定對植物在氮限制條件 下的表現進行評估。例如, 在 18 天幼苗測定中, 轉基因植物被種植于商品化盆栽培養基 Turface 中, 然后用包含下列營養物質的溶液每天澆四次 : 1mM CaCl2、 2mM MgSO4、 0.5mM KH2PO4、 83ppmSprint330、 3mM KCl、 1mM KNO3、 1μM ZnSO4、 1μM MnCl2、 3μM H3BO4、 0.1μM CuSO4 和 0.1μM NaMoO4。植物在種植后 18 天收獲, 并且評價多個性狀, 包括但不限于 : SPAD( 綠度 )、 莖直徑、 根干重、 苗干重、 總干重、 mg 氮每克干重 (mg N/g dwt)、 以及植物氮濃 度。采用 Studentt 檢驗, 以 0.1 的最小值 (P < t) 比較平均值和無效轉基因平均值參數。
     實施例 19
     氮利用效率幼苗檢測分析法
     利用種子顏色標記將轉基因事件的種子分成了轉基因的 ( 處理 1 ; 包含構建體 PHP29875) 和無效的 ( 處理 2) 種子。
     每一處理 ( 轉基因的或批無效的 ) 被隨機分配至 54 個盆 ( 實驗單位 ) 組成的區 塊中, 所述盆按 6 行 9 列排列。重復每個處理 ( 轉基因或批無效的 )9 次。
     將所有種子種在 4 英寸的方盆中, 盆中包含在 8 英寸交錯中心上的 Turface, 每天 用包含以下營養物質的溶液澆灌四次 :
     1mM CaCl2 2mM MgSO4 0.5mM KH2PO4 83ppm Sprint330
     3mM KCl 1mM KNO3 1μM ZnSO4 1μM MnCl2
     3μM H3BO4 1μM MnCl2 0.1μM CuSO4 0.1μM NaMoO4
     植物出苗后, 將其間苗至每盆一個種子。 在收獲時從盆中移除植物, 并且將蒙脫石 從根部洗脫。使根與苗分開, 把根置于紙袋中并且在 70℃干燥 70 小時。將干燥后的植物部 分 ( 根和苗 ) 稱重并置于 50mL 的圓錐管中, 管中有大約 20 5/32 英寸的鋼球, 在涂料振蕩 器中進行振蕩研磨。
     The Nitrogen/Protein Analyzer 來自 Thermo Electron Corporation 的氮 / 蛋 白質分析器 ( 型號 FlashEA 1112N) 使用約 30mg 的基本組織。樣品從自動取樣機被點樣至 氧化反應室內部的坩堝內。在 900℃和純氧條件下, 樣品被強烈的放熱反應氧化, 產生 N2、 CO2、 H2O 和 SO2 的混合氣體。燃燒結束后, 打開載氣氦, 使氣體混合物流入還原反應室。在 680℃, 使氣體混合物流過還原銅, 其中可能形成的氮氧化物被轉化為氮元素而過量的氧氣 被保留。所述氣體混合物從還原反應器流出, 依次經過兩個吸收過濾器。第一個過濾器包 含堿石灰, 留住了二氧化碳和二氧化硫。 第二個過濾器包含分子篩和顆粒狀的硅膠, 以阻止 水通過。 然后, 氮被洗脫進色譜柱, 并被轉至熱導率檢測器, 熱導率檢測器生成電子信號, 所 述電子信號經 Eager 300 軟件的適當處理, 提供了氮 - 蛋白質百分比。
     利用這些數據, 測量了下列參數, 并且采用 Student t 檢驗將轉基因組的參數的平 均值與無效組的參數的平均值進行了比較。
    利用方差分析 (ANOVA) 計算和完全隨機設計 (CRD) 模型, 計算了每一區塊內的方 差。使用 F 統計, 通過將總區塊處理平均面積除以總區塊誤差平均面積對每個區塊計算了 總處理效應。計算了更大的 Student′ s t 檢驗的概率用于比較每個轉基因平均值與合適 的無效轉基因平均值。顯示顯著差異的變量 (*) 具有最小值 (P < t)0.1。
     表 5 示出原始數據和包含構建體 PHP29875 的植物的雙尾 Student’ s t 概率。p 值的數學符號反映所述事件對相應的無效組的相對表現, 即 ‘+’ =提高的表現, ‘-’ =降低 的表現。比較轉基因事件和構建體無效轉基因。無效的構建體是陰性的入門構建體, 其由 來自陰性分離子的果仁的抽樣組成, 并因此是全部陰性的代表性樣本。
     表5: PHP29875 的溫室幼苗測定數據
    
    實施例 20A
     具有擬南芥屬前導基因或玉米同源物的玉米品系的產量分析
     自交或頂交雜交體的轉基因植物可通過更嚴苛的大田試驗來研究在氮限制條件 下和無氮限制條件下的產量增加和 / 或穩定性。標準化的產量試驗將通常包括 4 至 6 次重 復, 以及至少 4 個位置。
     可進行產量分析以測定與構建體無效的或野生型的對照 ( 或參考 ) 植物相比, 包 含編碼包含 SNF2 結構域的蛋白的經驗證擬南芥屬基因或相關玉米基因的植物是否具有產 量表現方面的提高 ( 在氮限制或非氮限制條件下 )。具體地講, 對于包含經驗證的擬南芥 前導基因或 lnt6 的玉米同源物的植物和對照植物, 可于開花和 / 或灌漿時期施加氮限制條 件。可以測得這兩種植物的產量都有所減少。包含驗證過的擬南芥屬前導基因或其玉米同 源物的植物在氮限制條件下將具有比對照植物更少的產量損失, 或者在非氮限制條件下將 具有比對照植物更高的產量。
     實施例 20B
     用 PHP29875 轉化的玉米品系的產量分析
     玉米測交雜種包含存在于載體 PHP29875 中的擬南芥前導基因 ( 編碼包含 SNF2 結 構域的多肽 ) 的表達盒, 并且它們的對照植物于 2008 年和 2009 年在多個位置的低氮 (LN) 和標準氮 (NN) 環境下生長。基于由 Federal and State Extension 服務對特定生長區域 確定的土壤測試標準, 低氮 (LN) 環境指氮量少于在早春或夏季施加的標準氮肥的量, 而標
     準氮 (NN) 環境指加入正常產量所需的充足的氮。與 NN 條件中獲得的產量相比, 在 LN 條件 中觀察到了產量的降低。就該分析而言, 構建體無效組是由來自一種構建體的全部事件的 陰性分離子組成的負輸入, 批無效組是由來自一次實驗的全部構建體的全部陰性分離子組 成的負輸入。
     2008 年在 York, NE(YK) 和 Woodland, CA(WO) 兩個地點對九個轉基因事件進行了 大田試驗, 并評估了產量。玉米測交雜交體被用于與構建體無效的 (CN) 相比較。2008 年大 田試驗的結果顯示于表 6 中。
     表6
     用 PHP29875 轉化的玉米的 2008 年大田試驗
    測量單位為蒲式耳 / 英畝。
     陰影代表與構建體無效 (CN) 相比較顯著性較高的 (P < 0.1) 結果。
     粗體代表與構建體無效 (CN) 相比較顯著性較低的 (P < 0.1) 結果。
     九個以前測試的轉基因事件中有八個是 2009 年在以下位置進行的大田測試 : York, NE(YK) ; Marion, IA(MR)Woodland, CA(WO) ; Dallas Center, IA(DS) ; 和 Princeton, IN(PR)。然而, 在 2009 年玉米測交雜種與批無效 (BN) 進行比較。2009 年大田試驗的結果 顯示于表 7 中。 在 York, 在低氮條件下三個事件顯示產量比批無效顯著提高, 在標準氮條件 下一個事件顯示產量比批無效顯著提高。在 Woodland, 在低氮條件下一個事件具有比批無 效顯著更高的產量。在 Marion, 在低氮條件下三個事件的產量比批無效顯著更高。
     表7
     用 PHP29875 轉化的玉米的 2009 年大田試驗
    
    測量單位為蒲式耳 / 英畝。
     陰影代表與批無效 (BN) 相比較顯著性較高的 (P < 0.1) 結果。
     黑體代表與批無效 (BN) 相比較顯著性較低的 (P < 0.1) 結果。
     實施例 21
     用經驗證的前導基因的大豆同源物對大豆進行的轉化和評估
     基于同源性搜索, 可鑒定驗證過的擬南芥屬前導基因的一個或若干個候選大豆同 源物, 并且還可評估它們增加大豆氮限制條件耐受性的能力。 載體構建、 植物轉化和表型分 析將類似于上文實施例所述的規程。
     實施例 22
     用經驗證的前導基因的玉米同源物對玉米進行的轉化和評估
     基于同源性搜索, 可鑒定經驗證的擬南芥屬前導基因的一個或若干個候選的玉米 同源物 ( 例如 SEQ ID NO : 18/19、 20/21、 22/23、 43/44 或 45/46), 并且還評估它們增加玉米 氮限制條件耐受性的能力。載體構建、 植物轉化和表型分析可類似于上文實施例所述的規 程。
     實施例 23
     用驗證過的前導基因的玉米和大豆同源物轉化擬南芥屬
     可將驗證過的擬南芥屬前導基因的大豆和玉米同源物在 35S 啟動子的控制下轉 化到擬南芥屬中, 并且當在低氮培養基中生長時分析其葉片面積和綠色區積聚。可如本文 實施例所述進行載體構建和植物轉化。檢測分析的條件、 數據采集和數據分析可類似于上 文實施例所述的規程。
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     “調控序列” 和 “調控元件” 可互換使用, 并且指位于編碼序列的上游 (5′非編碼 序列 )、 中間或下游 (3′非編碼序列 ), 并且影響相關編碼序列的轉錄、 RNA 加工或穩定性或 者翻譯的核苷酸序列。 調控序列可包括但不限于啟動子、 翻譯前導序列、 內含子和多腺苷酸 化識別序列。
     “啟動子” 指能夠控制另一核酸片段轉錄的核酸片段。
     “在植物中有功能的啟動子” 指能夠控制植物細胞中的轉錄的啟動子, 無論其是否 來源于植物細胞。
     “組織特異性啟動子” 和 “組織優選啟動子” 可以互換使用, 并且指主要但非必須專 一地在一種組織或器官中表達, 但是也可以在一種特定細胞中表達的啟動子。
     “發育調控啟動子” 指其活性由發育事件決定的啟動子。
     術語 “可操作地連接” 指核酸片段連接成單一片段, 使得其中一個核酸片段的功能 受到另一個核酸片段的調控。 例如, 在啟動子能夠調節核酸片段的轉錄時, 該啟動子與該核 酸片段進行了可操作地連接。
     “表達” 指功能產物的產生。因此, 核酸片段的表達可指核酸片段的轉錄 ( 如生成 mRNA 或功能 RNA 的轉錄 ) 和 / 或 mRNA 翻譯成前體或成熟蛋白質。
     “表型” 意指細胞或生物體的可檢測的特征。
     有關將核酸片段 ( 例如重組 DNA 構建體 ) 插入細胞內的 “引入” 意指 “轉染” 或 “轉 化” 或 “轉導” , 并且包括指將核酸片段整合進真核或原核細胞中, 在該細胞中核酸片段可整 合進細胞的基因組 ( 如染色體、 質粒、 質體或線粒體 DNA) 內, 轉變成自主的復制子或瞬時表 達 ( 如轉染的 mRNA)。
     “轉化細胞” 是將核酸片段 ( 如重組 DNA 構建體 ) 引入其中的任何細胞。
     在此所用的 “轉化” 指穩定轉化和瞬時轉化兩者。
     “穩定轉化” 指將核酸片段引入宿主生物體的基因組中, 導致基因穩定遺傳。一旦 穩定轉化, 核酸片段穩定地整合進宿主生物體和任何連續世代的基因組中。
     “瞬時轉化” 指將核酸片段引入宿主生物體的核中或包含 DNA 的細胞器中, 引起基 因表達而沒有基因穩定遺傳。
     “等位基因” 是占據染色體上給定位點的基因的幾種供選擇替代形式的其中一種。 當二倍體植物中一對同源染色體上給定基因座上存在的等位基因相同時, 該植物在該基因 座處是純合的。如果二倍體植物中一對同源染色體上給定基因座上存在的等位基因不同, 則該植物在該基因座處是雜合的。 如果轉基因存在于二倍體植物中一對同源染色體中的其 中之一上, 則該植物在該基因座處是半合子的。
     “葉綠體轉運肽” 是與蛋白質共同被翻譯, 并將該蛋白質導向葉綠體或導向該蛋白 質在其中被生成的細胞中的其他質體類型的氨基酸序列。 “葉綠體轉運序列” 是指編碼葉 綠體轉運肽的核苷酸序列。 “信號肽” 是一種與蛋白質共同被翻譯并將蛋白導向分泌系統 的氨基酸序列 (Chrispeels, (1991)Ann.Rev.Plant Phys.Plant Mol.Biol.42 : 21-53)。如 果將所述蛋白導向液泡, 可另外加上液泡靶向信號 ( 同上 ), 或者如果將所述蛋白導向內質 網, 可加上內質網駐留信號 ( 同上 )。如果將蛋白導向細胞核, 將移除任何存在的信號肽并 用以核定位信號替代 (Raikhel, (1992)Plant Phys.100 : 1627-1632)。 “線粒體信號肽” 是指導前體蛋白質導進入線粒體中的氨基酸序列 (Zhang 和 Glaser(2002)Trends Plant Sci 7: 14-21)。
     序列比對和同一性百分比可用設計用于檢測同源序列的多種比較方法來測定, 這些方法包括但不限于 LASERGENE 生物信息計算包 (DNASTAR Inc., Madison, WI) 的 MEGALIGN 程序。除非另外說明, 本文提供的序列的多重比對用 Clustal V 比對方法 (Higgins 和 Sharp, CABIOS. : 5: 151-153(1989)) 采用默認參數 ( 空位罰分= 10, 空位長度 罰分= 10) 執行。用 Clustal V 方法進行成對比對和蛋白質序列的百分比同一性計算的默 認參數為 KTUPLE = 1、 缺口罰分= 3、 窗口 (WINDOW) = 5 和 DIAGONALS SAVED = 5。對于核 酸, 這些參數為 KTUPLE = 2, 缺口罰分= 5, 窗口= 4 和 DIAGONALS SAVED = 4。在序列比對 后, 使用 Clustal V 程序, 通過參閱相同程序上的 “序列距離” 表可能獲得 “百分比同一性” 和 “趨異度” 值; 除非另外說明, 本文提供的和申明的同一性百分比和趨異度是以該方式計 算。
     本文使用的標準重組 DNA 和分子克隆技術是本領域所熟知的并且在如下文獻 中有更全面的描述 : Sambrook, J., Fritsch, E.F. 和 Maniatis, T.Molecular Cloning : A Laboratory Manual ; Cold Spring Harbor Laboratory Press : Cold Spring Harbor, 1989( 下文稱為 “Sambrook” )。現在來看實施方案 :
     實施方案包括分離的多核苷酸和多肽、 重組 DNA 構建體、 包含這些重組 DNA 構建體 的組合物 ( 例如植株或種子 ) 以及利用這些重組 DNA 構建體的方法。
     分離的多核苷酸和多肽
     本發明包括下列分離的多核苷酸和多肽 :
     分離的多核苷酸包含 : (i) 編碼多肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 36、 38、 或 46 進行比較時具有至少 50%、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96%、 97%、 98%、 99%、 或 100%的序列同一性 ; 或 (ii)(i) 的核酸序列的全長互補序列, 其 中 (i) 的核酸序列的全長互補序列由相同數目的核苷酸組成并且是 100%互補的。任一上 述分離的多核苷酸可用于本發明的任何重組 DNA 構建體 ( 包括抑制 DNA 構建體 )。所述多 肽是包含 SNF2 結構域的蛋白。
     分離的多肽, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 36、 38、 或 46 進行比較時具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%、 或 100%的序列同一 性。所述多肽是包含 SNF2 結構域的蛋白。
     分離的多核苷酸, 包括 : (i) 基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 18、 20、 22、 35、 37、 或 45 進行比較時具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、
     實施方案包括分離的多核苷酸和多肽、 重組 DNA 構建體、 包含這些重組 DNA 構建體 的組合物 ( 例如植株或種子 ) 以及利用這些重組 DNA 構建體的方法。
     分離的多核苷酸和多肽
     本發明包括下列分離的多核苷酸和多肽 :
     分離的多核苷酸包含 : (i) 編碼多肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 36、 38、 或 46 進行比較時具有至少 50%、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96%、 97%、 98%、 99%、 或 100%的序列同一性 ; 或 (ii)(i) 的核酸序列的全長互補序列, 其 中 (i) 的核酸序列的全長互補序列由相同數目的核苷酸組成并且是 100%互補的。任一上 述分離的多核苷酸可用于本發明的任何重組 DNA 構建體 ( 包括抑制 DNA 構建體 )。所述多 肽是包含 SNF2 結構域的蛋白。
     分離的多肽, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 36、 38、 或 46 進行比較時具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%、 或 100%的序列同一 性。所述多肽是包含 SNF2 結構域的蛋白。
     分離的多核苷酸, 包括 : (i) 基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 18、 20、 22、 35、 37、 或 45 進行比較時具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、
     74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%、 或 100%的序列同一性的 核酸序列 ; 或 (ii)(i) 的核酸序列的全長互補序列。任一上述分離的多核苷酸可用于本發 明的任何重組 DNA 構建體 ( 包括抑制 DNA 構建體 )。所述分離的多核苷酸編碼包含 SNF2 結 構域的蛋白。
     重組 DNA 構建體和抑制 DNA 構建體
     在一個方面, 本發明包括重組 DNA 構建體 ( 包括抑制 DNA 構建體 )。
     在一個實施方案中, 重組 DNA 構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列 ( 如, 在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸包括 : (i) 核酸序列, 所述核酸 序列編碼的氨基酸序列基于 ClustalV 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或 100%的序列同一性 ; 或 (ii)(i) 的核酸序列的全長互補序列。 在另一個實施方案中, 重組 DNA 構建體包含可操作地連接至至少一種調控序列 ( 如, 在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸包括 : (i) 核酸序列, 所述 核酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 18、 20、 22、 24、 26、 28、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 或 47 進行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57%、 58%、 59%、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%序列同一性 ; 或 (ii)(i) 的核酸序列的全長互補序列。
     在另一個實施方案中, 重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少一種調控序列 ( 如, 在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼包含 SNF2 結構域的蛋白。
     在另一方面, 本發明包括抑制 DNA 構建體。
     抑制 DNA 構建體可包含至少一種調控序列 ( 例如植物中有功能的啟動子 ), 該調 控序列可操作地連接至 (a) 以下序列的全部或部分 : (i) 編碼多肽的核酸序列, 所述多肽的 氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%的序列 同一性, 或 (ii)(a)(i) 的核酸序列的全長互補序列 ; 或者 (b) 源自受關注靶基因的有義鏈 或反義鏈的全部或部分的區域, 當與所述區域所來源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較 時, 基于 Clustal V 比對方法, 所述區域的核酸序列具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或
     在另一個實施方案中, 重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少一種調控序列 ( 如, 在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼包含 SNF2 結構域的蛋白。
     在另一方面, 本發明包括抑制 DNA 構建體。
     抑制 DNA 構建體可包含至少一種調控序列 ( 例如植物中有功能的啟動子 ), 該調 控序列可操作地連接至 (a) 以下序列的全部或部分 : (i) 編碼多肽的核酸序列, 所述多肽的 氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%的序列 同一性, 或 (ii)(a)(i) 的核酸序列的全長互補序列 ; 或者 (b) 源自受關注靶基因的有義鏈 或反義鏈的全部或部分的區域, 當與所述區域所來源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較 時, 基于 Clustal V 比對方法, 所述區域的核酸序列具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或
     100%的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的蛋白 ; 或 (c) 以 下序列的全部或部分 : (i) 核酸序列, 基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 18、 20、 22、 24、 26、 28、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 或 47 進行比較時, 所述多肽的氨基酸序列具有至少 50%、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或 100 %的序列同一性, 或 (ii)(c)(i) 核酸序列的全長互補序列。 抑制 DNA 構建體可包含共抑制構建體、 反義構建體、 病毒抑制構建體、 發夾抑制構建體、 莖 環抑制構建體、 產生雙鏈 RNA 的構建體、 RNAi 構建體或小 RNA 構建體 ( 如, siRNA 構建體或 miRNA 構建體 )。
     應當理解 ( 正如本領域技術人員將會理解的 ), 本發明不僅僅涵蓋這些具體的示 例性序列。 導致給定位點處產生化學上等價的氨基酸但不影響所編碼多肽的功能特性的核 酸片段中的改變是本領域眾所周知的。因此, 氨基酸丙氨酸 ( 一種疏水性氨基酸 ) 的密碼 子可被編碼另一個疏水性較弱的殘基 ( 例如甘氨酸 ) 或疏水性較強的殘基 ( 例如纈氨酸、 亮氨酸或異亮氨酸 ) 的密碼子取代。類似地, 導致一個帶負電荷的殘基替換為另一個帶負 電荷的殘基 ( 例如, 天冬氨酸替代谷氨酸 ) 或者一個帶正電荷的殘基替換為另一個帶正電 荷的殘基 ( 例如, 賴氨酸替換精氨酸 ) 的改變也可預期產生功能上等價的產物。導致多肽 分子的 N 末端和 C 末端部分改變的核苷酸變化也將預計不會改變多肽的活性。所提出的修 飾中的每一種均完全在本領域常規技術內, 如測定編碼產物生物活性的保留情況。
     “抑制 DNA 構建體” 是在轉化或穩定整合進植物基因組時, 導致該植物中的靶基因 “沉默” 的重組 DNA 構建體。靶基因可為植物內源基因或植物轉基因。如本文針對靶基因所 使用的, “沉默” 通常指在由靶基因表達的 mRNA 或蛋白質 / 酶的水平上的抑制, 和 / 或在酶 活性或蛋白質功能性的水平上的抑制。術語 “抑制” 和 “沉默” 本文互換使用, 包括降低、 減 少、 下降、 減小、 抑制、 除去或阻止。 “沉默” 或 “基因沉默” 不指具體機制, 它包括但不限于反 義、 共抑制、 病毒抑制、 發夾抑制、 莖 - 環抑制、 基于 RNAi 的方法、 以及基于小 RNA 的方法。
     抑制 DNA 構建體可包含源自受關注的靶基因的區域并且可包含受關注的靶基因 的有義鏈 ( 或反義鏈 ) 的核酸序列的全部或部分。取決于所要采用的方法, 該區域可與 受關注基因的有義鏈 ( 或反義鏈 ) 的全部或部分 100 %相同或者具有少于 100 %的同一 性 ( 如, 具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 或 99%同一性 )。
     抑制 DNA 構建體是本領域所熟知的, 一旦選定受關注的靶基因就很容易構建, 并 且包括但不限于共抑制構建體、 反義構建體、 病毒抑制構建體、 發夾抑制構建體、 莖環抑制 構建體、 產生雙鏈 RNA 的構建體, 以及更通常的是, RNAi(RNA 干擾 ) 構建體和小 RNA 構建體, 例如 siRNA( 短干擾 RNA) 構建體和 miRNA( 微 RNA) 構建體。
     “反義抑制” 指產生能夠抑制靶基因或基因產物表達的反義 RNA 轉錄物。 “反義 RNA” 指與靶初級轉錄物或 mRNA 的全部或部分互補, 并阻斷分離的靶核酸片段表達的 RNA 轉錄物 ( 美國專利 5,107,065)。 反義 RNA 可與特定基因轉錄物的任何部分, 即 5′非編碼序列、 3′非編碼序列、 內含子或編碼序列互補。
     “共抑制” 指產生能夠抑制靶基因或基因產物表達的有義 RNA 轉錄物。 “有義” RNA 指包括 mRNA 的 RNA 轉錄物, 它能夠在細胞內或體外被翻譯成蛋白。此前, 已通過著眼于以 有義方向過表達與內源 mRNA 具有同源性的核酸序列 ( 其導致與過表達的序列具有同源性 的所有 RNA 減少 ) 設計出了植物中的共抑制構建體 ( 參見 Vaucheret 等人, Plant J.16 : 651-659(1998) ; 和 Gura, Nature 404 : 804-808(2000))。
     另一種變型描述了將植物病毒序列用于引導對近端 mRNA 編碼序列的抑制 ( 于 1998 年 8 月 20 日公開的 PCT 公開 WO 98/36083)。
     RNA 干擾是指由短干擾性 RNA(siRNA) 介導的動物中序列特異性轉錄后基因沉默 的過程 (Fire 等人, Nature 391 : 806(1998))。 在植物中的對應過程通常稱為轉錄后基因沉 默 (PTGS) 或 RNA 沉默, 并且在真菌中也稱為阻抑作用 (quelling)。 據信轉錄后基因沉默過 程是用于防止外來基因表達的進化保守性細胞防御機制, 并且通常由不同植物區系和門所 共有 (Fire 等人, Trends Genet.15 : 358(1999))。
     小 RNA 在控制基因表達中起重要作用。很多發育過程 ( 包括開花 ) 的調節是由小 RNA 控制的。現在有可能通過使用在植物中產生小 RNA 的轉基因構建體來以工程手段改變 植物基因的基因表達。
     小 RNA 似乎是通過與互補 RNA 或 DNA 靶序列堿基配對來行使功能的。當與 RNA 結 合時, 小 RNA 或者引發靶序列的 RNA 裂解或者引發翻譯抑制。當與 DNA 靶序列結合時, 據信 小 RNA 可介導靶序列的 DNA 甲基化。無論具體機制是什么, 這些事件的后果是基因表達受 到抑制。
     微 RNA(miRNA) 是長度為約 19 至約 24 個核苷酸 (nt) 的已經在動物和植物中鑒 定出的非編碼 RNA(Lagos-Quintana 等人, Science 294 : 853-858(2001), Lagos-Quintana 等 人, Curr.Biol.12 : 735-739(2002) ; Lau 等 人, Science 294 : 858-862(2001) ; Lee 和 Ambros, Science 294 : 862-864(2001) ; Llave 等 人, Plant Cell 14 : 1605-1619(2002) ; Mourelatos 等 人, Genes. 偏 差 16 : 720-728(2002) ; Park 等 人, Curr.Biol.12 : 1484-1495(2002) ; Reinhart 等人, Genes. 偏差 16 : 1616-1626(2002))。它們是由大小為大 約 70 至 200nt 的較長的前體轉錄物加工生成的, 并且這些前體轉錄物能夠形成穩定的發夾 結構。
     微 RNA(miRNA) 看起來通過與位于由這些基因產生的轉錄物中的互補序列結合來 調節靶基因。看來似乎 miRNA 可能以至少兩種途徑進入靶基因調控 : (1) 翻譯抑制 ; 和 (2) RNA 裂解。進入 RNA 裂解途徑的微 RNA 與在動物中 RNA 干擾 (RNAi) 期間以及在植物中轉 錄后基因沉默 (PTGS) 期間產生的 21-25nt 短干擾 RNA(siRNA) 類似, 并且可能整合進與在 RNAi 情況中觀察到的復合物類似或相同的 RNA- 誘導的沉默復合物 (RISC) 內。
     調控序列 :
     本發明的重組 DNA 構建體 ( 包括抑制 DNA 構建體 ) 可包含至少一種調控序列。
     調控序列可為啟動子。
     多種啟動子可用于本發明的重組 DNA 構建體 ( 及抑制 DNA 構建體 ) 中。可根據所 需結果來選擇啟動子, 并且可包括用于在宿主生物體中表達的組成型啟動子、 組織特異性 啟動子、 誘導型啟動子或其他啟動子。在多數情況下引起基因在大多數細胞型中表達的啟動子通常稱為 “組成型啟動子” 。 雖然候選基因當通過組成型啟動子驅動表達時可預測其效應, 但候選基因在 35S 或 UBI 啟動子控制下的高水平、 組成型表達可以 ( 或可以不 ) 具有多重效應。使用組織特 異和 / 或脅迫特異啟動子可消除不需要的效應但保留氮耐受性的能力。在擬南芥屬中已經 觀察到了對干旱和寒冷耐受性的這種類型的效應 (Kasuga 等人, Nature Biotechnol.17 : 287-91(1999))。
     適用于植物宿主細胞的組成型啟動子包括 ( 例如 )Rsyn7 啟動子的核心啟動子 和在 WO 99/43838 和美國專利 6,072,050 中公開的其他組成型啟動子 ; CaMV 35S 核心 啟動子 (Odell 等人, Nature 313 : 810-812(1985)) ; 稻肌動蛋白啟動子 (McElroy 等人, Plant Cell 2 : 163-171(1990)) ; 泛 素 啟 動 子 (Christensen 等 人, Plant Mol.Biol.12 : 619-632(1989) 和 Christensen 等 人, Plant Mol.Biol.18 : 675-689(1992)) ; pEMU 啟 動 子 (Last 等 人, Theor.Appl.Genet.81 : 581-588(1991)) ; MAS 啟 動 子 (Velten 等 人, EMBO J.3 : 2723-2730(1984)) ; ALS 啟動子 ( 美國專利 5,659,026) 等。其他組成型啟動子包括 例 如 在 美 國 專 利 5,608,149、 5,608,144、 5,604,121、 5,569,597、 5,466,785、 5,399,680、 5,268,463、 5,608,142 和 6,177,611 中公開的那些啟動子。
     在選擇啟動子用于本發明方法時, 可能有利的是使用組織特異性啟動子或發育調 控啟動子。
     組織特異性啟動子或發育調節啟動子是這樣的 DNA 序列 : 該序列調節 DNA 序列選 擇性地在對雄穗發育、 結籽或兩者重要的植物細胞 / 組織中表達, 并限制這種 DNA 序列只在 植物的雄穗發育或種子成熟期間表達。 任何引起所需時空表達的可鑒定啟動子均可用于本 發明的方法中。
     可用于本發明的種子或胚芽特異性啟動子包括大豆 Kunitz 胰蛋白酶抑制劑啟動 子 (Kti3, Jofuku 和 Goldberg, Plant Cell 1 : 1079-1093(1989))、 馬鈴薯塊莖特異蛋白啟 動子 (patatin 啟動子 )( 馬鈴薯塊莖 )(Rocha-Sosa, M. 等人, EMBO J.8 : 23-29(1989))、 convicilin 啟動子、 豌豆球蛋白啟動子、 豆球蛋白啟動子 ( 豌豆子葉 )(Rerie, W.G. 等人, Mol.Gen.Genet.259 : 149-157(1991) ; Newbigin, E.J. 等人, Planta 180 : 461-470(1990) ; Higgins, T.J.V. 等人, Plant.Mol.Biol.11 : 683-695(1988))、 玉米蛋白啟動子 ( 玉米胚 乳 )(Schemthaner, J.P. 等人, EMBO J.7 : 1249-1255(1988))、 菜豆蛋白啟動子 ( 菜豆子葉 ) (Segupta-Gopalan, C. 等人, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82 : 3320-3324(1995))、 植物血 球凝集素啟動子 ( 菜豆子葉 )(Voelker, T. 等人, EMBO J.6 : 3571-3577(1987))、 B- 伴球蛋 白啟動子和大豆球蛋白啟動子 ( 大豆子葉 )(Chen, Z-L 等人, EMBO J.7 : 297-302(1988))、 谷 蛋白啟動子 ( 大米胚乳 )、 大麥醇溶蛋白啟動子 ( 大麥胚乳 )(Marris, C. 等人, Plant Mol. Biol.10 : 359-366(1988))、 麥谷蛋白啟動子和麥醇溶蛋白啟動子 ( 小麥胚乳 )(Colot, V. 等 人, EMBO J.6 : 3559-3564(1987))、 和甘薯貯藏蛋白啟動子 ( 甘薯塊根 )(Hattori, T. 等人, Plant Mol.Biol.14 : 595-604(1990))。 可操作地連接至嵌合基因構建體異源編碼區的種子 特異性基因的啟動子在轉基因植物中保持它們的時空表達模式。 這樣的實施例包括在擬南 芥屬和甘藍型油菜 (Brassica napus) 種子中表達腦啡肽的擬南芥 2S 種子儲藏蛋白基因啟 動子 (Vanderkerckhove 等人, Bio/Technology 7 : L929-932(1989))、 表達熒光素酶的菜豆
     凝集素和 β- 菜豆蛋白啟動子 (Riggs 等人, Plant Sci.63 : 47-57(1989)), 以及表達氯霉素 乙酰轉移酶的小麥谷蛋白啟動子 (Colot 等人, EMBO J.6 : 3559-3564(1987))。
     可誘導啟動子響應內源性或外源性刺激的存在, 例如, 通過化合物 ( 化學誘導 劑 ), 或響應環境、 激素、 化學信號和 / 或發育信號而選擇性表達可操作地連接的 DNA 序列。 可誘導的或受調控的啟動子包括 ( 例如 ) 受光、 熱、 脅迫、 水澇或干旱、 植物激素、 創傷或諸 如乙醇、 茉莉酮酸酯、 水楊酸或安全劑之類的化學品調控的啟動子。
     本發明使用的啟動子包括以下啟動子 : 1) 脅迫誘導型 RD29A 啟動子 (Kasuga 等 人, Nature Biotechnol.17 : 287-91(1999)) ; 2) 大 麥 啟 動 子 B22E ; B22E 的 表 達 是 發 育中的玉米籽粒中的柄所特異性的 (“Primary Structure of a Novel Barley Gene Differentially Expressed in Immature Aleurone Layers( 在未成熟糊粉層中差異表 達的新大麥基因的一級結構” , Klemsdal 等人, Mol.Gen.Genet.228(1/2) : 9-16(1991)) ; 以 及 3) 玉米啟動子 Zag2(“Identification and molecular characterization of ZAG1, the maize homolog of the Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUS(ZAG1- 擬南 芥屬花同源異形基因 AGAMOUS 的玉米同系物的鑒定和分子表征 )” , Schmidt 等人, Plant Cell 5(7) : 729-737(1993) “ ;Structural characterization, chromosomal localization and phylogenetic evaluation of two pairs of AGAMOUS-like MADS-box genes from maize” (“兩對來自玉米的 AGAMOUS 樣 MADS-box 基因的結構表征、 染色體定位及系統發育 評價 )” , Theissen 等人, Gene 156(2) : 155-166(1995) ; NCBI GenBank 登錄號 X80206))。 Zag2 轉錄物可在授粉前五天至授粉后天數 (“DAP” ) 七至八天被檢測到, 并且引導 Ciml 在 發育中的雌花序心皮中表達, Ciml 對發育中的玉米籽粒的籽仁而言是特異性的。Ciml 轉錄 物在授粉前四到五天至六到八 DAP 被檢測到。其他可用的啟動子包括可源自其表達與發育 中的雌小花母系相關的基因的任何啟動子。
     用于調控本發明的核苷酸序列在植物中表達的啟動子是莖特異性啟動子。這種 莖特異性啟動子包括苜蓿 S2A 啟動子 (GenBank 登錄號 : EF030816 ; Abrahams 等人, Plant Mol.Biol.27 : 513-528(1995)) 和 S2B 啟動子 (GenBank 登錄號 : EF030817) 等等, 將這些文 獻以引用的方式并入本文。
     啟動子可整體源于天然基因, 或者由源于天然存在的不同啟動子的不同元件構 成, 或者甚至可包含合成的 DNA 片段。
     用于本發明的啟動子可包括 : RIP2、 mLIP15、 ZmCOR1、 Rab17、 CaMV 35S、 RD29A、 B22E、 Zag2、 SAM 合成酶啟動子、 泛素啟動子、 CaMV 19S、 nos、 Adh、 蔗糖合成酶啟動子、 R- 等 位基因啟動子、 維管組織的其他啟動子 S2A(Genbank 登陸號 EF030816) 和 S2B(Genbank 登錄號 EF030817) 及來自玉米的組成型啟動子 GOS2。其他啟動子包括根啟動子, 例如玉 米 NAS2 啟動子、 玉米 Cyclo 啟動子 (US 公布 2006/0156439, 公開于 2006 年 7 月 13 日 )、 玉米 ROOTMET2 啟動子 (WO 2005/063998, 公開于 2005 年 7 月 14 日 )、 CR1BIO 啟動子 (WO 2006/055487, 公開于 2006 年 5 月 26 日 )、 CRWAQ81(WO 2005/035770, 公開于 2005 年 4 月 21 日 ) 和玉米 ZRP2.47 啟動子 (NCBI 登錄號 U38790 ; NCBI GI No.1063664)。
     本發明的重組 DNA 構建體 ( 及抑制 DNA 構建體 ) 也可包括其他調控序列, 包括但 不限于翻譯前導序列、 內含子和多腺苷酸化識別序列。 在本發明的另一個實施方案中, 本發 明的重組 DNA 構建體還包括增強子或沉默子。內含子序列可加至 5’ 非翻譯區、 蛋白編碼區或 3’ 非翻譯區以增加積聚在胞漿中 的成熟信息的量。已經顯示, 在植物和動物兩者的表達構建體的轉錄單位中包含可剪接內 含子可使基因表達在 mRNA 和蛋白質水平上均增強高達 1000 倍 (Buchman 和 Berg, Mol.Cell Biol.8 : 4395-4405(1988) ; Callis 等人, Genes Dev.1 : 1183-1200(1987))。
     任何植物都可以選擇用來鑒定將用于本發明重組 DNA 構建體的調控序列和基因。 適用于分離基因和調控序列的靶植物的實例應該包括但不限于苜蓿、 蘋果、 杏、 擬南芥屬植 物、 洋薊、 芝麻菜、 蘆筍、 鱷梨、 香蕉、 大麥、 豆類、 甜菜、 黑莓、 藍莓、 西蘭花、 抱子甘藍、 卷心 菜、 低芥酸菜籽、 香瓜、 胡蘿卜、 木薯、 蓖麻、 菜花、 芹菜、 櫻桃、 菊苣、 芫荽、 柑桔類、 克萊門氏 小柑橘類、 三葉草、 椰子、 咖啡、 玉米、 棉、 蔓越莓、 黃瓜、 花旗松、 茄子、 菊苣、 茅菜、 桉樹、 茴 香、 無花果、 大蒜、 葫蘆、 葡萄、 柚子樹、 白蘭瓜、 豆薯、 獼猴桃、 生菜、 韭蔥、 檸檬、 酸橙、 火炬 松、 亞麻子、 玉米、 芒果、 甜瓜、 蘑菇、 油桃、 堅果、 燕麥、 油棕、 油菜、 秋葵、 橄欖樹、 洋蔥、 橙、 觀 賞植物、 棕櫚、 木瓜樹、 歐芹、 歐洲防風草、 豌豆、 桃樹、 花生、 梨樹、 胡椒、 柿樹、 松樹、 菠蘿、 大 蕉、 李樹、 石榴樹、 白楊、 馬鈴薯、 南瓜、 溫柏、 輻射松、 紅菊苣、 蘿卜、 油菜、 樹莓、 稻、 黑麥、 高 粱、 南方松、 大豆、 菠菜、 南瓜、 草莓、 甜菜、 甘蔗、 向日葵、 甘薯、 楓香樹、 柑橘、 茶、 煙草、 蕃茄、 黑小麥、 草皮草、 蕪菁、 葡萄樹、 西瓜、 小麥、 薯蕷和西葫蘆。
     組合物
     本發明的組合物是其基因組中包含本發明的任何重組 DNA 構建體 ( 包括任何抑制 DNA 構建體 )( 例如上面所討論的任何一種其他構建體 ) 的植物。 組合物也包括任何植物的 子代, 以及獲取自植物或其子代的任何種子, 其中所述子代或種子在其基因組中包含重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 )。子代包括通過植物的自花授粉或異型雜交而獲得的連 續世代。子代也包括雜交種和近交系。
     在雜交種子繁殖的農作物中, 成熟的轉基因植物可自花授粉而產生純合的自交系 植物。該近交系植物產生含有新引入的重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的種子。這 些種子可以生長而產生將會表現出改變的農學特性 ( 如, 在氮限制條件下農學特性增加 ) 的植物, 或者可以用于育種程序以產生雜交種子, 這些雜交種子可以生長而產生將會表現 出如改變的農學特性的植物。所述種子可為玉米種子。
     植物可為單子葉植物或雙子葉植物, 例如玉米或大豆植物, 如玉米雜種植物或玉 米自交系植物。植物還可以是向日葵、 高梁、 低芥酸菜籽、 小麥、 苜蓿、 棉、 稻、 大麥、 小米、 甘 蔗、 或柳枝稷。
     重組 DNA 構建體可穩定地整合進植物的基因組中。
     具體實施方案包括但不限于下列的 :
     1. 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有 一種氨基酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%、 51%、 52%、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98%、 99%、 或 100%的序列同一性, 并且其中所述植物在與未包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出增加的氮脅迫耐受性。在與該對照植物比較時, 該植物還可表 現出至少一種農學特性的改變。
     2. 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 該重組 DNA 構 建體包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼包含 SNF2 結構域的多肽, 并且其中在與未包含所述重組 DNA 構建體的對照植物比較時, 所述植物表 現出增加的氮脅迫耐受性。在與該對照植物比較時, 該植物還可表現出至少一種農學特性 的改變。
     3. 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 該重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼包含 SNF2 結構域的多肽, 并且其中在與未包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時, 所述植 物表現出在氮限制條件下至少一種農學特性的改變。
     4. 在因組中包含重組 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 所述重組 DNA 構 建體包含可操作地連接到至少一種調控元件的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種 氨基酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99%、 或 100%的序列同一性, 并且其中所述植物在與未包含所述重組 DNA 構建體的對照植 物進行比較時表現出在氮限制條件下至少一種農學特性的改變。
     5. 在基因組中包含抑制 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 該抑制 DNA 構建體包含至少一種可操作地連接至源自受關注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部 分的區域的調控元件, 當與所述區域所來源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時, 基于 Clustal V 比對方法, 所述區域的核酸序列具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86%、 87%、 88 %、 89%、 90 %、 91%、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或 100 % 的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的多肽, 并且其中在與 未包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時, 所述植物表現出在氮限制條件下至少 一種農學特性的改變。
     6. 在基因組中包含抑制 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控元件, 該調控元件可操作地連接至以下序列的全部或部分 : (a) 編碼多肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%序列同一性 ; 或 (b)(a) 的核酸序列的全長互補序列, 并且其 中所述植物在氮限制條件下在與不包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出至少一種農學特性的改變。
     7. 上述實施方案 1-6 中的植物的任何子代、 上述實施方案 1-6 中的植物的任何種 子、 上述實施方案 1-6 中的植物的子代的任何種子以及來自上述實施方案 1-6 中的任何植 物以及它們的子代的細胞。
     在前述實施方案 1-7 的任一項中或本發明的任何其他實施方案中, 包含 SNF2 結構 域的多肽可來自擬南芥 (Arabidopsis thaliana)、 玉米 (Zea mays)、 大豆 (Glycine max)、 煙豆 (Glycine tabacina)、 野大豆 (Glycine soja) 或短絨野大豆 (Glycine tomentella)。
     在上述實施方案 1-7 或本發明的任一其他實施方案中的任一項中, 重組 DNA 構建 體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 可包含至少一種在植物中有功能的啟動子作為調控序列。
     在前述實施方案 1-7 中任一項或本發明的任何其他實施方案中, 所述至少一種農 學特性的改變是增加或減少。
     在前述實施方案 1-7 中任一項或本發明的任何其他實施方案中, 所述至少一種農 學特性可選自 : 綠度、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時的鮮重、 成熟時的干重、 果實產量、 種 子產量、 總植物含氮量、 果實含氮量、 種子含氮量、 營養組織含氮量、 總植物氨基酸含量、 營 養組織游離氨基酸含量、 果實游離氨基酸含量、 種子游離氨基酸含量、 總植物蛋白質含量、 果實蛋白質含量、 種子蛋白質含量、 營養組織蛋白質含量、 耐旱性、 氮攝取、 根倒伏抗性、 收 獲指數、 莖倒伏、 植株高度、 穗高、 穗長、 鹽耐受性、 早期幼苗活力、 和在低溫脅迫下的出苗。 例如, 至少一種農學特性的改變可為產量、 綠度或生物量的增加。 在前述實施方案 1-7 中任一項或本發明的任何其他實施方案中, 所述植物在與不 包含所述重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的對照植物在氮脅迫條件下進行比較時, 可表現出至少一種農學特性的改變。
     本領域的普通技術人員熟悉模擬氮條件 ( 限制性的或非限制性的 ) 的規程, 以及 用于評價已經經受過模擬的或天然存在的氮條件 ( 限制性的或非限制性的 ) 的植物的規 程。例如, 技術人員可通過向植物提供比正常需求更少的氮或在一定時期內不提供氮來模 擬氮條件, 并且技術人員可通過尋找農學特性的差異來評價此類植物, 例如在生理學和 / 或物理條件上的變化, 包括 ( 但不限于 ) 活力、 生長、 大小、 或根長、 或具體地講葉片顏色或 葉片面積大小。 用于評價此類植物的其他技術包括測量葉綠素熒光、 光合作用速率、 根生長 或換氣速率。
     下面的實施例描述了一些用于模擬氮限制條件和 / 或在此類條件下評價植物的 代表性規程和技術。
     技術人員也可通過植物在大田測試中, 在模擬的或天然存在的低氮或高氮條件 下保持足夠產量 ( 例如, 至少 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85%、 86%、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%、 或 100%的產量 ) 的能力 ( 例如通過測量在低氮或高氮條件下, 與標準氮條件下相比基本上等 同的產量, 或通過測量在低氮或高氮條件下與對照或參照植物相比更少的產量損失 ) 來評 價氮脅迫耐受性。
     在評估或測量其中利用了對照或參照植物的本發明任何實施方案 ( 例如, 如本文 描述的組合物或方法 ) 中的轉基因植物的農學特性或表型時, 本領域的普通技術人員將很 容易認識到要利用的合適對照植物。例如, 通過如下非限制性示例來說明 :
     1. 轉化過的植物的子代, 該轉化過的植物對于重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建 體 ) 來說是半合子的, 使得該子代分離成包含或不包含該 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的植株 : 包含該重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的子代將通常相對于不包含該重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的子代來進行測量 ( 即, 不包含該重組 DNA 構建體 ( 或抑 制 DNA 構建體 ) 的子代是對照或參照植株 )。
     2. 重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 基因滲入至近交系中, 例如在玉米中, 或 基因滲入進變種中, 例如在大豆中 : 基因滲入品系將通常相對于親本近交系或變種品系進 行測量 ( 即, 親本近交系或品種品系是對照或參照植物 )。
     3. 雙雜交系, 其中第一雜交系由兩個親本近交系產生, 而第二雜交系由相同的兩 個親本近交系產生, 不同的是其中一個親本近交系含有重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建 體): 第二雜交系通常將相對于第一雜交系進行測量 ( 即第一雜交系為對照植物或參照植 物 )。
     4. 包含重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的植株 : 該植株可以相對于這樣 的對照植株進行評估或測量, 該對照植株不包含重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ), 但具有與該植株相當的遺傳背景 ( 例如, 與包含重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的 植株相比較, 核遺傳物質具有至少 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99%或 100%的序列同一性 )。存在許多可用于分析、 比較和表征植物遺傳背景的基于實 驗室的技術 ; 其中這些技術是同工酶電泳、 限制性片段長度多態性 (RFLP)、 隨機擴增多態 性 DNA(RAPD)、 任何引物聚合成酶鏈反應 (AP-PCR)、 DNA 擴增指紋 (DAF)、 序列特異擴增區域 (SCAR)、 擴增片段長度多態性 (AFLP ) 和也稱為微衛星的簡單序列重復 (SSR)。 此外, 本領域的普通技術人員將容易認識到, 評估或測量轉基因植物的農學特性 或表型時合適的對照或參照植物將不包括先前已經針對所需的農學特性或表型, 通過誘變 或轉化而選擇的植物。
     方法
     方法包括但不限于用于提高植物氮脅迫耐受性的方法、 用于評價植物氮脅迫耐受 性的方法、 用于改變植物農學特性的方法、 用于測定植物農學特性改變的方法、 和用于制備 種子的方法。所述植物可為單子葉或雙子葉植物, 例如玉米或大豆植物。植物還可以是向 日葵、 高梁、 低芥酸菜籽、 小麥、 苜蓿、 棉、 稻、 大麥、 小米、 或甘蔗。所述種子可為玉米或大豆 種子, 例如玉米雜交種子或玉米自交系種子。
     方法包括但不限于如下方法 :
     轉化細胞的方法包括用本發明的任何分離的多核苷酸轉化細胞。 也包括通過這種 方法轉化的細胞。 在具體實施方案中, 所述細胞是真核細胞, 例如酵母、 昆蟲或植物細胞, 或 原核細胞, 例如細菌細胞。
     生產轉基因植物的方法, 所述方法包括用本發明的任何分離的多核苷酸或重組 DNA 構建體 ( 包括抑制 DNA 構建體 ) 來轉化植物細胞并從轉化的植物細胞中再生轉基因植 物。 本發明也涉及由該方法制備的轉基因植物, 以及從該轉基因植物中獲取的轉基因種子。 通過該方法獲取的轉基因植物可被用于本發明的其他方法中。
     用于從細胞或細胞培養基中分離本發明多肽的方法, 其中所述細胞包含具有本發 明多核苷酸的重組 DNA 構建體, 所述多核苷酸可操作地連接到至少一個調控序列, 并且其
     中轉化的宿主細胞在適于重組 DNA 構建體表達的條件下生長。
     改變宿主細胞中本發明多肽表達水平的方法, 所述方法包括 : (a) 用本發明的重 組 DNA 構建體轉化宿主細胞 ; 以及 (b) 在適于表達所述重組 DNA 構建體的條件下培養轉化 過的細胞, 其中重組 DNA 構建體的表達導致轉化過的宿主細胞中的本發明多肽含量改變。
     提高植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 將重組 DNA 構建體引入到可再 生的植物細胞中, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列 ( 例如在植 物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的, 所述 氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%的序列 同一性 ; 和 (b) 在步驟 (a) 之后, 從所述可再生的植物細胞再生出轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體并且在與不包含該重組 DNA 構建體的對照 植物進行比較時表現出提高的氮脅迫耐受性。所述方法可進一步包括 (c) 獲取源自該轉基 因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體并且在與未包含 該重組 DNA 構建體的對照植物比較時表現出增加的氮脅迫耐受性。
     提高植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 將抑制 DNA 構建體引入到可再 生的植物細胞中, 該抑制 DNA 構建體包含可操作地連接至少一種調控序列 ( 例如在植物中 有功能的啟動子 ) 的以下序列的全部或部分 : (i) 編碼多肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸 序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57%、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%的序列同一 性, 或 (ii)(a)(i) 的核酸序列的全長互補序列 ; 以及 (b) 在步驟 (a) 之后, 從該可再生的植 物細胞再生出轉基因植物, 其中該轉基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 并且在 與不包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出增加的氮脅迫耐受性。所述方 法可進一步包括 (c) 獲取源自該轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中 包含抑制 DNA 構建體并且在與未包含該抑制 DNA 構建體的對照植物比較時表現出增加的氮 脅迫耐受性。
     提高植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 將抑制 DNA 構建體引入到可再 生的植物細胞中, 該抑制 DNA 構建體包含可操作地連接源自受關注靶基因有義鏈或反義鏈 的全部或部分區域的至少一種調控序列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 所述區域的核 酸序列基于 Clustal V 比對方法在與所述區域所來源的有義鏈或反義鏈的全部或部分進 行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57%、 58%、 59%、 60%、 61%、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的多肽 ; 以及 (b) 在步驟 (a) 之后, 從所述可再生的植物細 胞再生出轉基因植物, 其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構建體并且在 與不包含該抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出增加的氮脅迫耐受性。所述方法 可進一步包括 (c) 獲取源自該轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包 含抑制 DNA 構建體并且在與未包含該抑制 DNA 構建體的對照植物比較時表現出增加的氮脅 迫耐受性。
     評價植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含重組 DNA 構建體, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少 一種調控序列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有 一種氨基酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%、 51%、 52%、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98%、 99%或 100%的序列同一性 ; (b) 獲取來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述 子代植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體 ; 以及 (c) 評價所述子代植物在與不包含 所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時的氮脅迫耐受性。
     評價植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控序 列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 其可操作地連接以下序列的全部或部分 : (i) 編碼多 肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或 100 %的序列同一性 ; 或 (ii)(a)(i) 的核酸序列的全長互補序列 ; (b) 獲取來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構建體 ; 以及 (c) 評價所述子代植物在與不包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行 比較時的氮脅迫耐受性。
     評價植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控序 列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 其可操作地連接源自受關注靶基因有義鏈或反義鏈 的全部或部分區域, 所述區域的核酸序列基于 Clustal V 比對方法在與所述區域所來源的 有義鏈或反義鏈的全部或部分進行比較時, 具有至少 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 或 100% 的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的多肽 ; (b) 獲取來源 于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構建體; 以及 (c) 評價所述子代植物在與不包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時的 氮脅迫耐受性。
     測定植物農學特性改變的方法, 所述方法包括 (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含重組 DNA 構建體, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少 一種調控序列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有 一種氨基酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%、 51%、 52%、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98%、 99%或 100%的序列同一性 ; (b) 獲取來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述 子代植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體 ; 以及 (c) 測定所述子代植物任選地在氮 限制條件下與不包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時是否表現出至少一種農 學特性的改變。
     測定植物農學特性改變的方法, 所述方法包括 (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控序 列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 其可操作地連接以下序列的全部或部分 : (i) 編碼多 肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97%、 98%、 99%或 100%的序列同一性 ; 或 (ii)(i) 的核酸序列的全長互補序列 ; (b) 獲取 來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構 建體 ; 以及 (c) 測定所述子代植物任選地在氮限制條件下與不包含所述抑制 DNA 構建體的 對照植物進行比較時是否表現出至少一種農學特性的改變。
     測定植物農學特性改變的方法, 所述方法包括 (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控序列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 其可操作地連接源自受關注靶基因有義鏈或反義鏈的 全部或部分的區域, 所述區域的核酸序列基于 Clustal V 比對方法在與所述區域所來源的 有義鏈或反義鏈的全部或部分進行比較時, 具有至少 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 或 100% 的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的多肽 ; (b) 獲取來源 于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構建 體; 以及 (c) 測定所述子代植物任選地在氮限制條件下與不包含所述抑制 DNA 構建體的對 照植物進行比較時是否表現出至少一種農學特性的改變。
     產生種子 ( 例如可作為提供氮脅迫耐受性的產品銷售的種子 ) 的方法, 該方法包括任一上述的方法, 并且還包括從所述子代植物獲取種子, 其中所述種子在其基因組中包 含所述重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 )。
     在任何前述方法或本發明的方法的任何其他實施方案中, 在所述導入步驟中所述 可再生的植物細胞可包括愈傷組織細胞、 胚胎愈傷組織細胞、 配子細胞、 分生細胞或未成熟 胚芽細胞。可再生的植物細胞可來自近交系玉米植物。
     在任一前述方法或本發明方法的任一其他實施方案中, 所述再生步驟可包括 : (i) 在包含促胚發生激素的培養基中培養所述轉化的植物細胞, 直至觀察到愈傷組織 ; (ii) 將 步驟 (i) 的所述轉化植物細胞轉移到第一培養基中, 所述培養基包括促組織形成激素 ; 以 及 (iii) 在第二培養基上傳代培養步驟 (ii) 后的所述轉化的植物細胞, 以允許嫩芽伸長、 根發育或這兩者同時發生。
     在任何前述方法或本發明的方法的任何其他實施方案中, 所述至少一種農學特性 可選自 : 綠度、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時的鮮重、 成熟時的干重、 果實產量、 種子產量、 總植物含氮量、 果實含氮量、 種子含氮量、 營養組織含氮量、 總植物氨基酸含量、 營養組織游 離氨基酸含量、 果實游離氨基酸含量、 種子游離氨基酸含量、 總植物蛋白質含量、 果實蛋白 質含量、 種子蛋白質含量、 營養組織蛋白質含量、 耐旱性、 氮攝取、 根倒伏抗性、 收獲指數、 莖 倒伏、 植株高度、 穗高、 穗長、 鹽耐受性、 早期幼苗活力、 和在低溫脅迫下的出苗。 至少一種農 學特性的改變可為產量、 綠度或生物量的增加。 在任一上述方法或本發明的任一方法中, 在與不包含所述重組 DNA 構建體 ( 或抑 制 DNA 構建體 ) 的對照植物在氮限制條件下進行比較時, 植物可表現出至少一種農學特性 的改變。
     在任一前述方法或本發明方法的任何其他實施方案中, 存在供選擇的替代方案用 于將包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸的重組 DNA 構建體導入可再生的 植物細胞中。例如, 可將調控序列 ( 例如一種或多種增強子, 例如, 作為轉座因子的部件 ) 導入可再生的植物細胞, 然后篩選其中將所述調控序列可操作地連接至編碼本發明的多肽 的內源基因的事件。
     將本發明的重組 DNA 構建體引入植物可通過任何合適的技術來進行, 這些技 術包括但不限于 DNA 直接攝取、 化學處理、 電穿孔、 顯微注射、 細胞融合、 感染、 載體介導 的 DNA 轉移、 轟擊或農桿菌屬介導的轉化。植物轉化和再生技術已經在國際專利公布 WO 2009/006276 中進行了描述, 其內容以引用方式并入本文。
     含有編碼受關注蛋白質的外來的外源性分離核酸片段的植物的發育或再生是本 領域所熟知的。可將再生的植物進行自花授粉以產生純合的轉基因植物。或者, 將得自再 生植物的花粉與農學上重要的品系的產生種子的植株進行雜交。相反, 將來自這些重要品 系植物的花粉用于給再生植物授粉。 利用本領域技術人員所熟知的方法培育含有所需多肽 的本發明的轉基因植物。
    實施例 本發明將在下面的實施例中進一步說明, 其中份數和百分比是以重量計并且度數 是攝氏度, 除非另外說明。應該理解, 盡管這些實施例說明了本發明的實施方案, 但僅是以 例證的方式給出的。根據上面的論述和這些實施例, 本領域的技術人員可以確定本發明的
     基本特征, 并在不脫離本發明的精神和范圍的情況下, 可對本發明做出多種改變和修改, 以 使其適用于多種用法和條件。此外, 除了那些本文所示和描述的那些之外, 根據前文所述, 本發明的各種修改形式對本領域的技術人員來說將是顯而易見的。 這些修改形式也旨在涵 蓋于所附權利要求書的范圍內。
     實施例 1
     制備具有激活標記基因的擬南芥種群
     構建 18.49kb 的 T-DNA 基二元構建體, pHSbarENDs2(SEQ ID NO : 1; 圖 1) 包含四 個來源于花椰菜花葉病毒 35S 啟動子的四個多聚增強子元件 ( 對應于序列 -341 至 -64, 如 Odell 等人 Nature 313 : 810-812 所述 (1985))。該構建體也包含允許質粒救援的載體序列 (pUC9) 和多接頭 (SEQ ID NO : 11)、 再動員 T-DNA 的轉座子序列 (Ds)、 以及允許草胺磷選擇 轉基因植物的 bar 基因。原則上, 僅將從右邊界 (RB) 至左邊界 (LB) 包含的 10.8kb 片段轉 移到寄主植物基因組中。因為增強子元件位于靠近 RB 處, 它們可誘導 T-DNA 整合后的基因 組位點順式激活。
     通過整個植株的農桿菌屬轉化制備擬南芥屬激活標記種群。將 pHSbarENDs2 構建 體轉化到根癌農桿菌菌株 C58 中, 在 25℃下在溶菌肉湯培養基中培養至 OD600 ~ 1.0。然 后離心沉淀細胞, 并重懸在相等體積的 5%蔗糖 /0.05% Silwet L-77(OSI Specialties, Inc) 中。在早期抽薹時, 培育擬南芥生態型 Col-0 的土壤使用農桿菌屬懸浮液進行頂部灌 溉。 一周后, 相同植株再次用在蔗糖 /Silwet 中的相同農桿菌屬菌株進行頂部灌溉。 然后將 該植物的種子設為標準。所得 T1 種子在土壤中播種, 通過噴灑草胺磷 (FINALE ; AgrEvo ; Bayer Environmental Science) 選擇轉基因幼苗。選擇了總計 100,000 個草胺磷抗性 T1 幼苗。分開保存來自每個品系的 T2 種子。
     實施例 2
     篩選以鑒定具有低氮耐受性的品系
     來 自 每 個 100,000 個 分 離 T1 激 活 標 記 品 系 的 十 一 個 T2 植 物 可 種 植 在 方 板 (15mm×15mm) 上, 方板包含 0.5x N-Free Hoagland’ s, 0.4mM 硝酸鉀, 0.1%蔗糖, 1mM MES TM 和 0.25% Phyytagel ( 低氮培養基 )。 每個板種植五個品系, 并且每個板包括 9 個野生型個 體以使總計 64 個個體排列成 8×8 的網格圖案 ( 參見圖 12)。在暗處、 4℃條件下保持平板 三天以使種子分層, 然后在 22℃光照和 20℃黑暗交替條件下水平放置九天。光周期為十六 小時光照和八小時黑暗, 平均光照強度為~ 200mmol/m2/s。每天旋轉并振動每個架子中的 平板。在第十二天 ( 生長九天 ), 對整個板拍照以評價幼苗狀態。
     在掩蔽該平板圖像以去除背景顏色后, 每個個體收集兩個不同的測量數據 : 總羅 賽塔面積和進入綠色區的顏色百分比。使用色調、 飽和度和強度數據 (HSI), 綠色區由色調 50 至 66 組成。 總羅賽塔面積用作植物生物量的量度, 而綠色區通過劑量 - 響應研究已經顯 示指示氮同化作用 ( 參見圖 13)。
     將在與野生型對照植物進行比較時具有顯著的總羅賽塔面積和 / 或綠色區增加 的品系命名為 Phase 1 hits。在相同分析條件下進行 Phase 1hits 的重復試樣再篩選 (Phase 2 篩選 )。還通過 Phase 3 篩選以進一步驗證通過 Phases 1 和 2 的突變體。在 Phase 3 中, 將每個品系分開種植在低氮培養基中, 使得 32 個 T2 個體緊鄰著 32 個野生型個 體生長, 為分析提供更高的統計學嚴謹性。如果一個品系顯示與 Phase 3 中對照的顯著差異, 然后可認為該品系是經驗證的氮缺乏抗性品系。
     實施例 3
     鑒定激活標記基因
     在氮耐受性品系中側接 T-DNA 插入序列的基因使用以下兩個標準程序中的一個 或兩個進行鑒定 : (1) 熱不對稱交錯 (TAIL)PCR(Liu 等人, Plant J.8 : 457-63(1995)) ; 以及 (2)SAIFF PCR(Siebert 等人, Nucleic Acids Res.23 : 1087-1088(1995))。至于復雜的多 聚 T-DNA 插入序列, TAIL PCR 和 SAIFF PCR 可能均不足以鑒定候選基因。在這些情況下, 可使用包括反式 PCR、 質粒拯救和 / 或基因組文庫構建在內的其他程序。
     成功的結果是其中單個 TAIL 或 SAIFF PCR 片段包含 T-DNA 邊界序列和擬南芥屬 基因組序列。一旦獲取側接 T-DNA 插入序列的基因組序列標記, 通過與公開可用的擬南芥 屬基因組的序列比對來鑒定候選基因。具體地講, 最靠近 35S 增強子元件 /T-DNA RB 的注 釋基因是激活的基因的候選基因。
     為了驗證鑒定的基因真的靠近 T-DNA 并排除 TAIL/SAIFF 片段是嵌合偽克隆的可 能性, 用一個 T-DNA 中的寡核苷酸和一個候選基因特異性的寡核苷酸進行對基因組 DNA 的 診斷 PCR。將提供 PCR 產品的基因組 DNA 樣本理解為表示 T-DNA 插入序列。該分析也驗證 了其中一種以上的插入事件發生在相同品系中的情況, 例如, 在 TAIL 和 / 或 SAIFF PCR 分 析中鑒定是否有多個不同基因組片段。
     實施例 4
     鑒定編碼包含 SNF2 結構域的多肽的激活標記基因
     進一步分析了顯示出氮缺乏耐受性的激活標記品系 ( 品系 112579)。提取來自該 品系的 DNA, 并且在突變品系中側接 T-DNA 插入序列的基因通過連接介導 PCR(Siebert 等 人, Nucleic Acids Res.23 : 1087-1088(1995)) 進行鑒定。鑒定一個單獨擴增的片段, 它包 含 T-DNA 邊界序列和擬南芥屬基因組序列。一旦獲取側接 T-DNA 插入序列的基因組序列標 記, 通過與完全擬南芥屬基因組的序列比對鑒定候選基因。具體地講, 最靠近 35S 增強子元 件 /T-DNA RB 的注釋基因是品系中激活的基因的候選基因。就品系 112579 而言, 最靠近 35S 增強子的基因是 At1g61140, 它編碼擬南芥包含 SNF2 結構域的多肽。
     實施例 5
     通過轉化擬南芥屬驗證候選的擬南芥基因 (At1g61140)
     可將候選基因轉化到擬南芥屬中并在 35S 啟動子作用下過表達。如果在轉基因品 系中觀察到與親本激活標記品系相同或相似的表型, 則將該候選基因認為是擬南芥屬中驗 證過的 “前導基因” 。
     候選擬南芥屬基因 (At1g61140) 編碼包含 SNF2 結構域的多肽, 用以下方法測試其 賦予氮缺乏耐受性的能力。設計引物以擴增突變體 At1g61140.1。
     通過 RT-PCR, 用以下引物擴增 At1g61140.1cDNA(SEQ ID NO : 24) :
     1.At1g61140-5’ attB 正向引物 (SEQ ID NO : 33)
     正向引物包含 attB1 序列 (ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT ; SEQ ID NO : 12) 和共有 的 Kozak 序列 (CAACA) 蛋白編碼區上游的前 21 個核苷酸 ( 以所述 cDNA 的 ATG 起始密碼子 開頭 )。
     2.At1g61140-3’ attB 反向引物 (SEQ ID NO : 34)。反向引物包含 attB2 序列 (ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT ; SEQ ID NO : 13), 該序列 鄰近蛋白編碼區的反向互補序列的后 21 個核苷酸 ( 以所述 cDNA 的終止密碼子的反向互補 序列開頭 )。
     使用 INVITROGENTM GATEWAY CLONASETM 技術, 用 pDONRTMZeo(SEQ ID NO : 2; 圖 2) 對每個 RT-PCR 產物進行了 BP 重組反應。這種方法將細菌致死 ccdB 基因以及氯霉素抗性 基因 (CAM) 從 pDONRTMZeo 移除并定向地克隆了該在旁側具有 attB1 和 attB2 位點的 PCR 產 物而得到入門克隆 (entry clone)。鑒定為陽性的入門克隆與一個目的載體一起被用于隨 后的 LR 重組反應, 如下所述。
     用緊接 INVITROGENTMGATEWAY C1 轉化插入序列上游的 1.3-kb35S 啟動子構建 稱為 pBC-yellow(SEQ ID NO : 4; 圖 4) 的基于 16.8-kbT-DNA 的二元載體 ( 目的載體 ), 所述插入序列包含 ccdB 細菌致死基因以及側接 attR1 和 attR2 序列的氯霉素抗性基因 (CAM)。該載體還包含 RD29a 啟動子, 該啟動子驅動基因表達 ZS-Yellow(INVITROGENTM), 它 TM 賦予轉化過的種子黃色熒光。使用 INVITROGEN GATEWAY 技術, 對包含核苷酸編碼序列 At1g61140.1(SEQ ID NO : 24) 和 pBC-yellow 載體的入門克隆進行 LR 重組反應 ; 然而, 也可 使用任一種其他突變體 (SEQ ID NO : 26 和 28)。該擴增允許迅速地定向克隆在 pBC-yellow 中的 35S 啟動子之后的 At1g61140.1(SNF2.1 ; SEQ ID NO : 24)。 申請人然后使用如實施例 1 所述的相同農桿菌介導的轉化程序將 35S 啟動子 : At1g61140 表達構建體導入野生型擬南芥屬生態型 Col-0 中。 轉基因 T1 種子通過黃色熒光 進行選擇, 并且將 32 個這些 T1 種子緊鄰著 32 個野生型擬南芥屬生態型 Col-0 種子種植在 低氮培養基上。所有隨后的生長和拍照條件均如實施例 1 所述。發現來自激活標記的、 對 氮限制條件具有耐受性的初始表型, 可在用其中 At1g61140 基因通過 35S 啟動子直接表達 的構建體轉化過的野生型擬南芥屬植物中重現。
     實施例 6a
     cDNA 文庫的制備和 cDNA 克隆的分離和測序
     cDNA 文庫可通過許多可用的方法中的任一種制備。例如, 通過首先根據生產商的 說明書 (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) 制備 Uni-ZAPTMXR 載體中的 cDNA 文 庫, 可將 cDNA 引入質粒載體中。 根據 Stratagene 提供的說明書, 將 Uni-ZAPTMXR 文庫轉換成 質粒文庫。當轉換的時候, 將把 cDNA 插入序列包含于質粒載體 pBLUESCRIPT 中。此外, 可
    使用 T4 連接酶 (New England Biolabs) 將 cDNA 直接導入預切過的 BLUESCRIPT II SK(+) 載體 (Stratagene) 中, 隨后按照制造商規程 (GIBCO BRL Products) 轉染 DH10B 細胞。一 旦 cDNA 插入序列處于質粒載體中, 從隨機選取的含重組 pBLUESCRIPT 質粒的細菌菌落制 備質粒 DNA, 或者用對插入的 cDNA 序列旁側的載體序列特異性的引物, 通過聚合酶鏈式反 應擴增插入的 cDNA 序列。將擴增的 DNA 插入序列或質粒 DNA 在染料 - 引物標記法測序反 應 (dye-primer sequencing reaction) 中進行測序, 以產生部分 cDNA 序列 ( 表達序列標 記或 “EST” ; 參見 Adams 等人, Science 252 : 1651-1656(1991))。用 Perkin Elmer Model 377 熒光測序儀分析所得的 EST。
     用改進的轉座規程產生全長插入序列 (FIS) 數據。從歸檔的甘油原種作為單一菌 落回收確定了 FIS 的克隆, 并通過堿性裂解分離質粒 DNA。將分離的 DNA 模板在基于 PCR 的 測序反應中與載體引物 M13 正向和反向寡核苷酸反應并上樣至自動化的測序儀上。通過與對其進行 FIS 查詢的初始 EST 序列進行序列比對來確認克隆鑒定。
     將確認的模板通過基于釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)Ty1 轉座因子 (Devine 和 Boeke, Nucleic Acids Res.22 : 3765-3772(1994)) 的 Primer Island 轉座試劑 盒 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) 進行轉座。該體外轉座系統在整個一組大 DNA 分子中隨機地放入獨特的結合位點。隨后將轉座的 DNA 用于通過電穿孔轉化 DH10B 電 感受態細胞 (GIBCO BRL/Life Technologies, Rockville, MD)。轉座因子含有另外的可選 標記 ( 稱為 DHFR ; Fling 和 Richards, Nucleic Acids Res.11 : 5147-5158(1983)), 使得能 在瓊脂平板上僅雙重篩選含有整合的轉座子的那些亞克隆。 從每次轉座反應隨機地選擇多 個亞克隆, 通過堿性裂解制備質粒 DNA, 并用對轉座子內的結合位點特異性的獨特引物從轉 座事件位點向外進行測序 (ABI PRISM dyeterminator ReadyReaction mix)。
     收 集 序 列 數 據 (ABI PRISM Collections) 并 用 Phred 和 Phrap(Ewing 等 人, Genome Res.8 : 175-185(1998) ; Ewing 等人, Genome Res.8 : 186-194(1998)) 組裝。Phred 是一種公用軟件程序, 該程序再次讀取 ABI 序列數據, 再次調出 (recall) 堿基, 賦質量值, 并將堿基序列 (base call) 和質量值寫入可編輯的輸出文件中。Phrap 序列組裝程序使用 這些質量值來增加組裝的序列重疊群的準確度。通過 Consed 序列編輯器 (Gordon 等人, Genome Res.8 : 195-202(1998))。
     在一些克隆中, cDNA 片段對應基因的 3’ 端的一部分并且不會涵蓋整個開放閱讀 框。為了獲取上游信息, 使用兩種不同規程中的一種。這兩種方法中的第一種方法導致產 生含有所需基因序列的部分的 DNA 片段, 而第二種方法導致產生含有整個開放閱讀框的片 段。這兩種方法均使用兩輪 PCR 擴增以從一個或多個文庫獲取片段。有時基于以前的知識 ( 特定的基因應該存在于某些組織中 ) 選擇文庫, 有時則進行隨機地選擇。 獲取相同基因的 反應可平行地在若干文庫中進行, 或者在文庫池中進行。文庫池通常用 3 至 5 個不同的文 庫制備并且使其歸一化而成為一致的稀釋度。在第一輪擴增中, 兩種方法均使用載體特異 性的 ( 正向 ) 引物, 同時還使用基因特異性的 ( 反向 ) 引物, 該正向引物對應位于克隆 5’ 端處的載體的一部分。第一種方法使用與已知基因序列的一部分互補的序列, 而第二種方 法使用與 3’ 非翻譯區 ( 也稱為 UTR) 的一部分互補的基因特異性引物。在第二輪擴增中, 兩種方法均使用套式引物組。按照生產商的說明書, 用市售試劑盒將所得 DNA 片段連接進 pBLUESCRIPT 載體中。該試劑盒選自可得自包括 INVITROGENTM(Carlsbad, CA)、 Promega Biotech(Madison, WI) 和 Gibco-BRL(Gaithersburg, MD) 在內的一些供應商的許多試劑盒。 如上所述, 將質粒 DNA 通過堿性裂解方法分離并進行測序和用 Phred/Phrap 進行裝配。
     實施例 6B
     制備 cDNA 文庫并獲取序列
     可利用用于總 RNA 分離的 Qiagen RNA 分離試劑盒分離 mRNA, 然后通過吸附到 Invitrogen(Life Technologies, Carlsbad, CA) 的 oligo(dT)Dynabeads 上分離 mRNA, 并且 測序文庫能夠使用 Illumina, Inc.(SanDiego, CA) 的標準 mRNA-Seq 試劑盒和規程進行制 備。在這一方法中, 使用 ZnCl2 溶液破壞 mRNA, 使用隨機引物將其反轉錄成 cDNA, 進行末端 修復以制備鈍末端片段, 3’ A- 尾化, 并且用 Illumina 雙末端文庫接頭進行連接。然后可使 用 Illumina 雙末端文庫引物對連接好的 cDNA 片段進行 PCR 擴增, 并且能夠在用配有雙末 端模塊的 Genome Analyzer II 測序前使用 Agilent Bioanalyzer DNA 1000 芯片檢查純化PCR 產物的質量和數量。
     測序運行中的讀數可在組合之前進行軟修剪以使觀察到具有低于 15 的 FASTQ 質 量評分的每個讀數的首個堿基對和后面所有堿基對通過 Python Script 進行修剪。Velvet 裝 配 器 (Zerbino 等 人, Genome Research18 : 821-9(2008)) 能 在 不 同 kmer 和 覆 蓋 截 斷 (coverage cutoff) 參數下運行以制備某一嚴格性范圍內的若干個推定裝配物。能夠使用 Vmatch 軟件 ( 在 Vmatch 網站上可用 ) 將在那些裝配物內的鄰接序列 ( 重疊群 ) 組合成組 使得被鑒定為較長重疊群亞組的重疊群分組并被排除, 留下最長 “sentinel” 重疊群的非冗 余組。這些非冗余組能用于與來自已知模型植物種類的同源序列進行比對。
     如果重疊群不提供完整基因, 能夠經由 Blast 或 Perl Script, 使用在第一次搜索 中發現的序列對非冗余組進行再查詢。如果發現了延伸所述重疊群末端的序列, 它們能夠 用桌面裝配器如 DNAStar′ s SeqMan 或 GeneCode′ s Sequencher 與初始序列一起進行裝 配。可重復這些步驟直至不再發現更多的延伸序列。就仍不完整的轉錄物而言, 理論上屬 于一類 ( 基于與其他草本植物的同源性 ) 的基因片段能用來自另一種草本植物的連接序列 進行人工連接。
     實施例 7 鑒定 cDNA 序列
     編碼包含 SNF2 結構域的多肽的 cDNA 序列通過 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool ; Altschul 等人, J.Mol.Biol.215 : 403-410(1993) ; 還可參見國立衛生研究院 國家醫學圖書館的國家生物技術信息中心的萬維網址上對 BLAST 算法的解釋 ) 進行鑒定, 尋找與 BLAST“nr” 數據庫中所包含氨基酸序列 ( 包括所有非冗余 GenBank CDS 翻譯序列、 源自 3 維結構 Brookhaven 蛋白質數據庫 (Protein Data Bank)、 SWISSPROT 蛋白質序列數 據庫的最新的主要版本、 EMBL 和 DDBJ 數據庫的序列 ) 的相似性。在所有的閱讀框中翻譯 DNA 序列并用 NCBI 提供的 BLASTX 算法 (Gish 和 States, Nat.Genet.3 : 266-272(1993)) 比 較與包含在 “nr” 數據庫中的所有可公開獲取的氨基酸序列的相似性。采用國家生物技術 信息中心 (NCBI) 提供的 BLASTP 算法, 分析 cDNA 序列編碼的多肽與包含在 “nr” 數據庫中 的所有可公開獲取的氨基酸序列的相似性。為方便起見, 通過 BLAST 計算僅僅偶然觀察到 cDNA 序列與所搜索的數據庫中所包含序列的匹配的 P 值 ( 概率 ) 或 E 值 ( 期望值 ), 在本 文報導為 “pLog” 值, 它代表所報導的 P 值或 E 值的負對數。因此, pLog 值越大, cDNA 編碼 的序列和 BLAST 的 “匹配” 代表同源蛋白的可能性就越大。
     EST 序 列 可 與 如 上 所 述 的 Genbank 數 據 庫 進 行 比 較。 通 過 使 用 BLASTN 算 法 (Altschul 等人, Nucleic Acids Res.25 : 3389-3402(1997)) 對杜邦專利數據庫比較具有序 列同源共有區域或重疊區域的核苷酸序列, 可找到含更 5′端或 3′端序列的 EST。在兩個 或更多個核酸片段之間存在共有或重疊序列時, 該序列可裝配成單一的連續核苷酸序列, 從而使最初的片段在 5′或 3′初始方向上延伸。一旦確定了最 5′的 EST, 即能通過全長 插入序列來確定其完整的序列。
     可用 tBLASTn 算法, 通過將已知基因 ( 來自專有來源或公開數據庫的已知基因 ) 的氨基酸序列對 EST 數據庫進行比較, 可找到屬于不同物種的同源基因。 tBLASTn 算法對所 有 6 個閱讀框都翻譯了的核苷酸數據庫進行氨基酸查詢的搜索。該搜索允許不同物種之間 的核苷酸密碼子使用的差異, 并且允許密碼子簡并。
     實施例 8a
     表征編碼編碼包含 SNF2 結構域的多肽的 cDNA 序列
     制備提供來自玉米 (Zea mays)、 畫眉草 (Eragrostis nindensis)(Resurrection grass)、 和百喜草 (Paspalum notatum)(Bahiagrass) 不同組織的 mRNA 的 cDNA 文庫。下面 描述了該文庫的特征。
     表2
     來自玉米的 cDNA 文庫
    如 表 3、 圖 16A-AM 和 圖 17 所 示, 表 2 中 鑒 定 的 cDNA 編 碼 類 似 于 以 下 多 肽 的 多肽: 來 自 擬 南 芥 (At1g61140.1(GI No.186492170 ; SEQ ID NO : 25) ; At1g61140.2(GI No.186492172 ; SEQ ID NO : 27) ; 和 At1g61140.3(GI No.186492175 ; SEQ ID NO : 29)) 的 包 含 SNF2 結 構 域 的 多 肽、 和 來 自 水 稻 (GI No.53792213, 對 應 于 SEQ ID NO : 30, GI No.218200575, 對應于 SEQ ID NO : 31, 以及 GI No.90399293, 對應于 SEQ ID NO : 32) 以及高 粱 (GI No.242058897, 對應于 SEQ ID NO : 49) 的包含 SNF2 結構域的多肽。
     表 3( 非專利文獻 ) 和表 4( 專利文獻 ) 中所示的分別是單獨的 EST( “EST” )BLASTP 結果、 包含標明的 cDNA 克隆的整個 cDNA 插入物的序列 ( “FIS” )、 由兩個或更多個 EST、 FIS 或 PCR 序列裝配而成的重疊群序列 (“Contig” )、 或編碼源自 FIS 或重疊群的完整蛋白或 功能性蛋白的序列 (“CGS” )。表 3 和表 4 也顯示了使用 Clustal V 比對方法、 使用默認參 數計算的每對氨基酸序列的序列同一性百分比值 ( 如下所述 )。
     表3
     多肽的 BLASTP 結果
     包含 SNF2 結構域的多肽的同源物
    
    
    
    
    表4 多肽的 BLASTP 結果 包含 SNF2 結構域的多肽的同源物實施例 8b
     鑒定其他包含 SNF2 結構域的多肽
     與 編 碼 包 含 SNF2 結 構 域 的 蛋 白 的 前 導 基 因 同 源 的 序 列 可 使 用 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool ; Altschul 等 人, J.Mol.Biol.215 : 403-410(1993) ; 也參 見美國國家衛生研究院 (National Institutes of Health) 國立醫學圖書館 (National Library of Medicine) 的國家生物技術信息中心 (National Center for Biotechnology Information) 的萬維網網址上對 BLAST 算法的解釋 ) 之類的序列比較算法進行鑒定。例 如, 由 At1g61140 編碼的蛋白的氨基酸序列用作查詢序列, 使用 BlastP 查詢公共數據庫, 并 且隨后將如 SEQ ID NO : 40、 42、 和 48 所示的多肽序列鑒定為同源物 ( 對應的核苷酸序列分 別是 SEQ ID NO : 39、 41、 和 47)。 對公共 BAC 序列進行的 TblastN 搜索也鑒定了 SEQ ID NO : 44( 對應的核苷酸序列是 SEQ ID NO : 43) 所示的玉米同源物。
     實施例 8c
     包含 SNF2 結構域的多肽的序列比對和同一性百分比計算
     圖 16A-AM 給 出 如 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、
     46、 48、 和 49 所示的氨基酸序列比對結果。圖 17 示出圖 16A-AM 中顯示的每對氨基酸序列 的序列同一性百分比和趨異值的圖表。
     用 LASERGENE 生物信息計算包 (DNASTAR Inc., Madison, WI) 的 MEGALIGN 程 序進行序列比對和同一性百分比計算。用 Clustal 比對方法 (Higgins 和 Sharp(1989), CABIOS.5 : 151-153) 進行序列的多重比對, 默認參數 ( 空位罰分= 10, 空位長度罰分= 10)。使用 Clustal 方法采用以下逐對比對的默認參數 : KTUPLE 1, 空位罰分= 3, 窗口= 5, DIAGONALS SAVED = 5。 實施例 9
     包含擬南芥屬前導基因的同源物的植物表達載體的制備
     與 編 碼 包 含 SNF2 結 構 域 的 蛋 白 的 前 導 基 因 同 源 的 序 列 可 使 用 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool ; Altschul 等 人, J.Mol.Biol.215 : 403-410(1993) ; 也參 見美國國家衛生研究院 (National Institutes of Health) 國立醫學圖書館 (National Library of Medicine) 的國家生物技術信息中心 (National Center for Biotechnology Information) 的萬維網網址上對 BLAST 算法的解釋 ) 之類的序列比較算法進行鑒定。 與編 碼包含 SNF2 結構域的蛋白的基因類似的核苷酸序列, 如實施例 8A-C 所述的序列, 可通過任 何一種以下方法進行 PCR 擴增。
     方法 1( 基于 RNA 的方法 ) : 如果蛋白編碼區域的 5’ 和 3’ 序列信息是可用的, 可 如實施例 5 所述設計基因特異性引物。可將 RT-PCR 用于植物 RNA 來獲取含有蛋白編碼區 的核酸片段, 該 EXST 蛋白編碼區旁側為 attB1(SEQ ID NO : 12) 和 attB2(SEQ ID NO : 13) 序 列。引物可含有起始密碼子上游的共有 Kozak 序列 (CAACA)。
     方法 2( 基于 DNA 的方法 ) : 作為另外一種選擇, 如果 cDNA 克隆是可用的, 可以 PCR 擴增完整 cDNA 插入序列 ( 含有 5′和 3′非編碼區 )。可設計正向引物和反向引物, 使它們 分別或者含有 attB1 序列和在該 cDNA 插入序列前面的載體特異性序列或者含有 attB2 序 列和在該 cDNA 插入序列后面的載體特異性序列。對于克隆進載體 pBLUESCRIPT SK+ 中的 cDNA 插入序列, 可使用正向引物 VC062(SEQ ID NO : 16) 和反向引物 VC063(SEQ ID NO : 17)。
     方 法 3( 基 于 基 因 組 DNA 的 方 法 ) : 能 夠 使 用 長 程 基 因 組 PCR 捕 集 獲 取 基 因 組 序 列。 能 夠 基 于 基 因 座 序 列 設 計 引 物, 并 且 能 夠 對 所 得 PCR 產 物 測 序。 能 夠 使 用 FGENESH(Salamov, A.and Solovyev, V.(2000)Genome Res., 10 : 516-522) 程序進行序列分 析, 并且任選地能夠與來自其他物種的同源序列進行比對以輔助鑒定推定的內含子和外顯 子。
     方法 1、 2 和 3 可根據本領域技術人員已知的步驟進行修改。例如, 方法 1 的引物 可含有限制性酶切位點而不是 attB1 和 attB2 位點, 用于后來將 PCR 產物克隆進含有 attB1 和 attB2 位點的載體內。另外, 方法 2 可涉及從 cDNA 克隆、 λ 克隆、 BAC 克隆或基因組 DNA 擴增。
     可利用 BP 重組反應將通過任一種上述方法獲取的 PCR 產物與 GATEWAY 供體載
    體 ( 例如 pDONRTMZeo(SEQ ID NO : 2; 圖 2) 或 pDONRTM221(SEQ ID NO : 3; 圖 3) 組合。這種方 TM 法將細菌致死 ccdB 基因以及氯霉素抗性基因 (CAM) 從 pDONR Zeo 或 pDONRTM221 移除并定 向地克隆了在旁側具有 attB1 和 attB2 位點的 PCR 產物而得到入門克隆 (entry clone)。 使用 INVITROGENTM GATEWAY CLONASETM 技術, 然后可將來自入門克隆的編碼同源包含 SNF2結構域的多肽的序列轉移到合適的目的載體中, 例如 pBC-Yellow(SEQ ID NO : 4; 圖 4)、 PHP27840(SEQ ID NO : 5; 圖 5)、 或 PHP23236(SEQ ID NO : 6; 圖 6), 以獲取植物表達載體, 所 述載體分別用于擬南芥屬、 大豆、 和玉米。 TM
     供體載體 pDONR /Zeo 或 pDONRTM221 的 attP1 和 attP2 位點分別顯示于圖 2 和圖 3 中。目的載體 pBC-Yellow、 PHP27840 和 PHP23236 的 attR1 和 attR2 位點分別顯示于圖 4、 5 和 6 中。
     作為另外一種選擇, 可進行多個入門克隆和合適的目的載體之間的 MultiSite Gateway LR 重組反應以產生表達載體。 實施例 10
     用驗證過的擬南芥屬前導基因制備大豆表達載體并轉化大豆
     為了檢查所得表型, 可將大豆植株轉化以過表達每個驗證過的擬南芥屬基因或來 自不同物種的對應同源物。
     可將實施例 5 中所述的相同 GATEWAY 入門克隆用于將每個基因定向克隆進
    PHP27840 載體 (SEQ ID NO : 5; 圖 5) 中, 使得該基因的表達處于 SCP1 啟動子的控制下。
     然后可用包含編碼本多肽的序列的表達載體轉化大豆胚。 大豆轉化和再生技術已 經在國際專利公布 WO 2009/006276 中進行了描述, 其內容以引用方式并入本文。 可在氮限制條件下 ( 例如 1mM 硝酸鹽 ) 栽培 T1 植株并分析表型變化。利用圖像 分析可定量下面的參數 : 可收集并定量植株面積、 體積、 生長速率以及顏色分析。超表達構 建體與合適的對照植物比較導致綠度 ( 綠色區 )、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時的鮮重或 干重、 果實或種子產量、 總植物氮含量、 果實或種子氮含量、 營養組織的氮含量、 總植物游離 氨基酸含量、 營養組織中的游離氨基酸含量、 果實或種子中的游離氨基酸含量、 果實或種子 中的蛋白質含量、 營養組織中的蛋白質含量發生變化, 可認為它是擬南芥屬前導基因在大 豆中發揮功能提高對氮缺乏耐受性 ( 增加的氮耐受性 ) 的證據。
     可分析用驗證過的基因轉化大豆植株以研究相對于對照或參照植株的農學特性。 例如, 可分析在低氮和高氮條件 ( 如氮限制條件和氮充分條件 ) 下的產量增加和 / 或穩定 性。
     實施例 11
     使用粒子轟擊法用驗證過的擬南芥屬前導基因轉化玉米
     為了檢查所得表型, 可將玉米植株轉化以過表達驗證過的擬南芥屬前導基因或來 自不同物種的對應同源物。
     可以將實施例 5 中所述的相同 GATEWAY 入門克隆用于將每種相應的基因定向
    克隆進玉米轉化載體中。在玉米轉化載體中的基因的表達可以處于組成型啟動子的控 制下, 例如玉米泛素啟動子 (Christensen 等人, Plant Mol.Biol.12 : 619-632(1989) 和 Christensen 等人, Plant Mol.Biol.18 : 675-689(1992)) 然后可通過粒子轟擊將上述重組 DNA 構建體引入玉米細胞中。通過粒子轟擊進行 玉米轉化的技術已經在國際專利公布 WO 2009/006276 中進行了描述, 其內容以引用方式 并入本文。
     可在氮限制條件下 ( 例如 1mM 硝酸鹽 ) 栽培 T1 植株并分析表型變化。利用圖像 分析可定量下面的參數 : 可收集并定量植株面積、 體積、 生長速率以及顏色分析。超表達構
     建體與合適的對照植物比較導致綠度 ( 綠色區 )、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時的鮮重或 干重、 果實或種子產量、 總植物氮含量、 果實或種子氮含量、 營養組織的氮含量、 總植物游離 氨基酸含量、 營養組織中的游離氨基酸含量、 果實或種子中的游離氨基酸含量、 果實或種子 中的蛋白質含量、 營養組織中的蛋白質含量發生變化, 可認為它是擬南芥屬前導基因在玉 米中發揮功能提高對氮缺乏耐受性 ( 增加的氮耐受性 ) 的證據。
     實施例 12
     電穿孔根癌農桿菌 LBA4404
     將電穿孔感受態細胞 (40μl), 例如根癌農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens) LBA4404( 含有 PHP10523) 在冰上解凍 (20-30 分鐘 )。 PHP10523 含有用于 T-DNA 轉移的 VIR 基因、 農桿菌屬的低拷貝數質粒復制起始區、 四環素抗性基因以及用于體內 DNA 生物分子 重組的 cos 位點。同時, 將電穿孔管 (electroporation cuvette) 在冰上冷卻。將該電穿 孔儀的設置調節至 2.1kV。將 DNA 等分試樣 (0.5μL 親代 DNA, 在低鹽緩沖液或雙蒸 H2O 中 的濃度為 0.2μg-1.0μg) 與解凍的根癌農桿菌 LBA4404 細胞混合, 同時仍然保持在冰上。 將混合物轉移至電穿孔管的底部并靜止保持在冰上 1-2 分鐘。按下 “pulse( 脈沖 )” 鍵兩 次 ( 理想的是獲取 4.0 毫秒的脈沖 ) 對細胞進行電穿孔 (Eppendorf 電穿孔儀 2510)。隨 后, 將 0.5mL 室溫下的 2xYT 培養基 ( 或 SOC 培養基 ) 加入到電穿孔管并轉移至 15mL 按壓 蓋管 ( 例如 FALCONTM 管 ) 中。將細胞在 28-30℃、 200-250rpm 下培養 3 小時。 將 250μL 的等分試樣散布在包含 YM 培養基和 50μg/mL 奇放線菌素的板上并在 28-30℃下培養三天。為了增加轉化體的數目, 可進行如下兩個可選步驟中的其中一個 :
     選擇 1 : 用 30μL 15mg/mL 的利福平覆蓋平板。LBA4404 具有針對利福平的染色體 抗性基因。這種附加的選擇消除了在使用較差的 LBA4404 感受態細胞制備物時觀察到的一 些污染克隆。
     選擇 2 : 進行兩次重復的電穿孔以補償較差的電感受態細胞。
     轉化體的鑒定 :
     選取四個獨立的克隆并劃痕接種在包含 AB 基本培養基和 50μg/mL 奇放線菌素的 平板上用于分離單個克隆。 將平板在 28℃下孵育二至三天。 對于每個推定的共整合體選取 單個克隆并將其接種在 4mL 的 10g/L 細菌蛋白胨, 10g/L 酵母提取物, 5g/L 氯化鈉, 和 50mg/ L 奇放線菌素中。將該混合物在 28℃下搖動培養 24 小時。采用 QIAGEN Miniprep 和可選 的 PB 緩沖液洗滌, 從 4mL 培養物分離出質粒 DNA。DNA 在 30μl 中洗提。如上所述, 將 2μL 可將 15μl 等分試樣用于 的等分試樣用于電穿孔 20μL DH10b+20μL 雙蒸 H2O。可任選地, TM 轉化 75-100μl 的 INVITROGEN Library Efficiency DH5α。將細胞散布在包含 LB 培養 基和 50μg/mL 奇放線菌素的平板上并將其在 37℃下培養過夜。
     對于每個推定的共整合體選取三至四個獨立克隆并將其接種在 4mL 的 2xYT 培養 基 (10g/L 細菌蛋白胨, 10g/L 酵母提取物, 5g/L 氯化鈉 ) 和 50μg/mL 奇放線菌素中。將 細胞在 37℃下搖晃培養過夜。接下來, 使用 QIAprep Miniprep, 用任選 PB 緩沖液洗滌液
    ( 稀釋成 50μL) 從 4mL 培養物中分離質粒 DNA。8μL 質粒 DNA 用 SalI( 使用親本 DNA 和 PHP10523 作對照物 ) 進行消化。對于 4 個質粒利用限制性內切酶 BamHI、 EcoRI 和 HindIII 再進行三次消化 ( 使用親本 DNA 和 PHP10523 作為對照 ), 這 4 個質粒代表 2 種具有正確 SalI 消化模式的推定共整合體。推薦電凝膠 (Electronic gel) 用于比較。實施例 13
     使用農桿菌屬 (Agrobacterium) 細菌轉化玉米
     為了檢查所得表型, 可將玉米植株轉化以過表達驗證過的擬南芥屬前導基因或來 自不同物種的對應同源物。
     農 桿 菌 介 導 的 玉 米 轉 化 基 本 上 按 照 Zhao 等 人, Meth.Mol.Biol.318 : 315-323(2006) 中描述的方法進行 ( 還可參見 Zhao 等人, Mol.Breed.8 : 323-333(2001) 和 1999 年 11 月 9 日公布的美國專利 5,981,840, 所述文獻以引用方式并入本文 )。該轉化過 程涉及細菌接種、 共培養、 靜息、 選擇和植物再生。
     1. 未成熟胚芽制備 :
     將未成熟胚芽從穎果上切下來, 并且放置在含有 2mL PHI-A 培養基的 2mL 微管中。
     2. 未成熟胚芽的農桿菌屬細菌感染和其培養 :
     2.1 感染步驟 :
     用 1mL 微吸移管將 (1) 的 PHI-A 培養基取出, 并且加入 1mL 農桿菌屬懸浮液。將 該管輕輕地倒置以混合。將該混合物在室溫下培養 5 分鐘。
     2.2 共培養步驟 :
     用 1mL 微量吸移管將農桿菌屬懸浮液從感染步驟中移出。使用無菌刮刀將胚從管 中刮出并轉移到 100×15mm 培養皿中的 PHI-B 培養基的平板中。測定胚的朝向, 使得胚軸 在培養基表面上朝下。將具有胚芽的平板在 20℃下于黑暗中培養三天。L- 半胱氨酸可用 于共培養階段。采用標準二元載體, 補充有 100-400mg/L L- 半胱氨酸的共培養培養基對于 回收穩定的轉基因事件是至關重要的。
     3. 選擇推定的轉基因事件 :
     向在 100×15mm 培養皿中的 PHI-D 培養基的平板中轉移 10 個胚芽, 保持朝向, 并 且用 parafilm 將培養皿密封。將平板在黑暗中于 28℃下培養。預計在六至八周將看見作 為黃色胚芽組織的主動生長推定事件。不產生事件的胚可能是棕色和壞死的, 并且幾乎看 不見脆性組織生長。以二 - 三周的間隔將推定的轉基因胚芽組織轉移到新鮮的 PHI-D 平板 上進行傳代培養, 時間間隔取決于生長速度。記錄事件。
     4.T0 植株的再生 :
     將在 PHI-D 培養基上繁殖的胚芽組織轉移到在 100×25mm 培養皿中的 PHI-E 培 養基 ( 體細胞胚芽成熟培養基 ) 中進行傳代培養, 在 28℃于黑暗中培養直至體細胞胚芽成 熟, 培養大約十至十八天。將具有良好限定的盾片和胚芽鞘的個體成熟體細胞胚芽轉移到 PHI-F 胚芽發芽培養基中, 并且在 28℃下于光中 ( 約 80μE, 來自冷光燈或同等熒光燈 ) 培 養。在七至十天, 將約 10cm 高的再生的植株置于盆中的園藝混合物中, 并且使用標準園藝 方法進行耐寒鍛煉 (hardened-off)。
     用于植物轉化的培養基 :
     1.PHI-A : 4g/L CHU 基礎鹽, 1.0mL/L 1000×Eriksson′ s 維生素混合物, 0.5mg/L 鹽酸硫胺, 1.5mg/L 2, 4-D, 0.69g/L L- 脯氨酸, 68.5g/L 蔗糖, 36g/L 葡萄糖, pH5.2。加入 100μM 乙酰丁香酮 ( 過濾滅菌的 )。
     2.PHI-B : PHI-A, 不含有葡萄糖, 將 2, 4-D 增加至 2mg/L, 將蔗糖降低至 30g/L, 并 且補充 0.85mg/L 硝酸銀 ( 過濾滅菌的 ), 3.0g/LGELRITE , 100μM 乙酰丁香酮 ( 過濾滅菌的 ), pH5.8。
     3.PHI-C : PHI-B, 不含 GELRITE 和乙酰丁香酮, 將 2, 4-D 降低至 1.5mg/L, 并且補 充 8.0g/L 瓊脂, 0.5g/L 2-[N- 嗎啉代 ] 乙烷 - 磺酸 (MES) 緩沖液, 100mg/L 羧芐西林 ( 過 濾滅菌的 )。
     4.PHI-D : PHI-C 補充 3mg/L 雙丙氨磷 ( 過濾滅菌的 )。
     5.PHI-E : 4.3g/L Murashige and Skoog(MS) 鹽 (Gibco, BRL 11117-074), 0.5mg/L 煙酸, 0.1mg/L 鹽酸硫胺, 0.5mg/L 鹽酸吡哆醇, 2.0mg/L 甘氨酸, 0.1g/L 肌醇, 0.5mg/L 玉米 素 (Sigma, 目錄 No.Z-0164), 1mg/L 吲哚乙酸 (IAA), 26.4μg/L 脫落酸 (ABA), 60g/L 蔗糖, 3mg/Lbialaphos( 過濾滅菌的 ), 100mg/L 羧芐西林 ( 過濾滅菌的 ), 8g/L 瓊脂, pH5.6。
     6.PHI-F : PHI-E, 不 含 有 玉 米 素、 IAA、 ABA ; 將 蔗 糖 降 低 至 40g/L ; 用 1.5g/L GELRITE 替代瓊脂 ; pH 5.6。 通過首先將組織簇轉移到補充有 0.2mg 每升的 2, 4-D 的 N6 培養基中, 可從該 轉基因愈傷組織再生出植物。兩周后, 可將組織轉移到再生培養基中 (Fromm 等人, Bio/ Technology 8 : 833-839(1990))。
     轉基因 T0 植株可以再生, 并且可以確定其表型。可收集 T1 種子。
    此外, 可通過直接轉化或者從單獨轉化的品系基因滲入而將含有證實的擬南芥屬 基因的重組 DNA 構建體導入玉米自交系內。
     自交或雜交的轉基因植物可通過更嚴苛的大田試驗來研究在氮限制條件下和非 氮限制條件下的產量增加和 / 或穩定性。
     隨后可進行產量分析以測定包含驗證過的擬南芥屬前導基因的植物在與不包含 驗證過的擬南芥屬前導基因的對照植物 ( 或參比植物 ) 進行比較時是否具有產量改善 ( 在 氮限制條件下和非氮限制條件下 )。包含驗證過的擬南芥前導基因的植物在氮限制條件下 將具有比對照植物更少的產量損失, 例如至少 25%更少的產量損失, 或者在非氮限制條件 下將具有比對照植物更高的產量。
     實施例 14A
     用于用經過驗證的候選擬南芥屬基因 (At1g61140) 通過農桿菌屬轉化玉米品系 的表達載體的制備
     使用 INVITROGENTM GATEWAY 技術, 用 GATEWAY 入門克隆進行 LR 重組反應, 所述
    入門克隆具有編碼擬南芥屬包含 SNF2 結構域的蛋白的序列 ( 如實施例 5 所述, 并且在該 實施例和隨后的實施例中稱為 AT-SNF2.1)、 入門克隆 PHP23112(SEQ ID NO : 14)、 入門克隆 PHP20234(SEQ ID NO : 9; 圖 9) 和目的載體 PHP22655(SEQ ID NO : 10) 的序列以生成前體質 粒 PHP29872。PHP29872 包含以下表達盒 :
     1. 表達 PAT 抗除草劑性基因的泛素啟動子 ::moPAT::PinII 終止子盒, 該基因用于 轉化過程期間的選擇。
     2. 表達 DS-RED 顏色標記的 LTP2 啟動子 ::DS-RED2::PinII 終止子盒, 該標記用于 分選種子。 3. 泛素啟動子 ::AT-SNF2.1::PinII 終止子盒過表達擬南芥屬包含 SNF2.1 結構域 的蛋白質 (At1g61140.1)。
     實施例 14B
     用經驗證的候選擬南芥屬基因 (At1g61140) 通過農桿菌屬轉化玉米品系
     使用如實施例 12 和 13 所述的農桿菌介導轉化, 能將存在于載體 PHP29872( 如 14A 所述 ) 中、 或包含其他兩種 At1g61140 突變體中的任一種的載體中的 SNF2.1 表達盒導入玉 米自交系、 或來源于優良玉米自交系的可轉化玉米品系。
     可將表達載體 PHP29872 通過電穿孔導入包含載體 PHP10523(SEQ ID NO : 7, 圖 7) 的 LBA4404 農桿菌屬菌株以制備共整合載體 PHP29875, 該載體包含 SNF2.1 表達盒。共整 合載體通過每個載體上包含的 COS 重組位點重組兩個質粒 PHP29872 和 PHP10523 形成, 并 且除了農桿菌菌株以及農桿菌介導轉化需要的其他基因 (TET、 TET、 TRFA、 ORI 終止子、 CTL、 ORI V、 VIR C1、 VIR C2、 VIR G、 VIR B) 之外, 還包含上述相同的三個表達盒 ( 實施例 14A)。 可使用 ( 但不限于 ) 實施例 12 中的電穿孔規程。
     實施例 15
     用于轉入 Gaspe Flint 衍生的玉米品系的目的載體 PHP23236 的制備
     目的載體 PHP23236( 圖 6, SEQ ID NO : 6) 通過用載體 PHP23235( 圖 8, SEQ ID NO : 8) 轉化農桿菌屬菌株 LBA4404 并分離所得共整合產物而獲取, 所述菌株包含質粒 PHP10523( 圖 7, SEQ ID NO : 7)。
     目的載體 PHP23236 可被用于如實施例 16 所述的與入門克隆的重組反應, 以產生 用于轉化 Gaspe Flint 衍生的玉米品系的玉米表達載體。
     實施例 16
     用于轉入 Gaspe Flint 衍生的玉米品系的表達構建體的制備
     使用 INVITROGENTM GATEWAY LR 重組技術, 可將如實施例 5 所述的相同入門克 隆定向克隆到目的載體 PHP29634(SEQ ID NO : 15 ; 圖 11) 中以形成表達載體。目的載體 PHP29634 與目的載體 PHP23236 是相似的, 但是, 目的載體 PHP29634 具有位點特異性的重 組位點 FRT1 和 FRT87, 并且還編碼用于利用草甘膦對轉化體進行選擇的 GAT4602 選擇性標 記蛋白。該表達載體將包含所述受關注的 cDNA, 其在 UBI 啟動子的控制下編碼 At-SNF2.1、 At-SNF2.2、 或 AtSNF2.3, 并且是農桿菌介導轉化到玉米中的 T-DNA 二元載體, 該載體如本 文所述實施例所述但不受其限制。 實施例 17A
     用驗證過的候選擬南芥屬基因 (At1g61140) 轉化 Gaspe Flint 來源的玉米品系
     為了檢查所得表型, 可轉化玉米植株以過表達擬南芥屬 At1g61140 基因 ( 和來自 其他物種的對應同源物 )。可使用如實施例 16 所述的表達構建體。
     受體植株
     受體植株細胞可來自具有短的生活周期 ( “快速循環” )、 小的個體尺寸以及轉化潛 能高的單一玉米品系。對玉米典型的這些植株細胞是來自可公開獲得的 Gaspe Flint(GF) 品 系 變 種 的 植 株 細 胞。 一 種 可 能 的 候 選 植 株 品 系 變 種 是 GF×QTM(Quick Turnaround Maize( 快速周轉玉米 ), 選擇用于在溫室條件下生長的 Gaspe Flint 的可公開獲得形式 ) 的 F1 雜交種, 其在 Tomes 等人 ( 美國專利申請 10/367,416, 提交于 2003 年 2 月 13 日 ; 美 國專利公開 2003/0221212 A1, 公布于 2003 年 11 月 27 日 ) 中公開。從該品系獲得的轉基 因植株具有如此小的尺寸使得它們可在四英寸的盆中生長 ( 是正常大小的玉米植株所需 空間的 1/4) 并且它們在少于 2.5 個月時間內成熟。( 傳統上, 一旦轉基因植株適應溫室后
     需要 3.5 個月來獲得轉基因 T0 種子。) 另一合適的品系包括但不限于 GS3( 高度可轉化的 品系 )X Gaspe Flint 的雙單倍體品系。還有另一種合適的品系是攜帶引起較早開花、 高度 減小或這兩者的轉基因的可轉化的優良玉米自交系。
     轉化規程
     任何合適的方法可用于將轉基因引入玉米細胞中, 包括但不限于利用基于農桿菌 屬載體的接種類型的步驟 ( 參見例如實施例 12 和 13)。轉化可在受體 ( 靶標 ) 植株的未成 熟胚上進行。
     精確的生長和植株跟蹤
     將由轉化的玉米胚產生的轉基因 (T0) 植株的事件群體在受控的溫室環境中栽 培, 該溫室使用改良的隨機分塊 (block) 設計以降低或消除環境誤差。隨機分塊設計是這 樣一種植株布局, 在該布局中, 實驗植株被分成組 ( 如, 每組三十株植株 ), 稱為塊, 而每株 植株隨塊被隨機分配一個位置。
     對于一組三十株植株, 二十四株轉化的實驗植株和六株對照植株 ( 具有設定好的 表型的植株 )( 總起來說稱為 “重復組” ) 被置于盆中, 這些盆在位于溫室內的桌子上布置成 陣列 ( 也叫做重復組或塊 )。每株植株 ( 對照植株或實驗植株 ) 隨塊被隨機分配一個位置, 所述的塊映射一個唯一的、 溫室物理位置以及映射該重復組。在單次實驗中多個三十株植 株的重復組中的每一個可栽培在相同的溫室中。應該測定重復組的布局 ( 布置方式 ) 以使 對空間的要求最小以及溫室內的環境影響最小。這樣一種布局可稱為壓縮的溫室布局。
     對于加入特定的對照組的一種替代方法是鑒定不表達受關注基因的那些轉基因 植株。可將諸如 RT-PCR 之類的多種技術應用于定量評估引入基因的表達水平。可將不表 達轉基因的 T0 植株與表達轉基因的那些植株進行比較。
     在整個評價過程中鑒定和跟蹤事件群體中的每株植株, 并且從那些植株收集的數 據自動與那些植株相關聯, 使得所搜集的數據可與由該植株攜帶的轉基因關聯。 例如, 每個 植株容器具有機器可讀的標簽 ( 例如通用貨單代碼 (UPC) 條形碼 ), 該標簽包含了關于植物 身份的信息, 身份信息繼而又與溫室位置相關, 使得從植物獲得的數據可自動與該植物相 關聯。
     作為另外一種選擇, 可使用任何有效的、 機器可讀的植物識別系統, 例如二維矩陣 代碼或甚至是射頻識別標簽 (RFID), 其中數據被接收并由射頻接收器 / 處理器進行翻譯。 參見美國專利申請 10/324,288, 提交于 2002 年 12 月 19 日 ( 美國專利公布 2004/0122592 A1, 公布于 2004 年 6 月 24 日 ), 以引用方式并入本文。
     利用三維成像進行表型分析
     對 T0 事件群體中的每株溫室植株 ( 包括任何對照植株 ) 分析所關注的農學特性, 并且以這樣一種方式記錄或存儲每株植株的農學數據, 該方式使得數據與該植株的辨識數 據 ( 見上面 ) 相關聯。可利用與上述類似的實驗設計, 可在 T1 代中完成對表型 ( 基因效 應 ) 的確認。
     在植物的整個溫室生活周期中, 利用定量的非破壞性成像技術在表型水平上來分 析 T0 植株以評估所關注的性狀。任選地, 將數字成像分析儀用于整株植物的自動多維分 析。成像可在溫室內進行。將兩個攝像系統 ( 位于頂部和側面 ) 和用于旋轉植物的裝置用 于從所有側面觀察植物和成像。從每株植物的頂部、 前面和側面采集圖像。所有的三個圖像一起提供了足夠的信息用于評價例如每株植物的生物量、 大小和形態。
     由于植物在第一片葉片從土壤顯現出來時到植物處于它們發育的末期時大小的 改變, 從頂部以較高的放大倍率任選地記錄植物發育的早期。這攝像可通過利用完全由成 像軟件控制的自動變焦鏡頭系統來完成。
     在單次成像分析操縱中, 進行如下事件 : (1) 將植株傳送至分析儀區域內, 旋轉 360 度以便其機器可讀標簽可被讀取, 并且讓其保持靜止直至其葉片停止移動 ; (2) 獲取側 面圖像并將其輸入數據庫 ; (3) 將植株旋轉 90 度并再次讓其保持靜止直至其葉片停止移 動, 以及 (4) 將該植株傳送出分析儀。
     每二十四小時的周期讓植物至少六個小時處于黑暗以便具有正常的白天 / 黑夜 周期。
     成像儀器
     可 使 用 任 何 合 適 的 成 像 儀 器, 包 括 但 不 限 于 可 從 LemnaTec GmbH(Wurselen, Germany) 商購獲得的光譜數字成像儀。 獲取圖像并用具有 1/2″ IT Progressive Scan IEE CCD 成像設備的 LemnaTec Scanalyzer HTS LT-0001-2 進行分析。該成像照相機可配備有 自動變焦、 自動調節光圈和自動聚焦。可利用 LemnaTec 軟件設定所有的照相機設置。任選 地, 對于主要組成成像分析儀的儀器差異小于約 5%, 對于次要組成成像分析儀的儀器差異 小于約 10%。 軟件
     成像分析系統包括用于顏色和構造分析的 LemnaTec HTS Bonit 軟件程序和用于 存儲約 500,000 次分析的數據 ( 包括分析數據 ) 的服務器數據庫。原始圖像和分析過的圖 像儲存在一起以允許用戶根據需要進行再次分析。 可將數據庫連接至成像硬件用于自動的 數據收集和存儲。多種可商購獲得的軟件系統 ( 例如 Matlab, 其他軟件 ) 可用于定量解釋 圖像數據, 并且可將這些軟件體系中的任何一種應用于所述圖像數據集。
     傳送系統
     具有植物旋轉裝置的傳送系統可用于將植物傳送至成像區域并在成像過程中選 擇植物。例如, 將最多四株植物 ( 每株最高高度為 1.5m) 裝上汽車, 該汽車在循環的傳送系 統上行進并通過成像測量區域。在這種情況下, 該單位 ( 成像分析儀和傳送環線 ) 的總占 有面積為約 5m×5m。
     可擴大傳送系統以同時容納更多植物。 將植物沿傳送環線傳送至成像區域并對每 株植物分析最多 50 秒。獲取植物的三個視圖。傳送系統以及成像設備應該能夠用于溫室 環境條件。
     照明
     任何合適的照明模式可用于圖像采集。例如, 可在暗背景上使用頂部照明。作為 另外一種選擇, 可采用使用白色背景的頂部照明和背部照明的組合。應該將被照亮的區域 圍起來以確保恒定的照明條件。 遮蔽物應該長于測量區域使得能保持恒定的光條件而不需 要打開和關閉門。 作為另一種選擇, 可變化照明以引起轉基因 ( 如, 綠色熒光蛋白 (GFP)、 紅 色熒光蛋白 (RFP)) 的激發或者引起內源性 ( 如葉綠素 ) 熒光基團的激發。
    
    
    基于三維成像的生物量評價 為了更好地評價生物量, 應該從至少三個軸 ( 任選地, 頂部視圖和兩個側面 ( 側面1 和側面 2) 視圖 ) 獲取植物圖像。然后分析這些圖像以將植物從背景 ( 盆和花粉控制袋 ( 如果適用的話 )) 分離。可通過如下計算評價植物的體積 :
     體積 ( 體素 ) = - √頂部面積 ( 像素 )× √側面 1 面積 ( 像素 )× √側面 2 面積 ( 像素 )
     在上面的等式中, 體積和面積的單位是 “任意單位” 。 在該系統中, 任意單位完全足 以檢測基因對植物大小和生長影響, 因為所需的是檢測與實驗平均值或對照平均值的差值 ( 正較大和負較小兩者 )。大小 ( 如面積 ) 的任意單位可通過將物理參照加入到成像過程 而輕易地轉化成物理量度。例如, 可在頂部成像過程和側面成像過程兩者中均包括已知面 積的物理參照。 基于這些物理參照的面積, 可測定轉換因子以允許從像素轉換為面積單位, 2 例如平方厘米 (cm )。物理參照可以是或可以不是獨立的樣本。例如, 具有已知直徑和高度 的盆足可用作物理參照。
     顏色分類
     成像技術還可用于測定植物顏色以及用于將植物顏色歸為各種衍生類型。 將圖像 顏色歸屬于顏色類型是 LemnaTec 軟件的固有特色。使用其他圖像分析軟件系統, 可通過多 種計算方法測定顏色分類。
     對于植物大小和生長參數的測定, 一種有用的分類方案是定義一種單一顏色方 案, 包括綠色的兩種或三種色調 ( 例如色調是 50-66, 參見圖 13), 此外, 還有關于缺綠病、 壞 死和漂白 ( 在這些條件出現時 ) 的顏色類型。還使用了背景顏色類型, 其包括圖像中的非 植物顏色 ( 例如盆和土壤顏色 ), 并將這些像素特別地從測定大小中排除。 在受控的恒定照 明下分析植物, 使得可以定量一株植物內隨時間推移的任何改變, 或者植物之間或植物不 同分枝之間的任何改變 ( 如季節差異 )。
     除了其在測定植物的大小、 生長中的有效性以外, 顏色分類還可用于評估其他產 量構成性狀。對于這些其他產量構成性狀, 可使用另外的顏色分離方案。例如, 稱為 “保綠 度 (staygreen)” 的性狀 ( 已經將其與產量的提高相關聯 ) 可通過顏色分類來評估, 該顏色 分類將綠色色調與黃色和棕色色調 ( 其指示老化的組織 ) 相分離。通過將這種顏色分類應 用于在 T0 或 T1 植物生活周期末獲取的圖像, 可鑒定綠色的量相對于黃色和棕色 ( 例如, 可 表示為綠色 / 黃色比率 ) 增加的植物。這種綠色 / 黃色比率具有顯著差異的植物可被鑒定 為攜帶影響這種重要農學性狀的轉基因。
     熟練的植物學家將認識到可指示植物健康或應激反應的其他植物顏色 ( 花青素 ) 的出現, 以及認識到其他顏色分類方案可提供對基因在與這些響應相關的性狀方面的作用 的進一步度量。
     植物結構分析
     改變植物結構參數的轉基因也可以用本發明鑒定, 包括諸如最大高度和寬度、 節 間距離、 葉與莖之間的角度、 在節處開始的葉片數以及葉片長度。 LemnaTec 系統軟件可如下 用于測定植物構造。在第一成像步驟中將植物簡化至其主要的幾何構造, 并且隨后基于該 圖像可進行不同構造參數的參數化鑒定。 或者是單獨地或者是組合地修改任何這些構造參 數的轉基因可通過應用此前所述的統計方法來鑒定。
     花粉脫落日期
     花粉脫落日期是轉基因植物中要分析的一個重要參數, 并且可通過活性雄花第一次出現在植物上來測定。為了找到雄花目標, 通過顏色對莖的上端進行分類以檢測黃色或 紫色花藥。然后將這種顏色分類分析用于定義活性花, 活性花繼而可用于計算花粉脫落日 期。
     作為另外一種選擇, 花粉脫落日期和其他易于在視覺上檢測到的植物屬性 ( 如授 粉日期、 第一穗絲日期 ) 可以由負責進行植物看護的工作人員來記錄。為了使數據完整性 和過程效率最大化, 通過利用相同的由 LemnaTec 光譜數字分析設備利用的條形碼來跟蹤 該數據。 可將具有條形碼閱讀器的電腦、 掌上設備或筆記本電腦用于使記錄觀察時間、 植物 標識符的數據捕捉變得容易, 以及使捕捉數據的操作者感覺舒適。
     植物的取向
     以接近商業栽培的密度種植的成熟玉米植物通常具有平面的構造。也就是說, 植 物具有一可清晰分辨的寬的側面和窄的側面。對來自植物寬側的圖像進行測定。對于每株 植物, 給其賦予一個明確界定的基本取向以獲得寬側圖像與窄側 (edgewise) 圖像之間的 最大差別。將頂部圖像用于測定植物的主軸, 而將額外的旋轉裝置用于在開始主圖像采集 前將植物轉至合適的取向。
     實施例 17B
     用玉米同源物轉化 Gaspe Flint 衍生的玉米品系
     使用 INVITROGENTM GATEWAY LR 重組技術, 可制備入門克隆用于任何玉米同源物 (SEQ ID NO : 18/19、 20/21、 22/23、 43/44、 或 45/46)( 入門克隆的制備參見實施例 5), 并能 夠將入門克隆定向克隆到 GATEWAY 目的載體 29634(SEQ ID NO : 15 ; 圖 11) 中以制備對應 的表達載體。每個表達載體將包含處于 UBI 啟動子控制下的所關注的 cDNA, 并且將是用 于農桿菌屬介導的向玉米內的轉化的 T-DNA 二元載體, 所述玉米如但不限于本文所述的實 例。 實施例 18
     在氮限制條件下對玉米品系的篩選
     Gaspe Flint 來源的玉米品系
     轉基因植物可含有兩個或三個劑量的 Gaspe Flint-3 與一個劑量的 GS3(GS3/ (Gaspe-3)2X 或 GS3/(Gaspe-3)3X), 并且對于顯性轉基因會以 1 ∶ 1 分離。將轉基因植物 在 100% Turface( 一種商業栽培培養基 ) 中栽培, 每天用 1mM KNO3 生長培養基和 2mM KNO3 或更高的生長培養基澆灑四次 ( 參見圖 14)。 在 1mM KNO3 培養基中培養的對照植物的綠度 較小, 產生較少的生物量并且在開花期具有較小的穗 ( 關于樣本數據的示例請參見圖 15)。 Gaspe 來源的品系將生長至開花期。
     將用統計學確定處理株之間所觀察到的差異是否真有差異。圖 15 示出了一種方 法, 該方法將字母放在數值后面。同一列中其后具有相同字母 ( 不是字母組 ) 的那些值不 具有顯著的差異。 使用該方法, 如果在一列中的值的后面沒有字母, 則該列中的這些值的任 何之間不存在顯著的差異, 換句話講, 該列中的所有這些值是均等的。
     與無效轉基因相比較, 轉基因的表達將導致植物在 1mM KNO3 中具有改善的植物生 長。因此生物量和綠度 ( 如實施例 2 和 17A 所述 ) 將在生長期間進行監控, 并與無效轉基 因植物比較。生長、 綠度、 開花期穗的大小的改善將表明氮耐受性增強。
     幼苗測定
     還可采用幼苗測定對轉基因玉米植物進行評估, 所述測定對植物在氮限制條件 下的表現進行評估。例如, 在 18 天幼苗測定中, 轉基因植物被種植于商品化盆栽培養基 Turface 中, 然后用包含下列營養物質的溶液每天澆四次 : 1mM CaCl2、 2mM MgSO4、 0.5mM KH2PO4、 83ppmSprint330、 3mM KCl、 1mM KNO3、 1μM ZnSO4、 1μM MnCl2、 3μM H3BO4、 0.1μM CuSO4 和 0.1μM NaMoO4。植物在種植后 18 天收獲, 并且評價多個性狀, 包括但不限于 : SPAD( 綠度 )、 莖直徑、 根干重、 苗干重、 總干重、 mg 氮每克干重 (mg N/g dwt)、 以及植物氮濃 度。采用 Studentt 檢驗, 以 0.1 的最小值 (P < t) 比較平均值和無效轉基因平均值參數。
     實施例 19
     氮利用效率幼苗檢測分析法
     利用種子顏色標記將轉基因事件的種子分成了轉基因的 ( 處理 1 ; 包含構建體 PHP29875) 和無效的 ( 處理 2) 種子。
     每一處理 ( 轉基因的或批無效的 ) 被隨機分配至 54 個盆 ( 實驗單位 ) 組成的區 塊中, 所述盆按 6 行 9 列排列。重復每個處理 ( 轉基因或批無效的 )9 次。
     將所有種子種在 4 英寸的方盆中, 盆中包含在 8 英寸交錯中心上的 Turface, 每天 用包含以下營養物質的溶液澆灌四次 :
     1mM CaCl2 2mM MgSO4 0.5mM KH2PO4 83ppm Sprint330
     3mM KCl 1mM KNO3 1μM ZnSO4 1μM MnCl2
     3μM H3BO4 1μM MnCl2 0.1μM CuSO4 0.1μM NaMoO4
     植物出苗后, 將其間苗至每盆一個種子。 在收獲時從盆中移除植物, 并且將蒙脫石 從根部洗脫。使根與苗分開, 把根置于紙袋中并且在 70℃干燥 70 小時。將干燥后的植物部 分 ( 根和苗 ) 稱重并置于 50mL 的圓錐管中, 管中有大約 20 5/32 英寸的鋼球, 在涂料振蕩 器中進行振蕩研磨。
     The Nitrogen/Protein Analyzer 來自 Thermo Electron Corporation 的氮 / 蛋 白質分析器 ( 型號 FlashEA 1112N) 使用約 30mg 的基本組織。樣品從自動取樣機被點樣至 氧化反應室內部的坩堝內。在 900℃和純氧條件下, 樣品被強烈的放熱反應氧化, 產生 N2、 CO2、 H2O 和 SO2 的混合氣體。燃燒結束后, 打開載氣氦, 使氣體混合物流入還原反應室。在 680℃, 使氣體混合物流過還原銅, 其中可能形成的氮氧化物被轉化為氮元素而過量的氧氣 被保留。所述氣體混合物從還原反應器流出, 依次經過兩個吸收過濾器。第一個過濾器包 含堿石灰, 留住了二氧化碳和二氧化硫。 第二個過濾器包含分子篩和顆粒狀的硅膠, 以阻止 水通過。 然后, 氮被洗脫進色譜柱, 并被轉至熱導率檢測器, 熱導率檢測器生成電子信號, 所 述電子信號經 Eager 300 軟件的適當處理, 提供了氮 - 蛋白質百分比。
     利用這些數據, 測量了下列參數, 并且采用 Student t 檢驗將轉基因組的參數的平 均值與無效組的參數的平均值進行了比較。
    利用方差分析 (ANOVA) 計算和完全隨機設計 (CRD) 模型, 計算了每一區塊內的方 差。使用 F 統計, 通過將總區塊處理平均面積除以總區塊誤差平均面積對每個區塊計算了 總處理效應。計算了更大的 Student′ s t 檢驗的概率用于比較每個轉基因平均值與合適 的無效轉基因平均值。顯示顯著差異的變量 (*) 具有最小值 (P < t)0.1。
     表 5 示出原始數據和包含構建體 PHP29875 的植物的雙尾 Student’ s t 概率。p 值的數學符號反映所述事件對相應的無效組的相對表現, 即 ‘+’ =提高的表現, ‘-’ =降低 的表現。比較轉基因事件和構建體無效轉基因。無效的構建體是陰性的入門構建體, 其由 來自陰性分離子的果仁的抽樣組成, 并因此是全部陰性的代表性樣本。
     表5: PHP29875 的溫室幼苗測定數據
    
    實施例 20A
     具有擬南芥屬前導基因或玉米同源物的玉米品系的產量分析
     自交或頂交雜交體的轉基因植物可通過更嚴苛的大田試驗來研究在氮限制條件 下和無氮限制條件下的產量增加和 / 或穩定性。標準化的產量試驗將通常包括 4 至 6 次重 復, 以及至少 4 個位置。
     可進行產量分析以測定與構建體無效的或野生型的對照 ( 或參考 ) 植物相比, 包 含編碼包含 SNF2 結構域的蛋白的經驗證擬南芥屬基因或相關玉米基因的植物是否具有產 量表現方面的提高 ( 在氮限制或非氮限制條件下 )。具體地講, 對于包含經驗證的擬南芥 前導基因或 lnt6 的玉米同源物的植物和對照植物, 可于開花和 / 或灌漿時期施加氮限制條 件。可以測得這兩種植物的產量都有所減少。包含驗證過的擬南芥屬前導基因或其玉米同 源物的植物在氮限制條件下將具有比對照植物更少的產量損失, 或者在非氮限制條件下將 具有比對照植物更高的產量。
     實施例 20B
     用 PHP29875 轉化的玉米品系的產量分析
     玉米測交雜種包含存在于載體 PHP29875 中的擬南芥前導基因 ( 編碼包含 SNF2 結 構域的多肽 ) 的表達盒, 并且它們的對照植物于 2008 年和 2009 年在多個位置的低氮 (LN) 和標準氮 (NN) 環境下生長。基于由 Federal and State Extension 服務對特定生長區域 確定的土壤測試標準, 低氮 (LN) 環境指氮量少于在早春或夏季施加的標準氮肥的量, 而標
     準氮 (NN) 環境指加入正常產量所需的充足的氮。與 NN 條件中獲得的產量相比, 在 LN 條件 中觀察到了產量的降低。就該分析而言, 構建體無效組是由來自一種構建體的全部事件的 陰性分離子組成的負輸入, 批無效組是由來自一次實驗的全部構建體的全部陰性分離子組 成的負輸入。
     2008 年在 York, NE(YK) 和 Woodland, CA(WO) 兩個地點對九個轉基因事件進行了 大田試驗, 并評估了產量。玉米測交雜交體被用于與構建體無效的 (CN) 相比較。2008 年大 田試驗的結果顯示于表 6 中。
     表6
     用 PHP29875 轉化的玉米的 2008 年大田試驗
    測量單位為蒲式耳 / 英畝。
     陰影代表與構建體無效 (CN) 相比較顯著性較高的 (P < 0.1) 結果。
     粗體代表與構建體無效 (CN) 相比較顯著性較低的 (P < 0.1) 結果。
     九個以前測試的轉基因事件中有八個是 2009 年在以下位置進行的大田測試 : York, NE(YK) ; Marion, IA(MR)Woodland, CA(WO) ; Dallas Center, IA(DS) ; 和 Princeton, IN(PR)。然而, 在 2009 年玉米測交雜種與批無效 (BN) 進行比較。2009 年大田試驗的結果 顯示于表 7 中。 在 York, 在低氮條件下三個事件顯示產量比批無效顯著提高, 在標準氮條件 下一個事件顯示產量比批無效顯著提高。在 Woodland, 在低氮條件下一個事件具有比批無 效顯著更高的產量。在 Marion, 在低氮條件下三個事件的產量比批無效顯著更高。
     表7
     用 PHP29875 轉化的玉米的 2009 年大田試驗
    
    測量單位為蒲式耳 / 英畝。
     陰影代表與批無效 (BN) 相比較顯著性較高的 (P < 0.1) 結果。
     黑體代表與批無效 (BN) 相比較顯著性較低的 (P < 0.1) 結果。
     實施例 21
     用經驗證的前導基因的大豆同源物對大豆進行的轉化和評估
     基于同源性搜索, 可鑒定驗證過的擬南芥屬前導基因的一個或若干個候選大豆同 源物, 并且還可評估它們增加大豆氮限制條件耐受性的能力。 載體構建、 植物轉化和表型分 析將類似于上文實施例所述的規程。
     實施例 22
     用經驗證的前導基因的玉米同源物對玉米進行的轉化和評估
     基于同源性搜索, 可鑒定經驗證的擬南芥屬前導基因的一個或若干個候選的玉米 同源物 ( 例如 SEQ ID NO : 18/19、 20/21、 22/23、 43/44 或 45/46), 并且還評估它們增加玉米 氮限制條件耐受性的能力。載體構建、 植物轉化和表型分析可類似于上文實施例所述的規 程。
     實施例 23
     用驗證過的前導基因的玉米和大豆同源物轉化擬南芥屬
     可將驗證過的擬南芥屬前導基因的大豆和玉米同源物在 35S 啟動子的控制下轉 化到擬南芥屬中, 并且當在低氮培養基中生長時分析其葉片面積和綠色區積聚。可如本文 實施例所述進行載體構建和植物轉化。檢測分析的條件、 數據采集和數據分析可類似于上 文實施例所述的規程。
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     適用于植物宿主細胞的組成型啟動子包括 ( 例如 )Rsyn7 啟動子的核心啟動子 和在 WO 99/43838 和美國專利 6,072,050 中公開的其他組成型啟動子 ; CaMV 35S 核心 啟動子 (Odell 等人, Nature 313 : 810-812(1985)) ; 稻肌動蛋白啟動子 (McElroy 等人, Plant Cell 2 : 163-171(1990)) ; 泛 素 啟 動 子 (Christensen 等 人, Plant Mol.Biol.12 : 619-632(1989) 和 Christensen 等 人, Plant Mol.Biol.18 : 675-689(1992)) ; pEMU 啟 動 子 (Last 等 人, Theor.Appl.Genet.81 : 581-588(1991)) ; MAS 啟 動 子 (Velten 等 人, EMBO J.3 : 2723-2730(1984)) ; ALS 啟動子 ( 美國專利 5,659,026) 等。其他組成型啟動子包括 例 如 在 美 國 專 利 5,608,149、 5,608,144、 5,604,121、 5,569,597、 5,466,785、 5,399,680、 5,268,463、 5,608,142 和 6,177,611 中公開的那些啟動子。
     在選擇啟動子用于本發明方法時, 可能有利的是使用組織特異性啟動子或發育調 控啟動子。
     組織特異性啟動子或發育調節啟動子是這樣的 DNA 序列 : 該序列調節 DNA 序列選 擇性地在對雄穗發育、 結籽或兩者重要的植物細胞 / 組織中表達, 并限制這種 DNA 序列只在 植物的雄穗發育或種子成熟期間表達。 任何引起所需時空表達的可鑒定啟動子均可用于本 發明的方法中。
     可用于本發明的種子或胚芽特異性啟動子包括大豆 Kunitz 胰蛋白酶抑制劑啟動 子 (Kti3, Jofuku 和 Goldberg, Plant Cell 1 : 1079-1093(1989))、 馬鈴薯塊莖特異蛋白啟 動子 (patatin 啟動子 )( 馬鈴薯塊莖 )(Rocha-Sosa, M. 等人, EMBO J.8 : 23-29(1989))、 convicilin 啟動子、 豌豆球蛋白啟動子、 豆球蛋白啟動子 ( 豌豆子葉 )(Rerie, W.G. 等人, Mol.Gen.Genet.259 : 149-157(1991) ; Newbigin, E.J. 等人, Planta 180 : 461-470(1990) ; Higgins, T.J.V. 等人, Plant.Mol.Biol.11 : 683-695(1988))、 玉米蛋白啟動子 ( 玉米胚 乳 )(Schemthaner, J.P. 等人, EMBO J.7 : 1249-1255(1988))、 菜豆蛋白啟動子 ( 菜豆子葉 ) (Segupta-Gopalan, C. 等人, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82 : 3320-3324(1995))、 植物血 球凝集素啟動子 ( 菜豆子葉 )(Voelker, T. 等人, EMBO J.6 : 3571-3577(1987))、 B- 伴球蛋 白啟動子和大豆球蛋白啟動子 ( 大豆子葉 )(Chen, Z-L 等人, EMBO J.7 : 297-302(1988))、 谷 蛋白啟動子 ( 大米胚乳 )、 大麥醇溶蛋白啟動子 ( 大麥胚乳 )(Marris, C. 等人, Plant Mol. Biol.10 : 359-366(1988))、 麥谷蛋白啟動子和麥醇溶蛋白啟動子 ( 小麥胚乳 )(Colot, V. 等 人, EMBO J.6 : 3559-3564(1987))、 和甘薯貯藏蛋白啟動子 ( 甘薯塊根 )(Hattori, T. 等人, Plant Mol.Biol.14 : 595-604(1990))。 可操作地連接至嵌合基因構建體異源編碼區的種子 特異性基因的啟動子在轉基因植物中保持它們的時空表達模式。 這樣的實施例包括在擬南 芥屬和甘藍型油菜 (Brassica napus) 種子中表達腦啡肽的擬南芥 2S 種子儲藏蛋白基因啟 動子 (Vanderkerckhove 等人, Bio/Technology 7 : L929-932(1989))、 表達熒光素酶的菜豆
     凝集素和 β- 菜豆蛋白啟動子 (Riggs 等人, Plant Sci.63 : 47-57(1989)), 以及表達氯霉素 乙酰轉移酶的小麥谷蛋白啟動子 (Colot 等人, EMBO J.6 : 3559-3564(1987))。
     可誘導啟動子響應內源性或外源性刺激的存在, 例如, 通過化合物 ( 化學誘導 劑 ), 或響應環境、 激素、 化學信號和 / 或發育信號而選擇性表達可操作地連接的 DNA 序列。 可誘導的或受調控的啟動子包括 ( 例如 ) 受光、 熱、 脅迫、 水澇或干旱、 植物激素、 創傷或諸 如乙醇、 茉莉酮酸酯、 水楊酸或安全劑之類的化學品調控的啟動子。
     本發明使用的啟動子包括以下啟動子 : 1) 脅迫誘導型 RD29A 啟動子 (Kasuga 等 人, Nature Biotechnol.17 : 287-91(1999)) ; 2) 大 麥 啟 動 子 B22E ; B22E 的 表 達 是 發 育中的玉米籽粒中的柄所特異性的 (“Primary Structure of a Novel Barley Gene Differentially Expressed in Immature Aleurone Layers( 在未成熟糊粉層中差異表 達的新大麥基因的一級結構” , Klemsdal 等人, Mol.Gen.Genet.228(1/2) : 9-16(1991)) ; 以 及 3) 玉米啟動子 Zag2(“Identification and molecular characterization of ZAG1, the maize homolog of the Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUS(ZAG1- 擬南 芥屬花同源異形基因 AGAMOUS 的玉米同系物的鑒定和分子表征 )” , Schmidt 等人, Plant Cell 5(7) : 729-737(1993) “ ;Structural characterization, chromosomal localization and phylogenetic evaluation of two pairs of AGAMOUS-like MADS-box genes from maize” (“兩對來自玉米的 AGAMOUS 樣 MADS-box 基因的結構表征、 染色體定位及系統發育 評價 )” , Theissen 等人, Gene 156(2) : 155-166(1995) ; NCBI GenBank 登錄號 X80206))。 Zag2 轉錄物可在授粉前五天至授粉后天數 (“DAP” ) 七至八天被檢測到, 并且引導 Ciml 在 發育中的雌花序心皮中表達, Ciml 對發育中的玉米籽粒的籽仁而言是特異性的。Ciml 轉錄 物在授粉前四到五天至六到八 DAP 被檢測到。其他可用的啟動子包括可源自其表達與發育 中的雌小花母系相關的基因的任何啟動子。
     用于調控本發明的核苷酸序列在植物中表達的啟動子是莖特異性啟動子。這種 莖特異性啟動子包括苜蓿 S2A 啟動子 (GenBank 登錄號 : EF030816 ; Abrahams 等人, Plant Mol.Biol.27 : 513-528(1995)) 和 S2B 啟動子 (GenBank 登錄號 : EF030817) 等等, 將這些文 獻以引用的方式并入本文。
     啟動子可整體源于天然基因, 或者由源于天然存在的不同啟動子的不同元件構 成, 或者甚至可包含合成的 DNA 片段。
     用于本發明的啟動子可包括 : RIP2、 mLIP15、 ZmCOR1、 Rab17、 CaMV 35S、 RD29A、 B22E、 Zag2、 SAM 合成酶啟動子、 泛素啟動子、 CaMV 19S、 nos、 Adh、 蔗糖合成酶啟動子、 R- 等 位基因啟動子、 維管組織的其他啟動子 S2A(Genbank 登陸號 EF030816) 和 S2B(Genbank 登錄號 EF030817) 及來自玉米的組成型啟動子 GOS2。其他啟動子包括根啟動子, 例如玉 米 NAS2 啟動子、 玉米 Cyclo 啟動子 (US 公布 2006/0156439, 公開于 2006 年 7 月 13 日 )、 玉米 ROOTMET2 啟動子 (WO 2005/063998, 公開于 2005 年 7 月 14 日 )、 CR1BIO 啟動子 (WO 2006/055487, 公開于 2006 年 5 月 26 日 )、 CRWAQ81(WO 2005/035770, 公開于 2005 年 4 月 21 日 ) 和玉米 ZRP2.47 啟動子 (NCBI 登錄號 U38790 ; NCBI GI No.1063664)。
     本發明的重組 DNA 構建體 ( 及抑制 DNA 構建體 ) 也可包括其他調控序列, 包括但 不限于翻譯前導序列、 內含子和多腺苷酸化識別序列。 在本發明的另一個實施方案中, 本發 明的重組 DNA 構建體還包括增強子或沉默子。內含子序列可加至 5’ 非翻譯區、 蛋白編碼區或 3’ 非翻譯區以增加積聚在胞漿中 的成熟信息的量。已經顯示, 在植物和動物兩者的表達構建體的轉錄單位中包含可剪接內 含子可使基因表達在 mRNA 和蛋白質水平上均增強高達 1000 倍 (Buchman 和 Berg, Mol.Cell Biol.8 : 4395-4405(1988) ; Callis 等人, Genes Dev.1 : 1183-1200(1987))。
     任何植物都可以選擇用來鑒定將用于本發明重組 DNA 構建體的調控序列和基因。 適用于分離基因和調控序列的靶植物的實例應該包括但不限于苜蓿、 蘋果、 杏、 擬南芥屬植 物、 洋薊、 芝麻菜、 蘆筍、 鱷梨、 香蕉、 大麥、 豆類、 甜菜、 黑莓、 藍莓、 西蘭花、 抱子甘藍、 卷心 菜、 低芥酸菜籽、 香瓜、 胡蘿卜、 木薯、 蓖麻、 菜花、 芹菜、 櫻桃、 菊苣、 芫荽、 柑桔類、 克萊門氏 小柑橘類、 三葉草、 椰子、 咖啡、 玉米、 棉、 蔓越莓、 黃瓜、 花旗松、 茄子、 菊苣、 茅菜、 桉樹、 茴 香、 無花果、 大蒜、 葫蘆、 葡萄、 柚子樹、 白蘭瓜、 豆薯、 獼猴桃、 生菜、 韭蔥、 檸檬、 酸橙、 火炬 松、 亞麻子、 玉米、 芒果、 甜瓜、 蘑菇、 油桃、 堅果、 燕麥、 油棕、 油菜、 秋葵、 橄欖樹、 洋蔥、 橙、 觀 賞植物、 棕櫚、 木瓜樹、 歐芹、 歐洲防風草、 豌豆、 桃樹、 花生、 梨樹、 胡椒、 柿樹、 松樹、 菠蘿、 大 蕉、 李樹、 石榴樹、 白楊、 馬鈴薯、 南瓜、 溫柏、 輻射松、 紅菊苣、 蘿卜、 油菜、 樹莓、 稻、 黑麥、 高 粱、 南方松、 大豆、 菠菜、 南瓜、 草莓、 甜菜、 甘蔗、 向日葵、 甘薯、 楓香樹、 柑橘、 茶、 煙草、 蕃茄、 黑小麥、 草皮草、 蕪菁、 葡萄樹、 西瓜、 小麥、 薯蕷和西葫蘆。
     組合物
     本發明的組合物是其基因組中包含本發明的任何重組 DNA 構建體 ( 包括任何抑制 DNA 構建體 )( 例如上面所討論的任何一種其他構建體 ) 的植物。 組合物也包括任何植物的 子代, 以及獲取自植物或其子代的任何種子, 其中所述子代或種子在其基因組中包含重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 )。子代包括通過植物的自花授粉或異型雜交而獲得的連 續世代。子代也包括雜交種和近交系。
     在雜交種子繁殖的農作物中, 成熟的轉基因植物可自花授粉而產生純合的自交系 植物。該近交系植物產生含有新引入的重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的種子。這 些種子可以生長而產生將會表現出改變的農學特性 ( 如, 在氮限制條件下農學特性增加 ) 的植物, 或者可以用于育種程序以產生雜交種子, 這些雜交種子可以生長而產生將會表現 出如改變的農學特性的植物。所述種子可為玉米種子。
     植物可為單子葉植物或雙子葉植物, 例如玉米或大豆植物, 如玉米雜種植物或玉 米自交系植物。植物還可以是向日葵、 高梁、 低芥酸菜籽、 小麥、 苜蓿、 棉、 稻、 大麥、 小米、 甘 蔗、 或柳枝稷。
     重組 DNA 構建體可穩定地整合進植物的基因組中。
     具體實施方案包括但不限于下列的 :
     1. 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有 一種氨基酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%、 51%、 52%、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98%、 99%、 或 100%的序列同一性, 并且其中所述植物在與未包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出增加的氮脅迫耐受性。在與該對照植物比較時, 該植物還可表 現出至少一種農學特性的改變。
     2. 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 該重組 DNA 構 建體包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼包含 SNF2 結構域的多肽, 并且其中在與未包含所述重組 DNA 構建體的對照植物比較時, 所述植物表 現出增加的氮脅迫耐受性。在與該對照植物比較時, 該植物還可表現出至少一種農學特性 的改變。
     3. 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 該重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼包含 SNF2 結構域的多肽, 并且其中在與未包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時, 所述植 物表現出在氮限制條件下至少一種農學特性的改變。
     4. 在因組中包含重組 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 所述重組 DNA 構 建體包含可操作地連接到至少一種調控元件的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種 氨基酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99%、 或 100%的序列同一性, 并且其中所述植物在與未包含所述重組 DNA 構建體的對照植 物進行比較時表現出在氮限制條件下至少一種農學特性的改變。
     5. 在基因組中包含抑制 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 該抑制 DNA 構建體包含至少一種可操作地連接至源自受關注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部 分的區域的調控元件, 當與所述區域所來源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時, 基于 Clustal V 比對方法, 所述區域的核酸序列具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86%、 87%、 88 %、 89%、 90 %、 91%、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或 100 % 的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的多肽, 并且其中在與 未包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時, 所述植物表現出在氮限制條件下至少 一種農學特性的改變。
     6. 在基因組中包含抑制 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控元件, 該調控元件可操作地連接至以下序列的全部或部分 : (a) 編碼多肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%序列同一性 ; 或 (b)(a) 的核酸序列的全長互補序列, 并且其 中所述植物在氮限制條件下在與不包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出至少一種農學特性的改變。
     7. 上述實施方案 1-6 中的植物的任何子代、 上述實施方案 1-6 中的植物的任何種 子、 上述實施方案 1-6 中的植物的子代的任何種子以及來自上述實施方案 1-6 中的任何植 物以及它們的子代的細胞。
     在前述實施方案 1-7 的任一項中或本發明的任何其他實施方案中, 包含 SNF2 結構 域的多肽可來自擬南芥 (Arabidopsis thaliana)、 玉米 (Zea mays)、 大豆 (Glycine max)、 煙豆 (Glycine tabacina)、 野大豆 (Glycine soja) 或短絨野大豆 (Glycine tomentella)。
     在上述實施方案 1-7 或本發明的任一其他實施方案中的任一項中, 重組 DNA 構建 體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 可包含至少一種在植物中有功能的啟動子作為調控序列。
     在前述實施方案 1-7 中任一項或本發明的任何其他實施方案中, 所述至少一種農 學特性的改變是增加或減少。
     在前述實施方案 1-7 中任一項或本發明的任何其他實施方案中, 所述至少一種農 學特性可選自 : 綠度、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時的鮮重、 成熟時的干重、 果實產量、 種 子產量、 總植物含氮量、 果實含氮量、 種子含氮量、 營養組織含氮量、 總植物氨基酸含量、 營 養組織游離氨基酸含量、 果實游離氨基酸含量、 種子游離氨基酸含量、 總植物蛋白質含量、 果實蛋白質含量、 種子蛋白質含量、 營養組織蛋白質含量、 耐旱性、 氮攝取、 根倒伏抗性、 收 獲指數、 莖倒伏、 植株高度、 穗高、 穗長、 鹽耐受性、 早期幼苗活力、 和在低溫脅迫下的出苗。 例如, 至少一種農學特性的改變可為產量、 綠度或生物量的增加。 在前述實施方案 1-7 中任一項或本發明的任何其他實施方案中, 所述植物在與不 包含所述重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的對照植物在氮脅迫條件下進行比較時, 可表現出至少一種農學特性的改變。
     本領域的普通技術人員熟悉模擬氮條件 ( 限制性的或非限制性的 ) 的規程, 以及 用于評價已經經受過模擬的或天然存在的氮條件 ( 限制性的或非限制性的 ) 的植物的規 程。例如, 技術人員可通過向植物提供比正常需求更少的氮或在一定時期內不提供氮來模 擬氮條件, 并且技術人員可通過尋找農學特性的差異來評價此類植物, 例如在生理學和 / 或物理條件上的變化, 包括 ( 但不限于 ) 活力、 生長、 大小、 或根長、 或具體地講葉片顏色或 葉片面積大小。 用于評價此類植物的其他技術包括測量葉綠素熒光、 光合作用速率、 根生長 或換氣速率。
     下面的實施例描述了一些用于模擬氮限制條件和 / 或在此類條件下評價植物的 代表性規程和技術。
     技術人員也可通過植物在大田測試中, 在模擬的或天然存在的低氮或高氮條件 下保持足夠產量 ( 例如, 至少 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85%、 86%、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%、 或 100%的產量 ) 的能力 ( 例如通過測量在低氮或高氮條件下, 與標準氮條件下相比基本上等 同的產量, 或通過測量在低氮或高氮條件下與對照或參照植物相比更少的產量損失 ) 來評 價氮脅迫耐受性。
     在評估或測量其中利用了對照或參照植物的本發明任何實施方案 ( 例如, 如本文 描述的組合物或方法 ) 中的轉基因植物的農學特性或表型時, 本領域的普通技術人員將很 容易認識到要利用的合適對照植物。例如, 通過如下非限制性示例來說明 :
     1. 轉化過的植物的子代, 該轉化過的植物對于重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建 體 ) 來說是半合子的, 使得該子代分離成包含或不包含該 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的植株 : 包含該重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的子代將通常相對于不包含該重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的子代來進行測量 ( 即, 不包含該重組 DNA 構建體 ( 或抑 制 DNA 構建體 ) 的子代是對照或參照植株 )。
     2. 重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 基因滲入至近交系中, 例如在玉米中, 或 基因滲入進變種中, 例如在大豆中 : 基因滲入品系將通常相對于親本近交系或變種品系進 行測量 ( 即, 親本近交系或品種品系是對照或參照植物 )。
     3. 雙雜交系, 其中第一雜交系由兩個親本近交系產生, 而第二雜交系由相同的兩 個親本近交系產生, 不同的是其中一個親本近交系含有重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建 體): 第二雜交系通常將相對于第一雜交系進行測量 ( 即第一雜交系為對照植物或參照植 物 )。
     4. 包含重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的植株 : 該植株可以相對于這樣 的對照植株進行評估或測量, 該對照植株不包含重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ), 但具有與該植株相當的遺傳背景 ( 例如, 與包含重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的 植株相比較, 核遺傳物質具有至少 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99%或 100%的序列同一性 )。存在許多可用于分析、 比較和表征植物遺傳背景的基于實 驗室的技術 ; 其中這些技術是同工酶電泳、 限制性片段長度多態性 (RFLP)、 隨機擴增多態 性 DNA(RAPD)、 任何引物聚合成酶鏈反應 (AP-PCR)、 DNA 擴增指紋 (DAF)、 序列特異擴增區域 (SCAR)、 擴增片段長度多態性 (AFLP ) 和也稱為微衛星的簡單序列重復 (SSR)。 此外, 本領域的普通技術人員將容易認識到, 評估或測量轉基因植物的農學特性 或表型時合適的對照或參照植物將不包括先前已經針對所需的農學特性或表型, 通過誘變 或轉化而選擇的植物。
     方法
     方法包括但不限于用于提高植物氮脅迫耐受性的方法、 用于評價植物氮脅迫耐受 性的方法、 用于改變植物農學特性的方法、 用于測定植物農學特性改變的方法、 和用于制備 種子的方法。所述植物可為單子葉或雙子葉植物, 例如玉米或大豆植物。植物還可以是向 日葵、 高梁、 低芥酸菜籽、 小麥、 苜蓿、 棉、 稻、 大麥、 小米、 或甘蔗。所述種子可為玉米或大豆 種子, 例如玉米雜交種子或玉米自交系種子。
     方法包括但不限于如下方法 :
     轉化細胞的方法包括用本發明的任何分離的多核苷酸轉化細胞。 也包括通過這種 方法轉化的細胞。 在具體實施方案中, 所述細胞是真核細胞, 例如酵母、 昆蟲或植物細胞, 或 原核細胞, 例如細菌細胞。
     生產轉基因植物的方法, 所述方法包括用本發明的任何分離的多核苷酸或重組 DNA 構建體 ( 包括抑制 DNA 構建體 ) 來轉化植物細胞并從轉化的植物細胞中再生轉基因植 物。 本發明也涉及由該方法制備的轉基因植物, 以及從該轉基因植物中獲取的轉基因種子。 通過該方法獲取的轉基因植物可被用于本發明的其他方法中。
     用于從細胞或細胞培養基中分離本發明多肽的方法, 其中所述細胞包含具有本發 明多核苷酸的重組 DNA 構建體, 所述多核苷酸可操作地連接到至少一個調控序列, 并且其
     中轉化的宿主細胞在適于重組 DNA 構建體表達的條件下生長。
     改變宿主細胞中本發明多肽表達水平的方法, 所述方法包括 : (a) 用本發明的重 組 DNA 構建體轉化宿主細胞 ; 以及 (b) 在適于表達所述重組 DNA 構建體的條件下培養轉化 過的細胞, 其中重組 DNA 構建體的表達導致轉化過的宿主細胞中的本發明多肽含量改變。
     提高植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 將重組 DNA 構建體引入到可再 生的植物細胞中, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列 ( 例如在植 物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的, 所述 氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%的序列 同一性 ; 和 (b) 在步驟 (a) 之后, 從所述可再生的植物細胞再生出轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體并且在與不包含該重組 DNA 構建體的對照 植物進行比較時表現出提高的氮脅迫耐受性。所述方法可進一步包括 (c) 獲取源自該轉基 因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體并且在與未包含 該重組 DNA 構建體的對照植物比較時表現出增加的氮脅迫耐受性。
     提高植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 將抑制 DNA 構建體引入到可再 生的植物細胞中, 該抑制 DNA 構建體包含可操作地連接至少一種調控序列 ( 例如在植物中 有功能的啟動子 ) 的以下序列的全部或部分 : (i) 編碼多肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸 序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57%、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%的序列同一 性, 或 (ii)(a)(i) 的核酸序列的全長互補序列 ; 以及 (b) 在步驟 (a) 之后, 從該可再生的植 物細胞再生出轉基因植物, 其中該轉基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 并且在 與不包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出增加的氮脅迫耐受性。所述方 法可進一步包括 (c) 獲取源自該轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中 包含抑制 DNA 構建體并且在與未包含該抑制 DNA 構建體的對照植物比較時表現出增加的氮 脅迫耐受性。
     提高植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 將抑制 DNA 構建體引入到可再 生的植物細胞中, 該抑制 DNA 構建體包含可操作地連接源自受關注靶基因有義鏈或反義鏈 的全部或部分區域的至少一種調控序列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 所述區域的核 酸序列基于 Clustal V 比對方法在與所述區域所來源的有義鏈或反義鏈的全部或部分進 行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57%、 58%、 59%、 60%、 61%、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的多肽 ; 以及 (b) 在步驟 (a) 之后, 從所述可再生的植物細 胞再生出轉基因植物, 其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構建體并且在 與不包含該抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出增加的氮脅迫耐受性。所述方法 可進一步包括 (c) 獲取源自該轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包 含抑制 DNA 構建體并且在與未包含該抑制 DNA 構建體的對照植物比較時表現出增加的氮脅 迫耐受性。
     評價植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含重組 DNA 構建體, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少 一種調控序列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有 一種氨基酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%、 51%、 52%、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98%、 99%或 100%的序列同一性 ; (b) 獲取來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述 子代植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體 ; 以及 (c) 評價所述子代植物在與不包含 所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時的氮脅迫耐受性。
     評價植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控序 列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 其可操作地連接以下序列的全部或部分 : (i) 編碼多 肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或 100 %的序列同一性 ; 或 (ii)(a)(i) 的核酸序列的全長互補序列 ; (b) 獲取來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構建體 ; 以及 (c) 評價所述子代植物在與不包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行 比較時的氮脅迫耐受性。
     評價植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控序 列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 其可操作地連接源自受關注靶基因有義鏈或反義鏈 的全部或部分區域, 所述區域的核酸序列基于 Clustal V 比對方法在與所述區域所來源的 有義鏈或反義鏈的全部或部分進行比較時, 具有至少 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 或 100% 的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的多肽 ; (b) 獲取來源 于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構建體; 以及 (c) 評價所述子代植物在與不包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時的 氮脅迫耐受性。
     測定植物農學特性改變的方法, 所述方法包括 (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含重組 DNA 構建體, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少 一種調控序列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有 一種氨基酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%、 51%、 52%、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98%、 99%或 100%的序列同一性 ; (b) 獲取來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述 子代植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體 ; 以及 (c) 測定所述子代植物任選地在氮 限制條件下與不包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時是否表現出至少一種農 學特性的改變。
     測定植物農學特性改變的方法, 所述方法包括 (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控序 列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 其可操作地連接以下序列的全部或部分 : (i) 編碼多 肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97%、 98%、 99%或 100%的序列同一性 ; 或 (ii)(i) 的核酸序列的全長互補序列 ; (b) 獲取 來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構 建體 ; 以及 (c) 測定所述子代植物任選地在氮限制條件下與不包含所述抑制 DNA 構建體的 對照植物進行比較時是否表現出至少一種農學特性的改變。
     測定植物農學特性改變的方法, 所述方法包括 (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控序列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 其可操作地連接源自受關注靶基因有義鏈或反義鏈的 全部或部分的區域, 所述區域的核酸序列基于 Clustal V 比對方法在與所述區域所來源的 有義鏈或反義鏈的全部或部分進行比較時, 具有至少 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 或 100% 的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的多肽 ; (b) 獲取來源 于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構建 體; 以及 (c) 測定所述子代植物任選地在氮限制條件下與不包含所述抑制 DNA 構建體的對 照植物進行比較時是否表現出至少一種農學特性的改變。
     產生種子 ( 例如可作為提供氮脅迫耐受性的產品銷售的種子 ) 的方法, 該方法包括任一上述的方法, 并且還包括從所述子代植物獲取種子, 其中所述種子在其基因組中包 含所述重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 )。
     在任何前述方法或本發明的方法的任何其他實施方案中, 在所述導入步驟中所述 可再生的植物細胞可包括愈傷組織細胞、 胚胎愈傷組織細胞、 配子細胞、 分生細胞或未成熟 胚芽細胞。可再生的植物細胞可來自近交系玉米植物。
     在任一前述方法或本發明方法的任一其他實施方案中, 所述再生步驟可包括 : (i) 在包含促胚發生激素的培養基中培養所述轉化的植物細胞, 直至觀察到愈傷組織 ; (ii) 將 步驟 (i) 的所述轉化植物細胞轉移到第一培養基中, 所述培養基包括促組織形成激素 ; 以 及 (iii) 在第二培養基上傳代培養步驟 (ii) 后的所述轉化的植物細胞, 以允許嫩芽伸長、 根發育或這兩者同時發生。
     在任何前述方法或本發明的方法的任何其他實施方案中, 所述至少一種農學特性 可選自 : 綠度、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時的鮮重、 成熟時的干重、 果實產量、 種子產量、 總植物含氮量、 果實含氮量、 種子含氮量、 營養組織含氮量、 總植物氨基酸含量、 營養組織游 離氨基酸含量、 果實游離氨基酸含量、 種子游離氨基酸含量、 總植物蛋白質含量、 果實蛋白 質含量、 種子蛋白質含量、 營養組織蛋白質含量、 耐旱性、 氮攝取、 根倒伏抗性、 收獲指數、 莖 倒伏、 植株高度、 穗高、 穗長、 鹽耐受性、 早期幼苗活力、 和在低溫脅迫下的出苗。 至少一種農 學特性的改變可為產量、 綠度或生物量的增加。 在任一上述方法或本發明的任一方法中, 在與不包含所述重組 DNA 構建體 ( 或抑 制 DNA 構建體 ) 的對照植物在氮限制條件下進行比較時, 植物可表現出至少一種農學特性 的改變。
     在任一前述方法或本發明方法的任何其他實施方案中, 存在供選擇的替代方案用 于將包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸的重組 DNA 構建體導入可再生的 植物細胞中。例如, 可將調控序列 ( 例如一種或多種增強子, 例如, 作為轉座因子的部件 ) 導入可再生的植物細胞, 然后篩選其中將所述調控序列可操作地連接至編碼本發明的多肽 的內源基因的事件。
     將本發明的重組 DNA 構建體引入植物可通過任何合適的技術來進行, 這些技 術包括但不限于 DNA 直接攝取、 化學處理、 電穿孔、 顯微注射、 細胞融合、 感染、 載體介導 的 DNA 轉移、 轟擊或農桿菌屬介導的轉化。植物轉化和再生技術已經在國際專利公布 WO 2009/006276 中進行了描述, 其內容以引用方式并入本文。
     含有編碼受關注蛋白質的外來的外源性分離核酸片段的植物的發育或再生是本 領域所熟知的。可將再生的植物進行自花授粉以產生純合的轉基因植物。或者, 將得自再 生植物的花粉與農學上重要的品系的產生種子的植株進行雜交。相反, 將來自這些重要品 系植物的花粉用于給再生植物授粉。 利用本領域技術人員所熟知的方法培育含有所需多肽 的本發明的轉基因植物。
    實施例 本發明將在下面的實施例中進一步說明, 其中份數和百分比是以重量計并且度數 是攝氏度, 除非另外說明。應該理解, 盡管這些實施例說明了本發明的實施方案, 但僅是以 例證的方式給出的。根據上面的論述和這些實施例, 本領域的技術人員可以確定本發明的
     基本特征, 并在不脫離本發明的精神和范圍的情況下, 可對本發明做出多種改變和修改, 以 使其適用于多種用法和條件。此外, 除了那些本文所示和描述的那些之外, 根據前文所述, 本發明的各種修改形式對本領域的技術人員來說將是顯而易見的。 這些修改形式也旨在涵 蓋于所附權利要求書的范圍內。
     實施例 1
     制備具有激活標記基因的擬南芥種群
     構建 18.49kb 的 T-DNA 基二元構建體, pHSbarENDs2(SEQ ID NO : 1; 圖 1) 包含四 個來源于花椰菜花葉病毒 35S 啟動子的四個多聚增強子元件 ( 對應于序列 -341 至 -64, 如 Odell 等人 Nature 313 : 810-812 所述 (1985))。該構建體也包含允許質粒救援的載體序列 (pUC9) 和多接頭 (SEQ ID NO : 11)、 再動員 T-DNA 的轉座子序列 (Ds)、 以及允許草胺磷選擇 轉基因植物的 bar 基因。原則上, 僅將從右邊界 (RB) 至左邊界 (LB) 包含的 10.8kb 片段轉 移到寄主植物基因組中。因為增強子元件位于靠近 RB 處, 它們可誘導 T-DNA 整合后的基因 組位點順式激活。
     通過整個植株的農桿菌屬轉化制備擬南芥屬激活標記種群。將 pHSbarENDs2 構建 體轉化到根癌農桿菌菌株 C58 中, 在 25℃下在溶菌肉湯培養基中培養至 OD600 ~ 1.0。然 后離心沉淀細胞, 并重懸在相等體積的 5%蔗糖 /0.05% Silwet L-77(OSI Specialties, Inc) 中。在早期抽薹時, 培育擬南芥生態型 Col-0 的土壤使用農桿菌屬懸浮液進行頂部灌 溉。 一周后, 相同植株再次用在蔗糖 /Silwet 中的相同農桿菌屬菌株進行頂部灌溉。 然后將 該植物的種子設為標準。所得 T1 種子在土壤中播種, 通過噴灑草胺磷 (FINALE ; AgrEvo ; Bayer Environmental Science) 選擇轉基因幼苗。選擇了總計 100,000 個草胺磷抗性 T1 幼苗。分開保存來自每個品系的 T2 種子。
     實施例 2
     篩選以鑒定具有低氮耐受性的品系
     來 自 每 個 100,000 個 分 離 T1 激 活 標 記 品 系 的 十 一 個 T2 植 物 可 種 植 在 方 板 (15mm×15mm) 上, 方板包含 0.5x N-Free Hoagland’ s, 0.4mM 硝酸鉀, 0.1%蔗糖, 1mM MES TM 和 0.25% Phyytagel ( 低氮培養基 )。 每個板種植五個品系, 并且每個板包括 9 個野生型個 體以使總計 64 個個體排列成 8×8 的網格圖案 ( 參見圖 12)。在暗處、 4℃條件下保持平板 三天以使種子分層, 然后在 22℃光照和 20℃黑暗交替條件下水平放置九天。光周期為十六 小時光照和八小時黑暗, 平均光照強度為~ 200mmol/m2/s。每天旋轉并振動每個架子中的 平板。在第十二天 ( 生長九天 ), 對整個板拍照以評價幼苗狀態。
     在掩蔽該平板圖像以去除背景顏色后, 每個個體收集兩個不同的測量數據 : 總羅 賽塔面積和進入綠色區的顏色百分比。使用色調、 飽和度和強度數據 (HSI), 綠色區由色調 50 至 66 組成。 總羅賽塔面積用作植物生物量的量度, 而綠色區通過劑量 - 響應研究已經顯 示指示氮同化作用 ( 參見圖 13)。
     將在與野生型對照植物進行比較時具有顯著的總羅賽塔面積和 / 或綠色區增加 的品系命名為 Phase 1 hits。在相同分析條件下進行 Phase 1hits 的重復試樣再篩選 (Phase 2 篩選 )。還通過 Phase 3 篩選以進一步驗證通過 Phases 1 和 2 的突變體。在 Phase 3 中, 將每個品系分開種植在低氮培養基中, 使得 32 個 T2 個體緊鄰著 32 個野生型個 體生長, 為分析提供更高的統計學嚴謹性。如果一個品系顯示與 Phase 3 中對照的顯著差異, 然后可認為該品系是經驗證的氮缺乏抗性品系。
     實施例 3
     鑒定激活標記基因
     在氮耐受性品系中側接 T-DNA 插入序列的基因使用以下兩個標準程序中的一個 或兩個進行鑒定 : (1) 熱不對稱交錯 (TAIL)PCR(Liu 等人, Plant J.8 : 457-63(1995)) ; 以及 (2)SAIFF PCR(Siebert 等人, Nucleic Acids Res.23 : 1087-1088(1995))。至于復雜的多 聚 T-DNA 插入序列, TAIL PCR 和 SAIFF PCR 可能均不足以鑒定候選基因。在這些情況下, 可使用包括反式 PCR、 質粒拯救和 / 或基因組文庫構建在內的其他程序。
     成功的結果是其中單個 TAIL 或 SAIFF PCR 片段包含 T-DNA 邊界序列和擬南芥屬 基因組序列。一旦獲取側接 T-DNA 插入序列的基因組序列標記, 通過與公開可用的擬南芥 屬基因組的序列比對來鑒定候選基因。具體地講, 最靠近 35S 增強子元件 /T-DNA RB 的注 釋基因是激活的基因的候選基因。
     為了驗證鑒定的基因真的靠近 T-DNA 并排除 TAIL/SAIFF 片段是嵌合偽克隆的可 能性, 用一個 T-DNA 中的寡核苷酸和一個候選基因特異性的寡核苷酸進行對基因組 DNA 的 診斷 PCR。將提供 PCR 產品的基因組 DNA 樣本理解為表示 T-DNA 插入序列。該分析也驗證 了其中一種以上的插入事件發生在相同品系中的情況, 例如, 在 TAIL 和 / 或 SAIFF PCR 分 析中鑒定是否有多個不同基因組片段。
     實施例 4
     鑒定編碼包含 SNF2 結構域的多肽的激活標記基因
     進一步分析了顯示出氮缺乏耐受性的激活標記品系 ( 品系 112579)。提取來自該 品系的 DNA, 并且在突變品系中側接 T-DNA 插入序列的基因通過連接介導 PCR(Siebert 等 人, Nucleic Acids Res.23 : 1087-1088(1995)) 進行鑒定。鑒定一個單獨擴增的片段, 它包 含 T-DNA 邊界序列和擬南芥屬基因組序列。一旦獲取側接 T-DNA 插入序列的基因組序列標 記, 通過與完全擬南芥屬基因組的序列比對鑒定候選基因。具體地講, 最靠近 35S 增強子元 件 /T-DNA RB 的注釋基因是品系中激活的基因的候選基因。就品系 112579 而言, 最靠近 35S 增強子的基因是 At1g61140, 它編碼擬南芥包含 SNF2 結構域的多肽。
     實施例 5
     通過轉化擬南芥屬驗證候選的擬南芥基因 (At1g61140)
     可將候選基因轉化到擬南芥屬中并在 35S 啟動子作用下過表達。如果在轉基因品 系中觀察到與親本激活標記品系相同或相似的表型, 則將該候選基因認為是擬南芥屬中驗 證過的 “前導基因” 。
     候選擬南芥屬基因 (At1g61140) 編碼包含 SNF2 結構域的多肽, 用以下方法測試其 賦予氮缺乏耐受性的能力。設計引物以擴增突變體 At1g61140.1。
     通過 RT-PCR, 用以下引物擴增 At1g61140.1cDNA(SEQ ID NO : 24) :
     1.At1g61140-5’ attB 正向引物 (SEQ ID NO : 33)
     正向引物包含 attB1 序列 (ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT ; SEQ ID NO : 12) 和共有 的 Kozak 序列 (CAACA) 蛋白編碼區上游的前 21 個核苷酸 ( 以所述 cDNA 的 ATG 起始密碼子 開頭 )。
     2.At1g61140-3’ attB 反向引物 (SEQ ID NO : 34)。反向引物包含 attB2 序列 (ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT ; SEQ ID NO : 13), 該序列 鄰近蛋白編碼區的反向互補序列的后 21 個核苷酸 ( 以所述 cDNA 的終止密碼子的反向互補 序列開頭 )。
     使用 INVITROGENTM GATEWAY CLONASETM 技術, 用 pDONRTMZeo(SEQ ID NO : 2; 圖 2) 對每個 RT-PCR 產物進行了 BP 重組反應。這種方法將細菌致死 ccdB 基因以及氯霉素抗性 基因 (CAM) 從 pDONRTMZeo 移除并定向地克隆了該在旁側具有 attB1 和 attB2 位點的 PCR 產 物而得到入門克隆 (entry clone)。鑒定為陽性的入門克隆與一個目的載體一起被用于隨 后的 LR 重組反應, 如下所述。
     用緊接 INVITROGENTMGATEWAY C1 轉化插入序列上游的 1.3-kb35S 啟動子構建 稱為 pBC-yellow(SEQ ID NO : 4; 圖 4) 的基于 16.8-kbT-DNA 的二元載體 ( 目的載體 ), 所述插入序列包含 ccdB 細菌致死基因以及側接 attR1 和 attR2 序列的氯霉素抗性基因 (CAM)。該載體還包含 RD29a 啟動子, 該啟動子驅動基因表達 ZS-Yellow(INVITROGENTM), 它 TM 賦予轉化過的種子黃色熒光。使用 INVITROGEN GATEWAY 技術, 對包含核苷酸編碼序列 At1g61140.1(SEQ ID NO : 24) 和 pBC-yellow 載體的入門克隆進行 LR 重組反應 ; 然而, 也可 使用任一種其他突變體 (SEQ ID NO : 26 和 28)。該擴增允許迅速地定向克隆在 pBC-yellow 中的 35S 啟動子之后的 At1g61140.1(SNF2.1 ; SEQ ID NO : 24)。 申請人然后使用如實施例 1 所述的相同農桿菌介導的轉化程序將 35S 啟動子 : At1g61140 表達構建體導入野生型擬南芥屬生態型 Col-0 中。 轉基因 T1 種子通過黃色熒光 進行選擇, 并且將 32 個這些 T1 種子緊鄰著 32 個野生型擬南芥屬生態型 Col-0 種子種植在 低氮培養基上。所有隨后的生長和拍照條件均如實施例 1 所述。發現來自激活標記的、 對 氮限制條件具有耐受性的初始表型, 可在用其中 At1g61140 基因通過 35S 啟動子直接表達 的構建體轉化過的野生型擬南芥屬植物中重現。
     實施例 6a
     cDNA 文庫的制備和 cDNA 克隆的分離和測序
     cDNA 文庫可通過許多可用的方法中的任一種制備。例如, 通過首先根據生產商的 說明書 (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) 制備 Uni-ZAPTMXR 載體中的 cDNA 文 庫, 可將 cDNA 引入質粒載體中。 根據 Stratagene 提供的說明書, 將 Uni-ZAPTMXR 文庫轉換成 質粒文庫。當轉換的時候, 將把 cDNA 插入序列包含于質粒載體 pBLUESCRIPT 中。此外, 可
    使用 T4 連接酶 (New England Biolabs) 將 cDNA 直接導入預切過的 BLUESCRIPT II SK(+) 載體 (Stratagene) 中, 隨后按照制造商規程 (GIBCO BRL Products) 轉染 DH10B 細胞。一 旦 cDNA 插入序列處于質粒載體中, 從隨機選取的含重組 pBLUESCRIPT 質粒的細菌菌落制 備質粒 DNA, 或者用對插入的 cDNA 序列旁側的載體序列特異性的引物, 通過聚合酶鏈式反 應擴增插入的 cDNA 序列。將擴增的 DNA 插入序列或質粒 DNA 在染料 - 引物標記法測序反 應 (dye-primer sequencing reaction) 中進行測序, 以產生部分 cDNA 序列 ( 表達序列標 記或 “EST” ; 參見 Adams 等人, Science 252 : 1651-1656(1991))。用 Perkin Elmer Model 377 熒光測序儀分析所得的 EST。
     用改進的轉座規程產生全長插入序列 (FIS) 數據。從歸檔的甘油原種作為單一菌 落回收確定了 FIS 的克隆, 并通過堿性裂解分離質粒 DNA。將分離的 DNA 模板在基于 PCR 的 測序反應中與載體引物 M13 正向和反向寡核苷酸反應并上樣至自動化的測序儀上。通過與對其進行 FIS 查詢的初始 EST 序列進行序列比對來確認克隆鑒定。
     將確認的模板通過基于釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)Ty1 轉座因子 (Devine 和 Boeke, Nucleic Acids Res.22 : 3765-3772(1994)) 的 Primer Island 轉座試劑 盒 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) 進行轉座。該體外轉座系統在整個一組大 DNA 分子中隨機地放入獨特的結合位點。隨后將轉座的 DNA 用于通過電穿孔轉化 DH10B 電 感受態細胞 (GIBCO BRL/Life Technologies, Rockville, MD)。轉座因子含有另外的可選 標記 ( 稱為 DHFR ; Fling 和 Richards, Nucleic Acids Res.11 : 5147-5158(1983)), 使得能 在瓊脂平板上僅雙重篩選含有整合的轉座子的那些亞克隆。 從每次轉座反應隨機地選擇多 個亞克隆, 通過堿性裂解制備質粒 DNA, 并用對轉座子內的結合位點特異性的獨特引物從轉 座事件位點向外進行測序 (ABI PRISM dyeterminator ReadyReaction mix)。
     收 集 序 列 數 據 (ABI PRISM Collections) 并 用 Phred 和 Phrap(Ewing 等 人, Genome Res.8 : 175-185(1998) ; Ewing 等人, Genome Res.8 : 186-194(1998)) 組裝。Phred 是一種公用軟件程序, 該程序再次讀取 ABI 序列數據, 再次調出 (recall) 堿基, 賦質量值, 并將堿基序列 (base call) 和質量值寫入可編輯的輸出文件中。Phrap 序列組裝程序使用 這些質量值來增加組裝的序列重疊群的準確度。通過 Consed 序列編輯器 (Gordon 等人, Genome Res.8 : 195-202(1998))。
     在一些克隆中, cDNA 片段對應基因的 3’ 端的一部分并且不會涵蓋整個開放閱讀 框。為了獲取上游信息, 使用兩種不同規程中的一種。這兩種方法中的第一種方法導致產 生含有所需基因序列的部分的 DNA 片段, 而第二種方法導致產生含有整個開放閱讀框的片 段。這兩種方法均使用兩輪 PCR 擴增以從一個或多個文庫獲取片段。有時基于以前的知識 ( 特定的基因應該存在于某些組織中 ) 選擇文庫, 有時則進行隨機地選擇。 獲取相同基因的 反應可平行地在若干文庫中進行, 或者在文庫池中進行。文庫池通常用 3 至 5 個不同的文 庫制備并且使其歸一化而成為一致的稀釋度。在第一輪擴增中, 兩種方法均使用載體特異 性的 ( 正向 ) 引物, 同時還使用基因特異性的 ( 反向 ) 引物, 該正向引物對應位于克隆 5’ 端處的載體的一部分。第一種方法使用與已知基因序列的一部分互補的序列, 而第二種方 法使用與 3’ 非翻譯區 ( 也稱為 UTR) 的一部分互補的基因特異性引物。在第二輪擴增中, 兩種方法均使用套式引物組。按照生產商的說明書, 用市售試劑盒將所得 DNA 片段連接進 pBLUESCRIPT 載體中。該試劑盒選自可得自包括 INVITROGENTM(Carlsbad, CA)、 Promega Biotech(Madison, WI) 和 Gibco-BRL(Gaithersburg, MD) 在內的一些供應商的許多試劑盒。 如上所述, 將質粒 DNA 通過堿性裂解方法分離并進行測序和用 Phred/Phrap 進行裝配。
     實施例 6B
     制備 cDNA 文庫并獲取序列
     可利用用于總 RNA 分離的 Qiagen RNA 分離試劑盒分離 mRNA, 然后通過吸附到 Invitrogen(Life Technologies, Carlsbad, CA) 的 oligo(dT)Dynabeads 上分離 mRNA, 并且 測序文庫能夠使用 Illumina, Inc.(SanDiego, CA) 的標準 mRNA-Seq 試劑盒和規程進行制 備。在這一方法中, 使用 ZnCl2 溶液破壞 mRNA, 使用隨機引物將其反轉錄成 cDNA, 進行末端 修復以制備鈍末端片段, 3’ A- 尾化, 并且用 Illumina 雙末端文庫接頭進行連接。然后可使 用 Illumina 雙末端文庫引物對連接好的 cDNA 片段進行 PCR 擴增, 并且能夠在用配有雙末 端模塊的 Genome Analyzer II 測序前使用 Agilent Bioanalyzer DNA 1000 芯片檢查純化PCR 產物的質量和數量。
     測序運行中的讀數可在組合之前進行軟修剪以使觀察到具有低于 15 的 FASTQ 質 量評分的每個讀數的首個堿基對和后面所有堿基對通過 Python Script 進行修剪。Velvet 裝 配 器 (Zerbino 等 人, Genome Research18 : 821-9(2008)) 能 在 不 同 kmer 和 覆 蓋 截 斷 (coverage cutoff) 參數下運行以制備某一嚴格性范圍內的若干個推定裝配物。能夠使用 Vmatch 軟件 ( 在 Vmatch 網站上可用 ) 將在那些裝配物內的鄰接序列 ( 重疊群 ) 組合成組 使得被鑒定為較長重疊群亞組的重疊群分組并被排除, 留下最長 “sentinel” 重疊群的非冗 余組。這些非冗余組能用于與來自已知模型植物種類的同源序列進行比對。
     如果重疊群不提供完整基因, 能夠經由 Blast 或 Perl Script, 使用在第一次搜索 中發現的序列對非冗余組進行再查詢。如果發現了延伸所述重疊群末端的序列, 它們能夠 用桌面裝配器如 DNAStar′ s SeqMan 或 GeneCode′ s Sequencher 與初始序列一起進行裝 配。可重復這些步驟直至不再發現更多的延伸序列。就仍不完整的轉錄物而言, 理論上屬 于一類 ( 基于與其他草本植物的同源性 ) 的基因片段能用來自另一種草本植物的連接序列 進行人工連接。
     實施例 7 鑒定 cDNA 序列
     編碼包含 SNF2 結構域的多肽的 cDNA 序列通過 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool ; Altschul 等人, J.Mol.Biol.215 : 403-410(1993) ; 還可參見國立衛生研究院 國家醫學圖書館的國家生物技術信息中心的萬維網址上對 BLAST 算法的解釋 ) 進行鑒定, 尋找與 BLAST“nr” 數據庫中所包含氨基酸序列 ( 包括所有非冗余 GenBank CDS 翻譯序列、 源自 3 維結構 Brookhaven 蛋白質數據庫 (Protein Data Bank)、 SWISSPROT 蛋白質序列數 據庫的最新的主要版本、 EMBL 和 DDBJ 數據庫的序列 ) 的相似性。在所有的閱讀框中翻譯 DNA 序列并用 NCBI 提供的 BLASTX 算法 (Gish 和 States, Nat.Genet.3 : 266-272(1993)) 比 較與包含在 “nr” 數據庫中的所有可公開獲取的氨基酸序列的相似性。采用國家生物技術 信息中心 (NCBI) 提供的 BLASTP 算法, 分析 cDNA 序列編碼的多肽與包含在 “nr” 數據庫中 的所有可公開獲取的氨基酸序列的相似性。為方便起見, 通過 BLAST 計算僅僅偶然觀察到 cDNA 序列與所搜索的數據庫中所包含序列的匹配的 P 值 ( 概率 ) 或 E 值 ( 期望值 ), 在本 文報導為 “pLog” 值, 它代表所報導的 P 值或 E 值的負對數。因此, pLog 值越大, cDNA 編碼 的序列和 BLAST 的 “匹配” 代表同源蛋白的可能性就越大。
     EST 序 列 可 與 如 上 所 述 的 Genbank 數 據 庫 進 行 比 較。 通 過 使 用 BLASTN 算 法 (Altschul 等人, Nucleic Acids Res.25 : 3389-3402(1997)) 對杜邦專利數據庫比較具有序 列同源共有區域或重疊區域的核苷酸序列, 可找到含更 5′端或 3′端序列的 EST。在兩個 或更多個核酸片段之間存在共有或重疊序列時, 該序列可裝配成單一的連續核苷酸序列, 從而使最初的片段在 5′或 3′初始方向上延伸。一旦確定了最 5′的 EST, 即能通過全長 插入序列來確定其完整的序列。
     可用 tBLASTn 算法, 通過將已知基因 ( 來自專有來源或公開數據庫的已知基因 ) 的氨基酸序列對 EST 數據庫進行比較, 可找到屬于不同物種的同源基因。 tBLASTn 算法對所 有 6 個閱讀框都翻譯了的核苷酸數據庫進行氨基酸查詢的搜索。該搜索允許不同物種之間 的核苷酸密碼子使用的差異, 并且允許密碼子簡并。
     實施例 8a
     表征編碼編碼包含 SNF2 結構域的多肽的 cDNA 序列
     制備提供來自玉米 (Zea mays)、 畫眉草 (Eragrostis nindensis)(Resurrection grass)、 和百喜草 (Paspalum notatum)(Bahiagrass) 不同組織的 mRNA 的 cDNA 文庫。下面 描述了該文庫的特征。
     表2
     來自玉米的 cDNA 文庫
    如 表 3、 圖 16A-AM 和 圖 17 所 示, 表 2 中 鑒 定 的 cDNA 編 碼 類 似 于 以 下 多 肽 的 多肽: 來 自 擬 南 芥 (At1g61140.1(GI No.186492170 ; SEQ ID NO : 25) ; At1g61140.2(GI No.186492172 ; SEQ ID NO : 27) ; 和 At1g61140.3(GI No.186492175 ; SEQ ID NO : 29)) 的 包 含 SNF2 結 構 域 的 多 肽、 和 來 自 水 稻 (GI No.53792213, 對 應 于 SEQ ID NO : 30, GI No.218200575, 對應于 SEQ ID NO : 31, 以及 GI No.90399293, 對應于 SEQ ID NO : 32) 以及高 粱 (GI No.242058897, 對應于 SEQ ID NO : 49) 的包含 SNF2 結構域的多肽。
     表 3( 非專利文獻 ) 和表 4( 專利文獻 ) 中所示的分別是單獨的 EST( “EST” )BLASTP 結果、 包含標明的 cDNA 克隆的整個 cDNA 插入物的序列 ( “FIS” )、 由兩個或更多個 EST、 FIS 或 PCR 序列裝配而成的重疊群序列 (“Contig” )、 或編碼源自 FIS 或重疊群的完整蛋白或 功能性蛋白的序列 (“CGS” )。表 3 和表 4 也顯示了使用 Clustal V 比對方法、 使用默認參 數計算的每對氨基酸序列的序列同一性百分比值 ( 如下所述 )。
     表3
     多肽的 BLASTP 結果
     包含 SNF2 結構域的多肽的同源物
    
    
    
    
    表4 多肽的 BLASTP 結果 包含 SNF2 結構域的多肽的同源物實施例 8b
     鑒定其他包含 SNF2 結構域的多肽
     與 編 碼 包 含 SNF2 結 構 域 的 蛋 白 的 前 導 基 因 同 源 的 序 列 可 使 用 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool ; Altschul 等 人, J.Mol.Biol.215 : 403-410(1993) ; 也參 見美國國家衛生研究院 (National Institutes of Health) 國立醫學圖書館 (National Library of Medicine) 的國家生物技術信息中心 (National Center for Biotechnology Information) 的萬維網網址上對 BLAST 算法的解釋 ) 之類的序列比較算法進行鑒定。例 如, 由 At1g61140 編碼的蛋白的氨基酸序列用作查詢序列, 使用 BlastP 查詢公共數據庫, 并 且隨后將如 SEQ ID NO : 40、 42、 和 48 所示的多肽序列鑒定為同源物 ( 對應的核苷酸序列分 別是 SEQ ID NO : 39、 41、 和 47)。 對公共 BAC 序列進行的 TblastN 搜索也鑒定了 SEQ ID NO : 44( 對應的核苷酸序列是 SEQ ID NO : 43) 所示的玉米同源物。
     實施例 8c
     包含 SNF2 結構域的多肽的序列比對和同一性百分比計算
     圖 16A-AM 給 出 如 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、
     46、 48、 和 49 所示的氨基酸序列比對結果。圖 17 示出圖 16A-AM 中顯示的每對氨基酸序列 的序列同一性百分比和趨異值的圖表。
     用 LASERGENE 生物信息計算包 (DNASTAR Inc., Madison, WI) 的 MEGALIGN 程 序進行序列比對和同一性百分比計算。用 Clustal 比對方法 (Higgins 和 Sharp(1989), CABIOS.5 : 151-153) 進行序列的多重比對, 默認參數 ( 空位罰分= 10, 空位長度罰分= 10)。使用 Clustal 方法采用以下逐對比對的默認參數 : KTUPLE 1, 空位罰分= 3, 窗口= 5, DIAGONALS SAVED = 5。 實施例 9
     包含擬南芥屬前導基因的同源物的植物表達載體的制備
     與 編 碼 包 含 SNF2 結 構 域 的 蛋 白 的 前 導 基 因 同 源 的 序 列 可 使 用 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool ; Altschul 等 人, J.Mol.Biol.215 : 403-410(1993) ; 也參 見美國國家衛生研究院 (National Institutes of Health) 國立醫學圖書館 (National Library of Medicine) 的國家生物技術信息中心 (National Center for Biotechnology Information) 的萬維網網址上對 BLAST 算法的解釋 ) 之類的序列比較算法進行鑒定。 與編 碼包含 SNF2 結構域的蛋白的基因類似的核苷酸序列, 如實施例 8A-C 所述的序列, 可通過任 何一種以下方法進行 PCR 擴增。
     方法 1( 基于 RNA 的方法 ) : 如果蛋白編碼區域的 5’ 和 3’ 序列信息是可用的, 可 如實施例 5 所述設計基因特異性引物。可將 RT-PCR 用于植物 RNA 來獲取含有蛋白編碼區 的核酸片段, 該 EXST 蛋白編碼區旁側為 attB1(SEQ ID NO : 12) 和 attB2(SEQ ID NO : 13) 序 列。引物可含有起始密碼子上游的共有 Kozak 序列 (CAACA)。
     方法 2( 基于 DNA 的方法 ) : 作為另外一種選擇, 如果 cDNA 克隆是可用的, 可以 PCR 擴增完整 cDNA 插入序列 ( 含有 5′和 3′非編碼區 )。可設計正向引物和反向引物, 使它們 分別或者含有 attB1 序列和在該 cDNA 插入序列前面的載體特異性序列或者含有 attB2 序 列和在該 cDNA 插入序列后面的載體特異性序列。對于克隆進載體 pBLUESCRIPT SK+ 中的 cDNA 插入序列, 可使用正向引物 VC062(SEQ ID NO : 16) 和反向引物 VC063(SEQ ID NO : 17)。
     方 法 3( 基 于 基 因 組 DNA 的 方 法 ) : 能 夠 使 用 長 程 基 因 組 PCR 捕 集 獲 取 基 因 組 序 列。 能 夠 基 于 基 因 座 序 列 設 計 引 物, 并 且 能 夠 對 所 得 PCR 產 物 測 序。 能 夠 使 用 FGENESH(Salamov, A.and Solovyev, V.(2000)Genome Res., 10 : 516-522) 程序進行序列分 析, 并且任選地能夠與來自其他物種的同源序列進行比對以輔助鑒定推定的內含子和外顯 子。
     方法 1、 2 和 3 可根據本領域技術人員已知的步驟進行修改。例如, 方法 1 的引物 可含有限制性酶切位點而不是 attB1 和 attB2 位點, 用于后來將 PCR 產物克隆進含有 attB1 和 attB2 位點的載體內。另外, 方法 2 可涉及從 cDNA 克隆、 λ 克隆、 BAC 克隆或基因組 DNA 擴增。
     可利用 BP 重組反應將通過任一種上述方法獲取的 PCR 產物與 GATEWAY 供體載
    體 ( 例如 pDONRTMZeo(SEQ ID NO : 2; 圖 2) 或 pDONRTM221(SEQ ID NO : 3; 圖 3) 組合。這種方 TM 法將細菌致死 ccdB 基因以及氯霉素抗性基因 (CAM) 從 pDONR Zeo 或 pDONRTM221 移除并定 向地克隆了在旁側具有 attB1 和 attB2 位點的 PCR 產物而得到入門克隆 (entry clone)。 使用 INVITROGENTM GATEWAY CLONASETM 技術, 然后可將來自入門克隆的編碼同源包含 SNF2結構域的多肽的序列轉移到合適的目的載體中, 例如 pBC-Yellow(SEQ ID NO : 4; 圖 4)、 PHP27840(SEQ ID NO : 5; 圖 5)、 或 PHP23236(SEQ ID NO : 6; 圖 6), 以獲取植物表達載體, 所 述載體分別用于擬南芥屬、 大豆、 和玉米。 TM
     供體載體 pDONR /Zeo 或 pDONRTM221 的 attP1 和 attP2 位點分別顯示于圖 2 和圖 3 中。目的載體 pBC-Yellow、 PHP27840 和 PHP23236 的 attR1 和 attR2 位點分別顯示于圖 4、 5 和 6 中。
     作為另外一種選擇, 可進行多個入門克隆和合適的目的載體之間的 MultiSite Gateway LR 重組反應以產生表達載體。 實施例 10
     用驗證過的擬南芥屬前導基因制備大豆表達載體并轉化大豆
     為了檢查所得表型, 可將大豆植株轉化以過表達每個驗證過的擬南芥屬基因或來 自不同物種的對應同源物。
     可將實施例 5 中所述的相同 GATEWAY 入門克隆用于將每個基因定向克隆進
    PHP27840 載體 (SEQ ID NO : 5; 圖 5) 中, 使得該基因的表達處于 SCP1 啟動子的控制下。
     然后可用包含編碼本多肽的序列的表達載體轉化大豆胚。 大豆轉化和再生技術已 經在國際專利公布 WO 2009/006276 中進行了描述, 其內容以引用方式并入本文。 可在氮限制條件下 ( 例如 1mM 硝酸鹽 ) 栽培 T1 植株并分析表型變化。利用圖像 分析可定量下面的參數 : 可收集并定量植株面積、 體積、 生長速率以及顏色分析。超表達構 建體與合適的對照植物比較導致綠度 ( 綠色區 )、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時的鮮重或 干重、 果實或種子產量、 總植物氮含量、 果實或種子氮含量、 營養組織的氮含量、 總植物游離 氨基酸含量、 營養組織中的游離氨基酸含量、 果實或種子中的游離氨基酸含量、 果實或種子 中的蛋白質含量、 營養組織中的蛋白質含量發生變化, 可認為它是擬南芥屬前導基因在大 豆中發揮功能提高對氮缺乏耐受性 ( 增加的氮耐受性 ) 的證據。
     可分析用驗證過的基因轉化大豆植株以研究相對于對照或參照植株的農學特性。 例如, 可分析在低氮和高氮條件 ( 如氮限制條件和氮充分條件 ) 下的產量增加和 / 或穩定 性。
     實施例 11
     使用粒子轟擊法用驗證過的擬南芥屬前導基因轉化玉米
     為了檢查所得表型, 可將玉米植株轉化以過表達驗證過的擬南芥屬前導基因或來 自不同物種的對應同源物。
     可以將實施例 5 中所述的相同 GATEWAY 入門克隆用于將每種相應的基因定向
    克隆進玉米轉化載體中。在玉米轉化載體中的基因的表達可以處于組成型啟動子的控 制下, 例如玉米泛素啟動子 (Christensen 等人, Plant Mol.Biol.12 : 619-632(1989) 和 Christensen 等人, Plant Mol.Biol.18 : 675-689(1992)) 然后可通過粒子轟擊將上述重組 DNA 構建體引入玉米細胞中。通過粒子轟擊進行 玉米轉化的技術已經在國際專利公布 WO 2009/006276 中進行了描述, 其內容以引用方式 并入本文。
     可在氮限制條件下 ( 例如 1mM 硝酸鹽 ) 栽培 T1 植株并分析表型變化。利用圖像 分析可定量下面的參數 : 可收集并定量植株面積、 體積、 生長速率以及顏色分析。超表達構
     建體與合適的對照植物比較導致綠度 ( 綠色區 )、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時的鮮重或 干重、 果實或種子產量、 總植物氮含量、 果實或種子氮含量、 營養組織的氮含量、 總植物游離 氨基酸含量、 營養組織中的游離氨基酸含量、 果實或種子中的游離氨基酸含量、 果實或種子 中的蛋白質含量、 營養組織中的蛋白質含量發生變化, 可認為它是擬南芥屬前導基因在玉 米中發揮功能提高對氮缺乏耐受性 ( 增加的氮耐受性 ) 的證據。
     實施例 12
     電穿孔根癌農桿菌 LBA4404
     將電穿孔感受態細胞 (40μl), 例如根癌農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens) LBA4404( 含有 PHP10523) 在冰上解凍 (20-30 分鐘 )。 PHP10523 含有用于 T-DNA 轉移的 VIR 基因、 農桿菌屬的低拷貝數質粒復制起始區、 四環素抗性基因以及用于體內 DNA 生物分子 重組的 cos 位點。同時, 將電穿孔管 (electroporation cuvette) 在冰上冷卻。將該電穿 孔儀的設置調節至 2.1kV。將 DNA 等分試樣 (0.5μL 親代 DNA, 在低鹽緩沖液或雙蒸 H2O 中 的濃度為 0.2μg-1.0μg) 與解凍的根癌農桿菌 LBA4404 細胞混合, 同時仍然保持在冰上。 將混合物轉移至電穿孔管的底部并靜止保持在冰上 1-2 分鐘。按下 “pulse( 脈沖 )” 鍵兩 次 ( 理想的是獲取 4.0 毫秒的脈沖 ) 對細胞進行電穿孔 (Eppendorf 電穿孔儀 2510)。隨 后, 將 0.5mL 室溫下的 2xYT 培養基 ( 或 SOC 培養基 ) 加入到電穿孔管并轉移至 15mL 按壓 蓋管 ( 例如 FALCONTM 管 ) 中。將細胞在 28-30℃、 200-250rpm 下培養 3 小時。 將 250μL 的等分試樣散布在包含 YM 培養基和 50μg/mL 奇放線菌素的板上并在 28-30℃下培養三天。為了增加轉化體的數目, 可進行如下兩個可選步驟中的其中一個 :
     選擇 1 : 用 30μL 15mg/mL 的利福平覆蓋平板。LBA4404 具有針對利福平的染色體 抗性基因。這種附加的選擇消除了在使用較差的 LBA4404 感受態細胞制備物時觀察到的一 些污染克隆。
     選擇 2 : 進行兩次重復的電穿孔以補償較差的電感受態細胞。
     轉化體的鑒定 :
     選取四個獨立的克隆并劃痕接種在包含 AB 基本培養基和 50μg/mL 奇放線菌素的 平板上用于分離單個克隆。 將平板在 28℃下孵育二至三天。 對于每個推定的共整合體選取 單個克隆并將其接種在 4mL 的 10g/L 細菌蛋白胨, 10g/L 酵母提取物, 5g/L 氯化鈉, 和 50mg/ L 奇放線菌素中。將該混合物在 28℃下搖動培養 24 小時。采用 QIAGEN Miniprep 和可選 的 PB 緩沖液洗滌, 從 4mL 培養物分離出質粒 DNA。DNA 在 30μl 中洗提。如上所述, 將 2μL 可將 15μl 等分試樣用于 的等分試樣用于電穿孔 20μL DH10b+20μL 雙蒸 H2O。可任選地, TM 轉化 75-100μl 的 INVITROGEN Library Efficiency DH5α。將細胞散布在包含 LB 培養 基和 50μg/mL 奇放線菌素的平板上并將其在 37℃下培養過夜。
     對于每個推定的共整合體選取三至四個獨立克隆并將其接種在 4mL 的 2xYT 培養 基 (10g/L 細菌蛋白胨, 10g/L 酵母提取物, 5g/L 氯化鈉 ) 和 50μg/mL 奇放線菌素中。將 細胞在 37℃下搖晃培養過夜。接下來, 使用 QIAprep Miniprep, 用任選 PB 緩沖液洗滌液
    ( 稀釋成 50μL) 從 4mL 培養物中分離質粒 DNA。8μL 質粒 DNA 用 SalI( 使用親本 DNA 和 PHP10523 作對照物 ) 進行消化。對于 4 個質粒利用限制性內切酶 BamHI、 EcoRI 和 HindIII 再進行三次消化 ( 使用親本 DNA 和 PHP10523 作為對照 ), 這 4 個質粒代表 2 種具有正確 SalI 消化模式的推定共整合體。推薦電凝膠 (Electronic gel) 用于比較。實施例 13
     使用農桿菌屬 (Agrobacterium) 細菌轉化玉米
     為了檢查所得表型, 可將玉米植株轉化以過表達驗證過的擬南芥屬前導基因或來 自不同物種的對應同源物。
     農 桿 菌 介 導 的 玉 米 轉 化 基 本 上 按 照 Zhao 等 人, Meth.Mol.Biol.318 : 315-323(2006) 中描述的方法進行 ( 還可參見 Zhao 等人, Mol.Breed.8 : 323-333(2001) 和 1999 年 11 月 9 日公布的美國專利 5,981,840, 所述文獻以引用方式并入本文 )。該轉化過 程涉及細菌接種、 共培養、 靜息、 選擇和植物再生。
     1. 未成熟胚芽制備 :
     將未成熟胚芽從穎果上切下來, 并且放置在含有 2mL PHI-A 培養基的 2mL 微管中。
     2. 未成熟胚芽的農桿菌屬細菌感染和其培養 :
     2.1 感染步驟 :
     用 1mL 微吸移管將 (1) 的 PHI-A 培養基取出, 并且加入 1mL 農桿菌屬懸浮液。將 該管輕輕地倒置以混合。將該混合物在室溫下培養 5 分鐘。
     2.2 共培養步驟 :
     用 1mL 微量吸移管將農桿菌屬懸浮液從感染步驟中移出。使用無菌刮刀將胚從管 中刮出并轉移到 100×15mm 培養皿中的 PHI-B 培養基的平板中。測定胚的朝向, 使得胚軸 在培養基表面上朝下。將具有胚芽的平板在 20℃下于黑暗中培養三天。L- 半胱氨酸可用 于共培養階段。采用標準二元載體, 補充有 100-400mg/L L- 半胱氨酸的共培養培養基對于 回收穩定的轉基因事件是至關重要的。
     3. 選擇推定的轉基因事件 :
     向在 100×15mm 培養皿中的 PHI-D 培養基的平板中轉移 10 個胚芽, 保持朝向, 并 且用 parafilm 將培養皿密封。將平板在黑暗中于 28℃下培養。預計在六至八周將看見作 為黃色胚芽組織的主動生長推定事件。不產生事件的胚可能是棕色和壞死的, 并且幾乎看 不見脆性組織生長。以二 - 三周的間隔將推定的轉基因胚芽組織轉移到新鮮的 PHI-D 平板 上進行傳代培養, 時間間隔取決于生長速度。記錄事件。
     4.T0 植株的再生 :
     將在 PHI-D 培養基上繁殖的胚芽組織轉移到在 100×25mm 培養皿中的 PHI-E 培 養基 ( 體細胞胚芽成熟培養基 ) 中進行傳代培養, 在 28℃于黑暗中培養直至體細胞胚芽成 熟, 培養大約十至十八天。將具有良好限定的盾片和胚芽鞘的個體成熟體細胞胚芽轉移到 PHI-F 胚芽發芽培養基中, 并且在 28℃下于光中 ( 約 80μE, 來自冷光燈或同等熒光燈 ) 培 養。在七至十天, 將約 10cm 高的再生的植株置于盆中的園藝混合物中, 并且使用標準園藝 方法進行耐寒鍛煉 (hardened-off)。
     用于植物轉化的培養基 :
     1.PHI-A : 4g/L CHU 基礎鹽, 1.0mL/L 1000×Eriksson′ s 維生素混合物, 0.5mg/L 鹽酸硫胺, 1.5mg/L 2, 4-D, 0.69g/L L- 脯氨酸, 68.5g/L 蔗糖, 36g/L 葡萄糖, pH5.2。加入 100μM 乙酰丁香酮 ( 過濾滅菌的 )。
     2.PHI-B : PHI-A, 不含有葡萄糖, 將 2, 4-D 增加至 2mg/L, 將蔗糖降低至 30g/L, 并 且補充 0.85mg/L 硝酸銀 ( 過濾滅菌的 ), 3.0g/LGELRITE , 100μM 乙酰丁香酮 ( 過濾滅菌的 ), pH5.8。
     3.PHI-C : PHI-B, 不含 GELRITE 和乙酰丁香酮, 將 2, 4-D 降低至 1.5mg/L, 并且補 充 8.0g/L 瓊脂, 0.5g/L 2-[N- 嗎啉代 ] 乙烷 - 磺酸 (MES) 緩沖液, 100mg/L 羧芐西林 ( 過 濾滅菌的 )。
     4.PHI-D : PHI-C 補充 3mg/L 雙丙氨磷 ( 過濾滅菌的 )。
     5.PHI-E : 4.3g/L Murashige and Skoog(MS) 鹽 (Gibco, BRL 11117-074), 0.5mg/L 煙酸, 0.1mg/L 鹽酸硫胺, 0.5mg/L 鹽酸吡哆醇, 2.0mg/L 甘氨酸, 0.1g/L 肌醇, 0.5mg/L 玉米 素 (Sigma, 目錄 No.Z-0164), 1mg/L 吲哚乙酸 (IAA), 26.4μg/L 脫落酸 (ABA), 60g/L 蔗糖, 3mg/Lbialaphos( 過濾滅菌的 ), 100mg/L 羧芐西林 ( 過濾滅菌的 ), 8g/L 瓊脂, pH5.6。
     6.PHI-F : PHI-E, 不 含 有 玉 米 素、 IAA、 ABA ; 將 蔗 糖 降 低 至 40g/L ; 用 1.5g/L GELRITE 替代瓊脂 ; pH 5.6。 通過首先將組織簇轉移到補充有 0.2mg 每升的 2, 4-D 的 N6 培養基中, 可從該 轉基因愈傷組織再生出植物。兩周后, 可將組織轉移到再生培養基中 (Fromm 等人, Bio/ Technology 8 : 833-839(1990))。
     轉基因 T0 植株可以再生, 并且可以確定其表型。可收集 T1 種子。
    此外, 可通過直接轉化或者從單獨轉化的品系基因滲入而將含有證實的擬南芥屬 基因的重組 DNA 構建體導入玉米自交系內。
     自交或雜交的轉基因植物可通過更嚴苛的大田試驗來研究在氮限制條件下和非 氮限制條件下的產量增加和 / 或穩定性。
     隨后可進行產量分析以測定包含驗證過的擬南芥屬前導基因的植物在與不包含 驗證過的擬南芥屬前導基因的對照植物 ( 或參比植物 ) 進行比較時是否具有產量改善 ( 在 氮限制條件下和非氮限制條件下 )。包含驗證過的擬南芥前導基因的植物在氮限制條件下 將具有比對照植物更少的產量損失, 例如至少 25%更少的產量損失, 或者在非氮限制條件 下將具有比對照植物更高的產量。
     實施例 14A
     用于用經過驗證的候選擬南芥屬基因 (At1g61140) 通過農桿菌屬轉化玉米品系 的表達載體的制備
     使用 INVITROGENTM GATEWAY 技術, 用 GATEWAY 入門克隆進行 LR 重組反應, 所述
    入門克隆具有編碼擬南芥屬包含 SNF2 結構域的蛋白的序列 ( 如實施例 5 所述, 并且在該 實施例和隨后的實施例中稱為 AT-SNF2.1)、 入門克隆 PHP23112(SEQ ID NO : 14)、 入門克隆 PHP20234(SEQ ID NO : 9; 圖 9) 和目的載體 PHP22655(SEQ ID NO : 10) 的序列以生成前體質 粒 PHP29872。PHP29872 包含以下表達盒 :
     1. 表達 PAT 抗除草劑性基因的泛素啟動子 ::moPAT::PinII 終止子盒, 該基因用于 轉化過程期間的選擇。
     2. 表達 DS-RED 顏色標記的 LTP2 啟動子 ::DS-RED2::PinII 終止子盒, 該標記用于 分選種子。 3. 泛素啟動子 ::AT-SNF2.1::PinII 終止子盒過表達擬南芥屬包含 SNF2.1 結構域 的蛋白質 (At1g61140.1)。
     實施例 14B
     用經驗證的候選擬南芥屬基因 (At1g61140) 通過農桿菌屬轉化玉米品系
     使用如實施例 12 和 13 所述的農桿菌介導轉化, 能將存在于載體 PHP29872( 如 14A 所述 ) 中、 或包含其他兩種 At1g61140 突變體中的任一種的載體中的 SNF2.1 表達盒導入玉 米自交系、 或來源于優良玉米自交系的可轉化玉米品系。
     可將表達載體 PHP29872 通過電穿孔導入包含載體 PHP10523(SEQ ID NO : 7, 圖 7) 的 LBA4404 農桿菌屬菌株以制備共整合載體 PHP29875, 該載體包含 SNF2.1 表達盒。共整 合載體通過每個載體上包含的 COS 重組位點重組兩個質粒 PHP29872 和 PHP10523 形成, 并 且除了農桿菌菌株以及農桿菌介導轉化需要的其他基因 (TET、 TET、 TRFA、 ORI 終止子、 CTL、 ORI V、 VIR C1、 VIR C2、 VIR G、 VIR B) 之外, 還包含上述相同的三個表達盒 ( 實施例 14A)。 可使用 ( 但不限于 ) 實施例 12 中的電穿孔規程。
     實施例 15
     用于轉入 Gaspe Flint 衍生的玉米品系的目的載體 PHP23236 的制備
     目的載體 PHP23236( 圖 6, SEQ ID NO : 6) 通過用載體 PHP23235( 圖 8, SEQ ID NO : 8) 轉化農桿菌屬菌株 LBA4404 并分離所得共整合產物而獲取, 所述菌株包含質粒 PHP10523( 圖 7, SEQ ID NO : 7)。
     目的載體 PHP23236 可被用于如實施例 16 所述的與入門克隆的重組反應, 以產生 用于轉化 Gaspe Flint 衍生的玉米品系的玉米表達載體。
     實施例 16
     用于轉入 Gaspe Flint 衍生的玉米品系的表達構建體的制備
     使用 INVITROGENTM GATEWAY LR 重組技術, 可將如實施例 5 所述的相同入門克 隆定向克隆到目的載體 PHP29634(SEQ ID NO : 15 ; 圖 11) 中以形成表達載體。目的載體 PHP29634 與目的載體 PHP23236 是相似的, 但是, 目的載體 PHP29634 具有位點特異性的重 組位點 FRT1 和 FRT87, 并且還編碼用于利用草甘膦對轉化體進行選擇的 GAT4602 選擇性標 記蛋白。該表達載體將包含所述受關注的 cDNA, 其在 UBI 啟動子的控制下編碼 At-SNF2.1、 At-SNF2.2、 或 AtSNF2.3, 并且是農桿菌介導轉化到玉米中的 T-DNA 二元載體, 該載體如本 文所述實施例所述但不受其限制。 實施例 17A
     用驗證過的候選擬南芥屬基因 (At1g61140) 轉化 Gaspe Flint 來源的玉米品系
     為了檢查所得表型, 可轉化玉米植株以過表達擬南芥屬 At1g61140 基因 ( 和來自 其他物種的對應同源物 )。可使用如實施例 16 所述的表達構建體。
     受體植株
     受體植株細胞可來自具有短的生活周期 ( “快速循環” )、 小的個體尺寸以及轉化潛 能高的單一玉米品系。對玉米典型的這些植株細胞是來自可公開獲得的 Gaspe Flint(GF) 品 系 變 種 的 植 株 細 胞。 一 種 可 能 的 候 選 植 株 品 系 變 種 是 GF×QTM(Quick Turnaround Maize( 快速周轉玉米 ), 選擇用于在溫室條件下生長的 Gaspe Flint 的可公開獲得形式 ) 的 F1 雜交種, 其在 Tomes 等人 ( 美國專利申請 10/367,416, 提交于 2003 年 2 月 13 日 ; 美 國專利公開 2003/0221212 A1, 公布于 2003 年 11 月 27 日 ) 中公開。從該品系獲得的轉基 因植株具有如此小的尺寸使得它們可在四英寸的盆中生長 ( 是正常大小的玉米植株所需 空間的 1/4) 并且它們在少于 2.5 個月時間內成熟。( 傳統上, 一旦轉基因植株適應溫室后
     需要 3.5 個月來獲得轉基因 T0 種子。) 另一合適的品系包括但不限于 GS3( 高度可轉化的 品系 )X Gaspe Flint 的雙單倍體品系。還有另一種合適的品系是攜帶引起較早開花、 高度 減小或這兩者的轉基因的可轉化的優良玉米自交系。
     轉化規程
     任何合適的方法可用于將轉基因引入玉米細胞中, 包括但不限于利用基于農桿菌 屬載體的接種類型的步驟 ( 參見例如實施例 12 和 13)。轉化可在受體 ( 靶標 ) 植株的未成 熟胚上進行。
     精確的生長和植株跟蹤
     將由轉化的玉米胚產生的轉基因 (T0) 植株的事件群體在受控的溫室環境中栽 培, 該溫室使用改良的隨機分塊 (block) 設計以降低或消除環境誤差。隨機分塊設計是這 樣一種植株布局, 在該布局中, 實驗植株被分成組 ( 如, 每組三十株植株 ), 稱為塊, 而每株 植株隨塊被隨機分配一個位置。
     對于一組三十株植株, 二十四株轉化的實驗植株和六株對照植株 ( 具有設定好的 表型的植株 )( 總起來說稱為 “重復組” ) 被置于盆中, 這些盆在位于溫室內的桌子上布置成 陣列 ( 也叫做重復組或塊 )。每株植株 ( 對照植株或實驗植株 ) 隨塊被隨機分配一個位置, 所述的塊映射一個唯一的、 溫室物理位置以及映射該重復組。在單次實驗中多個三十株植 株的重復組中的每一個可栽培在相同的溫室中。應該測定重復組的布局 ( 布置方式 ) 以使 對空間的要求最小以及溫室內的環境影響最小。這樣一種布局可稱為壓縮的溫室布局。
     對于加入特定的對照組的一種替代方法是鑒定不表達受關注基因的那些轉基因 植株。可將諸如 RT-PCR 之類的多種技術應用于定量評估引入基因的表達水平。可將不表 達轉基因的 T0 植株與表達轉基因的那些植株進行比較。
     在整個評價過程中鑒定和跟蹤事件群體中的每株植株, 并且從那些植株收集的數 據自動與那些植株相關聯, 使得所搜集的數據可與由該植株攜帶的轉基因關聯。 例如, 每個 植株容器具有機器可讀的標簽 ( 例如通用貨單代碼 (UPC) 條形碼 ), 該標簽包含了關于植物 身份的信息, 身份信息繼而又與溫室位置相關, 使得從植物獲得的數據可自動與該植物相 關聯。
     作為另外一種選擇, 可使用任何有效的、 機器可讀的植物識別系統, 例如二維矩陣 代碼或甚至是射頻識別標簽 (RFID), 其中數據被接收并由射頻接收器 / 處理器進行翻譯。 參見美國專利申請 10/324,288, 提交于 2002 年 12 月 19 日 ( 美國專利公布 2004/0122592 A1, 公布于 2004 年 6 月 24 日 ), 以引用方式并入本文。
     利用三維成像進行表型分析
     對 T0 事件群體中的每株溫室植株 ( 包括任何對照植株 ) 分析所關注的農學特性, 并且以這樣一種方式記錄或存儲每株植株的農學數據, 該方式使得數據與該植株的辨識數 據 ( 見上面 ) 相關聯。可利用與上述類似的實驗設計, 可在 T1 代中完成對表型 ( 基因效 應 ) 的確認。
     在植物的整個溫室生活周期中, 利用定量的非破壞性成像技術在表型水平上來分 析 T0 植株以評估所關注的性狀。任選地, 將數字成像分析儀用于整株植物的自動多維分 析。成像可在溫室內進行。將兩個攝像系統 ( 位于頂部和側面 ) 和用于旋轉植物的裝置用 于從所有側面觀察植物和成像。從每株植物的頂部、 前面和側面采集圖像。所有的三個圖像一起提供了足夠的信息用于評價例如每株植物的生物量、 大小和形態。
     由于植物在第一片葉片從土壤顯現出來時到植物處于它們發育的末期時大小的 改變, 從頂部以較高的放大倍率任選地記錄植物發育的早期。這攝像可通過利用完全由成 像軟件控制的自動變焦鏡頭系統來完成。
     在單次成像分析操縱中, 進行如下事件 : (1) 將植株傳送至分析儀區域內, 旋轉 360 度以便其機器可讀標簽可被讀取, 并且讓其保持靜止直至其葉片停止移動 ; (2) 獲取側 面圖像并將其輸入數據庫 ; (3) 將植株旋轉 90 度并再次讓其保持靜止直至其葉片停止移 動, 以及 (4) 將該植株傳送出分析儀。
     每二十四小時的周期讓植物至少六個小時處于黑暗以便具有正常的白天 / 黑夜 周期。
     成像儀器
     可 使 用 任 何 合 適 的 成 像 儀 器, 包 括 但 不 限 于 可 從 LemnaTec GmbH(Wurselen, Germany) 商購獲得的光譜數字成像儀。 獲取圖像并用具有 1/2″ IT Progressive Scan IEE CCD 成像設備的 LemnaTec Scanalyzer HTS LT-0001-2 進行分析。該成像照相機可配備有 自動變焦、 自動調節光圈和自動聚焦。可利用 LemnaTec 軟件設定所有的照相機設置。任選 地, 對于主要組成成像分析儀的儀器差異小于約 5%, 對于次要組成成像分析儀的儀器差異 小于約 10%。 軟件
     成像分析系統包括用于顏色和構造分析的 LemnaTec HTS Bonit 軟件程序和用于 存儲約 500,000 次分析的數據 ( 包括分析數據 ) 的服務器數據庫。原始圖像和分析過的圖 像儲存在一起以允許用戶根據需要進行再次分析。 可將數據庫連接至成像硬件用于自動的 數據收集和存儲。多種可商購獲得的軟件系統 ( 例如 Matlab, 其他軟件 ) 可用于定量解釋 圖像數據, 并且可將這些軟件體系中的任何一種應用于所述圖像數據集。
     傳送系統
     具有植物旋轉裝置的傳送系統可用于將植物傳送至成像區域并在成像過程中選 擇植物。例如, 將最多四株植物 ( 每株最高高度為 1.5m) 裝上汽車, 該汽車在循環的傳送系 統上行進并通過成像測量區域。在這種情況下, 該單位 ( 成像分析儀和傳送環線 ) 的總占 有面積為約 5m×5m。
     可擴大傳送系統以同時容納更多植物。 將植物沿傳送環線傳送至成像區域并對每 株植物分析最多 50 秒。獲取植物的三個視圖。傳送系統以及成像設備應該能夠用于溫室 環境條件。
     照明
     任何合適的照明模式可用于圖像采集。例如, 可在暗背景上使用頂部照明。作為 另外一種選擇, 可采用使用白色背景的頂部照明和背部照明的組合。應該將被照亮的區域 圍起來以確保恒定的照明條件。 遮蔽物應該長于測量區域使得能保持恒定的光條件而不需 要打開和關閉門。 作為另一種選擇, 可變化照明以引起轉基因 ( 如, 綠色熒光蛋白 (GFP)、 紅 色熒光蛋白 (RFP)) 的激發或者引起內源性 ( 如葉綠素 ) 熒光基團的激發。
    
    
    基于三維成像的生物量評價 為了更好地評價生物量, 應該從至少三個軸 ( 任選地, 頂部視圖和兩個側面 ( 側面1 和側面 2) 視圖 ) 獲取植物圖像。然后分析這些圖像以將植物從背景 ( 盆和花粉控制袋 ( 如果適用的話 )) 分離。可通過如下計算評價植物的體積 :
     體積 ( 體素 ) = - √頂部面積 ( 像素 )× √側面 1 面積 ( 像素 )× √側面 2 面積 ( 像素 )
     在上面的等式中, 體積和面積的單位是 “任意單位” 。 在該系統中, 任意單位完全足 以檢測基因對植物大小和生長影響, 因為所需的是檢測與實驗平均值或對照平均值的差值 ( 正較大和負較小兩者 )。大小 ( 如面積 ) 的任意單位可通過將物理參照加入到成像過程 而輕易地轉化成物理量度。例如, 可在頂部成像過程和側面成像過程兩者中均包括已知面 積的物理參照。 基于這些物理參照的面積, 可測定轉換因子以允許從像素轉換為面積單位, 2 例如平方厘米 (cm )。物理參照可以是或可以不是獨立的樣本。例如, 具有已知直徑和高度 的盆足可用作物理參照。
     顏色分類
     成像技術還可用于測定植物顏色以及用于將植物顏色歸為各種衍生類型。 將圖像 顏色歸屬于顏色類型是 LemnaTec 軟件的固有特色。使用其他圖像分析軟件系統, 可通過多 種計算方法測定顏色分類。
     對于植物大小和生長參數的測定, 一種有用的分類方案是定義一種單一顏色方 案, 包括綠色的兩種或三種色調 ( 例如色調是 50-66, 參見圖 13), 此外, 還有關于缺綠病、 壞 死和漂白 ( 在這些條件出現時 ) 的顏色類型。還使用了背景顏色類型, 其包括圖像中的非 植物顏色 ( 例如盆和土壤顏色 ), 并將這些像素特別地從測定大小中排除。 在受控的恒定照 明下分析植物, 使得可以定量一株植物內隨時間推移的任何改變, 或者植物之間或植物不 同分枝之間的任何改變 ( 如季節差異 )。
     除了其在測定植物的大小、 生長中的有效性以外, 顏色分類還可用于評估其他產 量構成性狀。對于這些其他產量構成性狀, 可使用另外的顏色分離方案。例如, 稱為 “保綠 度 (staygreen)” 的性狀 ( 已經將其與產量的提高相關聯 ) 可通過顏色分類來評估, 該顏色 分類將綠色色調與黃色和棕色色調 ( 其指示老化的組織 ) 相分離。通過將這種顏色分類應 用于在 T0 或 T1 植物生活周期末獲取的圖像, 可鑒定綠色的量相對于黃色和棕色 ( 例如, 可 表示為綠色 / 黃色比率 ) 增加的植物。這種綠色 / 黃色比率具有顯著差異的植物可被鑒定 為攜帶影響這種重要農學性狀的轉基因。
     熟練的植物學家將認識到可指示植物健康或應激反應的其他植物顏色 ( 花青素 ) 的出現, 以及認識到其他顏色分類方案可提供對基因在與這些響應相關的性狀方面的作用 的進一步度量。
     植物結構分析
     改變植物結構參數的轉基因也可以用本發明鑒定, 包括諸如最大高度和寬度、 節 間距離、 葉與莖之間的角度、 在節處開始的葉片數以及葉片長度。 LemnaTec 系統軟件可如下 用于測定植物構造。在第一成像步驟中將植物簡化至其主要的幾何構造, 并且隨后基于該 圖像可進行不同構造參數的參數化鑒定。 或者是單獨地或者是組合地修改任何這些構造參 數的轉基因可通過應用此前所述的統計方法來鑒定。
     花粉脫落日期
     花粉脫落日期是轉基因植物中要分析的一個重要參數, 并且可通過活性雄花第一次出現在植物上來測定。為了找到雄花目標, 通過顏色對莖的上端進行分類以檢測黃色或 紫色花藥。然后將這種顏色分類分析用于定義活性花, 活性花繼而可用于計算花粉脫落日 期。
     作為另外一種選擇, 花粉脫落日期和其他易于在視覺上檢測到的植物屬性 ( 如授 粉日期、 第一穗絲日期 ) 可以由負責進行植物看護的工作人員來記錄。為了使數據完整性 和過程效率最大化, 通過利用相同的由 LemnaTec 光譜數字分析設備利用的條形碼來跟蹤 該數據。 可將具有條形碼閱讀器的電腦、 掌上設備或筆記本電腦用于使記錄觀察時間、 植物 標識符的數據捕捉變得容易, 以及使捕捉數據的操作者感覺舒適。
     植物的取向
     以接近商業栽培的密度種植的成熟玉米植物通常具有平面的構造。也就是說, 植 物具有一可清晰分辨的寬的側面和窄的側面。對來自植物寬側的圖像進行測定。對于每株 植物, 給其賦予一個明確界定的基本取向以獲得寬側圖像與窄側 (edgewise) 圖像之間的 最大差別。將頂部圖像用于測定植物的主軸, 而將額外的旋轉裝置用于在開始主圖像采集 前將植物轉至合適的取向。
     實施例 17B
     用玉米同源物轉化 Gaspe Flint 衍生的玉米品系
     使用 INVITROGENTM GATEWAY LR 重組技術, 可制備入門克隆用于任何玉米同源物 (SEQ ID NO : 18/19、 20/21、 22/23、 43/44、 或 45/46)( 入門克隆的制備參見實施例 5), 并能 夠將入門克隆定向克隆到 GATEWAY 目的載體 29634(SEQ ID NO : 15 ; 圖 11) 中以制備對應 的表達載體。每個表達載體將包含處于 UBI 啟動子控制下的所關注的 cDNA, 并且將是用 于農桿菌屬介導的向玉米內的轉化的 T-DNA 二元載體, 所述玉米如但不限于本文所述的實 例。 實施例 18
     在氮限制條件下對玉米品系的篩選
     Gaspe Flint 來源的玉米品系
     轉基因植物可含有兩個或三個劑量的 Gaspe Flint-3 與一個劑量的 GS3(GS3/ (Gaspe-3)2X 或 GS3/(Gaspe-3)3X), 并且對于顯性轉基因會以 1 ∶ 1 分離。將轉基因植物 在 100% Turface( 一種商業栽培培養基 ) 中栽培, 每天用 1mM KNO3 生長培養基和 2mM KNO3 或更高的生長培養基澆灑四次 ( 參見圖 14)。 在 1mM KNO3 培養基中培養的對照植物的綠度 較小, 產生較少的生物量并且在開花期具有較小的穗 ( 關于樣本數據的示例請參見圖 15)。 Gaspe 來源的品系將生長至開花期。
     將用統計學確定處理株之間所觀察到的差異是否真有差異。圖 15 示出了一種方 法, 該方法將字母放在數值后面。同一列中其后具有相同字母 ( 不是字母組 ) 的那些值不 具有顯著的差異。 使用該方法, 如果在一列中的值的后面沒有字母, 則該列中的這些值的任 何之間不存在顯著的差異, 換句話講, 該列中的所有這些值是均等的。
     與無效轉基因相比較, 轉基因的表達將導致植物在 1mM KNO3 中具有改善的植物生 長。因此生物量和綠度 ( 如實施例 2 和 17A 所述 ) 將在生長期間進行監控, 并與無效轉基 因植物比較。生長、 綠度、 開花期穗的大小的改善將表明氮耐受性增強。
     幼苗測定
     還可采用幼苗測定對轉基因玉米植物進行評估, 所述測定對植物在氮限制條件 下的表現進行評估。例如, 在 18 天幼苗測定中, 轉基因植物被種植于商品化盆栽培養基 Turface 中, 然后用包含下列營養物質的溶液每天澆四次 : 1mM CaCl2、 2mM MgSO4、 0.5mM KH2PO4、 83ppmSprint330、 3mM KCl、 1mM KNO3、 1μM ZnSO4、 1μM MnCl2、 3μM H3BO4、 0.1μM CuSO4 和 0.1μM NaMoO4。植物在種植后 18 天收獲, 并且評價多個性狀, 包括但不限于 : SPAD( 綠度 )、 莖直徑、 根干重、 苗干重、 總干重、 mg 氮每克干重 (mg N/g dwt)、 以及植物氮濃 度。采用 Studentt 檢驗, 以 0.1 的最小值 (P < t) 比較平均值和無效轉基因平均值參數。
     實施例 19
     氮利用效率幼苗檢測分析法
     利用種子顏色標記將轉基因事件的種子分成了轉基因的 ( 處理 1 ; 包含構建體 PHP29875) 和無效的 ( 處理 2) 種子。
     每一處理 ( 轉基因的或批無效的 ) 被隨機分配至 54 個盆 ( 實驗單位 ) 組成的區 塊中, 所述盆按 6 行 9 列排列。重復每個處理 ( 轉基因或批無效的 )9 次。
     將所有種子種在 4 英寸的方盆中, 盆中包含在 8 英寸交錯中心上的 Turface, 每天 用包含以下營養物質的溶液澆灌四次 :
     1mM CaCl2 2mM MgSO4 0.5mM KH2PO4 83ppm Sprint330
     3mM KCl 1mM KNO3 1μM ZnSO4 1μM MnCl2
     3μM H3BO4 1μM MnCl2 0.1μM CuSO4 0.1μM NaMoO4
     植物出苗后, 將其間苗至每盆一個種子。 在收獲時從盆中移除植物, 并且將蒙脫石 從根部洗脫。使根與苗分開, 把根置于紙袋中并且在 70℃干燥 70 小時。將干燥后的植物部 分 ( 根和苗 ) 稱重并置于 50mL 的圓錐管中, 管中有大約 20 5/32 英寸的鋼球, 在涂料振蕩 器中進行振蕩研磨。
     The Nitrogen/Protein Analyzer 來自 Thermo Electron Corporation 的氮 / 蛋 白質分析器 ( 型號 FlashEA 1112N) 使用約 30mg 的基本組織。樣品從自動取樣機被點樣至 氧化反應室內部的坩堝內。在 900℃和純氧條件下, 樣品被強烈的放熱反應氧化, 產生 N2、 CO2、 H2O 和 SO2 的混合氣體。燃燒結束后, 打開載氣氦, 使氣體混合物流入還原反應室。在 680℃, 使氣體混合物流過還原銅, 其中可能形成的氮氧化物被轉化為氮元素而過量的氧氣 被保留。所述氣體混合物從還原反應器流出, 依次經過兩個吸收過濾器。第一個過濾器包 含堿石灰, 留住了二氧化碳和二氧化硫。 第二個過濾器包含分子篩和顆粒狀的硅膠, 以阻止 水通過。 然后, 氮被洗脫進色譜柱, 并被轉至熱導率檢測器, 熱導率檢測器生成電子信號, 所 述電子信號經 Eager 300 軟件的適當處理, 提供了氮 - 蛋白質百分比。
     利用這些數據, 測量了下列參數, 并且采用 Student t 檢驗將轉基因組的參數的平 均值與無效組的參數的平均值進行了比較。
    利用方差分析 (ANOVA) 計算和完全隨機設計 (CRD) 模型, 計算了每一區塊內的方 差。使用 F 統計, 通過將總區塊處理平均面積除以總區塊誤差平均面積對每個區塊計算了 總處理效應。計算了更大的 Student′ s t 檢驗的概率用于比較每個轉基因平均值與合適 的無效轉基因平均值。顯示顯著差異的變量 (*) 具有最小值 (P < t)0.1。
     表 5 示出原始數據和包含構建體 PHP29875 的植物的雙尾 Student’ s t 概率。p 值的數學符號反映所述事件對相應的無效組的相對表現, 即 ‘+’ =提高的表現, ‘-’ =降低 的表現。比較轉基因事件和構建體無效轉基因。無效的構建體是陰性的入門構建體, 其由 來自陰性分離子的果仁的抽樣組成, 并因此是全部陰性的代表性樣本。
     表5: PHP29875 的溫室幼苗測定數據
    
    實施例 20A
     具有擬南芥屬前導基因或玉米同源物的玉米品系的產量分析
     自交或頂交雜交體的轉基因植物可通過更嚴苛的大田試驗來研究在氮限制條件 下和無氮限制條件下的產量增加和 / 或穩定性。標準化的產量試驗將通常包括 4 至 6 次重 復, 以及至少 4 個位置。
     可進行產量分析以測定與構建體無效的或野生型的對照 ( 或參考 ) 植物相比, 包 含編碼包含 SNF2 結構域的蛋白的經驗證擬南芥屬基因或相關玉米基因的植物是否具有產 量表現方面的提高 ( 在氮限制或非氮限制條件下 )。具體地講, 對于包含經驗證的擬南芥 前導基因或 lnt6 的玉米同源物的植物和對照植物, 可于開花和 / 或灌漿時期施加氮限制條 件。可以測得這兩種植物的產量都有所減少。包含驗證過的擬南芥屬前導基因或其玉米同 源物的植物在氮限制條件下將具有比對照植物更少的產量損失, 或者在非氮限制條件下將 具有比對照植物更高的產量。
     實施例 20B
     用 PHP29875 轉化的玉米品系的產量分析
     玉米測交雜種包含存在于載體 PHP29875 中的擬南芥前導基因 ( 編碼包含 SNF2 結 構域的多肽 ) 的表達盒, 并且它們的對照植物于 2008 年和 2009 年在多個位置的低氮 (LN) 和標準氮 (NN) 環境下生長。基于由 Federal and State Extension 服務對特定生長區域 確定的土壤測試標準, 低氮 (LN) 環境指氮量少于在早春或夏季施加的標準氮肥的量, 而標
     準氮 (NN) 環境指加入正常產量所需的充足的氮。與 NN 條件中獲得的產量相比, 在 LN 條件 中觀察到了產量的降低。就該分析而言, 構建體無效組是由來自一種構建體的全部事件的 陰性分離子組成的負輸入, 批無效組是由來自一次實驗的全部構建體的全部陰性分離子組 成的負輸入。
     2008 年在 York, NE(YK) 和 Woodland, CA(WO) 兩個地點對九個轉基因事件進行了 大田試驗, 并評估了產量。玉米測交雜交體被用于與構建體無效的 (CN) 相比較。2008 年大 田試驗的結果顯示于表 6 中。
     表6
     用 PHP29875 轉化的玉米的 2008 年大田試驗
    測量單位為蒲式耳 / 英畝。
     陰影代表與構建體無效 (CN) 相比較顯著性較高的 (P < 0.1) 結果。
     粗體代表與構建體無效 (CN) 相比較顯著性較低的 (P < 0.1) 結果。
     九個以前測試的轉基因事件中有八個是 2009 年在以下位置進行的大田測試 : York, NE(YK) ; Marion, IA(MR)Woodland, CA(WO) ; Dallas Center, IA(DS) ; 和 Princeton, IN(PR)。然而, 在 2009 年玉米測交雜種與批無效 (BN) 進行比較。2009 年大田試驗的結果 顯示于表 7 中。 在 York, 在低氮條件下三個事件顯示產量比批無效顯著提高, 在標準氮條件 下一個事件顯示產量比批無效顯著提高。在 Woodland, 在低氮條件下一個事件具有比批無 效顯著更高的產量。在 Marion, 在低氮條件下三個事件的產量比批無效顯著更高。
     表7
     用 PHP29875 轉化的玉米的 2009 年大田試驗
    
    測量單位為蒲式耳 / 英畝。
     陰影代表與批無效 (BN) 相比較顯著性較高的 (P < 0.1) 結果。
     黑體代表與批無效 (BN) 相比較顯著性較低的 (P < 0.1) 結果。
     實施例 21
     用經驗證的前導基因的大豆同源物對大豆進行的轉化和評估
     基于同源性搜索, 可鑒定驗證過的擬南芥屬前導基因的一個或若干個候選大豆同 源物, 并且還可評估它們增加大豆氮限制條件耐受性的能力。 載體構建、 植物轉化和表型分 析將類似于上文實施例所述的規程。
     實施例 22
     用經驗證的前導基因的玉米同源物對玉米進行的轉化和評估
     基于同源性搜索, 可鑒定經驗證的擬南芥屬前導基因的一個或若干個候選的玉米 同源物 ( 例如 SEQ ID NO : 18/19、 20/21、 22/23、 43/44 或 45/46), 并且還評估它們增加玉米 氮限制條件耐受性的能力。載體構建、 植物轉化和表型分析可類似于上文實施例所述的規 程。
     實施例 23
     用驗證過的前導基因的玉米和大豆同源物轉化擬南芥屬
     可將驗證過的擬南芥屬前導基因的大豆和玉米同源物在 35S 啟動子的控制下轉 化到擬南芥屬中, 并且當在低氮培養基中生長時分析其葉片面積和綠色區積聚。可如本文 實施例所述進行載體構建和植物轉化。檢測分析的條件、 數據采集和數據分析可類似于上 文實施例所述的規程。
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    65102365365 A CN 102365386序列表16/189 頁
    66102365365 A CN 102365386序列表17/189 頁
    67102365365 A CN 102365386序列表18/189 頁
    68102365365 A CN 102365386序列表19/189 頁
    69102365365 A CN 102365386序列表20/189 頁
    70102365365 A CN 102365386序列表21/189 頁
    71102365365 A CN 102365386序列表22/189 頁
    72102365365 A CN 102365386序列表23/189 頁
    73102365365 A CN 102365386序列表24/189 頁
    74102365365 A CN 102365386序列表25/189 頁
    75102365365 A CN 102365386序列表26/189 頁
    76102365365 A CN 102365386序列表27/189 頁
    77102365365 A CN 102365386序列表28/189 頁
    78102365365 A CN 102365386序列表29/189 頁
    79102365365 A CN 102365386序列表30/189 頁
    80102365365 A CN 102365386序列表31/189 頁
    81102365365 A CN 102365386序列表32/189 頁
    82102365365 A CN 102365386序列表33/189 頁
    83102365365 A CN 102365386序列表34/189 頁
    84102365365 A CN 102365386序列表35/189 頁
    85102365365 A CN 102365386序列表36/189 頁
    86102365365 A CN 102365386序列表37/189 頁
    87102365365 A CN 102365386序列表38/189 頁
    88102365365 A CN 102365386序列表39/189 頁
    89102365365 A CN 102365386序列表40/189 頁
    90102365365 A CN 102365386序列表41/189 頁
    91102365365 A CN 102365386序列表42/189 頁
    92102365365 A CN 102365386序列表43/189 頁
    93102365365 A CN 102365386序列表44/189 頁
    94102365365 A CN 102365386序列表45/189 頁
    95102365365 A CN 102365386序列表46/189 頁
    96102365365 A CN 102365386序列表47/189 頁
    97102365365 A CN 102365386序列表48/189 頁
    98102365365 A CN 102365386序列表49/189 頁
    99102365365 A CN 102365386序列表50/189 頁
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    101102365365 A CN 102365386序列表52/189 頁
    102102365365 A CN 102365386序列表53/189 頁
    103102365365 A CN 102365386序列表54/189 頁
    104102365365 A CN 102365386序列表55/189 頁
    105102365365 A CN 102365386序列表56/189 頁
    106102365365 A CN 102365386序列表57/189 頁
    107102365365 A CN 102365386序列表58/189 頁
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    117102365365 A CN 102365386序列表68/189 頁
    118102365365 A CN 102365386序列表69/189 頁
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    138102365365 A CN 102365386序列表89/189 頁
    139102365365 A CN 102365386序列表90/189 頁
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    161102365365 A CN 102365386序列表112/189 頁
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    163102365365 A CN 102365386序列表114/189 頁
    164102365365 A CN 102365386序列表115/189 頁
    165102365365 A CN 102365386序列表116/189 頁
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    175102365365 A CN 102365386序列表126/189 頁
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    178102365365 A CN 102365386序列表129/189 頁
    179102365365 A CN 102365386序列表130/189 頁
    180102365365 A CN 102365386序列表131/189 頁
    181102365365 A CN 102365386序列表132/189 頁
    182102365365 A CN 102365386序列表133/189 頁
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    184102365365 A CN 102365386序列表135/189 頁
    185102365365 A CN 102365386序列表136/189 頁
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     任何植物都可以選擇用來鑒定將用于本發明重組 DNA 構建體的調控序列和基因。 適用于分離基因和調控序列的靶植物的實例應該包括但不限于苜蓿、 蘋果、 杏、 擬南芥屬植 物、 洋薊、 芝麻菜、 蘆筍、 鱷梨、 香蕉、 大麥、 豆類、 甜菜、 黑莓、 藍莓、 西蘭花、 抱子甘藍、 卷心 菜、 低芥酸菜籽、 香瓜、 胡蘿卜、 木薯、 蓖麻、 菜花、 芹菜、 櫻桃、 菊苣、 芫荽、 柑桔類、 克萊門氏 小柑橘類、 三葉草、 椰子、 咖啡、 玉米、 棉、 蔓越莓、 黃瓜、 花旗松、 茄子、 菊苣、 茅菜、 桉樹、 茴 香、 無花果、 大蒜、 葫蘆、 葡萄、 柚子樹、 白蘭瓜、 豆薯、 獼猴桃、 生菜、 韭蔥、 檸檬、 酸橙、 火炬 松、 亞麻子、 玉米、 芒果、 甜瓜、 蘑菇、 油桃、 堅果、 燕麥、 油棕、 油菜、 秋葵、 橄欖樹、 洋蔥、 橙、 觀 賞植物、 棕櫚、 木瓜樹、 歐芹、 歐洲防風草、 豌豆、 桃樹、 花生、 梨樹、 胡椒、 柿樹、 松樹、 菠蘿、 大 蕉、 李樹、 石榴樹、 白楊、 馬鈴薯、 南瓜、 溫柏、 輻射松、 紅菊苣、 蘿卜、 油菜、 樹莓、 稻、 黑麥、 高 粱、 南方松、 大豆、 菠菜、 南瓜、 草莓、 甜菜、 甘蔗、 向日葵、 甘薯、 楓香樹、 柑橘、 茶、 煙草、 蕃茄、 黑小麥、 草皮草、 蕪菁、 葡萄樹、 西瓜、 小麥、 薯蕷和西葫蘆。
     組合物
     本發明的組合物是其基因組中包含本發明的任何重組 DNA 構建體 ( 包括任何抑制 DNA 構建體 )( 例如上面所討論的任何一種其他構建體 ) 的植物。 組合物也包括任何植物的 子代, 以及獲取自植物或其子代的任何種子, 其中所述子代或種子在其基因組中包含重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 )。子代包括通過植物的自花授粉或異型雜交而獲得的連 續世代。子代也包括雜交種和近交系。
     在雜交種子繁殖的農作物中, 成熟的轉基因植物可自花授粉而產生純合的自交系 植物。該近交系植物產生含有新引入的重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的種子。這 些種子可以生長而產生將會表現出改變的農學特性 ( 如, 在氮限制條件下農學特性增加 ) 的植物, 或者可以用于育種程序以產生雜交種子, 這些雜交種子可以生長而產生將會表現 出如改變的農學特性的植物。所述種子可為玉米種子。
     植物可為單子葉植物或雙子葉植物, 例如玉米或大豆植物, 如玉米雜種植物或玉 米自交系植物。植物還可以是向日葵、 高梁、 低芥酸菜籽、 小麥、 苜蓿、 棉、 稻、 大麥、 小米、 甘 蔗、 或柳枝稷。
     重組 DNA 構建體可穩定地整合進植物的基因組中。
     具體實施方案包括但不限于下列的 :
     1. 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有 一種氨基酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%、 51%、 52%、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98%、 99%、 或 100%的序列同一性, 并且其中所述植物在與未包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出增加的氮脅迫耐受性。在與該對照植物比較時, 該植物還可表 現出至少一種農學特性的改變。
     2. 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 該重組 DNA 構 建體包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼包含 SNF2 結構域的多肽, 并且其中在與未包含所述重組 DNA 構建體的對照植物比較時, 所述植物表 現出增加的氮脅迫耐受性。在與該對照植物比較時, 該植物還可表現出至少一種農學特性 的改變。
     3. 在基因組中包含重組 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 該重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少一種調控序列的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼包含 SNF2 結構域的多肽, 并且其中在與未包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時, 所述植 物表現出在氮限制條件下至少一種農學特性的改變。
     4. 在因組中包含重組 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 所述重組 DNA 構 建體包含可操作地連接到至少一種調控元件的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種 氨基酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99%、 或 100%的序列同一性, 并且其中所述植物在與未包含所述重組 DNA 構建體的對照植 物進行比較時表現出在氮限制條件下至少一種農學特性的改變。
     5. 在基因組中包含抑制 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 該抑制 DNA 構建體包含至少一種可操作地連接至源自受關注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部 分的區域的調控元件, 當與所述區域所來源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時, 基于 Clustal V 比對方法, 所述區域的核酸序列具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86%、 87%、 88 %、 89%、 90 %、 91%、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或 100 % 的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的多肽, 并且其中在與 未包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時, 所述植物表現出在氮限制條件下至少 一種農學特性的改變。
     6. 在基因組中包含抑制 DNA 構建體的植物 ( 例如玉米或大豆植物 ), 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控元件, 該調控元件可操作地連接至以下序列的全部或部分 : (a) 編碼多肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%序列同一性 ; 或 (b)(a) 的核酸序列的全長互補序列, 并且其 中所述植物在氮限制條件下在與不包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出至少一種農學特性的改變。
     7. 上述實施方案 1-6 中的植物的任何子代、 上述實施方案 1-6 中的植物的任何種 子、 上述實施方案 1-6 中的植物的子代的任何種子以及來自上述實施方案 1-6 中的任何植 物以及它們的子代的細胞。
     在前述實施方案 1-7 的任一項中或本發明的任何其他實施方案中, 包含 SNF2 結構 域的多肽可來自擬南芥 (Arabidopsis thaliana)、 玉米 (Zea mays)、 大豆 (Glycine max)、 煙豆 (Glycine tabacina)、 野大豆 (Glycine soja) 或短絨野大豆 (Glycine tomentella)。
     在上述實施方案 1-7 或本發明的任一其他實施方案中的任一項中, 重組 DNA 構建 體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 可包含至少一種在植物中有功能的啟動子作為調控序列。
     在前述實施方案 1-7 中任一項或本發明的任何其他實施方案中, 所述至少一種農 學特性的改變是增加或減少。
     在前述實施方案 1-7 中任一項或本發明的任何其他實施方案中, 所述至少一種農 學特性可選自 : 綠度、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時的鮮重、 成熟時的干重、 果實產量、 種 子產量、 總植物含氮量、 果實含氮量、 種子含氮量、 營養組織含氮量、 總植物氨基酸含量、 營 養組織游離氨基酸含量、 果實游離氨基酸含量、 種子游離氨基酸含量、 總植物蛋白質含量、 果實蛋白質含量、 種子蛋白質含量、 營養組織蛋白質含量、 耐旱性、 氮攝取、 根倒伏抗性、 收 獲指數、 莖倒伏、 植株高度、 穗高、 穗長、 鹽耐受性、 早期幼苗活力、 和在低溫脅迫下的出苗。 例如, 至少一種農學特性的改變可為產量、 綠度或生物量的增加。 在前述實施方案 1-7 中任一項或本發明的任何其他實施方案中, 所述植物在與不 包含所述重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的對照植物在氮脅迫條件下進行比較時, 可表現出至少一種農學特性的改變。
     本領域的普通技術人員熟悉模擬氮條件 ( 限制性的或非限制性的 ) 的規程, 以及 用于評價已經經受過模擬的或天然存在的氮條件 ( 限制性的或非限制性的 ) 的植物的規 程。例如, 技術人員可通過向植物提供比正常需求更少的氮或在一定時期內不提供氮來模 擬氮條件, 并且技術人員可通過尋找農學特性的差異來評價此類植物, 例如在生理學和 / 或物理條件上的變化, 包括 ( 但不限于 ) 活力、 生長、 大小、 或根長、 或具體地講葉片顏色或 葉片面積大小。 用于評價此類植物的其他技術包括測量葉綠素熒光、 光合作用速率、 根生長 或換氣速率。
     下面的實施例描述了一些用于模擬氮限制條件和 / 或在此類條件下評價植物的 代表性規程和技術。
     技術人員也可通過植物在大田測試中, 在模擬的或天然存在的低氮或高氮條件 下保持足夠產量 ( 例如, 至少 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85%、 86%、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%、 或 100%的產量 ) 的能力 ( 例如通過測量在低氮或高氮條件下, 與標準氮條件下相比基本上等 同的產量, 或通過測量在低氮或高氮條件下與對照或參照植物相比更少的產量損失 ) 來評 價氮脅迫耐受性。
     在評估或測量其中利用了對照或參照植物的本發明任何實施方案 ( 例如, 如本文 描述的組合物或方法 ) 中的轉基因植物的農學特性或表型時, 本領域的普通技術人員將很 容易認識到要利用的合適對照植物。例如, 通過如下非限制性示例來說明 :
     1. 轉化過的植物的子代, 該轉化過的植物對于重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建 體 ) 來說是半合子的, 使得該子代分離成包含或不包含該 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的植株 : 包含該重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的子代將通常相對于不包含該重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的子代來進行測量 ( 即, 不包含該重組 DNA 構建體 ( 或抑 制 DNA 構建體 ) 的子代是對照或參照植株 )。
     2. 重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 基因滲入至近交系中, 例如在玉米中, 或 基因滲入進變種中, 例如在大豆中 : 基因滲入品系將通常相對于親本近交系或變種品系進 行測量 ( 即, 親本近交系或品種品系是對照或參照植物 )。
     3. 雙雜交系, 其中第一雜交系由兩個親本近交系產生, 而第二雜交系由相同的兩 個親本近交系產生, 不同的是其中一個親本近交系含有重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建 體): 第二雜交系通常將相對于第一雜交系進行測量 ( 即第一雜交系為對照植物或參照植 物 )。
     4. 包含重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的植株 : 該植株可以相對于這樣 的對照植株進行評估或測量, 該對照植株不包含重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ), 但具有與該植株相當的遺傳背景 ( 例如, 與包含重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 ) 的 植株相比較, 核遺傳物質具有至少 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99%或 100%的序列同一性 )。存在許多可用于分析、 比較和表征植物遺傳背景的基于實 驗室的技術 ; 其中這些技術是同工酶電泳、 限制性片段長度多態性 (RFLP)、 隨機擴增多態 性 DNA(RAPD)、 任何引物聚合成酶鏈反應 (AP-PCR)、 DNA 擴增指紋 (DAF)、 序列特異擴增區域 (SCAR)、 擴增片段長度多態性 (AFLP ) 和也稱為微衛星的簡單序列重復 (SSR)。 此外, 本領域的普通技術人員將容易認識到, 評估或測量轉基因植物的農學特性 或表型時合適的對照或參照植物將不包括先前已經針對所需的農學特性或表型, 通過誘變 或轉化而選擇的植物。
     方法
     方法包括但不限于用于提高植物氮脅迫耐受性的方法、 用于評價植物氮脅迫耐受 性的方法、 用于改變植物農學特性的方法、 用于測定植物農學特性改變的方法、 和用于制備 種子的方法。所述植物可為單子葉或雙子葉植物, 例如玉米或大豆植物。植物還可以是向 日葵、 高梁、 低芥酸菜籽、 小麥、 苜蓿、 棉、 稻、 大麥、 小米、 或甘蔗。所述種子可為玉米或大豆 種子, 例如玉米雜交種子或玉米自交系種子。
     方法包括但不限于如下方法 :
     轉化細胞的方法包括用本發明的任何分離的多核苷酸轉化細胞。 也包括通過這種 方法轉化的細胞。 在具體實施方案中, 所述細胞是真核細胞, 例如酵母、 昆蟲或植物細胞, 或 原核細胞, 例如細菌細胞。
     生產轉基因植物的方法, 所述方法包括用本發明的任何分離的多核苷酸或重組 DNA 構建體 ( 包括抑制 DNA 構建體 ) 來轉化植物細胞并從轉化的植物細胞中再生轉基因植 物。 本發明也涉及由該方法制備的轉基因植物, 以及從該轉基因植物中獲取的轉基因種子。 通過該方法獲取的轉基因植物可被用于本發明的其他方法中。
     用于從細胞或細胞培養基中分離本發明多肽的方法, 其中所述細胞包含具有本發 明多核苷酸的重組 DNA 構建體, 所述多核苷酸可操作地連接到至少一個調控序列, 并且其
     中轉化的宿主細胞在適于重組 DNA 構建體表達的條件下生長。
     改變宿主細胞中本發明多肽表達水平的方法, 所述方法包括 : (a) 用本發明的重 組 DNA 構建體轉化宿主細胞 ; 以及 (b) 在適于表達所述重組 DNA 構建體的條件下培養轉化 過的細胞, 其中重組 DNA 構建體的表達導致轉化過的宿主細胞中的本發明多肽含量改變。
     提高植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 將重組 DNA 構建體引入到可再 生的植物細胞中, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列 ( 例如在植 物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的, 所述 氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%的序列 同一性 ; 和 (b) 在步驟 (a) 之后, 從所述可再生的植物細胞再生出轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體并且在與不包含該重組 DNA 構建體的對照 植物進行比較時表現出提高的氮脅迫耐受性。所述方法可進一步包括 (c) 獲取源自該轉基 因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體并且在與未包含 該重組 DNA 構建體的對照植物比較時表現出增加的氮脅迫耐受性。
     提高植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 將抑制 DNA 構建體引入到可再 生的植物細胞中, 該抑制 DNA 構建體包含可操作地連接至少一種調控序列 ( 例如在植物中 有功能的啟動子 ) 的以下序列的全部或部分 : (i) 編碼多肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸 序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57%、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%的序列同一 性, 或 (ii)(a)(i) 的核酸序列的全長互補序列 ; 以及 (b) 在步驟 (a) 之后, 從該可再生的植 物細胞再生出轉基因植物, 其中該轉基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 并且在 與不包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出增加的氮脅迫耐受性。所述方 法可進一步包括 (c) 獲取源自該轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中 包含抑制 DNA 構建體并且在與未包含該抑制 DNA 構建體的對照植物比較時表現出增加的氮 脅迫耐受性。
     提高植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 將抑制 DNA 構建體引入到可再 生的植物細胞中, 該抑制 DNA 構建體包含可操作地連接源自受關注靶基因有義鏈或反義鏈 的全部或部分區域的至少一種調控序列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 所述區域的核 酸序列基于 Clustal V 比對方法在與所述區域所來源的有義鏈或反義鏈的全部或部分進 行比較時, 具有至少 50%、 51%、 52%、 53%、 54%、 55%、 56%、 57%、 58%、 59%、 60%、 61%、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的多肽 ; 以及 (b) 在步驟 (a) 之后, 從所述可再生的植物細 胞再生出轉基因植物, 其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構建體并且在 與不包含該抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時表現出增加的氮脅迫耐受性。所述方法 可進一步包括 (c) 獲取源自該轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包 含抑制 DNA 構建體并且在與未包含該抑制 DNA 構建體的對照植物比較時表現出增加的氮脅 迫耐受性。
     評價植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含重組 DNA 構建體, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少 一種調控序列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有 一種氨基酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%、 51%、 52%、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98%、 99%或 100%的序列同一性 ; (b) 獲取來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述 子代植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體 ; 以及 (c) 評價所述子代植物在與不包含 所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時的氮脅迫耐受性。
     評價植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控序 列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 其可操作地連接以下序列的全部或部分 : (i) 編碼多 肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %或 100 %的序列同一性 ; 或 (ii)(a)(i) 的核酸序列的全長互補序列 ; (b) 獲取來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構建體 ; 以及 (c) 評價所述子代植物在與不包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行 比較時的氮脅迫耐受性。
     評價植物氮脅迫耐受性的方法, 所述方法包括 : (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控序 列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 其可操作地連接源自受關注靶基因有義鏈或反義鏈 的全部或部分區域, 所述區域的核酸序列基于 Clustal V 比對方法在與所述區域所來源的 有義鏈或反義鏈的全部或部分進行比較時, 具有至少 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 或 100% 的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的多肽 ; (b) 獲取來源 于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構建體; 以及 (c) 評價所述子代植物在與不包含所述抑制 DNA 構建體的對照植物進行比較時的 氮脅迫耐受性。
     測定植物農學特性改變的方法, 所述方法包括 (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含重組 DNA 構建體, 所述重組 DNA 構建體包含可操作地連接至少 一種調控序列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ) 的多核苷酸, 其中所述多核苷酸編碼具有 一種氨基酸序列的, 所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時具有至少 50%、 51%、 52%、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98%、 99%或 100%的序列同一性 ; (b) 獲取來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述 子代植物在其基因組中包含所述重組 DNA 構建體 ; 以及 (c) 測定所述子代植物任選地在氮 限制條件下與不包含所述重組 DNA 構建體的對照植物進行比較時是否表現出至少一種農 學特性的改變。
     測定植物農學特性改變的方法, 所述方法包括 (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控序 列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 其可操作地連接以下序列的全部或部分 : (i) 編碼多 肽的核酸序列, 所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 或 49 進行比較時, 具有至少 50 %、 51 %、 52 %、 53 %、 54 %、 55 %、 56 %、 57 %、 58 %、 59 %、 60 %、 61 %、 62 %、 63 %、 64 %、 65 %、 66 %、 67 %、 68 %、 69 %、 70 %、 71 %、 72 %、 73 %、 74 %、 75 %、 76 %、 77 %、 78 %、 79 %、 80 %、 81 %、 82 %、 83 %、 84 %、 85 %、 86 %、 87 %、 88 %、 89 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97%、 98%、 99%或 100%的序列同一性 ; 或 (ii)(i) 的核酸序列的全長互補序列 ; (b) 獲取 來源于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構 建體 ; 以及 (c) 測定所述子代植物任選地在氮限制條件下與不包含所述抑制 DNA 構建體的 對照植物進行比較時是否表現出至少一種農學特性的改變。
     測定植物農學特性改變的方法, 所述方法包括 (a) 獲取轉基因植物, 其中所述轉 基因植物在其基因組中包含抑制 DNA 構建體, 所述抑制 DNA 構建體包含至少一種調控序列 ( 例如在植物中有功能的啟動子 ), 其可操作地連接源自受關注靶基因有義鏈或反義鏈的 全部或部分的區域, 所述區域的核酸序列基于 Clustal V 比對方法在與所述區域所來源的 有義鏈或反義鏈的全部或部分進行比較時, 具有至少 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 或 100% 的序列同一性, 并且其中所述受關注的靶基因編碼包含 SNF2 結構域的多肽 ; (b) 獲取來源 于所述轉基因植物的子代植物, 其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制 DNA 構建 體; 以及 (c) 測定所述子代植物任選地在氮限制條件下與不包含所述抑制 DNA 構建體的對 照植物進行比較時是否表現出至少一種農學特性的改變。
     產生種子 ( 例如可作為提供氮脅迫耐受性的產品銷售的種子 ) 的方法, 該方法包括任一上述的方法, 并且還包括從所述子代植物獲取種子, 其中所述種子在其基因組中包 含所述重組 DNA 構建體 ( 或抑制 DNA 構建體 )。
     在任何前述方法或本發明的方法的任何其他實施方案中, 在所述導入步驟中所述 可再生的植物細胞可包括愈傷組織細胞、 胚胎愈傷組織細胞、 配子細胞、 分生細胞或未成熟 胚芽細胞。可再生的植物細胞可來自近交系玉米植物。
     在任一前述方法或本發明方法的任一其他實施方案中, 所述再生步驟可包括 : (i) 在包含促胚發生激素的培養基中培養所述轉化的植物細胞, 直至觀察到愈傷組織 ; (ii) 將 步驟 (i) 的所述轉化植物細胞轉移到第一培養基中, 所述培養基包括促組織形成激素 ; 以 及 (iii) 在第二培養基上傳代培養步驟 (ii) 后的所述轉化的植物細胞, 以允許嫩芽伸長、 根發育或這兩者同時發生。
     在任何前述方法或本發明的方法的任何其他實施方案中, 所述至少一種農學特性 可選自 : 綠度、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時的鮮重、 成熟時的干重、 果實產量、 種子產量、 總植物含氮量、 果實含氮量、 種子含氮量、 營養組織含氮量、 總植物氨基酸含量、 營養組織游 離氨基酸含量、 果實游離氨基酸含量、 種子游離氨基酸含量、 總植物蛋白質含量、 果實蛋白 質含量、 種子蛋白質含量、 營養組織蛋白質含量、 耐旱性、 氮攝取、 根倒伏抗性、 收獲指數、 莖 倒伏、 植株高度、 穗高、 穗長、 鹽耐受性、 早期幼苗活力、 和在低溫脅迫下的出苗。 至少一種農 學特性的改變可為產量、 綠度或生物量的增加。 在任一上述方法或本發明的任一方法中, 在與不包含所述重組 DNA 構建體 ( 或抑 制 DNA 構建體 ) 的對照植物在氮限制條件下進行比較時, 植物可表現出至少一種農學特性 的改變。
     在任一前述方法或本發明方法的任何其他實施方案中, 存在供選擇的替代方案用 于將包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸的重組 DNA 構建體導入可再生的 植物細胞中。例如, 可將調控序列 ( 例如一種或多種增強子, 例如, 作為轉座因子的部件 ) 導入可再生的植物細胞, 然后篩選其中將所述調控序列可操作地連接至編碼本發明的多肽 的內源基因的事件。
     將本發明的重組 DNA 構建體引入植物可通過任何合適的技術來進行, 這些技 術包括但不限于 DNA 直接攝取、 化學處理、 電穿孔、 顯微注射、 細胞融合、 感染、 載體介導 的 DNA 轉移、 轟擊或農桿菌屬介導的轉化。植物轉化和再生技術已經在國際專利公布 WO 2009/006276 中進行了描述, 其內容以引用方式并入本文。
     含有編碼受關注蛋白質的外來的外源性分離核酸片段的植物的發育或再生是本 領域所熟知的。可將再生的植物進行自花授粉以產生純合的轉基因植物。或者, 將得自再 生植物的花粉與農學上重要的品系的產生種子的植株進行雜交。相反, 將來自這些重要品 系植物的花粉用于給再生植物授粉。 利用本領域技術人員所熟知的方法培育含有所需多肽 的本發明的轉基因植物。
    實施例 本發明將在下面的實施例中進一步說明, 其中份數和百分比是以重量計并且度數 是攝氏度, 除非另外說明。應該理解, 盡管這些實施例說明了本發明的實施方案, 但僅是以 例證的方式給出的。根據上面的論述和這些實施例, 本領域的技術人員可以確定本發明的
     基本特征, 并在不脫離本發明的精神和范圍的情況下, 可對本發明做出多種改變和修改, 以 使其適用于多種用法和條件。此外, 除了那些本文所示和描述的那些之外, 根據前文所述, 本發明的各種修改形式對本領域的技術人員來說將是顯而易見的。 這些修改形式也旨在涵 蓋于所附權利要求書的范圍內。
     實施例 1
     制備具有激活標記基因的擬南芥種群
     構建 18.49kb 的 T-DNA 基二元構建體, pHSbarENDs2(SEQ ID NO : 1; 圖 1) 包含四 個來源于花椰菜花葉病毒 35S 啟動子的四個多聚增強子元件 ( 對應于序列 -341 至 -64, 如 Odell 等人 Nature 313 : 810-812 所述 (1985))。該構建體也包含允許質粒救援的載體序列 (pUC9) 和多接頭 (SEQ ID NO : 11)、 再動員 T-DNA 的轉座子序列 (Ds)、 以及允許草胺磷選擇 轉基因植物的 bar 基因。原則上, 僅將從右邊界 (RB) 至左邊界 (LB) 包含的 10.8kb 片段轉 移到寄主植物基因組中。因為增強子元件位于靠近 RB 處, 它們可誘導 T-DNA 整合后的基因 組位點順式激活。
     通過整個植株的農桿菌屬轉化制備擬南芥屬激活標記種群。將 pHSbarENDs2 構建 體轉化到根癌農桿菌菌株 C58 中, 在 25℃下在溶菌肉湯培養基中培養至 OD600 ~ 1.0。然 后離心沉淀細胞, 并重懸在相等體積的 5%蔗糖 /0.05% Silwet L-77(OSI Specialties, Inc) 中。在早期抽薹時, 培育擬南芥生態型 Col-0 的土壤使用農桿菌屬懸浮液進行頂部灌 溉。 一周后, 相同植株再次用在蔗糖 /Silwet 中的相同農桿菌屬菌株進行頂部灌溉。 然后將 該植物的種子設為標準。所得 T1 種子在土壤中播種, 通過噴灑草胺磷 (FINALE ; AgrEvo ; Bayer Environmental Science) 選擇轉基因幼苗。選擇了總計 100,000 個草胺磷抗性 T1 幼苗。分開保存來自每個品系的 T2 種子。
     實施例 2
     篩選以鑒定具有低氮耐受性的品系
     來 自 每 個 100,000 個 分 離 T1 激 活 標 記 品 系 的 十 一 個 T2 植 物 可 種 植 在 方 板 (15mm×15mm) 上, 方板包含 0.5x N-Free Hoagland’ s, 0.4mM 硝酸鉀, 0.1%蔗糖, 1mM MES TM 和 0.25% Phyytagel ( 低氮培養基 )。 每個板種植五個品系, 并且每個板包括 9 個野生型個 體以使總計 64 個個體排列成 8×8 的網格圖案 ( 參見圖 12)。在暗處、 4℃條件下保持平板 三天以使種子分層, 然后在 22℃光照和 20℃黑暗交替條件下水平放置九天。光周期為十六 小時光照和八小時黑暗, 平均光照強度為~ 200mmol/m2/s。每天旋轉并振動每個架子中的 平板。在第十二天 ( 生長九天 ), 對整個板拍照以評價幼苗狀態。
     在掩蔽該平板圖像以去除背景顏色后, 每個個體收集兩個不同的測量數據 : 總羅 賽塔面積和進入綠色區的顏色百分比。使用色調、 飽和度和強度數據 (HSI), 綠色區由色調 50 至 66 組成。 總羅賽塔面積用作植物生物量的量度, 而綠色區通過劑量 - 響應研究已經顯 示指示氮同化作用 ( 參見圖 13)。
     將在與野生型對照植物進行比較時具有顯著的總羅賽塔面積和 / 或綠色區增加 的品系命名為 Phase 1 hits。在相同分析條件下進行 Phase 1hits 的重復試樣再篩選 (Phase 2 篩選 )。還通過 Phase 3 篩選以進一步驗證通過 Phases 1 和 2 的突變體。在 Phase 3 中, 將每個品系分開種植在低氮培養基中, 使得 32 個 T2 個體緊鄰著 32 個野生型個 體生長, 為分析提供更高的統計學嚴謹性。如果一個品系顯示與 Phase 3 中對照的顯著差異, 然后可認為該品系是經驗證的氮缺乏抗性品系。
     實施例 3
     鑒定激活標記基因
     在氮耐受性品系中側接 T-DNA 插入序列的基因使用以下兩個標準程序中的一個 或兩個進行鑒定 : (1) 熱不對稱交錯 (TAIL)PCR(Liu 等人, Plant J.8 : 457-63(1995)) ; 以及 (2)SAIFF PCR(Siebert 等人, Nucleic Acids Res.23 : 1087-1088(1995))。至于復雜的多 聚 T-DNA 插入序列, TAIL PCR 和 SAIFF PCR 可能均不足以鑒定候選基因。在這些情況下, 可使用包括反式 PCR、 質粒拯救和 / 或基因組文庫構建在內的其他程序。
     成功的結果是其中單個 TAIL 或 SAIFF PCR 片段包含 T-DNA 邊界序列和擬南芥屬 基因組序列。一旦獲取側接 T-DNA 插入序列的基因組序列標記, 通過與公開可用的擬南芥 屬基因組的序列比對來鑒定候選基因。具體地講, 最靠近 35S 增強子元件 /T-DNA RB 的注 釋基因是激活的基因的候選基因。
     為了驗證鑒定的基因真的靠近 T-DNA 并排除 TAIL/SAIFF 片段是嵌合偽克隆的可 能性, 用一個 T-DNA 中的寡核苷酸和一個候選基因特異性的寡核苷酸進行對基因組 DNA 的 診斷 PCR。將提供 PCR 產品的基因組 DNA 樣本理解為表示 T-DNA 插入序列。該分析也驗證 了其中一種以上的插入事件發生在相同品系中的情況, 例如, 在 TAIL 和 / 或 SAIFF PCR 分 析中鑒定是否有多個不同基因組片段。
     實施例 4
     鑒定編碼包含 SNF2 結構域的多肽的激活標記基因
     進一步分析了顯示出氮缺乏耐受性的激活標記品系 ( 品系 112579)。提取來自該 品系的 DNA, 并且在突變品系中側接 T-DNA 插入序列的基因通過連接介導 PCR(Siebert 等 人, Nucleic Acids Res.23 : 1087-1088(1995)) 進行鑒定。鑒定一個單獨擴增的片段, 它包 含 T-DNA 邊界序列和擬南芥屬基因組序列。一旦獲取側接 T-DNA 插入序列的基因組序列標 記, 通過與完全擬南芥屬基因組的序列比對鑒定候選基因。具體地講, 最靠近 35S 增強子元 件 /T-DNA RB 的注釋基因是品系中激活的基因的候選基因。就品系 112579 而言, 最靠近 35S 增強子的基因是 At1g61140, 它編碼擬南芥包含 SNF2 結構域的多肽。
     實施例 5
     通過轉化擬南芥屬驗證候選的擬南芥基因 (At1g61140)
     可將候選基因轉化到擬南芥屬中并在 35S 啟動子作用下過表達。如果在轉基因品 系中觀察到與親本激活標記品系相同或相似的表型, 則將該候選基因認為是擬南芥屬中驗 證過的 “前導基因” 。
     候選擬南芥屬基因 (At1g61140) 編碼包含 SNF2 結構域的多肽, 用以下方法測試其 賦予氮缺乏耐受性的能力。設計引物以擴增突變體 At1g61140.1。
     通過 RT-PCR, 用以下引物擴增 At1g61140.1cDNA(SEQ ID NO : 24) :
     1.At1g61140-5’ attB 正向引物 (SEQ ID NO : 33)
     正向引物包含 attB1 序列 (ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT ; SEQ ID NO : 12) 和共有 的 Kozak 序列 (CAACA) 蛋白編碼區上游的前 21 個核苷酸 ( 以所述 cDNA 的 ATG 起始密碼子 開頭 )。
     2.At1g61140-3’ attB 反向引物 (SEQ ID NO : 34)。反向引物包含 attB2 序列 (ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT ; SEQ ID NO : 13), 該序列 鄰近蛋白編碼區的反向互補序列的后 21 個核苷酸 ( 以所述 cDNA 的終止密碼子的反向互補 序列開頭 )。
     使用 INVITROGENTM GATEWAY CLONASETM 技術, 用 pDONRTMZeo(SEQ ID NO : 2; 圖 2) 對每個 RT-PCR 產物進行了 BP 重組反應。這種方法將細菌致死 ccdB 基因以及氯霉素抗性 基因 (CAM) 從 pDONRTMZeo 移除并定向地克隆了該在旁側具有 attB1 和 attB2 位點的 PCR 產 物而得到入門克隆 (entry clone)。鑒定為陽性的入門克隆與一個目的載體一起被用于隨 后的 LR 重組反應, 如下所述。
     用緊接 INVITROGENTMGATEWAY C1 轉化插入序列上游的 1.3-kb35S 啟動子構建 稱為 pBC-yellow(SEQ ID NO : 4; 圖 4) 的基于 16.8-kbT-DNA 的二元載體 ( 目的載體 ), 所述插入序列包含 ccdB 細菌致死基因以及側接 attR1 和 attR2 序列的氯霉素抗性基因 (CAM)。該載體還包含 RD29a 啟動子, 該啟動子驅動基因表達 ZS-Yellow(INVITROGENTM), 它 TM 賦予轉化過的種子黃色熒光。使用 INVITROGEN GATEWAY 技術, 對包含核苷酸編碼序列 At1g61140.1(SEQ ID NO : 24) 和 pBC-yellow 載體的入門克隆進行 LR 重組反應 ; 然而, 也可 使用任一種其他突變體 (SEQ ID NO : 26 和 28)。該擴增允許迅速地定向克隆在 pBC-yellow 中的 35S 啟動子之后的 At1g61140.1(SNF2.1 ; SEQ ID NO : 24)。 申請人然后使用如實施例 1 所述的相同農桿菌介導的轉化程序將 35S 啟動子 : At1g61140 表達構建體導入野生型擬南芥屬生態型 Col-0 中。 轉基因 T1 種子通過黃色熒光 進行選擇, 并且將 32 個這些 T1 種子緊鄰著 32 個野生型擬南芥屬生態型 Col-0 種子種植在 低氮培養基上。所有隨后的生長和拍照條件均如實施例 1 所述。發現來自激活標記的、 對 氮限制條件具有耐受性的初始表型, 可在用其中 At1g61140 基因通過 35S 啟動子直接表達 的構建體轉化過的野生型擬南芥屬植物中重現。
     實施例 6a
     cDNA 文庫的制備和 cDNA 克隆的分離和測序
     cDNA 文庫可通過許多可用的方法中的任一種制備。例如, 通過首先根據生產商的 說明書 (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) 制備 Uni-ZAPTMXR 載體中的 cDNA 文 庫, 可將 cDNA 引入質粒載體中。 根據 Stratagene 提供的說明書, 將 Uni-ZAPTMXR 文庫轉換成 質粒文庫。當轉換的時候, 將把 cDNA 插入序列包含于質粒載體 pBLUESCRIPT 中。此外, 可
    使用 T4 連接酶 (New England Biolabs) 將 cDNA 直接導入預切過的 BLUESCRIPT II SK(+) 載體 (Stratagene) 中, 隨后按照制造商規程 (GIBCO BRL Products) 轉染 DH10B 細胞。一 旦 cDNA 插入序列處于質粒載體中, 從隨機選取的含重組 pBLUESCRIPT 質粒的細菌菌落制 備質粒 DNA, 或者用對插入的 cDNA 序列旁側的載體序列特異性的引物, 通過聚合酶鏈式反 應擴增插入的 cDNA 序列。將擴增的 DNA 插入序列或質粒 DNA 在染料 - 引物標記法測序反 應 (dye-primer sequencing reaction) 中進行測序, 以產生部分 cDNA 序列 ( 表達序列標 記或 “EST” ; 參見 Adams 等人, Science 252 : 1651-1656(1991))。用 Perkin Elmer Model 377 熒光測序儀分析所得的 EST。
     用改進的轉座規程產生全長插入序列 (FIS) 數據。從歸檔的甘油原種作為單一菌 落回收確定了 FIS 的克隆, 并通過堿性裂解分離質粒 DNA。將分離的 DNA 模板在基于 PCR 的 測序反應中與載體引物 M13 正向和反向寡核苷酸反應并上樣至自動化的測序儀上。通過與對其進行 FIS 查詢的初始 EST 序列進行序列比對來確認克隆鑒定。
     將確認的模板通過基于釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)Ty1 轉座因子 (Devine 和 Boeke, Nucleic Acids Res.22 : 3765-3772(1994)) 的 Primer Island 轉座試劑 盒 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) 進行轉座。該體外轉座系統在整個一組大 DNA 分子中隨機地放入獨特的結合位點。隨后將轉座的 DNA 用于通過電穿孔轉化 DH10B 電 感受態細胞 (GIBCO BRL/Life Technologies, Rockville, MD)。轉座因子含有另外的可選 標記 ( 稱為 DHFR ; Fling 和 Richards, Nucleic Acids Res.11 : 5147-5158(1983)), 使得能 在瓊脂平板上僅雙重篩選含有整合的轉座子的那些亞克隆。 從每次轉座反應隨機地選擇多 個亞克隆, 通過堿性裂解制備質粒 DNA, 并用對轉座子內的結合位點特異性的獨特引物從轉 座事件位點向外進行測序 (ABI PRISM dyeterminator ReadyReaction mix)。
     收 集 序 列 數 據 (ABI PRISM Collections) 并 用 Phred 和 Phrap(Ewing 等 人, Genome Res.8 : 175-185(1998) ; Ewing 等人, Genome Res.8 : 186-194(1998)) 組裝。Phred 是一種公用軟件程序, 該程序再次讀取 ABI 序列數據, 再次調出 (recall) 堿基, 賦質量值, 并將堿基序列 (base call) 和質量值寫入可編輯的輸出文件中。Phrap 序列組裝程序使用 這些質量值來增加組裝的序列重疊群的準確度。通過 Consed 序列編輯器 (Gordon 等人, Genome Res.8 : 195-202(1998))。
     在一些克隆中, cDNA 片段對應基因的 3’ 端的一部分并且不會涵蓋整個開放閱讀 框。為了獲取上游信息, 使用兩種不同規程中的一種。這兩種方法中的第一種方法導致產 生含有所需基因序列的部分的 DNA 片段, 而第二種方法導致產生含有整個開放閱讀框的片 段。這兩種方法均使用兩輪 PCR 擴增以從一個或多個文庫獲取片段。有時基于以前的知識 ( 特定的基因應該存在于某些組織中 ) 選擇文庫, 有時則進行隨機地選擇。 獲取相同基因的 反應可平行地在若干文庫中進行, 或者在文庫池中進行。文庫池通常用 3 至 5 個不同的文 庫制備并且使其歸一化而成為一致的稀釋度。在第一輪擴增中, 兩種方法均使用載體特異 性的 ( 正向 ) 引物, 同時還使用基因特異性的 ( 反向 ) 引物, 該正向引物對應位于克隆 5’ 端處的載體的一部分。第一種方法使用與已知基因序列的一部分互補的序列, 而第二種方 法使用與 3’ 非翻譯區 ( 也稱為 UTR) 的一部分互補的基因特異性引物。在第二輪擴增中, 兩種方法均使用套式引物組。按照生產商的說明書, 用市售試劑盒將所得 DNA 片段連接進 pBLUESCRIPT 載體中。該試劑盒選自可得自包括 INVITROGENTM(Carlsbad, CA)、 Promega Biotech(Madison, WI) 和 Gibco-BRL(Gaithersburg, MD) 在內的一些供應商的許多試劑盒。 如上所述, 將質粒 DNA 通過堿性裂解方法分離并進行測序和用 Phred/Phrap 進行裝配。
     實施例 6B
     制備 cDNA 文庫并獲取序列
     可利用用于總 RNA 分離的 Qiagen RNA 分離試劑盒分離 mRNA, 然后通過吸附到 Invitrogen(Life Technologies, Carlsbad, CA) 的 oligo(dT)Dynabeads 上分離 mRNA, 并且 測序文庫能夠使用 Illumina, Inc.(SanDiego, CA) 的標準 mRNA-Seq 試劑盒和規程進行制 備。在這一方法中, 使用 ZnCl2 溶液破壞 mRNA, 使用隨機引物將其反轉錄成 cDNA, 進行末端 修復以制備鈍末端片段, 3’ A- 尾化, 并且用 Illumina 雙末端文庫接頭進行連接。然后可使 用 Illumina 雙末端文庫引物對連接好的 cDNA 片段進行 PCR 擴增, 并且能夠在用配有雙末 端模塊的 Genome Analyzer II 測序前使用 Agilent Bioanalyzer DNA 1000 芯片檢查純化PCR 產物的質量和數量。
     測序運行中的讀數可在組合之前進行軟修剪以使觀察到具有低于 15 的 FASTQ 質 量評分的每個讀數的首個堿基對和后面所有堿基對通過 Python Script 進行修剪。Velvet 裝 配 器 (Zerbino 等 人, Genome Research18 : 821-9(2008)) 能 在 不 同 kmer 和 覆 蓋 截 斷 (coverage cutoff) 參數下運行以制備某一嚴格性范圍內的若干個推定裝配物。能夠使用 Vmatch 軟件 ( 在 Vmatch 網站上可用 ) 將在那些裝配物內的鄰接序列 ( 重疊群 ) 組合成組 使得被鑒定為較長重疊群亞組的重疊群分組并被排除, 留下最長 “sentinel” 重疊群的非冗 余組。這些非冗余組能用于與來自已知模型植物種類的同源序列進行比對。
     如果重疊群不提供完整基因, 能夠經由 Blast 或 Perl Script, 使用在第一次搜索 中發現的序列對非冗余組進行再查詢。如果發現了延伸所述重疊群末端的序列, 它們能夠 用桌面裝配器如 DNAStar′ s SeqMan 或 GeneCode′ s Sequencher 與初始序列一起進行裝 配。可重復這些步驟直至不再發現更多的延伸序列。就仍不完整的轉錄物而言, 理論上屬 于一類 ( 基于與其他草本植物的同源性 ) 的基因片段能用來自另一種草本植物的連接序列 進行人工連接。
     實施例 7 鑒定 cDNA 序列
     編碼包含 SNF2 結構域的多肽的 cDNA 序列通過 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool ; Altschul 等人, J.Mol.Biol.215 : 403-410(1993) ; 還可參見國立衛生研究院 國家醫學圖書館的國家生物技術信息中心的萬維網址上對 BLAST 算法的解釋 ) 進行鑒定, 尋找與 BLAST“nr” 數據庫中所包含氨基酸序列 ( 包括所有非冗余 GenBank CDS 翻譯序列、 源自 3 維結構 Brookhaven 蛋白質數據庫 (Protein Data Bank)、 SWISSPROT 蛋白質序列數 據庫的最新的主要版本、 EMBL 和 DDBJ 數據庫的序列 ) 的相似性。在所有的閱讀框中翻譯 DNA 序列并用 NCBI 提供的 BLASTX 算法 (Gish 和 States, Nat.Genet.3 : 266-272(1993)) 比 較與包含在 “nr” 數據庫中的所有可公開獲取的氨基酸序列的相似性。采用國家生物技術 信息中心 (NCBI) 提供的 BLASTP 算法, 分析 cDNA 序列編碼的多肽與包含在 “nr” 數據庫中 的所有可公開獲取的氨基酸序列的相似性。為方便起見, 通過 BLAST 計算僅僅偶然觀察到 cDNA 序列與所搜索的數據庫中所包含序列的匹配的 P 值 ( 概率 ) 或 E 值 ( 期望值 ), 在本 文報導為 “pLog” 值, 它代表所報導的 P 值或 E 值的負對數。因此, pLog 值越大, cDNA 編碼 的序列和 BLAST 的 “匹配” 代表同源蛋白的可能性就越大。
     EST 序 列 可 與 如 上 所 述 的 Genbank 數 據 庫 進 行 比 較。 通 過 使 用 BLASTN 算 法 (Altschul 等人, Nucleic Acids Res.25 : 3389-3402(1997)) 對杜邦專利數據庫比較具有序 列同源共有區域或重疊區域的核苷酸序列, 可找到含更 5′端或 3′端序列的 EST。在兩個 或更多個核酸片段之間存在共有或重疊序列時, 該序列可裝配成單一的連續核苷酸序列, 從而使最初的片段在 5′或 3′初始方向上延伸。一旦確定了最 5′的 EST, 即能通過全長 插入序列來確定其完整的序列。
     可用 tBLASTn 算法, 通過將已知基因 ( 來自專有來源或公開數據庫的已知基因 ) 的氨基酸序列對 EST 數據庫進行比較, 可找到屬于不同物種的同源基因。 tBLASTn 算法對所 有 6 個閱讀框都翻譯了的核苷酸數據庫進行氨基酸查詢的搜索。該搜索允許不同物種之間 的核苷酸密碼子使用的差異, 并且允許密碼子簡并。
     實施例 8a
     表征編碼編碼包含 SNF2 結構域的多肽的 cDNA 序列
     制備提供來自玉米 (Zea mays)、 畫眉草 (Eragrostis nindensis)(Resurrection grass)、 和百喜草 (Paspalum notatum)(Bahiagrass) 不同組織的 mRNA 的 cDNA 文庫。下面 描述了該文庫的特征。
     表2
     來自玉米的 cDNA 文庫
    如 表 3、 圖 16A-AM 和 圖 17 所 示, 表 2 中 鑒 定 的 cDNA 編 碼 類 似 于 以 下 多 肽 的 多肽: 來 自 擬 南 芥 (At1g61140.1(GI No.186492170 ; SEQ ID NO : 25) ; At1g61140.2(GI No.186492172 ; SEQ ID NO : 27) ; 和 At1g61140.3(GI No.186492175 ; SEQ ID NO : 29)) 的 包 含 SNF2 結 構 域 的 多 肽、 和 來 自 水 稻 (GI No.53792213, 對 應 于 SEQ ID NO : 30, GI No.218200575, 對應于 SEQ ID NO : 31, 以及 GI No.90399293, 對應于 SEQ ID NO : 32) 以及高 粱 (GI No.242058897, 對應于 SEQ ID NO : 49) 的包含 SNF2 結構域的多肽。
     表 3( 非專利文獻 ) 和表 4( 專利文獻 ) 中所示的分別是單獨的 EST( “EST” )BLASTP 結果、 包含標明的 cDNA 克隆的整個 cDNA 插入物的序列 ( “FIS” )、 由兩個或更多個 EST、 FIS 或 PCR 序列裝配而成的重疊群序列 (“Contig” )、 或編碼源自 FIS 或重疊群的完整蛋白或 功能性蛋白的序列 (“CGS” )。表 3 和表 4 也顯示了使用 Clustal V 比對方法、 使用默認參 數計算的每對氨基酸序列的序列同一性百分比值 ( 如下所述 )。
     表3
     多肽的 BLASTP 結果
     包含 SNF2 結構域的多肽的同源物
    
    
    
    
    表4 多肽的 BLASTP 結果 包含 SNF2 結構域的多肽的同源物實施例 8b
     鑒定其他包含 SNF2 結構域的多肽
     與 編 碼 包 含 SNF2 結 構 域 的 蛋 白 的 前 導 基 因 同 源 的 序 列 可 使 用 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool ; Altschul 等 人, J.Mol.Biol.215 : 403-410(1993) ; 也參 見美國國家衛生研究院 (National Institutes of Health) 國立醫學圖書館 (National Library of Medicine) 的國家生物技術信息中心 (National Center for Biotechnology Information) 的萬維網網址上對 BLAST 算法的解釋 ) 之類的序列比較算法進行鑒定。例 如, 由 At1g61140 編碼的蛋白的氨基酸序列用作查詢序列, 使用 BlastP 查詢公共數據庫, 并 且隨后將如 SEQ ID NO : 40、 42、 和 48 所示的多肽序列鑒定為同源物 ( 對應的核苷酸序列分 別是 SEQ ID NO : 39、 41、 和 47)。 對公共 BAC 序列進行的 TblastN 搜索也鑒定了 SEQ ID NO : 44( 對應的核苷酸序列是 SEQ ID NO : 43) 所示的玉米同源物。
     實施例 8c
     包含 SNF2 結構域的多肽的序列比對和同一性百分比計算
     圖 16A-AM 給 出 如 SEQ ID NO : 19、 21、 23、 25、 27、 29、 30、 31、 32、 36、 38、 40、 42、 44、
     46、 48、 和 49 所示的氨基酸序列比對結果。圖 17 示出圖 16A-AM 中顯示的每對氨基酸序列 的序列同一性百分比和趨異值的圖表。
     用 LASERGENE 生物信息計算包 (DNASTAR Inc., Madison, WI) 的 MEGALIGN 程 序進行序列比對和同一性百分比計算。用 Clustal 比對方法 (Higgins 和 Sharp(1989), CABIOS.5 : 151-153) 進行序列的多重比對, 默認參數 ( 空位罰分= 10, 空位長度罰分= 10)。使用 Clustal 方法采用以下逐對比對的默認參數 : KTUPLE 1, 空位罰分= 3, 窗口= 5, DIAGONALS SAVED = 5。 實施例 9
     包含擬南芥屬前導基因的同源物的植物表達載體的制備
     與 編 碼 包 含 SNF2 結 構 域 的 蛋 白 的 前 導 基 因 同 源 的 序 列 可 使 用 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool ; Altschul 等 人, J.Mol.Biol.215 : 403-410(1993) ; 也參 見美國國家衛生研究院 (National Institutes of Health) 國立醫學圖書館 (National Library of Medicine) 的國家生物技術信息中心 (National Center for Biotechnology Information) 的萬維網網址上對 BLAST 算法的解釋 ) 之類的序列比較算法進行鑒定。 與編 碼包含 SNF2 結構域的蛋白的基因類似的核苷酸序列, 如實施例 8A-C 所述的序列, 可通過任 何一種以下方法進行 PCR 擴增。
     方法 1( 基于 RNA 的方法 ) : 如果蛋白編碼區域的 5’ 和 3’ 序列信息是可用的, 可 如實施例 5 所述設計基因特異性引物。可將 RT-PCR 用于植物 RNA 來獲取含有蛋白編碼區 的核酸片段, 該 EXST 蛋白編碼區旁側為 attB1(SEQ ID NO : 12) 和 attB2(SEQ ID NO : 13) 序 列。引物可含有起始密碼子上游的共有 Kozak 序列 (CAACA)。
     方法 2( 基于 DNA 的方法 ) : 作為另外一種選擇, 如果 cDNA 克隆是可用的, 可以 PCR 擴增完整 cDNA 插入序列 ( 含有 5′和 3′非編碼區 )。可設計正向引物和反向引物, 使它們 分別或者含有 attB1 序列和在該 cDNA 插入序列前面的載體特異性序列或者含有 attB2 序 列和在該 cDNA 插入序列后面的載體特異性序列。對于克隆進載體 pBLUESCRIPT SK+ 中的 cDNA 插入序列, 可使用正向引物 VC062(SEQ ID NO : 16) 和反向引物 VC063(SEQ ID NO : 17)。
     方 法 3( 基 于 基 因 組 DNA 的 方 法 ) : 能 夠 使 用 長 程 基 因 組 PCR 捕 集 獲 取 基 因 組 序 列。 能 夠 基 于 基 因 座 序 列 設 計 引 物, 并 且 能 夠 對 所 得 PCR 產 物 測 序。 能 夠 使 用 FGENESH(Salamov, A.and Solovyev, V.(2000)Genome Res., 10 : 516-522) 程序進行序列分 析, 并且任選地能夠與來自其他物種的同源序列進行比對以輔助鑒定推定的內含子和外顯 子。
     方法 1、 2 和 3 可根據本領域技術人員已知的步驟進行修改。例如, 方法 1 的引物 可含有限制性酶切位點而不是 attB1 和 attB2 位點, 用于后來將 PCR 產物克隆進含有 attB1 和 attB2 位點的載體內。另外, 方法 2 可涉及從 cDNA 克隆、 λ 克隆、 BAC 克隆或基因組 DNA 擴增。
     可利用 BP 重組反應將通過任一種上述方法獲取的 PCR 產物與 GATEWAY 供體載
    體 ( 例如 pDONRTMZeo(SEQ ID NO : 2; 圖 2) 或 pDONRTM221(SEQ ID NO : 3; 圖 3) 組合。這種方 TM 法將細菌致死 ccdB 基因以及氯霉素抗性基因 (CAM) 從 pDONR Zeo 或 pDONRTM221 移除并定 向地克隆了在旁側具有 attB1 和 attB2 位點的 PCR 產物而得到入門克隆 (entry clone)。 使用 INVITROGENTM GATEWAY CLONASETM 技術, 然后可將來自入門克隆的編碼同源包含 SNF2結構域的多肽的序列轉移到合適的目的載體中, 例如 pBC-Yellow(SEQ ID NO : 4; 圖 4)、 PHP27840(SEQ ID NO : 5; 圖 5)、 或 PHP23236(SEQ ID NO : 6; 圖 6), 以獲取植物表達載體, 所 述載體分別用于擬南芥屬、 大豆、 和玉米。 TM
     供體載體 pDONR /Zeo 或 pDONRTM221 的 attP1 和 attP2 位點分別顯示于圖 2 和圖 3 中。目的載體 pBC-Yellow、 PHP27840 和 PHP23236 的 attR1 和 attR2 位點分別顯示于圖 4、 5 和 6 中。
     作為另外一種選擇, 可進行多個入門克隆和合適的目的載體之間的 MultiSite Gateway LR 重組反應以產生表達載體。 實施例 10
     用驗證過的擬南芥屬前導基因制備大豆表達載體并轉化大豆
     為了檢查所得表型, 可將大豆植株轉化以過表達每個驗證過的擬南芥屬基因或來 自不同物種的對應同源物。
     可將實施例 5 中所述的相同 GATEWAY 入門克隆用于將每個基因定向克隆進
    PHP27840 載體 (SEQ ID NO : 5; 圖 5) 中, 使得該基因的表達處于 SCP1 啟動子的控制下。
     然后可用包含編碼本多肽的序列的表達載體轉化大豆胚。 大豆轉化和再生技術已 經在國際專利公布 WO 2009/006276 中進行了描述, 其內容以引用方式并入本文。 可在氮限制條件下 ( 例如 1mM 硝酸鹽 ) 栽培 T1 植株并分析表型變化。利用圖像 分析可定量下面的參數 : 可收集并定量植株面積、 體積、 生長速率以及顏色分析。超表達構 建體與合適的對照植物比較導致綠度 ( 綠色區 )、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時的鮮重或 干重、 果實或種子產量、 總植物氮含量、 果實或種子氮含量、 營養組織的氮含量、 總植物游離 氨基酸含量、 營養組織中的游離氨基酸含量、 果實或種子中的游離氨基酸含量、 果實或種子 中的蛋白質含量、 營養組織中的蛋白質含量發生變化, 可認為它是擬南芥屬前導基因在大 豆中發揮功能提高對氮缺乏耐受性 ( 增加的氮耐受性 ) 的證據。
     可分析用驗證過的基因轉化大豆植株以研究相對于對照或參照植株的農學特性。 例如, 可分析在低氮和高氮條件 ( 如氮限制條件和氮充分條件 ) 下的產量增加和 / 或穩定 性。
     實施例 11
     使用粒子轟擊法用驗證過的擬南芥屬前導基因轉化玉米
     為了檢查所得表型, 可將玉米植株轉化以過表達驗證過的擬南芥屬前導基因或來 自不同物種的對應同源物。
     可以將實施例 5 中所述的相同 GATEWAY 入門克隆用于將每種相應的基因定向
    克隆進玉米轉化載體中。在玉米轉化載體中的基因的表達可以處于組成型啟動子的控 制下, 例如玉米泛素啟動子 (Christensen 等人, Plant Mol.Biol.12 : 619-632(1989) 和 Christensen 等人, Plant Mol.Biol.18 : 675-689(1992)) 然后可通過粒子轟擊將上述重組 DNA 構建體引入玉米細胞中。通過粒子轟擊進行 玉米轉化的技術已經在國際專利公布 WO 2009/006276 中進行了描述, 其內容以引用方式 并入本文。
     可在氮限制條件下 ( 例如 1mM 硝酸鹽 ) 栽培 T1 植株并分析表型變化。利用圖像 分析可定量下面的參數 : 可收集并定量植株面積、 體積、 生長速率以及顏色分析。超表達構
     建體與合適的對照植物比較導致綠度 ( 綠色區 )、 產量、 生長速率、 生物量、 成熟時的鮮重或 干重、 果實或種子產量、 總植物氮含量、 果實或種子氮含量、 營養組織的氮含量、 總植物游離 氨基酸含量、 營養組織中的游離氨基酸含量、 果實或種子中的游離氨基酸含量、 果實或種子 中的蛋白質含量、 營養組織中的蛋白質含量發生變化, 可認為它是擬南芥屬前導基因在玉 米中發揮功能提高對氮缺乏耐受性 ( 增加的氮耐受性 ) 的證據。
     實施例 12
     電穿孔根癌農桿菌 LBA4404
     將電穿孔感受態細胞 (40μl), 例如根癌農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens) LBA4404( 含有 PHP10523) 在冰上解凍 (20-30 分鐘 )。 PHP10523 含有用于 T-DNA 轉移的 VIR 基因、 農桿菌屬的低拷貝數質粒復制起始區、 四環素抗性基因以及用于體內 DNA 生物分子 重組的 cos 位點。同時, 將電穿孔管 (electroporation cuvette) 在冰上冷卻。將該電穿 孔儀的設置調節至 2.1kV。將 DNA 等分試樣 (0.5μL 親代 DNA, 在低鹽緩沖液或雙蒸 H2O 中 的濃度為 0.2μg-1.0μg) 與解凍的根癌農桿菌 LBA4404 細胞混合, 同時仍然保持在冰上。 將混合物轉移至電穿孔管的底部并靜止保持在冰上 1-2 分鐘。按下 “pulse( 脈沖 )” 鍵兩 次 ( 理想的是獲取 4.0 毫秒的脈沖 ) 對細胞進行電穿孔 (Eppendorf 電穿孔儀 2510)。隨 后, 將 0.5mL 室溫下的 2xYT 培養基 ( 或 SOC 培養基 ) 加入到電穿孔管并轉移至 15mL 按壓 蓋管 ( 例如 FALCONTM 管 ) 中。將細胞在 28-30℃、 200-250rpm 下培養 3 小時。 將 250μL 的等分試樣散布在包含 YM 培養基和 50μg/mL 奇放線菌素的板上并在 28-30℃下培養三天。為了增加轉化體的數目, 可進行如下兩個可選步驟中的其中一個 :
     選擇 1 : 用 30μL 15mg/mL 的利福平覆蓋平板。LBA4404 具有針對利福平的染色體 抗性基因。這種附加的選擇消除了在使用較差的 LBA4404 感受態細胞制備物時觀察到的一 些污染克隆。
     選擇 2 : 進行兩次重復的電穿孔以補償較差的電感受態細胞。
     轉化體的鑒定 :
     選取四個獨立的克隆并劃痕接種在包含 AB 基本培養基和 50μg/mL 奇放線菌素的 平板上用于分離單個克隆。 將平板在 28℃下孵育二至三天。 對于每個推定的共整合體選取 單個克隆并將其接種在 4mL 的 10g/L 細菌蛋白胨, 10g/L 酵母提取物, 5g/L 氯化鈉, 和 50mg/ L 奇放線菌素中。將該混合物在 28℃下搖動培養 24 小時。采用 QIAGEN Miniprep 和可選 的 PB 緩沖液洗滌, 從 4mL 培養物分離出質粒 DNA。DNA 在 30μl 中洗提。如上所述, 將 2μL 可將 15μl 等分試樣用于 的等分試樣用于電穿孔 20μL DH10b+20μL 雙蒸 H2O。可任選地, TM 轉化 75-100μl 的 INVITROGEN Library Efficiency DH5α。將細胞散布在包含 LB 培養 基和 50μg/mL 奇放線菌素的平板上并將其在 37℃下培養過夜。
     對于每個推定的共整合體選取三至四個獨立克隆并將其接種在 4mL 的 2xYT 培養 基 (10g/L 細菌蛋白胨, 10g/L 酵母提取物, 5g/L 氯化鈉 ) 和 50μg/mL 奇放線菌素中。將 細胞在 37℃下搖晃培養過夜。接下來, 使用 QIAprep Miniprep, 用任選 PB 緩沖液洗滌液
    ( 稀釋成 50μL) 從 4mL 培養物中分離質粒 DNA。8μL 質粒 DNA 用 SalI( 使用親本 DNA 和 PHP10523 作對照物 ) 進行消化。對于 4 個質粒利用限制性內切酶 BamHI、 EcoRI 和 HindIII 再進行三次消化 ( 使用親本 DNA 和 PHP10523 作為對照 ), 這 4 個質粒代表 2 種具有正確 SalI 消化模式的推定共整合體。推薦電凝膠 (Electronic gel) 用于比較。實施例 13
     使用農桿菌屬 (Agrobacterium) 細菌轉化玉米
     為了檢查所得表型, 可將玉米植株轉化以過表達驗證過的擬南芥屬前導基因或來 自不同物種的對應同源物。
     農 桿 菌 介 導 的 玉 米 轉 化 基 本 上 按 照 Zhao 等 人, Meth.Mol.Biol.318 : 315-323(2006) 中描述的方法進行 ( 還可參見 Zhao 等人, Mol.Breed.8 : 323-333(2001) 和 1999 年 11 月 9 日公布的美國專利 5,981,840, 所述文獻以引用方式并入本文 )。該轉化過 程涉及細菌接種、 共培養、 靜息、 選擇和植物再生。
     1. 未成熟胚芽制備 :
     將未成熟胚芽從穎果上切下來, 并且放置在含有 2mL PHI-A 培養基的 2mL 微管中。
     2. 未成熟胚芽的農桿菌屬細菌感染和其培養 :
     2.1 感染步驟 :
     用 1mL 微吸移管將 (1) 的 PHI-A 培養基取出, 并且加入 1mL 農桿菌屬懸浮液。將 該管輕輕地倒置以混合。將該混合物在室溫下培養 5 分鐘。
     2.2 共培養步驟 :
     用 1mL 微量吸移管將農桿菌屬懸浮液從感染步驟中移出。使用無菌刮刀將胚從管 中刮出并轉移到 100×15mm 培養皿中的 PHI-B 培養基的平板中。測定胚的朝向, 使得胚軸 在培養基表面上朝下。將具有胚芽的平板在 20℃下于黑暗中培養三天。L- 半胱氨酸可用 于共培養階段。采用標準二元載體, 補充有 100-400mg/L L- 半胱氨酸的共培養培養基對于 回收穩定的轉基因事件是至關重要的。
     3. 選擇推定的轉基因事件 :
     向在 100×15mm 培養皿中的 PHI-D 培養基的平板中轉移 10 個胚芽, 保持朝向, 并 且用 parafilm 將培養皿密封。將平板在黑暗中于 28℃下培養。預計在六至八周將看見作 為黃色胚芽組織的主動生長推定事件。不產生事件的胚可能是棕色和壞死的, 并且幾乎看 不見脆性組織生長。以二 - 三周的間隔將推定的轉基因胚芽組織轉移到新鮮的 PHI-D 平板 上進行傳代培養, 時間間隔取決于生長速度。記錄事件。
     4.T0 植株的再生 :
     將在 PHI-D 培養基上繁殖的胚芽組織轉移到在 100×25mm 培養皿中的 PHI-E 培 養基 ( 體細胞胚芽成熟培養基 ) 中進行傳代培養, 在 28℃于黑暗中培養直至體細胞胚芽成 熟, 培養大約十至十八天。將具有良好限定的盾片和胚芽鞘的個體成熟體細胞胚芽轉移到 PHI-F 胚芽發芽培養基中, 并且在 28℃下于光中 ( 約 80μE, 來自冷光燈或同等熒光燈 ) 培 養。在七至十天, 將約 10cm 高的再生的植株置于盆中的園藝混合物中, 并且使用標準園藝 方法進行耐寒鍛煉 (hardened-off)。
     用于植物轉化的培養基 :
     1.PHI-A : 4g/L CHU 基礎鹽, 1.0mL/L 1000×Eriksson′ s 維生素混合物, 0.5mg/L 鹽酸硫胺, 1.5mg/L 2, 4-D, 0.69g/L L- 脯氨酸, 68.5g/L 蔗糖, 36g/L 葡萄糖, pH5.2。加入 100μM 乙酰丁香酮 ( 過濾滅菌的 )。
     2.PHI-B : PHI-A, 不含有葡萄糖, 將 2, 4-D 增加至 2mg/L, 將蔗糖降低至 30g/L, 并 且補充 0.85mg/L 硝酸銀 ( 過濾滅菌的 ), 3.0g/LGELRITE , 100μM 乙酰丁香酮 ( 過濾滅菌的 ), pH5.8。
     3.PHI-C : PHI-B, 不含 GELRITE 和乙酰丁香酮, 將 2, 4-D 降低至 1.5mg/L, 并且補 充 8.0g/L 瓊脂, 0.5g/L 2-[N- 嗎啉代 ] 乙烷 - 磺酸 (MES) 緩沖液, 100mg/L 羧芐西林 ( 過 濾滅菌的 )。
     4.PHI-D : PHI-C 補充 3mg/L 雙丙氨磷 ( 過濾滅菌的 )。
     5.PHI-E : 4.3g/L Murashige and Skoog(MS) 鹽 (Gibco, BRL 11117-074), 0.5mg/L 煙酸, 0.1mg/L 鹽酸硫胺, 0.5mg/L 鹽酸吡哆醇, 2.0mg/L 甘氨酸, 0.1g/L 肌醇, 0.5mg/L 玉米 素 (Sigma, 目錄 No.Z-0164), 1mg/L 吲哚乙酸 (IAA), 26.4μg/L 脫落酸 (ABA), 60g/L 蔗糖, 3mg/Lbialaphos( 過濾滅菌的 ), 100mg/L 羧芐西林 ( 過濾滅菌的 ), 8g/L 瓊脂, pH5.6。
     6.PHI-F : PHI-E, 不 含 有 玉 米 素、 IAA、 ABA ; 將 蔗 糖 降 低 至 40g/L ; 用 1.5g/L GELRITE 替代瓊脂 ; pH 5.6。 通過首先將組織簇轉移到補充有 0.2mg 每升的 2, 4-D 的 N6 培養基中, 可從該 轉基因愈傷組織再生出植物。兩周后, 可將組織轉移到再生培養基中 (Fromm 等人, Bio/ Technology 8 : 833-839(1990))。
     轉基因 T0 植株可以再生, 并且可以確定其表型。可收集 T1 種子。
    此外, 可通過直接轉化或者從單獨轉化的品系基因滲入而將含有證實的擬南芥屬 基因的重組 DNA 構建體導入玉米自交系內。
     自交或雜交的轉基因植物可通過更嚴苛的大田試驗來研究在氮限制條件下和非 氮限制條件下的產量增加和 / 或穩定性。
     隨后可進行產量分析以測定包含驗證過的擬南芥屬前導基因的植物在與不包含 驗證過的擬南芥屬前導基因的對照植物 ( 或參比植物 ) 進行比較時是否具有產量改善 ( 在 氮限制條件下和非氮限制條件下 )。包含驗證過的擬南芥前導基因的植物在氮限制條件下 將具有比對照植物更少的產量損失, 例如至少 25%更少的產量損失, 或者在非氮限制條件 下將具有比對照植物更高的產量。
     實施例 14A
     用于用經過驗證的候選擬南芥屬基因 (At1g61140) 通過農桿菌屬轉化玉米品系 的表達載體的制備
     使用 INVITROGENTM GATEWAY 技術, 用 GATEWAY 入門克隆進行 LR 重組反應, 所述
    入門克隆具有編碼擬南芥屬包含 SNF2 結構域的蛋白的序列 ( 如實施例 5 所述, 并且在該 實施例和隨后的實施例中稱為 AT-SNF2.1)、 入門克隆 PHP23112(SEQ ID NO : 14)、 入門克隆 PHP20234(SEQ ID NO : 9; 圖 9) 和目的載體 PHP22655(SEQ ID NO : 10) 的序列以生成前體質 粒 PHP29872。PHP29872 包含以下表達盒 :
     1. 表達 PAT 抗除草劑性基因的泛素啟動子 ::moPAT::PinII 終止子盒, 該基因用于 轉化過程期間的選擇。
     2. 表達 DS-RED 顏色標記的 LTP2 啟動子 ::DS-RED2::PinII 終止子盒, 該標記用于 分選種子。 3. 泛素啟動子 ::AT-SNF2.1::PinII 終止子盒過表達擬南芥屬包含 SNF2.1 結構域 的蛋白質 (At1g61140.1)。
     實施例 14B
     用經驗證的候選擬南芥屬基因 (At1g61140) 通過農桿菌屬轉化玉米品系
     使用如實施例 12 和 13 所述的農桿菌介導轉化, 能將存在于載體 PHP29872( 如 14A 所述 ) 中、 或包含其他兩種 At1g61140 突變體中的任一種的載體中的 SNF2.1 表達盒導入玉 米自交系、 或來源于優良玉米自交系的可轉化玉米品系。
     可將表達載體 PHP29872 通過電穿孔導入包含載體 PHP10523(SEQ ID NO : 7, 圖 7) 的 LBA4404 農桿菌屬菌株以制備共整合載體 PHP29875, 該載體包含 SNF2.1 表達盒。共整 合載體通過每個載體上包含的 COS 重組位點重組兩個質粒 PHP29872 和 PHP10523 形成, 并 且除了農桿菌菌株以及農桿菌介導轉化需要的其他基因 (TET、 TET、 TRFA、 ORI 終止子、 CTL、 ORI V、 VIR C1、 VIR C2、 VIR G、 VIR B) 之外, 還包含上述相同的三個表達盒 ( 實施例 14A)。 可使用 ( 但不限于 ) 實施例 12 中的電穿孔規程。
     實施例 15
     用于轉入 Gaspe Flint 衍生的玉米品系的目的載體 PHP23236 的制備
     目的載體 PHP23236( 圖 6, SEQ ID NO : 6) 通過用載體 PHP23235( 圖 8, SEQ ID NO : 8) 轉化農桿菌屬菌株 LBA4404 并分離所得共整合產物而獲取, 所述菌株包含質粒 PHP10523( 圖 7, SEQ ID NO : 7)。
     目的載體 PHP23236 可被用于如實施例 16 所述的與入門克隆的重組反應, 以產生 用于轉化 Gaspe Flint 衍生的玉米品系的玉米表達載體。
     實施例 16
     用于轉入 Gaspe Flint 衍生的玉米品系的表達構建體的制備
     使用 INVITROGENTM GATEWAY LR 重組技術, 可將如實施例 5 所述的相同入門克 隆定向克隆到目的載體 PHP29634(SEQ ID NO : 15 ; 圖 11) 中以形成表達載體。目的載體 PHP29634 與目的載體 PHP23236 是相似的, 但是, 目的載體 PHP29634 具有位點特異性的重 組位點 FRT1 和 FRT87, 并且還編碼用于利用草甘膦對轉化體進行選擇的 GAT4602 選擇性標 記蛋白。該表達載體將包含所述受關注的 cDNA, 其在 UBI 啟動子的控制下編碼 At-SNF2.1、 At-SNF2.2、 或 AtSNF2.3, 并且是農桿菌介導轉化到玉米中的 T-DNA 二元載體, 該載體如本 文所述實施例所述但不受其限制。 實施例 17A
     用驗證過的候選擬南芥屬基因 (At1g61140) 轉化 Gaspe Flint 來源的玉米品系
     為了檢查所得表型, 可轉化玉米植株以過表達擬南芥屬 At1g61140 基因 ( 和來自 其他物種的對應同源物 )。可使用如實施例 16 所述的表達構建體。
     受體植株
     受體植株細胞可來自具有短的生活周期 ( “快速循環” )、 小的個體尺寸以及轉化潛 能高的單一玉米品系。對玉米典型的這些植株細胞是來自可公開獲得的 Gaspe Flint(GF) 品 系 變 種 的 植 株 細 胞。 一 種 可 能 的 候 選 植 株 品 系 變 種 是 GF×QTM(Quick Turnaround Maize( 快速周轉玉米 ), 選擇用于在溫室條件下生長的 Gaspe Flint 的可公開獲得形式 ) 的 F1 雜交種, 其在 Tomes 等人 ( 美國專利申請 10/367,416, 提交于 2003 年 2 月 13 日 ; 美 國專利公開 2003/0221212 A1, 公布于 2003 年 11 月 27 日 ) 中公開。從該品系獲得的轉基 因植株具有如此小的尺寸使得它們可在四英寸的盆中生長 ( 是正常大小的玉米植株所需 空間的 1/4) 并且它們在少于 2.5 個月時間內成熟。( 傳統上, 一旦轉基因植株適應溫室后
     需要 3.5 個月來獲得轉基因 T0 種子。) 另一合適的品系包括但不限于 GS3( 高度可轉化的 品系 )X Gaspe Flint 的雙單倍體品系。還有另一種合適的品系是攜帶引起較早開花、 高度 減小或這兩者的轉基因的可轉化的優良玉米自交系。
     轉化規程
     任何合適的方法可用于將轉基因引入玉米細胞中, 包括但不限于利用基于農桿菌 屬載體的接種類型的步驟 ( 參見例如實施例 12 和 13)。轉化可在受體 ( 靶標 ) 植株的未成 熟胚上進行。
     精確的生長和植株跟蹤
     將由轉化的玉米胚產生的轉基因 (T0) 植株的事件群體在受控的溫室環境中栽 培, 該溫室使用改良的隨機分塊 (block) 設計以降低或消除環境誤差。隨機分塊設計是這 樣一種植株布局, 在該布局中, 實驗植株被分成組 ( 如, 每組三十株植株 ), 稱為塊, 而每株 植株隨塊被隨機分配一個位置。
     對于一組三十株植株, 二十四株轉化的實驗植株和六株對照植株 ( 具有設定好的 表型的植株 )( 總起來說稱為 “重復組” ) 被置于盆中, 這些盆在位于溫室內的桌子上布置成 陣列 ( 也叫做重復組或塊 )。每株植株 ( 對照植株或實驗植株 ) 隨塊被隨機分配一個位置, 所述的塊映射一個唯一的、 溫室物理位置以及映射該重復組。在單次實驗中多個三十株植 株的重復組中的每一個可栽培在相同的溫室中。應該測定重復組的布局 ( 布置方式 ) 以使 對空間的要求最小以及溫室內的環境影響最小。這樣一種布局可稱為壓縮的溫室布局。
     對于加入特定的對照組的一種替代方法是鑒定不表達受關注基因的那些轉基因 植株。可將諸如 RT-PCR 之類的多種技術應用于定量評估引入基因的表達水平。可將不表 達轉基因的 T0 植株與表達轉基因的那些植株進行比較。
     在整個評價過程中鑒定和跟蹤事件群體中的每株植株, 并且從那些植株收集的數 據自動與那些植株相關聯, 使得所搜集的數據可與由該植株攜帶的轉基因關聯。 例如, 每個 植株容器具有機器可讀的標簽 ( 例如通用貨單代碼 (UPC) 條形碼 ), 該標簽包含了關于植物 身份的信息, 身份信息繼而又與溫室位置相關, 使得從植物獲得的數據可自動與該植物相 關聯。
     作為另外一種選擇, 可使用任何有效的、 機器可讀的植物識別系統, 例如二維矩陣 代碼或甚至是射頻識別標簽 (RFID), 其中數據被接收并由射頻接收器 / 處理器進行翻譯。 參見美國專利申請 10/324,288, 提交于 2002 年 12 月 19 日 ( 美國專利公布 2004/0122592 A1, 公布于 2004 年 6 月 24 日 ), 以引用方式并入本文。
     利用三維成像進行表型分析
     對 T0 事件群體中的每株溫室植株 ( 包括任何對照植株 ) 分析所關注的農學特性, 并且以這樣一種方式記錄或存儲每株植株的農學數據, 該方式使得數據與該植株的辨識數 據 ( 見上面 ) 相關聯。可利用與上述類似的實驗設計, 可在 T1 代中完成對表型 ( 基因效 應 ) 的確認。
     在植物的整個溫室生活周期中, 利用定量的非破壞性成像技術在表型水平上來分 析 T0 植株以評估所關注的性狀。任選地, 將數字成像分析儀用于整株植物的自動多維分 析。成像可在溫室內進行。將兩個攝像系統 ( 位于頂部和側面 ) 和用于旋轉植物的裝置用 于從所有側面觀察植物和成像。從每株植物的頂部、 前面和側面采集圖像。所有的三個圖像一起提供了足夠的信息用于評價例如每株植物的生物量、 大小和形態。
     由于植物在第一片葉片從土壤顯現出來時到植物處于它們發育的末期時大小的 改變, 從頂部以較高的放大倍率任選地記錄植物發育的早期。這攝像可通過利用完全由成 像軟件控制的自動變焦鏡頭系統來完成。
     在單次成像分析操縱中, 進行如下事件 : (1) 將植株傳送至分析儀區域內, 旋轉 360 度以便其機器可讀標簽可被讀取, 并且讓其保持靜止直至其葉片停止移動 ; (2) 獲取側 面圖像并將其輸入數據庫 ; (3) 將植株旋轉 90 度并再次讓其保持靜止直至其葉片停止移 動, 以及 (4) 將該植株傳送出分析儀。
     每二十四小時的周期讓植物至少六個小時處于黑暗以便具有正常的白天 / 黑夜 周期。
     成像儀器
     可 使 用 任 何 合 適 的 成 像 儀 器, 包 括 但 不 限 于 可 從 LemnaTec GmbH(Wurselen, Germany) 商購獲得的光譜數字成像儀。 獲取圖像并用具有 1/2″ IT Progressive Scan IEE CCD 成像設備的 LemnaTec Scanalyzer HTS LT-0001-2 進行分析。該成像照相機可配備有 自動變焦、 自動調節光圈和自動聚焦。可利用 LemnaTec 軟件設定所有的照相機設置。任選 地, 對于主要組成成像分析儀的儀器差異小于約 5%, 對于次要組成成像分析儀的儀器差異 小于約 10%。 軟件
     成像分析系統包括用于顏色和構造分析的 LemnaTec HTS Bonit 軟件程序和用于 存儲約 500,000 次分析的數據 ( 包括分析數據 ) 的服務器數據庫。原始圖像和分析過的圖 像儲存在一起以允許用戶根據需要進行再次分析。 可將數據庫連接至成像硬件用于自動的 數據收集和存儲。多種可商購獲得的軟件系統 ( 例如 Matlab, 其他軟件 ) 可用于定量解釋 圖像數據, 并且可將這些軟件體系中的任何一種應用于所述圖像數據集。
     傳送系統
     具有植物旋轉裝置的傳送系統可用于將植物傳送至成像區域并在成像過程中選 擇植物。例如, 將最多四株植物 ( 每株最高高度為 1.5m) 裝上汽車, 該汽車在循環的傳送系 統上行進并通過成像測量區域。在這種情況下, 該單位 ( 成像分析儀和傳送環線 ) 的總占 有面積為約 5m×5m。
     可擴大傳送系統以同時容納更多植物。 將植物沿傳送環線傳送至成像區域并對每 株植物分析最多 50 秒。獲取植物的三個視圖。傳送系統以及成像設備應該能夠用于溫室 環境條件。
     照明
     任何合適的照明模式可用于圖像采集。例如, 可在暗背景上使用頂部照明。作為 另外一種選擇, 可采用使用白色背景的頂部照明和背部照明的組合。應該將被照亮的區域 圍起來以確保恒定的照明條件。 遮蔽物應該長于測量區域使得能保持恒定的光條件而不需 要打開和關閉門。 作為另一種選擇, 可變化照明以引起轉基因 ( 如, 綠色熒光蛋白 (GFP)、 紅 色熒光蛋白 (RFP)) 的激發或者引起內源性 ( 如葉綠素 ) 熒光基團的激發。
    
    
    基于三維成像的生物量評價 為了更好地評價生物量, 應該從至少三個軸 ( 任選地, 頂部視圖和兩個側面 ( 側面1 和側面 2) 視圖 ) 獲取植物圖像。然后分析這些圖像以將植物從背景 ( 盆和花粉控制袋 ( 如果適用的話 )) 分離。可通過如下計算評價植物的體積 :
     體積 ( 體素 ) = - √頂部面積 ( 像素 )× √側面 1 面積 ( 像素 )× √側面 2 面積 ( 像素 )
     在上面的等式中, 體積和面積的單位是 “任意單位” 。 在該系統中, 任意單位完全足 以檢測基因對植物大小和生長影響, 因為所需的是檢測與實驗平均值或對照平均值的差值 ( 正較大和負較小兩者 )。大小 ( 如面積 ) 的任意單位可通過將物理參照加入到成像過程 而輕易地轉化成物理量度。例如, 可在頂部成像過程和側面成像過程兩者中均包括已知面 積的物理參照。 基于這些物理參照的面積, 可測定轉換因子以允許從像素轉換為面積單位, 2 例如平方厘米 (cm )。物理參照可以是或可以不是獨立的樣本。例如, 具有已知直徑和高度 的盆足可用作物理參照。
     顏色分類
     成像技術還可用于測定植物顏色以及用于將植物顏色歸為各種衍生類型。 將圖像 顏色歸屬于顏色類型是 LemnaTec 軟件的固有特色。使用其他圖像分析軟件系統, 可通過多 種計算方法測定顏色分類。
     對于植物大小和生長參數的測定, 一種有用的分類方案是定義一種單一顏色方 案, 包括綠色的兩種或三種色調 ( 例如色調是 50-66, 參見圖 13), 此外, 還有關于缺綠病、 壞 死和漂白 ( 在這些條件出現時 ) 的顏色類型。還使用了背景顏色類型, 其包括圖像中的非 植物顏色 ( 例如盆和土壤顏色 ), 并將這些像素特別地從測定大小中排除。 在受控的恒定照 明下分析植物, 使得可以定量一株植物內隨時間推移的任何改變, 或者植物之間或植物不 同分枝之間的任何改變 ( 如季節差異 )。
     除了其在測定植物的大小、 生長中的有效性以外, 顏色分類還可用于評估其他產 量構成性狀。對于這些其他產量構成性狀, 可使用另外的顏色分離方案。例如, 稱為 “保綠 度 (staygreen)” 的性狀 ( 已經將其與產量的提高相關聯 ) 可通過顏色分類來評估, 該顏色 分類將綠色色調與黃色和棕色色調 ( 其指示老化的組織 ) 相分離。通過將這種顏色分類應 用于在 T0 或 T1 植物生活周期末獲取的圖像, 可鑒定綠色的量相對于黃色和棕色 ( 例如, 可 表示為綠色 / 黃色比率 ) 增加的植物。這種綠色 / 黃色比率具有顯著差異的植物可被鑒定 為攜帶影響這種重要農學性狀的轉基因。
     熟練的植物學家將認識到可指示植物健康或應激反應的其他植物顏色 ( 花青素 ) 的出現, 以及認識到其他顏色分類方案可提供對基因在與這些響應相關的性狀方面的作用 的進一步度量。
     植物結構分析
     改變植物結構參數的轉基因也可以用本發明鑒定, 包括諸如最大高度和寬度、 節 間距離、 葉與莖之間的角度、 在節處開始的葉片數以及葉片長度。 LemnaTec 系統軟件可如下 用于測定植物構造。在第一成像步驟中將植物簡化至其主要的幾何構造, 并且隨后基于該 圖像可進行不同構造參數的參數化鑒定。 或者是單獨地或者是組合地修改任何這些構造參 數的轉基因可通過應用此前所述的統計方法來鑒定。
     花粉脫落日期
     花粉脫落日期是轉基因植物中要分析的一個重要參數, 并且可通過活性雄花第一次出現在植物上來測定。為了找到雄花目標, 通過顏色對莖的上端進行分類以檢測黃色或 紫色花藥。然后將這種顏色分類分析用于定義活性花, 活性花繼而可用于計算花粉脫落日 期。
     作為另外一種選擇, 花粉脫落日期和其他易于在視覺上檢測到的植物屬性 ( 如授 粉日期、 第一穗絲日期 ) 可以由負責進行植物看護的工作人員來記錄。為了使數據完整性 和過程效率最大化, 通過利用相同的由 LemnaTec 光譜數字分析設備利用的條形碼來跟蹤 該數據。 可將具有條形碼閱讀器的電腦、 掌上設備或筆記本電腦用于使記錄觀察時間、 植物 標識符的數據捕捉變得容易, 以及使捕捉數據的操作者感覺舒適。
     植物的取向
     以接近商業栽培的密度種植的成熟玉米植物通常具有平面的構造。也就是說, 植 物具有一可清晰分辨的寬的側面和窄的側面。對來自植物寬側的圖像進行測定。對于每株 植物, 給其賦予一個明確界定的基本取向以獲得寬側圖像與窄側 (edgewise) 圖像之間的 最大差別。將頂部圖像用于測定植物的主軸, 而將額外的旋轉裝置用于在開始主圖像采集 前將植物轉至合適的取向。
     實施例 17B
     用玉米同源物轉化 Gaspe Flint 衍生的玉米品系
     使用 INVITROGENTM GATEWAY LR 重組技術, 可制備入門克隆用于任何玉米同源物 (SEQ ID NO : 18/19、 20/21、 22/23、 43/44、 或 45/46)( 入門克隆的制備參見實施例 5), 并能 夠將入門克隆定向克隆到 GATEWAY 目的載體 29634(SEQ ID NO : 15 ; 圖 11) 中以制備對應 的表達載體。每個表達載體將包含處于 UBI 啟動子控制下的所關注的 cDNA, 并且將是用 于農桿菌屬介導的向玉米內的轉化的 T-DNA 二元載體, 所述玉米如但不限于本文所述的實 例。 實施例 18
     在氮限制條件下對玉米品系的篩選
     Gaspe Flint 來源的玉米品系
     轉基因植物可含有兩個或三個劑量的 Gaspe Flint-3 與一個劑量的 GS3(GS3/ (Gaspe-3)2X 或 GS3/(Gaspe-3)3X), 并且對于顯性轉基因會以 1 ∶ 1 分離。將轉基因植物 在 100% Turface( 一種商業栽培培養基 ) 中栽培, 每天用 1mM KNO3 生長培養基和 2mM KNO3 或更高的生長培養基澆灑四次 ( 參見圖 14)。 在 1mM KNO3 培養基中培養的對照植物的綠度 較小, 產生較少的生物量并且在開花期具有較小的穗 ( 關于樣本數據的示例請參見圖 15)。 Gaspe 來源的品系將生長至開花期。
     將用統計學確定處理株之間所觀察到的差異是否真有差異。圖 15 示出了一種方 法, 該方法將字母放在數值后面。同一列中其后具有相同字母 ( 不是字母組 ) 的那些值不 具有顯著的差異。 使用該方法, 如果在一列中的值的后面沒有字母, 則該列中的這些值的任 何之間不存在顯著的差異, 換句話講, 該列中的所有這些值是均等的。
     與無效轉基因相比較, 轉基因的表達將導致植物在 1mM KNO3 中具有改善的植物生 長。因此生物量和綠度 ( 如實施例 2 和 17A 所述 ) 將在生長期間進行監控, 并與無效轉基 因植物比較。生長、 綠度、 開花期穗的大小的改善將表明氮耐受性增強。
     幼苗測定
     還可采用幼苗測定對轉基因玉米植物進行評估, 所述測定對植物在氮限制條件 下的表現進行評估。例如, 在 18 天幼苗測定中, 轉基因植物被種植于商品化盆栽培養基 Turface 中, 然后用包含下列營養物質的溶液每天澆四次 : 1mM CaCl2、 2mM MgSO4、 0.5mM KH2PO4、 83ppmSprint330、 3mM KCl、 1mM KNO3、 1μM ZnSO4、 1μM MnCl2、 3μM H3BO4、 0.1μM CuSO4 和 0.1μM NaMoO4。植物在種植后 18 天收獲, 并且評價多個性狀, 包括但不限于 : SPAD( 綠度 )、 莖直徑、 根干重、 苗干重、 總干重、 mg 氮每克干重 (mg N/g dwt)、 以及植物氮濃 度。采用 Studentt 檢驗, 以 0.1 的最小值 (P < t) 比較平均值和無效轉基因平均值參數。
     實施例 19
     氮利用效率幼苗檢測分析法
     利用種子顏色標記將轉基因事件的種子分成了轉基因的 ( 處理 1 ; 包含構建體 PHP29875) 和無效的 ( 處理 2) 種子。
     每一處理 ( 轉基因的或批無效的 ) 被隨機分配至 54 個盆 ( 實驗單位 ) 組成的區 塊中, 所述盆按 6 行 9 列排列。重復每個處理 ( 轉基因或批無效的 )9 次。
     將所有種子種在 4 英寸的方盆中, 盆中包含在 8 英寸交錯中心上的 Turface, 每天 用包含以下營養物質的溶液澆灌四次 :
     1mM CaCl2 2mM MgSO4 0.5mM KH2PO4 83ppm Sprint330
     3mM KCl 1mM KNO3 1μM ZnSO4 1μM MnCl2
     3μM H3BO4 1μM MnCl2 0.1μM CuSO4 0.1μM NaMoO4
     植物出苗后, 將其間苗至每盆一個種子。 在收獲時從盆中移除植物, 并且將蒙脫石 從根部洗脫。使根與苗分開, 把根置于紙袋中并且在 70℃干燥 70 小時。將干燥后的植物部 分 ( 根和苗 ) 稱重并置于 50mL 的圓錐管中, 管中有大約 20 5/32 英寸的鋼球, 在涂料振蕩 器中進行振蕩研磨。
     The Nitrogen/Protein Analyzer 來自 Thermo Electron Corporation 的氮 / 蛋 白質分析器 ( 型號 FlashEA 1112N) 使用約 30mg 的基本組織。樣品從自動取樣機被點樣至 氧化反應室內部的坩堝內。在 900℃和純氧條件下, 樣品被強烈的放熱反應氧化, 產生 N2、 CO2、 H2O 和 SO2 的混合氣體。燃燒結束后, 打開載氣氦, 使氣體混合物流入還原反應室。在 680℃, 使氣體混合物流過還原銅, 其中可能形成的氮氧化物被轉化為氮元素而過量的氧氣 被保留。所述氣體混合物從還原反應器流出, 依次經過兩個吸收過濾器。第一個過濾器包 含堿石灰, 留住了二氧化碳和二氧化硫。 第二個過濾器包含分子篩和顆粒狀的硅膠, 以阻止 水通過。 然后, 氮被洗脫進色譜柱, 并被轉至熱導率檢測器, 熱導率檢測器生成電子信號, 所 述電子信號經 Eager 300 軟件的適當處理, 提供了氮 - 蛋白質百分比。
     利用這些數據, 測量了下列參數, 并且采用 Student t 檢驗將轉基因組的參數的平 均值與無效組的參數的平均值進行了比較。
    利用方差分析 (ANOVA) 計算和完全隨機設計 (CRD) 模型, 計算了每一區塊內的方 差。使用 F 統計, 通過將總區塊處理平均面積除以總區塊誤差平均面積對每個區塊計算了 總處理效應。計算了更大的 Student′ s t 檢驗的概率用于比較每個轉基因平均值與合適 的無效轉基因平均值。顯示顯著差異的變量 (*) 具有最小值 (P < t)0.1。
     表 5 示出原始數據和包含構建體 PHP29875 的植物的雙尾 Student’ s t 概率。p 值的數學符號反映所述事件對相應的無效組的相對表現, 即 ‘+’ =提高的表現, ‘-’ =降低 的表現。比較轉基因事件和構建體無效轉基因。無效的構建體是陰性的入門構建體, 其由 來自陰性分離子的果仁的抽樣組成, 并因此是全部陰性的代表性樣本。
     表5: PHP29875 的溫室幼苗測定數據
    
    實施例 20A
     具有擬南芥屬前導基因或玉米同源物的玉米品系的產量分析
     自交或頂交雜交體的轉基因植物可通過更嚴苛的大田試驗來研究在氮限制條件 下和無氮限制條件下的產量增加和 / 或穩定性。標準化的產量試驗將通常包括 4 至 6 次重 復, 以及至少 4 個位置。
     可進行產量分析以測定與構建體無效的或野生型的對照 ( 或參考 ) 植物相比, 包 含編碼包含 SNF2 結構域的蛋白的經驗證擬南芥屬基因或相關玉米基因的植物是否具有產 量表現方面的提高 ( 在氮限制或非氮限制條件下 )。具體地講, 對于包含經驗證的擬南芥 前導基因或 lnt6 的玉米同源物的植物和對照植物, 可于開花和 / 或灌漿時期施加氮限制條 件。可以測得這兩種植物的產量都有所減少。包含驗證過的擬南芥屬前導基因或其玉米同 源物的植物在氮限制條件下將具有比對照植物更少的產量損失, 或者在非氮限制條件下將 具有比對照植物更高的產量。
     實施例 20B
     用 PHP29875 轉化的玉米品系的產量分析
     玉米測交雜種包含存在于載體 PHP29875 中的擬南芥前導基因 ( 編碼包含 SNF2 結 構域的多肽 ) 的表達盒, 并且它們的對照植物于 2008 年和 2009 年在多個位置的低氮 (LN) 和標準氮 (NN) 環境下生長。基于由 Federal and State Extension 服務對特定生長區域 確定的土壤測試標準, 低氮 (LN) 環境指氮量少于在早春或夏季施加的標準氮肥的量, 而標
     準氮 (NN) 環境指加入正常產量所需的充足的氮。與 NN 條件中獲得的產量相比, 在 LN 條件 中觀察到了產量的降低。就該分析而言, 構建體無效組是由來自一種構建體的全部事件的 陰性分離子組成的負輸入, 批無效組是由來自一次實驗的全部構建體的全部陰性分離子組 成的負輸入。
     2008 年在 York, NE(YK) 和 Woodland, CA(WO) 兩個地點對九個轉基因事件進行了 大田試驗, 并評估了產量。玉米測交雜交體被用于與構建體無效的 (CN) 相比較。2008 年大 田試驗的結果顯示于表 6 中。
     表6
     用 PHP29875 轉化的玉米的 2008 年大田試驗
    測量單位為蒲式耳 / 英畝。
     陰影代表與構建體無效 (CN) 相比較顯著性較高的 (P < 0.1) 結果。
     粗體代表與構建體無效 (CN) 相比較顯著性較低的 (P < 0.1) 結果。
     九個以前測試的轉基因事件中有八個是 2009 年在以下位置進行的大田測試 : York, NE(YK) ; Marion, IA(MR)Woodland, CA(WO) ; Dallas Center, IA(DS) ; 和 Princeton, IN(PR)。然而, 在 2009 年玉米測交雜種與批無效 (BN) 進行比較。2009 年大田試驗的結果 顯示于表 7 中。 在 York, 在低氮條件下三個事件顯示產量比批無效顯著提高, 在標準氮條件 下一個事件顯示產量比批無效顯著提高。在 Woodland, 在低氮條件下一個事件具有比批無 效顯著更高的產量。在 Marion, 在低氮條件下三個事件的產量比批無效顯著更高。
     表7
     用 PHP29875 轉化的玉米的 2009 年大田試驗
    
    測量單位為蒲式耳 / 英畝。
     陰影代表與批無效 (BN) 相比較顯著性較高的 (P < 0.1) 結果。
     黑體代表與批無效 (BN) 相比較顯著性較低的 (P < 0.1) 結果。
     實施例 21
     用經驗證的前導基因的大豆同源物對大豆進行的轉化和評估
     基于同源性搜索, 可鑒定驗證過的擬南芥屬前導基因的一個或若干個候選大豆同 源物, 并且還可評估它們增加大豆氮限制條件耐受性的能力。 載體構建、 植物轉化和表型分 析將類似于上文實施例所述的規程。
     實施例 22
     用經驗證的前導基因的玉米同源物對玉米進行的轉化和評估
     基于同源性搜索, 可鑒定經驗證的擬南芥屬前導基因的一個或若干個候選的玉米 同源物 ( 例如 SEQ ID NO : 18/19、 20/21、 22/23、 43/44 或 45/46), 并且還評估它們增加玉米 氮限制條件耐受性的能力。載體構建、 植物轉化和表型分析可類似于上文實施例所述的規 程。
     實施例 23
     用驗證過的前導基因的玉米和大豆同源物轉化擬南芥屬
     可將驗證過的擬南芥屬前導基因的大豆和玉米同源物在 35S 啟動子的控制下轉 化到擬南芥屬中, 并且當在低氮培養基中生長時分析其葉片面積和綠色區積聚。可如本文 實施例所述進行載體構建和植物轉化。檢測分析的條件、 數據采集和數據分析可類似于上 文實施例所述的規程。
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關 鍵 詞:
限制 條件下 具有 改變 農學 特性 植物 涉及 編碼 包含 SNF2 結構 多肽 基因 相關 構建 方法
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